CN104428008A - 多价脑膜炎球菌缀合物及制备缀合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本文公开了可引起针对来自组A、C、W-135和Y的脑膜炎球菌多糖(PS)和组B因子H结合蛋白(fHbp)的免疫应答的脑膜炎球菌免疫原性缀合物。所述公开的缀合物还表现出针对脑膜炎球菌A、C、W-135、Y、B和X血清组的杀菌活性。还公开了改进的制备缀合物——例如免疫原性缀合物——的方法，包括在约4℃下用氰基化试剂活化多糖。

Description

多价脑膜炎球菌缀合物及制备缀合物的方法
相关申请的交叉引用
本发明要求2012年5月24日提交的美国临时申请No.61/651,382的优先权，所述申请以引用的方式全文纳入本文。
技术领域
本公开内容涉及缀合物，具体为免疫原性脑膜炎球菌缀合物，以及制备所述缀合物的方法。
背景技术
在13个分离的脑膜炎球菌血清组中，A、B、C、W-135和Y是最普遍的。现有三种FDA批准的基于荚膜多糖(PS)的疫苗——四价PS疫苗(Sanofi Pasteur)、(SanofiPasteur)和(Novartis)四价缀合疫苗，用于针对由组A、C、W-135和Y脑膜炎奈瑟氏球菌引起的脑膜炎球菌疾病进行保护。组B荚膜PS——具有α2→8糖苷键的多聚唾液酸——与某些人组织中表达的PS结构相似(Finne et al.，Lancet 2：355-357，1983)，从而使其成为较差的免疫原。另外，如果用作疫苗，存在其诱导自身免疫应答的可能性。因此，需要开发其他脑膜炎球菌疫苗，特别是针对组B和组X脑膜炎球菌血清组。
发明内容
本文公开了免疫原性缀合物，所述免疫原性缀合物包括至少一种缀合至奈瑟氏球菌表面蛋白(例如组B因子H结合蛋白(fHbp)或奈瑟氏球菌表面蛋白A(NspA))的多糖或蛋白质。在一些实例中，所述缀合物是脑膜炎球菌的免疫原性缀合物，所述缀合物可引起针对来自组A、C、W-135和Y的脑膜炎球菌多糖(PS)的免疫应答。在其他实例中，所述免疫原性缀合物也可引起针对fHbp或NspA的免疫应答。在其他实例中，所公开的缀合物还表现出针对脑膜炎球菌A、C、W-135、Y、B和X血清组的杀菌活性。在一些实例中，所述免疫原性缀合物是多价免疫原性缀合物。
还公开了改进的制备缀合物——包括这类免疫原性缀合物——的方法。在一些实施方案中，所述方法包括将至少一种第一部分(例如PS、蛋白质、药物或其他化合物)与氰基化试剂(cyanylation agent)在约2℃至约6℃下反应，形成氰酸酯-活化的第一部分，并将所述氰酸酯-活化的第一部分与具有至少一个氨基基团或至少一个酰肼基团(例如酰肼-活化的第二部分)的第二部分(例如PS、蛋白质、药物或其他化合物)在约2℃至约6℃接触，得到包括至少一个在至少一个第一部分和至少一个第二部分之间形成的C-N键的缀合物。
在一些非限制性实施方案中，所述方法包括使至少一种多糖与氰基化试剂在约2℃至约6℃反应，形成氰酸酯-活化的多糖，并将所述氰酸酯-活化的多糖与至少一种蛋白质(例如fHbp或NspA)接触，得到包括至少一个在所述至少一种多糖和所述至少一种蛋白质之间形成的C-N键的免疫原性缀合物。在一些实例中，本方法也包括将所述至少一种蛋白质与肼、羰酰肼、盐酸肼(hydrazine chloride)、二酰肼或其混合物在约2℃至约6℃反应，形成至少一种酰肼-活化的蛋白质溶液，并将所述至少一种氰酸酯-活化的多糖与至少一种蛋白质在约2℃至约6℃接触，使所述至少一种氰酸酯-活化的多糖与所述至少一种酰肼-活化的蛋白质反应，得到包括至少一个在所述至少一种多糖和所述至少一种蛋白质之间形成的C-N键的免疫原性缀合物。
从参照附图进行的以下详细描述中，所述公开内容的上述和其他特征会变得更加清楚。
附图说明
图1A-1B是纯化的重组脑膜炎球菌因子H结合蛋白变体1(fHbp1)、变体2(fHbp2)及其融合产物(fHbp(1+2))的一对数字图像。图1A是SDS-PAGE分析的数字图像：fHbp1在泳道1；fHbp2在泳道2；fHbp(1+2)在泳道3；分子量梯度在泳道4。图1B是用单克隆抗体Jar 5(fHbp1特异性)和Jar 11(fHbp2特异性)进行蛋白质印记分析的数字图像。泳道1和4中的fHbp(1+2)分别用单克隆抗体Jar5和Jar 11进行；泳道2中的fHbp1用单克隆抗体Jar 5进行；泳道3中的fHbp2用单克隆抗体Jar 11进行。
图2是缀合物产物的尺寸排阻HPLC图谱的图(在280nm监测)，所述缀合物产物是在原始缀合条件(底部印迹；室温)或改变的缀合条件(顶部印记；4℃)下制备的fHbp(1+2)和脑膜炎球菌血清组C多糖(MCPS)的缀合物产物。
图3A和3B是一组缀合物产物的HPLC图谱。图3A是在280nm鉴测的fHbp1，以及fHbp1MCPS、fHbp2MCPS和fHbp(1+2)MCPS的缀合物产品的HPLC图谱。缀合后，蛋白质信号从低分子量洗脱时间(约23分钟)移动到高分子量位置(约17.5分钟)。图3B是在280nm鉴测的fHbp(1+2)，以及fHbp(1+2)和脑膜炎球菌血清组A多糖(MAPS)的缀合产物，fHbp(1+2)MCPS，fHbp(1+2)和脑膜炎血清组W-135多糖(MWPS)的缀合产物及fHbp(1+2)和脑膜炎血清组Y多糖(MYPS)的缀合产物的HPLC图谱。缀合后，蛋白质信号从约22.5分钟移动到约15.5-18.5分钟。
序列表
本文中或随附的序列表中所列出的任何核酸和氨基酸序列是用37C.F.R.§1.822中定义的核苷酸碱基和氨基酸的标准字母缩写示出的。在至少一些情况下，只示出了每个核酸序列的一条链，但应该理解任意引用的所述示出的链都包含互补链。
SEQ ID NOs：1和2分别是示例性的NspA核酸和氨基酸序列。
SEQ ID Nos：3和4分别是示例性的fHbp1核酸和氨基酸序列。
SEQ ID NOs：5和6分别是示例性的fHbp2核酸和氨基酸序列。
SEQ ID NOs：7和8分别是示例性的fHbp1-fHbp2融合蛋白的核酸和氨基酸序列。
SEQ ID NOs：9和10分别是正向和反向fHbp1引物的核酸序列。
SEQ ID NOs：11和12分别是正向和反向fHbp2引物的核酸序列。
SEQ ID NOs：13和14是另外的反向fHbp1引物的核酸序列。
SEQ ID NOs：15和16是另外的正向fHbp2引物的核酸序列。
具体实施方式
Kohn和Wilchek首先介绍了1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸盐(CDAP)作为在PS树脂上的羟基基团的活化中CNBr的取代物(Appl.Biochem.Biotech.9：285-305，1984)。随后将指定的蛋白质与所述活化的PS树脂混合并将其缀合至所述活化的PS树脂用于亲和层析。该方法随后被用于活化可溶性PS以制备PS-蛋白质缀合物(例如Lees et al.，Vaccine 26：190-198，1996)。为实现缀合产品的最佳收率，该方法在pH9、室温下需要2-2.5分钟的PS活化时间。
本文公开了缀合方法，其避免2-2.5分钟PS活化时间的不方便的且难以控制的操作。现已发现，PS可以由CDAP在约4℃活化1.5-3小时，并实现与蛋白质缀合的更好的收率。不囿于理论，可能是CDAP和所得的氰酸酯基团在更低温度(例如4℃)下比在室温下具有更长的半衰期。相似的现象在4℃下PS缀合至在酰肼-活化的蛋白质中的酰肼基团时观察到。因此，所述公开的方法提供制备多糖-蛋白质缀合物的优势，包括改善的控制性、便利性和收率。这些特征对于缀合物的大规模制备(如商业疫苗制备)是特别有利的。
所公开的改进的缀合方法不限于PS和蛋白质的缀合物的制备。这些改进的方法可被用于任何氰酸酯-活化的部分与任意包括氨基基团的部分或任何酰肼-活化的部分的缀合，提供了改进的便利性并且增加了所得缀合物的收率。例如，所述公开的方法可被用于制备化学、生物化学的、医学的、药学的、诊断的和/或治疗的试剂。
I.缩写
ADH   己二酸二酰肼
APDO  1-氨基-2，3-丙二醇
CAPS  3-(环己基氨基)-1-丙磺酸
CDAP  1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸盐
CHES  (2-(N-环己基氨基)乙磺酸
EDC    1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺盐酸盐
fHbp  因子H结合蛋白
fHbp1 因子H结合蛋白1(亚家族B)
fHbp2 因子H结合蛋白2(亚家族A)
HEPES N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)
MAPS  脑膜炎球菌血清组A多糖
MCPS  脑膜炎球菌血清组C多糖
MWPS  脑膜炎球菌血清组W-135多糖
MYPS  脑膜炎球菌血清组Y多糖
NspA  奈瑟氏球菌表面蛋白A
PS    多糖
TT    破伤风类毒素
II.术语
除非另外解释，本文使用的所有的技术和科学术语具有与本公开内容所属的技术领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。单数“一(a)”、“一个(an)”和“所述(the)”、包括复数指示物，除非上下文另外清楚地指示。类似地，词语“或(or)”意在包括“和(and)”，除非上下文另外清楚地指示。还应理解，为核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小，及所有分子量或分子质量数值，都是近似值，并被提供用于描述。尽管在实施或测试本公开内容时可以使用与本文记载的方法和材料相似的或等价的方法和材料，但是以下描述了合适的方法和材料。术语“包含”指“包括”。本文提及的所有出版物、专利申请、专利及其他参考文献均以引用的方式全文纳入本文用于所有目的。本文提及的所有GenBank登记号的截止到2012年5月24日的全部内容以引用的方式纳入本文。在矛盾的情况下，以本说明书——包括术语解释——为准。另外，材料、方法和实例仅为说明性的而不意欲进行限制。
除非另有说明，技术术语按照常规用法使用。分子生物学的常用术语的定义可参见：Beniamin Lewin，Genes V，由Oxford UniversityPress出版，1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew et al.(eds.)，TheEncyclopedia of Molecular Biology，由Blackwell Science Ltd.出版，1994(ISBN 0-632-02182-9)；和Robert A.Meyers(ed.)，Molecular Biologyand Biotechnology：a Comprehensive Desk Reference，由VCHPublishers，Inc.出版，1995(ISBN 1-56081-569-8)。
为了有助于理解本公开内容的多个实施方案，提供了以下具体术语的释义：
佐剂：非特异性地增强针对抗原的免疫应答的物质或赋形剂(vehicle)。佐剂可包括吸附有抗原的矿物质(例如明矾、氢氧化铝或磷酸铝)的悬液，或抗原溶液乳化在矿物油中的油包水乳液(例如弗氏不完全佐剂)，有时包括灭活的分枝杆菌(弗氏完全佐剂)以进一步增强抗原性。免疫刺激性寡核苷酸(例如包括CpG基序的那些)也可被用作佐剂(例如，参见美国专利号6,194,388、6,207,646、6,214,806、6,218,371、6,239,116、6,339,068、6,406,705和6,429,199)。佐剂也包括生物分子，例如共刺激分子。示例性的生物佐剂包括IL-2、RANTES、GM-CSF、TNF-α、IFN-γ、G-CSF、LFA-3、CD72、B7-1、B7-2、OX-40L和41BBL。
抗原：可特异性地被具有特异性体液或细胞免疫性的产物——例如抗体分子或T-细胞受体——结合的化合物、组合物或物质。抗原可以是任何类型的生物分子，包括，例如简单中间代谢产物、糖类(例如寡糖)、脂质和激素以及大分子例如复杂的碳水化合物(例如多糖)、磷脂、核酸和蛋白质。抗原的种类包括但不限于，病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原、原生动物及其他寄生虫抗原、肿瘤抗原，参与自身免疫性疾病、过敏和移植排斥的抗原，毒素及其他各种抗原。
载体：可与半抗原或抗原(例如多糖)结合或缀合的免疫原性分子。当结合或缀合至载体时，该分子的免疫原性更强。选择载体从而提高所述结合的或缀合的分子的免疫原性和/或引起针对所述载体的抗体，所述载体是诊断、分析和/或治疗上有益的。分子与载体的共价连接可赋予增强的免疫原性和T-细胞依赖性(Pozsgay et al.，PNAS96：5194-97，1999；Lee et al.，J.Immunol.116：1711-18，1976；Dintzis etal.，PNAS 73：3671-75，1976)。有用的载体包括聚合物载体，其可以是含有一个或多个可连接至反应物部分的官能团的天然的(例如来自细菌或病毒的蛋白质)、半合成的或合成的材料。
用作载体的细菌产物的实例包括细菌毒素，例如炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)保护性抗原(包括含有至少一个抗原表位的片段和能够引起免疫应答的类似物或衍生物)、致死因子和致死毒素及其他细菌毒素和类毒素，例如破伤风毒素/类毒素、白喉毒素/类毒素、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)外毒素/类毒素、百日咳毒素/类毒素，和产气荚膜梭菌(C.perfringens)外毒素/类毒素。如本文公开的，脑膜炎球菌因子H结合蛋白或NspA蛋白也是有用的载体蛋白。病毒蛋白，例如乙型肝炎表面抗原和核心抗原也可用作载体。
缀合(缀合的)：将第一单元偶合至第二单元。其包括但不限于，将一个分子共价结合到另一分子(例如，直接地或通过连接物分子)、将一个分子非共价的结合到另一分子(例如，静电结合)(参见，例如美国专利号6921496，其公开了用于静电缀合的方法)、通过氢键将一个分子非共价地结合到另一分子、通过范德华力将一个分子非共价地结合到另一分子，及这类偶合的任何或全部组合。在一个实施方案中，缀合包括多糖与蛋白质的共价键连接。所述共价键连接可以是直接的或间接的，例如通过间隔物分子连接。
共价键：两个原子间的原子间键，其特征在于由所述各原子共享一个或多个电子对。术语“共价结合”或“共价连接”是指使两个独立的分子成为一个相连的分子。
有效量：特定试剂的量，其足以在用该试剂治疗的受试者中达到理想的效果。例如，其可以是在提高抵抗、预防、减轻和/或治疗受试者中的感染和由细菌感染引起疾病中有用的免疫原性缀合物(例如脑膜炎球菌PS-fHbp缀合物)的量。试剂的治疗有效量可包括足以提高抵抗、预防、减轻和/或治疗受试者中的感染或由感染引起的疾病的量，而不会引起所述受试者中严重的细胞毒性效应。对于提高抵抗、预防、减轻和/或治疗受试者中的感染和/或由感染引起的疾病有用的试剂的有效量或治疗有效量取决于被治疗的受试者、痛苦的严重性和组合物的给药方式。
因子H结合蛋白(fHbp)：一种脑膜炎球菌的表面蛋白，也被称为GNA1870或LP2086(Masignani et aL.，J.Exp.Med.197：789-799，2003；Fletcher et al.，Inf，Immun.72：2088-2100，2004)。fHbp与因子H——其为在C3b切割成iC3b过程中的辅因子——结合，阻止因子B与C3b结合从而减慢旁路C3转化酶的形成，并且一旦C3转化酶形成便不可逆地将其分解。存在两个fHbp亚家族，亚家族A(也被称为fHbp2)和亚家族B(也被称为fHbp1)。所述fHbp蛋白在脑膜炎奈瑟氏球菌菌株中表现出大量的序列变异，但所有都与因子H结合。
fHbp核酸和蛋白质序列是公开可得的。示例性的fHbp核酸序列包括GenBank登记号NC_003112(1975218-1976180)、AY330353、AY330354、AY330363、AY330361、AY330367、AY330370、AY330375、AY330398、AY330399、AY330400、AY330401、AY330406、AY330407、AY330408、AY330409、AY330411、JN580522及相关的氨基酸序列，所有这些的存在于2012年5月24日GenBank中的序列以引用的方式纳入本文。本领域技术人员可鉴定另外的fHbp核酸和蛋白质序列。
免疫应答：免疫系统的细胞例如B-细胞、T-细胞、巨噬细胞或多形核细胞对刺激的应答。免疫应答可包括参与宿主防御反应的身体的任何细胞，例如，分泌干扰素或细胞因子的上皮细胞。免疫应答包括但不限于，先天性免疫应答或炎症。
免疫原：能够在适当条件下在受试者中刺激产生抗体或T-细胞应答的化合物、组合物或物质，包括注射或吸收到受试者中的组合物。
免疫原性缀合物或组合物：可用于在受试者中刺激或引起特异性免疫应答(或免疫原性应答)的组合物。在一些实施方案中，该免疫应答是保护性的或提供保护性免疫，因为其使受试者更好地抵抗来源于所述免疫原性组合物所针对的生物体的感染和疾病发展。免疫原性组合物的一个具体实例是疫苗。
免疫原性不同的多糖：一种多糖，其引起的免疫应答与另一类多糖引起的免疫应答不同。免疫原性不同的多糖可以是两种或多种来自不同的有荚膜的细菌的多糖。例如与脑膜炎球菌多糖相比，肺炎球菌多糖是一种免疫原性不同的多糖。免疫原性不同的多糖也包括两种或多种来自不同血清组或血清型的多糖。例如，与血清组C的脑膜炎球菌多糖相比，血清组A的脑膜炎球菌多糖是一种免疫原性不同的多糖。
抑制或治疗疾病：“抑制”疾病指抑制疾病或病症的完全发生，例如，在有患疾病如脑膜炎球菌性脑膜炎的风险的受试者中。疾病的抑制的范围可为所述疾病的部分抑制至基本上完全抑制(预防)。在一些实例中，术语“抑制”指降低或延缓疾病的发生或进展。“治疗”指在疾病已经开始发生后，减轻疾病或病理状况的征象或症状的治疗性干预。如本文使用的，关于疾病、病理状况或症状的术语“改善”，指治疗的任何可观察的有益效果。所述有益效果可以通过以下证明，例如在易得病的受试者中延缓疾病的临床症状的发生、疾病的一些或全部临床症状的严重性降低、疾病进展更慢、疾病复发的次数降低、受试者的总体健康或健康改善，或通过本领域已知的对特定疾病而言特异性的其他参数。
多价免疫原性缀合物或多价缀合物疫苗：包括多于一种抗原表位的分子或缀合物。一类多价免疫原性缀合物包括不同分子的混合物，每种分子包含不同的免疫原性不同的多糖，其中每个不同的免疫原性不同的多糖缀合到单独的蛋白质载体(其可以是相同的或不同的蛋白质载体)。另一类多价免疫原性缀合物是其中多个免疫原性不同的多糖缀合到单个蛋白质分子或单个蛋白质构建体(所述蛋白质构建体自身包括多于一个不同蛋白质)上的分子。另一类多价免疫原性缀合物包括第一类缀合物和第二类缀合物的混合物。第一类多价免疫原性缀合物的实例可被描述为由下式代表的不同结构的混合物：
P1-PS1；P1-PS2和P1-PS3
其中P1是载体蛋白；并且PS1、PS2和PS3为各自免疫原性不同的多糖。
第二类多价免疫原性缀合物的实例可被描述为由下式代表的结构：
其中P1是载体蛋白；PS1、PS2和PS3为共价连接到P1的各自免疫原性不同的多糖。
上式中的蛋白质和多糖可以是单一或多个结构单元，且在所述蛋白质和多糖间形成至少一个键。
脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)：在人中引起脑膜炎球菌性脑膜炎的细菌。存在至少13个脑膜炎奈瑟球菌血清组，包括组A、B、C、W-135、X、Y、D、29E、H、I、K、L和Z，其基于其多糖荚膜的组成进行分类。这些中的A、B、C、W-135、X和Y是大部分脑膜炎球菌性疾病的原因。脑膜炎球菌性脑膜炎的症状包括颈强直、高烧、对光敏感、头疼和呕吐。即使进行早期诊断和抗生素治疗，仍有5-10％的被感染个体死亡。脑膜炎球菌性脑膜炎也可在10-20％该疾病的幸存者中引起大脑损伤或听力丧失。脑膜炎球菌性疾病也可发展成脑膜炎球菌性败血症，其特征在于出血性皮疹和快速循环衰竭。
脑膜炎奈瑟球菌细菌通过接触携带者的呼吸或咽喉分泌物而传播(例如通过咳嗽、打喷嚏、亲吻、分享食物或用具以及近距离生活)。最高达10-20％的人群可在鼻咽中携带所述细菌而在任何给定时间都没有症状，并且该携带率在大爆发期间甚至可能更高。
奈瑟球菌属表面蛋白A(NspA)：能够与因子H结合的脑膜炎球菌表面蛋白(Lewis et al.，PloS Pathogens 6：e1001027)。
NspA核酸和蛋白质序列是公开可得的。示例性的NspA核酸序列包括GenBank登记号NC_003112.2(690298..690822，互补物)、NC_013016.1(590409..590933，互补物)、NC_010120.1(632166..632690，互补物)和NC_008767.1(635025..635549，互补物)及其相关的氨基酸序列，所有这些的存在于2012年5月24日GenBank中的序列以引用的方式纳入本文。本领域技术人员可鉴定另外的NspA序列。
可药用载体：在本公开内容中有用的可药用载体是常规的。Remington：The Science and Practice of Pharmacy，The University of theSciences in Philadelphia，Editor，Lippincott，Williams，&Wilkins，Philadelphia，PA，21st Edition(2005)，描述了适用于一种或多种治疗性化合物或分子的药物递送的组合物和制剂，例如一种或多种公开的免疫原性缀合物，和另外的药物试剂。
受试者：活的多细胞脊椎动物生物，包括人和非人哺乳动物的一类。受试者包括兽医学受试者，包括家畜如牛和羊、啮齿动物(例如小鼠和大鼠)和非人灵长类。
III.免疫原性缀合物
本文公开了新型免疫原性缀合物，其包括缀合至载体蛋白(例如奈瑟球菌表面蛋白如脑膜炎球菌fHbp或NspA)的多糖(例如一种或多种细菌多糖)或蛋白质(例如细菌表面蛋白或其免疫原性部分)。所述公开的缀合物在受试者中具有免疫原性(如在以下实施例中证实的)。
在具体的非限制性实施方案中，所述公开的免疫原性缀合物包括缀合至fHbp或NspA的一个或多个(例如1、2、3、4或更多个)免疫原性不同的多糖。在具体实例中，所述免疫原性缀合物包括缀合至fHbp或NspA的一个或多个脑膜炎球菌多糖(例如一个或多个脑膜炎球菌血清组A、C、W-135、Y或X多糖)。在其他实例中，所述免疫原性缀合物包括缀合至fHbp或NspA的一个或多个肺炎球菌、B组链球菌(streptococcal)、b型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)或伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)多糖。
在其他实施方案中，所述公开的免疫原性缀合物包括缀合至载体蛋白(例如fHbp或NspA)的一个或多个(例如1、2、3、4或更多个)蛋白质或其免疫原性部分。在一些实例中，所述免疫原性缀合物包括缀合至fHbp的一个或多个细菌表面蛋白。在其他实例中，所述免疫原性缀合物包括缀合至NspA的一个或多个细菌表面蛋白。
在一些实施方案中，所述免疫原性缀合物是多价免疫原性缀合物，例如包括多于一个抗原表位的缀合物。在一些实例中，多价免疫原性缀合物包括不同分子的混合物，每种分子包括不同的免疫原性不同的多糖，其中每种不同的免疫原性不同的多糖缀合至单独的蛋白质载体(其各自可以是相同的或不同的蛋白质载体)。在一个非限制性实例中，这类多价免疫原性缀合物可被描述为由下式代表的不同结构的混合物：
P1-PS1；P1-PS2；和P1-PS3或
P2-PS1；P2-PS2；和P2-PS3，
其中P1和P2是载体蛋白(例如fHbp和NspA)；PS1、PS2和PS3是各自免疫原性不同的多糖。
在其他实例中，多价免疫原性缀合物包括其中多个免疫原性不同的多糖缀合至单个蛋白质分子或单个蛋白质构建体(所述蛋白质构建体自身包括多于一个不同的蛋白质)的分子。这类多价缀合物的非限制性实例可以由下式代表的结构描述：
其中P1和P2是载体蛋白(例如fHbp和NspA)；PS1、PS2和PS3是共价连接至P1或P2的各自免疫原性不同的多糖。
在另一实例中，多价免疫原性缀合物包括以上描述的一种或多种缀合物的混合物。在一个实例中，多价免疫原性缀合物包括缀合物MAPS-fHbp、MCPS-fHbp、MWPS-fHbp和MYPS-fHbp的混合物。在另一实例中，多价免疫原性缀合物也可包括一种或多种具有缀合到fHbp的多糖的免疫原性缀合物和一种或多种具有缀合至NspA的多糖的免疫原性缀合物的混合物。
A.多糖
本文使用的术语“多糖”，是广义的术语并以其常用含义使用，包括，不限于，包含多个重复单元的糖，包括但不限于具有50个以上重复单元的多糖和具有50以下重复单元的寡糖。通常，多糖具有约50、55、60、65、70、75、80、85、90或95个重复单元至约2000个或更多个重复单元，例如约100、150、200、250、300、350、400、500、600、700、800、900或1000个重复单元至约1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800或1900个重复单元。寡糖通常具有约6、7、8、9或10个重复单元至约15、20、25、30或35个至约40或45个重复单元。
在一些实例中，用于所述公开的缀合物和方法的多糖包括来自有荚膜细菌的多糖和寡糖。所述多糖和寡糖可以来自任何来源，例如，它们可以衍生自天然存在的细菌、遗传工程菌或可由合成产生。所述多糖和寡糖可以在活化前经过一个或多个处理步骤，例如纯化、官能化、用温和的氧化条件解聚、脱乙酰化等。如果需要，还可以采用后处理步骤。可以使用本领域已知的任何适用于合成、制备和/或纯化合适的多糖和寡糖的方法。
用于所述公开的缀合物和方法的多糖和寡糖包括例如血清组1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F的肺炎球菌多糖；血清型A、B、C、W-135和Y的脑膜炎球菌多糖、b型流感嗜血杆菌的多糖磷酸多核糖基核糖醇、组B血清型III和V链球菌多糖和伤寒沙门菌Vi多糖。其他肺炎球菌和组B链球菌血清型以及脑膜炎球菌血清组的多糖以及其他T非依赖性多糖和寡糖抗原(例如，从组A链球菌、葡萄球菌、肠球菌、克雷伯氏肺炎菌、大肠杆菌、绿脓假单胞菌和炭疽杆菌衍生的多糖或寡糖)也适用于本文用途。尽管细菌多糖和寡糖是特别适用的，也可以使用革兰氏-阴性细菌脂多糖和脂寡糖及其多糖和寡糖衍生物、病毒多糖和寡糖。在一个实例中，脱毒的突变脑膜炎球菌脂多糖可用于所述公开的缀合物(见例如，Weynants et al.，Inf，Immun.77：2084-2093，2009)。
具有侧链磷和/或骨架磷的多糖适用于所述公开的缀合物和方法。所述缀合反应(例如在以下第1V部分描述的那些)特别好地适于使用在骨架中含磷的多糖，尽管其并不限于这类多糖。
B.载体蛋白
在一些实施方案中，所述公开的免疫原性缀合物包括缀合至载体蛋白的多糖或一种或多种(例如1、2、3、4或更多种)蛋白质(例如一种或多种细菌表面蛋白)的至少一部分(例如免疫原性部分)。在一些实例中，所述载体蛋白是奈瑟氏菌表面蛋白。在具体实施方案中，所述载体蛋白是fHbp。在一些实例中，所述免疫原性缀合物包括缀合至fHbp的脑膜炎球菌多糖或蛋白质。在其他实施方案中，所述载体蛋白是NspA。在一些实例中，所述免疫原性缀合物包括缀合至NspA的脑膜炎球菌多糖或蛋白质。在其他实例中，所述免疫原性缀合物包括缀合至fHbp或NspA的脑膜炎球菌外膜小泡或脑膜炎球菌外膜蛋白混合物。
NspA的核酸和氨基酸序列是公开可得的。在一些实例中，NspA蛋白由与SEQ ID NO：1列出的核酸序列至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％)相同的核酸序列编码。在一些实例中，NspA蛋白与SEQ ID NO：2列出的氨基酸序列至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％)相同。
因子H结合蛋白(fHbp)是脑膜炎球菌表面蛋白，也被称为GNA1870或LP2086(Masignani et al.，J.Exp.Med.197：789-799，2003；Fletcher et al.，Inf，Immun.72：2088-2100，2004)。fHbp与因子H——其为在C3b切割成iC3b的过程中的辅因子——结合，阻止因子B与C3b结合从而减慢旁路C3转化酶的形成，并且一旦C3转化酶形成便不可逆地将其分解。存在两个fHbp亚家族，亚家族A(也被称为fHbp2)和亚家族B(也被称为fHbp1)。
fHbp1的核酸和氨基酸序列是公开可得的。在一些实例中，fHbp1蛋白由与SEQ ID NO：3列出的核酸序列至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％)相同的核酸序列编码。在一些实例中，fHbp1蛋白与SEQ IDNO：4列出的氨基酸序列至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％)相同。
fHbp2的核酸和氨基酸序列是公开可得的。在一些实例中，fHbp2蛋白由与SEQ ID NO：5列出的核酸序列至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％)相同的核酸序列编码。在一些实例中，fHbp2蛋白与SEQ IDNO：6列出的氨基酸序列至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％)相同。
在一些实例中，所述免疫原性缀合物包括融合蛋白，所述融合蛋白包含fHbp1和fHbp2中的每个的至少一部分。在一个实例中，fHbp1-fHbp2融合蛋白由直接或间接(例如通过连接物)与编码fHbp2的核酸(或其一部分)连接的编码fHbp1的核酸(或其一部分)编码。在一些实例中，fHbp1-fHbp2融合蛋白由与SEQ ID NO：7列出的核酸序列至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％)相同的核酸序列编码。在一些实例中，fHbp1-fHbp2融合蛋白与SEQ ID NO：8列出的氨基酸序列至少70％(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％)相同。
IV.制备免疫原性缀合物的方法
所述公开的免疫原性缀合物可通过包括还原胺化缀合或氰基化缀合的方法制备。在一些实例中，制备所述免疫原性缀合物的方法是本领域技术人员已知的标准方法。在其他实例中，所述方法是改进的方法，其提供例如提高的便利性、提高的进行大规模反应的能力及相对于标准方法提高的收率。所述改进的方法可用于在任何氰酸酯-活化的部分(例如PS、蛋白质、药物或其他化合物)与任何具有至少一个氨基基团的部分(例如PS、蛋白质、药物或其他化合物)或任何酰肼-活化的部分(例如PS、蛋白质、药物或其他化合物)之间制备缀合物。本领域技术人员会意识到，所述改进的方法不局限于免疫原性缀合物的制备，如本文公开的那些。
A.还原胺化缀合
在一些实施方案中，制备所述公开的免疫原性缀合物的方法包括还原胺化反应，以将含有醛基的多糖缀合至蛋白质(例如酰肼修饰的蛋白质)。在一些实例中，所述方法包括将至少一种多糖与氧化剂反应，形成至少一种醛-活化的多糖；将至少一种蛋白质与肼、羰酰肼、盐酸肼、二酰肼或其混合物反应，形成至少一种酰肼-活化的蛋白质；将所述至少一种醛-活化的多糖与所述至少一种酰肼-活化的蛋白质接触，形成具有在至少一种多糖和至少一种蛋白质之间的一个或多个C＝N双键的缀合物。在一些实例中，所述方法还包括将所述缀合物的基本上全部C＝N双键还原还原成C-N键(例如用硼氢化钠)。示例性的方法包括国际专利公布号WO 2005/014037、WO 2005/037320和WO2007/109129中那些，所述专利以引用的方式全文纳入本文。在一些实例中，所述公开的方法包括将至少一种醛-活化的脑膜炎球菌PS(例如MAPS、MCPS、MWPS、MYPS，或其两种以上的组合)缀合到酰肼-活化的fHbp。
可以使用任何适当的官能化反应来活化具有醛基的多糖或寡糖。某些多糖和寡糖具有可以参与缀合反应的末端醛基。如果所述多糖或寡糖被醛基活化，那么优选的反应包括使用氧化剂(如NaIO4)的反应。氧化剂具有片段化多糖或寡糖的潜力。不需要的片段化可以通过选择使用的特定氧化剂和氧化剂浓度来避免或控制。酮基也能够与酰肼反应，所以在某些实施方案中可以使用具有酮基的多糖或寡糖的活化。在一些实例中，将多糖与高碘酸钠在约2-6℃(例如约2℃、约2.5℃、约3℃、约3.5℃、约4℃、约4.5℃、约5℃、约5.5℃或约6℃)反应6-24小时(例如约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23或约24小时)或过夜。所述活化的多糖可被纯化，例如通过针对水的透析过滤进行。
在一些实例中，强缓冲的(例如pH为约6.5至约8，具有约100mM至约200mM的高缓冲浓度)活化多糖溶液在缀合反应中以强缓冲溶液的形式使用。可以使用任何适当的缓冲液，例如缓冲液N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)(HEPES)或磷酸盐缓冲盐水。在其他实例中，将所述活化的多糖的缓冲液更换为10mM HEPES、pH 7.5。
在一些实例中，所述方法包括通过由碳二亚胺(例如1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，尽管可以使用任何水溶性碳二亚胺)催化将蛋白质与过量肼、羰酰肼、盐酸肼或二酰肼(例如琥珀酰二酰肼或己二酸二酰肼(ADH))反应，而将至少一个酰肼基团引入到所述蛋白质(例如载体蛋白，例如fHbp或NspA)上。在一些实例中，在EDC的存在下，所述蛋白质与肼或ADH在约pH 5.5-6.5(例如pH约5.5、约5.6、约5.7、约5.8、约5.9、约6.0、约6.1、约6.2、约6.3、约6.4或约6.5)反应。
在一些实例中，在缀合前，用浓度为约3或更低至约10mM或更高(例如约4或5mM至约6、7、8或9mM)的缓冲液将所述酰肼-活化的蛋白质在约10至约11.5的pH(例如约10.1、10.2、10.3或10.4至约10.6、10.7、10.8、10.9、11.0、11.1、11.2、11.3或11.4，例如约10.5)保持可溶，。合适的缓冲液包括但不限于Na2CO3、3-(环己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS)和(2-(N-环己基氨基)乙磺酸(CHES)。在一个实例中，所述酰肼-活化的蛋白质的缓冲液被更换为约pH 10.5的溶液(例如30mM和3mM Na2CO3，pH 10.5)。在其他实例中，所述酰肼活化的蛋白质通过在至少一种氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸、半胱氨酸或其两种以上的混合物)存在下将所述蛋白质活化而在中性或近中性pH(例如pH为约7至约7.5)保持可溶(见，例如WO 07/109129，其以引用的方式纳入本文)。所述活化反应也可包括的氨基酸浓度为约1-500mM、约20-300mM或约36-144mM。
所述基于酰肼的缀合反应可在1至3天内反应完全，反应物浓度为约1至约40mg/mL，或约1至约50mg/mL，PS/蛋白质重量比为约1∶5至约5∶1，例如约1∶2至约2∶1，例如约1∶1，但在某些实施方案中可以使用更高或更低的比率。在一些实例中，所述缀合反应在约4℃至约40℃的温度(例如约4、10、15或20℃至约25、30或35℃，)在pH为约6至约8.5(例如约6.1、6.2、6.3、6.4或6.5至约6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3或8.4)下进行，最佳条件根据多糖而变化。
在常规还原胺化反应中，醛基和氨基基团之间的反应是可逆且不利的，因此需要氰基硼氢化钠通过将C＝N双键转化成C-N单键使整个还原胺化反应不可逆而有利于缀合。与之相比，由于酰肼-醛基反应的高效性，所述公开的还原胺化缀合反应方法不借助于氰基硼氢化钠而进行。所述还原胺化缀合反应结束时，使用硼氢化钠或另一合适的还原剂将C＝N双键还原成C-N单键，并将任何残留的醛基还原成醇基。这些方法的还原胺化缀合反应避免了产生的缀合物被氰化物污染，氰化物是氰基硼氢化钠的副产物。
为减少在缀合反应期间活化的蛋白质的析出，所述活化的蛋白质以具有约3mM至约10mM的低缓冲浓度的弱缓冲溶液的形式提供，其可被添加到强缓冲的(pH为约6.5至约7.5，具有约100mM至约200mM的高缓冲浓度)活化的多糖溶液中。在具体实例中，所述活化的蛋白质溶液的pH被缓冲为约pH 10至约pH 11.5，例如约pH 10.5。所述活化的多糖溶液被强缓冲为约pH 6至约pH 8，例如约pH 6.5至约pH7.5。所述酰肼-醛还原胺化反应以快的速率进行，并且低于10.5的pH(例如，pH低至从约8.5至约9.5)对活化的蛋白质的析出效应被正在进行反应的活化的多糖的分子性质抵消。
在另一实施方案中，所述公开的方法包括将至少一种醛-活化的蛋白质与至少一种酰肼-活化的多糖反应，从而产生免疫原性缀合物。可以使用任何适当的官能化反应活化具有醛基基团的蛋白质。在一个实例中，所述蛋白质与1-氨基-2，3-丙二醇(APDO)在EDC存在下反应。可以用氨基糖例如葡萄糖胺、半乳糖胺等代替APDO。在一个实例中，所述方法包括在EDC存在下、pH为约6至约7下将至少一种蛋白质与APDO反应，由此获得APDO-修饰的蛋白质溶液；将所述APDO-修饰的蛋白质溶液的缓冲液更换为pH为约10.0至11.0；将所述APDO-修饰的蛋白质与氧化剂反应，由此得到醛-活化的蛋白质溶液；将所述醛-活化的蛋白质溶液的缓冲液更换为pH为约10.0至约11.0；将酰肼-活化的多糖与所述醛-活化的蛋白质在pH为约6至约8下反应，由此得到包括一个或多个C＝N双键的缀合物；将所述缀合物的基本上所有的C＝N双键还原成C-N单键。在一些实例中，所述酰肼-活化的多糖通过以下得到：将多糖与氧化剂(例如NaIO4)在溶液中反应，产生醛-活化的多糖；将所述醛-活化的多糖与ADH反应，产生包括一个或多个C＝N双键的中间体；并将所述中间体的基本上所有C＝N双键还原成C-N单键(例如用NaBH4)，产生酰肼-活化的多糖。
B.氰基化缀合
在其他实施方案中，制备缀合物(例如所述公开的免疫原性缀合物)的方法包括氰基化缀合反应，所述氰基化缀合反应将含有至少一个氰酸酯基团的部分缀合到包括至少一个氨基基团的部分或缀合到至少一个酰肼-活化的部分。在一些实例中，所述方法包括将含有氰酸酯基团的多糖缀合到蛋白质(例如天然蛋白或酰肼修饰的蛋白质)。在一些实施方案中，本文公开的改进的氰基化缀合方法包括将至少一种第一部分(例如PS、蛋白质、药物或其他化合物)与氰基化试剂在约2℃至约6℃反应，形成氰酸酯-活化的第一部分，并将所述氰酸酯-活化的第一部分与具有至少一个氨基基团或至少一个酰肼-基团的第二部分(例如酰肼-活化的第二部分)在约2℃至约6℃接触，得到包括至少一个在所述至少一种第一部分和所述至少一种第二部分之间形成的C-N键的缀合物。所得缀合物可用于多个目的，包括例如免疫原性的、诊断的和/或治疗的化合物或试剂。本领域技术人员可选择合适的部分用于通过本文提供的氰基化缀合方法进行的缀合，且所述方法不限于本文提供的具体实例的制备。
在一些实例中，所述公开的方法包括将至少一种多糖与氰基化试剂反应，得到至少一种氰酸酯-活化的多糖。在一些实施方案中，所述至少一种氰酸酯-活化的多糖与至少一种蛋白质反应，得到包括至少一个在至少一种多糖和至少一种蛋白质之间形成的C-N键的缀合物。在其他实施方案中，所述至少一种氰酸酯-活化的多糖与酰肼-活化的蛋白质反应。因此，在一些实例中，所述方法还包括将至少一种蛋白质与肼、羰酰肼、盐酸肼、二酰肼或其混合物反应，得到至少一种酰肼-活化的蛋白质。示例性的方法包括国际专利公开号WO 2005/014037、WO 2005/037320和WO 2007/109129中的那些，所有所述专利公开文本以引用的方式全文纳入本文。在一些实例中，所述公开的方法包括将至少一种氰酸酯-活化的脑膜炎球菌PS(例如MAPS、MCPS、MWPS、MYPS或其两种以上的组合)缀合到fHbp蛋白(例如天然fHbp或酰肼-活化的fHbp)。在其他实例中，所述公开的方法包括将至少一种氰酸酯-活化的脑膜炎球菌PS(例如MAPS、MCPS、MWPS、MYPS或其两种以上的组合)缀合到NspA蛋白。
可以使用任何适当的官能化反应活化所述具有氰酸酯基团的多糖或寡糖。在一个非限制性的实例中，所述多糖或寡糖与1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸盐(CDAP)在三乙胺的存在下反应。另外的氰基化试剂包括溴化氰、对-硝基苯基氰酸酯(pNPC)、1-氰基-4-吡咯烷基吡啶四氟硼酸盐(CPIP)和四氟硼酸N-氰基-N，N，N-三乙基铵(CTEA)。
在一些实例中，将至少一种多糖与氰基化制剂(例如CDAP)在约20℃-25℃(例如约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃或约25℃)、在三乙胺存在下反应约1-5分钟(例如约1、约1.5、约2、约2.5、约3、约3.5、约4、约4.5或约5分钟)。在其他实例中，将至少一种多糖与氰基化制剂(例如CDAP)在约2℃-6℃(例如约2℃、约2.5℃、约3℃、约3.5℃、约4℃、约4.5℃、约5℃、约5.5℃或约6℃，例如约4℃)、在三乙胺存在下反应约1-3小时(例如约1、约1.5、约2、约2.5或约3小时)。
与常规的在室温下活化较短时间相比，将多糖用氰基化试剂(例如CDAP)在约4℃活化更长时间是更便利的并更容易控制。尤其是，更长的反应时间使所述方法更适用于大规模制备免疫原性缀合物，例如用于商业疫苗生产。另外，与使用标准(室温)活化条件得到的收率相比，所述改变的活化条件在缀合到蛋白质(例如酰肼-活化的蛋白质)之后，提供了更高的收率。在一些实例中，当在4℃进行活化反应时，与在室温进行所述反应相比，所述免疫原性缀合物的收率为多约1.1倍、约1.2倍、约1.3倍、约1.4倍、约1.5倍、约1.6倍、约1.7倍、约1.8倍、约1.9倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍或更高。在一些实例中，所述反应中未缀合的蛋白质的量从当所述反应在室温进行时的30％降低至当所述反应在约4℃进行时的低于约5％，相当于缀合收率提高了约40％。
在一些实例中，所述方法还包括通过由碳二亚胺(例如1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，但可以使用任何水溶性碳二亚胺)催化将蛋白质与过量肼、羰酰肼、盐酸肼或二酰肼(例如琥珀酰二酰肼或己二酸二酰肼(ADH))反应将至少一个酰肼基团引入到所述蛋白质(例如载体蛋白，如fHbp)。在一些实例中，将所述蛋白质与肼或ADH在EDC存在下、在pH约5.5-6.5(例如pH约5.5、约5.6、约5.7、约5.8、约5.9、约6.0、约6.1、约6.2、约6.3、约6.4或约6.5)反应。
在一些实例中，在缀合前，用浓度为约3或更低至约10mM或更高(例如约4或5mM至约6、7、8或9mM)的缓冲液将所述酰肼-活化的蛋白质在pH约10至约15(例如约10.1、10.2、10.3或10.4至约10.6、10.7、10.8、10.9、11.0、11.1、11.2、11.3或11.4，例如约10.5)保持可溶。适当的缓冲液包括但不限于Na2CO3、3-(环己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS)和(2-(N-环己基氨基)乙磺酸(CHES)。在一个实例中，将所述酰肼-活化的蛋白质的缓冲液更换为约pH 10.5的溶液(例如30mM NaCl和3mM Na2CO3，pH 10.5)。在其他实施方案中，所述酰肼-活化的蛋白质通过将所述蛋白质在至少一种氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸、半胱氨酸或其两种以上的混合物)的存在下活化，而在中性或近中性pH(例如pH约7至约7.5)保持可溶(见例如WO 07/109129)。所述活化反应中可包括的氨基酸的浓度为约1-500mM、约20-300mM或约36-144mM。
所述氰基化缀合反应是高效且可逆的，对产物形成有利。在某些实施方案中，使用阻断剂去除残留的氰酸酯基团。然而，向反应混合物加入阻断剂使缀合反应逆向进行并使缀合收率减少5-12％。然而在某些实施方案中，可能需要使用阻断剂(例如ADH、肼、甘氨酸或乙醇胺)淬灭残余的氰酸酯基团，通常优选避免使用阻断剂以避免缀合收率降低。为了不使用阻断剂而去除缀合产物中残留的氰酸酯基团，可以延长缀合时间。在一些实例中，缀合在约0℃至约6℃(例如约2℃、约2.5℃、约3℃、约3.5℃、约4℃、约4.5℃、约5℃、约5.5℃或约6℃)的温度下进行约36至约48小时，例如在约4℃进行约36小时，随后在约20℃至约25℃进行另外的约18至24小时(例如在约20℃至24℃进行约18小时)，从而使残留的氰酸酯基团与水反应并分解。如果需要，可以使用更长或更短的缀合时间和/或更高或更低的缀合温度，并且可在不同时间和温度下进行不同顺序的步骤。然而，理想地，在低温下(至少最初在低温下)进行缀合反应，例如约0℃至约6℃，例如约2℃至约6℃(例如约2℃、约2.5℃、约3℃、约3.5℃、约4℃、约4.5℃、约5℃、约5.5℃或约6℃)，从而降低所述缀合物析出的程度。在具体的实例中，所述反应在约4℃进行。
C.多价免疫原性缀合物的制备
在一些实施方案中，所述公开的方法使用多种免疫原性不同的多糖和/或多种蛋白质以制备多价免疫原性缀合物。例如，利用以上描述的方法将两种以上(例如2、3、4、5或更多种)免疫原性不同的多糖的混合物(例如多种免疫原性不同的多糖)缀合到至少一种蛋白质(例如fHbp或NspA)。在一些实例中，所述多种免疫原性不同的多糖包括两种以上脑膜炎球菌多糖(例如两种或更多种的选自血清型A、B、C、W-135和Y的脑膜炎球菌多糖)。在一个具体实例中，所述多种免疫原性不同的多糖包括脑膜炎球菌血清组A多糖(MAPS)、脑膜炎球菌血清组C多糖(MCPS)、脑膜炎球菌血清组W-135多糖(MWPS)和脑膜炎球菌血清组Y多糖(MYPS)。在其他实例中，所述多种免疫原性不同的多糖包括来自两种以上不同细菌的多糖(例如脑膜炎球菌多糖、肺炎球菌多糖、b型流感嗜血杆菌多糖、伤寒沙门菌Vi多糖和组B链霉菌多糖中的两种或更多种)。在一个具体实例中，所述多种免疫原性不同的多糖包括至少一种脑膜炎球菌多糖，至少一种肺炎球菌多糖和至少一种b型流感嗜血杆菌多糖。
在一些实例中，多于一种多糖的混合物(例如多种免疫原性不同的多糖)可通过在单个批次步骤中与单一的活化试剂(或活化试剂混合物)反应被同时活化。在一个实例中，MAPS、MCPS、MWPS和MYPS的混合物可以在单个批次反应中与醛-官能化试剂反应。在另一实例中，MAPS、MCPS、MWPS和MYPS的混合物可在单个批次反应中与氰酸酯-官能化试剂反应。在另外的实例中，至少一种脑膜炎球菌多糖(例如血清型A、B、C、W-135和Y的脑膜炎球菌多糖的至少一种)、和至少一种肺炎球菌多糖(血清组1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F的肺炎球菌多糖的至少一种)和至少一种b型流感嗜血杆菌多糖的混合物可以用氰酸酯-官能化试剂的醛-官能化试剂活化。随后将活化的多糖的混合物在单一方法中缀合到至少一种蛋白质(例如fHbp或NspA)。
在另一个实例中，每个单独的多糖可以通过在单独的方法中与活化试剂反应而被活化。随后可在缀合步骤之前将所述单独活化的多糖混合，从而所述活化的多糖可在单一方法中同时缀合。
在其他实例中，多价免疫原性缀合物通过将各独立的免疫原性缀合物混合来制备。例如，多价免疫原性缀合物可以通过将MAPS-fHbp、MCPS-fHbp、MWPS-fHbp和MYPS-fHbp缀合物混合而制备。多价免疫原性缀合物也可通过将具有缀合到fHbp的多糖的一种或多种免疫原性缀合物与具有缀合到NspA的多糖的一种或多种免疫原性缀合物混合来制备。
所述活化和缀合反应可依据以上描述的方法进行。
V.引起免疫应答或抑制或治疗感染的方法
将本文公开的和/或依据本文公开的方法制备的缀合物以有效量(例如治疗有效量)以适当的形式给予受试者，从而在所述受试者中引起免疫应答。在一些实施方案中，所述公开的免疫原性缀合物能够治疗、抑制或在一些实例中甚至预防受试者的感染或疾病(例如脑膜炎奈瑟氏菌感染)。本文使用的受试者，指动物例如哺乳动物。例如，哺乳动物包括人、灵长类、狗、猫、绵羊、牛、山羊、猪、马、小鼠、大鼠、兔、豚鼠等。术语受试者、患者和宿主互换使用。引起免疫应答或治疗、抑制或减轻感染的有效的特定剂量取决于待治疗的受试者的年龄、体重和身体状况，以及给药方法。使用所述公开的缀合物的免疫方案提供组合物和方法，用于预防或治疗受试者的疾病、紊乱和/或感染，这样的免疫方案是本领域普通技术人员已知的。合适的剂量和免疫方案可由本领域普通技术人员容易地确定。
包括所述公开的缀合物的药物组合物可相对于常规疫苗提供多个优势，包括增强弱免疫原性抗原的免疫原性、可能降低所使用的抗原的量、更低频率的免疫加强、提高的效力、优先刺激免疫性或潜在地以免疫应答为标靶。如下文所述，所述公开的免疫原性缀合物、由所述公开的方法制备的缀合物和/或包括所述缀合物的药物组合物可通过不同途径给予受试者，包括但不限于肠胃外、真皮内、跨膜、经皮肤(包括局部的)、肌内、腹膜内、静脉内、动脉内、病灶内、皮下、口服和鼻内(例如吸入)的给药途径。免疫原性缀合物可通过快速推注(bolus injection)或通过连续输注给药以及局部给药，例如在疾病或伤口部位进行。所述缀合物可任选地在可药用载体或生理上可接受的载体(赋形剂)中给药。
一种或多种所述公开的缀合物(例如2、3、4、5、6或更多种)可以与佐剂、稀释剂、赋形剂、载体及其他可药用物质一起配制。术语“可药用”用于指与生物系统例如细胞、细胞培养物、组织或生物体相容的无毒的材料。在一些实例中，所述公开的组合物是无菌的且在适用于向受试者给药的单位重量或体积中含有治疗有效量或预防有效量的所述缀合物。在本公开内容中使用的可药用载体(赋形剂)是常规的。Remington：The Science and Practice of Pharmacy，The Universityof the Sciences in Philadelphia，Editor，Lippincott，Williams，&Wilkins，Philadelphia，PA，21st Edition(2005)，描述了适用于一种或多种治疗性化合物或分子的药物递送的组合物和制剂。所述载体的性质取决于给药途径。生理上可接受的载体和可药用载体包括稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂及其他本领域熟知的材料。
将所述免疫原性缀合物配制成药物组合物可以利用本领域已知的方法进行。在一些实例中，所述组合物也可含有一种或多种佐剂。合适的佐剂包括，例如铝佐剂(如氢氧化铝或磷酸铝)、弗氏佐剂、BAY、3(N，N，-二甲基氨基乙烷)-氨甲酰基胆固醇(DC-Chol)、聚[二(羧酸钠苯氧基)膦腈](PCPP)、单磷酰基脂质A、CpG、QS-21、霍乱毒素和甲酰甲硫氨酰肽。参见，例如Vaccine Design，the Subunit andAdjuvant Approach，1995(M.F. Powell and M.J.Newman，eds.，PlenumPress，N.Y.)。
给予受试者的免疫原性缀合物的剂量和给药方案可根据制药和兽医领域普通技术人员熟知的标准技术确定，考虑预期使用的此类因素：特定抗原、佐剂(如果存在)、年龄、性别、体重、物种、总体状况、受试者之前的疾病和/或治疗，以及给药途径。初步剂量可以根据动物实验确定，对于向人类给药的剂量分级根据本领域接受的实践例如标准剂量实验进行。例如，治疗有效剂量最初可从血清抗体水平实验中评估。所述剂量取决于所述缀合物的比活力并可通过常规实验容易地确定。
在实践用于抑制、治疗和/或预防特定疾病的免疫方案时，向受试者给予治疗有效量的缀合物。在一些实例中，治疗有效量是对于受试者足以表现有意义的益处的治疗剂(例如缀合物)或其他活性组分的总量，所述有意义的益处例如免疫应答、治疗、治愈、抑制、预防或减轻相关的身体状况(疾病、感染等)、或提高治疗、治愈、预防或减轻这类病症的速度。有效量可包括独立的治疗剂(例如独立的本文公开的免疫原性缀合物)、治疗剂结合物(例如两种以上所述公开的免疫原性缀合物)、或一种或多种所述公开的免疫原性缀合物与其他试剂的结合物的量。可以同时、基本上同时或连续地向受试者给予组合物。在具体实例中，受试者被给予一定量的治疗剂或组合物，其以一定剂量和持续一定时间以治疗、抑制或甚至预防感染，例如脑膜炎奈瑟球菌感染将给予。
通常，有效量的或治疗有效量的缀合物的量是约1μg/kg或更少至约100μg/kg或更多，例如约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50μg/kg至约55、60、65、70、75、80、85、90或95μg/kg体重。如果感染后持续时间较短，有效量可以较少，因为病原体繁殖的时间较短。有效量也可取决于诊断时的细菌含量。可以考虑在几天时间内多次注射给药用于治疗用途。
所述公开的免疫原性缀合物可以作为单一剂量或在一系列包括一次或多次加强剂中给药。例如，受试者可接受单一剂量(例如，在生命早期)，随后最高达1个月、2个月、3个月、6个月、1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年或更晚被给予加强剂剂量。如果需要，如本领域技术人员确定的，可以给予多于一个加强剂剂量。该加强剂剂量产生来自已接触抗原的B-细胞的抗体，例如记忆性应答。在一些实例中，所述免疫原性缀合物在婴儿或儿童中引起高的初级功能抗体应答，并且能够在给予加强剂后引起记忆性应答，证明由所述缀合物疫苗引起的保护性免疫应答是长效的。
所述公开的免疫原性缀合物可被配制成液体制剂，例如用于口服、经鼻的(nasal)、经肛门的、经直肠的、经颊的、经阴道的、经口的(peroral)、经胃的、经粘膜的、经舌的、经肺的、经齿龈的、经嗅的(olfactory)或经呼吸道粘膜给药。适用于这类给药的形式包括悬液、糖浆和酏剂。所述公开的免疫原性缀合物也可被配制用于肠胃外、皮下、真皮内、肌肉内、腹膜内或静脉内给药、可注射给药、从埋植剂持续释放，或通过滴眼剂给药。适用于这类给药的形式包括无菌的悬液和乳液。这类制剂可以与适当的载体、稀释剂或赋形剂(例如无菌水、生理盐水、葡萄糖等)混合。所述免疫原性缀合物也可是冻干的。所述免疫原性缀合物或其制剂可含有辅助物质例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、胶凝或提高粘度的添加剂、防腐剂、调味剂、色素等，这取决于所需的给药途径和剂型。这类制剂可包括络合剂、金属离子、聚合化合物(例如聚乙酸(polyacetic acid)、聚乙醇酸、水凝胶、葡聚糖等)、脂质体、微乳剂、微团、单层或多层脂质体、血影或球芽。用于脂质体制剂的适当的脂质包括但不限于，甘油单酯、甘油二酯、硫苷脂、溶血卵磷脂、磷脂、皂苷、胆汁酸等。这些另外的组分的存在可影响物理状态、溶解性、稳定性、体内释放速率和体内清除速率，因此根据预期的应用进行选择，从而使载体的特性适合所选的给药途径。
所述免疫原性缀合物可以作为液体悬液或冷冻干燥产品提供。适当的液体剂型包括，例如，等渗的水溶液、悬液、乳液或被缓冲至所选pH的粘稠的组合物。经皮剂型包括洗液、凝胶、喷雾剂、软膏或其他适当的技术。如果需要经鼻或呼吸道(粘膜)给药(例如气溶胶吸入或注气法)，组合物可以为一种形式并用挤压喷雾分配器、泵分配器或气溶胶分配器分散。气溶胶通常借助烃加压。如下文所述，泵分配器可分散计量剂量或具有特定颗粒尺寸的剂量。
当为溶液、悬液或凝胶的形式时，除了活性成分之外，所述缀合物的制剂通常还可含有主要量的水(例如纯水)。也可存在少量的其他成分例如pH调节剂、乳化剂、分散剂、缓冲剂、防腐剂、润湿剂、胶凝剂、色素等。
在具体实例中，所述组合物是与受试者的血液或其他体液等渗的。所述组合物的等渗性可通过使用酒石酸钠、丙二醇或其他无机的或有机的溶质获得。氯化钠是特别优选的。可以使用缓冲剂，例如乙酸及乙酸盐、柠檬酸及柠檬酸盐、硼酸及硼酸盐和磷酸及磷酸盐。肠胃外赋形剂包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖(Ringer’s dextrose)、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏液或不挥发油。静脉的赋形剂包括液体和营养补充物、电解质补充物(例如基于林格氏葡萄糖的那些)等。
所述组合物的粘度可使用可药用增稠剂保持在所选的水平。一种合适的增稠剂是甲基纤维素，因为其可容易地并经济地获得，并且易于操作。其他合适的增稠剂包括，例如黄原胶、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、卡波姆等。增稠剂的浓度可取决于所选的试剂并且所使用的量可达到所选的粘度。通常通过加入这样的增稠剂而从溶液制备粘稠的组合物。
可以使用可药用防腐剂延长所述组合物的货架期。苯甲醇可能是合适的，但是也可以使用多种防腐剂包括例如对羟基苯甲酸酯、硫柳汞、三氯叔丁醇或苯扎氯铵。所述防腐剂的合适的浓度可为以总重量计0.02％至2％，但根据所选的试剂存在可理解的变化。
也可采用经肺递送所述缀合物。所述缀合物在吸气时被递送到哺乳动物的肺，穿过肺上皮内层到血流中。可以使用多种被设计为用于经肺递送治疗产品的机械装置，包括但不限于，喷雾器、计量剂量吸入器和粉末吸入器，其全部是本领域普通技术人员熟悉的。这些装置使用适用于分配缀合物的制剂。典型地，各制剂对所用装置的类型具有特异性，并且除了治疗中有用的稀释剂、佐剂和/或载体之外，还可涉及使用适当的推进剂材料。
有利地，所述缀合物被制备为用于经肺递送的微粒形式，平均颗粒尺寸为0.1μm或更小至10μm或更大，更大例如约0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8或0.9μm至约1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0或9.5μm用于经肺递送。用于经肺递送所述缀合物的可药用载体包括碳水化合物例如海藻糖、甘露醇、木糖醇、蔗糖、乳糖和山梨醇。用于肺部制剂中的其他成分可包括二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)和二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)。可以使用天然的或合成的表面活性剂，包括聚乙二醇和葡聚糖如环葡聚糖。也可使用胆盐及其他相关增强剂，以及纤维素和纤维素衍生物和氨基酸。也可使用脂质体、微囊、微球、包合络合物及其他类型的载体。
适合与喷雾器——喷射的或超声的——一起使用的制剂通常包含以一定浓度溶于或悬浮于水中的所述缀合物，所述浓度为每mL溶液约0.01mg或更少至100mg或更多缀合物，例如每mL溶液约0.1、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mg至约15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85或90mg缀合物。所述制剂也可包括缓冲剂和单糖(例如，用于蛋白质稳定和调节渗透压)。所述喷雾制剂也可含有表面活性剂，以降低或防止在形成气溶胶时雾化所述溶液引起的缀合物表面诱导的聚集。
与计量剂量吸入器装置一起使用的制剂通常包括细分散的粉末，所述粉末含有借助于表面活性剂悬浮于喷射剂的本发明化合物。所述喷射剂可包括常规喷射剂，例如氟氯化碳(chlorofiuorocarbon)、氢氯氟碳化物(hydrochlorofluorocarbon)、氢氟碳化物(hydrofiuorocarbons)和烃类，例如三氯氟甲烷、二氯二氟乙烷、二氯四氟乙醇和1，1，1，2-四氟乙烷及其结合物。合适的表面活性剂包括失水山梨醇三油酸酯、大豆卵磷脂和油酸。
用于粉末吸入器装置分散的制剂通常包括细分散的干燥粉末，所述干燥粉末含有所述缀合物，任选地包括疏松剂如乳糖、山梨醇、蔗糖、甘露醇、海藻糖或木糖醇，其含量有助于所述粉末从该装置分散，通常为所述制剂的约1wt.％或更少至99wt.％或更多，例如为所述制剂的约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50wt.％至约55、60、65、70、75、80、85或90wt.％。
当所述缀合物通过静脉、经皮、皮下或其他注射给药时，所述组合物可以是无热源的、胃肠外可接受的水溶液。制备具有适当的pH、等渗性、稳定性等的胃肠外可接受的溶液，是在本领域普通技术人员能力范围内的。在一个实例中，用于注射的药物组合物含有等渗赋形剂(isotonic vehicle)例如氯化钠注射液、林格氏注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖氯化钠注射液、乳酸林格氏注射液或其他本领域已知的赋形剂。所述药物组合物也可含有稳定剂、防腐剂、缓冲剂、抗氧化剂或其他本领域普通技术人员已知的添加剂。
注射持续时间可根据不同因素变化，并可包括在数秒或更短时间内的单次注射给药，至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时或更长时间的连续静脉给药。
所述缀合物可以通过液体或凝胶，或作为埋植剂或装置而局部(topically)、全身或区域性(locally)给药。
所述公开的缀合物或所述公开的缀合方法在制备疫苗中可为有用的，所述疫苗用于治疗、抑制或预防多种细菌感染，包括但不限于由脑膜炎奈瑟球菌、淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(A组链球菌)、Streptococcus agalaciae(B组链球菌)、链球菌(草绿色组)(Streptococcus(viridans group))、粪链球菌(Streptococcus faecalis)、牛链球菌(Streptococcus bovis)、链球菌(厌氧种)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、流感嗜血杆菌和伤寒沙门菌引起的感染。
所述缀合物可以与多种疫苗组合给药，所述疫苗是目前正在使用的或正在开发的疫苗，是预期用于人或非人受试者的。用于人受试者并针对感染性疾病的疫苗的实例包括复合白喉破伤风毒素疫苗；百日咳全细胞疫苗；灭活的流感疫苗；23-价肺炎球菌疫苗；麻疹病毒活疫苗；或流行性腮腺炎活疫苗；风疹活疫苗；卡介苗I(BCG)结核疫苗(Bacille C almette-Guerin I(BCG)tuberculosis vaccine)；甲型肝炎疫苗；乙型肝炎疫苗；丙型肝炎疫苗；狂犬病疫苗(例如人二倍体细胞疫苗)；灭活的脊髓灰质炎疫苗；脑膜炎球菌多糖疫苗(例如Sanofi Pasteur)；四价脑膜炎球菌缀合物乙醚(例如(SanofiPasteur)或(Novartis))；黄热病活病毒疫苗；伤寒灭活全细胞疫苗；霍乱疫苗；日本乙型脑炎灭活病毒疫苗；腺病毒疫苗；巨细胞病毒疫苗；轮状病毒疫苗；水痘疫苗；炭疽菌苗；天花疫苗；及其他可商购的和实验的疫苗。
所述缀合物可以试剂盒的形式提供给用药医师或其他卫生护理专业人员。所述试剂盒是一个套装，所述套装具有含有所述免疫原性缀合物的容器和和向受试者给予所述组合物的说明。该试剂盒也可任选地含有一种或多种其他治疗剂。该试剂盒可任选地含有一种或多种诊断工具及使用说明。例如，可以包括含有两种以上所述公开的免疫原性缀合物或其他疫苗的组合物，或含有不同缀合物、疫苗或治疗剂的单独的药物组合物。该试剂盒也可含有用于连续或顺序给药的各单独剂量的所述免疫原性缀合物。所述试剂盒可含有合适的给药装置，例如注射器、吸入装置等，及所述治疗剂的给药说明。该试剂盒可任选地含有用于贮存、复水(如果可用)以及给予任何或全部所包括的治疗剂的说明。所述试剂盒可包括多个容器，所述容器反映了向受试者给药的次数。如果所述试剂盒含有第一和第二个容器，则可以存在多个容器。
本公开内容以下非限制性实施例进行说明。
实施例1
缀合物的制备
方法
MAPS由SynCo BioPartners，Amsterdam，The Netherlands生产。MCPS来自FioCruz，BioMaguinhus，Brazil。MWPS和MYPS来自Chiron(Emoryville，CA)。破伤风类毒素(TT)从印度的Wyeth Vaccinesand Serum Institute获得。1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸盐(CDAP)购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)。
fHbp1基因通过PCR扩增，利用基因组脑膜炎奈瑟氏球菌H44/76基因组DNA作为模板、正向引物AAGCTTCCTCGAGTGAGCAGTGGAGGGGGTGGTGTCGCC(SEQ ID NO：9)和反向引物GGCGGGGAATTCACTTATTGCTTGGCGGCAAGGCCGAT(SEQID NO：10)进行。fHbp2基因通过PCR扩增，利用基因组脑膜炎奈瑟氏球菌7608基因组DNA作为模板、正向引物AAGCTTCCTCGAGTGAGCAGTGGAGGCGGCGGTGTCGCC(SEQ ID NO：11)和反向引物GGCGGGGAATTCACTTACTACTGTTTGCCGGCGATGCC(SEQID NO：12)进行。将PCR产物克隆到pT7-MAT-Tag-Flag-1载体(Sigma-Aldrich)的XhoI-EcoRI位点，随后将该载体用于转化大肠杆菌(E.coli)细胞BL21(DE3)。将转化的细胞在LB培养基中培养，用1mM IPTG诱导，将细胞裂解，并将His-标记的蛋白质在镍柱上纯化。
对于fHbp1/fHbp2融合蛋白(fHbp1+2)，先将fHbp1基因通过PCR扩增，利用基因组脑膜炎奈瑟氏球菌H44/76基因组DNA为模板、fHbp1使用的正向引物(SEQ ID NO：9)，和反向引物CGATCCGCCACCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCTTGCTTGGCAAGGCCGAT(SEQ ID NO：13)进行。将PCR产物用相同的正向引物和反向引物GCCGCCTCCTCTAGAACCGCCACCGCCAGAGCCACC(SEQ IDNO：14)再次扩增。fHbp2基因通过PCR扩增，利用基因组脑膜炎奈瑟氏球菌7608基因组DNA作为模板、正向引物GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGGAGGCGGCGGTGTCGCC(SEQ ID NO：15)和fHbp2使用的反向引物(SEQ ID NO：12)进行。将所述PCR产物用正向引物GGTGGCGGTTCTAGAGGAGGCGGCGGTGTCGCC(SEQ ID NO：16)和相同的反向引物再次扩增。将fHbp1PCR产物用XhoI和XbaI消化，而将fHbp2PCR产物用XbaI和EcoRI消化。将消化的产物克隆到pT7-MATTag-Flag-1载体(Sigma-Aldrich)的XhoI-EcoRI位点，所述载体随后被用于转化大肠杆菌细胞BL21(DE3)。将转化的细胞在LB培养基中培养，用1mM IPTG诱导，将细胞裂解并将His-标记的蛋白质在镍柱上纯化。
将纯化的蛋白质在10％SDS-PAGE凝胶上分析，并用Jar 5和Jar11单克隆抗体进行蛋白质印记分析。
多糖缀合至fHbp通过利用改进的Lees et al(Vaccine 26：190-198，1996)的CDAP缀合方法进行，所述改进涉及在4℃进行全部活化和缀合反应。首先，将10μL PS(10mg/mL；Mn A、C、W135或Y)与1μL CDAP(100mg/mL于乙腈中)混合，随后向所述反应混合物中加入1μL三乙胺(TEA，0.2M)。在4℃孵育1.5-2小时后，向所述反应混合物中加入4μL 0.1M磷酸盐缓冲液，pH 5.5，之后加入0.1mg fHbp或根据Lee et al.(Vaccine 27：726-732，2009)制备的酰肼-修饰的TT。将所述缀合反应在冷室中进行过夜，伴随旋转搅拌器搅拌。用10mM HEPES，pH 7.2，50mM NaCl(4x1000mL)在4℃透析后，将所述缀合产物用透析缓冲液调节至[PS]＝0.2mg/mL并储存于冰箱中。
将蛋白质、多糖和缀合产物(25μL，0.1mg/mL)的样品施加于含0.9％NaCl、10mM Tris(pH 7.2)、1mM EDTA的WatersUltrahydrogelTM 2000柱，以0.5mL/分钟在使用软件的Dionex HPLC系统中，用UV检测器在280nm监测蛋白质信号，并用折光率检测器(refractive index detector)检测蛋白质、多糖和缀合物。
结果
图1A-B示出了用于制备缀合物疫苗的纯化的fHbp1、fHbp2和fHbp(1+2)蛋白的SDS-PAGE凝胶和蛋白质印记。将所述纯化的fHbp(1+2)蛋白通过由Lees et al.(Vaccine 26：190-198，1996)开发的常规CDAP缀合方法缀合到PS，所述方法需要在室温下将PS活化2-2.5分钟以实现最大收率；或通过改变的方法缀合，其中用CDAP活化PS在4℃进行1.5至2小时。两个方法的产物的尺寸排阻HPLC图谱显示，与常规方法相比，改变的方法导致更高的缀合收率(图2)。
改变的缀合方法用于后续的所有纯化的fHbp蛋白与脑膜炎球菌多糖的缀合。图3A示出了在280nm监测的fHbp1和MCPS-fHbp1、MCPS-fHbp2及MCPS-fHbp(1+2)缀合物的尺寸排阻HPLC图谱，图3B示出了fHbp(1+2)及其与MAPS、MCPS、MWPS和MYPS的缀合物的尺寸排阻HPLC图谱。fHbp1、fHbp2和fHbp(1+2)各自的峰在22-23分钟。在PS和所述蛋白质之间形成缀合物通过蛋白质信号的移动指示，所述蛋白质信号从22-23分钟移动到缀合后在15-19分钟的更高分子量位置，而剩余的未被缀合的蛋白质残留物没有移动。
实施例2
fHbp缀合物的免疫原性
方法
将数组5或10只NIH-Swiss小鼠用0.1mL接种物在第0、14和28天经皮下免疫，在第35天收集血清，所述接种物含有实施例1制备的缀合物或fHbp和天然PS的混合物(对照)。
将1B板(Dynatech)用100μL的包被溶液包被2小时，所述包被液含PBS(pH 7.4)、与甲基化人血清白蛋白(5μg/mL)或1μg/mL fHbp1或fHbp2混合的天然Mn A、C、W135或Y PS(5μg/mL)，并用150μL洗涤缓冲液(PBS，pH 7.4，0.05％20和0.02％NaN3)洗涤三次。将血清样品或参照血清(被指定具有3200单位/mL抗-Mn A、C、W135或Y PS抗体，或32000单位/mL抗-fHbp1或fHbp2抗体)用稀释缓冲液(PBS，pH 7.4，4％新生小牛血清，0.02％NaN3)稀释，从1∶200开始的一系列二倍稀释。将100μL这些稀释的样品加到ELISA板的每个孔中。将板在室温孵育过夜，用150μL洗涤缓冲液洗涤三次，随后与100μL缀合有碱性磷酸酶的山羊抗-小鼠IgG Fc(稀释缓冲液中1/3000稀释)孵育2小时。将所述板用150μL洗涤缓冲液洗涤三次，与100μL对-硝基苯基磷酸酯(1mg/mL，溶于1M Tris，pH 9加0.3mM MgCl2中)孵育以显色。加入50μL 1N NaOH终止反应，并用ELISA酶标仪(plate reader)(ModelEL800，Bio-Tek，Winooski，VT)在405nm测定吸光度。基于在同一板中共同分析的参照血清的标准曲线，从读数计算所述样品的抗体水平。计算每个小鼠组的抗体水平的几何平均值。
结果
用缀合到fHbp1、fHbp2和fHbp(1+2)的MCPS免疫的小鼠对载体蛋白fHbp1、fHbp2和fHbp(1+2)以及脑膜炎球菌C多糖都具有强IgG应答(表1)。如预期的，当用蛋白质(fHbp1、fHbp2和fHbp(1+2))和脑膜炎球菌C多糖的未缀合的混合物免疫小鼠时，没有观察到针对脑膜炎球菌C多糖的免疫应答。这表明fHbp1、fHbp2和fHbp(1+2)可充当增强缀合的MCPS的免疫原性的有效载体蛋白。另外，fHbp1MCPS、fHbp2MCPS和fHbp(1+2)MCPS缀合物中的蛋白质可诱导与对照组中未缀合的蛋白质相当的抗体水平(单位/mL)。由于所述融合蛋白fHbp(1+2)能够诱导针对fHbp1和fHbp2二者的强免疫应答，其在后续实验中被用作载体蛋白。
表1.来自用1μg缀合物或1μ蛋白质+1μg MCPS混合物(对照)免疫后一周的小鼠(n＝5)的抗血清中的ELISA IgG[Ab]水平(单位/mL)a的几何平均值
a指定的参照血清IgG[Ab]水平(单位/mL)：[抗-MCPS]＝3200；[抗-fHbp1]＝32,000；[抗-fHbp2]＝32,000
表2示出了由在单一的单价或组合制剂中的缀合物诱导的针对MAPS、MCPS、MWPS、MYPS、fHbp1和fHbp2的ELISA IgG水平的几何平均值。与用fHbp(1+2)和脑膜炎球菌组A、C、W135和Y PS的混合物注射的对照组相比，每种缀合物都诱导了高出许多的抗-PSIgG抗体(13,803-106,193单位/mL相对于21-774单位/mL)。在用所述缀合物免疫的小鼠中诱导的针对所述载体蛋白的抗体水平与在用未缀合的载体fHbp(1+2)蛋白免疫的小鼠中诱导的抗体水平类似(对于fHbp1组分，23,195-98,252单位/mL相对于64,468单位/mL；对于fHbp2组分，10,611-35,327单位/mL相对于6,393单位/mL)。对于组合制剂，以全部或1/4剂量，与每种单一的缀合物组分相比，诱导了相似水平的针对分别的PS抗原和载体蛋白组分的抗体。总之，这些数据证明，fHbp(1+2)可用作单一的单价或组合制剂中脑膜炎球菌组A、C、W135和Y PS的缀合物的有效载体蛋白。
表2.来自用1μg fHbp(1+2)+各1μg MAPS、MCPS、MWPS和MYPS的混合物(ACWY PS)(组a)、各1μg缀合物(组b-e)、组合制剂(组f)或1/4量的所述组合制剂(组g)免疫后一周的小鼠(n＝10)的抗血清中ELISA[IgG]水平(单位/mL)a的几何平均值
a指定的参照血清IgG[Ab]水平(单位/mL)：[抗-MAPS]＝3200；[抗-MCPS]＝3200；[抗-MWPS]＝32,000；[抗-MYPS＝32,000]；[抗-fHbp1]＝32,000；[抗-fHbp2]＝32,000
实施例3
诱导的抗血清的杀菌活性
方法
血清杀菌实验按之前的描述(Moran et al.，Infect.Immun.62：5290-295，1994)进行，使用预先筛选的缺乏针对受试菌株的杀菌活性的正常人血清作为补体来源。在血清杀菌实验测试前将来自每组小鼠的单独小鼠血清混合。根据可获得的血清的量和预期的滴度，对所述混合的小鼠血清用1∶2至1∶8的起始稀释度进行测试。当使用1∶4或1∶8的起始稀释度时，用标准杀灭曲线将结果外推至更低的稀释度。将杀死＞50％细菌的血清的最高稀释度的倒数作为所述血清的终点滴度。如果在测试的最低稀释度下杀灭百分比在35％至50％之间，那么所述血清被指定为下一个更低稀释度的滴度。如果杀灭百分比在0％至35％之间，所述血清被指定为低两个稀释度的滴度。如果在1∶2的稀释度下存在少于50％的杀灭，所述血清的滴度被指定为1∶1。测试的最高稀释度为1∶512。所有来自小鼠的预先接种疫苗的血清缺乏针对任何受试菌株的杀菌抗体并被指定为1∶1的滴度。
结果
表3示出了针对fHbp(1+2)的经诱导的IgG抗体对脑膜炎奈瑟氏球菌血清组B fHbp1-表达菌株44/76和8570和fHbp2-表达菌株7608和8047以及血清组X菌株9557、9558和9559的杀菌活性。预先采血的对照组表现出极低的杀菌活性，其滴度被指定为1。在用fHbp(1+2)和血清组A、C、W-135和Y PS的未缀合的混合物免疫的小鼠的血清中观察到针对fHbp1-表达血清组B和X脑膜炎奈瑟氏球菌菌株的杀菌抗体。当在经诱导的抗血清中观察到针对fHbp2的抗体时，发现他们没有杀菌作用。还在用fHbp(1+2)和血清组A、C、W-135和Y PS缀合物免疫的小鼠的血清中观察到针对fHbp1-表达血清组B和X脑膜炎奈瑟氏球菌菌株的杀菌抗体。针对fHbp2的杀菌抗体在用所述缀合物免疫的小鼠的血清中是可变的，并且与用其他fHbp(1+2)PS缀合物免疫的小鼠血清中存在的水平相比，用fHbp(1+2)MWPS缀合物免疫的针对fHbp1的杀菌抗体的水平通常相对较低。在组合制剂中，全剂量组(组f)具有与对照组大约相同的针对血清组B fHbp1-表达菌株的杀菌滴度(滴度4)及针对血清组X菌株的降低的滴度(滴度2)，而1/4剂量组具有针对组B和X菌株的降低的滴度(滴度2)。
表3.来自用1μg fHbp(1+2)+各1μg MAPS、MCPS、MWPS和MYPS的混合物(ACWY PS)(组a)、各1μg缀合物(组b-e)、组合制剂(组f)或1/4量的所述组合制剂(组g)免疫后一周的小鼠(n＝10；组a-g)的混合抗血清的针对组B和X脑膜炎球菌(分别为MB和MX)的杀菌滴度
PS-特异性IgG抗体的杀菌活性用针对PS-同源菌株(血清型A和C为4个菌株，并且W-135和Y为3个菌株)的杀菌实验测定(表4)。预先采血物以及ACWY PS和fHbp(1+2)的混合物对照组表现出无杀菌活性(滴度1)。所有测试的由单价缀合物或组合制剂诱导的抗血清被发现对受试的PS-同源菌株具有杀菌活性(表4)。由于已知来自血清组A、C、W-135和Y的荚膜多糖在小鼠中是非免疫原性的，因此这些数据表明，fHbp的确可以被用作缀合物疫苗的载体蛋白，所述缀合物疫苗又依次会诱导PS-特异性IgG抗体。将由单价缀合物诱导的抗血清的杀菌滴度与全剂量的组合制剂以及1/4降低剂量的组合制剂诱导的抗血清的杀菌滴度相比，血清组A、C和Y单价缀合物诱导了与组合制剂相比具有相等或更高滴度的抗血清。相反，血清组W-135诱导了与组合制剂相比具有相等或更低滴度的抗血清。
表4.来自用1μg fHbp(1+2)+各1μg MAPS、MCPS、MWPS和MYPS的混合物(ACWY PS)(组a)、各1μg缀合物(组b-e)、组合制剂(组f)或1/4量的所述组合制剂(组g)免疫后一周的小鼠(n＝10；组a-g)的混合抗血清针对PS-同源的A、C、W-135和Y菌株的杀菌滴度
鉴于本发明的原则可以应用到许多可能的实施方案，应当认识到，所示实施方案仅仅是实例，并且不应理解为限制本发明的范围。

Claims (23)

1.制备免疫原性缀合物的方法，包括
在约2℃至约6℃下将至少一种多糖与氰基化试剂反应，得到氰酸酯-活化的多糖；及
使至少一种氰酸酯-活化的多糖与至少一种蛋白质在pH约5至约8，约2℃至约6℃下接触，使得所述至少一种氰酸酯-活化的多糖与所述至少一种蛋白质反应，得到包括至少一个在所述至少一种多糖和所述至少一种蛋白质之间形成的C-N键的免疫原性缀合物。
2.权利要求1的方法，还包括：
在将所述至少一种氰酸酯-活化的多糖与所述至少一种蛋白质接触前，将所述至少一种蛋白质与肼、羰酰肼、盐酸肼、二酰肼或其混合物在约2℃至约6℃反应，产生至少一种酰肼-活化的蛋白质溶液。
3.权利要求2的方法，其中将所述至少一种蛋白质与肼、羰酰肼、琥珀酰二酰肼、己二酸二酰肼或其混合物在碳二亚胺盐酸盐的存在下、在pH约6至约7下反应，得到酰肼-活化的蛋白质溶液。
4.权利要求3的方法，其中所述碳二亚胺包括1-[3-(二甲氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述氰基化试剂包括1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸盐(CDAP)、1-氰基-4-吡咯烷基吡啶四氟硼酸盐(CPIP)、溴化氰、对-硝基苯基氰酸酯(pNPC)或四氟硼酸N-氰基-N，N，N-三乙基铵(CTEA)。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述至少一种多糖包括脑膜炎球菌组A多糖、脑膜炎球菌组C多糖、脑膜炎球菌组W-135多糖、脑膜炎球菌组Y多糖，或其两种以上的组合。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述至少一种蛋白质包括fHbp亚家族A(fHbp2)蛋白或其一部分、fHbp亚家族B(fHbp2)蛋白或其一部分，或其组合。
8.权利要求7的方法，其中所述fHbp蛋白包括fHbp融合蛋白，所述fHbp融合蛋白包括fHbp1的至少一部分和fHbp2的至少一部分。
9.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述至少一种蛋白质包括奈瑟球菌表面蛋白A或其免疫原性部分。
10.通过权利要求1-9中任一项的方法制备的免疫原性缀合物。
11.免疫原性缀合物，其包括至少一种多糖或至少一种蛋白质或其免疫原性部分，以及至少一种奈瑟球菌表面蛋白，其中所述至少一种多糖或所述至少一种蛋白质通过至少一个连接基团被连接到所述奈瑟球菌表面蛋白。
12.权利要求11的免疫原性缀合物，其中所述至少一种奈瑟球菌表面蛋白包括至少一种奈瑟球菌因子H结合蛋白(fHbp)或至少一种奈瑟球菌表面蛋白A(NspA)。
13.权利要求11或权利要求12的免疫原性缀合物，其中所述至少一种多糖包括脑膜炎球菌多糖、肺炎球菌多糖、B型流感嗜血杆菌多糖、伤寒沙门菌Vi多糖，或组B链球菌多糖。
14.权利要求3的免疫原性缀合物，其中所述至少一种多糖是选自以下的脑膜炎球菌多糖：脑膜炎球菌组A多糖、脑膜炎球菌组C多糖、脑膜炎球菌组W-135多糖、脑膜炎球菌组Y多糖，以及其两种以上的组合。
15.权利要求2-4中任一项的免疫原性缀合物，其中所述至少一种fHbp包括fHbp亚家族A(fHbp2)蛋白、fHbp亚家族B(fHbp2)蛋白，或其组合。
16.权利要求15的免疫原性缀合物，其中所述至少一种fHbp包括fHbp融合蛋白，所述fHbp融合蛋白包括fHbp1的至少一部分和fHbp2的至少一部分。
17.药物组合物，其包含一种或多种权利要求11-16中任一项的免疫原性缀合物及可药用载体。
18.权利要求17的药物组合物，其还包含佐剂。
19.在受试者中引起针对脑膜炎奈瑟氏球菌的免疫应答的方法，包括向所述受试者给予有效量的一种或多种权利要求11-16中任一项的免疫原性缀合物或权利要求17或权利要求18的组合物，从而在所述受试者中引起针对脑膜炎奈瑟氏球菌的免疫应答。
20.权利要求19的方法，其中所述针对脑膜炎奈瑟氏球菌的免疫应答包括针对脑膜炎球菌血清组A、脑膜炎球菌血清组B、脑膜炎球菌血清组C、脑膜炎球菌血清组W-135、脑膜炎球菌血清组Y、脑膜炎球菌血清组X或其两种以上的组合的免疫应答。
21.权利要求19或权利要求20的方法，其中所述免疫应答包括杀菌活性。
22.权利要求19-21中任一项的方法，其中所述受试者是人。
23.权利要求11-16中任一项的免疫原性缀合物或权利要求17或权利要求18的药物组合物，用于在受试者中引起针对脑膜炎奈瑟氏球菌的免疫应答。
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