CN103623405B

CN103623405B - 多糖-蛋白轭合物疫苗

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Publication number: CN103623405B
Application number: CN201310439763.1A
Authority: CN
Inventors: 车恒·罗伯特·李; 卡尔·E·弗拉施
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 2003-08-06
Filing date: 2004-08-06
Publication date: 2016-06-15
Anticipated expiration: 2024-08-06
Also published as: BRPI0413309A; EP2366403A3; CA2534870A1; BRPI0413309B1; EP1651261A2; AU2004263135B2; CA2534870C; CA2948114C; CA2844154A1; AU2004263135A1; WO2005014037A2; AU2004281630A1; CA2535043A1; CA2948114A1; US20070110762A1; WO2005037320A3; EP1651262A2; WO2005037320A2; CN1863553B; EP2366404B1

Abstract

本发明公开了以高产率合成和制备多糖-蛋白轭合物疫苗的方法。该方法涉及一种反应物上的酰肼基团与其他反应物上的醛基或氰酸盐酯基的反应。所述反应以较高的轭合效率快速进行，因此可以采用简化的纯化方法从未轭合的蛋白和多糖以及其他小分子副产物中分离出所述轭合物。

Description

多糖-蛋白轭合物疫苗

发明领域

本发明提供了以较高产量合成与制备多糖-蛋白轭合物疫苗的方法。该方法涉及在一种反应物上的酰肼基与另一种反应物上的醛基或氰酸盐酯基反应。所述反应以较高的轭合效率快速进行。可使用简化的纯化方法从未轭合的蛋白和多糖以及其他小分子副产物中分离所述轭合产物。

发明背景

细菌多糖(PSs)是在大龄儿童和成人中诱导短期免疫的非T细胞依赖性抗原，但幼小婴儿却常常缺乏。PSs并不能与主要组织相容性复合物结合，所述主要组织相容性复合物是抗原提呈以及刺激T-辅助淋巴细胞所必需的。PSs可以在无需T-辅助细胞淋巴细胞的帮助下刺激B淋巴细胞产生抗体。作为所述B淋巴细胞非T细胞依赖性刺激的结果，在这些抗原的免疫之后依然缺少记忆诱导。

通过多糖与蛋白分子的共价结合，非T细胞依赖性多糖抗原可转变为T细胞依赖性抗原。结合于所述轭合物疫苗多糖部分的B细胞可由辅助性T细胞来活化，该辅助性T细胞对该轭合载体蛋白部分的多肽具有特异性。对该载体蛋白产生应答的T辅助细胞能增强针对该多糖的抗体产生。多糖轭合疫苗是由蛋白与多糖的共价连接形成的多糖-蛋白杂合体。因为大多数天然细菌多糖在先经受某些化学修饰(“活化”)之前不能与蛋白化学相连，所以通常需要在结合前对所述多糖进行化学修饰。

对所述蛋白的结合产生了多种T细胞抗原决定簇。这些T细胞抗原决定簇会与CD4辅助性T细胞相互作用，极大地促进对所述结合多糖的抗体应答。甚至在婴儿体内，对轭合物的所述T辅助细胞依赖性应答可产生血清IgG抗体和免疫记忆。而且，与天然多糖相比，所述多糖轭合物的免疫原性对所述轭合多糖的大小的依赖程度有所降低。因此，采用多糖或寡糖制备的轭合物具有类似的免疫原性。

可采用多种轭合反应将多糖与蛋白共价连接。三种较为常用的方法有：1)还原性氨基化，其中一种反应成分的醛基或酮基与另一种反应成分的氨基或酰肼基反应，所形成的C=N双键随后被还原剂还原成C-N单键；2)氰基化轭合，其中可通过溴化氰(CNBr)或1-氰-4-二甲基氨基吡啶四氟硼酸(CDAP)向该羟基引入一个氰基，在加入蛋白成分后，其与氨基或酰肼基形成共价键；3)碳二亚胺反应，其中碳二亚胺能活化所述轭合反应中一种成份的羧基，所活化的羧基再与另一成分的氨基或酰肼基反应。这些反应经常被用来在所述轭合反应之前对所述轭合物的成份进行活化。

b型嗜血流感杆菌(Hib)轭合物疫苗是用于临床的第一种多糖-蛋白轭合物疫苗。Robbins及其同事在1980年运用生物工程技术将糖化学地连接到蛋白载体上，这是50年前就发展出来的概念。参见Avery等人，J.Exp.Med.1929;50:533-550;Schneerson等人，J.Exp.Med1980;152:361-376。在美国目前有四种不同的Hib轭合物疫苗获得了许可，每种各不相同，且各自具有其物理，化学和免疫学特征，如表1所总结。在这些疫苗所使用的轭合化学和质量控制的详细论述已经出版。参见Ellis等人在《b型等嗜血杆菌轭合物疫苗的发展与临床应用》(DevelopmentandclinicalusesofHaemophilusbconjugatevaccines)一书中由Kniskern等人所著的《轭合物：设计，化学与分析》"Conjugation:design,chemistry,andanalysis"章节，纽约，MarcelDekker出版社，1994年，37-69页。

表1

*所述四种Hib轭合物疫苗通常以其缩写以及括号中对应的生产厂商来进行描述。

最先商业化的Hib轭合物，多聚核糖基核糖醇磷酸白喉类毒素轭合物(PRP-D)通过6-碳间隔物、己二酸二酰肼(ADH)连接于白喉类毒素的部分大小减少的Hib多糖，使用的是Schneerson等人的方法，J.Exp.Med.1980;152:361-376。在1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)存在的条件下，使用ADH以该方法进行反应得到了白喉类毒素的ADH衍生物。然后通过使用CNBr在所述羟基上产生氰基来活化所述His多糖。将所活化的多糖与所述ADH-类毒素(氰基化轭合)轭合，但该方法产生的连接不稳定，而且所述轭合物还具有溶解性的问题。

随后对Robbins轭合化学进行了改进，使得所述ADH间隔物首先被加在所述多糖上，然后在EDC(碳二亚胺反应)存在的条件下，将该多糖轭合于纯化的蛋白。参见Chu等人,Infect.Immun.1983;40:245-256；Schneerson等人,Infect.Immun.1986,52:519-528。这一改进提高了轭合效率和产物的溶解性。多聚核糖基核糖醇磷酸破伤风蛋白轭合物(PRP-T)疫苗就是利用这一改进的化学方法共价地将Hib多糖连接于破伤风类毒素(参见表1)。

多聚核糖基核糖醇磷酸交联反应突变体白喉类毒素轭合物(PRP-CRM)疫苗，也称为嗜血流感杆菌b型寡糖轭合物(HbOC)，并不含有His多糖。相反，它利用的是在核糖醇部分中通过乙二醇官能性的高碘酸氧化衍生得到的约20个重复单位的寡糖。然后在氰基硼氢钠(还原氨基化)存在的条件下，将所述氧化的寡糖直接连接于CRM₁₉₇，其是从白喉杆菌(Corynebacteriumdiphtheriae)C7(β197)的培养物中分离到的一种白喉毒素的无毒性突变体。参见Anderson等人J.Immunol.1989;142:2464-8；以及Anderson,Infect.Immun.1983,39:233-238。在这种轭合方法中，认为寡糖与蛋白的比率对最佳的抗体应答至关重要。参见Ellis等人在《b型等嗜血杆菌轭合物疫苗的开发与临床应用》(DevelopmentandclinicalusesofHaemophilusbconjugatevaccines)一书中由Kniskern等人所著的《轭合物：设计，化学与分析》"Conjugation:design,chemistry,andanalysis"章节，纽约，MarcelDekker出版社，1994年，37-69页；以及Anderson等人,J.Immunol.1989;142:2464-8。

与其他Hib轭合物疫苗相比，Hib多糖-脑膜炎萘瑟菌(Neisseriameningitidis)外膜蛋白复合体轭合物疫苗(PRP-OMPC)具有多种独特的性质。所述蛋白载体并不是白喉，破伤风和百日咳(DTP)疫苗的成分，但却由脂多糖缺失的脑膜炎球菌外膜囊泡以及其上通过硫醚连接的大小缩小的Hib多糖构成。参见Marburg等人J.Amer.Chem.Soc.1986;108:5282-5287；Ellis等人在《b型等嗜血杆菌轭合物疫苗的发展与临床应用》(DevelopmentandclinicalusesofHaemophilusbconjugatevaccines)一书中由Kniskern等人所著的《轭合物：设计，化学与分析》"Conjugation:design,chemistry,andanalysis"章节，纽约，MarcelDekker出版社，1994年，37-69页；以及Anderson等人,J.Immunol.1989;142:2464-8。在该方法中，将单独的连接物与所述蛋白和Hib多糖连接，然后将所述连接物融合形成硫醚键。

脑膜炎萘瑟菌(Neisseriameningitidis)是全世界细菌性脑膜炎和败血症的首要原因。致病性脑膜炎球菌由多糖荚膜包被，该荚膜与该有机体的外膜表面相连接。根据荚膜多糖的免疫学特异性，已鉴定出了13种不同的脑膜炎球菌血清型(Frasch,C.E.等人，1985)。在这13种血清型中，有5种能导致绝大多数的脑膜炎球菌疾病；这些血清型包括血清型A，血清型B，血清型C，血清型W135和血清型Y。血清型A是造成大多数流行病的原因。血清型B，血清型C，和血清型Y能导致大多数的地方病及其局部爆发。对侵入性脑膜炎球菌的宿主防御依赖于补体介导的溶菌作用。负责补体介导的溶菌作用的血清抗体主要旨在对付所述外荚膜多糖。

基于脑膜炎球菌多糖的常规疫苗能够引起对于所述荚膜多糖的免疫应答。这些抗体能对所述血清型特异的脑膜炎球菌产生补体介导的溶菌作用。所述脑膜炎球菌多糖疫苗在儿童和成人中都表现得相当有效。然而，在婴儿和幼儿中，其效率受到限制，其在幼儿人群中的后续剂量仅能引起较弱的应答或不能增强应答。

如表2所总结的，已采用了多种方法来活化所述脑膜炎球菌的多糖并进行轭合作用。在所述多糖分子上，即使仅有相对较少的几个位点被活化的时候，每种活化方式也都具有改变重要抗原决定簇的潜能。例如，对C型脑膜炎球菌多糖的高碘酸活化，就能导致链断裂从而产生具有末端醛基的较小的糖单位，其可通过还原氨基化连接于所述蛋白。参见，Richmond等人,J.Infect.Dis.1999;179:1569-72。

表2

a.己二酸的N-羟基琥珀酰亚胺二酯

b.脱乙酰化的多糖，仅对C型脑膜炎球菌有过报道

在所述Hib轭合物的商业化之前，就已经出现了关于C型脑膜炎球菌轭合物的生产与优化的早期研究的报道。参见Beuvery等人,Infect.Immun.1982;37:15-22；Beuvery等人,Infect.Immun.1983;40:39-45；Beuvery等人,J.Infect.1983;6:247-55；Jennings等人,J.Immunol.1981;127:1011-8。

关于将所述C型多糖与蛋白载体的化学连接报道过两种不同的轭合方法。参见Jennings等人,J.Immunol.1981;127:1011-8；Beuvery等人,Infect.Immun.1983;40:39-45。第一种方法是对多糖进行部分解聚化，通过高碘酸氧化产生末端醛基进行活化(表2中的方法#1)。在氰基硼氢钠存在的条件下，通过还原氨基化反应，所述醛基与所述蛋白质的自由氨基(大多数为赖氨酸)结合。参见Jennings等人，JImmunol1981;127:1011-8。在该方法中，活化发生在所述C型多糖的一个特异性位点上。

第二种方法采用的是碳二亚胺反应(表2中的方法#2)，将高分子量多糖中的羧基共价连接于所述载体蛋白赖氨酸的ε-氨基。与高碘酸活化的方法相比，该方法的活化位点更加随机。

已经在动物上对通过这两种方法制备的C型脑膜炎球菌轭合物进行了评价。参见Beuvery等人，Dev.Biol.Stand.1986;65:197-204；以及Beuvery等人，J.Infect.1983;6:247-55。在初次免疫时所述轭合物都能刺激T细胞非依赖性和T细胞依赖性的应答。参见Beuvery等人，J.Infect.1983;6:247-55。然而，研究证明，所述多糖必须共价地与所述载体蛋白相连才能诱导T细胞依赖性的应答。

最初用于临床试验的A型和C型脑膜炎球菌轭合物是由ChironVaccine公司生产的，并在1992年就进行了报道(表2中的方法#3)。参见Costantino等人，Vaccine1992;10:691-8。所述轭和方法是基于通过温和的酸性水解选择性地对小分子寡糖的末端基团进行活化，然后通过烃间隔物与蛋白进行轭合。将白喉毒素的无毒性的突变体，CRM₁₉₇用作蛋白载体。为了活化寡糖以进行轭合反应，向所述寡糖的末端加上氨基基团，然后与己二酸的N-羟基琥珀酰亚胺二酯反应生成活性酯。然后将该活性酯共价结合于CRM₁₉₇蛋白赖氨酸的ε-氨基，形成了所述轭合物。

发明概述

尽管在多糖活化中已经使用过ADH形式的酰肼，但是在制备多糖-蛋白轭合物疫苗的现有方法中，还没有在还原氨基化轭合反应中采用酰肼化学的方法。这些现有技术都是利用所述蛋白的赖氨酸残基上的ε-氨基与活化多糖上诸如醛基(还原氨基化)和羧基的官能团进行反应。该反应的效率较低，通常仅有20%左右。该反应还需要2-3天时间才能完成所述轭合，且必须采用纯化步骤从未反应的多糖中分离出所述轭合物。参见Pollard等人《分子药物方法》(MethodsinMolecularMedicine),第66卷：《脑膜炎球菌疫苗：方法与实验设计》(MeningococcalVaccines:methodsandProtocols)书中Guo等人的《蛋白-多糖轭合》"Protein-polysaccharideconjugation"内容，HumanaPress,Totowa,NJ,2001,pg49-54。对所得到的较低产量有几种解释。首先，在所述轭合条件下(pH6.5-7.4)赖氨酸ε-氨基的反应性较低(pKa=10.5)。参见Inman等人，Biochemistry1969;8:4074-4082。其次，大多数轭合方法都将类毒素用作载体蛋白。所述类毒素都来自于用甲醛脱毒处理过的毒素，这些甲醛会与所述毒素上的氨基结合，从而只会留下有限数量能够进行轭合反应的氨基。第三，所得活化蛋白和蛋白-多糖轭合物的降低的溶解性经常导致沉淀。

因此，以较高产率合成和生产多糖-蛋白轭合物疫苗的方法是令人满意的。同样值得期待的还有这样的反应，其具有较快反应速率，降低的不希望副产物的产生，以及在该反应结束时残留未反应的蛋白和多糖量降低。

现有的基于多糖的疫苗在幼儿中使用受限，在成人中也不能提供长期保护。因此需要能够具有在儿童和成人体内对诸如细菌性脑膜炎，流感，破伤风以及其他细菌感染疾病有保护的蛋白-多糖轭合物疫苗。可将优选实施方案中的蛋白-多糖轭合物用于制备能够长期保护婴儿，儿童和成人的疫苗制剂。

因此，在第一实施方案中提供了制备轭合物疫苗的方法，该方法包括将多糖与氧化剂反应，由此得到了醛活化的多糖溶液；通过缓冲液更换将所述醛活化的多糖溶液的pH调至约7到约8；在pH约为6至约7，存在1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的条件下，将蛋白与肼或己二酸二酰肼反应，由此得到酰肼活化的蛋白溶液；将所述酰肼活化的蛋白溶液的pH升高至约7.0到约11；通过缓冲液更换将所述酰肼活化的蛋白溶液的pH调至约10.0至约11.0；在pH约6至约8的条件下，将所述醛活化的多糖与酰肼活化的蛋白反应，由此得到含有一或多个C=N双键的轭合物；以及将所述轭合物的全部C=N双键基本还原成C-N单键，由此得到能刺激免疫反应的轭合物疫苗。

在第一实施方案的一个方面，所述氧化剂包括NaIO₄。

在第一实施方案的一个方面，用HEPES缓冲液对所述醛活化的多糖溶液进行缓冲液更换。

在第一实施方案的一个方面，用Na₂CO₃缓冲液对所述酰肼活化的蛋白溶液进行缓冲液更换。

在第一实施方案的一个方面，以约1:2至约2:1的比例将所述醛活化的多糖与所述酰肼活化的蛋白反应。

在第一实施方案的一个方面，还原包括用NaBH₄进行还原。

在第一实施方案的一个方面，所述多糖选自脑膜炎球菌多糖，肺炎球菌多糖，b型嗜血流感杆菌多糖，伤寒杆菌Vi多糖，以及B型链球菌多糖。

在第一实施方案的一个方面，所述蛋白选自破伤风类毒素，白喉类毒素，CRM₁₉₇以及脑膜炎球菌蛋白。

在第二实施方案中也提供了制备轭合物疫苗的方法，该方法包括将多糖与1-氰-4-二甲基铵吡啶四氟硼酸反应，由此得到氰酸盐活化的多糖溶液；在pH约为6至约7，存在1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的条件下，将蛋白与肼或己二酸二酰肼(adipicaciddihydrazide)反应，由此得到酰肼活化的蛋白溶液；将所述酰肼活化的蛋白溶液的pH升高至约7到约11；通过缓冲液更换将所述酰肼活化的蛋白溶液的pH调至约10.0到约11.0；在pH约6至约8的条件下，将所述氰酸盐活化的多糖与酰肼活化的蛋白反应，得到能刺激免疫反应的轭合物疫苗。

在第二实施方案的一个方面，所述氰酸盐活化的多糖与酰肼活化的蛋白的反应步骤是在没有封闭剂的条件下进行的。

在第二实施方案的一个方面，所述多糖选自脑膜炎球菌多糖，肺炎球菌多糖，b型嗜血流感杆菌多糖，伤寒杆菌Vi多糖，以及B型链球菌多糖。

在第二实施方案的一个方面，所述蛋白选自破伤风类毒素，白喉类毒素，CRM₁₉₇以及脑膜炎球菌蛋白。

在第三实施方案中也提供了制备轭合物疫苗的方法，该方法包括在pH约为6至约7，存在1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的条件下，将蛋白与1-氨基-2,3-丙二醇(APDO)反应，由此得到APDO修饰的蛋白溶液；通过缓冲液更换将所述APDO修饰的蛋白溶液的pH调至约10.0到约11.0；将所述APDO修饰的蛋白与氧化剂反应，由此得到醛活化的蛋白溶液；通过缓冲液更换将所述醛活化的蛋白溶液的pH调至约10.0至约11.0；在pH约6至约8的条件下，将所述酰肼活化的多糖与醛活化的蛋白反应，由此得到含有一或多个C=N双键的轭合物；以及将所述轭合物的全部C=N双键基本还原成C-N单键，由此得到能刺激免疫反应的轭合物疫苗。

在第三实施方案的一个方面，所述多糖选自脑膜炎球菌多糖，肺炎球菌多糖，b型嗜血流感杆菌多糖，伤寒杆菌Vi多糖，以及B型链球菌多糖。

在第三实施方案的一个方面，所述蛋白选自破伤风类毒素，白喉类毒素，CRM₁₉₇以及脑膜炎球菌蛋白。

在第三实施方案的一个方面，通过在溶液中将多糖与氧化剂反应，由此得到醛活化的多糖；将所述醛活化的多糖与己二酸二酰肼反应，得到含有一或多个C=N双键的中间体；以及将所述中间体的全部C=N双键基本还原成C-N单键，由此得到酰肼活化的多糖。

在第三实施方案的一个方面，通过将多糖与1-氰-4-二甲基铵吡啶四氟硼酸反应，由此得到氰酸盐官能化的多糖；将所述氰酸盐官能化的多糖与己二酸二酰肼反应，由此得到酰肼活化的多糖。

在第三实施方案的一个方面，在1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺盐酸盐存在的条件下，将多糖与己二酸二酰肼反应，由此得到酰肼活化的多糖。

在第四实施方案中提供了轭合物疫苗，所述轭合物疫苗包含至少一种多糖部分和至少一种蛋白部分，其中所述多糖部分与所述蛋白部分通过至少一种式-C(=O)-NH-NH-CH₂-的连接基团相连接。

在第四实施方案的一个方面，所述轭合物疫苗含有通过多个连接基团将多个多糖部分与多个蛋白部分交联形成的晶格结构。

在第四实施方案的一个方面，所述多糖选自脑膜炎球菌多糖，肺炎球菌多糖，b型嗜血流感杆菌多糖，伤寒杆菌Vi多糖，以及B型链球菌多糖。

在第四实施方案的一个方面，所述蛋白选自破伤风类毒素，白喉类毒素，CRM₁₉₇以及脑膜炎球菌蛋白。

在第五实施方案中提供了轭合物疫苗，所述轭合物疫苗包括至少一种多糖部分和至少一种蛋白部分，其中所述多糖部分与所述蛋白部分通过至少一种式-C(=O)-NH-NH-C(=NH)-O-的连接基团相连接。

在第五实施方案的一个方面，所述轭合物疫苗含有通过多个连接基团将多个多糖部分与多个蛋白部分交联形成的晶格结构。

在第五实施方案的一个方面，所述多糖选自脑膜炎球菌多糖，肺炎球菌多糖，b型嗜血流感杆菌多糖，伤寒杆菌Vi多糖，以及B型链球菌多糖。

在第五实施方案的一个方面，所述蛋白选自破伤风类毒素，白喉类毒素，CRM₁₉₇以及脑膜炎球菌蛋白。

在第六实施方案中提供了轭合物疫苗，所述轭合物疫苗包括至少一种多糖部分和至少一种蛋白部分，其中所述多糖部分与所述蛋白部分通过至少一种式-C(=O)-NH-CH₂-CH₂-NH-NH-的连接基团相连接。

在第六实施方案的一个方面，所述轭合物疫苗含有通过多个连接基团将多个多糖部分与多个蛋白部分交联形成的晶格结构。

在第六实施方案的一个方面，所述多糖选自脑膜炎球菌多糖，肺炎球菌多糖，b型嗜血流感杆菌多糖，伤寒杆菌Vi多糖，以及B型链球菌多糖。

在第六实施方案的一个方面，所述蛋白选自破伤风类毒素，白喉类毒素，CRM₁₉₇以及脑膜炎球菌蛋白。

附图的简要描述

图1是通过使用WatersUltrahydrogel2000柱子在280nm进行HPSEC对轭合方法A和常规还原氨基化轭合进行的比较。图1所示为经高碘酸活化的C型脑膜炎球菌多糖与a)赖氨酸的ε-氨基(TT)(常规方法)，以及与b)天冬氨酸和谷氨酸残基上的酰肼基(TT-H)进行轭合反应产物的图谱。所述图谱是在对轭合产物进行透析步骤之前进行的，并且在超过25分钟后有超常峰，其在透析后不可见。TTH的轭合物(Conj.)产量比TT的轭合物产量大得多。

图2是封闭剂对方法B制备的轭合物产量的影响以及使用WatersUltrahydrogel2000柱子在280nm进行HPSEC分析。图2所示为在有无封闭剂ADH，肼，甘氨酸或乙醇胺的条件下，通过氰基化轭合制备的Pn18CPS-TT轭合物的高效分子排阻色谱图(HPSEC)。在封闭剂存在的情况下，所述轭合物(Conj.，15.5分钟)峰明显降低，而游离蛋白峰(22分钟)不降低。所述图谱是在对轭合产物进行透析步骤之前进行的，并且在超过25分钟后有超常峰，其在透析后不可见。

图3所示为使用WatersUltrahydrogel2000柱子在280nm对通过醛活化的多糖与酰肼活化的蛋白的还原氨基化轭合反应(轭合方法A)制备的4种MnCPS-TT轭合物的HPSEC图。在不同时间所述HPSEC图略有漂移。在22.5-24分钟的右肩峰来自于未轭合的蛋白TTH或TTADH，而16-17分钟的左肩峰则来自较高分子量的轭合物。

图4所示为对通过醛活化多糖与酰肼活化蛋白还原氨基化轭合反应(轭合方法A)制备的MnCPS-TT轭合物中游离多糖的估计以及使用WatersUltrahydrogel2000柱子在280nm进行HPSEC分析。图4A所示为在测定蛋白的280nm，对MnCPS-TT轭合物的C18吸附前(3)与吸收后(1)，以及纯TTH(2)进行监测的HPSEC图。C18对来自所述轭合产物的对各种蛋白类型的完全吸收可见于图谱(1)。图4B所示为在测定蛋白和多糖的206nm，对如图4A所示的三种相同的进样样品进行监测的HPSEC图。在C18吸附后(1)22.5分钟的峰来自于所述轭合产物中未被吸收的游离多糖。图4C所示为在206nm，轭合产物中的游离多糖HPSEC图谱(1)与含有0.033mg/ml(2)，0.067mg/ml(3)和0.134mg/ml(4)的活化MnC多糖的HPSEC图谱的比较。

图5所示为对通过醛活化多糖与酰肼活化蛋白的还原氨基化轭合反应(轭合方法A)制备的MnCPS-TT轭合物中游离多糖的定量，其中使用标准浓度的峰面积通过HPSEC进行浓度测定。测定图4C中在22.5分钟HPSEC图谱2，图谱3，图谱4的峰面积，并分别对其浓度进行作图从而构建标准曲线。从图4C中在22.5分钟HPSEC图谱1的峰面积计算轭合产物中的游离多糖浓度。

图6所示为使用WatersUltrahydrogel线性柱对通过醛活化多糖与酰肼活化蛋白的还原氨基化轭合反应(方法A)制备的MnA多糖-TT轭合物MA031219R以及TTH得到的HPSEC图谱(280nm)。在轭合时，所述蛋白信号从17.5分钟迁移到15分钟。

图7所示为使用WatersUltrahydrogel线性柱对通过氰基化轭合反应(方法B)制备的Pn6BPS-TT轭合物以及TTH得到的HPSEC图谱(280nm)。在轭合时，所述蛋白信号从17分钟迁移到13.5分钟。所述图谱是在对轭合产物进行透析步骤之前进行的，并且在超过25分钟后有超常峰，其在透析后不可见。

图8所示为使用WatersUltrahydrogel线性柱对通过氰基化轭合反应(方法B)制备的Pn7FPS-TT轭合物以及TTH得到的HPSEC图谱(280nm)。在轭合时，所述蛋白信号从17分钟迁移到13.5分钟。所述图谱是在对轭合产物进行透析步骤之前进行的，并且在超过25分钟后有超常峰，其在透析后不可见。

图9所示为使用WatersUltrahydrogel线性柱对通过酰肼活化多糖与醛活化蛋白TT-醛经过还原氨基化(方法C)制备的Pn9V多糖-TT轭合物以及TT-醛得到的HPSEC图谱(280nm)。在轭合时，所述蛋白信号从17分钟迁移到13.5分钟。

优选实施方案的详细描述

以下内容和实施例将对本发明的优选实施方案进行详细描述。本领域所属技术人员应该理解对本发明进行多种变化和修改均包括在本发明的范围内。因此，对优选实施方案的描述不应被认为对本发明的范围有所限制。

简介

常规合成与生产多糖-蛋白轭合物疫苗的方法通常的轭合反应效率都比较低(一般为20%左右)。这意味着丧失了最高至80%所加入的活化多糖。而且，通常还需要将所述轭合物从未轭合的多糖中纯化出来的色谱方法。优选实施方案的合成方法利用的是一种反应物上的酰肼基与另一反应物上的醛基或氰酸盐酯基反应的特有的化学性质，其轭合物产量也有所提高(一般高至60%左右)。

当所述轭合反应以较高的轭合效率进行时，反应后残留的未轭合蛋白与多糖的量会低至无需对其进行去除。因此，对所述轭合产物的纯化过程可以简化成，例如，对小分子副产物进行去除的透析步骤。可以在反应物浓度为约1-约40mg/mL，多糖/蛋白摩尔比从约1:5到约5:1，优选为从约1:2到约2:1，最优选为1:1，在一或两天之内完成基于酰肼的轭合反应，虽然在某些实施方案中，更高或更低的比率是优选的。随所述多糖的最适条件的变化，优选进行所述轭合反应的条件是温度是从约4℃至约40℃，优选为从约5，10，15或20℃至约25，30或35℃，pH至从约6至约8.5，优选从约6.1，6.2，6.3，6.4或6.5至约6.6，6.7，6.8，6.9，7.0，7.1，7.2，7.3，7.4，7.5，7.6，7.7，7.8，7.9，8.0，8.1，8.2，8.3或8.4。因此，当采用基于酰肼的轭合物反应时，可以较低的成本生产轭合物疫苗。

为了克服轭合物疫苗常规合成方法中的某些不足，提供了在还原氨基化和氰基化轭合反应中使用酰肼化学将多糖与载体蛋白轭合的方法。通过碳二亚胺与肼、ADH、碳酰肼(carbohydrazide)或琥珀酰二肼反应向蛋白分子的天冬氨酸和/或谷氨酸残基的羧基上引入具有-NH-NH₂结构的酰肼。在轭合前，在pH值从约10至约11.5，优选为从约10.1，10.2，10.3或10.4至约10.6，10.7，10.8，10.9，11.0，11.1，11.2，11.3或11.4，最优选为约10.5；缓冲液浓度从约3mM或更低至约10mM或更高，优选从约4或5mM至约6，7，8或9mM时，所活化的蛋白是可溶解的。适合的缓冲也包括Na₂CO₃，3-(环己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS)(3-(cyclohexylamino)-l-propanesulfonicacid)和2-(N-环己基氨基)乙磺酸(CHES)(2-(N-cyclohexylamino)ethanesulfonicacid)。然后在pH值从约6至约8.5，优选从约6.1，6.2，6.3，6.4或6.5至约6.6，6.7，6.8，6.9，7.0，7.1，7.2，7.3，7.4，7.5，7.6，7.7，7.8，7.9或8.0；在缓冲液浓度为从约100mM或更低至约200mM，优选从约110，120，130，140或150mM至约160，170，180或190mM时，将所活化的蛋白与含有醛基(还原氨基化)或氰酸盐(氰化轭合)基活化的多糖反应。适合的缓冲液包括N-(2-羟乙基)哌嗪-N`-(2-乙磺酸)(HEPES)，磷酸盐缓冲液(PBS)，TES(EDTA,Tris-HCI,SDS)，吗啉基丙磺酸(MOPS)以及N,N-二(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)。

可选择地，可使用酰肼及对所述多糖进行官能化。在采用pH为6.5-7.5较强的缓冲液时，可将所活化的多糖与醛基(还原氨基化)活化蛋白轭合。所述蛋白可在pH约为10.5较弱的缓冲液中一直保持其可溶性，直至轭合。由于在中性/弱酸性条件下与赖氨酸的ε-氨基(pKa=10.5)相比，酰肼基的反应性(pKa=2.6)要高得多，而且在轭合之前使用在pH至约为10.5时保持可溶性的活化蛋白能提高所述轭合物的溶解性，所以所述轭合反应的产量的到了很大提高。酰肼活化破伤风类毒素(TT-H)与破伤风类毒素(TT)的反应性比较如图1所示。

正如在小鼠实验中所证明的那样，通过这些方法制备的轭合物在实验动物中都具有免疫原性。而且，该轭合反应可以在没有氰基硼氢钠下高效完成，由此还避免了在该轭合产物中氰化物离子的引入。该反应可在弱酸性或中型pH条件下，在室温或在4℃过夜完成，这与常规还原氨基化轭合方法所需要的数天时间正好相反。这又一次确保了对来自诸如b型嗜血流感杆菌，19F型肺炎链球菌以及A型脑膜炎奈瑟菌的不稳定多糖的较高的轭合疫苗生产。可将优选实施方案中的方法用来制备更廉价的轭合物疫苗，从而大力推进公共卫生事业。

多糖

在本文中，术语“多糖”涵义广泛，取其常规含义，包括含有多个重复单位的糖，包括含有50个或更多重复单位的多糖以及含有50个或更少重复单位的寡糖。通常，多糖含有从约50，55，60，65，70，75，80，85，90或95个重复单位至约2,000个或更多重复单位，优选为从约100，150，200，250，300，350，400，500，600，700，800，900或1000个重复单位至约1100，1200，1300，1400，1500，1600，1700，1800或1900个重复单位。寡糖通常含有从约6，7，8，9或10个重复单位至约15，20，25，30或35至约40或45个重复单位。

适合在优选实施方案中进行使用的多糖包括来自具荚膜细菌的多糖和寡糖。所述多糖和寡糖可以是任意来源的，例如，可来自天然发生的细菌，遗传工程细菌或可以人工合成。在活化前可将所述多糖和寡糖进行一个或多个步骤的处理，例如，纯化，官能化，使用弱氧化条件解聚化，脱乙酰化等等。如果需要的话还可以进行后续处理步骤。可以采用本领域内公知的适当方法对适合的多糖和寡糖进行合成，制备和/或纯化。

适于在优选实施方案中进行使用的多糖和寡糖包括，例如血清型为1，2，3，4，5，6B，7F，8，9N，9V，10A，IIA，12F，14，15B，17F，18C，19A，19F，20，22F，23F和33F的肺炎球菌多糖；血清型为A，B，C，W135和Y的脑膜炎球菌多糖；b型嗜血流感菌多糖聚核糖基核糖醇磷酸；血清型III和V的B型链球菌多糖以及伤寒杆菌Vi多糖。肺炎球菌和B型链球菌血清型以及脑膜炎球菌血清型的其它多糖也适于在本发明中使用，其他T细胞非依赖性多糖和寡糖抗原，例如来自A型链球菌，葡萄球菌，肠球菌，肺炎克雷伯氏杆菌，大肠杆菌，绿脓假单胞菌和炭疽芽孢杆菌的多糖和寡糖，也一样适于在本发明中使用。尽管细菌多糖和寡糖是特别优选的，但革兰氏阴性细菌的脂多糖和脂寡糖及其多糖衍生物和寡糖衍生物，以及病毒性多糖和病毒性寡糖都是可以使用的。

在优选实施方案中适合的是具有侧链磷和/或主链磷的多糖。优选实施方案的轭合物反应特别适于使用具有主链磷的多糖。这些多糖对断裂和降解特别敏感，因此随着发生降解反应持续时间的减少，所述轭合反应的快速也导致了较高产量的轭合物产生。

在任意的预处理步骤完成之后，可将多糖或寡糖用于“活化”步骤。术语“活化”是指为所述多糖提供能与所述蛋白进行反应的化学基团的化学处理。在特定的优选实施方案中，活化涉及利用能与醛基的官能化蛋白进行反应的酰肼基官能化多糖或寡糖。可选择地，可采用与酰肼基的官能化蛋白发生反应的醛基，酮基或氰酸盐基对所述多糖或寡糖进行官能化。

可采用适合的官能化反应利用酰肼基来活化多糖或寡糖。优选官能化反应是还原氨基化，其中在高碘酸盐活化反应中将所述多糖或寡糖与NaIO₄反应生成醛基，所述醛基随后与己二酸二酰肼反应，再用NaBH₄进行还原。可选择地，还可以采用氰基化轭合反应，其中将多糖或寡糖与溴化氰或1-氰-4-二甲基铵吡啶四氟硼酸反应引入氰基，随后再使该氰基与己二酸二酰肼反应。还可以采用碳二亚胺反应，其中在存在1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺氯化氢的条件下，将多糖或寡糖与己二酸二酰肼反应。

可采用适合的官能化反应利用氰酸盐基来活化多糖或寡糖。优选地，在存在三乙胺的条件下将所述多糖与寡糖和1-氰-4-二甲基铵吡啶四氟硼酸反应。

可采用适合的官能化反应利用醛基来活化多糖或寡糖。某些具有末端醛基的多糖和寡糖可参与所述轭合反应。如果采用醛基对所述多糖和寡糖进行活化，则优选的反应涉及氧化剂，例如NaIO₄的反应。氧化剂具有将所述多糖或寡糖断裂的能力。通过选择特定的氧化剂以及该氧化剂的浓度来避免或控制不需要的片断。酮基也能与酰肼反应，因此在某些实施方案中也可使用酮基来活化所述多糖或寡糖。

优选地，可采用强缓冲溶液的方式将强缓冲(pH从约6.5至约8，从约100mM至约200mM的较高缓冲浓度)活化的多糖溶液用于轭合反应。可以使用任意适合的缓冲液，优选为诸如N-(2-羟乙基)哌嗪-N`-(2-乙磺酸)的缓冲液。

蛋白

活化的多糖或寡糖与蛋白轭合能产生轭合物疫苗。适合的蛋白包括细菌毒素，这些毒素是可通过化学或遗传手段安全地对患者进行给药的免疫有效载体。其示例包括诸如白喉类毒素，CRM₁₉₇，破伤风类毒素，百日咳类毒素，大肠杆菌LT，大肠杆菌ST以及来自绿脓假单胞菌外毒素的灭活的细菌毒素。也可以采用细菌外膜蛋白，例如外膜蛋白复合体c(OMPC)，孔道蛋白(porins)，转铁蛋白结合蛋白，肺炎球菌溶酶(pneumolysin)，肺炎球菌表面蛋白A(PspA)，肺炎球菌结合素蛋白(PsaA)，或肺炎球菌表面蛋白BVH-3和BVH-11。还可以使用诸如炭疽芽孢杆菌的保护性抗原(PA)，卵清蛋白，钥孔戚血蓝素(KLH)，人血清白蛋白，牛血清白蛋白(BSA)以及结核菌素衍生物纯化蛋白(PPD)的其他蛋白。所述蛋白优选无毒和无反应原性的蛋白，且可得到足够优选实施方案轭合方法所需的量与纯度。例如，可从白喉棒状杆菌(Corynebacteriadiphtheriae)的培养物中纯化得到白喉毒素，并使用甲醛进行化学脱毒从而得到适合的蛋白。

也可使用那些含有至少一种T细胞抗原决定簇的天然毒素或类毒素片断，同样可使用以上所列的外膜蛋白复合体，以及多种蛋白的某些类似物，片断和/或类似片断。上述蛋白可以是从天然来源获得的，通过重组技术生产的或者是由本领域公知技术合成的。可以通过多种方式获得类似物，例如，可以在不丧失利用诸如抗体的抗原结合区或底物分子的结合位点的结构产生的相互结合能力的条件下，用某些氨基酸替换蛋白中的另一些氨基酸。还可以使用诸如那些含有表面暴露有谷氨酸或天冬氨酸基团的其他蛋白质。

可以采用任意的官能化反应利用酰肼基来活化所述蛋白。常规的酰肼基修饰蛋白的制备方法包括EDC催化以及使用N-琥珀酰亚胺碘乙酸酯和巯基酰肼经由该蛋白的赖氨酸ε-氨基的两步方法。参见King等人，Biochemistry1986;25:5774-5779。通常需要将由EDC催化制备的修饰蛋白断裂成适于轭合反应使用的片断，且所述两步方法也过于繁复。因此，通常并不倾向于采用这样的方法制备酰肼修饰的蛋白。然而，在某些实施方案中这样的方法是可以采用的，甚至是需要的。

优选地，可以采用碳二亚胺反应，例如通过在EDC的存在下与肼，碳酰肼，琥珀酰二酰肼，己二酸二酰肼或其他二酰肼经由该蛋白的天冬氨酸和谷氨酸残基上的羧基向所述蛋白引入酰肼基。EDC可用作催化剂利用肼或二酰肼来活化和修饰所述蛋白反应物。可将包含EDC的任意水溶性碳二亚胺用作催化剂。EDC-催化的蛋白通常具有聚合和沉淀的趋势，因此在涉及蛋白的轭合物制备中并不是优选的。参见Schneerson等人，Infect.Immun.1986，52：519-528；Shafer等人，Vaccine2000，18(13):1273-1281；以及Inman等人，Biochemistry1969，8：4074-4082。所述活化蛋白的聚集和沉淀部分依赖于其pH环境。因此，可通过在缓冲溶液中保持这些酰肼修饰蛋白的可溶性，来控制其聚合与沉淀的趋势。通过对所述反应混合物进行缓冲液更换将所述活化蛋白的pH维持在约10.5，从而使得所活化的蛋白保持其可溶性以及稳定性以进行轭合反应。优选地，可以采用诸如从约3mM至约10mM的较低浓度Na₂CO₃弱缓冲液。

然后，当将所述缓冲的酰肼修饰蛋白加入pH从约6至8.5，优选从约6.5至约8的活化多糖中的时候，可制备蛋白-多糖轭合物而不产生沉淀。可使用任意适合的官能化反应利用醛基来活化蛋白。优选地，该蛋白在EDC的存在下与1-氨基-2,3-丙二醇进行反应。可使用诸如葡糖胺，半乳糖胺等等氨基糖来代替1-氨基-2,3-丙二醇。在这一反应中，EDC可被用作催化剂利用氨基二醇来活化和修饰该蛋白反应物，经由该蛋白的天冬氨酸和谷氨酸残基的羧基进行。

通过还原氨基化制备轭合物

可通过醛基和酰肼基的反应(还原氨基化)制备轭合物。所述还原氨基化轭合反应可用来将酰肼修饰的反应物(蛋白或多糖)与含有醛基的其它组分轭合。

在常规还原氨基化反应中，在醛基和氨基之间的反应是可逆和不利的，因此需要使用氰基硼氢钠来协助所述轭合反应，所述氰基硼氢钠通过将C=N双键转化成C-N单键从而使得所述整个还原氨基化事件成为不可逆。相比较而言，由于所述酰肼-醛反应具有较高的效率，因此在优选实施方案中的该还原氨基化轭合反应是在没有氰基硼氢钠的帮助下完成的。在该还原氨基化轭合反应结束的时候，可使用硼氢钠或其他适合的反应物来将C=N双键还原成C-N单键，同时将任意的醛基还原成醇基。优选实施方案中的所述还原氨基化轭合反应避免了所产生的轭合物中混有氰化物，氰基硼氢钠副产物的沾染。

为了降低所述轭合反应中的活化蛋白的沉淀，该活化蛋白优选地存在于从约3mM至约10mM的较低浓度的弱缓冲液中，然后将其加入到较强缓冲(pH值从约6.5至约7.5，约100mM至约200mM的高缓冲浓度)活化的多糖溶液中。优选地，将所述活化蛋白溶液的pH值缓冲至约pH10到约pH11.5，最优选为约pH10.5。将所活化多糖溶液优选地强缓冲至约pH6到约pH8，最优选为约pH6.5至约pH7.5。所述酰肼-醛还原氨基化反应以高速完成，对活化蛋白在pH低于10.5(例如pH低至约8.5至约9.5)条件下具有的沉淀作用可以通过具有反应活性的活化多糖的分子性质得以克服。

通过氰基化轭合制备轭合物

可通过酰肼与氰基的反应(氰基化轭合)制备轭合物。所述氰基化轭合反应是高效和可逆并且有利于产物形成的。在某些实施方案中，可使用封闭试剂去除残留的氰基。然而，向所述反应混合物中加入封闭试剂会驱动所述轭合反应逆向进行，使所述轭合物产量降低5-12%。现已对多种封闭试剂对产量的影响进行了研究。用CDAP活化肺炎球菌多糖的Pn18C多糖，然后将其与酰肼活化的破伤风类毒素(TTH)轭合过夜。将五份所述产物加入水或浓度为0.2M的封闭试剂。孵育4小时后，使用配备有280nm监测器的WatersUltrahydrogel2000柱子对所述样品进行HPSEC分析(图2)。如表3所示，通过测定对总蛋白15.5分钟轭合物峰的%面积，即轭合物峰加上游离TTH峰(22分钟)，来测定每种样品的轭合物产率。尽管在某些实施方案中，需要使用封闭试剂猝灭所剩余的残留氰基，但通常还有优选地避免使用封闭试剂从而避免轭合物产率的降低。

表3

封闭试剂(0.2M)	轭合物产率	%对照	%降低
				无(对照)	75	100	0
ADH	63	84	16
				肼	70	93	7
甘氨酸	66	89	11
				乙醇胺	65	87	13

为了在不使用封闭试剂的条件下去除所述轭合产物中残留的氰基，需要延长该轭合时间。优选地，该轭合反应是在约0℃至约5℃进行36-48小时，最优选为在4℃进行36小时，然后在约20℃至约25℃再进行18-24小时，最优选为在约20℃至约24℃进行18小时，使得所残留的氰基与水反应并分解。根据需要，可使用更长或更短的轭合反应时间和/或更高或更低的轭合反应温度，或者在不同时间的不同步骤顺序和温度来进行反应。然而，所需要的是，至少在起始的时候在低温，优选为从约0℃至约5℃，更优选为约4℃进行所述轭合反应，从而降低所述轭合物沉淀的程度。

由于所述轭合产物具有较高的轭合产率和较高的免疫原性，因此就没有必要在未轭合多糖中对所述轭合物进行的诸如柱层析和/或硫酸铵沉淀的纯化步骤了。然而，在某些实施方案中还是需要进行一或多步纯化。

轭合物

两种反应物的每个分子都含有多个反应基团。活化的多糖分子可以反应并形成与不止一个活化蛋白的分子连接的不止一个键。类似地，活化蛋白分子也可反应并形成与不止一个活化多糖的分子连接的不止一个键。因此，所述轭合物是具有多种交联基质型晶格结构的混合物。例如，可以只有单键，或2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29或30个或更多的键。优选地，可对多糖与蛋白之间连接键的平均数进行调节。所述连接键的平均数依赖于多糖的类型，蛋白的类型，轭合方法，反应条件等等。通常存在1至约2，3，4或5个连接键，从而避免了由过度轭合造成的所述蛋白对免疫系统刺激能力的干扰，也不会引起所述多糖结构的改变。然而，在某些实施方案中，高于5个连接键的情况也是可以容忍甚至是需要的。

轭合反应完成之后，可使用任意适合的方法对所述轭合物进行纯化。纯化的目的是为了去除未反应的多糖，蛋白或小分子反应副产物。纯化的方法包括超滤，分子排阻色谱，密度梯度离心，疏水作用色谱，硫酸铵分级分离等等本领域公知的方法。如上所述，优选实施方案中的所述轭合反应的产率较高，且产生了更少的不需要的小分子反应副产物。因此，无需进行纯化，或仅需要进行较低程度的纯化。根据需要，可将所述轭合物浓缩或稀释，或加工成任意适于在药物组合物中进行使用的形成。

治疗方法

可将由所述优选实施方案制备的轭合物以适合形式的免疫有效剂量对个体进行给药从而治疗和/或预防感染性疾病。在此使用的术语“个体”是指诸如哺乳动物的动物。例如，哺乳动物包括了人类，灵长类，狗，猫，绵羊，牛，山羊，猪，马，小鼠，大树，兔子，豚鼠等等。术语“个体”，“患者”和“宿主”可以交替使用。在本文中，术语“免疫有效”剂量的所述轭合物疫苗是指适于引起免疫反应的剂量。该具体的剂量依赖于需要进行治疗个体的年龄，体重和临床状态以及给药的方法。本领域所属技术人员应该很容易对适合的剂量进行确定。

与常规疫苗相比，含有优选实施方案的轭合物疫苗的药物组合物具有多种优点，包括增强较弱免疫原性抗原的免疫原性，有效地将抵抗原的用量，降低加强免疫的频率，提高效率，对免疫系统进行优先刺激，或者对免疫应答具有潜在的靶效应。可通过下述的多种方式对个体进行疫苗给药，包括肠道外(例如，通过脑池内注射和灌输技术)，皮内，跨膜的，透皮的(包括局部的)，肌肉的，腹膜内的，静脉的，动脉内的，灶内的，皮下的，口服以及鼻内(例如吸入)方式进行给药。可通过弹丸注射或连续灌输，以及例如对疾病或损伤位点的局部给药进行轭合物疫苗给药。所述轭合物疫苗可以药物或生理可接受载体的形式进行给药。

在本文中，术语“疫苗”涵义广泛，取其常规含义，包括优选实施方案的轭合物或其他抗原，与佐剂，稀释剂，赋形剂，载体和其他药物可接受物质配制而成。术语“药物可接受的”是指可与诸如细胞，细胞培养物，组织或有机体的生物系统相容的无毒材料。

使用优选实施方案轭合物的免疫方法为个体提供了预防或治疗疾病，病症和/或感染的组合物和方法。在本文中，术语“治疗”涵义广泛，取其常规含义，包括治愈性，阻止性，预防性，缓解性和/或改善性的治疗。

所述疫苗组合物优选是灭菌的，并含有治疗或预防有效量的适于对个体进行给药的重量单位或体积的所述轭合物。在本文中，术语“药物可接受的载体”是指适于对个体进行给药的一或多种相容的固体或液体填充剂，稀释剂或胶囊材料。术语“载体”是指有机或无机的，天然或合成的，与所述活性成分合并后可以促进应用的成分。所述载体的性质依赖于其给药方式。生理和药物可接受的载体包括稀释剂，填充剂，盐，缓冲液，稳定剂，增溶剂以及其他本领域公知的材料。

以不存在对所需要的药物效率造成潜在危害的相互作用的形式，药物组合物的成分也可以与所述优选实施方案的轭合物进行共混合，以及相互混合。

可适用本领域公知的方法将优选实施方案中的所述轭合物疫苗配制到药物组合物中。所述疫苗组合物可含有一种或多种佐剂。适合的佐剂包括诸如氢氧化铝或磷酸铝的铝佐剂，弗氏佐剂，BAY，DC-chol，pcpp，单磷酰脂A，CpG，QS-21，霍乱毒素以及甲酰甲硫氨酰肽。参见，例如《疫苗设计，亚基和佐剂方法》VaccineDesign,theSubunitandAdjuvantApproach,1995(M.F.PowellandM.J.Newman,eds.,PlenumPress,N.Y.)。

对个体进行给药的轭合物疫苗剂量以及给药方案对医药和兽医领域的所属技术人员而言是很容易理解的，需要参考诸如预期用途，具体的抗原，佐剂(如果有的化)，年龄，性别，体重，物种，一般情况，以往疾病和/或治疗情况，以及给药方式的因素。根据动物试验可以确定初始剂量，根据本领域内所接受的诸如标准剂量试验的实际操作，也可以确定对人给药的剂量大小。例如，可以从血清抗体水平测试对治疗有效剂量进行初步估测。所述剂量依赖于所述轭合物的特异活性，并可通过常规实验很容易地测定。

在实施治疗和/或预防特异的疾病的免疫方案中，可以对个体进行治疗有效量轭合物的给药。在本文中，术语“有效量”是指足以表现出对个体具有有意义好处的治疗剂(例如轭合物)或其他活性成分的总量，这些有意义的好处包括对相关临床状态(疾病，感染等等)的增强的免疫应答，治疗，治愈，预防或缓解；或者是提高的对这些病症治疗率，治愈率，预防率或缓解率。当将术语“有效量”用于单独给药的单独治疗剂时，该术语指单独的治疗剂。当将该术语用于联合给药时，是指无论是合并给药，依次给药或同时给药的条件下，产生所述治疗效果的所述组分的合并量。在本文中，短语治疗剂的“有效量给药”是指对所述个体进行所述治疗剂的治疗，其量与时间足以诱导至少一个反映所述疾病，感染或病症严重性的指征得到了某些改善，优选为持续的改善。

如果患者一段时间间隔的至少两次都表现出了改善的情况，那么则认为所述改善是“持续的”。可根据，例如免疫资料，疾病，感染或病症的信号或症状确定改善的程度。可对反映所述患者疾病程度的多种指征进行评估来确定治疗的量和时间是否是充分的。可以根据所述患者在所述接受治疗剂初次剂量给药之前的检查情况，或根据从健康患者人群中得到的统计学数据确立所选择指征或多种指征的基线值。如果将所述治疗剂给药用来治疗急性症状，则所述初次剂量应尽可能快地进行实际给药。直到所述患者表现出对于所选定的指征或多种指征的基线值具有改善的时候，治疗剂给药诱导了改善。在治疗慢性疾病的过程中，可通过在一段时间，例如一个月，两个月，三个月或更长，或无限期的重复给药所述治疗剂，从而获得这种程度的改善。单剂量可足以治疗或预防某种疾病。如果需要的话，与所述患者的疾病无关，可在所述相同水平或减少的剂量或频率进行无限期的治疗。一旦治疗有所降低或中断，如果症状复发，则能以所述原始水平重新开始治疗。

通常，所述轭合物提供的为对抗细菌感染接种的有效剂量或治疗有效量从约1μg或更低至约100μg或更高，优选从约2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，35，40，45或50μg至约55，60，65，70，75，80，85，90或95μg每千克体重。如果所述感染后时间持续的较短，则有效剂量对抗体的需要也可有所降低，因为对所述细菌的增殖而言时间也更短。有效剂量还可依赖于诊断时的细菌量(bacteriaload)。对于治疗用途，可以考虑在一段时间内进行多次注射给药。

可以单剂量或包含一或多次加强给药的一系列剂量对所述轭合物疫苗进行给药。例如，婴儿或儿童可在其一生的早期接受单剂量给药，然后在1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多年之后接受加强剂量的给药。所述加强剂量可从已接触抗原的B细胞中产生抗体，即记忆应答。换言之，加强给药后，所述轭合物疫苗能在婴儿或儿童体内引发较高的初级功能抗体反应，并能引起记忆应答，说明由所述轭合物疫苗引起的保护性免疫应答是长期有效的。

可将所述轭合物疫苗配制成液体制剂，进行，例如口服，鼻内，肛门，直肠，含服，阴道，口服，胃内，粘膜，perlinqual，肺泡，牙龈，鼻或呼吸道粘膜给药。适于这些给药的形式包括悬液，糖浆和酏剂。可将所述轭合物疫苗配制成肠道外，皮下，皮内，肌肉，腹膜内或静脉给药，注射给药，植入物的缓释给药，或通过滴眼剂给药。适于这些给药的形式包括灭菌的悬液和乳浊液。这些轭合物疫苗可与诸如灭菌水，生理盐水，葡萄糖等等适合的载体，稀释剂或赋形剂混合。还可将所述轭合物疫苗冷冻干燥。根据所需要的给药方式和制剂形式，所述轭合物疫苗可含有辅助性物质，例如湿润剂或乳化剂，pH缓冲剂，凝胶或粘度增强添加剂，防腐剂，调味剂，色素等等。无需进行不适当的实验，可参考诸如《雷明顿：制药科学与操作》"Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy",LippincottWilliams&Wilkins，第20版(2003年6月1日)以及《雷明顿制药科学》"Remington'sPharmaceuticalSciences",MackPub.Co.，第18和第19版(分别在1985年12月和1990年6月出版)的标准材料制备适合的制剂，在此将其全部引用作为参考。这些制剂可包括复合试剂，金属离子，诸如聚乙酸，聚乙醇酸，水凝胶，右旋糖苷等等的聚合物，脂质体，微乳浊剂，微团(micelles)，单层或多层囊泡，血影(erythrocyteghosts)或球芽(spheroblasts)。适于脂质体制剂的适合脂类包括但不限于甘油单酯，甘油二酯，硫酯，溶血卵磷脂，磷脂，皂角苷，胆汁酸等等。这些附加成分的存在会影响所述物理状态，溶解性，稳定性，体内释放率，以及体内清除率，从而根据目的应用进行选择，由此对所述载体的性质进行改造以适合所选择的给药途径。

优选地，以液体悬液或冷冻干燥产物的形式提供所述轭合物疫苗。适合的液体制剂包括例如缓冲至选定pH值的等渗水溶液，悬液，乳浊液，或粘性组合物。透皮的制剂包括洗液，凝胶，喷雾剂，药膏或其他适合的技术手段。如果需要进行鼻内或呼吸道(粘膜)给药(例如喷雾法或吸入法)，组合物则为能够通过挤压喷雾器，泵分配器或气雾剂分配器进行使用的形式。气雾剂通常都采用烃的方式进行压缩。泵分配器可优选地对测定的剂量或具有特定颗粒大小的药剂进行分配，如下所述。

当以溶液，悬液和凝胶形式存在时，除了所述活性成分外，所述轭合物的配方通常含有大量的水(优选为纯净水)。还可以具有少量的其他成分，例如pH调节剂，乳化剂，分散剂，缓冲剂，防腐剂，湿润剂，胶凝剂，色素等等。

优选地，所述组合物与受者的血液或其他体液是等渗的。可使用酒石酸钠，丙二醇或其他无机或有机溶质使得所述组合物具有等渗性。特别优选的是氯化钠。还可以使用缓冲剂，例如乙酸及其盐，柠檬酸及其盐，硼酸及其盐，以及磷酸及其盐。胃肠外载体包括氯化钠溶液，Ringer's葡萄糖，葡萄糖和氯化钠，乳酸盐Ringer's或不挥发油。静脉载体包括液体和营养补充剂，电解质补充剂(例如那些基于Ringer's葡萄糖的补充剂)等等。

使用药物可接受的增稠剂可在选定的水平保持所述组合物的粘度。甲基纤维素是优选的，因为其较容易和廉价得到，且易于使用。其他适合的增稠剂包括黄原胶，羧甲基纤维素，羟丙基纤维素，卡波姆(carbomer)等等。所述增稠剂的优选浓度可依赖于所选择的所述制剂。重要的是使用的量能获得所选定粘度。通常可优选地从加入这些增稠剂的溶液中制备粘性组合物。

可使用药物可接受的防腐剂来提高所述组合物的保存期。虽然有多种防腐剂，例如对羟苯甲酸酯(parabens)，硫柳汞(thimerosal)，氯丁醇(chlorobutanol)或氯苄烷铵(benzalkoniumchloride)可以使用，但苯甲醇是较为适合的。尽管会随所选择的制剂的变化而发生改变，所述防腐剂的适合浓度可从0.02%至2%(基于所述总重量)。

还可以将所述轭合物进行肺部给药。当吸入并穿过肺上皮层进入血流时，可对哺乳动物进行所述轭合物的肺给药。可使用多种针对治疗产品进行肺给药的医疗器械，包括但不限于喷雾器，计量吸入器以及粉末吸入器，这些器械对本领域所属技术人员是相当熟悉的。这些器械可使用对所述轭合物进行分配的适当配方。通常，除了用于治疗中的稀释剂，佐剂和/或载体之外，每种配方对该种器械都是特异性的，还会涉及适当的促进材料的使用。

为了进行肺部给药，可将所述轭合物方便地制备成平均颗粒大小从约0.1μm或更低至10μm或更高，更优选为从约0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8或0.9μm至约1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0或9.5μm的用于肺部给药的颗粒。适于将所述轭合物进行肺部给药的药物可接受载体包括诸如海藻糖，甘露醇，木糖醇，蔗糖，乳糖和山梨醇的糖。其他用于所述配方的成分还包括DPPC，DOPE，DSPC和DOPC。还可以使用包括聚乙二醇和诸如环葡聚糖的葡聚糖的天然或合成的表面活性剂。还可以使用胆盐和其他相关的增强剂，纤维素和纤维素衍生物以及氨基酸。还可以使用脂质体，微胶囊，微球体，内含物复合体以及其他类型的载体。

适合使用喷射或超声波喷雾器的配方，通常都包括以每毫升溶液含有约0.01或更低至100mg或更高轭合物的浓度，优选为每毫升溶液含有约0.1，1，2，3，4，5，6，7，8，9或10mg至约15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85或90mg的溶解或悬浮于水中的所述轭合物。所述配方还可以包括缓冲液和简单的糖(例如，用于蛋白稳定以及渗透压调节)。所述喷雾剂配方还可含有表面活性剂，从而降低或防止在所述气溶胶形成过程中由溶液雾化引起的表面诱导的所述轭合物的聚集。

适合使用计量吸入器装置的配方通常都包含精细粉末，该精细粉末含有表面活性剂协助的悬浮于促进剂的本发明化合物。所述促进剂可包括诸如含氯氟烃，氢代含氯氟烃(hydrochlorofluorocarbons)，氢代含氟烃(hydrofluorocarbons)的常规促进剂，以及诸如三氯氟甲烷，二氯二氟甲烷，二氯四氟乙醇以及1,1,1,2-四氟乙烷的烃及其组合。适合的表面活性剂包括去水山梨糖醇三油酸酯，大豆卵磷脂和油酸。

适于从粉末吸入装置中进行分配的配方通常都包含精细研磨的干粉，所述干粉含有所述轭合物，可任选地包括促进所述粉末从所述装置中进行分配的诸如乳糖，山梨醇，蔗糖，甘露醇，海藻糖或木糖醇的填充剂，其剂量通常为约1%重量比或更低至99%或更高重量比的所述配方，优选从约5，10，15，20，25，30，35，40，45或50%重量比至约55，60，65，70，75，80，85或90%重量比的所述配方。

当通过静脉，经皮，皮下或其他注射方式对所述轭合物进行给药时，所述轭合物疫苗优选为无热源，注射可接受的水性液体。具有适合pH，等渗能力，稳定性等等的所述注射可接受溶液的制剂是本领域内公知的。优选的适于注射的药物组合物优选的含有诸如氯化钠注射液，Ringer’s注射液，葡聚糖注射液，葡聚糖和氯化钠注射液，乳酸Ringer’s注射液的载体，或其他本领域内公知的等渗载体。

根据不同的因素所述注射的持续时间也有所变化，包括从几秒或更短时间的单次注射给药到1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23或24小时或更长时间的连续静脉给药。

可通过液体或凝胶，或作为植入体或装置对所述轭合物进行局部，系统或区域地给药。

优选实施方案中的轭合物，或优选实施方案中的轭合方法对于制备治疗多种细菌感染的疫苗而言非常有用，这些细菌感染包括由幽门螺旋杆菌(Helicobacterpyloris)，Boreliaburgdorferi，嗜肺性军团病菌(Legionellapneumophilia)，分支杆菌属(Mycobacteriasps.)(例如结核分支杆菌(M.tuberculosis)，鸟型分枝杆菌(M.avium)，胞内分枝杆菌(M.intracellulare)，堪萨斯分支杆菌(M.kansasii)，戈氏分枝杆菌(M.gordonae))，金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，淋病奈瑟菌(Neisseriagonorrhoeae)，脑膜炎萘瑟菌(Neisseriameningitidis)，单核细胞增多性李氏菌(Listeriamonocytogenes)，酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)(A型链球菌)，无乳链球菌(Streptococcusagalactiae(B型链球菌))，链球菌(草绿色型,viridansgroup)，粪链球菌(Streptococcusfaecalis)，牛链球菌(Streptococcusbovis),链球菌(厌氧型(anaerobicsps.))，肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)，致病的弯曲杆菌属(Campylobactersp.)，肠球菌属(Enterococcussp.)，流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)，炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)，白喉杆菌(Corynebacteriumdiphtheriae)，棒状杆菌属(corynebacteriumsp.)，猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrixrhusiopathiae)，产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridiumperfringers)，破伤风梭状芽胞杆菌(Clostridiumtetani)，产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)，肺炎克氏杆菌(Klebsiellapneumoniae)，Pasturellamultocida，拟杆菌属(Bacteroidessp.)，具核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum)，念珠状链杆菌(Streptobacillusmoniliformis)，苍白梅毒螺旋体(Treponemapallidium)，雅司螺旋体(Treponemapertenue)，细螺旋体属(Leptospira)，以色列放线菌(Actinomycesisraelli)引起的感染。

可使用优选实施方案的某些方法制备疫苗，所述疫苗可对个体进行治疗或免疫，从而抵抗诸如哺乳动物肉瘤和癌瘤的癌症，例如纤维肉瘤，粘液肉瘤，脂肪肉瘤，软骨肉瘤，成骨肉瘤，脊索瘤，血管肉瘤，内皮肉瘤,淋巴管肉瘤,淋巴管内皮肉瘤,滑膜瘤，间皮瘤，尤因氏瘤,平滑肌肉瘤,横纹肌肉瘤,结肠癌，胰腺癌，乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌,扁平细胞癌,基底细胞癌,腺癌,汗腺癌，皮脂腺癌，乳头状癌，乳头状腺癌，囊腺癌，髓样癌，支气管癌，肾细胞癌，肝癌，胆管癌，绒毛膜癌，serminoma，胚胎性癌，维尔姆斯氏肿瘤(Wilms'tumor)，子宫颈癌，睾丸肿瘤，肺癌，小细胞肺癌，膀胱癌，上皮癌，神经胶质瘤，星形细胞瘤，成神经管细胞瘤，颅咽管瘤，室管膜瘤，松果体瘤，成血管细胞瘤，听神经瘤，少突神经胶质瘤，脑脊膜瘤，黑素瘤，成神经细胞瘤，视网膜母细胞瘤；以及白血病，例如急性淋巴细胞性白血病和急性髓细胞性白血病(原始粒细胞性白血病，前髓细胞性白血病，粒单核细胞白血病，单核细胞性白血病以及红白血病)；慢性白血病(慢性粒细胞性(粒细胞的)白血病以及慢性淋巴细胞性白血病)；以及真性红细胞增多症，淋巴瘤(何杰金氏病和非何杰金氏病)，多发性骨髓瘤，瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症以及重链病，淋巴细胞增生性疾病，包括自身免疫淋巴细胞增生综合征(ALPS)，慢性成淋巴细胞白血病，毛细胞性白血病，慢性淋巴性白血病，外周T-细胞淋巴瘤，小淋巴细胞淋巴瘤，套细胞淋巴瘤，滤泡性淋巴瘤，伯基特淋巴瘤(Burkitt'slymphoma)，EB病毒阳性T-细胞淋巴瘤，组织细胞性淋巴瘤，何杰金氏病，弥散攻击性淋巴瘤，急性淋巴性白血病，T-γ淋巴细胞增生症，皮肤B细胞淋巴瘤，皮肤T细胞淋巴瘤(即蕈样肉芽肿病)和Szary综合征。

可将所述轭合物与多种目前正在使用或开发中，适于人类或非人类个体的疫苗结合给药。适于人类患者并对感染性疾病的疫苗包括联合的白喉和破伤风类毒素疫苗；百日咳全细胞疫苗；灭活的流感疫苗；23价肺炎球菌疫苗；麻疹活疫苗；流行性腮腺炎活疫苗；病毒性风疹活疫苗；卡介苗(BCG)结核疫苗；甲型肝炎疫苗；乙型肝炎疫苗；丙型肝炎疫苗；狂犬病疫苗(例如人二倍体细胞疫苗)；灭活的脊髓灰质炎疫苗；脑膜炎球菌多糖疫苗；四价脑膜炎球菌疫苗；黄热病活病毒疫苗；灭活的伤寒全细胞疫苗；霍乱疫苗；灭活的日本乙型脑炎疫苗；腺病毒疫苗；巨细胞病毒疫苗；轮状病毒疫苗；水痘疫苗；炭疽疫苗；天花疫苗以及其他可商业获得的疫苗和实验疫苗。

可以采用试剂盒的形式为进行给药的医生或其他健康关怀职业人员提供所述轭合物。所述试剂盒是具有容器的包装，其含有对个体进行轭合物疫苗给药的所述轭合物疫苗以及操作指导。任选地所述试剂盒可包含一或多种其它治疗试剂。任选地所述试剂盒可包含一或多种诊断工具及其使用指导。例如，其可包括含有2种或更多疫苗的混合疫苗(cocktailvaccine)，或含有不同疫苗或治疗剂的单独的药物组合物。所述试剂盒可包含进行连续给药或顺序给药所述轭合物疫苗的分别剂量。所述试剂盒可包含适合的给药装置，例如注射器，吸入装置等等，以及所述治疗剂的给药指导。所述试剂盒可选地包含关于将所包括的任意或全部治疗剂进行储存，重组(如果可用的话)，以及给药的指导。所述试剂盒可包括反映需要对个体进行给药数量的多个容器。如果所述试剂盒含有第一和第二个容器，则存在多个。

实验

材料

破伤风类毒素(TT)得自于LederleVaccines，PearlRiver，NYandSerumInstituteofIndia，Pune，印度。A型和C型脑膜炎球菌多糖(分别得MnA多糖和MnC多糖)得自Bio-Manguinhos，RiodeJaneiro，巴西。MnA多糖还可来自SynCoBioPartners，阿姆斯特丹，荷兰。MnW135和YPS's得自AventisPasteur。血清型为1，2，3，4，5，6B，7F，8，9N，9V，10A，11A，12F，14，15B，17F，18C，19A，19F，20，22F，23F和33F的肺炎球菌(Pn)多糖得自LederleVaccines。B型流感嗜血杆菌的多糖(PRP或Hib多糖)得自LederleVaccines。伤寒杆菌Vi多糖得自AventisPasteur。血清型为III和V的B型链球菌多糖可根据公开试验指南从培养基中分离得到。参见Carey等人，InfectionandImmunity1980;28:195-203。肼，碳酰肼(carbohydrazide)，己二酸二酰肼(ADH)，1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，N-(2-羟乙基)哌嗪-N`-(2-乙磺酸)(HEPES)，高碘酸钠，硼氢化钠，氰基硼氢化纳，4-氰-二甲基氨基吡啶四氟硼酸(CDAP)和1-氨基-2,3-丙二醇购买自Sigma/Aldrich化学公司。TNBSA(2,4,6-三硝基苯磺酸)和BCA(双金鸡纳酸)(bicinchoninicacid)分析试剂盒购自Pierce。

方法

通过本文所述方法用于与蛋白进行轭合作用的细菌多糖包括血清型为A，C，W135和Y的脑膜炎球菌多糖，血清型为1，2，3，4，5，6B，7F，8，9N，9V，10A，11A，12F，14，15B，17F，18C，19A，19F，20，22F，23F和33F的肺炎球菌多糖，B型流感嗜血杆菌的多糖(PRP或Hib多糖)，伤寒杆菌Vi多糖，以及血清型为III和V的B型链球菌多糖。以下通过三种常见方法A，常见方法B和常见方法C对多糖与蛋白的轭合作用进行描述。

常见方法A：醛活化的多糖与酰肼活化的蛋白反应(还原氨基化轭合)

在pH6.5，存在有EDC的条件下，用肼或己二酸二酰肼活化破伤风类毒素，然后用pH约为10.5的30mMNaCl，3mMNa₂CO₃进行缓冲液更换。用NaIO₄活化多糖，在4℃，pH7.5条件下用10mMHEPES进行缓冲液更换。以2:1至1:2的比例和1-40mg/ml的浓度，将酰肼活化的TT与醛活化的多糖在pH6.5-7.5，4-40℃的条件下反应过夜。然后加入NaBH₄(相当于初始反应物中所述醛基的10倍摩尔数)，保持6小时，将所述C=N双键还原成C-N单键，并将所述未反应的醛基还原成醇。使用12-14kDa的分子量排阻膜，用盐水，10mMHEPES，pH7.5，以及1mMEDTA对所述溶液进行缓冲液更换。通过Lowry分析方法测定总蛋白含量(参见PierceCatalog2003-2004，306页)。针对不同的细菌多糖可采用不同的化学分析方法测定总多糖含量，例如对MnA型和C型多糖采用间苯二酚分析方法(Monsigny等人，Anal.Biochem.1988;175:525-530)，对Pn多糖采用蒽酮分析方法(Keleti等人，《生物科学微量测定方法手册61卷己糖(蒽酮)》Handbookofmicromethodsforthebiologicalsciences.61.Hexoses(Anthrone).73页.VanNostrandReinholdCo.,NewYork,1974)，对MnA型多糖，Hib多糖和含磷的Pn多糖采用磷分析方法，对MnW135和Y多糖和含乙二醇的Pn多糖采用紫色分析方法(purpaldassay)(Lee等人，Anal.Biochem.2001;296:73-82)。

常见方法B：氰酸盐活化的多糖与酰肼活化的蛋白反应(氰基化轭合)

在pH6.5，存在有EDC的条件下，用肼或己二酸二酰肼活化破伤风类毒素，然后用pH约为10.5的30mMNaCl，3mMNa₂CO₃进行缓冲液更换。在三乙醇胺存在的条件下，在20-24℃，用CDAP对多糖活化2-2.5分钟。以2:1至1:2的比例和0.2-1mg/ml的浓度，将酰肼活化的TT与氰酸盐活化的多糖在pH6.5-7.5的条件下反应。在4℃反应36小时之后，将所述混合物在20-24℃再孵育18小时。延长的孵育可确保所剩余的未反应氰酸盐基团降解。使用12-14kDa的分子量排阻膜，用盐水，10mMHEPES，pH7.5，以及1mMEDTA对所述溶液进行缓冲液更换。参照常见方法A，通过Lowry分析方法测定总蛋白含量。如常见方法A中所述，针对不同的细菌多糖可采用不同的化学分析方法测定总多糖含量，例如对MnA型和C型多糖采用间苯二酚分析方法，对Pn多糖采用蒽酮分析方法，对MnA型多糖，Hib多糖和含磷的Pn多糖采用磷分析方法，对MnW135和Y多糖和含乙二醇的Pn多糖采用紫色分析方法。

常见方法C：酰肼活化的多糖与醛活化的蛋白反应(还原氨基化轭合)

在pH6.5，存在有EDC的条件下，用1-氨基-2,3-丙二醇(APDO)与破伤风类毒素反应，然后用pH约为10.5的30mMNaCl，3mMNa₂CO₃进行缓冲液更换。将TT-APDO与NaIO₄反应产生醛基，然后用pH约为10.5的30mMNaCl，3mMNa₂CO₃进行缓冲液更换。有三种制备酰肼活化多糖的方法：a)将多糖与NaIO₄反应然后与己二酸二酰肼反应，随后用NaBH₄还原(还原氨基化)；b)用CDAP活化多糖，然后与己二酸二酰肼反应(氰基化轭合反应)；或c)在EDC存在的条件下，将多糖与己二酸二酰肼反应(碳二亚胺反应)。以2:1至1:2的比例和1-5mg/ml的浓度，将醛活化的TT与酰肼活化的多糖在pH6.5-7.5，4-40℃的条件下反应18小时。然后加入NaBH₄(相当于初始反应物中所述醛基的10倍摩尔数)，保持6小时，将所述C=N双键还原成C-N单键，并将所述未反应的醛基还原成醇。使用12-14kDa的分子量排阻膜，用盐水，10mMHEPES，pH7.5，以及1mMEDTA对所述溶液进行缓冲液更换。参照常见方法A，通过Lowry分析方法测定总蛋白含量。如常见方法A中所述，针对不同的细菌多糖可采用不同的化学分析方法测定总多糖含量，例如对MnA型和C型多糖采用间苯二酚分析方法，对Pn多糖采用蒽酮分析方法，对MnA型多糖，Hib多糖和含磷的Pn多糖采用磷分析方法，对MnW135和Y多糖和含乙二醇的Pn多糖采用紫色分析方法。

反应物，活化多糖和轭合产物的物理-化学分析

高效液相分子排阻色谱图(HPSEC)

将蛋白，多糖和轭合产物的样品与盐水以0.5mL/分钟的流速流经配备有WatersUltrahydrogel2000或Ultrahydrogel线性柱子的DionexHPLC系统，该系统使用Chromelean软件，在280nm和206nm的UV检测器，以及Waters2410微分折射计(RI检测器)。在280nm使用UV检测器对含蛋白质物质以及含有芳香部分的化合物的信号进行监测。在206nm使用UV检测器通过羰基的存在对所述蛋白和多糖进行测定，而所述RI检测器则负责测定所述蛋白，多糖，轭合物及盐的信号。

多糖-蛋白轭合物在小鼠中的免疫原性

对小鼠进行的免疫

在第0天和第14天，或在第0天，第14天和第28天，以1μg/剂量的多糖或多糖-蛋白轭合物对小鼠(NIH-Swiss；每组10只)进行免疫，所述多糖-蛋白轭合物由常见方法A(MnA多糖-TT轭合物以及MnC多糖-TT轭合物)，常见方法B(Pn6B多糖-TT以及Pn7F多糖-TT轭合物)和常见方法C(Pn9V多糖-TT轭合物)制备，并分别在第28天和第42天收集抗血清。使用ELISA对由不同的天然多糖引起的抗体水平进行测定。

ELISA方法

使用100μL含多糖(对MnA型和C型，以及Pn7F多糖而言浓度为5μg/mL；对Pn6B多糖而言浓度为2μg/mL；对Pn9V多糖而言浓度为2.5μg/mL)和甲基化人血清白蛋白(对MnA型和C型，Pn6B以及Pn7F多糖而言浓度为5μg/mL；对Pn9V多糖而言浓度为2.5μg/mL)混合的包被溶液对Immunolon1板(Dynatech)进行包被18小时。用150μL洗涤缓冲液(含有0.05%Tween20，0.02%NaN₃的PBS)洗涤三次之后，向每一个孔中加入100μL从1/200(采用含有PBS，4%新生小牛血清，0.02%NaN₃(在肺炎球菌的情况中细胞壁多糖的浓度为2μg/mL)稀释)开始倍比连续稀释的特定的抗血清样品和对照血清(浓度为指定的3200单位/mL抗多糖抗体；两份)。过夜孵育后，将该板洗涤三次，再和100μL与碱性磷酸盐轭合的羊抗鼠IgGFc(在稀释缓冲液中稀释为1/3000)孵育2小时。将该板洗涤(3×150μL)后，将该板与100μL对-磷酸硝基苯基酯(1mg/mL对-磷酸硝基苯基酯溶解于1MTris，pH9.8，0.3mMMgCl₂)孵育30分钟，加入50μL1NNaOH中止反应。通过读板器测定ELISA读数，从该ELISA读数以及相同板中共分析的对照血清的标准曲线，计算出所述抗血清样品的抗多糖抗体水平。计算每组小鼠的抗体水平的几何平均值。

特定实施例

常见方法A-C型脑膜炎球菌轭合物

对TT进行活化使其含有酰肼基

在pH6.5，20-24℃，存在有20mMEDC，0.1MMES的条件下，用0.42M肼或己二酸二酰肼活化破伤风类毒素(4.2mg/mL)。反应4小时之后，用1NNaOH中止反应，所述反应混合物的pH会升高至7.5-10。然后使用12-14kDa的分子量排阻膜，在4℃，用pH约为10.5的30mMNaCl，3mMNa₂CO₃进行缓冲液更换。以牛血清白蛋白作为标准，采用Lowry分析(参见PierceCatalog2003-2004，306页)方法测定了所得TT-酰肼样品中的蛋白浓度。以己二酸二酰肼作为标准，采用Vidal，J.Immunol.Methods1986;86:155-156中所述的TNBS方法测定了其酰肼含量。由此制备的TT的活化程度为每TT分子中约有50个酰肼基。

对MnC型多糖进行活化使其含有醛基

在20-24℃，将MnC型多糖(10mg/mL)与6mMNaIO₄反应4小时。然后使用12-14kDa的透析膜，在4℃，用pH约为7.5的10mMHEPES透析所述样品。如Monsigny等人，在Anal.Biochem.1988;175:525-530中所述，使用N-乙酰神经氨酸作为标准，MnC型多糖/N-乙酰神经氨酸的校正因子为1.104/1，通过间苯二酚方法测定了所得活化多糖的浓度。以葡萄糖作为标准，使用BCA(PierceCatalog2003-2004，241页和305页)方法测定了所述活化多糖中的醛含量。通过该方法制备的活化MnC型多糖的活化程度为每80个单体中约有一个醛基。

活化的MnC型多糖与活化的TT的轭合

通过冷冻干燥与在水中重新溶解，将含酰肼的TT调为25mg/mL的等份。通过冷冻干燥以及在pH7.5的0.2MHEPES，30mMEDTA中重新溶解，将含醛的MnC型多糖调为25mg/mL的等份。将所述活化的TT溶液加入等体积的活化MnC型多糖溶液中并搅拌。将所述反应混合物在20-24℃孵育18小时。然后用NaBH₄(相当于所述活化多糖中初始醛基摩尔数的10倍)处理6小时。使用12-14kDa的分子量排阻膜，用盐水，pH7.5的10mMHEPES以及1mMEDTA对所述溶液进行缓冲液更换。以牛血清白蛋白作为标准，使用Lowry分析方法测定总蛋白。以N-乙酰神经氨酸作为标准，使用间苯二酚的方法测定了总MnC型多糖的含量，参照Monsigny等人，Anal.Biochem.1988;175:525-530。

使用肼或己二酸二酰肼作为间隔物，制备了4种MnC型多糖-TT轭合物。图3所示为这些轭合物的HPSEC洗脱图谱(280nm监测)。在这些洗脱图谱中可观察到轻微的漂移以及在22.5-25分钟未轭合游离蛋白的右肩峰。

通过在所述轭合产物中蛋白的C18颗粒吸附方法，然后将HPSEC上清中的糖信号与已知浓度的活化MnC型多糖的糖信号进行比较，测定了未轭合的游离MnC型多糖(图4和图5)。为了估计所述轭合反应的产量，将所述轭合产物稀释成浓度约为1mg/mL的MnC型多糖。在温和搅拌的条件下，将100μL所述溶液与250μL活化的C18颗粒混合并孵育1小时。离心后收集上清液，用100μL盐水洗涤所述C18凝胶两次。用盐水将上清液与洗涤液的组合调节至333μL，并流经0.2μm的膜微过滤器。将所得滤液与0.033，0.067和0.134mg/mL的活化MnC型多糖的标准浓度一同进行HPSEC分析，这些样品分别得到的糖信号面积为19.4，4.8，9.2和18.4。以标准曲线为0.141mg/mL对所得滤液的糖浓度进行计算，其相当于所述初始样品体积的3.3倍。因此所述初始样品含有0.465mg/mL(0.141mg/mL×3.3)的游离MnC型多糖。通过改进的间苯二酚分析方法测定的总MnC型多糖的浓度为1.131mg/mL。估计其产率为约60%(100%×(1-0.465/1.131))。

MnC型多糖-TT轭合物的免疫原性

在第0天和第14天，以1μg多糖/剂量，将以上制备的所述轭合物用来免疫每组10只的小鼠，并进行天然多糖免疫作为对照。假定参考血清的水平为3200单位/mL，第二次注射后两周，对照组所诱导的抗体水平(单位/mL)的几何平均值为16(8，34，1SD置信区间)，通过方法A制备的4种轭合物的抗体水平的几何平均值为2141(1069，4285)，4228(2189，8167)，1092(655，1820)和3977(2423，6526)(表4)。与所述天然MnC型多糖对照相比，在小鼠中所述轭合物诱导了高于68-254倍的抗-MnC型多糖特异性抗体。

表4

a.用1μg/剂量天然MnC型多糖或所述4种MnC型多糖-TT轭合物的第二次免疫后两周小鼠分组(每组10只)的抗-MnC型多糖抗体水平的几何平均值(与抗-MnC型多糖抗体水平为3200单位/mL的参考血清相比)与1SD置信区间。

方法A-A型脑膜炎球菌轭合物

对TT进行活化使其含有酰肼基

在pH6.5，20-24℃，存在有20mMEDC，0.1MMES的条件下，用0.42M肼活化破伤风类毒素(4.2mg/mL)。反应4小时之后，用1NNaOH中止反应，所述反应混合物的pH会升高至7.5-10。然后使用12-14kDa的透析膜，在4℃，用pH约为10.5的30mMNaCl，3mMNa₂CO₃进行缓冲液更换。以牛血清白蛋白作为标准，采用Lowry分析(参见PierceCatalog2003-2004，306页)方法测定了所得TT-酰肼样品中的蛋白浓度。以己二酸二酰肼作为标准，采用Vidal，J.Immunol.Methods1986;86:155-156中所述的TNBS方法测定了其酰肼含量。由此制备的TT的活化程度为每TT分子中约有50个酰肼基。

对MnA型多糖进行活化使其含有醛基

在20-24℃，将MnA型多糖(10mg/mL溶解于25mMHEPES中，pH7.4)与6mMNaIO₄反应4小时。然后使用12-14kDa的透析膜，在4℃，用pH7.4的10mMHEPES透析所述样品。通过磷分析方法，对所得活化多糖的浓度进行了测定，参见Keleti等人，《生物科学微量测定方法手册70卷磷(总磷)》Handbookofmicromethodsforthebiologicalsciences.70.Phosphorus(Total).84页.VanNostrandReinholdCo.,NewYork,1974。以葡萄糖作为标准，使用BCA(PierceCatalog2003-2004，241页和305页)方法测定了所述活化多糖中的醛含量。通过该方法制备的活化MnA型多糖的活化程度为每80-110个单体重复单位中约有一个醛基。

活化的MnA型多糖与活化的TT的轭合

通过冷冻干燥与在水中重新溶解，将含酰肼的TT调为10mg/mL的等份。通过冷冻干燥与在pH7.5的0.2MHEPES，30mMEDTA中重新溶解，将含醛的MnC型多糖调为10mg/mL的等份。将所述活化的TT溶液加入等体积的活化MnA型多糖溶液中并搅拌。将所述反应混合物在20-24℃孵育18小时。然后用NaBH₄(相当于所述活化多糖中初始醛基摩尔数的10倍)处理6小时。使用12-14kDa的分子量排阻膜，用盐水，pH7.5的10mMHEPES以及1mMEDTA对所述溶液进行缓冲液更换。以牛血清白蛋白作为标准，使用Lowry分析方法测定总蛋白。通过磷分析方法，对所得活化多糖的浓度进行了测定，参见Keleti等人，《生物科学微量测定方法手册70卷磷(总磷)》Handbookofmicromethodsforthebiologicalsciences.70.Phosphorus(Total).84页.VanNostrandReinholdCo.,NewYork,1974。制备了几种MnA型多糖-TT轭合物制剂。这些轭合物中的一种与所述活化的TT的HPSEC图谱如图6所示。

MnA型多糖-TT轭合物的免疫原性

在第0天和第14天，以1μg多糖/剂量，分别将这些MnA型多糖-TT轭合物和天然MnA型多糖用来免疫每组10只的小鼠。假定参考血清的水平为3200单位/mL，第二次注射后两周，天然多糖对照组所诱导的抗体水平(单位/mL)的几何平均值为79单位/mL，所述轭合物组为11,000-47,000(表5)。与所述天然MnA型多糖对照相比，在小鼠中所述轭合物诱导了169-595倍的抗-MnA型多糖特异性抗体。

表5

a.用1μg/剂天然MnA型多糖或所述4种MnA型多糖-TT轭合物的第二次免疫后两周小鼠分组(每组10只)的抗-MnA型多糖抗体水平的几何平均值(与抗-MnA型多糖抗体水平为3200单位/mL的参考血清相比)与1SD置信区间。

方法B-6B型肺炎球菌轭合物

对TT进行活化使其含有酰肼基

在pH6.5，20-24℃，存在有20mMEDC，0.1MMES的条件下，用0.42M肼活化破伤风类毒素(4.2mg/mL)。反应4小时之后，用1NNaOH中止反应，所述反应混合物的pH会升高至7.5-10。然后使用12-14kDa的分子量透析膜，在4℃，用pH约为10.5的30mMNaCl，3mMNa₂CO₃进行缓冲液更换。以牛血清白蛋白作为标准，采用Lowry分析(参见PierceCatalog2003-2004，306页)方法测定了所得TT-酰肼样品中的蛋白浓度。以己二酸二酰肼作为标准，采用Vidal，J.Immunol.Methods1986;86:155-156中所述的TNBS方法测定了其酰肼含量。由此制备的TT的活化程度为每TT分子中约有50个酰肼基。

对Pn6B型多糖进行活化使其含有氰基

在20-24℃，在存在有38μL0.2M三乙醇胺的条件下，用38μLCDAP(100mg/mL溶解于乙腈)将Pn6B型多糖(0.4mL，10mg/mL)活化2-2.5分钟。将所述活化的多糖与5mL冰预冷的pH7.5的0.2MHEPES，30mMEDTA混合，立即用于轭合。

活化的Pn6B型多糖与活化的TT的轭合

将所述活化的多糖加入到2mg活化的TT(冰预冷的，0.5mL，4mg/mL)中；搅拌。在伴随轻柔振荡在4℃孵育36小时之后，将所述反应混合物在20-24℃再孵育18小时。延长的孵育时间可确保任意残留未反应的氰酸盐基团的降解。使用12-14kDa的分子量排阻膜，用盐水，pH7.5的10MHEPES，1mMEDTA对所述溶液进行缓冲液更换。使用Lowry分析方法(参见PierceCatalog2003-2004，306页)测定总蛋白。采用蒽酮分析方法测定所述总多糖含量，参见Keleti等人，《生物科学微量测定方法手册61卷己糖(蒽酮)》Handbookofmicromethodsforthebiologicalsciences.61.Hexoses(Anthrone).73页.VanNostrandReinholdCo.,NewYork,1974。所述Pn6B型多糖-TT和所述活化的TT的HPSEC图谱如图7所示。

Pn6B型多糖-TT轭合物的免疫原性

在第0天，第14天和第28天，以1μg多糖/剂量，分别将如上制备的Pn6B型多糖-TT轭合物和天然Pn6B型多糖(对照)用来免疫每组10只的小鼠。假定参考血清的水平为3200单位/mL，第三次注射后两周，天然Pn6B型多糖对照组所诱导的抗体水平(单位/mL)的几何平均值为13单位/mL，而所述Pn6B型多糖-TT轭合物组则为3,700单位/mL(表6)。与所述天然Pn6B型多糖对照相比，在小鼠中所述轭合物诱导了285倍的抗-Pn6B型多糖特异性抗体。

表6

a.用1μg/剂量天然Pn6B型多糖或所述Pn6B型多糖-TT轭合物的第三次免疫后两周小鼠分组(每组10只)的抗-Pn6B型多糖抗体水平的几何平均值(与抗-Pn6B型多糖抗体水平为3200单位/mL的参考血清相比)与1SD置信区间。

方法B-7F型肺炎球菌轭合物

对TT进行活化使其含有酰肼基

在pH6.5，20-24℃，存在有20mMEDC，0.1MMES的条件下，用0.42M肼活化破伤风类毒素(4.2mg/mL)。反应4小时之后，用1NNaOH中止反应，所述反应混合物的pH会升高至7.5-10，。然后使用12-14kDa的分子量透析膜，在4℃，用pH约为10.5的30mMNaCl，3mMNa₂CO₃进行缓冲液更换。以牛血清白蛋白作为标准，采用Lowry分析(参见PierceCatalog2003-2004，306页)方法测定了所得TT-酰肼样品中的蛋白浓度。以己二酸二酰肼作为标准，采用Vidal，J.Immunol.Methods1986;86:155-156中所述的TNBS方法测定了其酰肼含量。由此制备的TT的活化程度为每TT分子中约有50个酰肼基。

对Pn7F型多糖进行活化使其含有氰基

在20-24℃，在存在有38μL0.2M三乙醇胺的条件下，用38μLCDAP(100mg/mL溶解于乙腈)将Pn7F型多糖(0.4mL，10mg/mL)活化2-2.5分钟。将所述活化的多糖与5mL冰预冷的pH7.5的0.2MHEPES，30mMEDTA混合，立即用于轭合。

活化的Pn7F型多糖与活化的TT的轭合

将所述活化的多糖加入到2mg活化的TT(冰预冷的，0.5mL，4mg/mL)中并进行搅拌。在伴随轻柔振荡在4℃孵育36小时之后，将所述反应混合物在20-24℃再孵育18小时。延长的孵育时间可确保任意残留未反应的氰酸盐基团的降解。使用12-14kDa的分子量排阻膜，用盐水，pH7.5的10MHEPES，1mMEDTA对所述溶液进行缓冲液更换。使用Lowry分析方法(参见PierceCatalog2003-2004，306页)测定总蛋白。采用蒽酮分析方法测定所述总多糖含量，参见Keleti等人，《生物科学微量测定方法手册61卷己糖(蒽酮)》Handbookofmicromethodsforthebiologicalsciences.61.Hexoses(Anthrone).73页.VanNostrandReinholdCo.,NewYork,1974。所述Pn7F型多糖-TT和所述活化的TT的HPSEC图谱如图8所示。

Pn7F型多糖-TT轭合物的免疫原性

在第0天，第14天和第28天，以1μg多糖/剂量，分别将如上制备的Pn7F型多糖-TT轭合物和天然Pn7F型多糖(对照)用来免疫每组10只的小鼠。假定所述参考血清的水平为3200单位/mL，第三次注射后两周，天然Pn7F型多糖对照组所诱导的抗体水平(单位/mL)的几何平均值为17单位/mL，而所述Pn7F型多糖-TT轭合物组则为17,077单位/mL(表7)。与所述天然Pn7F型多糖对照相比，在小鼠中所述轭合物诱导了1,005倍的抗-Pn7F型多糖特异性抗体。

表7

a.用1μg/剂量天然Pn7F型多糖或所述Pn7F型多糖-TT轭合物的第三次免疫后两周小鼠分组(每组10只)的抗-Pn7F型多糖抗体水平的几何平均值(与抗-Pn7F型多糖抗体水平为3200单位/mL的参考血清相比)与1SD置信区间。

方法C-9V血清型肺炎球菌轭合物

对TT进行活化使其含有醛基

在pH6.5，20-24℃，存在有20mMEDC，0.1MMES的条件下，用0.42M1-氨基-2,3-丙二醇(APDO)活化破伤风类毒素(4.2mg/mL)。反应4小时之后，用1NNaOH中止反应，所述反应混合物的pH会升高至7.5-10。然后使用12-14kDa的透析膜，在4℃，用pH约为10.5的30mMNaCl，3mMNa₂CO₃进行缓冲液更换。采用紫色分析方法(参见Lee等人，Anal.Biochem.2001;296:73-82)和Lowry分析(参见PierceCatalog2003-2004，306页)方法测定APDO对TT的修饰程度。将等分的TT-APDO与6mMNaIO₄反应1小时，然后用pH约为10.5的30mMNaCl，3mMNa₂CO₃进行缓冲液更换。由此制备的TT的活化程度为每TT分子中约有26个APDO或醛基。

对Pn9V型多糖进行活化使其含有酰肼基

在20-24℃，在存在有36μL0.2M三乙醇胺的条件下，用36μLCDAP(100mg/mL溶解于乙腈)将Pn9V型多糖(0.4mL，10mg/mL)活化2-2.5分钟。活化结束时，加入0.4mL0.5MADH并进行搅拌。将所述反应混合物在20-24℃孵育18小时。使用12-14kDa的透析膜，在4℃，用pH7.5的10mMHEPES透析所述样品。采用蒽酮分析方法测定所述多糖浓度，参见Keleti等人，《生物科学微量测定方法手册61卷己糖(蒽酮)》Handbookofmicromethodsforthebiologicalsciences.61.Hexoses(Anthrone).73页.VanNostrandReinholdCo.,NewYork,1974。以己二酸二酰肼作为标准，采用Vidal，J.Immunol.Methods1986;86:155-156中所述的TNBS方法测定了其酰肼含量。通过该方法制备的Pn9V多糖的活化程度为每个糖重复单位中约有1个酰肼基。

活化的Pn9V型多糖与活化的TT的轭合

将含有酰肼的Pn9V型多糖(1mg；0.236mL，4.233mg/mL)等分与pH7.5的0.067mL1MHEPES和0.068mLH₂O混合。将含醛的TT(1mg；0.286mL，3.38mg/mL)加入到该活化的Pn9V型多糖(总体积0.67mL；两种反应物的初始浓度均为1.5mg/mL)中。将所述反应物在20-24℃孵育18小时。将所述反应混合物用NaBH₄(相当于所述活化多糖中初始醛基摩尔数的10倍)处理6小时。使用12-14kDa的分子量排阻膜，用盐水，pH7.5的10mMHEPES以及1mMEDTA对所述溶液进行缓冲液更换。以牛血清白蛋白作为标准，使用Lowr_y分析方法(参见PierceCatalog2003-2004，306页)测定总蛋白。采用蒽酮分析方法测定所述Pn9V多糖总含量，参见Keleti等人，《生物科学微量测定方法手册61卷己糖(蒽酮)》Handbookofmicromethodsforthebiologicalsciences.61.Hexoses(Anthrone).73页.VanNostrandReinholdCo.,NewYork,1974。所述Pn9V型多糖-TT和所述活化的TT的HPSEC图谱如图9所示。

Pn9V型多糖-TT轭合物的免疫原性

在第0天，第14天和第28天，以1μg多糖/剂量，分别将如上制备的Pn9V型多糖-TT轭合物和天然Pn9V型多糖(对照)用来免疫每组10只的小鼠。假定所述参考血清的水平为3200单位/mL，第三次注射后两周，天然Pn9V型多糖对照组所诱导的抗体水平(单位/mL)的几何平均值为15单位/mL，而所述Pn9V型多糖-TT轭合物组则为13,291单位/mL(表8)。与所述天然Pn9V型多糖对照相比，在小鼠中所述轭合物诱导了886倍的抗-Pn9V型多糖特异性抗体。

表8

a.用1μg/剂量天然Pn9V型多糖或所述Pn9V型多糖-TT轭合物的第三次免疫后两周小鼠分组(每组10只)的抗-Pn9V型多糖抗体水平的几何平均值(与抗-Pn9V型多糖抗体水平为3200单位/mL的参考血清相比)与1SD置信区间。

本说明书中将所有参考文献全文引用。如果在参考本说明书中包含的出版物和专利或专利申请时发现与本说明书的公开内容有所抵触时，则以本说明书的内容替代这些抵触内容和/或优先考虑本说明书的内容。

在本说明书中，术语“包含”与“包括”，“含有”或“其特征在于”是同义词，其是包含性的或开放式的，且并不排除其他的，未引用的元件或方法步骤。

应该理解，在本说明书和权利要求中所有对成分，反应条件等等进行描述的所有数字在所有场合都采用了术语“约”对其进行修饰。因此，除非意思相反，在本说明书和所附权利要求中设定的数字参数都是近似的，其可随通过本发明要获得的所需要的特性不同而发生变化。至少，不对所述权利要求的范围的等价原则的应用进行限制，应根据其有效数字和普通的约数方法对每个数字参数进行解释。

以上内容公开了本发明的若干方法和材料。还可以对本发明的方法和材料，以及制作方法和设备进行修改。从本说明书的公开内容出发或在本发明公开的实践中，这些修改对本领域所属技术人员而言是显而易见的。因此，不应将本发明局限于所公开的特定实施方案之内，相反，本发明应涵盖在所附权利要求范围和精神之内的所有修改和替换。

Claims

1.制备轭合物疫苗的方法，该方法包括：

在pH为6至7，存在1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的条件下，将蛋白与1-氨基-2,3-丙二醇(APDO)反应，由此得到APDO修饰的蛋白溶液；

通过缓冲液更换将所述APDO修饰的蛋白溶液的pH调至10.0到11.0；

将所述APDO修饰的蛋白与氧化剂反应，由此得到醛活化的蛋白溶液；

通过缓冲液更换将所述醛活化的蛋白溶液的pH调至10.0至11.0；

在pH6至8的条件下，将酰肼活化的多糖与醛活化的蛋白反应，由此得到含有一或多个C＝N双键的轭合物；及

将所述轭合物的C＝N双键还原成C-N单键，由此得到能刺激免疫反应的轭合物疫苗，

其中通过以下步骤来制备酰肼活化的多糖：

在溶液中将多糖与氧化剂反应，由此得到醛活化的多糖，

将所述醛活化的多糖与己二酸二酰肼反应，得到含有一或多个C＝N双键的中间体，以及

将所述中间体的C＝N双键还原成C-N单键，由此得到酰肼活化的多糖；或者

其中通过以下步骤来制备酰肼活化的多糖：

将多糖与1-氰-4-二甲基铵吡啶四氟硼酸反应，由此得到氰酸盐活化的多糖，

将所述氰酸盐活化的多糖与己二酸二酰肼反应，由此得到酰肼活化的多糖；或者

其中通过以下步骤来制备酰肼活化的多糖：

在1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺盐酸盐存在的条件下，将多糖与己二酸二酰肼反应，由此得到酰肼活化的多糖。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述多糖选自脑膜炎球菌多糖，肺炎球菌多糖，b型嗜血流感杆菌多糖，伤寒杆菌Vi多糖，以及B型链球菌多糖。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述蛋白选自破伤风类毒素，白喉类毒素，CRM₁₉₇以及脑膜炎球菌蛋白。