CN118027423A - 一种1型肺炎球菌多糖蛋白结合物的制备方法及其产品 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种1型肺炎球菌多糖蛋白结合物的制备方法及其产品，涉及疫苗制备技术领域。一种1型肺炎球菌多糖蛋白结合物的制备方法，包括以下步骤：将1型肺炎球菌多糖原液解聚后，调节至酸性，加入连接剂，使1型肺炎球菌多糖与连接剂形成席夫碱，再加入还原剂进行反应，得到多糖‑linker衍生物；调节多糖‑linker衍生物的pH至碱性，并在30℃‑50℃下反应2h‑4h，脱去多糖‑linker衍生物的酯基，得到脱去保护基的多糖‑linker衍生物；将脱去保护基的多糖‑linker衍生物与载体蛋白在缩合剂的作用下发生缩合反应，形成多糖‑linker‑蛋白结合物，再进行纯化，得到1型肺炎球菌多糖蛋白结合物。
Description
技术领域
本申请涉及疫苗制备技术领域，特别涉及一种1型肺炎球菌多糖蛋白结合物的制备方法及其产品。
背景技术
多糖蛋白结合物是采用化学方法将多糖共价结合在蛋白载体上所制备成的疫苗。肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,Spn)是一种兼性厌氧革兰氏阳性菌，是上呼吸道共生菌群的一部分，可无症状地定殖于鼻咽。若Spn定殖鼻咽后没有被免疫系统清除，则会传播到下呼吸道以及其他器官和组织中，引起许多Spn相关的疾病，例如：脑膜炎、菌血症、肺炎、急性中耳炎和鼻窦炎，Spn在两岁以下的儿童和老年人中的发病率更高。肺炎链球菌荚膜多糖(capsule polysaccharides，CPS)是主要的毒力因子之一，覆盖肺炎链球菌整个表面，其作用机制是掩盖细胞表面并阻断针对细胞表面抗原的补体沉积，从而使肺炎链球菌能够逃避吞噬作用并在宿主鼻咽处定殖。同时CPS还具有免疫原性，可诱导产生抗肺炎链球菌感染的抗体，这也是目前研制肺炎球链菌疫苗的免疫学基础。现如今，针对多种Spn血清型的肺炎球菌多糖疫苗(PPV)和肺炎球菌结合疫苗(PCV)已经开发出来，并广泛用于预防肺炎球菌疾病。市场上已有PCV10、PCV13、PCV15和PCV20等肺炎疫苗，其中1型肺炎链球菌多糖是这些分子中研究最多的分子之一。
目前市售多糖结合疫苗的生产方式是还原胺化法或1-氰基-4-二甲氨基吡啶(CDAP)活化多糖羟基后与蛋白结合，但1型肺炎链球菌多糖上的官能团会对这两种生产方式都会产生干扰，生成多糖自身偶联物和多糖-linker-多糖偶联物，导致疫苗免疫原性降低。因此，有必要开发一种新的1型肺炎球菌多糖蛋白结合物的制备方法。
发明内容
本申请的主要目的是提供一种1型肺炎球菌多糖蛋白结合物的制备方法及其产品，旨在解决现有疫苗制备方法得到的1型肺炎球菌多糖蛋白结合物的免疫原性不高的技术问题。
为实现上述目的，本申请提出了一种1型肺炎球菌多糖蛋白结合物的制备方法，包括以下步骤：
将1型肺炎球菌多糖原液解聚，得到1型肺炎球菌多糖解聚溶液；
将所述1型肺炎球菌多糖解聚溶液调节至酸性，再加入连接剂，进行活化反应，使所述1型肺炎球菌多糖与所述连接剂形成席夫碱，再加入还原剂进行反应，得到多糖-linker衍生物；
调节所述多糖-linker衍生物的pH至碱性，并在30℃-50℃下反应2h-4h，脱去所述多糖-linker衍生物的酯基，得到脱去保护基的多糖-linker衍生物；
将所述脱去保护基的多糖-linker衍生物与载体蛋白在缩合剂的作用下发生缩合反应，形成多糖-linker-蛋白结合物；
将所述多糖-linker-蛋白结合物进行纯化，得到1型肺炎球菌多糖蛋白结合物。
可选地，所述将1型肺炎球菌多糖原液解聚，得到1型肺炎球菌多糖解聚溶液的步骤，包括：
将1型肺炎球菌多糖原液在1000bar-1100bar的压强下，，均质10次-15次，使所述1型肺炎球菌多糖分子量为5万-9万，得到解聚多糖溶液，于2℃-8℃下保存。
可选地，所述连接剂为Ald-PEG4-叔丁酯，所述连接剂的结构式为：
可选地，所述还原剂为氰基硼氢化钠。
可选地，所述将所述1型肺炎球菌多糖解聚溶液调节至酸性，再加入连接剂，进行活化反应，使所述1型肺炎球菌多糖与所述连接剂形成席夫碱，再加入还原剂进行反应，得到多糖-linker衍生物的步骤，包括：
在所述1型肺炎球菌多糖解聚溶液中加入醋酸，调节pH至4.0-5.0，再加入连接剂，并在20℃-30℃下反应活化3.5h-4.5h，使所述1型肺炎球菌多糖与所述连接剂形成席夫碱，静置3h-5h后，加入还原剂，并在20℃-30℃下反应40h-50h，反应结束后，进行超滤，得到多糖-linker衍生物。
可选地，所述调节所述多糖-linker衍生物的pH至碱性，并在30℃-50℃下反应2h-4h，脱去所述多糖-linker衍生物的酯基，得到脱去保护基的多糖-linker衍生物的步骤，包括：
在所述多糖-linker衍生物中加入NaOH溶液，调节pH为9.0-9.5，并在30℃-50℃下反应2h-4h，脱去所述多糖-linker衍生物的酯基，再进行超滤，得到脱去保护基的多糖-linker衍生物。
可选地，所述将所述脱去保护基的多糖-linker衍生物与载体蛋白在缩合剂的作用下发生缩合反应，形成多糖-linker-蛋白结合物的步骤，包括：
在所述脱去保护基的多糖-linker衍生物中加入PBS缓冲液，调节pH为5.5-6.5，再加入载体蛋白和缩合剂，在20℃-30℃下反应3h-5h，再进行超滤，得到多糖-linker-蛋白结合物。
可选地，所述缩合剂为4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐。
可选地，所述将所述多糖-linker-蛋白结合物进行纯化，得到1型肺炎球菌多糖蛋白结合物的步骤，包括：
将所述多糖-linker-蛋白结合物通过4FF层析柱进行层析纯化，经过洗脱后，收集洗脱峰部分，并使用注射用水进行超滤换液，再采用0.22μm滤膜过滤后，得到1型肺炎球菌多糖蛋白结合物。
本申请还提出了一种1型肺炎球菌多糖蛋白结合物产品，采用上述1型肺炎球菌多糖蛋白结合物的制备方法所得。
本申请首先将1型肺炎球菌多糖解聚成较小分子量的多糖，以便于后续与载体蛋白的结合，再引入连接剂与1型肺炎球菌多糖反应，1型肺炎球菌多糖上的游离氨基会与连接剂反应形成席夫碱结构，席夫碱结构上带有C-N键，且有利于引进其他特殊官能团，再通过还原剂还原后，得到的多糖-linker衍生物中不含有游离氨基，而是形成了C-N键，使得1型肺炎球菌多糖上游离的氨基被结合，避免了游离氨基对后面结合反应的影响，再将多糖-linker衍生物上的酯基脱掉，使羧基官能团裸露出来，通过引入羧基，一方面，可减小1型肺炎球菌多糖与载体蛋白结合时的位阻，从而增加了1型肺炎球菌多糖与载体蛋白的反应效率，有利于快速制备得到更多的1型肺炎球菌多糖蛋白结合物，另一方面，引入的羧基不会干扰1型肺炎球菌多糖上本身自带的羧基，其都可与载体蛋白结合，生成1型肺炎球菌多糖蛋白结合物，从而促进了1型肺炎球菌多糖与载体蛋白的结合，使得在结合反应时，未结合的1型肺炎球菌多糖与载体蛋白的量减少，节省了反应耗材。本申请针对1型肺炎球菌多糖的特殊官能团游离氨基对结合反应的影响，通过对游离氨基进行结合，从而避免了由于游离氨基的干扰而生成多糖自身偶联物或多糖-linker-多糖偶联物，进而提高了疫苗的免疫原性。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1为本申请实施例所述的1型肺炎球菌多糖蛋白结合物的合成路线图；
图2为本申请实施例所述的1型肺炎球菌多糖的分子结构图。
本申请目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
如图2所示(其中，R表示氢基或乙酰基)，由于1型肺炎球菌多糖的重复结构单元中不仅含有常见的羟基和羧基，还含有一种特殊的官能团游离氨基，而目前市售多糖结合疫苗的生产方式是还原胺化法或1-氰基-4-二甲氨基吡啶(CDAP)活化多糖羟基后与蛋白结合，但1型肺炎链球菌多糖上的游离氨基对这两种生产方式都会产生干扰，即生成多糖自身偶联物或多糖-linker-多糖偶联物，导致疫苗免疫原性降低。
针对现有技术所存在的技术问题，本申请的实施例提供了一种1型肺炎球菌多糖蛋白结合物的制备方法，包括以下步骤：
将1型肺炎球菌多糖原液解聚，得到1型肺炎球菌多糖解聚溶液；
将所述1型肺炎球菌多糖解聚溶液调节至酸性，再加入连接剂，进行活化反应，使所述1型肺炎球菌多糖与所述连接剂形成席夫碱，再加入还原剂进行反应，得到多糖-linker衍生物；
调节所述多糖-linker衍生物的pH至碱性，并在30℃-50℃下反应2h-4h，脱去所述多糖-linker衍生物的酯基，得到脱去保护基的多糖-linker衍生物；
将所述脱去保护基的多糖-linker衍生物与载体蛋白在缩合剂的作用下发生缩合反应，形成多糖-linker-蛋白结合物；
将所述多糖-linker-蛋白结合物进行纯化，得到1型肺炎球菌多糖蛋白结合物。
如图1所示，本申请首先将1型肺炎球菌多糖解聚成较小分子量的多糖，以便于后续与载体蛋白的结合，再引入连接剂与1型肺炎球菌多糖反应，1型肺炎球菌多糖上的游离氨基会与连接剂反应形成席夫碱结构，席夫碱结构上带有C-N键，且有利于引进其他特殊官能团，再通过还原剂还原后，得到的多糖-linker衍生物中不含有游离氨基，而是形成了C-N键，使得1型肺炎球菌多糖上游离的氨基被结合，避免了游离氨基对后面结合反应的影响，再将多糖-linker衍生物上的酯基脱掉，使羧基官能团裸露出来，通过引入羧基，一方面，可减小1型肺炎球菌多糖与载体蛋白结合时的位阻，从而增加了1型肺炎球菌多糖与载体蛋白的反应效率，有利于快速制备得到更多的1型肺炎球菌多糖蛋白结合物，另一方面，引入的羧基不会干扰1型肺炎球菌多糖上本身自带的羧基，其都可与载体蛋白结合，生成1型肺炎球菌多糖蛋白结合物，从而促进了1型肺炎球菌多糖与载体蛋白的结合，使得在结合反应时，未结合的1型肺炎球菌多糖与载体蛋白的量减少，节省了反应耗材。本申请针对1型肺炎球菌多糖的特殊官能团游离氨基对结合反应的影响，通过对游离氨基进行结合，从而避免了由于游离氨基的干扰而生成多糖自身偶联物或多糖-linker-多糖偶联物，进而提高了疫苗的免疫原性。
作为本申请的一种可实施方式，所述将1型肺炎球菌多糖原液解聚，得到1型肺炎球菌多糖解聚溶液的步骤，包括：
将1型肺炎球菌多糖原液在1000bar-1100bar的压强下，均质10次-15次，使所述1型肺炎球菌多糖分子量为5万-9万，得到浓度为2mg/mL-5mg/mL的解聚多糖溶液，于2℃-8℃下保存。
由于多糖的分子量对于多糖与蛋白的结合会产生影响，多糖的分子量过大与过小时都会影响多糖蛋白结合物的分子量，进而影响多糖蛋白结合物的免疫原性，故本申请首先将1型肺炎球菌多糖进行解聚成较小分子量，1型肺炎球菌多糖分子量优选为5万-9万，有利于与载体蛋白的结合。
作为本申请的一种可实施方式，所述连接剂为Ald-PEG4-叔丁酯，所述连接剂的结构式为：
在具体实施过程中，Ald-PEG4-叔丁酯为含有羰基的醛类化合物，而1型肺炎球菌多糖上的氨基为带有孤电子对的氮原子，其可作为亲核试剂，氮原子进攻羰基基团上带有正电荷的碳原子，完成亲核加成反应，从而形成了席夫碱，使得1型肺炎球菌多糖上的游离氨基被结合，避免了游离氨基在后续反应中的干扰。
作为本申请的一种可实施方式，所述还原剂为氰基硼氢化钠。
具体的，氰基硼氢化钠的化学式为NaBH3CN，其属于硼氢化物类还原剂，亲电性较强，在还原反应中可用于还原不同的化合物，而席夫碱具有亲核性，可以被亲电试剂攻击，在一般的酸性条件下，席夫碱会被氢离子进行质子化，形成R-OH2+，当氰基硼氢化钠和席夫碱反应时，首先形成类似缩合的过渡态，这个过渡态可以被氰基硼氢化钠的硼氢离子[H3B-CN]-攻击，产生了一个内禀亲核进攻机制的过程，这个机制导致了硼离子与席夫碱氧原子之间的结合，形成了一个中间化合物，然后氢离子攻击中间化合物的硼离子，并将席夫碱还原为R-H，并释放H2O分子。
作为本申请的一种可实施方式，所述将所述1型肺炎球菌多糖解聚溶液调节至酸性，再加入连接剂，进行活化反应，使所述1型肺炎球菌多糖与所述连接剂形成席夫碱，再加入还原剂进行反应，得到多糖-linker衍生物的步骤，包括：
在所述1型肺炎球菌多糖解聚溶液中加入醋酸，调节pH至4.0-5.0，再加入连接剂，使所述连接剂的浓度为0.5mol/L-1.0mol/L，并在20℃-30℃下反应活化3.5h-4.5h，使所述1型肺炎球菌多糖与所述连接剂形成席夫碱，静置3h-5h后，加入还原剂，使所述还原剂的浓度为30mol/L-40mol/L，并在20℃-30℃下反应40h-50h，反应结束后，进行超滤，得到多糖-linker衍生物。
本申请首先将1型肺炎球菌多糖解聚溶液调节至酸性，在酸性环境下，可促使1型肺炎球菌多糖上的氨基氮原子进攻Ald-PEG4-叔丁酯的羰基基团上带正电荷的碳原子，完成亲核加成反应，形成席夫碱，再通过氰基硼氢化钠将席夫碱还原，形成多糖-linker衍生物，使得1型肺炎球菌多糖上的氨基被结合，最后经过超滤去除未反应的Ald-PEG4-叔丁酯和氰基硼氢化钠等杂质。
作为本申请的一种可实施方式，所述调节所述多糖-linker衍生物的pH至碱性，并在30℃-50℃下反应2h-4h，脱去所述多糖-linker衍生物的酯基，得到脱去保护基的多糖-linker衍生物的步骤，包括：
在所述多糖-linker衍生物中加入NaOH溶液，调节pH为9.0-9.5，并在30℃-50℃下反应2h-4h，脱去所述多糖-linker衍生物的酯基，再进行超滤，得到脱去保护基的多糖-linker衍生物。
由于Ald-PEG4-叔丁酯上带有酯基基团，Ald-PEG4-叔丁酯连接到1型肺炎球菌多糖上后，使得多糖-linker衍生物上也带有酯基基团，为提高1型肺炎球菌多糖与载体蛋白结合时的反应效率，本申请通过将多糖-linker衍生物在碱性环境反应，使多糖-linker衍生物脱去，形成了裸露的羧基基团，而羧基基团可减小多糖与蛋白的结合时的位阻，提高反应效率，最后再通过超滤去除NaOH等小分子等杂质，得到较为纯净的脱去保护基的多糖-linker衍生物。
作为本申请的一种可实施方式，所述将所述脱去保护基的多糖-linker衍生物与载体蛋白在缩合剂的作用下发生缩合反应，形成多糖-linker-蛋白结合物的步骤，包括：
在所述脱去保护基的多糖-linker衍生物中加入PBS缓冲液，调节pH为5.5-6.5，再加入载体蛋白和缩合剂，在20℃-30℃下反应3h-5h，再进行超滤，得到多糖-linker-蛋白结合物。
在缩合剂的作用下，脱去保护基的多糖-linker衍生物上的羧基与载体蛋白上的氨基会发生缩合反应，从而形成多糖-linker-蛋白结合物，再通过超滤，可去除未反应的缩合剂，以便于后续纯化去除未结合的多糖与载体蛋白，得到纯度更高的1型肺炎球菌多糖蛋白结合物。
具体的，载体蛋白包括CRM197蛋白、DT蛋白以及TT蛋白中的一种。CRM197蛋白是指白喉毒素突变体，DT蛋白为人工制备的失活白喉毒素，TT蛋白为甲醛处理的破伤风梭菌制备物。
作为本申请的一种可实施方式，所述缩合剂为4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐。
具体的，4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐可作为一种性能优异的缩合试剂与其他化学试剂或小分子底物进行结合，形成更具特异性和生物活性的活性化合物，而脱去保护基的多糖-linker衍生物分子结构上含有羧基，在缩合试剂的作用下，可与载体蛋白形成具有特异性的活性化合物。
作为本申请的一种可实施方式，所述将所述多糖-linker-蛋白结合物进行纯化，得到1型肺炎球菌多糖蛋白结合物的步骤，包括：
将所述多糖-linker-蛋白结合物通过4FF层析柱进行层析纯化，经过洗脱后，收集洗脱峰部分，并使用注射用水进行超滤换液，再采用0.22μm滤膜过滤后，得到1型肺炎球菌多糖蛋白结合物。
具体的，本申请采用AKTApure纯化系统与4FF凝胶色谱柱对多糖蛋白结合物进行纯化分离，采用波长为206nm、280nm的紫外检测器检测流出液，经缓冲液洗脱后出现洗脱峰，收集洗脱峰部分，并通过注射用水超滤换液后，再经0.22μm的滤膜过滤，可得到纯度更高的1型肺炎球菌多糖蛋白结合物。
本申请的实施例还提供了一种1型肺炎球菌多糖蛋白结合物产品，采用上述1型肺炎球菌多糖蛋白结合物的制备方法所得。
下面结合具体实施例对本申请上述技术方案进行详细说明。
实施例1
一种1型肺炎球菌多糖蛋白结合物的制备方法，包括以下步骤：
将1型肺炎球菌多糖原液在1050bar的压强下，均质12次，使所述1型肺炎球菌多糖分子量为7万，得到浓度为4.5mg/mL的解聚多糖溶液，于6℃下保存；
在所述1型肺炎球菌多糖解聚溶液中加入醋酸，调节pH至4.0，再加入连接剂Ald-PEG4-叔丁酯，使Ald-PEG4-叔丁酯的浓度为0.75mol/L，并在25℃下反应活化4h，使所述1型肺炎球菌多糖与所述连接剂形成席夫碱，静置4h后，加入还原剂氰基硼氢化钠，使氰基硼氢化钠的浓度为35mol/L，并在25℃下反应45h，反应结束后，进行超滤，除去未反应的连接剂和氰基硼氢化钠等杂质，得到多糖-linker衍生物；
在所述多糖-linker衍生物中加入1mol/L的NaOH溶液，调节pH为9.0，并在40℃下反应3h，脱去多糖-linker衍生物的酯基，再进行超滤，除去NaOH等杂质，得到脱去保护基的多糖-linker衍生物；
在脱去保护基的多糖-linker衍生物中加入PBS缓冲液，调节pH为6.0，再加入5mg/L的CRM197和缩合剂4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐，在25℃下反应4h，再进行超滤，除去未反应的缩合剂以及未结合的蛋白、多糖等，得到多糖-linker-蛋白结合物；
将所述多糖-linker-蛋白结合物通过4FF层析柱进行层析纯化，经过洗脱后，收集洗脱峰部分，并使用注射用水进行超滤换液，再采用0.22μm滤膜过滤后，得到1型肺炎球菌多糖蛋白结合物。
实施例2
一种1型肺炎球菌多糖蛋白结合物的制备方法，包括以下步骤：
将1型肺炎球菌多糖原液在1000bar的压强下，均质15次，使所述1型肺炎球菌多糖分子量为5万，得到浓度为2mg/mL的解聚多糖溶液，于2℃下保存；
在所述1型肺炎球菌多糖解聚溶液中加入醋酸，调节pH至4.0，再加入连接剂Ald-PEG4-叔丁酯，使Ald-PEG4-叔丁酯的浓度为0.5mol/L，并在20℃下反应活化4.5h，使所述1型肺炎球菌多糖与所述连接剂形成席夫碱，静置3h后，加入还原剂氰基硼氢化钠，使氰基硼氢化钠的浓度为30mol/L，并在20℃下反应50h，反应结束后，进行超滤，除去未反应的连接剂和氰基硼氢化钠等杂质，得到多糖-linker衍生物；
在所述多糖-linker衍生物中加入1mol/L的NaOH溶液，调节pH为9.0，并在30℃下反应4h，脱去多糖-linker衍生物的酯基，再进行超滤，除去NaOH等杂质，得到脱去保护基的多糖-linker衍生物；
在脱去保护基的多糖-linker衍生物中加入PBS缓冲液，调节pH为5.5，再加入4mg/L的CRM197和缩合剂4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐，在20℃下反应5h，再进行超滤，除去未反应的缩合剂以及未结合的蛋白、多糖等，得到多糖-linker-蛋白结合物；
将所述多糖-linker-蛋白结合物通过4FF层析柱进行层析纯化，经过洗脱后，收集洗脱峰部分，并使用注射用水进行超滤换液，再采用0.22μm滤膜过滤后，得到1型肺炎球菌多糖蛋白结合物。
实施例3
一种1型肺炎球菌多糖蛋白结合物的制备方法，包括以下步骤：
将1型肺炎球菌多糖原液在1100bar的压强下，均质10次，使所述1型肺炎球菌多糖分子量为9万，得到浓度为5mg/mL的解聚多糖溶液，于8℃下保存；
在所述1型肺炎球菌多糖解聚溶液中加入醋酸，调节pH至5.0，再加入连接剂Ald-PEG4-叔丁酯，使Ald-PEG4-叔丁酯的浓度为1.0mol/L，并在30℃下反应活化3.5h，使所述1型肺炎球菌多糖与所述连接剂形成席夫碱，静置5h后，加入还原剂氰基硼氢化钠，使氰基硼氢化钠的浓度为40mol/L，并在30℃下反应40h，反应结束后，进行超滤，除去未反应的连接剂和氰基硼氢化钠等杂质，得到多糖-linker衍生物；
在所述多糖-linker衍生物中加入1mol/L的NaOH溶液，调节pH为9.5，并在50℃下反应2h，脱去多糖-linker衍生物的酯基，再进行超滤，除去NaOH等杂质，得到脱去保护基的多糖-linker衍生物；
在脱去保护基的多糖-linker衍生物中加入PBS缓冲液，调节pH为6.5，再加入6mg/L的DT蛋白和缩合剂4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐，在30℃下反应3h，再进行超滤，除去未反应的缩合剂以及未结合的蛋白、多糖等，得到多糖-linker-蛋白结合物；
将所述多糖-linker-蛋白结合物通过4FF层析柱进行层析纯化，经过洗脱后，收集洗脱峰部分，并使用注射用水进行超滤换液，再采用0.22μm滤膜过滤后，得到1型肺炎球菌多糖蛋白结合物。
实施例4
一种1型肺炎球菌多糖蛋白结合物的制备方法，包括以下步骤：
将1型肺炎球菌多糖原液在1020bar的压强下，均质12次，使所述1型肺炎球菌多糖分子量为5万，得到浓度为3mg/mL的解聚多糖溶液，于4℃下保存；
在所述1型肺炎球菌多糖解聚溶液中加入醋酸，调节pH至4.0，再加入连接剂Ald-PEG4-叔丁酯，使Ald-PEG4-叔丁酯的浓度为0.8mol/L，并在23℃下反应活化4.2h，使所述1型肺炎球菌多糖与所述连接剂形成席夫碱，静置4.5h后，加入还原剂氰基硼氢化钠，使氰基硼氢化钠的浓度为38mol/L，并在26℃下反应48h，反应结束后，进行超滤，除去未反应的连接剂和氰基硼氢化钠等杂质，得到多糖-linker衍生物；
在所述多糖-linker衍生物中加入1mol/L的NaOH溶液，调节pH为9.2，并在40℃下反应3h，脱去多糖-linker衍生物的酯基，再进行超滤，除去NaOH等杂质，得到脱去保护基的多糖-linker衍生物；
在脱去保护基的多糖-linker衍生物中加入PBS缓冲液，调节pH为6.0，再加入6mg/L的CRM197和缩合剂4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐，在25℃下反应3.5h，再进行超滤，除去未反应的缩合剂以及未结合的蛋白、多糖等，得到多糖-linker-蛋白结合物；
将所述多糖-linker-蛋白结合物通过4FF层析柱进行层析纯化，经过洗脱后，收集洗脱峰部分，并使用注射用水进行超滤换液，再采用0.22μm滤膜过滤后，得到1型肺炎球菌多糖蛋白结合物。
以上所述仅为本申请的可选实施例，并非因此限制本申请的专利范围，凡是在本申请的发明构思下，利用本申请说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本申请的专利保护范围内。
Claims (10)
1.一种1型肺炎球菌多糖蛋白结合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将1型肺炎球菌多糖原液解聚，得到1型肺炎球菌多糖解聚溶液；
将所述1型肺炎球菌多糖解聚溶液调节至酸性，再加入连接剂，进行活化反应，使所述1型肺炎球菌多糖与所述连接剂形成席夫碱，再加入还原剂进行反应，得到多糖-linker衍生物；
调节所述多糖-linker衍生物的pH至碱性，并在30℃-50℃下反应2h-4h，脱去所述多糖-linker衍生物的酯基，得到脱去保护基的多糖-linker衍生物；
将所述脱去保护基的多糖-linker衍生物与载体蛋白在缩合剂的作用下发生缩合反应，形成多糖-linker-蛋白结合物；
将所述多糖-linker-蛋白结合物进行纯化，得到1型肺炎球菌多糖蛋白结合物。
2.根据权利要求1所述的1型肺炎球菌多糖蛋白结合物的制备方法，其特征在于，所述将1型肺炎球菌多糖原液解聚，得到1型肺炎球菌多糖解聚溶液的步骤，包括：
将1型肺炎球菌多糖原液在1000bar-1100bar的压强下，，均质10次-15次，使所述1型肺炎球菌多糖分子量为5万-9万，得到解聚多糖溶液，于2℃-8℃下保存。
3.根据权利要求1所述的1型肺炎球菌多糖蛋白结合物的制备方法，其特征在于，所述连接剂为Ald-PEG4-叔丁酯，所述连接剂的结构式为：
4.根据权利要求3所述的1型肺炎球菌多糖蛋白结合物的制备方法，其特征在于，所述还原剂为氰基硼氢化钠。
5.根据权利要求4所述的1型肺炎球菌多糖蛋白结合物的制备方法，其特征在于，所述将所述1型肺炎球菌多糖解聚溶液调节至酸性，再加入连接剂，进行活化反应，使所述1型肺炎球菌多糖与所述连接剂形成席夫碱，再加入还原剂进行反应，得到多糖-linker衍生物的步骤，包括：
在所述1型肺炎球菌多糖解聚溶液中加入醋酸，调节pH至4.0-5.0，再加入连接剂，并在20℃-30℃下反应活化3.5h-4.5h，使所述1型肺炎球菌多糖与所述连接剂形成席夫碱，静置3h-5h后，加入还原剂，并在20℃-30℃下反应40h-50h，反应结束后，进行超滤，得到多糖-linker衍生物。
6.根据权利要求1所述的1型肺炎球菌多糖蛋白结合物的制备方法，其特征在于，所述调节所述多糖-linker衍生物的pH至碱性，并在30℃-50℃下反应2h-4h，脱去所述多糖-linker衍生物的酯基，得到脱去保护基的多糖-linker衍生物的步骤，包括：
在所述多糖-linker衍生物中加入NaOH溶液，调节pH为9.0-9.5，并在30℃-50℃下反应2h-4h，脱去所述多糖-linker衍生物的酯基，再进行超滤，得到脱去保护基的多糖-linker衍生物。
7.根据权利要求1所述的1型肺炎球菌多糖蛋白结合物的制备方法，其特征在于，所述将所述脱去保护基的多糖-linker衍生物与载体蛋白在缩合剂的作用下发生缩合反应，形成多糖-linker-蛋白结合物的步骤，包括：
在所述脱去保护基的多糖-linker衍生物中加入PBS缓冲液，调节pH为5.5-6.5，再加入载体蛋白和缩合剂，在20℃-30℃下反应3h-5h，再进行超滤，得到多糖-linker-蛋白结合物。
8.根据权利要求1所述的1型肺炎球菌多糖蛋白结合物的制备方法，其特征在于，所述缩合剂为4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐。
9.根据权利要求1所述的1型肺炎球菌多糖蛋白结合物的制备方法，其特征在于，所述将所述多糖-linker-蛋白结合物进行纯化，得到1型肺炎球菌多糖蛋白结合物的步骤，包括：
将所述多糖-linker-蛋白结合物通过4FF层析柱进行层析纯化，经过洗脱后，收集洗脱峰部分，并使用注射用水进行超滤换液，再采用0.22μm滤膜过滤后，得到1型肺炎球菌多糖蛋白结合物。
10.一种1型肺炎球菌多糖蛋白结合物产品，其特征在于，采用如权利要求1-9任一项所述的1型肺炎球菌多糖蛋白结合物的制备方法所得。
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