CN102686238A - 具有改善的免疫原性的蛋白质基质疫苗 - Google Patents
具有改善的免疫原性的蛋白质基质疫苗 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102686238A CN102686238A CN2010800504126A CN201080050412A CN102686238A CN 102686238 A CN102686238 A CN 102686238A CN 2010800504126 A CN2010800504126 A CN 2010800504126A CN 201080050412 A CN201080050412 A CN 201080050412A CN 102686238 A CN102686238 A CN 102686238A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- particle size
- antigen
- protein
- compositions
- dni
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 173
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 159
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 158
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 title claims abstract description 139
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 title abstract description 39
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 title abstract description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 277
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 277
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 277
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 190
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 174
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 174
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 146
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 55
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims abstract description 21
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 134
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 134
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 66
- 239000008187 granular material Substances 0.000 claims description 59
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 56
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 49
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 40
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 31
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 claims description 30
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 26
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 claims description 24
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 claims description 22
- 229940031000 streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 claims description 22
- 239000000376 reactant Substances 0.000 claims description 18
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 claims description 17
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 15
- 241000588650 Neisseria meningitidis Species 0.000 claims description 14
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 14
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims description 13
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 claims description 12
- 241000293871 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi Species 0.000 claims description 11
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims description 11
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims description 11
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 9
- 241000588919 Citrobacter freundii Species 0.000 claims description 8
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 claims description 7
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 claims description 7
- 108010040721 Flagellin Proteins 0.000 claims description 7
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 claims description 7
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 claims description 7
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 claims description 6
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 claims description 6
- 229960003983 diphtheria toxoid Drugs 0.000 claims description 6
- 229940047650 haemophilus influenzae Drugs 0.000 claims description 6
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 5
- 108010071134 CRM197 (non-toxic variant of diphtheria toxin) Proteins 0.000 claims description 5
- 241000589602 Francisella tularensis Species 0.000 claims description 5
- 101710183389 Pneumolysin Proteins 0.000 claims description 5
- 229940065181 bacillus anthracis Drugs 0.000 claims description 5
- 229940118764 francisella tularensis Drugs 0.000 claims description 5
- 101710146739 Enterotoxin Proteins 0.000 claims description 4
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 claims description 4
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 claims description 4
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 claims description 4
- 101900264058 Escherichia coli Beta-galactosidase Proteins 0.000 claims description 3
- 101710082714 Exotoxin A Proteins 0.000 claims description 3
- 241000186781 Listeria Species 0.000 claims description 3
- 241000607768 Shigella Species 0.000 claims description 2
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 2
- 108010044241 tetanus toxin fragment C Proteins 0.000 claims description 2
- 101000585552 Bacillus anthracis Protective antigen Proteins 0.000 claims 1
- 241001483952 Peach chlorotic mottle virus Species 0.000 description 149
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 133
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 description 124
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 66
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 58
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 52
- 108010060123 Conjugate Vaccines Proteins 0.000 description 51
- 229940031670 conjugate vaccine Drugs 0.000 description 51
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 47
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 34
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 34
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 31
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 30
- 239000000463 material Substances 0.000 description 29
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 25
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 24
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 20
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 20
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 19
- -1 phosphoric acid polysaccharide Chemical class 0.000 description 19
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 19
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 18
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 16
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 14
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 14
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 13
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 13
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 13
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 13
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 13
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 13
- 239000002585 base Substances 0.000 description 12
- 229920000620 organic polymer Polymers 0.000 description 12
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 11
- 101710194807 Protective antigen Proteins 0.000 description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 11
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 11
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 11
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 11
- 230000006054 immunological memory Effects 0.000 description 11
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 11
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 11
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 10
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 10
- 230000015654 memory Effects 0.000 description 10
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 9
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 9
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 9
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 9
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid Substances OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 9
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 9
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 9
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 9
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 9
- 239000002262 Schiff base Substances 0.000 description 8
- 150000004753 Schiff bases Chemical class 0.000 description 8
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 8
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 8
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 8
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 8
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 8
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 8
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 8
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 230000002787 reinforcement Effects 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 7
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 7
- 230000008859 change Effects 0.000 description 7
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 7
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 7
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 7
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 6
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 6
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 6
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 6
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 6
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 6
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 6
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 6
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 5
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 5
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 5
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 5
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 5
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 5
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 5
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 5
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 5
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 5
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 5
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 5
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 5
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 5
- 241000589291 Acinetobacter Species 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010019133 Hangover Diseases 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-N Methanethiol Chemical compound SC LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000003047 N-acetyl group Chemical group 0.000 description 4
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 4
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 4
- 108010055044 Tetanus Toxin Proteins 0.000 description 4
- 150000001336 alkenes Chemical class 0.000 description 4
- 125000004450 alkenylene group Chemical group 0.000 description 4
- 150000001345 alkine derivatives Chemical class 0.000 description 4
- 125000004419 alkynylene group Chemical group 0.000 description 4
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 4
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 4
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 4
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 4
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 4
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 4
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 4
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 4
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 239000011049 pearl Substances 0.000 description 4
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol group Chemical group C1(=CC=CC=C1)O ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 4
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N sodium cyanoborohydride Chemical compound [Na+].[B-]C#N BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940118376 tetanus toxin Drugs 0.000 description 4
- 150000003568 thioethers Chemical class 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 3
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 3
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 3
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 3
- 239000000783 alginic acid Substances 0.000 description 3
- 229960001126 alginic acid Drugs 0.000 description 3
- 150000004781 alginic acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 3
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 3
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 3
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- ZLFRJHOBQVVTOJ-UHFFFAOYSA-N dimethyl hexanediimidate Chemical compound COC(=N)CCCCC(=N)OC ZLFRJHOBQVVTOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 150000002337 glycosamines Chemical class 0.000 description 3
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 3
- TWNIBLMWSKIRAT-VFUOTHLCSA-N levoglucosan Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]2CO[C@@H]1O2 TWNIBLMWSKIRAT-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 3
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 229960002317 succinimide Drugs 0.000 description 3
- 230000006103 sulfonylation Effects 0.000 description 3
- 238000005694 sulfonylation reaction Methods 0.000 description 3
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001117 sulphuric acid Substances 0.000 description 3
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 3
- 125000002813 thiocarbonyl group Chemical group *C(*)=S 0.000 description 3
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 3
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 3
- MEZJQXVOMGUAMP-UHFFFAOYSA-N 1-(2-methylnaphthalen-1-yl)pyrrole-2,5-dione Chemical class CC1=CC=C2C=CC=CC2=C1N1C(=O)C=CC1=O MEZJQXVOMGUAMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HJBUBXIDMQBSQW-UHFFFAOYSA-N 4-(4-diazoniophenyl)benzenediazonium Chemical compound C1=CC([N+]#N)=CC=C1C1=CC=C([N+]#N)C=C1 HJBUBXIDMQBSQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N Acetamide Chemical compound CC(N)=O DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 229920000945 Amylopectin Polymers 0.000 description 2
- NOWKCMXCCJGMRR-UHFFFAOYSA-N Aziridine Chemical compound C1CN1 NOWKCMXCCJGMRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001453380 Burkholderia Species 0.000 description 2
- KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M Carbamate Chemical compound NC([O-])=O KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102100023344 Centromere protein F Human genes 0.000 description 2
- 241001337994 Cryptococcus <scale insect> Species 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 2
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 229920000663 Hydroxyethyl cellulose Polymers 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 241001597008 Nomeidae Species 0.000 description 2
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 2
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 2
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 2
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 2
- 229940124858 Streptococcus pneumoniae vaccine Drugs 0.000 description 2
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 description 2
- 239000005864 Sulphur Substances 0.000 description 2
- 241000607626 Vibrio cholerae Species 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 230000033289 adaptive immune response Effects 0.000 description 2
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 2
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 2
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 2
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 2
- 150000001409 amidines Chemical class 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 2
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 2
- 125000006297 carbonyl amino group Chemical group [H]N([*:2])C([*:1])=O 0.000 description 2
- 230000005859 cell recognition Effects 0.000 description 2
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 2
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 2
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 2
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 239000011246 composite particle Substances 0.000 description 2
- 229940028617 conventional vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 125000004185 ester group Chemical group 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000008202 granule composition Substances 0.000 description 2
- 150000008282 halocarbons Chemical class 0.000 description 2
- 150000007857 hydrazones Chemical class 0.000 description 2
- 235000019447 hydroxyethyl cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 239000000568 immunological adjuvant Substances 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 229920001427 mPEG Polymers 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 2
- 229940031348 multivalent vaccine Drugs 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- LFGREXWGYUGZLY-UHFFFAOYSA-N phosphoryl Chemical group [P]=O LFGREXWGYUGZLY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- 229920000233 poly(alkylene oxides) Polymers 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 101150038846 slc46a1 gene Proteins 0.000 description 2
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N succinimide Chemical compound O=C1CCC(=O)N1 KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000472 sulfonyl group Chemical group *S(*)(=O)=O 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 150000007970 thio esters Chemical class 0.000 description 2
- 239000011800 void material Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LLXVXPPXELIDGQ-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)benzoate Chemical compound C=1C=CC(N2C(C=CC2=O)=O)=CC=1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O LLXVXPPXELIDGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JIHQDMXYYFUGFV-UHFFFAOYSA-N 1,3,5-triazine Chemical compound C1=NC=NC=N1 JIHQDMXYYFUGFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 16-Epiaffinine Natural products C1C(C2=CC=CC=C2N2)=C2C(=O)CC2C(=CC)CN(C)C1C2CO PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BTVZFIIHBJWMOG-UHFFFAOYSA-N 2,2-dimethylhexanedioic acid Chemical compound OC(=O)C(C)(C)CCCC(O)=O BTVZFIIHBJWMOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DFSFLZCLKYZYRD-UHFFFAOYSA-N 3,4-diethoxycyclobut-3-ene-1,2-dione Chemical compound CCOC1=C(OCC)C(=O)C1=O DFSFLZCLKYZYRD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000981 3-amino-3-oxopropyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C(=O)N([H])[H] 0.000 description 1
- 125000004042 4-aminobutyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])N([H])[H] 0.000 description 1
- YYROPELSRYBVMQ-UHFFFAOYSA-N 4-toluenesulfonyl chloride Chemical compound CC1=CC=C(S(Cl)(=O)=O)C=C1 YYROPELSRYBVMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000856 Amylose Polymers 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 206010008190 Cerebrovascular accident Diseases 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N D-Cellobiose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-CBPJZXOFSA-N D-Gulose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-CBPJZXOFSA-N 0.000 description 1
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N D-Lyxoflavin Natural products OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-GSVOUGTGSA-N D-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- YTBSYETUWUMLBZ-QWWZWVQMSA-N D-threose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@H](O)C=O YTBSYETUWUMLBZ-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 101710101803 DNA-binding protein J Proteins 0.000 description 1
- ZNZYKNKBJPZETN-WELNAUFTSA-N Dialdehyde 11678 Chemical compound N1C2=CC=CC=C2C2=C1[C@H](C[C@H](/C(=C/O)C(=O)OC)[C@@H](C=C)C=O)NCC2 ZNZYKNKBJPZETN-WELNAUFTSA-N 0.000 description 1
- RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen sulfide Chemical compound S RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 1
- BRLQWZUYTZBJKN-UHFFFAOYSA-N Epichlorohydrin Chemical compound ClCC1CO1 BRLQWZUYTZBJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 1
- 239000001856 Ethyl cellulose Substances 0.000 description 1
- ZZSNKZQZMQGXPY-UHFFFAOYSA-N Ethyl cellulose Chemical compound CCOCC1OC(OC)C(OCC)C(OCC)C1OC1C(O)C(O)C(OC)C(CO)O1 ZZSNKZQZMQGXPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QUSNBJAOOMFDIB-UHFFFAOYSA-N Ethylamine Chemical compound CCN QUSNBJAOOMFDIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 229920002306 Glycocalyx Polymers 0.000 description 1
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 1
- 229920002907 Guar gum Polymers 0.000 description 1
- 101000669447 Homo sapiens Toll-like receptor 4 Proteins 0.000 description 1
- 239000004354 Hydroxyethyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920001612 Hydroxyethyl starch Polymers 0.000 description 1
- 229920002153 Hydroxypropyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- LKDRXBCSQODPBY-AMVSKUEXSA-N L-(-)-Sorbose Chemical compound OCC1(O)OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O LKDRXBCSQODPBY-AMVSKUEXSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 101900161471 Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- KPPMHVZIQDYDAY-UHFFFAOYSA-N S(=O)(=O)(O)C1C(=O)N(C(C1)=O)C(C(=O)O)(CCCCCC(=O)O)N1C(C(CC1=O)S(=O)(=O)O)=O.C(CCCCCCC(=O)O)(=O)O Chemical compound S(=O)(=O)(O)C1C(=O)N(C(C1)=O)C(C(=O)O)(CCCCCC(=O)O)N1C(C(CC1=O)S(=O)(=O)O)=O.C(CCCCCCC(=O)O)(=O)O KPPMHVZIQDYDAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- APTGPWJUOYMUCE-UHFFFAOYSA-N S-Ethyl thioacetate Chemical compound CCSC(C)=O APTGPWJUOYMUCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010079723 Shiga Toxin Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102100039360 Toll-like receptor 4 Human genes 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 150000001266 acyl halides Chemical class 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004721 adaptive immunity Effects 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N anhydrous guanidine Natural products NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- 150000001491 aromatic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 150000001502 aryl halides Chemical class 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000852 azido group Chemical group *N=[N+]=[N-] 0.000 description 1
- HFACYLZERDEVSX-UHFFFAOYSA-N benzidine Chemical compound C1=CC(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C=C1 HFACYLZERDEVSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000035 biogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Substances BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010418 carrageenan Nutrition 0.000 description 1
- 229920001525 carrageenan Polymers 0.000 description 1
- 230000011748 cell maturation Effects 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 238000012412 chemical coupling Methods 0.000 description 1
- 150000001804 chlorine Chemical class 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000006482 condensation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 150000001470 diamides Chemical class 0.000 description 1
- 239000012954 diazonium Substances 0.000 description 1
- 150000001989 diazonium salts Chemical class 0.000 description 1
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-O diazynium Chemical compound [NH+]#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- MCWXGJITAZMZEV-UHFFFAOYSA-N dimethoate Chemical compound CNC(=O)CSP(=S)(OC)OC MCWXGJITAZMZEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- 229920001249 ethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 235000019325 ethyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- YVPJCJLMRRTDMQ-UHFFFAOYSA-N ethyl diazoacetate Chemical compound CCOC(=O)C=[N+]=[N-] YVPJCJLMRRTDMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 210000004517 glycocalyx Anatomy 0.000 description 1
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 1
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000224 granular leucocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000665 guar gum Substances 0.000 description 1
- 235000010417 guar gum Nutrition 0.000 description 1
- 229960002154 guar gum Drugs 0.000 description 1
- 229940045808 haemophilus influenzae type b Drugs 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 229940027278 hetastarch Drugs 0.000 description 1
- KIWQWJKWBHZMDT-UHFFFAOYSA-N homocysteine thiolactone Chemical compound NC1CCSC1=O KIWQWJKWBHZMDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 1
- 229910000037 hydrogen sulfide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 150000001261 hydroxy acids Chemical group 0.000 description 1
- 239000001341 hydroxy propyl starch Substances 0.000 description 1
- 229940071826 hydroxyethyl cellulose Drugs 0.000 description 1
- 239000001863 hydroxypropyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010977 hydroxypropyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 235000013828 hydroxypropyl starch Nutrition 0.000 description 1
- 150000002466 imines Chemical class 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000037189 immune system physiology Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000008676 import Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012948 isocyanate Substances 0.000 description 1
- 150000002513 isocyanates Chemical class 0.000 description 1
- 150000002540 isothiocyanates Chemical class 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007787 long-term memory Effects 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000002398 materia medica Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 210000001806 memory b lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000000569 multi-angle light scattering Methods 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000001662 opsonic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 150000004880 oxines Chemical class 0.000 description 1
- 150000002924 oxiranes Chemical class 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 239000001814 pectin Substances 0.000 description 1
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 description 1
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 235000020030 perry Nutrition 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 229940049548 pneumovax Drugs 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920006324 polyoxymethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- FGIUAXJPYTZDNR-UHFFFAOYSA-N potassium nitrate Chemical compound [K+].[O-][N+]([O-])=O FGIUAXJPYTZDNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001814 protein method Methods 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000006268 reductive amination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 235000019192 riboflavin Nutrition 0.000 description 1
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 description 1
- 239000002151 riboflavin Substances 0.000 description 1
- AHTFMWCHTGEJHA-UHFFFAOYSA-N s-(2,5-dioxooxolan-3-yl) ethanethioate Chemical compound CC(=O)SC1CC(=O)OC1=O AHTFMWCHTGEJHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- LPXPTNMVRIOKMN-UHFFFAOYSA-M sodium nitrite Chemical class [Na+].[O-]N=O LPXPTNMVRIOKMN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- TYFQFVWCELRYAO-UHFFFAOYSA-L suberate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCCCCCC([O-])=O TYFQFVWCELRYAO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- SYLCYDCIIOFIGP-UHFFFAOYSA-N sulfane thiolan-2-imine Chemical compound N=C1SCCC1.S SYLCYDCIIOFIGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124530 sulfonamide Drugs 0.000 description 1
- 150000003456 sulfonamides Chemical class 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 229940021747 therapeutic vaccine Drugs 0.000 description 1
- UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N thiourea Chemical compound NC(N)=S UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003585 thioureas Chemical class 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000005809 transesterification reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 229940118696 vibrio cholerae Drugs 0.000 description 1
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 1
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 229920001285 xanthan gum Polymers 0.000 description 1
- 239000000230 xanthan gum Substances 0.000 description 1
- 235000010493 xanthan gum Nutrition 0.000 description 1
- 229940082509 xanthan gum Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
- A61K39/092—Streptococcus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
- A61K39/0275—Salmonella
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/07—Bacillus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55544—Bacterial toxins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6031—Proteins
- A61K2039/6068—Other bacterial proteins, e.g. OMP
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/70—Multivalent vaccine
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
本发明涉及含有目的抗原被包载在交联的载体蛋白质基质中的免疫原性组合物、制造疫苗的方法以及疫苗给药的方法,其中通过控制或筛选蛋白质基质颗粒的尺寸以消除低分子量基质颗粒(例如直径小于100nm的颗粒)而改善蛋白质基质的免疫原性,并因此改善其作为疫苗的效力。
Description
相关申请的交叉引用
本申请主张2009年9月9日递交的美国临时专利申请系列号61/276,183的优先权,在此将其整个内容全部引用作为参考。
发明领域
本发明涉及免疫原性组合物、制造疫苗的方法以及疫苗给药的方法。具体地,本发明涉及蛋白质荚膜基质疫苗,其特征在于目的抗原被包载在交联的载体蛋白质基质中,其中控制蛋白质荚膜基质的颗粒尺寸以增加组合物的免疫原性。更具体地,本发明涉及消除了低分子量基质颗粒(例如,<100nm直径)的基质疫苗制剂。在制备为具有大于100nm直径的平均颗粒尺寸直径的基质疫苗制剂中获得了免疫原性增加的优点,即考虑150nm、200nm、500nm、1微米、2微米或甚至更大的颗粒尺寸。
许多抗原,尤其是与病原体的荚膜层相关的那些抗原刺激很少或者不刺激免疫应答并且使产生针对那些抗原的有效疫苗的努力复杂化。荚膜是微生物的表面组分,其通常由有机化合物如碳水化合物、氨基酸或醇的聚合物所构成。荚膜的化学结构非常多样。构成荚膜的单体单元(例如碳水化合物)可以以多种分子构型连接在一起并且可以进一步被磷酸盐、氮、硫酸盐以及其他化学修饰所取代。完整的微生物荚膜的低免疫原性使得微生物免于宿主免疫系统的效应子细胞的作用。荚膜也可以是毒性因子,其防止微生物被宿主巨噬细胞和多形核白细胞吞噬以及杀死。
针对荚膜的抗体通过将补体固定在微生物表面而提供针对包膜化的生物体的潜在防御,这可以造成它们被噬菌性宿主免疫细胞裂解或调理、摄取以及杀死。针对微生物荚膜的最有潜能的抗体是IgG抗体。荚膜抗原由于引发不需要T辅助细胞的免疫应答并且通常并未引发长效免疫记忆反应,因此它们通常被分类为非T依赖性的抗原。蛋白质与荚膜抗原的共价偶联使得荚膜抗原为“T-依赖性的”,并且这种T-依赖性的抗原引发了辅助性T细胞介导的(Th-依赖的)IgG反应。
研究了致使抗原更具免疫原性以及更理想地T-依赖性的多种方法。微生物表面多糖片段的分离通常提供了能够引发将识别微生物荚膜中天然发生抗原的免疫应答的免疫原性抗原。也证明了抗原与载体蛋白的共价链接而提供的多价免疫原可以极大地增加抗原的免疫原性并且也促进理想的T-依赖性的免疫应答(或免疫记忆),该T-依赖性的免疫应答(或免疫记忆)造成针对具有抗原的微生物的后续感染的宿主保护。例如,非缀合的肺炎链球菌疫苗,如Merck的对于个体中的侵袭性肺炎链球菌疾病是有效的,然而它通常对于引发免疫记忆以及能允许终身免疫性及避免经常再免疫接种的理想的保护性免疫是无效的(例如,在婴儿中)。缀合疫苗如Pfizer的其多个肺炎链球菌多糖抗原缀合到蛋白质“载体”上,被证明即使在2个月大的婴儿中也具有高度的免疫原性,并且诱导T-依赖性的免疫性。
然而,尽管缀合疫苗在免疫原性上是有前途的,但是它们的制造可能极其困难复杂(并且昂贵),这极大地妨碍了它们对于世界上需要它们的所有患者以及患者群体的贡献。例如,在的情形下,令用来提供缀合用的7种多糖抗原的各肺炎链球菌(S.pneumoniae)菌株在生物反应器中生长;收获细胞;提取、纯化多糖并水解到适当大小;然后将各抗原与蛋白质载体缀合;再纯化缀合物,与通过相似方式制备的另外6种其他多糖-蛋白质复合体(缀合物)混合;最终将多-缀合混合物佐以明矾。预计在制造七价的疫苗时有超过200个GMP步骤。
近来,提出将蛋白质基质疫苗作为缀合疫苗的替代品。参见,美国专利公开2008-0095803,其在此通过引用作为参考。蛋白质基质疫苗并不是将目的抗原共价缀合到载体上,而是将抗原包载到载体蛋白质基质中,蛋白质基质疫苗是由在理想的抗原存在时通过交联载体蛋白而制备的。避免了抗原与载体蛋白的显著共价链接;相反,抗原通过在基质形成(交联反应)期间被蛋白质载体包载而仍旧与基质结合。这样的蛋白质基质疫苗显示出比单独使用抗原所制备的疫苗具有更高的免疫原性;并且蛋白质基质疫苗也可以实现在缀合疫苗中看到的那类免疫原性(以及T-依赖性的免疫性的诱导)。并且这种优点通过更少的生产缀合疫苗所需的处理步骤(例如,一半的步骤)以及复杂的缀合反应得以实现。
尽管蛋白质基质疫苗提供了若干优点,但是通过蛋白质基质疫苗引发的抗原特异性抗体的滴度通常显著低于通过相应的缀合疫苗(如果可以得到)所引发的滴度。因此,提供一种增加蛋白质基质疫苗的免疫原性的手段从而开发这一新兴技术的科学前景及制造及成本优势是本领域持续存在的技术问题。持续需要具有增强的免疫原性或潜能的改良的蛋白质基质疫苗。
发明概述
本发明涉及一种免疫原性组合物,包括(1)目的抗原和(2)载体蛋白,其中所述载体蛋白交联以形成蛋白质基质,所述目的抗原被所述蛋白质基质包载,并且所述组合物由高分子量蛋白质基质颗粒组成,例如具有平均颗粒尺寸大于100nm直径的蛋白质基质颗粒。这种组合物可通过混合抗原和载体蛋白组分,启动交联反应使载体蛋白交联,随后处理反应产物以消除较低分子量物质(例如,<100nm直径物质)而容易地制备。相比于低分子量蛋白质基质颗粒组合物或者具有包括较低分子量蛋白质基质颗粒的大范围颗粒尺寸的组合物,根据本发明的高分子量蛋白质基质颗粒的蛋白质基质疫苗组合物具有增加的免疫原性。
本发明也提供一种改善蛋白质基质疫苗组合物的免疫原性的方法,包括选择组合物的蛋白质基质颗粒尺寸以消除较低分子量颗粒(小于100nm直径)或者选择组合物的蛋白质基质颗粒尺寸以包括大于100nm直径的颗粒尺寸的步骤。根据本发明优选的组合物将具有范围在120-2000nm直径的颗粒尺寸或者将主要包括在该范围内选择的颗粒。适当的组合物可在形成含抗原的蛋白质基质后通过交联反应混合物的尺寸分级以及选择包括高分子量物质的理想组分来直接制备。
本发明的一个实施方式是含有目的抗原与载体蛋白质基质的疫苗组合物,其中抗原被载体蛋白质基质包载以形成复合物。在本发明理想的实施方式中,抗原/蛋白复合物具有高于100nm的平均颗粒尺寸直径。在本发明更理想的实施方式中,复合物具有大于120nm、大于170nm、大于200nm、大于500nm、大于1000nm、大于2000nm或者更大,例如达到收集蛋白质基质颗粒的方法学极限的平均颗粒尺寸直径。在本发明又更理想的实施方式中,疫苗组合物的蛋白质基质/抗原复合物将包含颗粒尺寸大于100nm直径的范围,例如100-2000nm直径,或者在该范围内选择,例如120-200nm、200-400nm、250-500nm、120-1000nm、200-2000nm,以及其他此种颗粒尺寸范围。在本发明又进一步理想的实施方式中,组合物包括具有170-185nm直径的颗粒尺寸的复合物。在此证明了提高平均复合物颗粒尺寸,或者从疫苗组合物中消除较小颗粒尺寸组分,造成所包载抗原免疫原性的出人意料的增加。此外,含有非常小量的抗原的较大蛋白质基质颗粒能够引发超过单独抗原(未复合的)组合物的免疫应答或与之相当的免疫应答,所述单独抗原组合物比本发明的颗粒尺寸经选择的蛋白荚膜基质组合物含有多倍(例如67倍)的荚膜抗原。
在本发明理想的实施方式中,本发明的改良的蛋白质基质疫苗组合物当给予哺乳动物时,引发哺乳动物的T细胞依赖的免疫应答(即,在疫苗接种的宿主中产生免疫记忆)。
在其他理想的实施方式中,疫苗组合物进一步包括两种或更多种的目的抗原,例如2、3、4、5、6、7、8、9和/或10种或更多种目的抗原。
本发明另一方面表征为制造疫苗组合物的方法。该方法包括(i)将目的抗原与载体蛋白混合以形成抗原和载体蛋白的混合物,(ii)用载体蛋白包载目的抗原以形成抗原/蛋白质复合物,以及(iii)选择具有大于100nm的平均颗粒尺寸直径的复合物。
在本发明优选的实施方式中,抗原/蛋白质复合物具有大于100nm的平均颗粒尺寸直径。更优选地,抗原/蛋白质基质复合物具有大于500nm的平均颗粒尺寸直径。在又进一步优选的实施方式中,抗原/蛋白质复合物具有大于1000nm的平均颗粒尺寸直径。在再进一步优选的实施方式中,抗原/蛋白质复合物具有大于1500nm的平均颗粒尺寸直径。在再进一步优选的实施方式中,抗原/蛋白质复合物具有大于2000nm的平均颗粒尺寸直径。
在本发明理想的实施方式中,免疫原性组合物包括包载在载体蛋白质基质中的目的抗原以及进一步包括可药用的赋形剂。
在优选的实施方式中,本发明表征为另一种制造疫苗组合物的方法。这一方法包括(i)将目的抗原与载体蛋白混合,(ii)加入交联物,该交联物能够在载体蛋白分子之间或者在相同载体蛋白分子的不同位点之间形成交联,(iii)启动载体蛋白和交联物之间的交联反应,以及(iv)从反应产物中选择具有大于100nm的平均颗粒尺寸直径的复合物。在交联物的反应基团和载体蛋白的反应位点会在接触时反应的某些情形下,混合以及启动步骤(ii)和(iii)将同时发生或者被当作一步。
另外,通过在步骤(iv)之前包括减弱交联反应的步骤来淬灭交联反应可能是有益的,例如,通过添加适当的淬灭剂或阻断剂。
通过下面的详细说明、附图和权利要求书,本发明的其他特征和优点将显而易见。
附图简要说明
图1是示出蛋白质荚膜基质疫苗(PCMV)组合物在CL-2B柱上的尺寸分级的色谱图,该组合物包括包载在炭疽杆菌保护性抗原的交联的显性负突变(DNI)中的肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)14型多糖抗原(PPS 14:DNI PCMV)。绘制了UV280吸收值图,示出DNI洗脱量。阴影表示收集并分池的用于后续免疫实验的组分。通过SEC-MALS-RI(用多角度激光检测器和折射系数检测器进行的尺寸排阻色谱)来测定池1的DNI平均颗粒尺寸和池2的平均颗粒尺寸。
图2是示出实施例1制备的组合物进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和考马斯亮蓝染色的图像,其示出PCMV组分的DNI载体蛋白的交联度。没有交联的未交联DNI蛋白迁移到83kDa处,组合物5)。组合物1(池1,颗粒尺寸200-120nm)、组合物2(池2,颗粒尺寸63nm)和组合物3(未分级的PCMV,使用0.25%戊二醛交联DNI)全部显示出DNI载体蛋白的广泛交联,其证据是条带向更高分子量物质迁移。组合物4(用0.05%戊二醛交联剂制备的未分级的PCMV)也显示出DNI载体蛋白的交联,只是证明了从较低分子量物质到较高分子量条带的更宽范围的条带。
图3示出DNI捕获ELISA的结果,其中用抗DNI抗体探测捕获的基质组合物以确认交联的DNI完整性并且用抗PPS 14抗体探测捕获的基质组合物来确认多糖(PPS 14)抗原在捕获的DNI基质中的包载和呈递。使所检测的制剂与固定在ELISA板上的抗DNI捕获抗体相结合。洗去未结合的物质,并且使用抗DNI抗体(A板)或抗多糖抗体(B板)来分别检测DNI基质或DNI基质内的多糖。A板示出了通过DNI捕获抗体捕获的DNI的检测以证明含有DNI的疫苗制剂被捕获抗体所结合。B板示出多糖抗原与DNI蛋白基质相缔合,如通过抗多糖特异性检测抗体所检测的。
图4是示出在用实施例1中提出的四种PCMV制剂免疫的小鼠中,抗PPS 14IgG免疫应答的柱状图。小鼠以两周的间隔免疫三次并且在免疫后10-12天收集各小鼠的血清。用5μg组合物1的蛋白质(池1,具有颗粒尺寸为直径120-200nm的PPS 14:DNI PCMV)免疫的小鼠产生了与用组合物2(池2,具有平均颗粒尺寸为直径63nm的PPS 14:DNI PCMV)免疫的小鼠相当或者比之更好的抗PPS 14IgG滴度,但是组合物1含有的多糖抗原剂量是组合物2给予的一半。
图5是示出用2μg组合物1(池1+明矾,含有0.95μg PPS 14)免疫的小鼠的抗PPS 14IgG抗体滴度与单独用2μg PPS 14抗原免疫的小鼠的抗PPS 14IgG抗体滴度相比的柱状图。小鼠以两周的间隔免疫三次并且在免疫后10-12天收集各小鼠的血清。数据证明用含有0.95μg PS的池1PCMV免疫的小鼠血清比单独用2μg PPS 14抗原免疫的小鼠的血清显示出随时间增强的PPS 14特异的IgG应答。
图6A和6B示出在实施例1的研究中第38天(血样3)的抗PPS 14IgG相互的(reciprocal)端点滴度的柱状图。图6A示出来自用组合物1(池1+明矾;含2.4μg PPS 14;颗粒尺寸范围是120-200nm)、组合物2(池2+明矾;5.0μg PPS 14;平均颗粒尺寸63nm)、组合物3(整个PCMV,用0.25%戊二醛交联)、组合物4(整个PCMV,用0.05%戊二醛交联)和抗原对照(单独PPS 14;5μg)的5μg蛋白质免疫小鼠的滴度。图6B示出来自用2μg的组合物1(池1+明矾,含0.95μg PPS)的蛋白质或单独用2μg的PPS 14免疫小鼠的血清在第38天(血样3)的数据。数据证明相比于用0.05%戊二醛制备的PCMV免疫的小鼠(其导致较少的高度交联的DNI载体和较小的颗粒尺寸),以及相比于单独用多糖抗原免疫的小鼠,抗PPS14IgG应答在用具有高度交联的载体蛋白的PCMV制剂(即,在形成反应时使用0.25%戊二醛的PCMV组合物或组分)免疫的小鼠中显著更高。
图7是示出使用伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)多糖抗原Vi和DNI载体蛋白制备的PCMV的分级色谱图。绘制了从CL-2B交联的琼脂糖凝胶柱洗脱的Vi:DNI反应产物的UV280吸收值。通过从x轴起始的短垂线示出所收集的组分。阴影面积表示收集并组合用于制造池1-4的组分。各池的颗粒尺寸通过动态光散射(DLS)来测定,这表示出混合物中含有的最大的颗粒尺寸,并且于各池上方列出颗粒尺寸(nm)。对于池1,颗粒尺寸计算为直径179nm。池2的颗粒直径为171nm。池3的颗粒直径为198nm,并且池4的颗粒直径计算为185nm。
图8是示出测量用按实施例2描述制备的四种PCMV制剂:池1+明矾(颗粒尺寸179nm)、池2+明矾(颗粒尺寸171nm)、池3+明矾(颗粒尺寸198nm)、池4+明矾(颗粒尺寸185nm)、整个(未分级的)PCMV(0.25%戊二醛)以及抗原对照制剂(10μg Vi抗原单独)免疫的小鼠抗Vi IgG免疫应答的分析检测结果的柱状图。
图9是示出分别用实施例2所述的PCMV制剂之一免疫的小鼠,相比于单独用荚膜抗原免疫的小鼠在第38天的抗Vi IgG端点滴度的柱状图。
图10是使用肺炎链球菌14型多糖抗原以及使用0.25%戊二醛交联的DNI载体蛋白的PCMV制剂的分级色谱图。在CL-2B交联的琼脂糖尺寸排阻柱上分离组分。对蛋白质的UV280吸收值绘图。通过从x轴起始的短垂线示出所收集的组分。阴影面积表示收集并组合用于池1、2、3和4的组分。
图11是考马斯亮蓝染色的SDS聚丙烯酰胺电泳凝胶(4-12%Bis-Tris凝胶)的图像,阐释了实施例3所述的PPS 14:DNI PCMV组合物的交联完整性。四个PCMV池和整个(未分级的)PCMV反应混合物全部显示出DNI载体蛋白的广泛交联,证据是没有向浓缩胶的迁移。对于池4,在孔下方的拖尾的出现,与整个PCMV反应的孔下方的拖尾相似,表明在这些样品中存在较低分子量的物质。
图12示出DNI捕获ELISA的结果以及使用抗PPS 14或抗DNI检测抗体探测以确认多糖抗原的包载以及DNI交联完整性。用固定的DNI捕获抗体来孵育不同浓度的PPS 14:DNI PCMV池(池1-4;参见,实施例3和图10),整个PCMV反应混合物,或者具有外源性添加的PPS 14多糖的交联的DNI。图12A示出在捕获及冲洗后仍旧与交联的DNI蛋白基质缔合的PPS 14的检测;图12B示出由固定的DNI捕获抗体捕获的DNI的检测以确认ELISA中捕获的颗粒是由DNI构成。
图13是示出用实施例3所述的PCMV制剂免疫的小鼠,相比于单独用抗原对照PPS 14或者用缀合疫苗免疫的小鼠,抗PPS 14IgG免疫应答的柱状图。图13A示出来自用含有0.5μg的DNI和不同量的包载抗原(即,0.03μg的PPS 14(池1)、0.06μg的PPS 14(池2)、0.13μg的PPS 14(池3)以及0.48μg的PPS 14(池4))的PCMV,相比于整个PCMV、单独的0.5μg的PPS 14或者(含有2μg的PPS 14)所免疫的小鼠的PPS 14特异性IgG。图13B示出来自用含有2μg的DNI和不同量的包载抗原(即,0.12μg的PPS 14(池1)、0.22μg的PPS 14(池2)、0.52μg的PPS 14(池3)以及1.91μg的PPS 14(池4))的PCMV,相比于整个PCMV、单独的2μg的PPS 14或者(含有2μg的PPS 14)所免疫的小鼠的PPS 14特异性IgG。端点滴度截留计算为比阴性对照(预免疫血清)的平均值高2个限定值(standard deviations)的滴度。含有较大尺寸的DNI载体颗粒的池1和2在显著少的PPS 14抗原剂量时,都引发与缀合疫苗引发的相当的抗PPS 14应答。
图14示出在完成实施例3所述的0.5μg免疫方案后,从血样3(第39天)收集的个体血清的抗PPS 14IgG端点滴度。用PCMV池1(0.5μg DNI、0.03μg PPS 14)和池2(0.5μg DNI、0.06μg PPS14)免疫的小鼠相比于用免疫的小鼠产生了相当量的抗PPS 14特异性IgG GMT。用PCMV免疫相比于用缀合疫苗免疫,递送放了显著降低的PPS 14抗原量,而引发显著的抗PPS14特异性IgG应答,并且在池1和2的情况下相当的抗PPS14特异性应答,与由在所用的制剂中含有的2μg剂量的PPS 14引发的应答相当。
图15示出在完成实施例3所述的2μg免疫方案后,从血样3(第39天)收集的个体血清的抗PPS 14IgG端点滴度。用PCMV池1(0.5μg DNI、0.12μg PPS 14)和池2(0.5μg DNI、0.22μg PPS14)免疫的小鼠相比于用缀合疫苗免疫的小鼠产生了相当量的抗PPS 14特异性IgGGMT。用PCMV免疫相比于用缀合疫苗免疫,递送了显著降低的PPS 14抗原量,而引发显著的抗PPS14特异性IgG应答,并且在池1和2的情况下相当的抗PPS14特异性应答,与由在所用的制剂中含有的2μg剂量的PPS 14引发的应答相当。与图14所见的结果相似,用包括大的颗粒尺寸的DNI基质的PCMV组分进行免疫在显著降低的PPS 14剂量下,相比在情形下用2μg PPS 14剂量诱导的滴度,引发了相当的抗PPS 14特异性IgG应答。
图16是实施例4所述的Vi:DNI PCMV制剂在CL-2B交联的琼脂糖凝胶柱上的分级色谱图。对在UV280的吸收值绘图。通过从x轴起始的短垂线示出所收集的组分。阴影面积表示收集用于池1、2、3和4的组分(参见实施例4)。
图17示出DNI捕获ELISA来确认Vi抗原在交联的DNI基质中的包载和缔合的结果。图17A示出通过抗Vi检测抗体检测的仍旧与DNI基质蛋白缔合的Vi。图17B示出通过DNI捕获抗体捕获的DNI的检测。
图18是考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶(4-12%Bis-Tris凝胶)的图像,阐释了实施例4所述的Vi:DNI PCMV组分池和整个PCMV的交联完整性。该PCMV分离的组分和整个PCMV反应混合物含有非常高分子量的物质,未看出它们迁移到凝胶中而是保留在上样孔中。未交联的DNI(对照)在电泳后显示出低分子量条带(无标记的箭头)。
图19是示出在用实施例4所述的PCMV和对照制剂免疫的小鼠中,抗Vi IgG免疫应答的柱状图。示出了从血样1(第8天)、血样2(第22天)和血样3(第41天)收集的个体血清的抗Vi IgG端点滴度。对池1-4和整个PCMV,用含有10μg的DNI的具有未测定剂量的Vi的PCMV制剂免疫的小鼠测定Vi特异性IgG应答。小鼠对照组用5μg在Vi-BSA缀合物中含有的Vi或用10μg源自伤寒沙门氏菌或弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)的Vi多糖抗原单独免疫。来自用较大载体基质颗粒(池1-3)免疫的小鼠的血清产生出比来自单独用10μg Vi免疫的小鼠的血清更高的Vi特异性IgG应答。用池4(较小颗粒)或整个PCMV免疫产生了与当单独用Vi免疫小鼠时相似的Vi特异性抗体应答。
图20是示出实施例4中所述的四种PCMV和对照制剂的抗Vi端点滴度的柱状图。在完成免疫方案后,从血样3(第41天)收集的单个血清测定抗Vi IgG端点滴度。
图21是示出抗PPS 14IgG/IgM比的柱状图。收集来自第10、54、239、243和260天血样的数据并分析PPS 14特异性IgG和IgM以及计算IgG/IgM比。对于池1和池2组观察到的随着免疫过程中高且增加的IgG/IgM比是免疫“记忆”应答的指示。对照随着时间变弱的应答以及低的IgG/IgM比指示由含有单独的多糖抗原的制剂并未诱导出免疫记忆。
发明详细说明
蛋白质基质疫苗,尤其是蛋白质荚膜基质疫苗(PCMV)描述于2008年2月21日公开的国际专利公开WO 2008/021076(Mekalanos),以及2008年4月28日公开的美国专利公开号US 2008-0095803(Mekalanos),它们在此都通过整体引用作为参考。这些出版物教导了蛋白质基质疫苗具有典型的PS-蛋白缀合疫苗的潜在免疫特性,但是理想地不同于缀合疫苗,蛋白质基质疫苗不需要显著的共价键合来将目的抗原结合到载体蛋白。相反,目的抗原,例如多糖、荚膜有机聚合物或其他抗原被包载在载体蛋白基质中。
当病原体的荚膜生物聚合物或多糖被包载在交联的蛋白质基质中时,这种疫苗被称作蛋白质荚膜基质疫苗(PCMV)。如在WO 2008/021076和US 2008-0095803中所述,产生的PCMV为包括基于模式非T依赖的荚膜抗原、聚γ-D-谷氨酸(PGA)以及海藻酸(藻酸盐)和葡聚糖,以及示例性载体蛋白、显性负抑制物突变体(DNI)的一类。DNI是炭疽杆菌(B.anthracis)的保护性抗原(PA)的一种突变形式并且通过Benson等人,Biochemistry,37:3941-3948(1998)的方法由大肠杆菌产生。
本发明涉及对于增强蛋白质基质疫苗组合物的免疫原性所作的发现与观察。
为了更清楚地理解本发明,按下述定义使用下面的缩写和术语。
在此描述的组合物或方法“包括”一种或多种命名的元件或步骤是开放式的,意指所命名的元件或步骤是必需的,但是在该组合物或方法的范围内也可加入其他元件或步骤。为了避免冗长,也应理解描述为任何组合物或方法“包括”(或者“包括了”)一种或多种命名的元件或步骤也就描述了相应的更加被限定的“主要由相同的所命名的元件或步骤组成”的组合物或方法,意味着该组合物或方法包括所命名的必需元件或步骤并且也可包括实质上不影响该组合物或方法的基本特性以及新特性的其他元件或步骤。也应理解在此描述为“包括”一种或多种命名的元件或步骤或者“主要由”一种或多种命名的元件或步骤“组成”的任何组合物或方法也就描述了相应的更加被限定的并且是封闭式的“由”一种或多种命名的元件或步骤“组成”的组合物或方法以排除任何其他未命名的元件或步骤。在此所公开的任何组合物或方法中,任何命名的必需元件或步骤的已知的或者公开的等效物可替代该元件或步骤。也应理解元件或步骤“选自由..组成的组”指在随附列表中的一种或多种元件或步骤,其包括所列元件或步骤的任何两种或更多种的组合。
本文结合疫苗组合物使用的术语“给予”意指向诸如人受试者的受试者以足以诱导受试者免疫应答的剂量提供疫苗组合物,该免疫应答造成特异结合该疫苗组合物中含有的抗原的抗体的产生(即,在治疗疫苗中,该抗原相当于病原体上的抗原标记)。理想的给药包括肌内注射、皮内注射、静脉内注射、腹膜内注射、皮下或经皮注射、吸入或摄取,视待给予的疫苗组合物的剂型和性质及活性而定。给药可包括单次给予疫苗或者以多剂量给予疫苗。理想地,二次(“加强剂”)给药被设计为抗体在受试者中的加强产生以防止传染原的感染。疫苗剂量的频率和数量取决于疫苗的比活性并且可由常规实验容易地测定。
术语“交联”指两分子、大分子或分子组合(例如载体蛋白分子)之间,或同一分子的两位点之间(例如同一蛋白质的两氨基酸残基之间),直接(当使用“0长度”接头,其产生直接的键)或通过使用在两反应位点之间形成分子桥或连接的双功能交联物分子,形成共价键。双功能交联物展现出两个功能性基团,各能够与两分开的分子之一或在同一分子的两分开的基团之一形成共价键(即,以便在诸如载体蛋白的分子内形成“环”或“折叠”)。示例性的接头包括能够交联两个载体蛋白的双功能交联物。
本文使用的术语“抗原”指被抗体或抗体片段特异性结合的任何的分子或分子组合。
本文使用的术语“双功能交联物”或“双功能接头”意指具有两个功能性基团的化合物,各功能性基团单独地能够与想要被连在一起的两个分开的分子、原子或分子集上的反应性基团形成共价键。示例性的双功能接头描述于,例如G.T.Hermanson,Bioconjugate Techniques(AcademicPress,1996)以及Dick and Beurret,"Glycoconj ugates of BacterialCarbohydrate Antigens,"在Conjugate Vaccines(Cruse and Lewis编著),Contrib.Microbiol.Immunol.Basel,Karger,1989,vol.10,pp.48-114)。理想地,双功能接头是戊二醛、双磺琥珀酰亚胺辛二酸酯或二甲基己二酸(dimethyl adipimidate)。
本文使用的术语“接头”或“交联物”指能够形成连接两个或更多个分子或者同一分子的两个或更多个位点的共价化学键或桥的化合物。理想的接头包括,例如戊二醛或通式OHC-R-CHO的其他二醛,其中R是1-12个碳原子的线性或分支的二价亚烷基,1-12个原子的线性或分支的二价杂烷基,2-12个碳原子的线性或分支的二价亚烯基(alkenylene),2-12个碳原子的线性或分支的二价亚炔基(alkynylene),5-10个碳原子的二价芳基基团,3-10个原子的环体系,-(CH2CH2O)qCH2CH2-,其中q是1-4,或者连接两个醛基团的直接的化学键。连接可以是直接的而不使用连接(桥接)分子。例如,可使用碳二亚胺化学物或使用酶促催化游离氨基酸与甲酰胺基团(例如Gln的甲酰胺基团)交联的转谷氨酰胺酶,使羧基(例如在载体蛋白的Asp或Glu残基的侧链上的羧基),直接与游离氨基酸(例如在Lys残基的侧链上的游离氨基酸)相连。
在引发抗体产生的上下文中的术语“加强”指在二次暴露于抗原期间发生的记忆B细胞的活化。这也称作“加强剂应答”并且指示长期的“二级”记忆免疫应答,造成长期的抗体产生。
在疫苗组合物的上下文中的术语“载体蛋白”指用于疫苗组合物中诱发对自身的免疫应答和/或对与此载体蛋白相缔合的或相复合的抗原进行免疫应答的蛋白质。在蛋白质基质疫苗组合物中,抗原与载体蛋白缔合,所述载体蛋白交联以形成蛋白质基质,由此包载的抗原与载体蛋白形成复合物,优选抗原与基质没有显著的共价连接。在缀合疫苗组合物中,抗原与载体蛋白反应,以便通过设计使抗原和载体蛋白彼此共价连接。理想地,载体蛋白含有由T细胞识别的表位。“载体蛋白”的定义中还包括多抗原肽(MAP),它们是支链肽。理想地,MAP包括赖氨酸(Lys),示例性的理想载体蛋白包括毒素和类毒素(化学的或遗传的),它们可突变,例如以降低反应原性。适当的载体蛋白包括,例如,白喉毒素或其突变体、白喉类毒素、破伤风毒素或其突变体、破伤风类毒素、铜绿假单胞菌外毒素A或其突变体、霍乱毒素B亚基、破伤风毒素片段C、细菌鞭毛蛋白、肺炎链球菌溶血素、李斯特菌溶胞素O(LLO,以及相关分子)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)的外膜蛋白、铜绿假单胞菌Hcp1蛋白、大肠杆菌热不稳定肠毒素、志贺样毒素、人LTB蛋白、来自整个细菌细胞的蛋白质提取物、炭疽杆菌(Bacillus anthracis)的保护性抗原的显性负抑制物突变体(DNI)或者大肠杆菌β-半乳糖苷酶或任何能够通过接头交联的其它蛋白质。
本文参考抗原使用的术语“包载的”意指抗原与载体蛋白(特别是交联形成基质的载体蛋白)的缔合或复合,所述基质与抗原形成缔合或者复合物,以便在生理水平下,抗原仍被保留在含有载体蛋白的该复合物中。理想地,抗原被包载在含载体蛋白的复合物中,而在抗原与载体蛋白之间没有显著的共价结合。如在此使用,没有显著的共价结合指不超过50%的抗原与载体蛋白共价结合。理想地,不超过40%、不超过30%、不超过20%、不超过10%,或者理想地,不超过5%的抗原与蛋白质基质疫苗组合物中的载体蛋白共价结合。
“感染”意指微生物,例如细菌、真菌、寄生虫或病毒对受试者的入侵。该感染可包括例如,通常存在于受试者体内或身体上的微生物的过度繁殖或者通常不存在于受试者体内或身体上的微生物的过度繁殖。当在受试者体内或身体上存在不想要的(例如病原性)过度的微生物群或者当该微生物群的存在正损害细胞或者造成受试者的组织的病理症状时,受试者罹患微生物感染。
“传染原”意指造成感染的微生物。
术语“免疫原性的”指诱导受试者的免疫应答的化合物。理想地,免疫应答是涉及IgG抗体产生的T细胞依赖的免疫应答。
术语“微生物荚膜聚合物”指存在于微生物的荚膜包被中或上的聚合物。理想地,微生物荚膜聚合物是有机聚合物,例如多糖、磷酸多糖、氨基糖具有N乙酰基取代的多糖、含有磺酰化糖的多糖、另一硫酸修饰的糖,或者磷酸修饰的糖、多元醇、多氨基酸、磷壁酸或者脂多糖的O侧链。
“单体”指能够与相似单体形成两个或更多个键、通常在成为“聚合物”一部分时,产生一条或一系列分支的、相连的重复单体亚结构链的分子结构。
“有机聚合物”指有共价连接的单体组成的聚合物,各单体由碳、氧、氢或氮原子或磷酸或硫酸部分组成。理想地,有机聚合物是多糖、磷酸多糖、氨基糖具有N乙酰基取代的多糖、含有磺酰化糖的多糖、另一硫酸修饰的糖,或者磷酸修饰的糖、糖、多元醇、多氨基酸、磷壁酸或者脂多糖的O侧链。
“多元醇”意指碳水化合物的氢化形式。所述碳水化合物羰基被还原成初级或二级羟基。示例性的多元醇是聚环氧烷(PAO),例如聚亚烷基二醇(PAG)包括聚亚甲基二醇、聚乙二醇(PEG)、甲氧基聚乙二醇(MPEG)和聚丙二醇;聚乙烯醇(PVA);聚乙烯马来酸酐共聚物;聚苯乙烯马来酸酐共聚物;葡聚糖包括羧甲基葡聚糖;纤维素;包括甲基纤维素,羧甲基纤维素,乙基纤维素,羟乙基纤维素羧乙基纤维素以及羟丙基纤维素;壳聚糖的水解产物;淀粉例如羟乙基淀粉和羟丙基淀粉;糖原;琼脂糖及其衍生物;瓜尔豆胶;支链淀粉;胰岛素;黄原胶;角叉菜胶;果胶;藻酸水解产物;山梨醇;葡萄糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、古洛糖、木糖、苏阿糖、山梨糖、果糖、甘油、麦芽糖纤维二糖、蔗糖、直链淀粉、支链淀粉的醇;或者单丙二醇(MPG)。
“多氨基酸”意指通过肽键连接的至少两个氨基酸。理想地,多氨基酸是含有重复的氨基酸序列或相同的氨基酸链(即同聚物)的肽。
术语“还原希夫碱”指将偶氮甲碱或通式R1R2C=N-R3(其中R1、R2和R3是化学亚结构,通常含有碳原子)的化合物暴露于还原剂,所述还原剂用氢原子使希夫碱的双键饱和。还原的方法是本领域技术人员已知的。
本文参照抗体或其部分使用的术语“特异地结合”意指抗体或抗体片段对特定抗原(例如蛋白质或其节段)相对于等量的任何其他抗原的增加的亲和性。如使用标准方法如酶联免疫吸附检测(ELISA)所测定的,抗体或抗体片段理想地对于其抗原的亲和性比对等量任何其他抗原(包括相关的抗原)高至少2倍、5倍、10倍、30倍或100倍。
“受试者”意指能够被微生物感染的动物。理想地,受试者是哺乳动物,例如人类、猴、狗、猫、小鼠、大鼠、牛、绵羊、山羊或马。人受试者可为成人、儿童、婴儿、幼儿或青春期前的儿童。
“非T细胞依赖的抗原”指无T淋巴细胞协作的情况下造成抗体产生的抗原。非T细胞依赖的抗原在无T淋巴细胞协作的情况下可直接刺激B淋巴细胞。示例性的理想的非T细胞依赖的抗原包括荚膜抗原聚-γ-D-谷氨酸(PGA)、藻酸(藻酸盐)、葡聚糖、多糖(PS)、多氨基酸、多元醇和核酸。
本发明的蛋白质基质疫苗组合物不需要旨在引起免疫应答的抗原与用于形成基质的载体蛋白之间的共价链接。这有益地简化了蛋白质基质疫苗组合物的制备,相比于缀合疫苗技术降低了它们的制备成本。多糖(PS)-蛋白质缀合疫苗被证明在发展中国家的生产和销售是过于昂贵的。常规的缀合疫苗由于每种疫苗所需的高度特异化的化学性质以及PS抗原和载体蛋白两者的生产和纯化的费用而非常难于廉价生产。
根据本发明的疫苗组合物满足了可以安全地诱导针对以前棘手的抗原的免疫性的疫苗的需要。在此所述的疫苗组合物可以是单价的(具有一个抗原来诱导免疫应答)或多价的(具有多个抗原来诱导多个免疫应答)。含有Toll样受体(TLR)配体的疫苗组合物显示出引起对于本来棘手的抗原的免疫应答,但是它们有不安全的倾向,这是因为TLR配体即使是小剂量也通常是促炎性的、有毒的,是致反应性的,并且相比于本发明的组合物可能造成不良症状。
其他术语的含义将通过其所出现的上下文得以理解或者是按照包括有机化学、药物学、微生物学、蛋白质生物化学以及免疫学领域在内的本领域技术人员(包括从业者)的理解。
本发明涉及免疫原性组合物,包括(1)目的抗原和(2)至少一种载体蛋白,其中所述载体蛋白交联以形成蛋白质基质,所述目的抗原被所述蛋白质基质包载,并且所述组合物由高分子量蛋白质基质颗粒组成,例如具有平均颗粒尺寸大于100nm直径,理想地平均颗粒尺寸在100-2000nm直径范围或更大的蛋白质基质颗粒。这种组合物可通过混合抗原和载体蛋白组分,启动交联反应使载体蛋白交联,随后处理反应产物以消除较低分子量物质(例如,<100nm直径物质)来容易地制备。已经发现生产具有大蛋白质基质颗粒尺寸,例如>100nm直径,的蛋白质基质疫苗组合物造成被运载的(被包载)抗原免疫原性的增加。此外,通过增加蛋白质基质颗粒尺寸得到的免疫原性的改善由于颗粒尺寸增加而变得更明显,以至于在此考虑大于200nm直径、300nm直径、500nm直径、750nm直径或1000nm(1μm)直径或更大的颗粒。相比于低分子量蛋白质基质颗粒组合物或者具有包括较低分子量蛋白质基质颗粒的大范围颗粒尺寸的组合物,根据本发明的高分子量蛋白质基质颗粒的蛋白质基质疫苗组合物具有增加的免疫原性。
特别地,本发明表征为高分子量蛋白荚膜基质颗粒的蛋白质荚膜基质疫苗组合物以及制造及给予此种组合物以提供针对抗原的免疫的方法,特别是非T细胞依赖的抗原或者通常引起弱免疫应答的抗原,如多糖(PS)、多元醇、多氨基酸以及其他有机聚合物。本发明的疫苗组合物具有典型的PS-蛋白质缀合疫苗的潜在免疫特性但理想地与缀合疫苗的不同在于本发明的疫苗组合物不需要显著的共价原子键合来将目的抗原(如PS或荚膜有机聚合物)与载体蛋白偶联。相反,目的抗原,如PS或荚膜有机聚合物被载体蛋白质基质包载。例如,蛋白质基质可通过在可溶性抗原(如PS或荚膜有机聚合物)存在下,使载体蛋白分子自身共价交联来形成。彼此高度交联的载体蛋白可以形成能够捕获抗原并促进在免疫细胞中摄取该抗原以及刺激抗体产生的基质。如在此所证明,蛋白质荚膜基质疫苗组合物的免疫原性进一步通过选择该组合物的蛋白质基质颗粒尺寸来消除较低分子量颗粒(小于100nm直径)或选择该组合物的蛋白质基质颗粒尺寸以包括大于100nm直径的颗粒尺寸来被增强。
载体蛋白质基质可为包围抗原的“筛网”的形式,或者是一系列的“链上的珠”的形式,在这一类比中,抗原是“链”,蛋白质或交联的蛋白质的复合物是“珠”。如果载体蛋白包围抗原以绕着抗原形成环或者抗原被缠结在其中的三维筛网,那么抗原被包载在载体蛋白中。
在理想的实施方式中,载体蛋白的分子共价交联,例如,共价链接含有在赖氨酸侧链的一级氨基和天冬酰胺或谷氨酰胺侧链的羧基之间的肽键。在其他理想的实施方式中,共价交联可以使用诸如通式为OHC-R-CHO的化合物的交联物来启动,其中R是1-12个碳原子的线性或分支的二价亚烷基,1-12个碳原子的线性或分支的二价杂烷基,2-12个碳原子的线性或分支的二价亚烯基(alkenylene),2-12个碳原子的线性或分支的二价亚炔基(alkynylene),5-10个碳原子的二价芳基,3-10个原子的环体系,-(CH2CH2O)qCH2CH2-,其中q是1-4,或者连接两个醛基的直接的化学键。在优选的实施方式中,使用戊二醛作为交联物形成共价链接,或者替代地,可使用诸如3-马来酰亚胺基苯甲酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester)、碳二亚胺或双重氮联苯胺(bis-biazotized benzidine)、双磺琥珀酰亚胺辛二酸酯(bis[sulfosuccinimidyl]suberate)或二甲基己二亚酰胺化物(dimethyladipimidate)的试剂。尽管在形成蛋白质基质疫苗组合物时并不需要,但是目的抗原可共价结合到载体蛋白,例如,达到与交联的载体蛋白质基质偶然形成共价结合的程度,例如,由于可能存在于抗原上的未被阻断的反应性基团或末端氨基或羧基或羟基。总体上,抗原与载体的共价链接并不是形成蛋白质基质疫苗的目的。出于本发明的目的,蛋白质基质疫苗是不超过50%的抗原共价链接到载体蛋白的疫苗组合物。
在理想的实施方式中,抗原和载体蛋白是非共价链接的。这种非共价链接可包括疏水相互作用、离子相互作用、范德华相互作用或者氢键。非共价链接可以包括非共价缔合抗原与蛋白复合物的物理几何构象(即,如在上面的类比中的“链上的珠”)。
本发明的疫苗组合物可使用在任何目的抗原存在下,交联许多可能的载体蛋白中的任何的许多可能的接头中的任何来制备。在此讨论示例性和优选的接头、载体蛋白以及目的抗原。
多糖(PS)是糖的聚合物。来自微生物荚膜的PS是参与针对诸如脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)以及B型流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)的包膜化细菌病原体的保护性免疫的初级抗原组分。用基于微生物多糖的疫苗免疫青少年和成年人已经成功用于降低疾病负担,但是被证明在对婴儿和幼童(即年龄小于24个月的儿童)提供保护性免疫不很有效。幼童没有产生成熟的适应性免疫谱库而非T细胞依赖的抗原(例如荚膜PS)的免疫原性差并且在这种年幼的疫苗接受者中不会产生长期的保护性免疫应答(即免疫记忆反应)。
非T细胞依赖的抗原如多糖可以通过多糖与蛋白质的化学偶联而转变成T细胞依赖的抗原。这一过程,被称作“缀合”,涉及在多糖结构中的原子与“载体”蛋白中存在的氨基酸的侧链原子之间的共价键的形成。此种“缀合疫苗”更有效地促进B细胞成熟以及同工型转换的诱导,产生具有正确的抗-PS保护特征的更高水平的抗体。保护性抗体对它们的多糖抗原具有高亲和性并且通常是免疫球蛋白G(IgG)亚类,即具补体固定且调理作用效应子活性的长寿抗体。
非T细胞依赖的抗原通常不刺激持久的免疫性,即IgG抗体的产生,但是可刺激较低潜能且更短暂的IgM抗体的产生。如此,多糖抗原单独通常不会产生IgG的加强反应。然而,如果以PS-蛋白缀合物进行初级免疫,那么由于该缀合物诱导的记忆细胞已经被编程来生产IgG,所以多糖确实产生增强反应。事实上,在疫苗接种的动物或人类中的加强反应被认为是由于暴露于展示PS的微生物而模拟保护性反应;在免疫受试者被免疫后,这一长期记忆对于疫苗发挥对被免疫受试者提供多年的保护性免疫功能是至关重要的。因此,PS-蛋白缀合物由于(1)它们诱导针对PS抗原的高水平IgG的能力,以及(2)它们诱导针对PS抗原的记忆免疫应答的能力而得到重视。多糖抗原通常不展示它们的特性并且因此是较差的抗原。合成缀合疫苗的难度以及它们的生产成本减缓了用于众多细菌疾病的缀合疫苗的开发,其中所述疫苗对于多糖抗原的免疫应答可为保护性的。
其他非T细胞依赖的抗原包括氨基酸的同聚物,例如聚-γ-D-谷氨酸(PGA),和多元醇。大多数生物聚合物是非T细胞依赖的抗原。聚合物由于其化学结构的重复本质(以及因此的表位)而可以交联识别它们的B细胞上的免疫球蛋白(Ig)受体。因此,聚合物可以活化B细胞以与多糖所采用的相同方式来生产抗聚合物IgM。例如,一种氨基酸同聚物,炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)的聚-γ-D-谷氨酸(PGA),是免疫原性差的荚膜聚合物并且也是非T细胞依赖的抗原。由缀合到蛋白载体的PGA构成的疫苗是具有高度免疫原性的,能够诱导抗-PGA IgG以及对于PGA的免疫记忆。因此,就它们的免疫原性而言,多数聚合物像PS一样反应,因为它们不能被加工并呈递在MHC-II背景中,因此不能募集T辅助细胞。在一些与另一类称作Toll-样受体(TLR)的受体相互作用的天然发生的聚合物中发现了例外。TLR一旦被激活就可以诱导宿主细胞产生细胞因子并产生适应性免疫应答的改变。一些PS共价地结合TLR配体或被这些配体沾染。例如,脂多糖(LPS)是具有高度免疫原性的且诱导IgG及记忆反应的PS;LPS的脂A部分是TLR配体并且可能负责免疫特性。
由于PS抗原和载体蛋白两者的生产及纯化成本以及参与各多糖-蛋白缀合的特异化学反应,因此难于便宜地生产常规缀合疫苗。通常,在缀合化学反应能以合理的偶联效率执行之前,需要PS抗原和载体蛋白两者都非常纯。通常,缀合化学反应必须是为化学性质独特的各种PS以及已被选择的载体蛋白特异开发的。这一偶联化学反应在PS中引入官能团,该官能团然后可以通常通过赖氨酸残基的ε氨基侧链而连接到载体蛋白上。PS引入此种偶联基团的化学修饰可以破坏PS上的表位并引入新的表位(例如,与接头或者经修饰的糖基相关联),其意义只能通过执行仔细的免疫分析来评估。此外,对于常规的PS-蛋白质缀合疫苗,PS的大小、每个蛋白质载体分子缀合的PS分子的数目、所选载体的性质以及键接化学反应的类型都可以影响缀合疫苗的免疫原性。如此,例如,在90+已知的血清型各具有不同的PS结构的肺炎链球菌疾病(Bentley等人,PLOSGenetics 2(3):e31262-269,2006)的情形下,一种单一的缀合方法可能不能适于所有的血清型。
可再生地合成具有可再生的免疫特性的缀合疫苗涉及对PS的大小、每个蛋白质载体分子缀合的PS分子的数目、所选载体的性质以及连接化学反应的类型的仔细控制,并且这接下来显著增加缀合疫苗的制造成本。
抗生素抗性的出现凸显了开发安全且有效的疫苗的紧迫性。使疫苗在大范围内可利用,特别是用于发展中国家,需要疫苗的制造也是低成本的。将针对于来自一种或多种细菌物种的不同血清型的许多多糖抗原的组合的缀合疫苗整合到童年免疫方案中将简化在该高风险群体中的疫苗给予。然而,目前的缀合疫苗技术并非低成本的,并因此,组合缀合疫苗由于其高成本而实际上不可能被推广到发展中国家。
在理想的实施方式中,本发明的免疫原性疫苗组合物是蛋白质荚膜基质疫苗(PCMV),其中,一种或多种细菌荚膜组分被包载到具有颗粒尺寸范围大于100nm直径,优选在100nm至2000nm直径的范围的交联的载体蛋白质基质中,或者将主要包括在该范围内所选的颗粒。PCMV可以容易地被制造,这是因为需要作为起始材料的目的抗原(例如荚膜)不必被水解成较小片段,且可能能使多个多糖同时被包载。
由于本发明的制造疫苗的方法不需要任何关于目的抗原(例如,荚膜多糖)的化学性质的知识,因此该方法不依赖于开发与目的抗原以及载体蛋白的化学性质相容的交联化学物。尽管存在着一些抗原可能不与交联物相互作用的可能,但是这将不会降低疫苗的效力,因为不管怎样,都会认为目的抗原与载体蛋白的不期望的交联具有免疫原性。在本发明的疫苗中,目的抗原与载体蛋白的交联并非疫苗有效所需。这与常规的缀合疫苗形成了鲜明对比,由于常规的缀合疫苗需要目的抗原与载体蛋白的交联因此损害了它们的制造及开发。本发明的疫苗理想地具有至少,例如1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%或者甚至100%的载体蛋白被交联,并且不超过,例如50%、40%、30%、25%、20%、15%、10%、5%或1%的目的抗原与载体蛋白交联。理想地,不超过10%的抗原与载体蛋白交联并且至少50%的载体蛋白被交联。
如本文所讨论,相比于低分子量蛋白质基质颗粒的组合物或者具有包括较低分子量蛋白质基质颗粒的广范围的颗粒尺寸的组合物,根据本发明的高分子量蛋白质基质颗粒的蛋白质基质疫苗组合物具有增加的免疫原性。因此,在将抗原与载体蛋白组分混合并启动交联反应以造成载体蛋白交联后,理想地进一步处理反应产物以消除较低分子量的物质(例如,<100nm直径物质)或者通过选择组合物的蛋白质基质颗粒尺寸以包括颗粒尺寸大于至少100nm直径。根据本发明优选的组合物将具有120-2000nm直径的颗粒尺寸范围或者将主要包括从该范围内选择的颗粒。在本发明理想的实施方式中,蛋白质基质疫苗组合物将具有平均颗粒尺寸直径大于120nm、大于170nm、大于200nm、大于500nm、大于1000nm、大于2000nm或甚至更大,例如达到收集蛋白质基质颗粒的方法学极限的蛋白质基质颗粒的蛋白质基质颗粒。在本发明又更理想的实施方式中,本发明的免疫原性组合物由颗粒尺寸大于100nm直径的范围,例如100-2000nm直径,或者在该范围内选择,例如120-200nm、200-400nm、250-500nm、120-1000nm、200-2000nm,以及其他这种颗粒尺寸范围的蛋白质基质/抗原复合物组成。在本发明又进一步理想的实施方式中,组合物包括颗粒尺寸为170-185nm直径的复合物。如本文所讨论,提高平均复合物颗粒尺寸,或者从疫苗组合物中消除较小颗粒尺寸组分,对于被包载的抗原可以产生出免疫原性的出人意料的增加。此外,含有非常小量的抗原的较大蛋白质基质颗粒能够引发超过单独抗原(未复合的)组合物的免疫应答或与之相当的免疫应答,所述单独抗原组合物比本发明的颗粒尺寸经选择的蛋白荚膜基质组合物含有多倍(例如67倍)更多的抗原。
理想的尺寸颗粒可以通过任何适当的手段来分级,包括尺寸排阻色谱(SEC),随后将较大尺寸的颗粒集中并丢弃较小尺寸的颗粒。替代地,可以使用对分子量截留进行充分选择的过滤膜来除去较小尺寸的颗粒同时保留理想尺寸的颗粒。可以通过任何已知的手段,例如色谱,包括尺寸排阻色谱(SEC)、凝胶过滤色谱或者凝胶渗透色谱,完成较小分子量物质(例如,<100nm直径物质)的消除或者包括颗粒尺寸大于至少100nm直径的组合物的蛋白质基质颗粒尺寸的选择。也可以使用凝胶电泳技术。
制造本文所述的疫苗的方法并不会造成目的抗原,例如荚膜聚合物的广泛修饰。抗原通常保持在相同的状态,而可能的修饰例如,PS荚膜的还原糖的减少,该PS荚膜在聚合物链的端部携带这些基团。这样小的修饰不可能影响多数荚膜PS的免疫原性,因为端部糖比聚合物中的内部残基的丰裕性差100-10000倍。相反,对于常规缀合疫苗,通常需要向抗原例如荚膜聚合物中引入接头基团,该接头基团用作载体共价附着点。需要使用接头是因为诸如荚膜聚合物的许多抗原都没有诸如羧基或氨基的反应性基团作为其结构的一部分。例如,向PS引入反应性基团能够造成荚膜表位的破坏以及由于它们与宿主自身表位的未知免疫交叉反应性而可能并非是疫苗产物理想的新表位的产生。
制造本文所述的疫苗的方法比缀合疫苗技术更简单,因为其化学反应只取决于载体蛋白(例如,DNI、霍乱毒素B亚基、白喉类毒素、破伤风类毒素或者片段C或大肠杆菌β半乳糖苷酶)的交联化学反应。例如,虽然荚膜聚合物在与DNI混合时影响交联速率,但是它不会影响交联的类型和程度,交联的类型和程度更多地是受到所用蛋白质、其浓度以及添加的交联物(例如,戊二醛)的浓度的控制。这些参数可以容易地被调节,由此降低制造该疫苗所需的时间和努力,并且节约花销。
制造本文所述的PCMV的方法可以使用任何抗原,例如荚膜聚合物或任何即使有氨基也很少的生物聚合物,以及任何可以被交联的载体蛋白,例如不具有可以被氢硼化物还原所破坏的关键表位的载体蛋白。可以用于本文所述方法中的载体蛋白理想地具有至少2个赖氨酸残基或者未被阻断且可以通过化学修饰而交联的其他残基。破伤风类毒素是一种可能的载体蛋白。这一毒素通过用与蛋白质的氨基基团反应的试剂甲醛处理而变得无毒。其他理想的载体蛋白包括霍乱毒素B亚基(获自SBL Vaccin AB)、白喉类毒素或者CRM197、破伤风类毒素或片段C(获自Sigma Aldrich)、DNI或者大肠杆菌的β半乳糖苷酶(获自Sigma Aldrich)。
目前的多价缀合疫苗是通过首先合成单个缀合疫苗,随后混合它们以生产“混合的”缀合疫苗从而制备(例如,惠氏的7价肺炎链球菌疫苗,)。本发明的制造疫苗的方法可以通过在例如用戊二醛或其他交联物来交联载体蛋白之前将化学上不同的抗原例如,荚膜有机聚合物混合在一起,或者通过使分开合成的本发明的特定疫苗混合而用于制造多价疫苗。这一灵活性相比于常规制造多价疫苗的方法提供了显著的优势。
在实施例中讨论的本发明的示例性疫苗与缀合疫苗相当地执行,而不管这些疫苗是通过被预测为不会在组成抗原分子的原子和载体蛋白之间产生任何共价键的方法而合成的事实。戊二醛仅仅典型地通过赖氨酸残基的ε氨基与蛋白质的氨基侧链反应。多糖抗原含有很少的游离氨基基团(任何氨基侧链通常都被乙酰化)与戊二醛或醛官能化交联物(例如上文讨论的OCH-R-CHO)反应,因此,这些抗原非常适于PCMV形成,其中少于50%的抗原直接与载体蛋白交联。如在下面的实施例中所见,与缀合物对照有利地对比,PCMV产生的免疫应答表明PS分子被分子性地包载在DNI蛋白分子的交联的基质中。
根据非限制性的模型,包载的作用为将蛋白质基质疫苗组合物运载到B细胞中,B细胞由于免疫性地识别PGA的Ig受体而结合此种基质。一旦被摄取到这些B细胞中,基质就以与常规缀合疫苗相似的方式被降解,并且这产生展示在相应B细胞的MHC II类分子上的源自载体蛋白的肽。这接下来募集T辅助细胞并因此造成此种B细胞的膨胀和成熟以成为生产IgG的血浆(plasma)和对抗原特异的记忆细胞。因此,根据该非限制性的模型,PCMV像蛋白质缀合荚膜疫苗一样免疫性地工作但又由于PCMV缺乏在载体蛋白和荚膜聚合物之间的显著的共价结合而与蛋白质缀合荚膜疫苗不同。
本发明的疫苗,包括PCMV,可组合使用,例如用于儿科疫苗。此外,本发明的疫苗可用于针对例如,肺炎链球菌感染、链球菌(A和B组)感染、B型流感嗜血菌(“HiB”)感染、脑膜炎球菌(例如脑膜炎奈瑟氏球菌)感染的疫苗接种,并且可用作革兰氏阴性细菌的O抗原疫苗,例如铜绿假单孢菌(Pseudomonas aeruginosa)、土拉热弗朗西丝菌(Francisella tularensis)(Thirumalapura等人,J.Med.Microbio 1.54:693-695,2005;Vinogradovand Perry,Carbohydr.Res.339:1643-1648,2004;Vinogradov等人,Carbohydr.Res.214:289-297,1991)、志贺氏杆菌(Shigella)种类、沙门氏菌(Salmonella)种类、不动杆菌属(Acinetobacter)种类、伯克霍尔德菌属(Burkholderia)种类以及大肠杆菌。
可使用任何接头(例如本文所述的那些)交联任何载体蛋白(例如本文所述的那些)在一种或多种目的抗原(例如本文所述的那些)存在下,来制备本发明的疫苗。如果使用一种目的抗原,那么认为本发明的蛋白质基质疫苗是单价的。如果使用一种以上的目的抗原,那么认为本发明的蛋白质基质疫苗是多价的。如果微生物荚膜聚合物或多糖是目的抗原,那么认为本发明的蛋白质基质疫苗是蛋白荚膜基质疫苗(PCMV)。
接头
对交联载体蛋白有用的交联剂是本领域公知的并且包括戊二醛、3-马来酰亚胺基苯甲酸N-羟基琥珀酰亚胺酯、碳二亚胺和双重氮联苯胺。
使用同源双功能或异源双功能接头,直接交联载体蛋白的一般方法和分子部分描述于,例如,G.T.Hermanson,Bioconjugate Techniques(Academic Press,1996)以及Dick and Beurret,"Glycoconjugates ofBacterial Carbohydrate Antigens,"in Conjugate Vaccines(Cruse andLewis编,Contrib.Microbiol.Immunol.Basel,Karger,1989,vol.10,pp.48-114)。例如,使用具有n个赖氨酸部分的载体蛋白,理论上,会有n+1个初级胺(包括末端胺)可用于与示例性的交联物的羧基基团的反应。因此,使用这一直接缀合方法,产物限于形成有n+1个酰胺键。
在本发明理想的实施方式中使用的接头,最简单地是连接两个载体蛋白的键。接头可以是线性的、环状的或分支的分子骨架,具有共价结合两个载体蛋白(A)和(B)的悬挂基团。任何给定的载体蛋白可与一个以上的载体蛋白连接,从而产生互联的载体蛋白的矩阵,在该载体蛋白中可包载目的抗原。
术语“连接基”指来自接头(L)的反应部分与(A)或(B)的官能团组合的共价键。连接基的实例包括但不限于酯、氨基甲酸酯、硫酯、亚胺、二硫化物、酰胺、醚、硫醚、磺酰胺、异脲、异硫脲、亚氨酸酯、脒、磷酰胺、磷酸二酯、硫醚和腙。
(A)与(B)的连接是通过共价手段来实现的,包括利用定位在(A)和(B)上的一或多个官能团的键(连接基)形成。为此目的可使用的化学反应性官能团的实例包括但不限于氨基、羟基、巯基、羧基、羰基、硫醚、胍基、咪唑基以及酚基,它们存在于许多载体蛋白中的天然发生的氨基酸中。
因此可使用含有能够与(A)和(B)中存在的此种官能团反应的反应性部分的接头(L)来实现(A)与(B)的共价链接。这一反应的产物是含有新形成的连接(L)和(A)以及连接(L)和(B)的键的连接基团。例如,(A)的羟基基团可与(L)的羧酸基团或者其活化的衍生物反应,或反之,从而形成酯连接基团。
能够与巯基基团反应的部分的实例包括XCH2CO-类型的α-卤酰基化合物(其中X=Br、Cl或I),其尤其显示出对于巯基基团的反应性,但也可以用于修饰咪唑基、硫醚、酚以及氨基基团,如Gurd,Methods Enzymol.,11:532,1967所述。N-马来酰亚胺衍生物也被认为对巯基基团是选择性的,但是可另外用于在某些条件下偶联氨基基团。通过氨基基团转变而导入巯基的试剂如2-亚氨基硫烷(iminothiolane)(Traut等人,Biochemistry,12:3266,1973)如果通过形成二硫桥而发生连接则可被当作巯基试剂。
能够与氨基基团反应的反应性部分的实例包括,例如烷化剂和酰化剂。代表性烷化剂包括:
(i)α-卤酰基化合物,其在没有反应性巯基存在下,显示出对氨基的特异性,并且是XCH2CO-类型的(其中X=Cl、Br或D,例如由Wong(Biochemistry,24:5337,1979所述);
(ii)N-马来酰亚胺衍生物,其可按Smyth等人(J Am.Chem.Soc.,82:4600,1960以及Biochem.J,91:589,1964)所述,通过Michael型反应或者通过酰化作用,添加环羰基而与氨基基团反应;
(iii)芳基卤,例如反应性的硝卤代芳基化合物;
(iv)卤代烃,例如,按McKenzie等人(J Protein Chem.,7:581,1988)所述;
(v)能够与氨基基团形成希夫碱的醛和酮,所形成的加成物通常通过还原而被稳定以得到稳定的酰胺;
(vi)环氧化物衍生物,例如表氯环氧丙烷和双环氧乙烷(bisoxirane),其可与氨基、巯基或酚羟基反应;
(vii)s-三嗪的含氯衍生物,其对于诸如氨基、巯基和羟基等的亲核试剂非常有反应性;
(viii)基于上面详述的s-三嗪化合物的氮丙啶,例如由Ross(J Adv.Cancer Res.2:1,1954)所述,其与诸如氨基基团的亲核试剂通过开环而反应;
(ix)方形酸二乙酯,例如由Tietze(Chem.Ber.,124:1215,1991)所述;以及
(x)α-卤烷基醚,其由于醚氧原子造成的活化而是比一般的卤代烃更有反应性的烷化剂,例如由Benneche等人(Eur.J Med.Chem.,28:463,1993)所述。
代表性的氨基反应性酰化剂包括:
(i)异氰酸酯和异硫氰酸酯,特别是芳香族衍生物,其分别形成稳定的脲和硫脲衍生物;
(ii)磺酰氯,其例如由Herzig等人(Biopolymers,2:349,1964)所述;
(iii)酰基卤;
(iv)活性酯,例如硝基苯酯或N-羟基琥珀酰亚胺酯;
(v)酸酐,例如混合的对称的或者N-羧基酸酐;
(vi)其他对于酰胺键形成有用的试剂,例如由M.Bodansky(Principlesof Peptide Synthesis,Springer-Verlag,1984)所述;
(vii)酰叠氮,例如,其中叠氮基团由使用亚硝酸钠预先形成的酰肼衍生物来产生,例如由Wetz等人(Anal.Biochem.,58:347,1974)所述;以及
(viii)亚氨酸酯,其与氨基反应是形成稳定的脒,例如如Hunter andLudwig(J Am.Chem.Soc.,84:3491,1962)所述。
醛,例如戊二醛,以及酮可与胺反应以形成希夫碱,其可有益地通过还原性氨基化作用被稳定。烷氧氨基部分容易地与酮和醛反应以产生稳定的烷氧胺,如Webb等人(Bioconjugate Chem.,1:96,1990)所述。
能够与羧基反应的反应性部分的实例包括重氮化合物,例如重氮乙酸乙酯和重氮乙酰胺,其高特异性地反应以产生酯基团,如Herriot所述(Adv.Protein Chem.,3:169,1947)。也可使用羧酸修饰剂如碳二亚胺,其通过形成O-酰基脲然后通过形成酰胺键进行反应。
如果需要,(A)和/或(B)中的官能团可在反应前转变成其他官能团,例如,以赋予另外的反应性或选择性。用于这一目的的方法的实例包括使用诸如二羧酸酐的试剂从胺转变成羧酸;使用诸如N-乙酰基高半胱氨酸硫内酯、S-乙酰巯基丁二酸酐、2-亚氨基硫烷或含硫醇的琥珀酰亚胺基衍生物的试剂从胺转变成硫醇;使用诸如α-卤代乙酸酯的试剂从硫醇转变成羧酸;使用诸如氮丙啶或2-溴乙胺的试剂从硫醇转变成胺;使用诸如碳二亚胺然后是二胺的试剂从羧酸转变成胺;以及使用诸如对甲苯磺酰氯的试剂然后是使用硫代乙酸乙酯进行转酯化反应以及使用乙酸钠水解成硫醇而从醇转变成硫醇。
根据本发明,如果需要,可使用所谓的零长度接头,涉及将(A)的反应性化学基团与(B)的反应性化学基团直接共价接合而不引入其他连接材料。实例包括化合物,其中(L)表示将(A)的氧原子与(B)中存在的羰基或硫代羰基部分进行连接的化学键,使得连接基是酯或者硫酯。例如,可以使用碳二亚胺化学物将氨基(A)与羧基(B)连接产生A-L-B,其中L是酰胺键或与N--R相连的RC(:O),其中R是源自相同的或两不同的蛋白质分子的氨基酸侧链的碳链。然而,最常见地,接头包括通过间隔物元件相连的两个或更多个反应性基团,如上所述。间隔物的存在允许双功能接头与(A)和(B)中的特异官能团反应,产生在这两种化合物之间的共价链接。接头(L)中的反应性部分可以是相同的(同源双功能接头)或不同的(异源双功能接头,或者当存在若干不同的反应性部分时为异源多功能接头),提供可在(A)和(B)之间带来共价结合的潜在试剂的多样性。
间隔物元件通常由有效地分开(A)和(B)的链组成,所述链为1-10个碳原子的线性或分支的烷基、1-10个碳原子的线性或分支的杂烷基、2-10个碳原子的线性或分支的烯烃、2-10个碳原子的线性或分支的炔烃、5-10个碳原子的芳香基、3-10个原子的环体系、或者-(CH2CH2O)nCH2CH2-,其中n是1-4。
通过连接剂所引入的外来材料的性质可对最终疫苗产物的药代动力学和/或活性有影响。因此,理想的是引入可切割的接头,含有可生物降解的或者化学敏感的或者带有酶切割位点的间隔物臂。
这些可切割的接头,例如在PCT公开WO92/17436(由此通过引用作为参考)中描述,易于在体内被生物降解。在一些情形下,连接基在酯酶存在下被切割,但是在没有此种酶时是稳定的。因此,(A)和(B)可有益地连接以允许它们被在疾病位点附近有活性的酶缓慢释放。
接头可与通式-(Z1)o-(Y1)u-(Z2)s-(R11)-(Z3)t-(Y2)v-(Z4)p-中的生物可降解的二脂、二酰胺或二氨基甲酸酯基团形成连接基,其中Z1、Z2、Z3和Z4各独立地选自O、S和NR12(其中R12是氢或烷基);Y1和Y2各独立地选自羰基、硫代羰基、磺酰基、磷酰基或类似的酸形成基团;o、p、s、t、u和v各独立地是0或1;并且R11是1-10个碳原子的线性或分支的烷基,1-10个碳原子的线性或分支的杂烷基、2-10个碳原子的线性或分支的烯烃、2-10个碳原子的线性或分支的炔烃、5-10个碳原子的芳香基、3-10个原子的环体系、-(CH2CH2O)qCH2CH2-,其中n是1-4或者连接-(Z1)o-(Y1)u-(Z2)s-(R11)-(Z3)v-(Y2)v-(Z4)p-的化学键。
示例性的用于本发明的理想的接头(L)可描述为式I-II中任一:
-C:O-R13-C:O- I
-C:O-NH-R13-NH-C:O- II
其中接头与氧原子(A)和(B)的氧原子二者共价结合。因此,式I-II的接头(L)通过二吡喃、酯或氨基甲酸酯连接基与载体蛋白(A)和(B)结合。在这些实施方式中,R13代表1-10个碳原子的线性或分支的烷基,1-10个碳原子的线性或分支的杂烷基、2-10个碳原子的线性或分支的烯烃、2-10个碳原子的线性或分支的炔烃、5-10个碳原子的芳香基、3-10个原子的环体系、-(CH2CH2O)nCH2CH2-,其中n是1-4,或者连接两个氮或两个羰基的化学键。
被设计用来形成腙连接的接头具有化学式III:
-(Y3)-(Z5)w-R14-C(:X4)-R15
其中Z5选自O、S或NR16;R16是氢或烷基基团;R15选自氢、烷基或杂烷基;Y3选自羰基、硫代羰基、磺酰基、磷酰基或与(A)的氧原子共价结合的类似的酸形成基团;w是0或1;R14是1-10个碳原子的线性或分支的烷基,1-10个碳原子的线性或分支的杂烷基、2-10个碳原子的线性或分支的烯烃、2-10个碳原子的线性或分支的炔烃、5-10个碳原子的芳香基、3-10个原子的环体系、-(CH2CH2O)nCH2CH2-,其中n是1-4或者连接-(Y3)-(Z5)W-的化学键并且X4是腙,其产生自含有酰肼基团的(B)和该接头II的前体的缩合反应,其中X4是酮或醛基团的氧原子。
载体蛋白
总体上,本发明可使用任何可以在生理条件下包载抗原的载体蛋白。理想地,抗原包载在具有交联的载体蛋白的复合物中,而在抗原和载体蛋白之间没有明显的共价键结。没有明显的共价键结指不超过50%的抗原被共价结合到载体蛋白上。在理想的实施方式中,不超过40%、30%、10%或5%的抗原共价结合到载体蛋白上。抗原/载体蛋白复合物可含有另外的化合物,例如明矾,并且在理想的实施方式中,这一另外的化合物可以包载抗原和载体蛋白。
用于本发明的疫苗的载体蛋白理想地是这样的蛋白质,其单独地或者与抗原组合引发受试者的免疫应答。理想地,该载体蛋白含有多个由辅助性T细胞识别的MCH II类限制性表位。理想地,该表位能够诱导受试者中的Th细胞反应并诱导B细胞产生针对于整个目的抗原的抗体。在描述本发明时使用的表位包括抗原上任何负责该抗原与抗体分子或其片段的特异性相互作用的决定簇。表位决定簇通常由诸如氨基酸或糖侧链的分子的化学活性表面基团所组成并且具有特异的三维结构特性以及特异的电荷特性。为了具有免疫原性,蛋白质或多肽通常能够刺激T细胞。然而,缺乏T细胞识别的表位的载体蛋白也可是免疫原性的。
通过选择已知能引发强免疫应答(即高度免疫原性的)的载体蛋白,可以用在此所述的蛋白质基质疫苗组合物来处理多种受体群。载体蛋白理想地是足够外源的以引发对疫苗强免疫应答。典型地,使用的载体蛋白是能够向目的抗原赋予免疫原性的分子。在理想的实施方式中,载体蛋白是具固有的高度免疫原性的蛋白质。因此,理想的载体蛋白是具有高度免疫原性且能够使与之复合的抗原的抗体生成最大化。
本发明的多种载体蛋白包括,例如毒素和类毒素(化学的或基因的),其可以是突变体或不是突变体,例如炭疽毒素、PA和DNI(PharmAthene,Inc.)、白喉类毒素(Massachusetts State Biological Labs;Serum Institute ofIndia,Ltd.)或CRM 197、破伤风毒素、破伤风类毒素(Massachusetts StateBiological Labs;Serum Institute of India,Ltd.)、破伤风毒素片段Z、铜绿假单孢菌(Pseudomonas aeruginosa)的外毒素A或外毒素A突变体、细菌鞭毛蛋白、肺炎链球菌溶血素、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)的外膜蛋白(菌株可获自ATCC(American Type CultureCollection,Manassas,Va.))、铜绿假单孢菌Hcpl蛋白、大肠杆菌的热不稳定肠毒素、志贺-样毒素、人LTB蛋白,一种来自整个细菌细胞的蛋白提取物,以及任何其它可以通过接头交联的蛋白质。理想地,载体蛋白是霍乱毒素B亚基(可获自SBL Vaccin AB)、白喉类毒素或CRM 197(Connaught,Inc.)、破伤风类毒素或片段C(可获自Sigma Aldrich)、DNI或来自大肠杆菌的β半乳糖苷酶(可获自Sigma Aldrich)。其他理想的载体蛋白包括牛血清白蛋白(BSA)、P40以及鸡核黄素。(除非另有说明,否则示例性的载体蛋白是可从Sigma Aldrich商业购买的。)其他示例性载体蛋白是MAPs(多抗原肽),其为分支的肽。通过使用MAP,由于多分支的氨基酸使得交联密度最大化。用于交联目的的理想的氨基酸残基(其可用于形成MAP)是在其侧链上具有游离氨基酸的赖氨酸,但不限于此。
在用动物进行实验时,BSA和钥孔血蓝蛋白(KLH)都普遍被用作载体来开发疫苗。已被用于制备治疗性疫苗的载体蛋白包括但不限于病原性细菌的多种毒素以及它们的类毒素。实例包括白喉和破伤风毒素以及它们药学上可接受的相应类毒素。其他候选物是与细菌毒素抗原性相似的被称作交联反应物质(CRM)的蛋白质。用于实践本发明的载体蛋白也包括任何非源自人类并且不在任何人类食物中存在的蛋白质。
在本发明理想的实施方式中,形成环样结构的蛋白质用于PCMV生产。此种蛋白质包括铜绿假单孢菌的Hcp1蛋白,霍乱毒素的非毒性“B亚基”,大肠杆菌的热不稳定肠毒素,以及志贺-样毒素。此种环样蛋白复合物可以形成“链上的珠”,其线性PS链穿入到这些环形蛋白复合物的中央通道中。在蛋白质交联后,预测此种复合物尤其稳定。蛋白质的结构数据表明这些中央通道对于PS链容易地进入是足够大的。例如,Hcpl六聚体环的中央通道是42埃,其足够宽到容易地容纳宽度为5.5埃的若干多糖链(Mougous等人,Science,312(5779):1526-1530(2006))。替代地,蛋白质环可绕着PS组装(例如,在特别的物化条件下,来自天然组装成环的单体载体蛋白的亚基)。此种可以组装成环的单体蛋白是本领域已知的,并且包括例如肺炎链球菌溶血素(Walker等人,Infect.Immun.,55(5):1184-1189(1987);Kanclerski and Mollby,J.Clin.Microbiol,25(2):222-225(1987))、李斯特菌溶胞素O(Kayal and Charbit,FEMS Microbiol.Rev.,30:514-529(2006);Mengaud等人,Infect.Immun.,55(12):3225-3227(1987))、DNI、炭疽PA、Hcpl、霍乱毒素B亚基、志贺毒素B亚基、鞭毛蛋白以及本领域已知的且由多种微生物制备的多种相关分子。
在另一理想的实施方式中,Toll样受体(TLR)激动剂用作载体蛋白。Toll样受体(TLR)活化对于塑造适应性免疫应答是重要的并且可在抗体反应的亲和成熟、同种型转换以及免疫记忆中起作用。霍乱弧菌(Vibriocholerae)的鞭毛蛋白(FLA)是TLR激动剂。从重组大肠杆菌中纯化了超过20mg的FLA蛋白并且该蛋白质在IL-6巨噬细胞诱导分析中显示为是潜在的TLR激活子。此外,被称作"肺炎链球菌溶血素"的非常保守的肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)蛋白也显示出激活TLR4并且额外地,是保护性抗原。因此,这一蛋白质也可以用作蛋白质基质载体蛋白。
进一步地,外膜蛋白(OMP)混合物(例如脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)的OMP)由Merck用作载体蛋白用于HIB缀合疫苗生产,并且来自整个肺炎链球菌细菌细胞的蛋白质提取物在动物感染模型中显示为至少是部分保护性的。在本发明理想的实施方式中,这些蛋白质混合物可用作载体蛋白。
在理想的实施方式中,使用具有例如至少两个赖氨酸残基或其他未被封闭的并且可以通过化学修饰而交联的其他残基的载体蛋白质来制造疫苗组合物。在其他理想的实施方式中,载体蛋白是多聚物(例如含有至少5个亚基的多聚物)。
在另一实施方式中,DNI由于它是非毒性的、不需要在使用前使其减毒,因此被用作载体蛋白。此外,DNI的使用是理想的,因为DNI除了引发目的抗原的保护性免疫应答以外,也可诱导对炭疽杆菌(B.anthracis)的保护性免疫应答。而且,DNI不具有内部二硫键。此种键易于被氢硼化物还原,这会使蛋白质变性并且造成诱导炭疽毒素中和抗体的表位损失。
目的抗原
本发明的疫苗组合物和制造并给予此种疫苗的方法可用于任何目的抗原,例如多糖、多元醇或多氨基酸。理想地,目的抗原不携带可以被制造疫苗的方法所用的化学反应破坏的初级基团,例如通过氢硼化物还原破坏抗原二硫键所造成的抗原变性。示例性的目的抗原包括但不限于有机聚合物,例如多糖(例如具有至少18个残基的多糖)、磷酸多糖、具有用N-乙酰基取代的氨基糖的多糖、含有磺酰化糖、其他硫酸盐-修饰的糖或磷酸盐修饰的糖的多糖、多元醇、多氨基酸、磷壁酸、脂多糖的O侧链。示例性的目的抗原也包括荚膜有机聚合物,包括通过微生物物如细菌、真菌、寄生物和病毒而合成,然后使用标准方法从此种生物源纯化的那些。示例性的目的抗原包括微生物荚膜有机聚合物,包括从下述微生物纯化的那些:细菌生物体如杆菌属种类(包括炭疽杆菌)(Wang and Lucas,Infect.Immun.,72(9):5460-5463(2004))、肺炎链球菌(Bentley等人,PLoS Genet.,2(3):e31(2006);Kolkman等人,J.Biochemistry,123:937-945(1998);andKong等人,J.Med.Microbiol,54:351-356(2005))、志贺氏杆菌(Zhao等人,Carbohydr.Res.,342(9):1275-1279(2007))、流感嗜血菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、伤寒沙门氏菌、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、大肠杆菌(Zhao等人,Carbohydr.Res.,342(9):1275-1279(2007))以及铜绿假单孢菌(Pseudomonasaeruginosa),和真菌生物体如隐球酵母属(Cryptococcus)和假丝酵母属(Candida)以及其他微生物(参见例如,Ovodov,Biochemistry(Mosc),71(9):937-954(2006);Lee等人,Adv.Exp.Med.Biol,491:453-471(2001);以及Lee,Mol.Immunol,24(10):1005-1019(1987))。示例性的目的抗原也包括天然不存在的并因此非生物来源的聚合物。
特定的肺炎链球菌抗原包括多糖荚膜类型1(例如1-g或1-q)、2(例如2-g、2-q或2-41A)、3(例如3-g、3-q、3-c或3-nz)、4、5(例如5-q、5-c、5-qap或5-g)、6A(例如6A-g、6A-c1、6A-c2、6A-n、6A-qap、6A-6B-g、6A-6B-q或6A-6B-s)、6B(例如6B-c、6A-6B-g、6A-6B-q或6A-6B-s)、7F(例如7F-7A)、7A(例如7A-cn或7F-7A)、7B(例如7B-40)、7C(例如7C-19C-24B)、8(例如8-g或8-s)、9A(例如9A-9V)、9L、9N、9V(例如9A-9V)、9V和14、10F(例如10F-q、10F-ca或10F-10C)、10A(例如10A-17A或10A-23F)、10B(例如10B-10C)、11F、11A(例如HA-nz或11A-11D-18F)、11B(例如11B-11C)、11C(例如11B-11C或11C-cn)、1ID(例如11A-11D-18F)、12F(例如12F-q或12F-12A-12B)、12A(例如12A-cn、12A-46或12F-12A-12B)、12B(例如12F-12A-12B)、13(例如13-20)、14(例如14-g、14-q、14-v或14-c)、15F(例如15F-cn1或15F-cn2)、15A(例如15A-ca1、15A-ca2或15A-chw)、15B(例如15B-C、15B-15C、15B-15C-22F-22A)、15C(例如15C-ca、15C-q1、15C-q2、15C-q3、15C-S、15B-15C或15B-15C-22F-22A)、16F(例如16F-q或16F-nz)、16A、17F(例如17F-n和17F-35B-35C-42)、17A(例如17A-ca或10A-17A)、18F(例如18F-ca、18F-w或11A-11D-18F)、18A(例如18A-nz或18A-q)、18B(例如18B-18C)、18C(例如18B-18C)、19F(例如19F-g1、19F-g2、19F-g3、19F-q、19F-n或19F-c)、19A(例如19A-g、19A-或19A-ca)、19B、19C(例如19C-cn1、19C-cn2或7C-19C-24B)、(例如13-20)、21(例如21-ca或21-cn)、22F(例如15B-15C-22F-22A)、23F(例如23F-C、10A-23F或23F-23A)、23B(例如23B-c或23B-q)、24F(例如24F-cn1、24F-cn2或24F-cn3)、24A、24B(例如7C-19C-24B)、25F(例如25F-38)、25A、27、28F(例如28F-28A或28F-cn)、28A(例如28F-28A)、29(例如29-ca或29-q)、31、32F(例如32F-32A)、32A(例如32A-cn或32F-32A)、33F(例如33F-g、33F-q、33F-chw、33F-33B或33F-33A-35A)、33A(例如33F-33A-35A)、33B(例如33B-q、33B-s或33F-33B)、33D、34(例如34-ca或34s)、35F(例如35F-47F)、35A(例如33F-33A-35A)、35B(例如17F-35B-35C-42)、36、37(例如37-g或37-ca)、38(例如25F-38)、39(例如39-cn1或39-cn2)、40(例如7B-40)、41F(例如41F-cn或41F-s)、41A(例如2-41A)、42(例如17B-35B-35C-42)、43、44、45、46(例如46-s或12A-46)、47F(例如35F-47F)、47A、48(例如48-cn1或48-cn2)或GenBank登录号AF532714或AF532715。
特别提及选自荚膜类型3、4、6B、7A、7B、7C、7F、9A、9L、9N、9V、12A、12B、12F、14、15A、15B、15C、15F、17、18B、18C、19F、23F、25A、25F、33F、35、37、38、44或46的肺炎链球菌多糖。
疫苗组合物
本发明的疫苗组合物,包括PCMV,可与例如儿科疫苗联合使用。此外,本发明的疫苗组合物可用于接种以抗例如肺炎链球菌感染、流感嗜血菌B型("HiB")感染、链球菌(A和B群)感染、脑膜炎球菌(例如脑膜炎奈瑟氏球菌)感染,并且可以用作来自革兰氏阴性细菌(例如铜绿假单孢菌、土拉热弗朗西丝菌、志贺氏杆菌种类、沙门氏菌(Salmonella)种类、不动杆菌属(Acinetobacter)种类、伯克霍尔德菌属(Burkholderia)种类和大肠杆菌)的O抗原疫苗。
疫苗制剂理想地包括至少一种载体蛋白,一种或多种目的抗原以及药学上可接受的载体或赋形剂(例如磷酸铝、氯化钠、无菌水)。疫苗组合物也可包括用于增强制剂的免疫原性的佐剂体系,例如在水包油体系或本领域已知的其他体系或其他药学上可接受的赋形剂。在生理条件下不溶的载体/抗原复合物是理想的以在给予受试者后缓慢地释放抗原。此种复合物理想地以含有药学上可接受的赋形剂的悬剂被递送。然而,载体/抗原复合物也可是在生理条件下可溶的。
典型地,蛋白质基质疫苗是以约0.5ml的体积用于皮下注射,0.5ml用于肌内注射,0.1ml用于皮内注射或者0.002-0.02ml用于经皮给药。0.5ml剂量的蛋白质基质疫苗可含有约2-500μg被约2-500μg载体蛋白包载的抗原。在理想的实施方式中,在0.5ml剂量中,约10μg抗原被约10μg载体蛋白包载。抗原与载体蛋白的摩尔比理想地在1-10(例如,1份抗原对2份载体或1份抗原对3份载体等)和10-1(例如,3份抗原对1份载体或2份抗原对1份载体等)之间。在理想的实施方式中,抗原与载体的摩尔比是1比1。替代地,抗原与载体蛋白的干重比理想地为1至10和10至1之间(例如按干重计为1比1)。
由于肽或缀合物可在胃中被降解,因此疫苗理想地非经肠道给予(例如,通过皮下、肌内、静脉内、腹膜内或皮内注射)。尽管通过物理穿透真皮层的方式递送是理想的(例如针、气枪或摩擦),但是本发明的疫苗也可以通过透皮吸收来给予。
特别地,本发明的疫苗可通过例如肌内注射、皮内注射或者以适当的免疫佐剂透皮免疫来给予受试者。本发明的疫苗可一次或多次给予,通常包括被设计为加增强受试者的抗体产生的二次给药来防止由对应于疫苗中包括的抗原的传染原的感染。获得理想的免疫应答或免疫水平的疫苗剂量频率和量取决于疫苗的比活性并且可通过常规实验而容易地确定。例如,对于婴儿,疫苗方案可以是三个0.5ml剂量,每次在约4至8周的间隔(在2月龄时开始),随后是在约12至15个月龄时0.5ml的第四剂量。对于一些疫苗,在四岁和六岁之间的第五剂量可能是需要的。
尽管给予第一剂量时的年龄通常是2个月,但是疫苗可以给予小至6周大的婴儿。对于成人,以其间间隔2-8周来给予两次或更多次的0.5ml剂量通常足以提供长期保护。理想地向之前被免疫接种过的成人和超过11岁的儿童每10年给予加强剂量。
制剂可以存在于单位剂量或者多剂量容器中,例如,密封安瓿和小瓶并且可在冻干(冷冻)条件下存储,而只需要在使用前才添加灭菌液体载体。本发明的疫苗可以在药理学上可接受的介载体中配制,例如氢氧化铝凝胶、佐剂制剂或生理盐水,然后例如通过肌内注射、皮内注射或者以适当的免疫佐剂透皮免疫来给予。
本发明也包括具有在此所述的疫苗(例如PCMV)的试剂盒。本发明的试剂盒也可以包括在此所述接种方法中使用试剂盒的说明书。
免疫接种方案的效力可通过使用测量受试者的抗体滴度的标准方法来测定。通常,约1μg/ml的平均抗体滴度(理想地,IgG滴度)被认为表示长期保护。
在本文下面通过参考具体实施例、实施方式和附图来说明本发明,其目的是阐释本发明而非限制本发明的范围。下面的实施例不被认为是限制性的。
本发明提供含有被载体蛋白质基质包载的目的抗原的疫苗组合物、制造此疫苗的方法以及疫苗给药的方法。已经发现该组合物的免疫原性以及因此其作为疫苗的效力可通过控制或选择载体蛋白质基质的颗粒尺寸得以提高。
实施例1:
使用肺炎链球菌多糖14型荚膜多糖(PPS-14)作为抗原以及使用大肠杆菌表达的炭疽杆菌保护性抗原(PA)的显性负突变形式(DNI)(如Benson等人(Biochemistry,37:3941-3948(1998))所述)作为载体蛋白,来调查颗粒尺寸对于基质疫苗组合物的影响。
将多糖抗原(PPS 14)与载体蛋白(DNI)以1:1的重量比混合并且对于每种组分以7.5mg/ml呈递。通过添加戊二醛作为交联剂来开始DNI载体蛋白的交联。形成两种交联反应混合物:一种的最终戊二醛浓度为0.05%以及另一种的最终戊二醛浓度为0.25%。通过在4℃孵育23小时,以0.5ml的总体积进行交联反应。在那时,加入还原希夫碱的氰基硼氢化钠至浓度为20mg/ml并且另外孵育反应混合物1小时。
将部分的0.25%戊二醛反应混合物施加到25mlCL-2B交联的琼脂糖凝胶尺寸分级柱(Sigma-Aldrich)中以根据颗粒尺寸来分离PPS 14:DNI基质疫苗组合物。使用10mM含有150mM NaCl的磷酸盐缓冲液进行分级。
分离两池的PPS 14:DNI基质疫苗颗粒用于进一步的评估。第一池由3种级分(1mL级分)组成,含有空体积(池1)以及在空体积和单体DNI蛋白(83kD)的位置之间从柱中洗脱的两种级分的池(池2)(参见图1)。在图1中DNI洗脱约24mL位置。通过折射率、多角度激光散射色谱(SEC-MALS-RI)进一步调查池1和池2。在池1中,颗粒尺寸在120-200nm直径变化,在池2中,平均颗粒尺寸为直径63nm。池的组合物示出于表1:
池1中的较大颗粒的DNI比池2中的较小颗粒含有更少的抗原(PPS14)。如通过MALS软件(Astra,Wyatt Technologies)所测定,池2中的颗粒由86%的PPS 14和14%的DNI蛋白质组成(数据未示出)。检测组合物以确认通过交联反应的PPS 14抗原的包载。制备5种组成并进行SDS-PAGE:
组成
1、池1(2.4μg PPS 14:DNI,颗粒尺寸200-120nm)
2、池2(5.0μg PPS 14:DNI,平均颗粒尺寸63nm)
3、整个PCMV反应混合物(交联的,0.25%戊二醛,未分级的)
4、整个PCMV反应混合物(交联的,0.05%戊二醛,未分级的)
5、对照:只有DNI(未交联的),来自池1和池2
如图2所示,组合物1-4全部显示出DNI载体蛋白的大量交联,如通过在SDS-PAGE上条带向更高分子量物质移动所证明。组成4(用0.05%戊二醛交联的整个PCMV反应混合物)显示出DNI的交联但是表明从较小分子量物质到较高分子量条带的更广范围的条带范围(参照组成1、2、3的泳道)。
为了确认PPS 14抗原仍旧与交联的DNI基质相缔合,进行DNI捕获ELISA,其中允许PPS 14:DNI疫苗制剂在室温下与固定化的小鼠抗DNI捕获抗体(自行制备)结合2小时。用PBS-0.5%Tween-20(PBST)洗去未结合的物质并且使用兔抗PPS 14抗体(Miravista Diagnostics)来检测仍旧与所捕获的DNI基质蛋白相缔合的多糖。使用兔抗DNI抗体(JohnCollier惠赠,Harvard Medical School)确认DNI基质组合物的固定化。兔抗PPS 14或兔抗DNI抗体通过用与碱性磷酸酶(Sigma)缀合的单克隆抗兔抗体孵育来检测并通过添加对-硝基苯基磷酸酯底物来可视化。在对照实验中,只有PPS 14的组合物(未与DNI相缔合)以及其中加入了外源性PPS 14的交联的DNI组合物(没有多糖抗原)同时在分析中使用。在最终的检测步骤中,这些对照组中都没有观察到PPS 14(参见图3B)。相反,当用PCMV组成1-4孵育抗DNI捕获抗体时,可通过PPS 14-特异性检测抗体检测到DNI基质中的PPS 14。这证实了PPS 14抗原仍旧与交联的DNI基质相缔合。
在图3A(抗DNI检测)和3B(抗PPS 14检测)中绘制了检测组合物浓度增加时的检测信号(OD 405)。参考图3B,用0.05%戊二醛制备的PCMV(组成4)显示出用抗PPS 14检测抗体更弱的检测信号,这可能与SDS-PAGE胶上的更广范围的分子物质大小相对应。池1和池2组合物(组合物1和2)以及用0.25%戊二醛交联的整个PCMV反应混合物(组合物3)在SDS-PAGE胶上显示出相应于较高分子量物质的迁移(图2)。这些样品(组合物1-3)在捕获ELISA中也显示出检测到最高的PPS 14(图3B)。
检测了PCMV制剂的免疫原性:
接种组合物
1.池1+明矾(2.4μg PPS 14)
2.池2+明矾(5.0μg PPS 14)
3.整个PCMV(0.25%戊二醛)+明矾
4.整个PCMV(0.05%戊二醛)+明矾
5.对照:单独的5μg PPS 14抗原(无明矾)
使用下面的剂量方案(参见下表2),以100μL体积,将包括明矾佐剂(每剂量170μg明矾)的PCMV接种组合物通过腹膜内途径注射(5μgDNI)到小鼠中。对照组小鼠也用单独的5μg PPS 14抗原免疫。也包括未处理的未免疫接种的小鼠组作为对照组。
通过PPS 14ELISA分析血清抗PPS 14特异性IgG应答并以各个滴度和端点几何平均滴度(GMT)来绘图。如从图4可见,出人意料地发现接种组合物1(明矾为佐剂的池1组分,2.4μg PS),PPS14:DNI PCMV颗粒尺寸范围是200nm至120nm直径,与接种组合物2(明矾为佐剂的池2组分,5.0μg PS),PPS14:DNI PCMV平均颗粒尺寸范围是63nm直径,有相同的或者更优的免疫原性。以一半的包载抗原剂量,较大尺寸的PCMV颗粒与较小尺寸的池2组分的可比较的免疫原性表明PCMV颗粒的尺寸影响疫苗组合物的免疫原性或潜力。
使用2μg明矾为佐剂的池1(0.95μg PPS 14)与单独的2μg PPS 14相对比重复进行实验。如图5所示,抗PPS 14滴度表明较大颗粒尺寸的疫苗组合物(即池1,颗粒尺寸在120至200nm直径范围)即使抗原剂量小于抗原单独接种的一半,仍旧显示出更优的免疫原性(0.95μg PS vs.2.0μgPS)。
比较来自上述免疫的端点几何平均滴度(下表3)并绘图(图6)。
*在第38天,相比于对照,17倍更高的GMT(在0、14、28天,3次免疫)
**在第38天,相比于对照,127倍更高的GMT(在0、14、28天,3次免疫)
结果表明,相比于对照或者由小颗粒尺寸池构成的组合物,较大颗粒尺寸疫苗组合物更具有免疫原性,即使是在抗原剂量显著降低时(例如,在两个实验中,0.95μg PS vs.2.4μg PS&5.0μg PS),进一步表明交联的载体蛋白的颗粒尺寸对于宿主对所运载的(包载的)抗原的免疫应答具有显著影响。
实施例2:
使用伤寒沙门氏菌多糖抗原Vi(提取自Salmonella enterica serovarTyphi菌株Ty2)作为抗原以及使用大肠杆菌表达的炭疽杆菌保护性抗原(PA)的显性负突变体(DNI)形式作为载体蛋白来制备基质疫苗组合物,来制造Vi:DNI蛋白质荚膜基质疫苗(Vi:DNI PCMV)。多糖抗原(Vi)和载体蛋白(DNI)以1:1重量比混合并且对于每种组分以7.5mg/ml呈递。通过添加戊二醛作为交联剂至最终戊二醛浓度为0.25%来开始DNI载体蛋白的交联。通过在4℃孵育23小时,以0.5ml的总体积进行交联反应。在那时,加入还原希夫碱的氰基硼氢化钠至浓度为20mg/ml并且另外孵育反应混合物1小时。
将部分的反应混合物施加到25mlCL-2B交联的琼脂糖凝胶尺寸分级柱(Sigma-Aldrich)中以根据颗粒尺寸来分离Vi:DNI基质疫苗组合物。使用10mM含有150mM NaCl的磷酸盐缓冲液进行分级。分离四个池的Vi:DNI PCMV洗脱组分用于进一步的评估(参见图7)。
通过动态光散射(DLS)进一步调查四个池。在图7中在各组分池上方示出了相应池的颗粒尺寸。对于池1,颗粒尺寸计算为179nm。池2中的颗粒尺寸为171nm直径。池3中的颗粒尺寸为198nm直径,而池4中的颗粒尺寸计算为185nm直径。动态光散射提供了被分入池的组分中最大组分的尺寸。它既没有提供颗粒的尺寸范围,也没有提供最大尺寸的颗粒的百分数读数。
按照下面的方法,使用包括池1-4的组合物免疫小鼠。
接种组合物
1.池1+明矾(alum)
2.池2+明矾
3.池3+明矾
4.池4+明矾
5.整个PCMV反应混合物(未分级的)+明矾
6.对照:单独的10μg Vi PS抗原(无明矾)
使用下面的剂量方案(参见下表4),以100μL体积,将包括明矾佐剂(每剂量170μg明矾)的PCMV接种组合物通过腹膜内途径注射(10μg蛋白质)到小鼠中。对照组小鼠也用单独的10μg Vi多糖(Vi PS)抗原免疫。也包括未处理的未免疫接种的小鼠组作为对照组。
通过Vi ELISA分析血清抗Vi PS特异性IgG反应并以各个滴度和端点GMT来绘图。参照图8和9,来自用组合物1(池1,明矾佐剂)和组合物2(池2,明矾佐剂)Vi:DNI PCMV免疫的小鼠的血清表明比来自用组合物3(池3,明矾佐剂)、组合物4(池4,明矾佐剂)或组合物5(整个未分级的PCMV,明矾佐剂)免疫的小鼠的血清有更优异的抗Vi PS IgG免疫应答。图9和下表5显示出用池1或池2Vi:DNI PCMV免疫的小鼠比用池3、池4和未分级的Vi-DNI PCMV免疫的小鼠有更优异的几何平均滴度,所述池是取自未分级的Vi-DNI PCMV。
池1和2中的颗粒尺寸较大,它们也可比诸如池3和4中的较小颗粒更有效地包载Vi多糖。
实施例3
按照实施例1的方案进行经尺寸分级的PPS 14:DNI蛋白荚膜基质疫苗的进一步实验,只不过规模更大。多糖抗原(PPS 14)和载体蛋白(DNI)以1:1重量比混合并且对于每种组分以7.5mg/ml呈递。通过添加戊二醛作为交联剂至最终戊二醛浓度为0.25%来开始DNI载体蛋白的交联。通过在4℃孵育23小时,以1.5ml的总体积进行交联反应。在那时,加入还原希夫碱的氰基硼氢化钠至浓度为20mg/ml并且另外孵育反应混合物1小时。
将部分的PPS 14:DNI PCMV反应混合物施加到100mlCL-2B交联的琼脂糖凝胶尺寸分级柱(Sigma-Aldrich)中以根据颗粒尺寸来分离PPS 14:DNI基质疫苗组合物。使用10mM含有150mM NaCl的磷酸盐缓冲液进行分级。
分离四个池的PPS 14:DNI基质疫苗颗粒用于进一步的评估。参见图10,通过沿着x轴的短垂线表示收集的组分。通过阴影表示组分池。
使用用于碳水化合物的酚-硫酸分析法来测定组分中呈递的PPS 14抗原的量。通过UV280吸光值来测定组分中存在的DNI的量。测定组分中DNI与PPS 14的比例。结果如表6所示。
按下述选择并收集组分用于进一步研究:
池1-组分14,15-DNI含量0.74mg/ml
池2-组分16-DNI含量0.63mg/ml
池3-组分17,18,19-DNI含量0.31mg/ml
池4-组分32,33,34-DNI含量0.20mg/ml
池中的抗原和载体蛋白组合物如表7所示:
通过SDS-PAGE(4-12%Bis-Tris凝胶)以及考马斯亮蓝染色(参见图11)来分析PPS 14:DNI PCMV被分池的组分以及从中得到组分的整个PCMV组合物的交联完整性。如图11所示,被分池的组分和整个PCMV反应都显示出DNI蛋白的大量交联,如通过没有向浓缩胶中的迁移来证明。池4的孔下出现的拖尾与整个PPS 14:DNI PCMV组合物孔下的拖尾相似表明在这些样品中存在较小分子量的物质。
也使用采用抗PPS 14血清探测的DNI捕获ELISA来表征PPS 14:DNIPCMV组分池和整个(未分级的)PPS 14:PCMV基质疫苗组合物来确定PPS 14抗原是否仍旧包载而表面暴露(参见图13)。简言之,使疫苗制剂结合固定在固体支持物上的小鼠抗DNI捕获抗体。洗去未结合的物质并使用多克隆兔抗PPS 14抗体(Miravista Diagnostics)来检测仍旧与DNI基质蛋白质相缔合的PPS 14抗原。使用兔抗DNI检测抗体来证明基质疫苗制剂实际上被DNI捕获抗体所捕获。
在所有的PCMV分级池1-4中检测到PPS 14。令人感兴趣的是,在池4中检测到较少的PPS 14抗原,表明较少的PPS 14包载。这一结果与显示出池4的较小分子量物质的证据的SDS-PAGE凝胶一致。在用于捕获ELISA的浓度下,用于整个PCMV组合物的PPS 14抗原信号弱,然而,当用捕获DNI抗体孵育较高浓度的整个(未分级的)PCMV组合物时,清晰地检测到载体基质中PPS 14的存在(数据未示出)。相反,当用捕获DNI抗体孵育具有外源性加入的PPS 14的交联化DNI时,通过PPS 14抗体没有检测到信号,表明缺少通过交联的DNI包载的外源PPS 14(图13A,空心矩形(□))。池1-4和交联的DNI对照被捕获DNI抗体结合(图13B)。整个PCMV组合物也被DNI捕获抗体结合并且当用捕获抗体孵育较高浓度的整个PCMV组合物时,被DNI检测抗体检测到(数据未示出)。因此,DNI捕获ELISA证明在DNI蛋白质基质中存在PPS 14的显著包载和表面定位。
根据下面的方法,使用包括组分的本实验池1-4来免疫小鼠。从被分池的组分制备组合物并且制备包括明矾佐剂的整个未分级的PPS 14:DNIPCMV用于免疫研究。
接种组合物
根据下面的设计,用接种组合物接种每组5-6只小鼠(共80只小鼠)的各组:
组1-0.5μg池1(左空)+明矾(6)
组2-2μg池1(左空)+明矾(6)
组3-0.5μg池2(中空)+明矾(6)
组4-2μg池2(中空)+明矾(6)
组5-0.5μg池3(右空)+明矾(6)
组6-2μg池3(右空)+明矾(6)
组7-0.5μg池4(拖尾峰)+明矾(6)
组8-2μg池4(拖尾峰)+明矾(5)
组9-0.5μg整个PCMV组合物+明矾(6)
组10-2μg整个PCMV组合物+明矾(5)
组11–阳性对照:单独0.5μg PPS 14抗原(5)
组12-阳性对照:单独2μg PPS 14抗原(6)
组14–阴性对照:未处理的未免疫接种疫苗的(5)
上述剂量通过载体蛋白(DNI)量来列出。
Wyeth(Madison,NJ,USA)制造并出售的肺炎疫苗是以明矾为佐剂的常规缀合疫苗,其含有2μg的PPS 14以及六种其他的肺炎链球菌多糖抗原,全部与总计20μg作为载体蛋白的CRM197交联。通过使用疫苗作为对照疫苗,将由尺寸-分级的蛋白质荚膜基质疫苗(PCMV)引发的对PPS 14的免疫应答直接与通过常规缀合疫苗引发的PPS14特异性应答相比较。也包括一组未处理的未免疫小鼠作为对照组。
免疫方案在表8中提出:
通过PPS 14ELISA分析血清抗PPS 14特异性IgG反应并以各个滴度和端点GMT来绘图(参见图12)。
参照图13A,来自用池1-4或整个PCMV免疫的小鼠的血清展现出比来自用单独0.5μg PPS14免疫的小鼠的血清有明显更高的PPS 14特异性IgG免疫应答,特别是池1和2,它们被确定为分别含有0.03μg PS和0.06μg PS抗原。图13A显示出用池1-4以及用有0.5μg DNI的整个PCMV免疫后的抗PPS 14特异性IgG反应;图13B显示出用池1-4以及用有2.0μg DNI的整个PCMV免疫后的抗PPS 14特异性IgG反应。在用池1-4或整个PCMV免疫的小鼠的血清中的PPS 14-特异性IgG滴度相比于来自用单独0.5μg PPS 14免疫的小鼠的血清中的PPS 14-特异性IgG滴度随时间增加。
图14示出以0.5μg DNI免疫,在第38天抗PPS 14端点滴度(血样#3),以及第38天的几何平均滴度示出于下表9。
值得注意的是用基质疫苗组分免疫所实现的抗PPS 14抗原滴度与单独使用抗原免疫的滴度相当。结果证实了通过将抗原包载到交联的蛋白质载体中所实现的免疫原性的优势。
具有最大的交联DNI颗粒(池1-3)的组分显示出比抗原单独或者甚至是池4(特征是相比于池1-3,较小分子量的DNI载体蛋白颗粒)或整个PPS 14:DNI疫苗组合物(含有所有颗粒尺寸范围)显著更大的免疫原性。当考虑到池1、2和3组合物所包载抗原含量比其他PCMV组合物(池4和整个PCMV)以及只有PS抗原的对照低3-17倍时,这些结果尤其出人意料。
相比于常规疫苗,含有较大尺寸的载体蛋白颗粒的池1和2引发可比较的抗PPS 14应答。考虑到给予的PCMV池1和2中的PPS 14抗原的实际剂量明显低于中含有的PPS 14的剂量:池1剂量比剂量约少66倍PPS 14抗原,并且池2剂量相比于剂量约少33倍PPS 14抗原,这一可比较的抗PPS 14应答是很显著的。
图15示出对于以2μg DNI免疫,在第38天的抗PPS 14端点滴度(血样#3),以及第38天的几何平均滴度示出于下表10。
再次,用基质疫苗组分免疫所实现的抗PPS 14抗原滴度优于单独使用抗原免疫所实现的滴度。结果证实了通过将抗原包载到交联的蛋白质载体中所实现的免疫原性的优势。
具有最大的交联DNI颗粒(池1-3,参见图11)的组分显示出比抗原单独或者甚至是池4(特征是相比于池1-3,更小分子量DNI载体蛋白质颗粒)或整个PPS 14:DNI疫苗组合物(含有所有颗粒尺寸范围)显著更大的免疫原性。当考虑到池1、2和3组合物所包载抗原含量比其他PCMV组合物(池4和整个PCMV)以及只有PS抗原的对照低3.7-16.7倍时,这些结果尤其出人意料。
含有较大尺寸的交联DNI载体颗粒的池1、2和3以与常规疫苗相同的级别引发抗PPS 14反应。考虑到给予的PCMV池1、2和3中的PPS 14抗原的实际剂量明显低于注射中含有的PPS 14的剂量:对于池1约少17倍PPS 14抗原,对于池2约少9倍PPS 14抗原以及对于池3约少4倍PPS 14抗原,这一可比较的抗PPS 14反应是很显著的。
再次参照图15,相比于单独用PPS14免疫的小鼠的血清,在用PCMV分级的池、未分级的PCMV组合物或进行免疫的小鼠中,总的PPS 14特异性IgG滴度增加。单独用PPS 14抗原免疫的小鼠在0.5μg和2μg PPS 14剂量水平时,都显示出PPS 14特异性IgG滴度随时间减小。这表明“免疫记忆”反应通过PCMV和接种所引发。
这些数据表明荚膜抗原作为基质疫苗一部分的存在不仅仅比单独用抗原进行免疫更有效而且可以比常规缀合疫苗更有效。这对于疫苗配制工艺有重要的启示,表明合理地调控基质颗粒尺寸可以显著地简化疫苗设计和生产工艺并且可以显著地降低引发保护性免疫应答所需的抗原量。
很明显,在理想的抗原存在下,允许载体蛋白交联反应以继续生产大的基质颗粒(即,>100nm直径)会非常有效地包载抗原。另外,即使当颗粒含有非常少量的抗原时,生产较大交联的载体颗粒尺寸(或者从反应中选择高分子量组分)实质上增强了PCMV组合物的免疫原性。数据显示出PCMV组合物的尺寸分级和用较大尺寸颗粒免疫动物可以诱导增强的抗PS特异性IgG反应,这与由常规缀合疫苗诱导的反应相当。此外,这些数据表明也可以通过用PCMV免疫来获得通过常规缀合疫苗(例如)引发的记忆免疫应答。
实施例4
使用弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)多糖Vi和DNI载体蛋白的基质疫苗组合物来制造Vi:DNI PCMV。多糖(弗氏柠檬酸杆菌Vi)和载体蛋白(DNI)以1:1重量比混合并且对于每种组分以7.5mg/ml呈递。交联反应以1.5ml体积进行,添加戊二醛作为交联剂至最终戊二醛浓度为0.25%,反应混合物在4℃孵育23小时。在那时,加入还原希夫碱的氰基硼氢化钠至浓度为20mg/ml并且另外孵育反应混合物1小时。
使用0.9mg/ml Vi抗原缀合牛血清白蛋白制备缀合物疫苗作为比较对照。
将部分的Vi:DNI PCMV反应混合物施加到100mlCL-2B交联的琼脂糖凝胶尺寸分级柱(Sigma-Aldrich)中以根据颗粒尺寸来分离Vi:DNI基质疫苗组合物。使用10mM含有150mM NaCl的磷酸盐缓冲液进行分级。分离四个池的Vi:DNI PCMV洗脱组分用于进一步的评估(参见图16)。
通过DNI捕获ELISA评估单个组分(图16)(图17)并且结果确定了组分如何最终被分入池中用于制造免疫组合物。通过固定化的抗DNI抗体捕获后,检测所有PCMV分级的制剂(图17A,组分13-25)和整个未分级的PCMV中的Vi。在对应于从柱中洗脱的最大颗粒尺寸的组分13中,最强烈地检测到Vi。Vi的检测对于被检测组分的剩余部分基本上是相当的,总趋势是含有较大尺寸的交联的DNI颗粒的早期组分具有比含有较小DNI颗粒的后面的组分稍微更易于检测的表面呈递的Vi抗原。这假定是由于包载较少Vi的较小颗粒尺寸。也在这些组分所来源的整个PCMV反应混合物中检测到Vi PS。相反,当用捕获抗DNI抗体来孵育外源性地添加了Vi PS的交联DNI时,由于缺少Vi包载,Vi特异性抗体没有检测到信号。单个Vi:DNI组分、未分级的Vi:DNI以及交联的DNI对照都以相似的程度被捕获抗DNI抗体所结合(图17B)。因此,DNI捕获ELISA证明在Vi:DNI蛋白质基质中存在可检测水平的包载表面定位的Vi。
显示出包载、呈递Vi PS的组分被收集并用于制备接种组合物(图17,阴影条)。通过SDS-PAGE以及考马斯亮蓝染色来分析交联完整性(图18)。收集的组分和整个PCMV反应混合物都含有非常高分子量的交联DNI物质,没有看到该物质向浓缩胶中的迁移而是留在了上样孔中。未交联的DNI形成较小分子量的条带(下面的箭头)。通过UV280吸光值来测定组分中存在的DNI的量。基于PS 14:DNI PCMV的比例来预计载体/抗原比例以及按表11所列,基于DNI来计算在10μg剂量中存在的Vi抗原量:
制备收集的组分和相关的对照用于免疫实验:
接种组合物
1.池1(10μg DNI)+明矾
2.池2(10μg DNI)+明矾
3.池3(10μg DNI)+明矾
4.池4(10μg DNI)+明矾
5.10μg DNI/整个PCMV+明矾
6.5μg PS Vi-BSA缀合物+明矾2μg伤寒沙门氏菌来源的Vi抗原单独(对照)
7.2μg弗氏柠檬酸杆菌来源的Vi抗原单独(对照)
使用表12示出的标准剂量方案(两周间隔的三次注射)将组合物腹膜内注射小鼠。Vi-BSA缀合物疫苗比较对照含有0.9mg/ml共价结合到BSA的Vi。也包括一组未处理的未免疫接种的小鼠作为对照组。
通过Vi ELISA评估血清抗Vi PS特异性IgG反应并按照各个滴度和端点GMT绘图(参见图19)。
图19示出在用10μg DNI的分级的PCMV池或整个PCMV免疫后,抗Vi特异性IgG反应的动力学。用较大的交联DNI颗粒(池1-3)免疫的小鼠的血清产生比用10μg Vi单独免疫小鼠的血清更高的Vi特异性IgG反应。相比之下,用池4(较小DNI颗粒)或整个PCMV免疫产生的Vi特异性抗体反应与用Vi单独免疫的小鼠相似。相比于单独用10μg Vi免疫的小鼠的血清,用池1-3免疫的小鼠的血清中的Vi特异性IgG滴度随时间增加。
当完成免疫方案时,计算在第41天(即最后一次免疫后2周)的Vi特异性IgG反应,作为相互的(reciprocal)几何平均滴度(GMT)(图20),如下表所列。
用PCMV池1、2或3免疫的小鼠产生的抗Vi特异性IgG GMT比单独用Vi免疫的小鼠高2-3倍。相反,用Vi-BSA缀合物的免疫相比于单独用Vi免疫诱导出高10倍的Vi特异性IgG GMT。Vi缀合物和Vi PCMV各诱导的抗Vi抗体水平比单独Vi诱导的更高。Vi-BSA缀合物(5μg Vi)比含有较少Vi抗原的PCMV制剂引发更高滴度的抗Vi抗体(参见图16和表11)。相比于肺炎链球菌PPS 14,具有较少免疫原性的多糖(PS)例如Vi,诸如颗粒尺寸和剂量的因素可以影响与单独用Vi PS免疫相比的免疫原性。根据由于洗脱谱相似而通过PPS14-DNI PCMV分级测定获得的相似PS蛋白量,推测Vi PS的量在尺寸-分级的PCMV池1(~0.66μg)中为Vi-BSA缀合物中Vi剂量的13%,在池2(~1μg)中为Vi-BSA缀合物中Vi剂量的20%,并且在池3(~5μg)中为Vi-BSA缀合物中Vi剂量的40%。因此,尽管Vi缀合物引发Vi:DNI PCMV池中相互的(reciprocal)抗Vi抗体滴度(2263)的约4-6倍,如果使反应对剂量标准化,那么Vi:DNIPCMV池1、池2和池3分别引发的相互的抗Vi抗体滴度为3030、2625和1515。因此,尺寸-分级的Vi:DNI PCMV组合物与Vi蛋白缀合物相当或比之稍好。
另外,应指出这一实例的免疫根据不同的载体蛋白(BSA vs.DNI基质)比较疫苗组合物。载体蛋白的选择会对制剂的致免疫力有影响。此外,并不确定用于制备缀合物和PCMV的Vi是否相同,并且来自不同来源的Vi抗原的抗原性和免疫原性可以显著不同。
总体上,对于Vi抗原,实施例2和4的数据表明:(i)用较高浓度的反应物配制的PCMV更有效地包载多糖,其中产物迁移到更高分子量物质处,(ii)继续反应以产生更大尺寸颗粒(>120nm直径)增强免疫原性以及(iii)PCMV反应的尺寸组分和用较大尺寸颗粒免疫动物诱导对Vi/蛋白质缀合物可比较的滴度以及比单独Vi抗原更高的滴度。
实施例5
维持来自实施例1的免疫组的小鼠用于免疫记忆实验。在随后的时间点收集另外的血清7个月以监测抗PPS 14免疫应答的动力学。最终,用同源PCMV或PPS 14制剂加强小鼠并且分析血清的辅助性T细胞类记忆(Th依赖的)免疫应答的产生。
在实施例1的三剂量免疫方案后约7个月,用下表示出的组合物加强小鼠:
在加强后4天和3周收集被加强的动物的血清以评估抗PPS14IgG免疫应答。选择第239天(加强后4天)时间点,因为如果引发记忆免疫应答,那么特异的IgG抗体的相应增加将显而易见。选择第260天(加强后3周)时间点,因为如果引发记忆应答,那么IgG抗体滴度将连续增加。总体上,在初始PPS 14:DNI PCMV免疫方案后,PPS14特异性IgG仍旧相对很高,如通过范围在152,691至334,531的加强前高GMT所示(表14,第3栏)。在加强后4天,相比于用PPS14抗原单独免疫的小鼠,只在PCMV免疫的动物中观察到PPS 14特异性IgG抗体的增加(表14,第3栏vs.第4栏)。与这些数据一致,在3周时间点,在PCMV免疫的小鼠中的加强反应显著增加(GMT为816,890或863,756),而仅PS免疫的小鼠的抗PPS14特异性IgG或者不增加或者增加微小(表14,第5栏)。
为了进一步探究PCMV配制的PPS14是否引发Th记忆反应,分析并测定IgG与IgM的比例(参见图21)。仅有多糖的疫苗通常引发IgM和低水平的IgG,而多糖蛋白质缀合物疫苗引发基本上更高水平的IgG。总体上,IgM比IgG在其抗原缀合亲和性上更加非特异。因此,在未处理的动物中观察到较低的IgG与IgM比,表明这一组中背景水平的非特异性抗体的存在。用单独PPS14免疫比未处理的动物诱导更多的抗PPS 14特异性免疫应答,产生比IgM更特异的IgG(IgG∶IgM,~1∶1)。在明显的对比中,相比于用PS单独免疫,用PPS 14:DNI PCMV池1和池2制剂免疫的小鼠引发比IgM明显更多的IgG,比例约有10-100倍变化。
从这些结果中看出,PPS 14:DNI PCMV免疫的动物在初始3剂量免疫方案后约7个月给予的加强免疫后产生PPS14特异性IgG的增加。在这一加强后4天和3周收集的血清强烈地表示Th依赖的、或者“记忆”免疫应答的产生。此外,用PPS 14:DNI PCMV制剂免疫的小鼠的IgG:IgM比例进一步支持了对所引发的记忆反应的观察(图21)。
所有专利、专利申请、专利申请出版物以及其他在此引用或参考的出版物都以如同各独立的专利、专利申请、专利申请出版物以及出版物具体地且独立地表示为通过引用作为参考的相同程度被引用作为参考。
Claims (20)
1.一种免疫原性组合物,包括(1)目的抗原和(2)载体蛋白,其中所述载体蛋白交联以形成蛋白质基质,所述目的抗原被所述蛋白质基质包载,并且所述组合物由平均颗粒尺寸大于100nm直径的蛋白质基质颗粒组成。
2.权利要求1的组合物,其中所述组合物包括平均颗粒尺寸直径大于120nm、大于170nm、大于200nm、大于500nm、大于1000nm、大于2000nm或者更大的蛋白质基质颗粒。
3.权利要求1的组合物,其中所述组合物包括具有平均颗粒尺寸直径为100nm至2000nm的蛋白质基质颗粒。
4.权利要求1的组合物,其中所述组合物包括颗粒尺寸直径在100至2000nm范围的蛋白质基质颗粒。
5.前述权利要求任何之一的组合物,其中抗原与载体蛋白的摩尔比是在1比10和10比1之间。
6.权利要求1的组合物,其中所述目的抗原包括两种或多于两种的抗原。
7.权利要求1的组合物,其中所述目的抗原是多糖。
8.权利要求7的组合物,其中所述多糖选自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)多糖、土拉热弗朗西丝菌(Francisellatularensis)多糖、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)多糖、流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)多糖、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)多糖、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)多糖、沙门氏菌属(Salmonella)物种的多糖、志贺氏杆菌(Shigella)多糖、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)多糖。
9.权利要求8的组合物,其中所述肺炎链球菌多糖选自荚膜类型3、4、6B、7A、7B、7C、7F、9A、9L、9N、9V、12A、12B、12F、14、15A、15B、15C、15F、17、18B、18C、19F、23F、25A、25F、33F、35、37、38、44或46。
10.前述权利要求中任一项的组合物,其中载体蛋白选自白喉类毒素、CRM 197、破伤风类毒素、铜绿假单孢菌的外毒素A或其突变体、霍乱毒素B亚基、破伤风毒素片段C、细菌鞭毛蛋白、肺炎链球菌溶血素、脑膜炎奈瑟氏球菌的外膜蛋白、铜绿假单孢菌Hcpl蛋白、大肠杆菌的热不稳定肠毒素、志贺-样毒素、人LTB蛋白,李斯特菌溶胞素O、来自整个细菌细胞的蛋白质提取物、炭疽芽孢杆菌保护性抗原的显性负抑制物(DNI)突变体或者大肠杆菌β半乳糖苷酶。
11.一种制造免疫原性组合物的方法,包括(i)将目的抗原与载体蛋白混合以形成混合物,和(ii)交联所述载体蛋白以形成包载所述目的抗原的载体蛋白质基质,其中在所述组合物中不超过50%的所述目的抗原与所述载体蛋白是交联的,以及(iii)从得到的组合物中除去具有平均颗粒尺寸直径小于100nm的蛋白质基质颗粒。
12.权利要求11的方法,其中,在步骤(iii),选择平均颗粒尺寸直径大于120nm、大于170nm、大于200nm、大于500nm、大于1000nm、或大于2000nm的蛋白质基质颗粒。
13.权利要求12的方法,其中所选择的蛋白质基质颗粒具有平均颗粒尺寸直径在100至2000nm范围的蛋白质基质颗粒。
14.权利要求12的方法,其中所选择的蛋白质基质颗粒具有平均颗粒尺寸直径在200至1000nm范围的蛋白质基质颗粒。
15.权利要求12的方法,其中所选择的蛋白质基质颗粒具有平均颗粒尺寸直径在120至200nm范围的蛋白质基质颗粒。
16.一种制造蛋白质基质疫苗组合物的方法,包括(i)将目的抗原与载体蛋白混合,和(ii)用交联剂启动交联反应,该交联剂交联所述载体蛋白上的官能团,以及(iii)从所述反应混合物中选择具有平均颗粒尺寸直径大于100nm的蛋白质基质颗粒。
17.权利要求16的方法,其中所选择的蛋白质基质颗粒具有大于120nm、大于170nm、大于200nm、大于500nm、大于1000nm、或者大于2000nm的平均颗粒尺寸直径。
18.权利要求16的方法,其中所选择的蛋白质基质颗粒具有平均颗粒尺寸直径在100至2000nm范围的蛋白质基质颗粒。
19.权利要求17的方法,其中所选择的蛋白质基质颗粒具有平均颗粒尺寸直径在200至1000nm范围的蛋白质基质颗粒。
20.一种针对传染因子向受试者接种的方法,所述方法包括向受试者给予足以引发免疫应答的量的根据权利要求1的组合物。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US27618309P | 2009-09-09 | 2009-09-09 | |
US61/276,183 | 2009-09-09 | ||
PCT/US2010/048311 WO2011031893A1 (en) | 2009-09-09 | 2010-09-09 | Protein matrix vaccines of improved immunogenicity |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN102686238A true CN102686238A (zh) | 2012-09-19 |
Family
ID=43732799
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN2010800504126A Pending CN102686238A (zh) | 2009-09-09 | 2010-09-09 | 具有改善的免疫原性的蛋白质基质疫苗 |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20120231086A1 (zh) |
EP (1) | EP2473188A4 (zh) |
JP (1) | JP2013504588A (zh) |
KR (1) | KR20120104178A (zh) |
CN (1) | CN102686238A (zh) |
AU (1) | AU2010292195A1 (zh) |
BR (1) | BR112012005349A2 (zh) |
CA (1) | CA2773690A1 (zh) |
MX (1) | MX2012002932A (zh) |
WO (1) | WO2011031893A1 (zh) |
ZA (1) | ZA201201714B (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104059941A (zh) * | 2013-03-19 | 2014-09-24 | 苏州工业园区唯可达生物科技有限公司 | 一种融合基因真核表达构建体、基因工程疫苗及其制备方法 |
Families Citing this family (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DK2709656T3 (da) | 2011-05-18 | 2019-06-24 | Matrivax Inc | Proteinmatrix-vaccinesammensætninger omfattende polykationer |
US10500283B2 (en) * | 2011-05-30 | 2019-12-10 | National Institute Of Immunology | Vaccine composition capable of inducing memory antibody response from single point immunization |
US9815886B2 (en) | 2014-10-28 | 2017-11-14 | Adma Biologics, Inc. | Compositions and methods for the treatment of immunodeficiency |
US10259865B2 (en) | 2017-03-15 | 2019-04-16 | Adma Biologics, Inc. | Anti-pneumococcal hyperimmune globulin for the treatment and prevention of pneumococcal infection |
BR112019026192B1 (pt) | 2017-06-10 | 2022-05-10 | Inventprise, Llc | Vacinas de conjugado multivalente com polissacarídeos de conjugado bivalente ou multivalente que fornecem imunogenicidade e avidez melhoradas |
US10729763B2 (en) | 2017-06-10 | 2020-08-04 | Inventprise, Llc | Mixtures of polysaccharide-protein pegylated compounds |
GEP20227420B (en) | 2017-12-06 | 2022-10-10 | Merck Sharp & Dohme Llc | Compositions comprising streptococcus pneumoniae polysaccharide-protein conjugates and methods of use thereof |
JOP20210148A1 (ar) | 2018-12-19 | 2023-01-30 | Merck Sharp & Dohme | تركيبات تشتمل على متقارنات بولي سكاريد-بروتين للمكورات العقدية الرئوية وطرق استخدامها |
NL2023863B1 (en) * | 2019-09-20 | 2021-05-25 | Univ Griffith | Protein particles and uses thereof |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20020164357A1 (en) * | 1995-09-18 | 2002-11-07 | George H. Lowell | Methods for the production of non-covalently complexed and multivalent proteosome sub-unit vaccines |
US20080095803A1 (en) * | 2006-08-07 | 2008-04-24 | President And Fellows Of Harvard College | Protein matrix vaccines and methods of making and administering such vaccines |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7129222B2 (en) * | 2000-03-10 | 2006-10-31 | Dynavax Technologies Corporation | Immunomodulatory formulations and methods for use thereof |
-
2010
- 2010-09-09 EP EP10816102.7A patent/EP2473188A4/en not_active Withdrawn
- 2010-09-09 CN CN2010800504126A patent/CN102686238A/zh active Pending
- 2010-09-09 WO PCT/US2010/048311 patent/WO2011031893A1/en active Application Filing
- 2010-09-09 MX MX2012002932A patent/MX2012002932A/es not_active Application Discontinuation
- 2010-09-09 US US13/394,147 patent/US20120231086A1/en not_active Abandoned
- 2010-09-09 JP JP2012528904A patent/JP2013504588A/ja not_active Withdrawn
- 2010-09-09 AU AU2010292195A patent/AU2010292195A1/en not_active Abandoned
- 2010-09-09 BR BR112012005349A patent/BR112012005349A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2010-09-09 CA CA2773690A patent/CA2773690A1/en not_active Abandoned
- 2010-09-09 KR KR1020127009044A patent/KR20120104178A/ko not_active Application Discontinuation
-
2012
- 2012-03-08 ZA ZA2012/01714A patent/ZA201201714B/en unknown
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20020164357A1 (en) * | 1995-09-18 | 2002-11-07 | George H. Lowell | Methods for the production of non-covalently complexed and multivalent proteosome sub-unit vaccines |
US20080095803A1 (en) * | 2006-08-07 | 2008-04-24 | President And Fellows Of Harvard College | Protein matrix vaccines and methods of making and administering such vaccines |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104059941A (zh) * | 2013-03-19 | 2014-09-24 | 苏州工业园区唯可达生物科技有限公司 | 一种融合基因真核表达构建体、基因工程疫苗及其制备方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR20120104178A (ko) | 2012-09-20 |
CA2773690A1 (en) | 2011-03-17 |
ZA201201714B (en) | 2012-11-28 |
EP2473188A1 (en) | 2012-07-11 |
EP2473188A4 (en) | 2014-01-01 |
JP2013504588A (ja) | 2013-02-07 |
US20120231086A1 (en) | 2012-09-13 |
BR112012005349A2 (pt) | 2016-03-29 |
AU2010292195A1 (en) | 2012-03-15 |
MX2012002932A (es) | 2012-09-07 |
WO2011031893A1 (en) | 2011-03-17 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN102686238A (zh) | 具有改善的免疫原性的蛋白质基质疫苗 | |
US9533032B2 (en) | Protein matrix vaccines and related methods of making and administering such vaccines | |
CN103747798B (zh) | 包含聚阳离子的蛋白质基质疫苗组合物 | |
CN101553246B (zh) | 蛋白质基质疫苗及这种疫苗的制备和给药方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20120919 |