JP5268222B2 - 改変された糖類、それらの結合体、およびそられの製造 - Google Patents

Description

本明細書中に引用しているすべての文書はその全体が参考として援用される。

本発明は糖類化学の分野にあり、改変された糖類、それらの調製のためのプロセスおよび、結合した誘導体に関する。特に、タンパク質に糖類を連結するために使用され得るリンカー部分を有する改変された糖類に関連している。

多糖類は重要な生物学的な分子で、疾患の予防および処置を目的として医薬産業において広く使用されている。例えば、莢膜多糖類は髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）やＨｉｂ(Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｔｙｐｅ Ｂ)のような莢膜菌に対するワクチンに何年間も使用されている。

特に子供において、これらの多糖類の免疫原性を向上させるために、結合ワクチンが開発されている。これらは輸送タンパク質に結合した莢膜多糖類を含む［例えば、米国特許第４，７１１，７７９号, 同第４，７６１，２８３号および同第４，８８２，３１７号]。結合した分子は直接的に結び付いた多糖類およびタンパク質を有し得るか、あるいは多糖類およびタンパク質がリンカー部分を経由して結び付く。

異なったタイプのリンカー部分が開発されているものの、汎用性であり、単純かつ確実な化学反応を使用して、多糖類およびタンパク質に結合できる新しいタイプのリンカーを必要とする。さらに、毒性がなく強酸や強塩基のような強い試薬の使用を避けて、穏やかな条件で形成され得る新しいリンカーを必要とする。

（本発明の改変された糖類）
本発明は式（Ｉ）の部分を含む改変された莢膜糖類を提供する：
−Ａ−Ｎ（Ｒ^１）−Ｌ−Ｍ （Ｉ）
ここで：
Ａは、結合、−Ｃ（Ｏ）−または−ＯＣ（Ｏ）−である。
Ｒ^１はＨまたはＣ_１−Ｃ_６アルキル基から選ばれる；
ＬはＣ_１−Ｃ_１２アルキレン基である；
Ｍはマスクされたアルデヒド基である。

「改変された莢膜糖類」という用語は、適切な改変によって、天然の莢膜糖類から得られる糖類を意味する。それゆえに、天然の莢膜糖類における単糖単位の繰り返しの基礎配列は本発明の改変された莢膜糖類においても保たれる。

「糖類」という用語は、オリゴ糖（例えば２〜３９の単糖単位を含んでいる）と多糖（例えば４０またはそれ以上の単糖単位を含んでいる）との両方を含んでいる。細菌において天然に見出されるように、一般に天然の莢膜糖類は多糖類の形態をとる。多糖類は短いオリゴ糖を生じるように扱われ得る。オリゴ糖は天然の多糖の精製および／またはサイズ処理により得られ得る（例えば、穏やかな酸での加水分解、加熱、サイジングクロマトグラフィーなどによる）。

代表的には、本発明の改変された糖類はオリゴ糖である。オリゴ糖は上記にしたサイズ処理方法のいずれかにより多糖から得られ得る。

本発明の改変された莢膜糖類は天然の莢膜糖類から得られる。しかしながら、本発明は天然の莢膜糖類から得られ得る改変された糖類に限定されていない。本発明の改変された莢膜糖類は、全てあるいは部分的な合成のような他の手法により得られ得る。

本発明の改変された莢膜糖類において、式（Ｉ）の部分は莢膜糖類の末端ではないヒドロキシル基または莢膜糖類の末端のアノマーのヒドロキシル基から誘導され得る。

式（Ｉ）の部分がアノマーのヒドロキシル基から誘導される場合、好ましくは、例えば還元的アミノ化反応によって、アノマーのヒドロキシル基を置換する。末端の糖類のヒドロキシル基上の還元的アミノ化反応は、当該分野において周知である。

式（Ｉ）の部分が末端でないヒドロキシル基から誘導される場合、好ましくは、例えばカルバメート基を経由して末端でないヒドロキシル基に連結される。それ故に、好ましい実施形態において、本発明の改変された莢膜糖類は式（Ｉａ）の部分を含む：
−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^１）−Ｌ−Ｍ （Ｉａ）
ここで、Ｒ^１、ＬおよびＭは上記の通りである。

このような化合物は、例えば、ＣＤＩで糖類上の遊離型ヒドロキシル基を誘導体化し、次いで、式：ＨＮ（Ｒ^１）−Ｌ−Ｍのアミンとカルバメート中間体を反応させることによって調製され得る。

好ましくは、Ｒ^１はＨである。好ましくは、ＬはＣ_１〜Ｃ_６のアルキレン基である。さらに好ましくは、Ｌは−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−である。糖類−タンパク質結合体において、式（Ｉ）のある部分がタンパク質に莢膜糖類を結びつけるために使用される場合、Ｌ基はスペーサーとして作用する。糖類とタンパク質の間のスペーサー基が結合体の安定性を高めることは知られている。

当業者は容易にアルデヒド基に変換される多くの異なった官能基を知っている。任意のそのような官能基がマスクされたアルデヒド基Ｍとして適切である。好ましくはマスクされたアルデヒド基Ｍは次から選ばれる。

ここで：
Ｒ^２はＨ、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、Ｃ_３〜Ｃ_１２シクロアルキル、Ｃ_５〜Ｃ_１２アリールまたはＣ_５〜１２アリール−Ｃ_１〜６アルキルから選ばれる（好ましくはＲ^２はＨではない）；
ＸとＹは同じまたは異なっていて、ＯまたはＳから独立して選ばれる；
Ｒ^３およびＲ^４はＣ_１〜Ｃ_１２アルキル、Ｃ_３〜Ｃ_１２シクロアルキル、Ｃ_５〜Ｃ_１２アリールまたはＣ_５〜１２アリール−Ｃ_１〜６アルキルから独立して選ばれるか；またはＲ^３およびＲ^４はヘテロ原子ＸおよびＹを含むＣ_３、Ｃ_４、Ｃ_５、Ｃ_６、Ｃ_７またはＣ_８シクロアルキル環を形成するように結合される；
Ｒ^５およびＲ^６はＨ、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、Ｃ_３〜Ｃ_１２シクロアルキル、Ｃ_５〜Ｃ_１２アリールまたはＣ_５〜１２アリール−Ｃ_１〜６アルキルから独立して選ばれるか；またはＲ^５およびＲ^６はＣ_３またはＣ_１２シクロアルキル環を形成するよう結合される；
Ｒ^９とＲ^１０はＨ、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、Ｃ_３〜Ｃ_１２シクロアルキル、Ｃ_５〜Ｃ_１２アリールまたはＣ_５〜１２アリール−Ｃ_１〜６アルキルから独立して選ばれるか；またはＲ^９およびＲ^１０はＣ_３〜１２シクロアルキル環を形成するように結合される；そして、
Ｒ^７およびＲ^８はＣ_１〜Ｃ_１２アルキル基またはＣ_３〜Ｃ_１２シクロアルキル基から独立して選ばれる。

「アルキル」という用語は、直鎖状と分枝状の両方の形態のアルキル基について言及するために本明細書中に使用されている。アルキル基は−Ｏ−、−ＮＨ−または−Ｓ−から選ばれた１、２または３個のヘテロ原子によって割り込まれ得る。アルキル基はまた、１、２または３個の二重結合および／または三重結合によって割り込まれ得る。しかしながら、「アルキル」という用語は普通、ヘテロ原子の妨害も、二重結合または三重結合の妨害も持たないアルキル基について言及している。Ｃ_１〜_１２アルキルについて参照される場合に、そのアルキル基は１個と１２個との間の任意の数の炭素原子（例えば、Ｃ_１、Ｃ_２、Ｃ_３、Ｃ_４、Ｃ_５、Ｃ_６、Ｃ_７、Ｃ_８、Ｃ_９、Ｃ_１０、Ｃ_１１、Ｃ_１２）を含有し得ることを意味する。同様に、Ｃ_１〜_６アルキルについて参照される場合に、そのアルキル基は１個と６個との間の任意の数の炭素原子（例えば、Ｃ_１、Ｃ_２、Ｃ_３、Ｃ_４、Ｃ_５、Ｃ_６）を含有し得ることを意味する。

「アルキレン」という用語は、直鎖状形態と分枝状形態の両方のアルキレン基について言及するために本明細書中に使用されている。そのアルキレン基は、−Ｏ−、−ＮＨ−、または−Ｓ−から選ばれた１、２または３個のヘテロ原子によって割り込まれ得る。アルキレン基はまた１、２、または３個の二重結合および／または三重結合によって割り込まれ得る。しかしながら、「アルキレン」という用語は普通、ヘテロ原子の妨害も、二重結合または三重結合の妨害も持たないアルキレン基について言及している。Ｃ_１〜_１２アルキレンについて参照される場合に、そのアルキレン基は１個と１２個との間の任意の数の炭素原子（例えば、Ｃ_１、Ｃ_２、Ｃ_３、Ｃ_４、Ｃ_５、Ｃ_６、Ｃ_７、Ｃ_８、Ｃ_９、Ｃ_１０、Ｃ_１１、Ｃ_１２）を含有し得ることを意味する。同様に、Ｃ_１〜_６アルキレンについて参照される場合に、そのアルキレン基は１個と６個との間の任意の数の炭素原子（例えば、Ｃ_１、Ｃ_２、Ｃ_３、Ｃ_４、Ｃ_５、Ｃ_６）を含有し得ることを意味する。

「シクロアルキル」という用語は、シクロアルキル基、ポリシクロアルキル基、およびシクロアルケニル基、ならびに、シクロアルキルアルキル基のようなアルキル基との組み合わせを含む。シクロアルキル基は−Ｏ−、−ＮＨ−、または−Ｓ−から選ばれた１、２または３個のヘテロ原子によって割り込まれ得る。しかしながら、「シクロアルキル」という用語は普通、ヘテロ原子の妨害を持たないシクロアルキル基について言及している。シクロアルキルの例としては、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘキセニル基、シクロヘキシルメチル基およびアダマンチル基が挙げられる。Ｃ_３〜１２シクロアルキルについて参照される場合に、シクロアルキル基は３個と１２個との間の任意の数の炭素原子（例えば、Ｃ_３、Ｃ_４、Ｃ_５、Ｃ_６、Ｃ_７、Ｃ_８、Ｃ_９、Ｃ_１０、Ｃ_１１、Ｃ_１２）を含有し得ることを意味する。

「アリール」という用語は、フェニルやナフチルのように、炭素と水素を含む芳香族基について言及するために本明細書中に使用されている。Ｃ_５〜１２アリールについて参照される場合に、５個と１２個との間の任意の数の炭素原子（例えば、Ｃ_５、Ｃ_６、Ｃ_７、Ｃ_８、Ｃ_９、Ｃ_１０、Ｃ_１１、Ｃ_１２）を含有し得ることを意味する。

「Ｃ_５〜１２アリール−Ｃ_１〜６アルキル」という用語は、ベンジル、フェニルエチルおよびナフチルエチルのような基について言及している。好ましくは、マスクされたアルデヒドは−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ_２ＯＨである。好ましくは、本発明の改変された莢膜糖類は式−ＮＨ（ＣＨ_２）_３ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ_２ＯＨ、さらに好ましくは−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_３ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ_２ＯＨの部分を含有する。

本発明はマスクされたアルデヒド基を有する化合物を提供する。マスクされたアルデヒドの使用は有利に莢膜糖類の改変中の不要な副反応を防止する。さらに、アルデヒド基が現れた場合、例えばタンパク質上のアミノ基の還元的アミノ化結合のために使用される。

一般に、式（Ｉ）または（Ｉａ）の部分はタンパク質のアミン基の次の反応の処理を提供する機能を果たす。本明細書中では、式（Ｉ）または（Ｉａ）の部分は普通、糖類−タンパク質結合体のリンカー基を形成することに使われる。

しかしながら、式（Ｉ）または（Ｉａ）、好ましくは（Ｉａ）は、分解、特に酸の加水分解による分解に対して糖類を安定させるためのブロック基として使用され得る。さらに式（Ｉａ）の部分は、リンカー基としての使用の代わりまたはリンカー基としての使用に加えて、ブロック基として使用され得る。莢膜糖類を安定させるブロック基の使用は国際特許出願ＰＣＴ／ＩＢ０３／０１４３６に記載されている。

式（Ｉａ）の部分が安定したブロック基として使用される場合、改変された糖類は好ましくは、安定させる効果を与える部分を１個より多く有する。例えば、改変された糖類の全てのまたは実質的に全ての単糖単位は式（Ｉａ）の基を含むブロック基を有し得る。代わりに、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の単糖単位は、式（Ｉ）の基を含むブロック基を有し得る。改変された糖類中の少なくとも、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個または３０個の単糖単位はブロック基を有し得る。

また、各単糖単位上のブロック基の数はさまざまであり得る。例えば、単糖単位上のブロック基の数は１個、２個、３個、４個、５個または６個であり得る。好ましくは１個〜４個で、さらに好ましくは１個または２個である。

好ましくは、本発明の改変された糖類は、式（Ｉ）または（Ｉａ）の部分を含み、この部分は、次いでアルデヒドに変換される。それ故に、本発明はさらに式（ＩＩ）または好ましくは式（ＩＩａ）の部分を含む改変された糖類を提供する：
−Ａ−Ｎ（Ｒ^１）−Ｌ−Ｃ（Ｏ）Ｈ （ＩＩ）
−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^１）−Ｌ−Ｃ（Ｏ）Ｈ （ＩＩａ）
ここで、Ａ、Ｒ^１およびＬは上で規定した通りである。

式（Ｉ）または（Ｉａ）のマスクされたアルデヒドを式（ＩＩ）または（ＩＩａ）に転換することは、簡単な合成段階を含む。例えば、ジオールは酸化的開裂によってアルデヒドに変換され得る（例えば、ＮａＩＯ_４、Ｐｂ（ＯＡｃ）_４など）；アルコールは酸化によって、アルデヒドに変換される（例えば、Ｓｗｅｒｎ酸化、Ｄｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎ酸化、Ｃｒ^ＶＩ酸化など）；アルケンは酸化的二重結合開裂によってアルデヒドに変換され得る（例えば、オゾン分解、続く還元的ワークアップ、Ｏ_ＳＯ_４／ＮａＩＯ_４、ＯｓＯ_４／Ｐｂ（ＯＡｃ）_４など）；アセタールは酸の加水分解によって、アルデヒドに変換され得る；チオアセタールは金属配位、アルキル化または酸化によって、アルデヒドに変換され得る（例えば、Ｈｇ^ＩＩ、Ａｇ^Ｉ、Ａｇ^ＩＩ、Ｃｕ^ＩＩ、ＭｅＩ、Ｎ−ブロモスクシンイミドなど）；カルボン酸エステル、シアノ化合物およびＷｅｉｎｒｅｂアミド類は、適切な還元によってアルデヒドに変換され得る（例えば、ＮａＢＨ_４、ＤＩＢＡＬなど）。

好ましくは、マスクされたアルデヒドＭは式−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ_２ＯＨである。このジオールは有利に、穏やかな過ヨウ素酸酸化剤を使用する場合に対応するアルデヒドに変換され得る。ＮａＩＯ_４のような過ヨウ素酸酸化剤は、莢膜糖類の他の感受性の官能基に影響せずに、選択的にアルデヒドを形成する。

それ故に、好ましい実施形態において、改変された糖類は式：−ＮＨ（ＣＨ_２）_３Ｃ（Ｏ）Ｈ、さらに好ましくは、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_３Ｃ（Ｏ）Ｈを含む。
（糖類−タンパク質結合体）
式（ＩＩ）または（ＩＩａ）の部分を含む改変された糖類は、輸送タンパク質に糖類を結合するために使用され得る。その結合は、好ましくは、式（ＩＩ）または（ＩＩａ）の部分を含む改変された糖類のアルデヒド基とタンパク質のアミノ基の還元的アミノ化を経由する。還元的アミノ化反応は、糖類とタンパク質を結合させるための確実な方法として周知である。普通、その反応は、ＮａＢＨ_３ＣＮを使うことによって行われるが、他の適した還元剤も使われ得る。

したがって、本発明は糖類−タンパク質結合体を提供し、ここで、糖類とタンパク質部分は式（ＩＶ）または好ましくは（ＩＶａ）の基によって連結される。
−Ａ−Ｎ（Ｒ^１）−Ｌ−ＮＨ− （ＩＶ）
−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^１）−Ｌ−ＮＨ− （ＩＶａ）
ここで、Ａ、Ｒ^１およびＬは上で規定した通りである。好ましくは、Ｌは本発明の結合体の−（ＣＨ_２）_４−である。好ましい実施形態として、糖類とタンパク質部分は式−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ_２）_４−ＮＨ−の基によって連結される。−ＮＨ−は一般に、タンパク質に存在するアミン基、例えばリジン残基から誘導される。

本発明のタンパク質−糖類結合体において、タンパク質は好ましくは、細菌の毒素またはトキソイド、さらに好ましくは、ジフテリアまたは破傷風の毒素またはトキソイドである。これらは一般に、結合ワクチンに使用される。ＣＲＭ₁₉₇ジフテリアトキソイドが特に好ましい［１］。他の適した輸送タンパク質としては、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外膜タンパク質［２］、合成ペプチド［３、４］、熱ショックタンパク質［５、６］、百日咳タンパク質［７、８］、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来のタンパク質Ｄ［９］、サイトカイン［１０］、リンフォカイン［１０］、ホルモン［１０］、成長因子［１０］、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の毒素ＡまたはＢ［１１］、鉄を取り込むタンパク質［１２］、などが挙げられる。輸送タンパク質の混合物を使用することが可能である。

結合後、遊離した糖類および結合した糖類は、分離され得る。疎水性クロマトグラフィー、接線（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ）限外濾過、ダイアフィルトレーション、などを含む多くの適した方法がある［参考文献１３、１４などもまた参照のこと］。

１つの輸送タンパク質は、複数の異なる糖類を運び得る［１５］。
（改変されたＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ａ糖類）
上記した全ての実施形態において、改変された莢膜糖類は、好ましくは改変されたＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ糖類である。さらに、好ましくは、改変された莢膜糖類は、改変されたＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ａ糖類である。

Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ａ糖類は次のような構造を持つ：

したがって、本発明は次の式の糖類を提供する：

ここで：
Ｔは式（Ａ）または（Ｂ）である：

ｎは１〜１００までの整数である。

各Ｚ基は−ＯＨ、−ＯＡｃ、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^１）−Ｌ−Ｍまたは−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^１）−Ｌ−Ｃ（Ｏ）Ｈから独立して選ばれる；
各Ｑ基は−ＯＨ、−ＯＡｃ、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^１）−Ｌ−Ｍまたは−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^１）−Ｌ−Ｃ（Ｏ）Ｈから独立して選ばれる；
Ｗは−ＯＨ、−ＯＡｃ、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^１）−Ｌ−Ｍまたは−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^１）−Ｌ−Ｃ（Ｏ）Ｈから選ばれる（好ましくはＷはＯＨである）；
Ｖは−Ｎ（Ｒ^１）−Ｌ−ＭまたはＮ（Ｒ^１）−Ｌ−Ｃ（Ｏ）Ｈである；
ここで、Ｒ^１、ＬおよびＭは上で規定した通りであり、また、糖類は式−Ｎ（Ｒ^１）−Ｌ−Ｍ、−Ｎ（Ｒ^１）−Ｌ−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^１）−Ｌ−Ｍまたは−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^１）−Ｌ−Ｃ（Ｏ）Ｈの少なくとも１つの部分を含む。

好ましくは、ｎは１５〜２５である。

好ましくは、Ｔは式（Ａ）である。好ましくは糖類は式−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^１）−Ｌ−ＭまたはＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^１）−Ｌ−Ｃ（Ｏ）Ｈの少なくとも１つの部分を含む。

好ましくは、ＱまたはＺ基の１つ、好ましくはＱ基の１つが−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^１）−Ｌ−Ｍまたは−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^１）−Ｌ−Ｃ（Ｏ）Ｈであることを除いて、天然のＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ａ糖類の場合と、基本的に同じ相対的割合で、ＱとＺはＯＨ基とＯＡｃ基の混合物である。
（改変された糖類を生産するための方法）
本発明はさらに次の工程を含む莢膜糖類を改変するための方法を提供する；
（ａ）ヒドロキシル基を有する莢膜糖類を提供する、工程；
（ｂ）有機溶媒中の二官能性試薬とヒドロキシル基を反応させる、工程；
（ｃ）式（ＩＩＩ）のアミノ化合物
ＨＮ（Ｒ^１）−Ｌ−Ｍ （ＩＩＩ）
と工程（ｂ）の生成物を反応させる、工程；
ここで、Ｒ^１、ＬおよびＭは上記で規定した通りであり得る。

莢膜糖類は天然の莢膜糖類（オリゴ糖または多糖）であり得る。代わりに、莢膜糖類は例えば、脱−Ｏ−アセチル化した莢膜糖類、ブロックした莢膜糖類（ＰＣＴ／ＩＢ０３／０１４３６に記載されている）または、末端のアミノ基を有する莢膜糖類（例えば、還元的アミノ化により得られる）であり得る。

「二官能性の試薬」という用語は、（ｉ）糖類のヒドロキシル基との結合のために第１の求電子性の炭素原子を提供すること；および（ｉｉ）工程（ｂ２）で使われるアミノ基との結合のために第２の求電子性の炭素原子を提供することの二重の機能を実行することができる任意の試薬を意味する。一般に、第２の求電子性の炭素原子は工程（ｂ）の間、第１の求電子性の炭素原子から再生される。二官能性の試薬は多糖類とアミノ化合物との間の−Ｃ（Ｏ）−結合を提供する。

本発明で使用される二官能性の試薬としては、１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、カルボニルジ−１，２，４トリアゾール（ＣＤＴ）、カルボニルジ−１，２，３−ベンゾトリアゾール（ＣＤＢ）、ジフェニルカルボネート、臭化シアン、ホスゲンまたはトリホスゲンが挙げられるが、これらに制限されていない。当業者は、これらと同じように機能し得る他の二官能性の試薬に気付く。ＣＤＩは、特に穏やかな試薬でＨＣｌまたはＨＢｒのような、強酸性の気体を発生することを避けられるので、好まれる。

好ましくは、有機溶媒は非プロトン性溶媒である。非プロトン性溶媒は当業者に周知であり、イオン化可能な水素原子は含まない。これらの溶媒は、ヒドロキシル基の求核性を高めることによって、二官能性の試薬と糖類のヒドロキシル基との反応を促進するので有利である。適切な非プロトン性溶媒としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ホルムアミド、ヘキサメチルホスホラミド（ＨＭＰＡ）、ヘキサメチルホスホラストリアミド（ＨＭＰＴ）、１，３−ジメチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２（１Ｈ）−ピリミジノン（ＤＭＰＵ）、またはジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）が挙げられるが、これらに制限されていない。ＤＭＳＯは好まれる。

上記の工程（ｃ）において、工程（ｂ）の後に生成した中間体カルバメート化合物は式（ＩＩＩ）のアミンと反応する。好ましくは、式（ＩＩＩ）のアミンはトリス−求核試薬Ｈ_２Ｎ（ＣＨ_２）_３ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ_２ＯＨである。

本発明の好ましい工程を、以下の図式１に例示する：

図式１において、糖類（例えば、ＭｅｎＡ多糖類またはオリゴ糖）は、ＤＭＳＯ溶媒中のＣＤＩを使用してヒドロキシル基の１つを通じて、最初に活性化される。その結果生じたイミダゾールカルバメートは、マスクされたアルデヒド官能性を有する改変された糖類に与えるために、トリス−求核試薬Ｈ_２Ｎ（ＣＨ_２）_３ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ_２ＯＨによって、トラップされる。図２はＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ａ糖類の活性化工程を示す。

あるいは、改変された糖類は、式ＸＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^１）−Ｌ−Ｍの試薬と莢膜糖類の１個以上のヒドロキシル基とを反応させることによって、１つの工程のプロセスで調製され得、ここで、Ｘは離脱基であり、Ｒ^１、ＬおよびＭは上記で規定した通りである。適切な離脱基としては、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−ＣＦ_３、−ＯＣ_６Ｈ_５または−ＣＣｌ_３が挙げられるが、これらに制限されていない。

好ましい実施形態において、さらに（ｄ）マスクされたアルデヒド基Ｍのマスクをはずすことによって、アルデヒド化合物を提供する工程；および（ｅ）還元的アミノ化反応によって、タンパク質にアルデヒド化合物を連結する工程を含む、上で規定した通りの糖類を改変するプロセスを提供する。このプロセスにおいて、マスクされたアルデヒド基Ｍは好ましくは−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ_２ＯＨであり、マスクをはずす工程は好ましくは過ヨウ素酸塩開裂であり、還元的アミノ化反応の還元剤は好ましくはＮａＢＨ_３ＣＮである。好ましい実施例は図１に示す。図１において、ＰＳは天然のＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ａ糖類から誘導した多糖類またはオリゴ糖を表す。

（薬学的組成物および方法）
本発明は、（ａ）本発明の改変された糖類、および／または本発明の結合体、ならびに（ｂ）薬学的に受容可能なキャリアーを含む薬学的組成物を提供する。結合体が存在する場合、組成物もまた遊離型のキャリアータンパク質を含み得る［１６］。

「薬学的に受容可能なキャリアー」は組成物を受容する個体に有害である抗体の産生を生じさせない任意のキャリアーを含む。適切なキャリアーは一般的に大きく、ゆっくり代謝する高分子、例えば、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合体のアミノ酸、アミノ酸の共重合体、トレハロース［１７］脂質凝集体（油滴またはリポソームのような）、および、不活性のウイルス粒子である。そのようなキャリアーは当業者に周知である。ワクチンはまた、水、生理食塩水、グリセロールなどのような希釈液を含み得る。さらに、湿潤剤、または乳化剤、ｐＨ緩衝物質のような補助物質が存在し得る。薬学的に受容可能な賦形剤の十分な考察は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、の例えば２０００版（ＩＳＢＮ：第０６８３３０６４７２号）で入手できる。

一般的に、組成物は溶液、または懸濁液のいずれかとして注射可能物として調製される；注射の前に、液体ビヒクル中の溶液または懸濁液として適切な固体形態もまた調製され得る。調製物はまた、アジュバント効果を高めるために、リポソームに乳化または被包され得る。組成物を直接送達することは、一般に非経口である（例えば、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、または組織内の間隙空間に送達する注射による）。組成物はまた、損傷に投与され得る。他の投与の様式は、経口投与および肺投与、直腸（座薬）、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）または経皮的（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）な適用［例えば、参考文献１８］、針および皮下噴射器が挙げられる。投薬治療は、単回投与または複数回投与の計画であり得る（例えば、追加抗原用量を含む）。

本発明の組成は好ましくは、無菌、緩衝化、および／または発熱物質なしである。

組成物は好ましくは、免疫原性の組成物（例えば、ワクチン）である。糖類または糖類−タンパク質結合体に基づいたワクチンは、当該分野において周知である。

免疫原性の組成物は、必要とされる場合、免疫学的に有効な量の糖類抗原および他の特定成分の任意の他のものを含む。「免疫学的に有効な量」によって、単回用量、または一連のものの部分として個体に対するその投与量が処置または予防に効果的であるということを意味する。この量は、処置されている個体の健康および体調、年齢、処置されている個体の分類学的なグループ（例えば、非ヒト霊長類、霊長類など）、抗体を合成する個体の免疫系の能力、望ましい予防の程度、ワクチンの処方、医療状況の処置する医師の評価、および他の関連した要因によって変わる。その量は慣用的な試用を通じて決定され得る比較的幅広い範囲になると予期される。投薬処置は単回用量の計画、または、複数回用量の計画（例えば、追加抗原用量を含む）である。そのワクチンは、他の免疫調節剤とともに投与され得る。

免疫原性の組成物はアジュバントを含み得る。組成物の有効性を高めるための好ましいアジュバントとしては、次の（Ａ）〜（Ｚ）が挙げられるが、これらに制限されていない：（Ａ）アルミニウム化合物（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、ヒドロキシリン酸アルミニウム、オキシヒドロキシド、オルトリン酸塩、硫酸塩など［例えば参考文献１９の８章と９章を参照のこと］）、または異なるアルミニウム化合物の混合物（任意の適切な形態をとる化合物（例えば、ゲル、結晶、非結晶性など）および、吸着が好まれる）；（Ｂ）ＭＦ５９（マイクロフリューダイザを使用してサブミクロン粒子に処方された５％Ｓｑｕａｌｅｎ、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０、および０．５％Ｓｐａｎ８５）［参考文献１９の１０章を参照のこと；参考文献２０もまた参照のこと］；（Ｃ）リポソーム［参考文献１９の１３章および１４章を参照のこと］；（Ｄ）添加された界面活性剤［２１］を欠くＩＳＣＯＭｓ［参考文献１９の２３章を参照のこと］（Ｅ）サブミクロンのエマルジョンに微流動化されるか、または大きな粒子サイズのエマルジョンを発生させるためにボルテックスされて、１０％Ｓｑｕａｌｅｎ、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロニック−ブロックポリマーＬ１２１、および、ｔｈｒ−ＭＤＰを含むＳＡＦ［参考文献１９の１２章を参照のこと］；（Ｆ）２％Ｓｑｕａｌｅｎ、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、（ＲｉｂｉＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍ）、およびモノホスホリリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる１個以上の細菌の細胞壁成分、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ^ＴＭ）を含むＲｉｂｉ^ＴＭアジュバントシステム（ＲＡＳ）；（Ｇ）ＱｕｉｌＡまたはＱＳ２１［参考文献１９の２２章を参照のこと］、また、Ｓｔｉｍｕｌｏｎ^ＴＭとして知られているようなサポニンアジュバント；（Ｈ）キトサン［例えば、２２］；（Ｉ）完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；（Ｊ）インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２など）、インターフェロン（例えば、インターフェロン−γ）、マクロファージコロニー刺激因子、腫瘍壊死因子などのようなサイトカイン［参考文献１９の２７章および２８章を参照のこと］；（Ｋ）生分解性および毒性のない物質（例えば、ポリ（α−ヒドロキシル酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトンなど）から形成される微粒子（すなわち、直径約１００ｎｍ〜約１５０μｍ、さらに好ましくは直径約２００ｎｍ〜約３０μｍ、最も好ましくは約５００ｎｍ〜約１０μｍ）；（Ｌ）モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）または３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）［例えば、参考文献１９の２１章］；（Ｍ）例えば、ＱＳ２１および／または水中油エマルジョンと３ｄＭＰＬの組み合わせ［２３］；（Ｎ）ＣｐＧモチーフ［２４］すなわち、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチドを含んでいる、５−メチルシトシンがシトシンの代わりに必要に応じて使用される、オリゴヌクレオチド；（Ｏ）ポリオキシエチレンエーテル、またはポリオキシエチレンエステル［２５］；（Ｐ）オクトキシノールと組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤［２６］、あるいは少なくとも１つのさらなるオクトキシノールのような非イオン性の界面活性剤と組み合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテル界面活性剤、またはエステル界面活性剤［２７］；（Ｑ）免疫賦活性のオリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）とサポニン［２８］；（Ｒ）免疫賦活剤と金属塩の粒子［２９］；（Ｓ）サポニンおよび水中油エマルジョン［３０］；（Ｔ）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（必要に応じて＋ステロール）［３１］；（Ｕ）熱に不安定なＥ．ｃｏｌｉエンテロトキシン（「ＬＴ」）、あるいはＫ６３またはＲ７２変異体のような毒性を除いたその変異体［例えば、参考文献３２の５章］；（Ｖ）コレラ毒素（「ＣＴ」）、または毒性を除いたその変異体［例えば、参考文献３２の５章］；（Ｗ）二本鎖ＲＮＡ；（Ｘ）アミノアルキルグルコサミニドホスフェイト誘導体、例えばＲＣ−５２９［３３］のようなモノホスホリルリピドＡ模倣物；（Ｙ）ポリホスファゼン（ＰＣＰＰ）；あるいは（Ｚ）エステル化されたヒアルロン酸ミクロフィア［３５］のような生物付着剤［３４］、またはポリ（アクリル酸）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖および、カルボキシメチルセルロースの架橋結合した誘導体からなる群から選ばれた粘膜付着剤。組成物の有効性を高めるための免疫賦活性の薬剤として作用する他の物質［例えば、参考文献１９の７章を参照のこと］もまた使用され得る。アルミニウム塩（特にリン酸アルミニウムおよび／または水酸化アルミニウム）は非経口の免疫化のアジュバントに好まれる。変異毒素は粘膜のアジュバントとして好まれる。

ムラミルペプチドは、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリロキシ）−エチルアミンＭＴＰ−ＰＥ）などを含む。

一旦、処方されると、本発明の組成物は被験体に直接投与され得る。処置される被験体は動物であり得る；特に人間の被験体が処置される。ワクチンは特に子供および十代の若者のワクチン接種に有効である。

本発明によるワクチンは予防薬（すなわち感染症を予防すること）または治療薬（すなわち感染症後に処置をすることのいずれか）であるが、しかし一般的には予防薬である。

改変された糖類と同様に、組成物はさらに抗原性の成分を含み得る。例えば、組成物は１個以上のさらなる糖類を含み得る（本発明により改変された糖であろうとなかろうと）。例えば、組成物はＮ．Ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清型Ｃ、Ｗ１３５およびＹ由来の糖類を含み得る（例えば、改変されたＭｅｎＡ糖類に加えて）。これらは一般に輸送タンパク質と結合し得、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの異なる血清型由来の糖類は、同じまたは異なる輸送タンパク質と結合し得る。混合物が血清型ＡとＣの両方由来の莢膜糖類を含む場合、ＭｅｎＣ糖類に対するＭｅｎＡ糖類の割合（ｗ／ｗ）は１より大きい（例．２：１、３：１、４：１、５：１、１０：１またはそれ以上）。ＭｅｎＡ成分の改良された免疫原性は、ＭｅｎＣ成分に対して過剰（塊／投与量）に存在する場合に認められる。

組成物はまた、タンパク質抗原を含み得る。

本発明の組成物に含まれ得る抗原は、次のものを含む：
−ＣａｇＡ［３６〜３９］、ＶａｃＡ［４０、４１］、ＮＡＰ［４２、４３、４４］、ＨｏｐＸ［例えば、４５］、ＨｏｐＹ［例えば、４５］および／またはウレアーゼのようなＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ由来の抗原。
−タンパク質‘２８７’（以下参照）および、特に好まれる誘導体（例えば、‘ΔＧ２８７’）と、参考文献４６〜５２のようなＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ由来のタンパク質抗原。
−参考文献５３、５４、５５、５６などに開示されているようなＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ由来の外膜小胞（ＯＭＶ）調製物。
−血清型Ｃ由来の参考文献５７に開示されているオリゴ糖［参考文献５８もまた参照のこと］のようなＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｃ由来の糖類抗原。
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ［例えば、５９、６０、６１］由来の糖類抗原。
−不活化されたウイルス［例えば、６２、６３］のようなＡ型肝炎ウイルス由来の抗原。
−表面および／または核抗原［例えば、６３、６４］のようなＢ型肝炎ウイルス由来の抗原。
−Ｃ型肝炎ウイルス［例えば、６５］由来の抗原。
−百日咳ホロトキシン（ＰＴ）のようなＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の抗原、およびＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、随意的にペルタクチンおよび／または凝集原２および３［例えば、参考文献６６および６７］との組合わせ由来の糸状赤血球凝集素（ＦＨＡ）。
−ジフテリアトキソイド［例えば、参考文献６８の３章］例えば、ＣＲＭ_１９７変異体［例えば、６９］のようなジフテリア抗原。
−破傷風トキソイド［例えば、参考文献６８の４章］のような破傷風抗原。
−Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅＢ［例えば、５８］由来の糖類抗原。
−Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ［例えば、４６、４７、４８］由来の抗原。
−Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ［例えば、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６］由来の抗原。
−Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ［例えば、７７］由来の抗原。
−Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ［例えば、７８］由来の抗原。
−ＩＰＶまたはＯＰＶのようなポリオ抗原［例えば、７９、８０］
−凍結乾燥した不活化されたウイルス［例えば、８２、ＲａｂＡｖｅｒｔ^ＴＭ］のような狂犬病抗原［例えば、８１］。
−はしか、おたふく風邪、および／または風疹の抗原［例えば、参考文献６８の９章、１０章および１１章］。
−赤血球凝集素および／またはノイラミニダーゼ表面タンパク質のようなインフルエンザ抗原［例えば、参考文献６８の１９章］。
−Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ［例えば、８３］由来の抗原。
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｂ群連鎖球菌）［例えば、８４、８５］由来の抗原。
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｂ群連鎖球菌）由来の糖類抗原。
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ａ群連鎖球菌）［例えば、８５、８６、８７］由来の抗原。
−Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ［例えば、８８］由来の抗原。
−Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ［例えば、８９、９０、９１］由来の抗原。
−黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、デング熱ウイルスの４つの血清型、ダニ媒介脳炎ウイルス、西ナイル熱ウイルスのようなフラビウイルス科（フラビウイルス属）のウイルス由来の抗原。
−古典的なブタ熱ウイルス、牛ウイルス性下痢ウイルス、および／またはボーダー病ウイルス由来のようなペスチウイルス抗原
−例えばパルボウイルスＢ１９由来のパルボウイルス抗原
−プリオンタンパク質（例えば、ＣＪＤプリオンタンパク質）
−βペプチド［９２］のようなアミロイドタンパク質
−参考文献９３の表１または参考文献９４の表３および表４に記載されているような癌抗原。

組成物はこれらの１つ以上の抗原をさらに含み得る。

有毒なタンパク質抗原は必要な場合には、解毒される（例えば、化学的およびまたは遺伝的な方法［６７］による百日咳の解毒）。

ジフテリア抗原が組成物に含まれる場合、破傷風抗原および百日咳抗原を含むことも好ましい。同様に、破傷風抗原が含まれる場合、ジフテリア抗原および百日咳抗原を含むことも好ましい。同様に、百日咳抗原が含まれる場合、ジフテリア抗原および破傷風抗原を含むことも好ましい。

抗原は好ましくは、アルミニウム塩に吸着される。

組成物の中に抗原は、代表的にはそれぞれ少なくとも、１μｇ／ｍｌの濃度で存在する。

通常、任意の与えられた抗原の濃度は、その抗原に対して免疫反応を誘発するには十分である。

本発明の組成物の中でタンパク質抗原を使用する代わりとして、この抗原をコードしている核酸が使用され得る［例えば、参考文献９５〜１０３］。本発明の組成物のタンパク質成分は、このようにしてタンパク質をコードした核酸（好ましくはＤＮＡ、例えばプラスミドの形態で）によって、取って代わられ得る。

本発明はまた、本発明の薬学的組成物を哺乳類に投与することを含む、哺乳類の抗体反応を上昇させるための方法を提供する。哺乳類は好ましくはヒトである。ヒトは成人または、好ましくは子供であり得る。抗体反応は好ましくは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ａによる感染を保護する。

本発明はまた、本発明の薬学的組成物を哺乳類に投与することを含む、哺乳類に免疫性を与えるための方法を提供する。

本発明はまた、医薬に使用する目的として、本発明の改変された糖類、または本発明の結合体を提供する。

本発明はまた、莢膜細菌によって引き起こされた疾患の予防または処置のための医薬品の製造における、本発明の改変された糖類、および本発明の結合体の使用を提供する。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａによって引き起こされる疾患は、髄膜炎、敗血症、および淋病を含む。Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅによって引き起こされる疾患は、中耳炎、気管支炎、肺炎、フレグモーネ、心膜炎、および髄膜炎を含む。肺炎球菌によって引き起こされる疾患は、髄膜炎、敗血症、肺炎を含む。細菌の髄膜炎の予防および／または処置はこのように好まれる。
（本発明を実行するための方法）
比較免疫原性研究
本発明は糖類とタンパク質の間の改良したタイプの結合を提供する。加えて、本発明による糖類−タンパク質結合体は、他のタイプの糖類−タンパク質結合体と比較して改良した免疫原性を有することが発見された。

比較の目的のために、代わりの結合を有する糖類−タンパク質結合体を調製した。改変されたＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ａ多糖類を、糖類の水酸基のＣＤＩ活性化に続くＮＨ_２−（ＣＨ_２）_５−ＣＯ_２ＨでのＣＤＩカルバメート中間体のクエンチによって調製した。この改変された多糖類を、ＣＲＭ_１９７とカルボキシル基のＥＤＡＣ活性化カップリングにより、糖−タンパク質結合体を調製するために使用した。したがって、多糖類とＣＲＭ_１９７をリンカー基−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ_２）_５−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−を通して結合した。この比較研究のために、糖類−タンパク質結合体の調製方法を「カルボジイミド法」と呼ぶ。

カルボジイミド法により調製された糖類−タンパク質結合体を、本発明による糖類−タンパク質結合体と比較した。したがって、改変されたＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ａ多糖類を、多糖類の水酸基のＣＤＩ活性化、続くトリス−求核ＮＨ_２−（ＣＨ_２）_３−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ_２ＯＨでのＣＤＩカルバメート中間体のクエンチにより調製した。アルデヒドをさらすための過ヨウ素酸塩開裂に続いて、改変された多糖類を還元的アミノ化（図１に示されているように）によりＣＲＭ_１９７に結合した。したがって、多糖類とＣＲＭ_１９７をリンカー基−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ_２）_４−ＮＨ−を通して結合した。この比較研究のために、糖類−タンパク質結合体のこの調製方法を、「還元的アミノ化法」と呼ぶ。

カルボジイミド法および還元的アミノ化法（２つの異なる割合で）により調製された結合体の免疫原性を、Ｂａｌｂ／ｃマウスで決定した。結合体は１用量につき２μｇ（糖類の塊として現された）を２用量（０および１４日）投与した。２５日に血液が採られ、ＩｇＧ力価（ＧＭＴ）を決定した。加えて、ＭｅｎＡ菌株Ｆ８２３８に対する血清殺菌性抗体（ＳＢＡ）力価を評価した。比較のために、本発明のオリゴ糖結合体および結合されていない多糖類もまた試験した。

結果を図３に示す。オリゴ糖結合体（Ｃ）は最も良いＧＭＴ値および１０２４のＳＢＡ力価を与えた。対照的に、何も手を加えていない多糖類（Ｅ）は悪いＧＭＴ力価（生理食塩水コントロールに匹敵する）および悪いＳＢＡ力価（４より小さい）を与えた。カルボジイミド法（Ｄ）を使用してＣＲＭ_１９７に結合させた場合、両方の力価は増加した（ＳＢＡ：１２８）。還元的アミノ化法（ＡとＢ）を使用してＣＲＭ１９７に結合させた場合、ＧＭＴおよびＳＢＡ力価は増加した（ＳＢＡ：５１２と１０２４の間）。還元的アミノ化を使用して調製した結合体で達成されるＳＢＡ力価は、結合したオリゴ糖の力価と一致した。

モルモットモデルを使用した比較のＥＬＩＳＡ計画はＢａｌｂ／Ｃマウスで得られた結果を確証させた。

本発明は単なる例として上で記載し、本発明の範囲および精神のままで改変がなされ得ることが理解される。

図１はＣＤＩ活性化した糖類由来の糖−タンパク質結合体の合成を示す。 図２はＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ａ糖類の水酸基とＣＤＩとの反応を示す。 図３は比較免疫原性研究の結果を示す。グラフは５つの異なる糖類免疫原（Ａ）〜（Ｅ）についてのＧＭＴ値を示し、表は血清型Ａ菌株Ｆ８２３８に対する血清殺菌力価を示す。

Claims (38)

1. 莢膜糖類であって、該莢膜糖類は式（Ｉ）：
   −Ａ−Ｎ（Ｒ^１）−Ｌ−Ｍ （Ｉ）
   の部分を該莢膜糖類のヒドロキシル基のうちの１つにおいて含み、ここで：
   Ａは結合、−Ｃ（Ｏ）−または−ＯＣ（Ｏ）−であり、
   Ｒ^１はＨまたはＣ_１〜Ｃ_６アルキルから選ばれ；
   ＬはＣ_１〜Ｃ_１２アルキレン基であり；
   Ｍはマスクされたアルデヒド基であり、該マスクされたアルデヒドが以下：
   

   

   から選択され、ここで：
   Ｒ^２はＨ、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、Ｃ_３〜Ｃ_１２シクロアルキル、Ｃ_５〜Ｃ_１２アリールまたは、Ｃ_５〜１２アリール−Ｃ_１〜６アルキルから選択され；
   ＸおよびＹは同じまたは異なっていて、ＯまたはＳから独立して選択され；
   Ｒ^３およびＲ^４はＣ_１〜Ｃ_１２アルキル、Ｃ_３〜Ｃ_１２シクロアルキル、Ｃ_５〜Ｃ_１２アリールまたはＣ_５〜１２アリール−Ｃ_１〜６アルキルから独立して選択されるか；あるいはＲ^３およびＲ^４はヘテロ原子ＸおよびＹを含むＣ_３、Ｃ_４、Ｃ_５、Ｃ_６、Ｃ_７またはＣ_８シクロアルキル環を形成するように結合され；
   Ｒ^５およびＲ^６はＨ、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、Ｃ_３〜Ｃ_１２シクロアルキル、Ｃ_５〜Ｃ_１２アリールまたはＣ_５〜１２アリール−Ｃ_１〜６アルキルから独立して選択されるか；あるいはＲ^５およびＲ^６はＣ_３またはＣ_１２シクロアルキル環を形成するよう結合され；
   Ｒ^９およびＲ^１０はＨ、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、Ｃ_３〜Ｃ_１２シクロアルキル、Ｃ_５〜Ｃ_１２アリールまたはＣ_５〜１２アリール−Ｃ_１〜６アルキルから独立して選択されるか；あるいはＲ^９およびＲ^１０はＣ_３〜Ｃ_１２シクロアルキル環を形成するように結合され；そして、
   Ｒ^７およびＲ^８はＣ_１〜Ｃ_１２アルキル基またはＣ_３〜Ｃ_１２シクロアルキル基から独立して選択される、
   莢膜糖類。
2. 請求項１に記載の莢膜糖類であって、Ａが−ＯＣ（Ｏ）−である、莢膜糖類。
3. 請求項１または２に記載の莢膜糖類であって、Ｒ^１がＨである、莢膜糖類。
4. 請求項１〜３のいずれか１項に記載の莢膜糖類であって、ＬがＣ_１〜Ｃ_６アルキレン基である、莢膜糖類。
5. 請求項４に記載の莢膜糖類であって、Ｌが−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−である、莢膜糖類。
6. 請求項１に記載の莢膜糖類であって、前記マスクされたアルデヒドが−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ_２ＯＨである、莢膜糖類。
7. 請求項１または請求項３〜６のいずれか１項に記載の莢膜糖類であって、式：−ＮＨ（ＣＨ_２）_３ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ_２ＯＨの部分を含む、莢膜糖類。
8. 請求項１〜６のいずれか１項に記載の莢膜糖類であって、式：−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_３ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ_２ＯＨの部分を含む、莢膜糖類。
9. 莢膜糖類であって、式（ＩＩ）：
   −Ａ−Ｎ（Ｒ^１）−Ｌ−Ｃ（Ｏ）Ｈ （ＩＩ）
   の部分を該莢膜糖類のヒドロキシル基のうちの１つにおいて含み、ここで、Ａ、Ｒ^１およびＬは請求項１〜５のいずれか１項に規定した通りである、
   莢膜糖類。
10. 請求項９に記載の莢膜糖類であって、Ａが−ＯＣ（Ｏ）−である、莢膜糖類。
11. 請求項９に記載の莢膜糖類であって、式：−ＮＨ（ＣＨ_２）_３Ｃ（Ｏ）Ｈの部分を含む、莢膜糖類。
12. 請求項９または１０に記載の莢膜糖類であって、式：−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_３Ｃ（Ｏ）Ｈの部分を含む、莢膜糖類。
13. 請求項１〜１２のいずれか１項に記載の莢膜糖類であって、該莢膜糖類が、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清型Ａ莢膜糖類である、莢膜糖類。
14. 以下の式：
    

    

    の莢膜糖類であって、ここで：
    Ｔは式（Ａ）または（Ｂ）：
    

    

    ｎは１〜１００までの整数であり；
    各Ｚ基は−ＯＨ、−ＯＡｃ、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^１）−Ｌ−Ｍまたは−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^１）−Ｌ−Ｃ（Ｏ）Ｈから独立して選択され；
    各Ｑ基は−ＯＨ、−ＯＡｃ、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^１）−Ｌ−Ｍまたは−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^１）−Ｌ−Ｃ（Ｏ）Ｈから独立して選択され；
    Ｗは−ＯＨ、−ＯＡｃ、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^１）−Ｌ−Ｍまたは−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^１）−Ｌ−Ｃ（Ｏ）Ｈから選択され；
    Ｖは−Ｎ（Ｒ^１）−Ｌ−Ｍまたは−Ｎ（Ｒ^１）−Ｌ−Ｃ（Ｏ）Ｈであり；
    ここで、Ｒ^１、ＬおよびＭは請求項１〜６のいずれか１項で規定した通りであり、式−Ｎ（Ｒ^１）−Ｌ−Ｍ、−Ｎ（Ｒ^１）−Ｌ−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^１）−Ｌ−Ｍまたは−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^１）−Ｌ−Ｃ（Ｏ）Ｈの部分を少なくとも１つ含む、莢膜糖類。
15. 請求項１４に記載の莢膜糖類であって、ｎが１５〜２５までの整数である、莢膜糖類。
16. 請求項１４または１５に記載の莢膜糖類であって、Ｔが式（Ａ）である、莢膜糖類。
17. 請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の莢膜糖類であって、Ｑ基またはＺ基の１つが−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^１）−Ｌ−Ｍまたは−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^１）−Ｌ−Ｃ（Ｏ）Ｈであることを除いて、天然の髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清型Ａ莢膜糖類の場合と、基本的に同じ相対的割合で、ＱおよびＺはＯＨ基とＯＡｃ基の混合物である、莢膜糖類。
18. 請求項１７に記載の莢膜糖類であって、Ｑ基の１つが−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^１）−Ｌ−Ｍまたは−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^１）−Ｌ−Ｃ（Ｏ）Ｈである、莢膜糖類。
19. 莢膜糖類を結合体にするための方法であって、該方法が、以下：
    （ａ）ヒドロキシル基を有する莢膜糖類を提供する、工程；
    （ｂ）有機溶媒中の二官能性試薬と該ヒドロキシル基を反応させる、工程；
    （ｃ）式（ＩＩＩ）のアミノ化合物
    ＨＮ（Ｒ^１）−Ｌ−Ｍ （ＩＩＩ）
    と工程（ｂ）の生成物を反応させる、工程であって、
    ここで、Ｒ^１、ＬおよびＭは請求項１〜６のいずれか１項に規定した通りである、工程、を含み、
    該二官能性の試薬が、１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、カルボニルジ−１，２，４−トリアゾール（ＣＤＴ）、カルボニルジ−１，２，３−ベンゾトリアゾール（ＣＤＢ）、ジフェニルカルボネート、臭化シアン、ホスゲンまたはトリホスゲンから選択され、
    該有機溶媒が非プロトン性溶媒である、
    方法。
20. 請求項１９に記載の方法であって、前記莢膜糖類が髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清型Ａ莢膜糖類である、方法。
21. 前記非プロトン性溶媒が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ホルムアミド、ヘキサメチルホスホラミド（ＨＭＰＡ）、ヘキサメチルホスホラストリアミド（ＨＭＰＴ）、１，３−ジメチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２（１Ｈ）−ピリミジノン（ＤＭＰＵ）、またはジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）から選択される、請求項１９または２０に記載の方法。
22. 請求項２１に記載の方法であって、前記非プロトン性溶媒がＤＭＳＯである、方法。
23. 請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の方法であって、前記二官能性の試薬が、ＣＤＩである、方法。
24. 請求項１９〜２３のいずれか１項に記載の方法であって、工程（ｃ）のアミノ化合物が、Ｈ_２Ｎ（ＣＨ_２）_３ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ_２ＯＨである、方法。
25. 請求項１９〜２４のいずれか１項に記載の方法であって、（ｄ）マスクされたアルデヒド基Ｍのマスクをはずすことによって、アルデヒド化合物を提供する工程をさらに含む、方法。
26. 請求項２５に記載の方法であって、マスクされたアルデヒド基Ｍが、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ_２ＯＨであり、マスクをはずす工程が過ヨウ素酸塩開裂である、方法。
27. 請求項２５または２６に記載の方法であって、（ｅ）還元的アミノ化反応によって、タンパク質にアルデヒド化合物を連結する工程をさらに含む、方法。
28. 請求項２７に記載の方法であって、還元的アミノ化反応の還元剤が、ＮａＢＨ_３ＣＮである、方法。
29. 髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清型Ａ莢膜糖類を結合体にする方法であって、該方法は以下：
    （ａ）髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清型Ａ莢膜糖類を提供する、工程；
    （ｂ）ＤＭＳＯ溶媒中で、ＣＤＩと該莢膜糖類のヒドロキシル基を反応させる、工程；
    （ｃ）Ｈ_２Ｎ（ＣＨ_２）_３ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ_２ＯＨと工程（ｂ）の生成物を反応させる、工程；
    （ｄ）過ヨウ素酸塩を用いて、工程（ｃ）の生成物を開裂して、アルデヒド化合物を提供する、工程；および、
    （ｅ）ＮａＢＨ_３ＣＮを使用する還元的アミノ化によって、タンパク質に工程（ｄ）のアルデヒド化合物を連結させる、工程
    を含む、方法。
30. 莢膜糖類−タンパク質結合体であって、該莢膜糖類およびタンパク質部分が式（ＩＶ）：
    −Ａ−Ｎ（Ｒ^１）−Ｌ−ＮＨ− （ＩＶ）
    の基を通して連結され、ここで、Ａ、Ｒ^１およびＬは請求項１〜４のいずれか１項に規定した通りである、
    莢膜糖類−タンパク質結合体。
31. 請求項３０に記載の莢膜糖類−タンパク質結合体であって、Ｒ^１がＨであり、Ａが−ＯＣ（Ｏ）−であり、Ｌが−（ＣＨ_２）_４−である、莢膜糖類−タンパク質結合体。
32. 請求項３０または３１に記載されている結合体であって、前記莢膜糖類が髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清型Ａ莢膜糖類である、結合体。
33. 請求項２７〜２９のいずれか１項に記載の方法であって、前記タンパク質が、細菌の毒素またはトキソイドである、方法。
34. 請求項３３に記載の方法であって、前記細菌の毒素またはトキソイドが、ジフテリア毒素またはトキソイドである、方法。
35. 請求項３３に記載の方法であって、前記細菌の毒素またはトキソイドが、ＣＲＭ_１９７である、方法。
36. 請求項３０〜３２のいずれか１項に記載の結合体であって、前記タンパク質が、細菌の毒素またはトキソイドである、結合体。
37. 請求項３６に記載の結合体であって、前記細菌の毒素またはトキソイドが、ジフテリア毒素またはトキソイドである、結合体。
38. 請求項３６に記載の結合体であって、前記細菌の毒素またはトキソイドが、ＣＲＭ_１９７である、結合体。

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