ES2260682T3 - Sacaridos modificados, sus conjugados y su produccion. - Google Patents

Sacaridos modificados, sus conjugados y su produccion.

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ES2260682T3
ES2260682T3 ES03791149T ES03791149T ES2260682T3 ES 2260682 T3 ES2260682 T3 ES 2260682T3 ES 03791149 T ES03791149 T ES 03791149T ES 03791149 T ES03791149 T ES 03791149T ES 2260682 T3 ES2260682 T3 ES 2260682T3
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Aldo Giannozzi
Giovanni Averani
Francesco Norelli
Paolo Costantino
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Abstract

Un sacárido capsular modificado que comprende un resto de la fórmula (I): -A-N(R1)-L-M (I) en la que: A es un enlace, C(O)-o 0C(O)y; R1 está seleccionado entre H o alquilo de C1-C6; L es un grupo alquileno de C1-C12; M es un grupo aldehído enmascarado.

Description

Sacáridos modificados, sus conjugados y su producción.
Ámbito técnico
La invención pertenece al campo de la química de sacáridos y se refiere a sacáridos modificados, procedimientos para su preparación, y derivados conjugados. En particular, se refiere a sacáridos modificados que tienen un resto ligador, que puede usarse para ligar el sacárido a una proteína.
Fundamentos de la técnica
Los polisacáridos son moléculas biológicas importantes y han sido ampliamente usadas en la industria farmacéutica para la prevención y tratamiento de enfermedades. Por ejemplo, los polisacáridos capsulares han sido usados durante muchos años en vacunas contra bacterias capsuladas, tales como meningococos (Neisseria meningitidis), neumococos (Streptococcus pneumoniae) y Hib (Haemophilus influenzae, tipo B).
Para potenciar la inmunogenicidad de estos polisacáridos, particularmente en niños, se desarrollaron vacunas conjugadas. Estas comprenden un polisacárido capsular conjugado con una proteína portadora (p. ej., Patentes de EE.U.U. 4.711.779, 4.761.283 y 4.882.317). La molécula conjugada puede tener el polisacárido y la proteína ligadas directamente o el polisacárido y la proteína pueden estar ligadas mediante un resto ligador.
Aunque se han desarrollado tipos diferentes de restos ligadores, existe una necesidad de tipos nuevos de ligadores que sean versátiles y que puedan acoplarse al polisacárido y la proteína usando química segura, simple. Existe una necesidad adicional de nuevos ligadores que sean no tóxicos y que puedan formarse bajo condiciones suaves, evitando el uso de reactivos severos, tales como ácidos y bases fuertes.
Descripción de la invención Sacáridos modificados de la invención
La invención proporciona un sacárido capsular modificado que comprende un resto de la fórmula (I):
(I)-A-N(R^{1})-L-M
en la que:
A es un enlace, -C(O)- o -OC(O)-;
R^{1} está seleccionado entre H o alquilo de C_{1}-C_{6};
L es un grupo alquileno de C_{1}-C_{12};
M es un grupo aldehído enmascarado.
El término "sacárido capsular modificado" significa un sacárido que es obtenible a partir de un sacárido capsular nativo mediante adecuada modificación. De acuerdo con ello, la secuencia básica de unidades monosacáridas de repetición en el sacárido capsular nativo está retenida en los sacáridos capsulares modificados de la presente invención.
El término "sacárido" abarca oligosacáridos (p. ej., que contienen desde 2 hasta 39 unidades monosacáridas) y polisacáridos (p. ej., que contienen 40 o más unidades monosacáridos). Tal como se encuentran de manera natural en bacterias, los sacáridos capsulares nativos adoptan generalmente la forma de polisacáridos. Los polisacáridos pueden ser manipulados para proporcionar oligosacáridos más cortos. Los oligosacáridos pueden obtenerse mediante purificación y/o dimensionado del polisacárido nativo (p. ej., mediante hidrólisis en ácido suave, mediante calentamiento, mediante cromatografía de tamaños, etc.).
Típicamente, los sacáridos modificados de la presente invención son oligosacáridos. Los oligosacáridos pueden obtenerse a partir de polisacáridos mediante cualquiera de los procedimientos de dimensionado descritos más adelante.
Los sacáridos capsulares modificados de esta invención son obtenibles a partir de sacáridos capsulares nativos. No obstante, la presente invención no está limitada a sacáridos modificados obtenidos a partir de sacáridos capsulares nativos. Los sacáridos capsulares modificados de la presente invención pueden obtenerse mediante otros procedimientos, tal como síntesis total o parcial.
En los sacáridos capsulares modificados de la presente invención, el resto de fórmula (I) puede derivar de un grupo hidroxilo no-terminal de un sacárido capsular o de un grupo hidroxilo anómero terminal de un sacárido capsular.
Cuando el resto de fórmula (I) deriva de un grupo hidroxilo anómero, este preferiblemente reemplaza el grupo hidroxilo anómero, por ejemplo, por una reacción de aminación reductiva. Las reacciones de aminación reductivas sobre grupos hidroxilos sacáridos terminales son bien conocidas en la técnica.
Cuando el resto de fórmula (I) deriva de un grupo hidroxilo no-terminal, este está preferiblemente ligado al grupo hidroxilo no-terminal mediante, por ejemplo, un grupo carbamato. De acuerdo con ello, en una realización preferida, el sacárido capsular modificado de la presente invención comprende un resto de la fórmula (Ia):
(Ia)-OC(O)N(R^{1})-L-M
en la que R^{1}, L y M son tal como se han definido anteriormente.
Dichos compuestos pueden prepararse mediante derivación de un grupo hidroxilo libre sobre un sacárido, por ejemplo, con CDl y, a continuación, haciendo reaccionar el compuesto intermedio carbamato con una amina de fórmula:
HN(R^{1})-L-M.
Preferiblemente, R^{1} es H. Preferiblemente, L es un grupo alquileno de C_{1}-C_{6}. Más preferiblemente, L es -CH_{2}CH_{2}
CH_{2}-. El grupo L actúa como un espaciador cuando el resto de la fórmula (I) se usa para ligar un sacárido capsular a una proteína en un conjugado sacárido-proteína. Se ha encontrado que un grupo espaciador entre el sacárido y la proteína mejora la estabilidad del conjugado.
La persona experta sabe de muchas funcionalidades diferentes que pueden fácilmente convertirse en un grupo aldehído. Cualquiera de dichas funcionalidades sería adecuada como el grupo aldehído enmascarado M. Preferiblemente, el grupo aldehído enmascarado M está seleccionado entre:
1
2
en la que:
R^{2} está seleccionado entre H, alquilo de C_{1}-C_{12}, cicloalquilo de C_{3}-C_{12}, arilo de C_{5}-C_{12} o arilo de C_{5-12}- alquilo de C_{1-6} (preferiblemente R^{2} no es H);
X e Y son el mismo o diferentes y están independientemente seleccionados entre O o S;
R^{3} y R^{4} están independientemente seleccionados entre alquilo de C_{1}-C_{12}, cicloalquilo de C_{3}-C_{12}, arilo de C_{5}-C_{12} o arilo de C_{5-12}- alquilo de C_{1-6}; o R^{3} y R^{4} están unidos para formar un anillo cicloalquilo de C_{3}, C_{4}, C_{5}, C_{6}, C_{7} o C_{8} que contiene los heteroátomos X e Y;
R^{5} y R^{6} están independientemente seleccionados entre H, alquilo de C_{1}-C_{12}, cicloalquilo de C_{3}-C_{12}, arilo de C_{5}-C_{12} o arilo de C_{5-12}- alquilo de C_{1-6}; o R^{5} y R^{6} están unidos para formar un anillo cicloalquilo de C_{3} o C_{12};
R^{9} y R^{10} están independientemente seleccionados entre H, alquilo de C_{1}-C_{12}, cicloalquilo de C_{3}-C_{12}, arilo de C_{5}-C_{12} o arilo de C_{5-12}- alquilo de C_{1-6}; o R^{9} y R^{10} están unidos para formar un anillo cicloalquilo de C_{3}-C_{12}; y
R^{7} y R^{8} están independientemente seleccionados entre grupos alquilo de C_{1}-C_{12} o cicloalquilo de C_{3}-C_{12}.
El término "alquilo" se usa aquí para referirse a grupos alquilo en formas recta y ramificada. El grupo alquilo puede estar interrumpido con 1, 2 ó 3 heteroátomos seleccionados entre -O-, -NH- o -S-. Igualmente, el grupo alquilo puede estar interrumpido con 1, 2 ó 3 enlaces dobles y/o triples. Sin embargo, el término "alquilo", usualmente, se refiere a grupos alquilo que no tienen interrupciones de heteroátomos o interrupciones de enlaces dobles o triples. Cuando se hace referencia a alquilo de C_{1-12}, se entiende que el grupo alquilo puede contener cualquier número de átomos de carbono entre 1 y 12 (p. ej, C_{1}, C_{2}, C_{3}, C_{4}, C_{5}, C_{6}, C_{7}, C_{8}, C_{9,} C_{10}, C_{11}, C_{12}). De manera similar, cuando se hace referencia a alquilo de C_{1-6}, se entiende que el grupo alquilo puede contener cualquier número de átomos de carbono entre 1 y 6 (p. ej, C_{1}, C_{2}, C_{3}, C_{4}, C_{5}, C_{6}).
El término "alquileno" se usa aquí para referirse a grupos alquileno en formas recta y ramificada. El grupo alquileno puede estar interrumpido con 1, 2 ó 3 heteroátomos seleccionados entre -O-, -NH- o -S-. Igualmente, el grupo alquileno puede estar interrumpido con 1, 2 ó 3 enlaces dobles y/o triples. Sin embargo, el término "alquileno", usualmente, se refiere a grupos alquileno que no tienen interrupciones de heteroátomos o interrupciones de enlaces dobles o triples. Cuando se hace referencia a alquileno de C_{1-12}, se entiende que el grupo alquileno puede contener cualquier número de átomos de carbono entre 1 y 12 (p. ej, C_{1}, C_{2}, C_{3}, C_{4}, C_{5}, C_{6}, C_{7}, C_{8}, C_{9,} C_{10}, C_{11}, C_{12}). De manera similar, cuando se hace referencia a alquileno de C_{1-6}, se entiende que el grupo alquileno puede contener cualquier número de átomos de carbono entre 1 y 6 (p. ej, C_{1}, C_{2}, C_{3}, C_{4}, C_{5}, C_{6}).
El término "cicloalquilo" incluye grupos cicloalquilo, policicloalquilo y cicloalquenilo, así como combinaciones de estos con grupos alquilo, tales como grupos cicloalquilalquilo. El grupo cicloalquilo puede estar interrumpido con 1, 2 ó 3 heteroátomos seleccionados entre -O-, -NH- o -S-. Sin embargo, el término "cicloalquilo", usualmente, se refiere a grupos cicloalquilo que no tienen interrupciones de heteroátomos. Los ejemplos de grupos cicloalquilo incluyen grupos ciclopentilo, ciclohexilo, ciclohexenilo, ciclohexilmetilo y adamantilo. Cuando se hace referencia a cicloalquilo de C_{3-12}, se entiende que el grupo cicloalquilo puede contener cualquier número de átomos de carbono entre 3 y 12 (p. ej, C_{3}, C_{4}, C_{5}, C_{6}, C_{7}, C_{8}, C_{9}, C_{10}, C_{11}, C_{12}).
El término "arilo" se usa aquí para referirse a un grupo aromático que contiene, tal como fenilo o naftilo. Cuando se hace referencia a arilo de C_{5-12}, se entiende que el grupo arilo puede contener cualquier número de átomos de carbono entre 5 y 12 (p. ej, C_{5}, C_{6}, C_{7}, C_{8}, C_{9,} C_{10}, C_{11}, C_{12}).
El término "arilo de C_{5-12}-alquilo de C_{1-6}" se refiere a grupos tales como bencilo, feniletilo y naftilmetilo.
Preferiblemente, el aldehído enmascarado es -CH(OH)CH_{2}OH. Preferiblemente, el sacárido capsular modificado de la presente invención comprende un resto de fórmula -NH(CH_{2})_{3}CH(OH)CH_{2}OH, más preferiblemente -OC(O)NH(CH_{2})_{3}CH(OH)CH_{2}OH.
La presente invención proporciona compuestos que tienen un grupo aldehído enmascarado. El uso de un aldehído enmascarado previene de manera ventajosa reacciones secundarias no deseadas durante la modificación del sacárido capsular. Más aún, cuando se revela un grupo enmascarado, este puede usarse para acoplamiento de aminación reductiva, por ejemplo, con un grupo amino sobre una proteína.
Generalmente, el resto de fórmula (I) o (Ia) realiza la función de proporcionar una fijación para la posterior reacción con un grupo amina de una proteína. De acuerdo con ello, el resto de fórmula (I) o (Ia), usualmente, se usa para formar un grupo ligador en un conjugado sacárido-proteína.
Sin embargo, el resto de fórmula (I) o (Ia), preferiblemente (Ia), puede usarse como un grupo de bloqueo para estabilizar el sacárido contra la degradación, especialmente la degradación por hidrólisis ácida. Este uso posterior del resto de fórmula (Ia) puede ser una alternativa a, o además de, su uso como un grupo ligador. El uso de grupos de bloqueo para estabilizar sacáridos capsulares se describe en la Solicitud de Patente Internacional PCT/IB03/01436.
Cuando el resto de fórmula (Ia) se usa como un grupo de bloqueo estabilizante, el sacárido modificado, preferiblemente, tiene más de uno de estos restos para proporcionar un efecto estabilizante. Por ejemplo, todas o substancialmente todas las unidades monosacáridas en el sacárido modificado tienen un grupo de bloqueo que comprende un grupo de fórmula (Ia). Como alternativa, al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90% de las unidades monosacáridas pueden tener un grupo de bloqueo que comprende un grupo de fórmula (I). Al menos 1, 2, 3, 4 ,5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30 unidades monosacáridos pueden tener grupos de bloqueo.
De igual forma, puede variar el número de grupos de bloqueo sobre cada unidad monosacárida. Por ejemplo, el número de grupos de bloqueo sobre una unidad monosacárido puede ser 1, 2, 3, 4, 5 ó 6, preferiblemente 1 a 4, y más preferiblemente 1 ó 2.
Preferiblemente, el sacárido modificado de la presente invención comprende un resto de fórmula (I) o (Ia), el cual, a continuación, se convierte en un aldehído. De acuerdo con ello, la presente invención proporciona además un sacárido modificado que comprende un resto de las fórmulas (II), o preferiblemente, (IIa):
(II)-A-N(R^{1})-L-C(O)H
(IIa)-OC(O)N(R^{1})-L-C(O)H
en las que A, R^{1} y L son tal como se han definido anteriormente.
La conversión de los aldehídos enmascarados de fórmula (I) o (Ia) en aldehídos de fórmula (II) o (IIa), implica una simple etapa de síntesis. Por ejemplo, los dioles pueden convertirse en aldehído mediante escisión oxidativa (p. ej., NalO_{4}, Pb(OAc)_{4}, etc.); los alcoholes pueden convertirse en aldehído mediante oxidación (p. ej., oxidación Swern, oxidación Dess-Martin, oxidaciones con Cr^{VI}, etc.); los alquenos pueden convertirse en aldehídos mediante escisión del doble enlace (p. ej., ozonolisis seguida de tratamiento reductor, OsO_{4}/NalO_{4}, OsO_{4}/Pb(OAc)_{4}, etc.); los acetales pueden convertirse en aldehídos mediante hidrólisis ácida; los tioacetales pueden convertirse en aldehídos mediante coordinación, alquilación u oxidación de metales (p. ej., Hg^{II}, Ag^{I}, Ag^{II}, Cu^{II}, Mel, N-bromosuccinimida, etc); los ésteres carboxílicos, ciano compuestos y amidas Weinreb pueden convertirse en aldehídos mediante una reducción adecuada (p. ej., NaBH_{4}, DIBAL, etc.).
Preferiblemente, el aldehído enmascarado M es de fórmula -CH(OH)CH_{2}OH. Este diol puede convertirse de manera ventajosa en el aldehído correspondiente usando un agente oxidante de peryodato suave. Se ha encontrado que los oxidantes de peryodato, tal como NalO_{4}, forman de manera selectiva un aldehído sin afectar otras funcionalidades sensibles sobre el sacárido capsular.
De acuerdo con ello, en una realización preferida, el sacárido modificado comprende un resto de fórmula -NH(CH_{2})_{3}C(O)H, más preferiblemente -OC(O)NH(CH_{2})_{3}C(O)H.
Conjugados sacárido-proteína
Los sacáridos modificados que comprenden un resto de fórmula (II) o (IIa), pueden usarse para acoplar el sacárido a un portador de proteína. Preferiblemente, el acoplamiento es mediante aminación reductiva de un grupo amino sobre la proteína con el grupo aldehído sobre el sacárido modificado que comprende un resto de fórmula (II) o (IIa). Las reacciones de aminación reductiva son bien conocidas por ser un procedimiento seguro para el acoplamiento de sacáridos y proteínas. Usualmente la reacción se realiza usando NaBH_{3}CN, aunque pueden igualmente usarse otros reductores adecuados.
De acuerdo con ello, la presente invención proporciona un conjugado sacárido-proteína, en el que los restos sacárido y proteína están ligados mediante un grupo de fórmula (IV) o, preferiblemente, (IVa):
(IV)-A-N(R^{1})-L-NH-
(IVa)-OC(O)N(R^{1})-L-NH-
en la que A, R^{1} y L son tal como se han definido anteriormente. Preferiblemente, L es -(CH_{2})_{4}- en conjugados de la presente invención. En una realización preferida, los restos sacárido y proteína están ligados mediante un grupo de fórmula -OC(O)NH-(CH_{2})_{4}-NH-. Típicamente el -NH- derivará de un grupo amina existente sobre la proteína, p. ej., en un resto lisina.
En los conjugados sacárido-proteína de la presente invención, la proteína es, preferiblemente, una toxina o toxoide bacteriano, más preferiblemente una toxina o toxoide de la difteria o tétanos. Estos se usan comúnmente en vacunas conjugadas. El toxoide de la difteria CRM_{197} es particularmente preferido [1]. Otras proteínas portadoras adecuadas incluyen la proteína de membrana exterior de N. meningitidis [2], péptidos sintéticos [3,4], proteínas de choque térmico [5,6], proteínas pertussis [7,8], proteína D procedente de H. influenzae [9], citocinas [10], linfocinas [10], hormonas [10], factores de crecimiento [10], toxina A o B procedente de C. difficile [11], proteínas de retención del hierro [12], etc. Es posible usar mezclas de proteínas portadoras.
Después de la conjugación, pueden separarse sacáridos libres y conjugados. Existen muchos procedimientos adecuados, los cuales incluyen cromatografía hidrófoba, ultrafiltración tangencial, diafiltración, etc. [véanse igualmente referencias 13, 14, etc.].
Una única proteína portadora puede portar múltiples sacáridos diferentes [15].
Sacáridos Neisseria meningitidis serogrupo A modificados
En todas las realizaciones descritas anteriormente, el sacárido capsular modificado es, preferiblemente, un sacárido Neisseria meningitidis modificado. Más preferiblemente, el sacárido capsular modificado es un sacárido Neisseria meningitidis serogrupo A modificado.
\newpage
El sacárido Neisseria miningitidis serogrupo A tiene la estructura siguiente:
3
De acuerdo con ello, la presente invención proporciona un sacárido de fórmula:
4
en la que:
T es de la fórmula (A) o (B):
5
n es un número entero desde 1 hasta 100;
cada grupo Z está independientemente seleccionado entre -OH, -OAc, -OC(O)N(R^{1})-L-M o -OC(O)N(R^{1})-L-CO)H;
cada grupo Q está independientemente seleccionado entre -OH, -OAc, -OC(O)N(R^{1})-L-M o -OC(O)N(R^{1})-L-CO)H;
W está seleccionado entre -OH, -OAc, -OC(O)N(R^{1})-L-M o -OC(O)N(R^{1})-L-CO)H (preferiblemente W es -OH);
V es -N(R^{1})-L-M o -N(R^{1})-L-CO)H;
en la que R^{1}, L y M son tal como se han definido anteriormente, con la condición de que el sacárido comprenda al menos un resto de la fórmula -N(R^{1})-L-M, -N(R^{1})-L-CO)H, -OC(O)N(R^{1})-L-M o -OC(O)N(R^{1})-L-CO)H.
Preferiblemente, n es un número entero desde 15 hasta 25.
Preferiblemente, T es de la fórmula (A). Preferiblemente el sacárido comprende al menos un resto de la fórmula -OC(O)N(R^{1})-L-M o -OC(O)N(R^{1})-L-CO)H.
Preferiblemente, Q y Z son una mezcla de grupos OH y OAc esencialmente en las mismas proporciones relativas que en el sacárido Neisseria meningitidis serogrupo A con la excepción de que uno de los grupos Q o Z, preferiblemente uno de los grupos Q, es -OC(O)N(R^{1})-L-M o -OC(O)N(R^{1})-L-CO)H.
Procedimiento para la producción de sacáridos modificados
Esta invención proporciona además un procedimiento para la modificación de un sacárido capsular que comprende las etapas de:
(a) proporcionar un sacárido capsular que tenga un grupo hidroxilo;
(b) hacer reaccionar el grupo hidroxilo con un reactivo bifuncional en un disolvente orgánico;
(c) hacer reaccionar el producto de la etapa (b) con un compuesto amina de fórmula (III):
(III)HN(R^{1})-L-M
en la que R^{1}, L y M son tal como se han definido anteriormente.
El sacárido capsular puede ser un sacárido capsular nativo (oligosacárido o polisacárido). Como alternativa, el sacárido capsular puede ser, por ejemplo, un sacárido capsular des-O-acetilado, un sacárido capsular bloqueado (tal como se describe en PCT/IB03/01436) o un sacárido capsular que tenga un grupo amino terminal (p. ej., obtenido mediante aminación reductiva).
El término "reactivo bifuncional" significa cualquier reactivo que sea capaz de realizar las funciones duales de (i) proporcionar un primer átomo de carbono electrófilo para acoplamiento con el grupo(s) hidroxilo sobre el sacárido; y (ii) proporcionar un segundo átomo de carbono electrófilo para acoplamiento con el grupo amino usado en la etapa (b2). Generalmente, el segundo átomo de carbono electrófilo se regenera a partir del primer átomo de carbono electrófilo durante la etapa (b). El reactivo bifuncional proporciona un ligamiento -C(O)- entre el polisacárido y el compuesto amino.
Los reactivos bifuncionales para uso en la presente invención incluyen, pero sin limitarse a ellos, 1,1'-carbonildiimidazol (CDl), carbonildi-1,2,3-triazol (CDT), carbonildi-1,2,3-benzotriazol (CDB), difenilcarbonato, bromuro de cianógeno, fosgeno o trifosgeno. La persona experta sabrá de otros reactivos bifuncionales que puedan realizar la misma función que estos. El CDl es el preferido, dado que es un reactivo particularmente suave y evita la generación de gases fuertemente ácidos, tales como HCl o HBr.
Preferiblemente, el disolvente orgánico es un disolvente aprótico. Los disolventes apróticos son bien conocidos para las personas expertas en la técnica y no contienen ningún átomo de hidrógeno ionizable. Estos disolventes son ventajosos dado que facilitan la reacción del grupo(s) hidroxilo sobre el sacárido con el reactivo bifuncional, mediante la potenciación de la nucleofilicidad del grupo(s) hidroxilo. Los disolventes apróticos adecuados incluyen, pero sin limitarse a ellos, dimetilsulfóxido (DMSO), dimetilformamida (DMF), formamida, hexametilfosforamida (HMPA), hexametilfosforotriamida (HMPT), 1,3-dimetil-3,4,5,6-tetrahidro-2(1H)-pirimidinona (DMPU) o dimetilacetamida (DMAC). El DMSO es el preferido.
En la etapa (c) anterior, el compuesto intermedio de carbamato generado después de la etapa (b) se hace reaccionar con una amina de fórmula (III). Preferiblemente, la amina de fórmula (III) es la H_{2}N(CH_{2})_{3}CH(OH)CH_{2}OH. tris-nucleófila.
En el Esquema 1 que figura a continuación, se ejemplifica un procedimiento preferido de la presente invención:
Esquema 1
6
En el Esquema 1, el sacárido (p. ej., polisacárido u oligosacárido Men A), en primer lugar es activado a través de uno de sus grupos hidroxilo usando CDl en disolvente DMSO. El carbamato de imidazol resultante es atrapado por la H_{2}N(CH_{2})_{3}CH(OH)CH_{2}OH tris-nucleófila para proporcionar el sacárido modificado que tiene una funcionalidad alde-
hído enmascarada. La Figura 2 muestra la etapa de activación para un sacárido Neisseria meningitidis serogrupo A.
Como alternativa, los sacáridos modificados pueden prepararse en un procedimiento de una etapa haciendo reaccionar uno o más grupos hidroxilo sobre un sacárido capsular con un reactivo de fórmula XC(O)N(R^{1})-L-M, en la que X es un grupo de cesión y R^{1}, L y M son tal como se han definido anteriormente. Los grupos de cesión adecuados incluyen, pero sin limitarse a ellos, -Cl, -Br, -CF_{3}, -OC_{6}H_{5} o -CCl_{3}.
En una realización preferida, se proporciona un procedimiento para la modificación de un sacárido tal como se ha descrito anteriormente, el cual comprende además las etapas de (d) desenmascaramiento del grupo aldehído enmascarado M, proporcionando, de esta forma, un compuesto aldehído; y (e) ligamiento del compuesto aldehído a una proteína mediante una reacción de aminación reductiva. En este procedimiento, el grupo aldehído enmascarado M es, preferiblemente, -CH(OH)CH_{2}OH, la etapa de desenmascaramiento es, preferiblemente, una escisión con peryodato, y el agente de reducción en la reacción de aminación reductiva es, preferiblemente, NaBH_{3}CN. Esta realización preferida se muestra en la Figura 1. En la Figura 1, PS representa un polisacárido u oligosacárido derivado a partir de sacárido Neisseria menigitidis serogrupo A nativo.
Composiciones y procedimientos farmacéuticos
La invención proporciona una composición farmacéutica que comprende (a) un sacárido modificado de la invención y/o un conjugado de la invención, y b) un vehículo aceptable farmacéuticamente.
Cuando está presente un conjugado, la composición puede comprender además una proteína portadora libre [16].
"Los vehículos aceptables farmacéuticamente" incluyen cualquier vehículo que por sí mismo no induzca la producción de anticuerpos perjudiciales al individuo que recibe la composición. Los vehículos adecuados son, típicamente, grandes macromoléculas lentamente metabolizadas tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos polímeros, copolímeros de aminoácidos, agregados lípidos de trehalosa [17] (tales como gotitas de aceite o liposomas), y partículas de virus inactivos. Dichos vehículos son bien conocidos por los expertos normales en la técnica. Igualmente, las vacunas pueden contener diluyentes, tales como agua, solución salina, glicerol, etc. Adicionalmente, pueden estar presentes substancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsificantes, substancias tamponadoras del pH, y similares. En Remington's Pharmaceutical Sciences, p. ej., edición de 2000 (ISBN: 0683306472), se encuentra disponible una completa exposición de excipientes aceptables farmacéuticamente.
Típicamente, las composiciones se preparan como inyectables, bien en soluciones líquidas o suspensiones; igualmente, pueden prepararse en formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en, vehículos líquidos antes de su inyección. Igualmente, la preparación puede emulsificarse o encapsularse en liposomas para un efecto adyuvante potenciado. El suministro directo de composiciones será generalmente parenteral (p. ej., mediante inyección, bien subcutáneamente, intraperitonealmente, intravenosamente o intramuscularmente, o suministrada al espacio intersticial de un tejido). Igualmente, las composiciones pueden administrarse dentro de una lesión. Otros modos de administración incluyen la administración oral y pulmonar, rectal (supositorios), y aplicaciones transdérmicas o tanscutáneas [p. ej., ref. 18], agujas, e hidropulverizadores. La dosificación del tratamiento puede ser de acuerdo con un programa de dosis única o de dosis múltiples (p. ej., que incluyan dosis de refuerzo).
Preferiblemente, la composición de la invención es estéril, tamponada y/o libre de pirógenos.
Preferiblemente, la composición es una composición inmunógena (p. ej., una vacuna). Las vacunas basadas en sacáridos o conjugados sacárido-proteína son bien conocidas en la técnica.
Las composiciones inmunógenas comprenden una cantidad eficaz de antígeno monosacárido, así como cualquier otro de los otros componentes especificados, según sea necesario. Por "cantidad eficaz inmunológicamente", se entiende que la administración de dicha cantidad a un individuo, bien en una dosis única o como parte de unas series, es eficaz para tratamiento o prevención. Esta cantidad varía dependiendo de la salud y afección física del individuo a ser tratado, edad, el grupo taxonómico del individuo a ser tratado (p. ej., primate no-humano, primate, etc.), la capacidad del sistema inmune del individuo para sintetizar anticuerpos, el grado de protección deseada, la formulación de la vacuna, la valoración de la situación médica del doctor que le trata, y otros factores importantes. Se espera que la cantidad caiga dentro de un intervalo relativamente amplio que pueda ser determinado mediante ensayos de rutina. La dosificación del tratamiento puede ser de acuerdo con un programa de dosis única o un programa de dosis múltiple (p. ej., que incluyan dosis de refuerzo). Las vacunas pueden administrarse conjuntamente con otros agentes inmunoreguladores.
La composición inmunogénica puede incluir un adyuvante. Los adyuvantes preferidos para potenciar la eficacia de la composición, incluyen, pero sin limitarse a ellos: (A) compuestos de aluminio (p. ej., hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, hidrofosfato de aluminio, oxihidróxido, ortofosfato, sulfato de aluminio, etc. [véanse, capítulos 8 y 9 de ref.19], o mezclas de diferentes compuestos de aluminio, con los compuestos usados en cualquier forma adecuada (p. ej., gel, cristalina, amorfa, etc.), y siendo preferidos con adsorción; (B) MF59 (escualeno al 5%, Tween 80 al 0,5% y Span 85 a 0,5%, formulado en partículas submicrónicas usando un microfluidizador) [véase, Capítulo 10 de ref. 19; véase, igualmente, ref. 20]; (C) liposomas [véanse, Capítulos 13 y 14 de ref. 19]; (D) ISCOMs [véase, Capítulo 23 de ref. 19], los cuales pueden estar exentos de detergente adicional [21]; (E) SAF, que contiene escualeno al 10%, Tween 80 al 0,4%, polímero de bloque plurónico al 5% L121, y thr-MDP, microfluidizado en emulsión submicrónica o batido para generar una emulsión de partículas más grandes [véase, Capítulo 12 de ref. 19]; (F) sistema adyuvante Ribi^{TM} (RAS), (Ribi Immunochem) que contiene escualeno al 2%, Tween 80 al 0,2%, y uno o más componentes de pared de célula bacteriana procedente del grupo formado por monofosforolípido A (MPL), dimicolato de trehalosa (TDM), y esqueleto de pared de célula (CWS), preferiblemente MPL + CWS (Detox^{TM}); (G) adyuvantes de saponina, tal como QuilA o QS21 [véase, Capítulo 22 de ref. 19], también conocidos como Stimulon^{TM}; (H) quitosan [p. ej., 22]; (I) adyuvante completo de Freund (CFA) y adyuvante incompleto de Freund (IFA); (J) citocinas, tales como interleuquinas (p. ej., IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, etc.), interferones (p. ej., interferón-\gamma), factor estimulante de colonias macrófagas, factor de necrosis de tumor, etc. [véanse, Capítulos 27 y 28 de ref. 19]; (K) micropartículas (es decir una partícula de \sim100 nm hasta \sim150 \mum de diámetro, más preferiblemente \sim20 nm hasta \sim30 \mum de diámetro, y lo más preferiblemente \sim500 nm hasta \sim10 \mum de diámetro), formadas a partir de materiales que son biodegradables y no tóxicos (p. ej., un poli(\alpha-hidroxi ácido), un ácido polihidroxibutírico, un poliortoéster, un polianhídrido, una policaprolactona, etc.); (L) monofosforil lípido A (MPL) ó MPL 3-O-desacilado (3dMPL) [p. ej., Capítulo 21 de ref. 19]; (M) combinaciones de 3dMPL con, por ejemplo, QS21 y/o emulsiones de aceite en agua [23]; (N) oligonucleótidos que comprenden motivos CpG [24], es decir, que contienen al menos un nucleótido CG, con 5-metilcitosina siendo usada opcionalmente en lugar de citosina; (O) un éter de polioxietileno o un éster de polioxietileno [25]; (P) un éster de polioxietileno sorbitano en combinación con octoxinol [26] o un tensioactivo de alquil éter o éster de polioxietileno en combinación con al menos un tensioactivo no iónico adicional tal como octoxinol [27]; (Q) un oligonucleótido inmunoestimulador (p. ej., un oligonucleótido CpG) y una saponina [28]; (R) un inmunoestimulante y una partícula de sal de metal [2]; (S) una saponina y una emulsión de aceite en agua [30]; (T) una saponina (p. ej., QS21 + 3dMPL + IL-2 (opcionalmente + un esterol) [31]; (U) enterotoxina térmicamente lábil de E. coli ("LT"), o mutantes destoxificados de la misma, tal como los mutantes K63 o R72 [p. ej., Capítulo 5 de ref. 32]; (V) toxina del cólera ("CT"), o mutantes destoxificados de la misma [p. ej., Capítulo 5 de ref. 32]; (W) RNA de doble hebra; (X) imitadores de monofosforil lípido A, tales como derivados aminoalquil glucosaminido fosfato, p. ej., RC-529 [33]; (Y) polifosfaceno (PCPP); o (Z) un bioadhesivo [34] tal como microesferas de ácido hialurónico esterificado [35] o un mucoadhesivo seleccionado entre el grupo formado por derivados reticulados de poli(ácido acrílico), poli(alcohol vinílico), polivinil pirrolidona, polisacáridos y carboximetilcelulosa. Igualmente, pueden usarse otras substancias que actúan como agentes inmunoestimulantes para potenciar la eficacia de la composición [p. ej., véase Capítulo 7 de ref. 19]. Las sales de aluminio (especialmente fosfato y/o hidróxidos de aluminio) son los adyuvantes preferidos para inmunización parenteral. Las toxinas mutantes son los adyuvantes mucosales preferidos.
Los péptidos de muramilo incluyen N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), N-acetil-muramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'-di-palmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE), etc.
Una vez formuladas, las composiciones de la invención pueden ser administradas directamente al sujeto. Los sujetos a tratar pueden ser animales; en particular, pueden ser tratados sujetos humanos. Las vacunas son particularmente útiles para la vacunación de niños y jóvenes de trece a diecinueve años.
Las vacunas de acuerdo con la invención pueden ser profilácticas (es decir, para prevenir la infección) o terapéuticas (es decir, para tratar la enfermedad después de la infección), pero, típicamente, serán profilácticas.
Al igual que los sacáridos modificados, la composición puede comprender además componentes antigénicos. Por ejemplo, las composiciones pueden incluir uno o más sacáridos adicionales (estén o no modificados de acuerdo con la invención). Por ejemplo, la composición puede comprender sacáridos procedentes de serogrupos C, W135 e Y de N. meningitidis (p. ej., además de un sacárido MenA modificado). Típicamente, estos estarán conjugados a proteínas soporte, y sacáridos procedentes de diferentes serogrupos de N. meningitidis pueden estar conjugados a la misma o a diferentes proteínas. Cuando una mezcla comprende sacáridos capsulares procedentes de ambos grupos A y C, se prefiere que la relación (p/p) de sacárido MenA:sacárido MenC sea superior a 1 (p. ej., 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1, o superiores). Se ha observado una inmunogenicidad mejorada del componente MenA cuando este está presente en exceso (masa/dosis) con respecto al componente MenC.
La composición puede comprender, igualmente, antígenos de proteínas.
Los antígenos que pueden incluirse en la composición de la invención, incluyen:
- antígenos procedentes de Helycobacter pylori tal como CagA [36 a 39], VacA [40, 41], NAP [42, 43, 44], HopX [p. ej., 45], HopY [p. ej., 45] y/o ureasa.
- un antígeno de proteína procedente de N. meningitidis serogrupo B, tal como los de las refs. 46 a 52, siendo particularmente preferidos la proteína "287" (véase más adelante) y derivados (p. ej., "\DeltaG287").
- preparación de una vesícula de membrana exterior (OVM) procedente de N. meningitidis serogrupo B, tal como las descritas en las refs 53, 54, 55, 56, etc.
- un antígeno de sacárido procedente de N. meningitidis serogrupo C, tal como el oligosacárido descrito en la ref. 57 procedente del serogrupo C [véase, igualmente, ref. 58].
- un antígeno de sacárido procedente de Streptococcus pneumoniae [p. ej., 59, 60, 61].
- un antígeno procedente del virus de la hepatitis A, tal como virus inactivado [p. ej., 62, 63].
- un antígeno procedente del virus de la hepatitis B, tal como los antígenos de superficie y/o de núcleo [p. ej, 63, 64].
- un antígeno procedente del virus de la hepatitis C [p. ej., 65].
- un antígeno procedente de Bordetella pertussis, tal como holotoxina pertussis (PT) y hemaglutinina filamentosa (FHA) procedente de B. pertussis, opcionalmente igualmente en combinación con pertactina y/o aglutinógenos 2 y 3 [p. ej., refs. 66 y 67].
- un antígeno de la difteria, tal como un toxoide de la difteria [p. ej., capítulo 3 de ref. 68], p. ej., el mutante CRM_{197} [p. ej., 69].
- un antígeno del tétanos, tal como un toxoide del tétanos [p. ej., capítulo 4 de ref. 68].
- un antígeno de sacárido procedente de Haemophilus influenzae B [p. ej. 58].
- un antígeno procedente de N. gonorrhoeae [p. e., 46, 47, 48].
- un antígeno procedente de Chlamydia pneumoniae [p. ej., 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76].
- un antígeno procedente de Chlamydia trachomatis [p. ej., 77].
- un antígeno procedente de Porphyromonas gingivalis [p. e., 78].
- antígeno(s) de la polio [p. ej., 79, 80], tal como IPV u OPV.
- antígeno(s) de la rabia [p. ej., 81], tal como virus inactivado liofilizado [p. ej. 82, RabAvert^{TM}].
- antígenos de sarampión, pariotiditis y/o rubéola [p. ej., capítulos 9, 10 y 11 de ref. 68].
- antígeno(s) de la influenza [p. ej., capítulo 19 de ref. 68], tal como las proteínas de superficie neuramidinasa y/o hemaglutinina.
- un antígeno procedente de Moraxella catarrhalis [p ej., 83].
- un antígeno procedente de Streptococcus agalactiae (estreptococos del grupo B) [p. ej., 84, 85].
- un antígeno de sacárido procedente de Streptococcus agalactiae (estreptococos del grupo B).
- un antígeno procedente de Streptococcus pyrogenes (estreptococos del grupo A) [p. ej., 85, 86, 87].
- un antígeno procedente de Staphylococcus aureus [p. ej., 88].
- un antígeno procedente de Bacillus anthracis [p. ej., 89, 90, 91].
- un antígeno procedente de un virus en la familia flavivíridos (género flavivirus), tal como procedente del virus de la fiebre amarilla, virus de la encefalitis japonesa, cuatro serotipos de virus del dengue, virus de la encefalitis asociada con la garrapata, virus del Nilo Occidental.
- un antígeno de pestivirus, tal como el procedente del virus de la fiebre porcina clásica, virus de la diarrea vírica bovina, y/o virus de enfermedad dudosa.
- un antígeno parvovirus, p. ej., procedente del parvovirus B19.
- una proteína prión (p. ej., la proteína prión CJD).
- una proteína amiloide, tal como beta péptido [92].
- un antígeno del cáncer, tal como los listados en la Tabla 1 de la ref. 93, o en las Tablas 3 y 4 de ref. 94.
La composición puede comprender uno o más de estos antígenos adicionales.
Los antígenos de proteínas tóxicas pueden destoxificarse en caso necesario (p. ej., destoxificación de toxina de pertussis por medios químicos y/o genéticos [67]).
Cuando se incluye un antígeno de la difteria en la composición, se prefiere igualmente incluir antígeno del tétanos y antígenos de pertussis. De manera similar, cuando se incluye un antígeno de pertussis se prefiere igualmente incluir antígenos de la difteria y del tétanos.
Preferiblemente, los antígenos están absorbidos en una sal de aluminio.
Típicamente, los antígenos en la composición estarán presentes a una concentración de al menos 1 \mug/m cada uno. En general, la concentración de cualquier antígeno dado será suficiente para provocar una respuesta inmune contra dicho antígeno.
Como una alternativa al uso de antígenos de proteínas en la composición de la invención, puede usarse ácido nucleico que codifica el antígeno [p. ej., refs. 95 a 103]. De acuerdo con ello, los componentes de la proteína de las composiciones de la invención pueden reemplazarse por ácido nucleico (preferiblemente DNA, p. ej., en la forma de un plásmido) que codifica la proteína.
Igualmente, la invención proporciona un procedimiento para generar una respuesta anticuerpo en un mamífero, que comprende la administración de una composición farmacéutica de la invención al mamífero. Preferiblemente, el mamífero es un humano. El humano puede ser un adulto o, preferiblemente, un niño. La respuesta anticuerpo es, preferiblemente, protectora contra la infección por N. meningitidis serogrupo A.
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Igualmente, la invención proporciona un procedimiento para la inmunización de un mamífero, que comprende la administración de una composición farmacéutica de la invención al mamífero.
Igualmente, la invención proporciona un sacárido modificado de la invención, o un conjugado de la invención, para uso como un medicamento.
Igualmente, la invención proporciona el uso de un sacárido modificado de la invención, o un conjugado de la invención, en la fabricación de un medicamento para la prevención o tratamiento de una enfermedad causada por bacterias capsuladas. Las enfermedades causadas por Neisseria incluyen meningitis, septicemia y gonorrea. Las enfermedades causadas por H. influenza incluyen otitis media, bronquitis, neumonía, celulitis, pericarditis y meningitis. Las enfermedades causadas por neumococos incluyen meningitis, sepsis y neumonía. De acuerdo con ello, se prefiere la prevención y/o tratamiento de la meningitis bacteriana.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra la síntesis de un conjugado sacárido-proteína partir de un sacárido activado por CDl.
La Figura 2 muestra la reacción de un grupo hidroxilo sobre un sacárido Neisseria meningitidis serogrupo A con CDl.
La Figura 3 muestra los resultados de estudios de inmunogenicidad comparativos. La gráfica muestra valores GMT para cinco inmunógenos de sacáridos diferentes (A) a (E), y la tabla muestra los títulos bactericidas del suero frente a la cepa F8238 serogrupo A.
Modos para llevar a cabo la invención Estudios de inmunogenicidad comparativos
La presente invención proporciona un tipo mejorado de ligamiento entre un sacárido y una proteína. Además, se ha encontrado que los conjugados sacárido-proteína de acuerdo con la invención, tienen inmunogenicidad mejorada comparada con otros tipos de conjugados sacárido-proteína.
Con fines comparativos, se preparó un conjugado sacárido-proteína que tiene un ligamiento alternativo. Se preparó un polisacárido Neisseria miningitidis serogrupo A modificado mediante la activación por CDl de un grupo hidroxilo sobre el sacárido, seguido de inactivación del compuesto intermedio carbamato CDl con NH_{2}-(CH_{2})_{5}-CO_{2}H. Este polisacárido modificado se usó para preparar un conjugado sacárido-proteína mediante acoplamiento activado por EDAC del grupo carboxilo con CRM_{197}. De acuerdo con ello, el polisacárido y CRM_{197} se acoplaron mediante un grupo ligador -OC(O)NH-(CH_{2})_{5}-C(O)NH-. Para los fines de este estudio comparativo, este procedimiento de preparación de un conjugado sacárido-proteína se denomina "el procedimiento carbodiimida".
El conjugado sacárido-proteína preparado mediante el procedimiento carbodiimida, se comparó con un conjugado sacárido-proteína de acuerdo con la presente invención. De acuerdo con ello, se preparó un polisacárido Neisseria meningitidis serogrupo A mediante activación por CDl de un grupo hidroxilo sobre el polisacárido, seguido de inactivación del compuesto intermedio carbamato CDl con la NH_{2}-(CH_{2})_{3}-CH(OH)CH_{2}OH tris-nucleófila. Después de escisión con peryodato para revelar un aldehído, el polisacárido modificado se acopló a CRM_{197} mediante aminación reductiva (tal como se ilustra en la Figura 1). De acuerdo con ello, el polisacárido y CRM_{197} se acoplaron mediante un grupo ligador -OC(O)NH-(CH_{2})_{4}-NH-. Para los fines de este estudio comparativo, este procedimiento de preparación de un conjugado sacárido-proteína se denomina "el procedimiento de aminación reductiva".
Las inmunogenicidades de los conjugados preparados mediante el procedimiento carbodiimida y el procedimiento de aminación reductiva (a dos relaciones diferentes), se determinaron en ratones Balb/c. Los conjugados se administraron como dos dosis (0 y 14 días) de 2 \mug/dosis (expresados como masa de sacárido). Se realizó una sangría el día 25 y se determinaron los títulos IgG (GMT). Además, se evaluaron los títulos de anticuerpos bactericidas del suero (SBA) frente a la cepa F8238 de MenA. Para comparación, igualmente se ensayaron un conjugado oligosacárido de la invención y un polisacárido no conjugado.
Los resultados se muestran en la Figura 3. El conjugado oligosacárido (C) dio el mejor valor GMT y un título SBA de 1024. Por el contrario, el polisacárido solo (E) dio un título GMT pobre (comparable al del control de solución salina) y un título SBA pobre (<4). Cuando se conjugó con CRM_{197} usando el procedimiento carbodiimida (D), ambos títulos aumentaron (SBA: 128). Cuando se conjugó con CRM_{197} usando el procedimiento de aminación reductiva (A y B), los títulos GMT y SBA aumentaron (SBA: entre 512 y 1024). El título SBA logrado con el conjugado preparado usando la aminación reductiva coincidió con el del oligosacárido conjugado.
Un ensayo ELISA comparativo usando un modelo de cobayo, confirmó los resultados obtenidos con los ratones Balb/c.
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Claims (44)

1. Un sacárido capsular modificado que comprende un resto de la fórmula (I):
(I)-A-N(R^{1})-L-M
en la que:
A es un enlace, -C(O)- o -OC(O)-;
R^{1} está seleccionado entre H o alquilo de C_{1}-C_{6};
L es un grupo alquileno de C_{1}-C_{12};
M es un grupo aldehído enmascarado.
2. El sacárido capsular modificado de la Reivindicación 1, en el que A es -OC(O)-.
3. El sacárido capsular modificado de la Reivindicación 1 ó 2, en el que R^{1} es H.
4. El sacárido capsular modificado de cualquier Reivindicación precedente, en el que L es un grupo alquileno de C_{1}-C_{6}.
5. El sacárido capsular modificado de la Reivindicación 4, en el que L es -CH_{2}CH_{2}CH_{2}-.
6. El sacárido capsular modificado de cualquier Reivindicación precedente, en el que el grupo aldehído enmascarado M está seleccionado entre:
\vskip1.000000\baselineskip
7 
\vskip1.000000\baselineskip
8 
\vskip1.000000\baselineskip
en el que:
R^{2} está seleccionado entre H, alquilo de C_{1}-C_{12}, cicloalquilo de C_{3}-C_{12}, arilo de C_{5}-C_{12} o arilo de C_{5-12}- alquilo de C_{1-6};
X e Y son el mismo o diferentes y están independientemente seleccionados entre O o S;
R^{3} y R^{4} están independientemente seleccionados entre alquilo de C_{1}-C_{12}, cicloalquilo de C_{3}-C_{12}, arilo de C_{5}-C_{12} o arilo de C_{5-12}- alquilo de C_{1-6}; o R^{3} y R^{4} están unidos para formar un anillo cicloalquilo de C_{3}, C_{4}, C_{5}, C_{6}, C_{7} o C_{8} que contiene los heteroátomos X e Y;
R^{5} y R^{6} están independientemente seleccionados entre H, alquilo de C_{1}-C_{12}, cicloalquilo de C_{3}-C_{12}, arilo de C_{5}-C_{12} o arilo de C_{5-12}- alquilo de C_{1-6}; o R^{5} y R^{6} están unidos para formar un anillo cicloalquilo de C_{3} o C_{12};
R^{9} y R^{10} están independientemente seleccionados entre H, alquilo de C_{1}-C_{12}, cicloalquilo de C_{3}-C_{12}, arilo de C_{5}-C_{12} o arilo de C_{5-12}- alquilo de C_{1-6}; o R^{9} y R^{10} están unidos para formar un anillo cicloalquilo de C_{3}-C_{12}; y
R^{7} y R^{8} están independientemente seleccionados entre grupos alquilo de C_{1}-C_{12} o cicloalquilo de C_{3}-C_{12}.
\newpage
7. El sacárido capsular modificado de la Reivindicación 6, en el que el aldehído enmascarado es -CH(OH)CH_{2}OH.
8. El sacárido capsular modificado de la Reivindicación 1 o las Reivindicaciones 3 a 7, que comprende un resto de la fórmula: -NH(CH_{2})_{3}CH(OH)CH_{2}OH-.
9. El sacárido capsular modificado de las Reivindicaciones 1 a 7, que comprende un resto de la fórmula: -OC(O)NH(CH_{2})_{3}CH(OH)CH_{2}OH-.
10. Un sacárido capsular modificado que comprende un resto de la fórmula (II):
(II)-A-N(R^{1})-L-C(O)H
en la que A, R^{1} y L son tal como se han definido en una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 5.
11. El sacárido capsular modificado de la Reivindicación 10, en el que A es -OC(O)-.
12. El sacárido capsular modificado de la Reivindicación 10, que comprende un resto de la fórmula: -NH(CH_{2})_{3}
C(O)H-.
13. El sacárido capsular modificado de las Reivindicaciones 10 ó 11, que comprende un resto de la fórmula:
-OC(O)NH(CH_{2})_{3}C(O)H-.
14. El sacárido capsular modificado de cualquier Reivindicación precedente, en el que el sacárido capsular es sacárido Neisseria meningitidis serogrupo A.
15. Un sacárido de la fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
9 
\vskip1.000000\baselineskip
en la que:
\newpage
T es de la fórmula (A) o (B):
10
n es un número entero desde 1 hasta 100;
cada grupo Z está independientemente seleccionado entre -OH, -OAc, -OC(O)N(R^{1})-L-M o -OC(O)N(R^{1})-L-CO)H;
cada grupo Q está independientemente seleccionado entre -OH, -OAc, -OC(O)N(R^{1})-L-M o -OC(O)N(R^{1})-L-CO)H;
W está seleccionado entre -OH, -OAc, -OC(O)N(R^{1})-L-M o -OC(O)N(R^{1})-L-CO)H;
V es -N(R^{1})-L-M o -N(R^{1})-L-CO)H;
en la que R^{1}, L y M son tal como se han definido en las reivindicaciones 1 a 7, y con la condición de que el sacárido comprenda al menos un resto de la fórmula -N(R^{1})-L-M, -N(R^{1})-L-CO)H, -OC(O)N(R^{1})-L-M o -OC(O)N(R^{1})-L-CO)H.
16. El sacárido de la Reivindicación 15, en el que n es un número entero desde 15 hasta 25.
17. El sacárido de la Reivindicación 15 ó 16, en el que T es de la fórmula (A).
18. El sacárido de las Reivindicaciones 15 a 17, en el que Q y Z son una mezcla de grupos OH y OAc esencialmente en las mismas proporciones relativas que en el sacárido Neisseria meningitidis serogrupo A, con la excepción de que uno de los grupos Q o Z es -OC(O)N(R^{1})-L-M o -OC(O)N(R^{1})-L-CO)H.
19. El sacárido de la Reivindicación 18, en el que uno de los grupos Q es -OC(O)N(R^{1})-L-M o -OC(O)N(R^{1})-L-CO)H.
20. Un procedimiento para la modificación de un sacárido capsular que comprende las etapas de:
(a)
proporcionar un sacárido capsular que tiene un grupo hidroxilo;
(b)
hacer reaccionar el grupo hidroxilo con un reactivo bifuncional en un disolvente orgánico;
(c)
hacer reaccionar el producto de la etapa (b) con un compuesto amina de fórmula (III):
(III)HN(R^{1})-L-M
en la que R^{1}, L y M son tal como se han definido en una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 7.
21. El procedimiento de la Reivindicación 20, en el que el sacárido capsular es sacárido Neisseria meningitidis serogrupo A.
22. El procedimiento de la Reivindicación 20 ó 21, en el que el disolvente orgánico es un disolvente aprótico.
23. El procedimiento de la Reivindicación 22, en el disolvente aprótico está seleccionado entre dimetilsulfóxido (DMSO), dimetilformamida (DMF), formamida, hexametilfosforamida (HMPA), hexametilfosforotriamida (HMPT), 1,3-dimetil-3,4,5,6-tetrahidro-2(1H)-pirimidinona (DMPU) o dimetilacetamida (DMAC).
24. El procedimiento de las Reivindicaciones 22 ó 23, en el que el disolvente aprótico es DMSO.
25. El procedimiento de las Reivindicaciones 20 a 24, en el que el reactivo bifuncional está seleccionado entre 1,1'-carbonildiimidazol (CDl), carbonildi-1,2,3-triazol (CDT), carbonildi-1,2,3-benzotriazol (CDB), difenilcarbonato, bromuro de cianógeno, fosgeno o trifosgeno.
26. El procedimiento de la Reivindicación 25, en el que el reactivo bifuncional es CDl.
27. El procedimiento de las Reivindicaciones 20 a 26, en el que el compuesto amino en la etapa (c) es H_{2}N(CH_{2})_{3}
CH(OH)CH_{2}OH.
28. El procedimiento de las Reivindicaciones 20 a 27, que comprende además la etapa de (d) desenmascaramiento del grupo aldehído enmascarado M, proporcionando, de esta forma, un compuesto aldehído.
29. El procedimiento de la Reivindicación 28, en el que el grupo aldehído enmascarado M es -CH(OH)CH_{2}OH y la etapa de desenmascaramiento es una escisión con peryodato.
30. El procedimiento de la Reivindicación 28 o 29, que comprende además la etapa de (e) ligamiento del compuesto aldehído a una proteína mediante una reacción de aminación reductiva.
31. El procedimiento de la Reivindicación 30, en el que el agente de reducción en la reacción de aminación reductiva es NaBH_{3}CN.
32. Un procedimiento para la modificación de un sacárido Neisseria meningitidis serogrupo A, que comprende las etapas de:
(a) proporcionar un sacárido Neisseria meningitidis serogrupo A;
(b) hacer reaccionar un grupo hidroxilo sobre el sacárido con CDl en disolvente DMSO;
(c) hacer reaccionar el producto de la etapa (b) con H_{2}N(CH_{2})_{3}CH(OH)CH_{2}OH;
(d) escisión del producto de la etapa (c) con peryodato, proporcionando, de esta forma un compuesto aldehído; y
(e) ligamiento del compuesto aldehído de la etapa (d) a una proteína mediante una reacción de aminación reductiva usando NaBH_{3}CN.
33. Un conjugado sacárido-proteína, en el que los restos sacárido proteína están ligados mediante un grupo de fórmula (IV):
(IV)-A-N(R^{1})-L-NH-
en la que A, R^{1} y L son tal como se han definido en las Reivindicaciones 1 a 4.
34. Un conjugado sacárido-proteína, en el que R^{1} es H, A es -OC(O)- y L es -(CH_{2})_{4}-.
35. El conjugado de la Reivindicación 33 ó 34, en el que el sacárido es un sacárido Neisseria meningitidis serogrupo A.
36. El procedimiento de las Reivindicaciones 30 a 32 o el conjugado de las Reivindicaciones 33 a 35, en el que la proteína es una toxina o toxoide bacteriana.
37. El procedimiento o conjugado de la Reivindicación 36, en el que la toxina o toxoide bacteriana es toxina o toxoide de la difteria.
38. El procedimiento de las Reivindicaciones 30 a 32 o el conjugado de la Reivindicación 36, en el que la toxina o toxoide bacteriana es CRM_{197}.
39. Una composición farmacéutica que comprende un conjugado sacárido-proteína de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 33 a 38 y/o un sacárido modificado de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 19, y (b) un vehículo aceptable farmacéuticamente.
40. La composición de la Reivindicación 39, que comprende además un adyuvante de vacuna.
41. La composición de la Reivindicación 40, que es una vacuna contra una enfermedad causada por Neisseria meningitidis.
42. El conjugado de una cualquiera de las Reivindicaciones 33 a 38 o el sacárido de las Reivindicaciones 1 a 19, para uso como un medicamento.
43. El uso del conjugado de una cualquiera de las Reivindicaciones 33 a 38 o un sacárido de las Reivindicaciones 1 a 19, en la fabricación de un medicamento para la prevención o tratamiento de una enfermedad causada por una o más bacterias capsuladas.
44. El uso de la Reivindicación 43, en la que la enfermedad es meningitis bacteriana.
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