JP2014094012A - 連鎖球菌属を培養するための発酵プロセスおよび連鎖球菌属由来の莢膜多糖(cp)を得るための精製プロセス - Google Patents
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Abstract
【課題】精製工程の複雑さおよび/または費用が少なくて高純度レベルがもたらされる単純化された精製手順を提供する。また、多糖がどのような初期純度であっても良好な収率の莢膜多糖が得られる精製手順を提供する。
【解決手段】莢膜多糖(cp)は、種々の細菌性疾患に関与している細菌の表面上に見られる重要な免疫原である。この特徴により、莢膜多糖は、ワクチンの設計において重要な成分となっている。莢膜多糖は、特に、担体タンパク質と連結させると、免疫応答の誘起に有用であることが示されている。本発明は、細菌培養の分野におけるものであり、特に、フィードバッチ式培養における連鎖球菌属菌株からの細菌莢膜多糖の生産を改善するための培養条件の最適化、および連鎖球菌属菌株からの細菌莢膜多糖の生産規模精製に適し、これまでの生産規模で得られるものより高い純度レベルがもたらされる新規な精製方法に関する。
【選択図】なし
【解決手段】莢膜多糖(cp)は、種々の細菌性疾患に関与している細菌の表面上に見られる重要な免疫原である。この特徴により、莢膜多糖は、ワクチンの設計において重要な成分となっている。莢膜多糖は、特に、担体タンパク質と連結させると、免疫応答の誘起に有用であることが示されている。本発明は、細菌培養の分野におけるものであり、特に、フィードバッチ式培養における連鎖球菌属菌株からの細菌莢膜多糖の生産を改善するための培養条件の最適化、および連鎖球菌属菌株からの細菌莢膜多糖の生産規模精製に適し、これまでの生産規模で得られるものより高い純度レベルがもたらされる新規な精製方法に関する。
【選択図】なし
Description
本願は、2007年12月20日に出願された米国仮特許出願第61/008,941号および2008年10月8日に出願された英国特許出願第0818453.3号の利益を主張する。米国仮特許出願第61/008,941号および英国特許出願第0818453.3号の両方は、その全体が参考により本明細書中に援用される。
発明の分野
本発明は、細菌培養の分野におけるものであり、好ましくは、細菌莢膜多糖の生産を改善するための培養条件の最適化および新規な精製方法に関する。
本発明は、細菌培養の分野におけるものであり、好ましくは、細菌莢膜多糖の生産を改善するための培養条件の最適化および新規な精製方法に関する。
発明の背景
莢膜多糖(cp)は、種々の細菌性疾患に関与している細菌の表面上に見られる重要な免疫原である。この特徴により、莢膜多糖は、ワクチンの設計において重要な成分となっている。莢膜多糖は、特に、担体タンパク質と連結させると、免疫応答の誘起に有用であることが示されている(参考文献1)。
莢膜多糖(cp)は、種々の細菌性疾患に関与している細菌の表面上に見られる重要な免疫原である。この特徴により、莢膜多糖は、ワクチンの設計において重要な成分となっている。莢膜多糖は、特に、担体タンパク質と連結させると、免疫応答の誘起に有用であることが示されている(参考文献1)。
典型的には、莢膜多糖は、複合培地中でのバッチ式培養(B群連鎖球菌属、Staphylococcus aureus、Streptococcus pneumoniaeおよびHaemophilus influenzae)、フィードバッチ式培養(H.influenzae)または連続式培養(B群連鎖球菌属およびLactobacillus rhamnosus)を用いて生産させる(参考文献2〜7)。ほとんどの研究では、インキュベーション中に増殖速度、栄養素レベルおよび代謝濃度が変化するバッチ式培養系が使用された。かかる系では、1つの要素の変化により、増殖と関連している他の要素の変化がもたらされ、これが、予測不可能に収率に影響することがあり得る。連続式培養では、研究者が、バッチ式培養での増殖中、相互依存性のパラメータ(増殖速度、栄養素および生成物濃度ならびに菌体密度など)を分離および規定することが可能である。連続式培養の際は、新鮮培地が培養物に一定速で添加され、菌体および培地が、一定の培養容量が維持される速度で除去される。連続式培養は、条件に依存性である場合では、莢膜多糖の生産に好ましいものであった(参考文献8)。
B群連鎖球菌属(GBS、S.agalactiae)では、菌体増殖速度が莢膜多糖の生産が調節される主要な要素であると報告された。さらに、III型莢膜多糖の生成は、増殖制限栄養素とは独立して起こり得ることが示された。菌体を高速(0.8、1.4または1.6時間)の質量倍加時間(td)で保持した方が、低速の場合(td=2.6または11時間)よりも高い比収率(約90mg/gCDW)が得られた(参考文献8〜10)。しかしながら、連続式培養は、菌株の安定性の問題および汚染を有する傾向にあり、培地と栄養素を連続的に供給するため、いくぶん費用がかかる。したがって、上記の連続式培養に伴う問題を解決するため、莢膜多糖の高収率生産のための連続式培養の代替法を見い出すことが必要である。
連続式培養の問題点を解決するためのアプローチの一例は、WO2007/052168に例示されている。cp生産に都合のよい栄養環境および増殖速度を維持するための複雑なフィードバッチ式発酵プロセスが開発された。このプロセスは、バッチ手法の利点と連続式手法の利点を併せ持ち、指数増殖期の長期化および発酵時の基質添加を制御する条件のため、高い菌体密度がもたらされる。しかしながら、この複雑なフィードバッチ式手法では、発酵を管理するための複雑なアルゴリズムを伴うソフトウェアを使用する。さらに、臨床試験をサポートするための物質を作製するためには、医薬品および医薬部外品の製造管理および品質管理の基準(Good Manufacturing Practices)に準拠したロバストで費用効果の高い生産プロセスが必要である。したがって、大規模生産用のフィードバッチ式発酵プロセスを単純化することが差し迫って必要である。
発酵プロトコルの単純化の必要性に加え、発酵後の莢膜多糖の大規模生産に使用され得る単純化された精製プロトコルが必要である。WO2007/052168に例示されたアプローチは、抽出、アルコール沈殿、ダイアフィルトレーション、カチオン系デタージェント処理および再可溶化を含む、WO2006/082527に開示された方法に基づいたものである。この手順は非常に効率的であり、典型的にはおよそ80%純粋な莢膜多糖の調製がもたらされる。しかしながら、カチオン系デタージェント処理工程で莢膜多糖を沈殿させる。その後の上清みからの沈殿物の分離(例えば、遠心分離による)および再可溶化は困難であり、莢膜多糖のロスが生じることがあり得、それにより収率が低下し得る。また、カチオン系デタージェント処理の効率は莢膜多糖の初期純度に依存し得る。莢膜多糖の初期純度が低いほど、カチオン系デタージェント処理の効率は低くなり得、さらに収率が制限される。したがって、精製工程の複雑さおよび/または費用が少なくて高純度レベルがもたらされる単純化された精製手順が必要である。また、多糖がどのような初期純度であっても良好な収率の莢膜多糖が得られる精製手順が必要である。
開示する実施形態の概要
本発明者らは、製造規模で連鎖球菌属から莢膜多糖(cp)を生産するための方法を提供することにより、発酵プロトコルの単純化のための必要性を満たした。一部の特定の実施形態において、炭素源の線形添加時のpH平衡化のためのアルゴリズムが排除され、他の実施形態では、培地の不必要な成分が除外された。連鎖球菌属の好ましい種はStreptococcus agalactiaeであり、これは、ランスフィールドのB群連鎖球菌属またはGBS、特に、菌株090、H36b、CBJ111、もしくはM781とも称される。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
(項目1)
(a)cpを発現する連鎖球菌属菌株の播種材料を準備すること、および(b)該菌株を発酵によって培養することを含み、前記培養は、培養培地への炭素源の線形添加を含み、該培養培地のpHをモニタリングすることにより該培養を制御するためのアルゴリズムを使用しない、製造規模での莢膜多糖(cp)の生産のための連鎖球菌属の培養方法。
(項目2)
さらに、莢膜多糖を回収する工程(c)を含む、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記連鎖球菌属菌株が、さらにStreptococcus agalactiaeを含む、項目1または項目2に記載の方法。
(項目4)
前記Streptococcus agalactiae菌株が090、H36b、CBJ111、またはM781である、項目3に記載の方法。
(項目5)
前記播種材料の光学密度(OD)が約0.6と約1.8の間である、項目1〜4のいずれか1項に記載の方法。
(項目6)
前記培養培地のpHが約6.0と約7.5の間である、項目1〜5のいずれか1項に記載の方法。
(項目7)
前記pHが約7.3である、項目6に記載の方法。
(項目8)
前記培養培地の温度が約34℃と約38℃の間である、項目1〜7のいずれか1項に記載の方法。
(項目9)
前記温度が約36℃である、項目8に記載の方法。
(項目10)
前記炭素源が、さらにグルコースを含む、項目1〜9のいずれか1項に記載の方法。
(項目11)
前記培養が、さらに、ODが指定レベルに達したら前記炭素源の線形添加が開始されるように培養培地のODをモニタリングすることを含む、項目1〜10のいずれか1項に記載の方法。
(項目12)
前記指定レベルが、cpの高容積生産が達成されるように選択される、項目11に記載の方法。
(項目13)
前記指定レベルが約9.8と約10.2の間である、項目11または項目12に記載の方法。
(項目14)
前記指定レベルが約10である、項目13に記載の方法。
(項目15)
前記培養が、さらに、ODが第1および第2の即時添加レベルに達したら、前記炭素源の線形添加の前に酵母抽出物の2回の即時添加が開始されるように培養培地のODをモニタリングすることを含む、項目11〜14のいずれか1項に記載の方法。
(項目16)
前記第1および第2の即時添加レベルが、cpの高容積生産が達成されるように選択される、項目15に記載の方法。
(項目17)
前記第1の即時添加レベルが約2.8と約3.2の間である、項目16に記載の方法。
(項目18)
前記第1の即時添加レベルが約3.0である、項目17に記載の方法。
(項目19)
前記第2の即時添加レベルが約4.3と約4.7の間である、項目16〜18のいずれか1項に記載の方法。
(項目20)
前記第2の即時添加レベルが約4.5である、項目19に記載の方法。
(項目21)
前記培養培地が、リン酸源、ミネラル源、炭素源、ビタミン源、および連鎖球菌属を増殖させるアミノ酸源を含む規定培地であり、前記ビタミン源が以下の7種類のビタミンのリスト:ビオチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、リボフラビン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシンおよび葉酸から選択される6種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち2種類はパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドでなければならない、項目1〜20のいずれか1項に記載の方法。
(項目22)
前記培養培地が、酵母抽出物、リン酸源、炭素源、ビタミン源、および任意選択で連鎖球菌属を増殖させるアミノ酸源を含む複合培地であり、前記ビタミン源が以下の5種類のビタミンのリスト:ビオチン、ナイアシンアミド、リボフラビン、塩酸チアミンおよび塩酸ピリドキシンから選択される4種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち1種類はビオチンでなければならない、項目1〜20のいずれか1項に記載の方法。
(項目23)
連鎖球菌属菌株、リン酸源、炭素源、ビタミン源、および連鎖球菌属を増殖させるアミノ酸源を含む培養培地であって、前記ビタミン源が以下の7種類のビタミンのリスト:ビオチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、リボフラビン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシンおよび葉酸から選択される6種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち2種類はパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドでなければならない、培養培地。(項目24)
前記連鎖球菌属がStreptococcus agalactiaeである、項目23に記載の培養培地。
(項目25)
前記リン酸源が、K2HPO4、KH2PO4、Na2HPO4・H2O、NaH2PO4・H2O、またはNaClからなる、項目23または項目24に記載の培養培地。
(項目26)
前記炭素源がグルコースである、項目23〜25のいずれか1項に記載の培養培地。
(項目27)
前記ビタミン源が、以下の7種類のビタミンのリスト:ビオチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、リボフラビン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシンおよび葉酸のうちの6種類以下からなり、2種類はパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドでなければならない、項目23〜26のいずれか1項に記載の培養培地。
(項目28)
前記ビタミン源が、以下の7種類のビタミンのリスト:ビオチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、リボフラビン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシンおよび葉酸のうちの5種類以下からなり、2種類はパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドでなければならない、項目23〜26のいずれか1項に記載の培養培地。
(項目29)
前記ビタミン源が、以下の7種類のビタミンのリスト:ビオチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、リボフラビン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシンおよび葉酸のうちの4種類以下からなり、2種類はパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドでなければならない、項目23〜26のいずれか1項に記載の培養培地。
(項目30)
前記ビタミン源が、以下の7種類のビタミンのリスト:ビオチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、リボフラビン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシンおよび葉酸のうちの3種類以下からなり、2種類はパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドでなければならない、項目23〜26のいずれか1項に記載の培養培地。
(項目31)
前記ビタミン源がパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドからなる、項目23〜26のいずれか1項に記載の培養培地。
(項目32)
前記アミノ酸源が、以下の19種類のアミノ酸のリスト:アラニン、アルギニン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、アスパラギン酸、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンのうちの19種類以下からなり、15種類は、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンでなければならない、項目23〜31のいずれか1項に記載の培養培地。
(項目33)
前記アミノ酸源が、以下の19種類のアミノ酸のリスト:アラニン、アルギニン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、アスパラギン酸、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンのうちの18種類以下からなり、15種類は、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンでなければならない、項目23〜31のいずれか1項に記載の培養培地。
(項目34)
前記アミノ酸源が、以下の19種類のアミノ酸のリスト:アラニン、アルギニン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、アスパラギン酸、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンのうちの17種類以下からなり、15種類は、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンでなければならない、項目23〜31のいずれか1項に記載の培養培地。
(項目35)
前記アミノ酸源が、以下の19種類のアミノ酸のリスト:アラニン、アルギニン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、アスパラギン酸、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンのうちの16種類以下からなり、15種類は、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンでなければならない、項目23〜31いずれか1項に記載の培養培地。
(項目36)
前記アミノ酸源が、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンからなる、項目23〜31いずれか1項に記載の培養培地。
(項目37)
連鎖球菌属菌株、酵母抽出物、リン酸源、炭素源、ビタミン源、および任意選択で連鎖球菌属を増殖させるアミノ酸源を含む培養培地であって、前記ビタミン源が、以下の5種類のビタミンのリスト:ビオチン、ナイアシンアミド、リボフラビン、塩酸チアミンおよび塩酸ピリドキシンから選択される4種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち1種類はビオチンでなければならない、培養培地。
(項目38)
前記連鎖球菌属がStreptococcus agalactiaeである、項目37に記載の培養培地。
(項目39)
前記ビタミン源が、以下の5種類のビタミンのリスト:ビオチン、ナイアシンアミド、リボフラビン、塩酸チアミンおよび塩酸ピリドキシンから選択される4種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち1種類はビオチンでなければならない、項目37または項目38に記載の培養培地。
(項目40)
前記ビタミン源が、以下の5種類のビタミンのリスト:ビオチン、ナイアシンアミド、リボフラビン、塩酸チアミンおよび塩酸ピリドキシンから選択される3種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち1種類はビオチンでなければならない、項目37または項目38に記載の培養培地。
(項目41)
前記ビタミン源が、以下の5種類のビタミンのリスト:ビオチン、ナイアシンアミド、リボフラビン、塩酸チアミンおよび塩酸ピリドキシンから選択される2種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち1種類はビオチンでなければならない、項目37または項目38に記載の培養培地。
(項目42)
前記ビタミン源がビオチンからなる、項目37または項目38に記載の培養培地。
(項目43)
付着性フィルターを用いた濾過工程を含む、Streptococcus agalactiaeから莢膜多糖を精製するための方法。
(項目44)
前記莢膜多糖を沈殿させるためのカチオン系デタージェント処理工程、その後の該莢膜多糖の再可溶化工程を含まない、項目43に記載の方法。
(項目45)
前記付着性フィルターがタンパク質付着性フィルターである、項目43または項目44に記載の方法。
(項目46)
前記付着性フィルターがカーボンフィルターである、項目43〜45のいずれか1項に記載の方法。
(項目47)
付着性フィルターを用いた濾過工程の前に、以下の工程:
(i)夾雑タンパク質および/または核酸のアルコール沈殿;ならびに
(ii)ダイアフィルトレーション
を行なう、項目43〜46のいずれか1項に記載の方法。
(項目48)
付着性フィルターを用いた濾過工程の後に、以下の工程:
(iv)再−N−アセチル化;
(v)ダイアフィルトレーション
を行なう、項目43〜47のいずれか1項に記載の方法。
(項目49)
(a)莢膜多糖を含む粗製分離物を準備すること;
(b)該粗製分離物をアルコール溶液と接触させることによって形成されたアルコール沈殿物を取り出すこと;
(c)莢膜多糖を保持したまま低分子量化合物を除去するために濾過すること;および
(d)タンパク質付着性フィルターを用いてタンパク質夾雑物を除去し、精製莢膜多糖を生成すること
を含む、精製莢膜多糖の生産方法。
(項目50)
さらに、前記精製莢膜多糖を再−N−アセチル化する工程(e)を含む、項目49に記載の方法。
(項目51)
さらに、前記精製莢膜多糖を沈殿させる工程(f)を含む、項目50に記載の方法。
(項目52)
さらに、前記莢膜多糖を一成分として有するワクチンを製剤化する工程(g)を含む、項目51に記載の方法。
(項目53)
工程(b)が、核酸夾雑物を沈殿させるが莢膜多糖は沈殿させないのに充分な濃度までアルコール溶液を添加することを含む、項目49〜52のいずれか1項に記載の方法。
(項目54)
前記アルコール溶液がエタノールを含む、項目53に記載の方法。
(項目55)
前記アルコール溶液が、さらにCaCl2を含む、項目53または項目54に記載の方法。
(項目56)
前記アルコール溶液が約10%と約50%の間のエタノール濃度まで添加される、項目54または項目55に記載の方法。
(項目57)
前記アルコール溶液が約30%のエタノール濃度まで添加される、項目56に記載の方法。
(項目58)
前記タンパク質付着性フィルターが活性炭フィルターである、項目49〜57のいずれか1項に記載の方法。
本発明者らは、製造規模で連鎖球菌属から莢膜多糖(cp)を生産するための方法を提供することにより、発酵プロトコルの単純化のための必要性を満たした。一部の特定の実施形態において、炭素源の線形添加時のpH平衡化のためのアルゴリズムが排除され、他の実施形態では、培地の不必要な成分が除外された。連鎖球菌属の好ましい種はStreptococcus agalactiaeであり、これは、ランスフィールドのB群連鎖球菌属またはGBS、特に、菌株090、H36b、CBJ111、もしくはM781とも称される。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
(項目1)
(a)cpを発現する連鎖球菌属菌株の播種材料を準備すること、および(b)該菌株を発酵によって培養することを含み、前記培養は、培養培地への炭素源の線形添加を含み、該培養培地のpHをモニタリングすることにより該培養を制御するためのアルゴリズムを使用しない、製造規模での莢膜多糖(cp)の生産のための連鎖球菌属の培養方法。
(項目2)
さらに、莢膜多糖を回収する工程(c)を含む、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記連鎖球菌属菌株が、さらにStreptococcus agalactiaeを含む、項目1または項目2に記載の方法。
(項目4)
前記Streptococcus agalactiae菌株が090、H36b、CBJ111、またはM781である、項目3に記載の方法。
(項目5)
前記播種材料の光学密度(OD)が約0.6と約1.8の間である、項目1〜4のいずれか1項に記載の方法。
(項目6)
前記培養培地のpHが約6.0と約7.5の間である、項目1〜5のいずれか1項に記載の方法。
(項目7)
前記pHが約7.3である、項目6に記載の方法。
(項目8)
前記培養培地の温度が約34℃と約38℃の間である、項目1〜7のいずれか1項に記載の方法。
(項目9)
前記温度が約36℃である、項目8に記載の方法。
(項目10)
前記炭素源が、さらにグルコースを含む、項目1〜9のいずれか1項に記載の方法。
(項目11)
前記培養が、さらに、ODが指定レベルに達したら前記炭素源の線形添加が開始されるように培養培地のODをモニタリングすることを含む、項目1〜10のいずれか1項に記載の方法。
(項目12)
前記指定レベルが、cpの高容積生産が達成されるように選択される、項目11に記載の方法。
(項目13)
前記指定レベルが約9.8と約10.2の間である、項目11または項目12に記載の方法。
(項目14)
前記指定レベルが約10である、項目13に記載の方法。
(項目15)
前記培養が、さらに、ODが第1および第2の即時添加レベルに達したら、前記炭素源の線形添加の前に酵母抽出物の2回の即時添加が開始されるように培養培地のODをモニタリングすることを含む、項目11〜14のいずれか1項に記載の方法。
(項目16)
前記第1および第2の即時添加レベルが、cpの高容積生産が達成されるように選択される、項目15に記載の方法。
(項目17)
前記第1の即時添加レベルが約2.8と約3.2の間である、項目16に記載の方法。
(項目18)
前記第1の即時添加レベルが約3.0である、項目17に記載の方法。
(項目19)
前記第2の即時添加レベルが約4.3と約4.7の間である、項目16〜18のいずれか1項に記載の方法。
(項目20)
前記第2の即時添加レベルが約4.5である、項目19に記載の方法。
(項目21)
前記培養培地が、リン酸源、ミネラル源、炭素源、ビタミン源、および連鎖球菌属を増殖させるアミノ酸源を含む規定培地であり、前記ビタミン源が以下の7種類のビタミンのリスト:ビオチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、リボフラビン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシンおよび葉酸から選択される6種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち2種類はパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドでなければならない、項目1〜20のいずれか1項に記載の方法。
(項目22)
前記培養培地が、酵母抽出物、リン酸源、炭素源、ビタミン源、および任意選択で連鎖球菌属を増殖させるアミノ酸源を含む複合培地であり、前記ビタミン源が以下の5種類のビタミンのリスト:ビオチン、ナイアシンアミド、リボフラビン、塩酸チアミンおよび塩酸ピリドキシンから選択される4種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち1種類はビオチンでなければならない、項目1〜20のいずれか1項に記載の方法。
(項目23)
連鎖球菌属菌株、リン酸源、炭素源、ビタミン源、および連鎖球菌属を増殖させるアミノ酸源を含む培養培地であって、前記ビタミン源が以下の7種類のビタミンのリスト:ビオチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、リボフラビン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシンおよび葉酸から選択される6種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち2種類はパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドでなければならない、培養培地。(項目24)
前記連鎖球菌属がStreptococcus agalactiaeである、項目23に記載の培養培地。
(項目25)
前記リン酸源が、K2HPO4、KH2PO4、Na2HPO4・H2O、NaH2PO4・H2O、またはNaClからなる、項目23または項目24に記載の培養培地。
(項目26)
前記炭素源がグルコースである、項目23〜25のいずれか1項に記載の培養培地。
(項目27)
前記ビタミン源が、以下の7種類のビタミンのリスト:ビオチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、リボフラビン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシンおよび葉酸のうちの6種類以下からなり、2種類はパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドでなければならない、項目23〜26のいずれか1項に記載の培養培地。
(項目28)
前記ビタミン源が、以下の7種類のビタミンのリスト:ビオチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、リボフラビン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシンおよび葉酸のうちの5種類以下からなり、2種類はパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドでなければならない、項目23〜26のいずれか1項に記載の培養培地。
(項目29)
前記ビタミン源が、以下の7種類のビタミンのリスト:ビオチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、リボフラビン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシンおよび葉酸のうちの4種類以下からなり、2種類はパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドでなければならない、項目23〜26のいずれか1項に記載の培養培地。
(項目30)
前記ビタミン源が、以下の7種類のビタミンのリスト:ビオチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、リボフラビン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシンおよび葉酸のうちの3種類以下からなり、2種類はパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドでなければならない、項目23〜26のいずれか1項に記載の培養培地。
(項目31)
前記ビタミン源がパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドからなる、項目23〜26のいずれか1項に記載の培養培地。
(項目32)
前記アミノ酸源が、以下の19種類のアミノ酸のリスト:アラニン、アルギニン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、アスパラギン酸、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンのうちの19種類以下からなり、15種類は、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンでなければならない、項目23〜31のいずれか1項に記載の培養培地。
(項目33)
前記アミノ酸源が、以下の19種類のアミノ酸のリスト:アラニン、アルギニン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、アスパラギン酸、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンのうちの18種類以下からなり、15種類は、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンでなければならない、項目23〜31のいずれか1項に記載の培養培地。
(項目34)
前記アミノ酸源が、以下の19種類のアミノ酸のリスト:アラニン、アルギニン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、アスパラギン酸、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンのうちの17種類以下からなり、15種類は、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンでなければならない、項目23〜31のいずれか1項に記載の培養培地。
(項目35)
前記アミノ酸源が、以下の19種類のアミノ酸のリスト:アラニン、アルギニン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、アスパラギン酸、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンのうちの16種類以下からなり、15種類は、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンでなければならない、項目23〜31いずれか1項に記載の培養培地。
(項目36)
前記アミノ酸源が、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンからなる、項目23〜31いずれか1項に記載の培養培地。
(項目37)
連鎖球菌属菌株、酵母抽出物、リン酸源、炭素源、ビタミン源、および任意選択で連鎖球菌属を増殖させるアミノ酸源を含む培養培地であって、前記ビタミン源が、以下の5種類のビタミンのリスト:ビオチン、ナイアシンアミド、リボフラビン、塩酸チアミンおよび塩酸ピリドキシンから選択される4種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち1種類はビオチンでなければならない、培養培地。
(項目38)
前記連鎖球菌属がStreptococcus agalactiaeである、項目37に記載の培養培地。
(項目39)
前記ビタミン源が、以下の5種類のビタミンのリスト:ビオチン、ナイアシンアミド、リボフラビン、塩酸チアミンおよび塩酸ピリドキシンから選択される4種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち1種類はビオチンでなければならない、項目37または項目38に記載の培養培地。
(項目40)
前記ビタミン源が、以下の5種類のビタミンのリスト:ビオチン、ナイアシンアミド、リボフラビン、塩酸チアミンおよび塩酸ピリドキシンから選択される3種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち1種類はビオチンでなければならない、項目37または項目38に記載の培養培地。
(項目41)
前記ビタミン源が、以下の5種類のビタミンのリスト:ビオチン、ナイアシンアミド、リボフラビン、塩酸チアミンおよび塩酸ピリドキシンから選択される2種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち1種類はビオチンでなければならない、項目37または項目38に記載の培養培地。
(項目42)
前記ビタミン源がビオチンからなる、項目37または項目38に記載の培養培地。
(項目43)
付着性フィルターを用いた濾過工程を含む、Streptococcus agalactiaeから莢膜多糖を精製するための方法。
(項目44)
前記莢膜多糖を沈殿させるためのカチオン系デタージェント処理工程、その後の該莢膜多糖の再可溶化工程を含まない、項目43に記載の方法。
(項目45)
前記付着性フィルターがタンパク質付着性フィルターである、項目43または項目44に記載の方法。
(項目46)
前記付着性フィルターがカーボンフィルターである、項目43〜45のいずれか1項に記載の方法。
(項目47)
付着性フィルターを用いた濾過工程の前に、以下の工程:
(i)夾雑タンパク質および/または核酸のアルコール沈殿;ならびに
(ii)ダイアフィルトレーション
を行なう、項目43〜46のいずれか1項に記載の方法。
(項目48)
付着性フィルターを用いた濾過工程の後に、以下の工程:
(iv)再−N−アセチル化;
(v)ダイアフィルトレーション
を行なう、項目43〜47のいずれか1項に記載の方法。
(項目49)
(a)莢膜多糖を含む粗製分離物を準備すること;
(b)該粗製分離物をアルコール溶液と接触させることによって形成されたアルコール沈殿物を取り出すこと;
(c)莢膜多糖を保持したまま低分子量化合物を除去するために濾過すること;および
(d)タンパク質付着性フィルターを用いてタンパク質夾雑物を除去し、精製莢膜多糖を生成すること
を含む、精製莢膜多糖の生産方法。
(項目50)
さらに、前記精製莢膜多糖を再−N−アセチル化する工程(e)を含む、項目49に記載の方法。
(項目51)
さらに、前記精製莢膜多糖を沈殿させる工程(f)を含む、項目50に記載の方法。
(項目52)
さらに、前記莢膜多糖を一成分として有するワクチンを製剤化する工程(g)を含む、項目51に記載の方法。
(項目53)
工程(b)が、核酸夾雑物を沈殿させるが莢膜多糖は沈殿させないのに充分な濃度までアルコール溶液を添加することを含む、項目49〜52のいずれか1項に記載の方法。
(項目54)
前記アルコール溶液がエタノールを含む、項目53に記載の方法。
(項目55)
前記アルコール溶液が、さらにCaCl2を含む、項目53または項目54に記載の方法。
(項目56)
前記アルコール溶液が約10%と約50%の間のエタノール濃度まで添加される、項目54または項目55に記載の方法。
(項目57)
前記アルコール溶液が約30%のエタノール濃度まで添加される、項目56に記載の方法。
(項目58)
前記タンパク質付着性フィルターが活性炭フィルターである、項目49〜57のいずれか1項に記載の方法。
一態様により、cpを発現する連鎖球菌属菌株の播種材料を提供する。一実施形態において、播種材料の光学密度(OD)は、好ましくは0.6〜1.8であり、これは、播種材料の対数増殖中期である。報告するOD値は590nmにおいて測定したものであるが、ODは、所与の実験の吸光度波長に基づいて変換され得る。
別の態様により、発酵による連鎖球菌属菌株の培養方法を提供する。一実施形態において、培養時の培養培地のpHは6.0〜7.5、好ましくは約7.3である。別の実施形態において、培養時の培養培地の温度は34〜38℃、好ましくは約36℃である。
別の態様により、酵母抽出物の2回の即時添加後、炭素源の線形添加を含む、連鎖球菌属菌株の培養方法を提供する。線形添加に好ましい炭素源はグルコースである。各添加は、細菌増殖速度を調節することによってcpの高容積生産が達成されるように、および最大の血清型特異的cpが生産されるよう微生物を適応させるために選択された指定ODレベルで開始される。
一実施形態において、酵母抽出物の第1の即時添加は、2.8〜3.2、好ましくは約3.0のODレベルで開始される。別の実施形態において、酵母抽出物の第2の即時添加は、4.3〜4.7、好ましくは約4.5のODレベルで開始される。別の実施形態において、炭素源の線形添加は、9.8〜10.0、好ましくは約10のODレベルで開始される。
全般的に、アルゴリズムなしでの炭素源の線形添加は、培養培地のpHをモニタリングすることにより培養を制御するためアルゴリズムを使用する以前の複雑なフィードバッチ式発酵プロセスと比べた改善点である。
別の態様により、規定培地または複合培地を含む培養培地を提供する。規定培地は、リン酸源、ミネラル源、炭素源、ビタミン源、および連鎖球菌属を増殖させるアミノ酸源を含む。ビタミン源は、以下の7種類のビタミンのリスト:ビオチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、リボフラビン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシンおよび葉酸から選択される6種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち2種類はパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドでなければならない。
複合培地は、複合抽出物(好ましくは酵母抽出物)、リン酸源、炭素源、ビタミン源、および任意選択で連鎖球菌属を増殖させるアミノ酸源を含む。ビタミン源は、以下の5種類のビタミンのリスト:ビオチン、ナイアシンアミド、リボフラビン、塩酸チアミンおよび塩酸ピリドキシンから選択される4種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち1種類はビオチンでなければならない(すなわち、5種類のうち4種類は培地に含まれるが、5種類目は、複合抽出物の天然成分として添加されない(other that))。好ましい実施形態において、ビタミン源は3種類以下、2種類以下、またはビオチンのみを有する。
さらに、本発明は、リン酸源、ミネラル源、炭素源、ビタミン源、および連鎖球菌属を増殖させるアミノ酸源で構成された規定培地である培養培地を含む組成物を提供する。この場合もまた、好ましい連鎖球菌属菌株はStreptococcus agalactiae、特に、菌株090、H36b、CBJ111、またはM781である。一実施形態において、リン酸源は、K2HPO4、KH2PO4、Na2HPO4・H2O、NaH2PO4・H2O、またはNaClからなる。一実施形態において、好ましい炭素源はグルコースである。
別の実施形態において、ビタミン源は、以下の7種類のビタミンのリスト:ビオチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、リボフラビン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシンおよび葉酸から選択される6種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち2種類はパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドでなければならない。
別の実施形態では、ビタミン源が、以下の7種類のビタミンのリスト:ビオチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、リボフラビン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシンおよび葉酸のうちの5種類以下からなり、2種類はパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドでなければならない。
別の実施形態では、ビタミン源が、以下の7種類のビタミンのリスト:ビオチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、リボフラビン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシンおよび葉酸のうちの4種類以下からなり、2種類はパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドでなければならない。
別の実施形態では、ビタミン源が、以下の7種類のビタミンのリスト:ビオチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、リボフラビン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシンおよび葉酸のうちの3種類以下からなり、2種類はパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドでなければならない。
別の実施形態では、ビタミン源が、パントテン酸カルシウムとナイアシンアミドからなる。
別の実施形態において、アミノ酸源は、以下の19種類のアミノ酸のリスト:アラニン、アルギニン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、アスパラギン酸、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンのうちの19種類以下からなり、15種類は、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンでなければならない。
別の実施形態では、アミノ酸源が、以下の19種類のアミノ酸のリスト:アラニン、アルギニン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、アスパラギン酸、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンのうちの18種類以下からなり、15種類は、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンでなければならない。
別の実施形態では、アミノ酸源が、以下の19種類のアミノ酸のリスト:アラニン、アルギニン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、アスパラギン酸、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンのうちの17種類以下からなり、15種類は、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンでなければならない。
別の実施形態では、アミノ酸源が、以下の19種類のアミノ酸のリスト:アラニン、アルギニン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、アスパラギン酸、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンのうちの16種類以下からなり、15種類は、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンでなければならない。
別の実施形態では、アミノ酸源が、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンからなる。
別の態様により、複合抽出物(好ましくは酵母抽出物)、リン酸源、炭素源、ビタミン源、および任意選択で連鎖球菌属を増殖させるアミノ酸源で構成された複合培地である培養培地を含む組成物を提供する。この場合もまた、好ましい連鎖球菌属菌株はStreptococcus agalactiae、特に、菌株090、H36b、CBJ111、またはM781である。
一実施形態において、ビタミン源は、以下の5種類のビタミンのリスト:ビオチン、ナイアシンアミド、リボフラビン、塩酸チアミンおよび塩酸ピリドキシンから選択される4種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち1種類はビオチンでなければならない。
別の実施形態では、ビタミン源が、以下の5種類のビタミンのリスト:ビオチン、ナイアシンアミド、リボフラビン、塩酸チアミンおよび塩酸ピリドキシンから選択される3種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち1種類はビオチンでなければならない。
別の実施形態では、ビタミン源が、以下の5種類のビタミンのリスト:ビオチン、ナイアシンアミド、リボフラビン、塩酸チアミンおよび塩酸ピリドキシンから選択される2種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち1種類はビオチンでなければならない。
別の実施形態では、ビタミン源がビオチンである。
前述の態様および実施形態は、互いに排他的であることを意図せず、互いに組み合わされ得、互いに排他的である範囲(to the extend)を除き、任意の他の態様または実施形態が本明細書において開示される。
さらに、本発明は、付着性フィルターを用いた濾過工程を含む、典型的にはStreptococcus agalactiaeからの莢膜多糖の精製方法を提供する。付着性フィルターは、莢膜多糖中に存在し得る夾雑物(例えば、タンパク質および/または核酸)と結合するが、莢膜多糖が該フィルターを通過すること可能である。本発明者らは、莢膜多糖を精製するために、WO2007/052168およびWO2006/082527に記載のカチオン系デタージェント処理の代わりに、付着性フィルターが使用され得ることを見い出した。付着性フィルターの使用により、カチオン系デタージェントを適用する必要がなくなり、これは、該方法のこの段階において莢膜多糖の沈殿を行なわないことを意味する。これにより、上清みから沈殿物を分離する必要がなくなり、該方法が単純化され、この分離時に起こり得る莢膜多糖のロス(あれば)が抑制される。したがって、付着性フィルターの使用により、精製方法の収率が改善され得る。また、付着性フィルターの効率は、莢膜多糖の初期純度に対する依存性が低い。
当業者には、この方法における使用のための適当な付着性フィルターを特定することが可能である。典型的には、莢膜多糖中の主な夾雑物はタンパク質であり、したがって、付着性フィルターはタンパク質付着性フィルターである。本発明者らは、カーボンフィルターが特に適していることを見い出した。これは、典型的には活性炭(例えば、粒状炭素床として、または圧縮もしくは押出カーボンブラックとして)で構成されており、試料精製のためのフィルターとしての機能を果たす。
当業者には、適当なカーボンフィルター特定することが可能である。典型的には、本発明における使用のためのカーボンフィルターは、マトリックス内に固定化された活性炭を含むものである。マトリックスは、試料に対して透過性である任意の多孔質フィルター媒体であり得る。マトリックスは、支持体物質および/または結合体物質を含むものであってもよい。支持体物質は、合成ポリマーまたは天然起源のポリマーであり得る。好適な合成ポリマーとしては、ポリスチレン、ポリアクリルアミドおよびポリメタクリル酸メチルが挙げられ得、一方、天然起源のポリマーとしては、セルロース、多糖類およびデキストラン、アガロースが挙げられ得る。典型的には、ポリマー支持体物質は、機械的剛性をもたらす繊維網目の形態である。結合体物質は樹脂であり得る。マトリックスは、膜シートの形態を有するものであってもよい。典型的には、マトリックス内に固定化された活性炭は、カートリッジの形態であり得る。カートリッジは、マトリックス内に固定化され、膜シートの形態に作製された粉末活性炭を内包する内蔵式の存在体である。膜シートは、プラスチックの透過性支持体内に保持され、ディスクを形成したものであってもよい。あるいはまた、膜シートをらせん状に巻き上げてもよい。フィルター表面積を大きくするため、いくつかのディスクを互いの上に積層してもよい。特に、互いの上に積層したディスクは、炭素処理された試料をフィルターから回収し、取り出すための中心コアパイプを有する。積層ディスクの構成は、半円筒形であってもよい。カーボンフィルター内の活性炭は、種々の原料、例えば、泥炭、亜炭、木材またはココナッツの殻に由来するものであり得る。当該技術分野で知られた任意の方法(水蒸気処理または化学的処理など)が炭素の活性化に使用され得る。本発明において、マトリックス内に固定化された活性炭をハウジング内に配置し、独立したフィルターユニットを形成してもよい。各フィルターユニットは、個々に精製対象試料の供給口および排出口を有する。本発明において使用され得るフィルターユニットの例は、Cuno Inc.(Meriden,USA)製またはPall Corporation(East Hill,USA)製の炭素カートリッジである。
特に、本発明者らは、CUNO zetacarbonTMフィルターが本発明における使用に適していることを見い出した。このカーボンフィルターは、活性炭粉末が内部に封入され、所定の位置で樹脂に結合されたセルロースマトリックスで構成されている。
本発明のこの態様の方法のための出発材料は、以下の「出発材料」という標題のセクションに記載の出発材料の1つであり得る。この方法には、さらに、以下の「アルコール沈殿およびカチオン交換」、「ダイアフィルトレーション」、「再−N−アセチル化」、「さらなるダイアフィルトレーション」、「コンジュゲートの作製」および/または「他の工程」という標題のセクションに記載の工程の1つ以上を含めてもよい。したがって、典型的な工程シーケンスは、i)「アルコール沈殿およびカチオン交換」という標題のセクションに記載の工程(1つまたは複数);ii)セクション「ダイアフィルトレーション」に記載の工程(1つまたは複数);iii)上記の付着性フィルターを用いた濾過工程;iv)「再−N−アセチル化」という標題のセクションに記載の工程(1つまたは複数);およびv)「さらなるダイアフィルトレーション」という標題のセクションに記載の工程(1つまたは複数)であり得る。次いで、このプロセスの後、「コンジュゲートの作製」という標題のセクションに記載の工程(1つまたは複数)を続けてもよい。最後に、このプロセスの後、「他の工程」という標題のセクションに記載の工程(1つまたは複数)を続けてもよい。
該方法には、さらに、以下の「カチオン系デタージェント処理」および「再可溶化」という標題のセクションに記載の工程の1つ以上を含めてもよいが、典型的には、これらの工程は、濾過が本発明の方法において付着性フィルターを用いて行なわれる場合、莢膜多糖を沈殿させるためのカチオン系デタージェント処理、およびその後の該多糖の再可溶化が一般的には必要とされないため、省略される。したがって、本発明では、具体的に、付着性フィルターを用いた濾過工程を含み、莢膜多糖を沈殿させるためのカチオン系デタージェント処理工程、その後の莢膜多糖の再可溶化工程を含まない、典型的にはStreptococcus agalactiaeからの莢膜多糖の精製方法が想定される。
さらに、本発明はまた、製造規模での連鎖球菌属からの莢膜多糖(cp)の精製方法を提供する。連鎖球菌属の好ましい種はStreptococcus agalactiaeであり、これは、ランスフィールドのB群連鎖球菌属またはGBS、特に、菌株090、H36b、CBJ111、もしくはM781とも称される。
好ましい実施形態において、精製莢膜多糖の生産方法は、以下の工程:(a)莢膜多糖を含む粗製分離株を準備する工程;(b)該粗製分離株をアルコール溶液と接触させることによって形成されたアルコール沈殿物を取り出す工程;(c)莢膜多糖を保持したまま低分子量化合物を除去するために濾過する工程;および(d)タンパク質付着性フィルターを用いてタンパク質夾雑物を除去し、精製莢膜多糖を得る工程の1つ以上を含む。好ましい実施形態において、該方法は前述の工程のすべてを含む。より好ましい実施形態において、方法では、デタージェント沈殿が省略される。
一部の特定の実施形態において、1つ以上のさらなる工程、例えば、(e)精製莢膜多糖を再−N−アセチル化する工程、(f)精製莢膜多糖を沈殿させる工程;および/または(g)莢膜多糖を一成分として有するワクチンを製剤化する工程が行なわれ得る。
一部の特定の実施形態において、アルコール溶液は、核酸夾雑物を沈殿させるが莢膜多糖は沈殿させないのに充分な濃度まで添加される。好ましい実施形態において、アルコールはエタノールであり、好ましくは約10%〜約50%のエタノール濃度まで、より好ましくは約30%のエタノール濃度まで添加される。アルコール溶液は、任意選択でカチオン、好ましくは金属カチオン、より好ましくは二価カチオン、最も好ましくはカルシウムを含むものであり得る。
一部の特定の実施形態(embodiement)において、タンパク質付着性フィルターは活性炭フィルターである。
好ましい実施形態の詳細な説明
本発明者らは、製造規模での高収率のcpが、任意の連鎖球菌属菌株でフィードバッチ式培養、すなわち、有限容量の新鮮培地中への菌体播種によって開始され、該菌体を培養した後、1回の回収によって終結され、付加的な栄養素は、最初の供給源の栄養素を消費させてから培養物に添加する培養を用いて得られ得ることを見い出した。かかる高収率は、連続式培養を用いて得られるものと同等であるか、またはより良好である。さらに、本明細書において開示した方法は、連続式培養の安定性と汚染の問題を有する傾向がない。さらに、本発明者らは、不純物が有意に改善されるとともに、プロトコルが単純で製造規模が廉価に維持される最適化精製プロトコルを開発した。
本発明者らは、製造規模での高収率のcpが、任意の連鎖球菌属菌株でフィードバッチ式培養、すなわち、有限容量の新鮮培地中への菌体播種によって開始され、該菌体を培養した後、1回の回収によって終結され、付加的な栄養素は、最初の供給源の栄養素を消費させてから培養物に添加する培養を用いて得られ得ることを見い出した。かかる高収率は、連続式培養を用いて得られるものと同等であるか、またはより良好である。さらに、本明細書において開示した方法は、連続式培養の安定性と汚染の問題を有する傾向がない。さらに、本発明者らは、不純物が有意に改善されるとともに、プロトコルが単純で製造規模が廉価に維持される最適化精製プロトコルを開発した。
本開示により、連鎖球菌属を培養するためのプロセスであって、連鎖球菌属をフィードバッチ式培養で培養するプロセスを提供する。連鎖球菌属の一部の特定の菌株は、培養中に生産されるcpが典型的には低レベルであるため、cpの「不良産生菌株(bad producer)」であることが知られている。かかる不良産生菌株の例としては、GBS菌株DK21および2603が挙げられる。しかしながら、本明細書において開示した方法を使用すると、cpの生産レベルが低いことがわかっているかかる菌株からでさえも高レベルのcpが得られ得る。したがって、本発明は、「不良産生菌株」の場合、バッチ式または連続式培養条件下で、該菌株によって<30mg cp/gCDWまたは<10mg cp/gCDWが生産され得る、フィードバッチ式培養において連鎖球菌属を培養することを含む、連鎖球菌属菌株からのcp収率の増大方法を提供する。
好ましくは、本発明は、高収率のcpが生産されるフィードバッチ式培養での連鎖球菌属の培養方法を提供する。好ましくは、cpの収率は、不良産生菌株の場合では10mg/gCDW以上(好ましくは15、20、25、または30またはそれ以上)であり、他の菌株の場合では30mg/gCDW以上(好ましくは40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200またはそれ以上)である。好ましくは、培養培地からのcpの収率は、10mg/L以上(例えば、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300またはそれ以上)である。より好ましくは、培養培地からのcpの収率は50mg/L以上(例えば、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650またはそれ以上)である。したがって、本発明により、連続式培養と比べて単位容積あたりの収率がさらに高いcpの生産が可能となる。場合によっては、単位容積あたりの収率は、連続式培養を用いて生産される量の少なくとも2倍、より好ましくは連続式培養を用いて生産される量の2.5倍または3倍であり得る。
また、本発明は、酵母抽出物の2回の即時添加後、炭素源の線形添加を含み、好ましくは、pHをモニタリングするためのアルゴリズムの使用を伴わない、発酵による連鎖球菌属菌株の培養方法を提供する。線形添加に好ましい炭素源はグルコースである。各添加は、細菌増殖速度を調節することによってcpの高容積生産が達成されるように、および最大の血清型特異的cpが生産されるよう微生物を適応させるために選択される指定ODレベルで開始される。
一実施形態において、酵母抽出物の第1の即時添加は、2.8〜3.2、好ましくは約3.0のODレベルで開始される。別の実施形態において、酵母抽出物の第2の即時添加は、4.3〜4.7、好ましくは約4.5のODレベルで開始される。別の実施形態において、炭素源の線形添加は、9.8〜10.0、好ましくは約10のODレベルで開始される。
全般的に、炭素源の線形添加は、培養培地のpHをモニタリングすることにより培養を制御するためアルゴリズムを使用する以前の複雑なフィードバッチ式発酵プロセスと比べた改善点である。
培養後、細菌に、cpを精製するため、およびこれを担体タンパク質にコンジュゲートするためのさらなる処理工程を行なってもよい。したがって、本発明は、さらに、細菌からcpを精製する工程、および莢膜糖を担体タンパク質にコンジュゲートしてタンパク質−糖コンジュゲートを得る工程(図1〜2参照)を含むものであってもよい。精製cpに、医薬調製物を調製するためのさらなる処理工程を行なってもよい。好ましい実施形態において、精製は、本明細書に開示した改善された精製プロトコルを用いて行なわれる。
連鎖球菌属
用語「連鎖球菌属」は、S.agalactiae(GBS)、S.pyogenes(GAS)、S.pneumoniae(pneumococcus)およびS.mutansから選択され得る細菌をいう。あるいはまた、連鎖球菌属は、S.thermophilusまたはS.lactisであってもよい。好ましくは、連鎖球菌属はGBSである。使用される連鎖球菌属がGBSである場合、好ましくは、選択される血清型は1a、1b、3、4または5である。好ましくは、使用されるGBS菌株は090(1a)、7357(1b)、H36b(1b)、DK21(2)、M781(3)、2603(5)、またはCJB111(5)である。図3A〜B参照。使用される連鎖球菌属がS.pneumoniaeである場合、好ましくは、選択される血清型は、4、6B、9V、14、18C、19Fおよび23Fのうちの1種類以上または全部である。また、好ましくは血清型1が選択され得る。好ましくは、選択される血清型は、1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19Fおよび23Fの1種類以上または全部である。
用語「連鎖球菌属」は、S.agalactiae(GBS)、S.pyogenes(GAS)、S.pneumoniae(pneumococcus)およびS.mutansから選択され得る細菌をいう。あるいはまた、連鎖球菌属は、S.thermophilusまたはS.lactisであってもよい。好ましくは、連鎖球菌属はGBSである。使用される連鎖球菌属がGBSである場合、好ましくは、選択される血清型は1a、1b、3、4または5である。好ましくは、使用されるGBS菌株は090(1a)、7357(1b)、H36b(1b)、DK21(2)、M781(3)、2603(5)、またはCJB111(5)である。図3A〜B参照。使用される連鎖球菌属がS.pneumoniaeである場合、好ましくは、選択される血清型は、4、6B、9V、14、18C、19Fおよび23Fのうちの1種類以上または全部である。また、好ましくは血清型1が選択され得る。好ましくは、選択される血清型は、1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19Fおよび23Fの1種類以上または全部である。
さらに、本発明の方法を用いて培養物は均一であってもよく(すなわち、連鎖球菌属の単一の菌種または菌株からなる)、不均一であってもよい(すなわち、連鎖球菌属の2種類以上の菌種または菌株を含む)。好ましくは、培養物は均一である。
使用される連鎖球菌属は、野生型菌株であってもよく、遺伝的に修飾されたものであってもよい。例えば、これは、非天然の莢膜多糖もしくは異種多糖が生産されるように、または収率が増大するように修飾され得る。
生産プロセスの概要
GBSの生産は、4つの部:(1)各cpの発酵による生産とその一次回収;(2)精密濾過の透過物の精製;(3)乾燥精製cpの構築;および(4)複合糖質生体分子の特性評価に分けられ得る。
GBSの生産は、4つの部:(1)各cpの発酵による生産とその一次回収;(2)精密濾過の透過物の精製;(3)乾燥精製cpの構築;および(4)複合糖質生体分子の特性評価に分けられ得る。
第1の工程は、パイロット規模の発酵ホールにおいて最適化され得、発酵によるバイオマスの生産、バイオマスの連続流遠心分離、ペレット(あるいは菌体ペースト)の回収、微生物の不活化とcpの放出、および回収透過物と菌体ペーストの最終の精密濾過からなる。発酵は、(1)播種材料の調製、(2)発酵、バイオマスの遠心分離、ペレットの化学的処理およびペレットの精密濾過(図4に表示)からなる。
本発明は製造規模でのcpの作製方法を提供し、該方法は、cpを発現する連鎖球菌属菌株の播種材料を準備するための方法、該菌株を発酵によって培養するための方法を含む。該培養は、培養培地のpHをモニタリングすることにより培養を制御するアルゴリズムとは反対に、ODが指定の添加レベルに達したら、酵母抽出物の2回の即時添加後、培養培地への炭素源の線形添加が促されるような培養培地の光学密度(OD)のモニタリングからなる。
播種材料の培養
播種材料の培養は、121℃でオートクレーブを用いて滅菌した振盪フラスコ内で行なわれ得る。播種材料には、複合培地(酵母抽出物、Na2HPO4・2H2O、NaH2PO4・H2O、およびグルコース一水和物(中性pHおよそ7.3を有する)からなる)、ビタミン溶液(NaOH中に希釈したチアミン、リボフラビン、ピリドキシンHCl、およびナイアシンアミドからなる)、およびビオチン溶液が含まれる。好ましい実施形態において、ビタミン溶液は除外され、ビオチン溶液がビタミン補給物として使用される。
播種材料の培養は、121℃でオートクレーブを用いて滅菌した振盪フラスコ内で行なわれ得る。播種材料には、複合培地(酵母抽出物、Na2HPO4・2H2O、NaH2PO4・H2O、およびグルコース一水和物(中性pHおよそ7.3を有する)からなる)、ビタミン溶液(NaOH中に希釈したチアミン、リボフラビン、ピリドキシンHCl、およびナイアシンアミドからなる)、およびビオチン溶液が含まれる。好ましい実施形態において、ビタミン溶液は除外され、ビオチン溶液がビタミン補給物として使用される。
好ましい実施形態において、各フラスコには、2.75±0.25mLの作業種菌株が播種される。培養物は、およそ35℃で、およそ200rpmでの攪拌下、インキュベータ内におよそ4時間維持される。この期間後、バイオマス濃度を、590nmにおけるODを測定し、グラム染色を行なうことをことにより評価した。OD590nmの値がおよそ0.6〜1.8である場合、およびグラム染色によってグラム陽性球菌のみが得られる場合、フラスコの内容物を、発酵槽のインキュベーションラインに接続された熱滅菌したビン内にプールする。
播種材料の調製時、好ましい条件は以下のとおり:培地の初期pHは7.3±0.1であり、作業種菌株の容量は2.5〜3.0mL/フラスコであり、インキュベーション温度は35±1℃であり、攪拌速度は200±10rpmである。フラスコ内での培養終了時、好ましい最終OD590nmは0.6〜1.8であり、好ましいグラム染色では、グラム陽性球菌のみが得られる。プールしたビンにおいて、好ましい培養物純度は、夾雑物がないような純度である。最後に、好ましいインキュベーション時間は3〜5時間である。
フィードバッチ式発酵プロセス
本発明は、フィードバッチ式プロセスを用いた製造規模での連鎖球菌属の改善された培養方法を提供する(図6〜18参照)。フィードバッチ式培養は、固定容量フィードバッチ式または可変容量フィードバッチ式のいずれかであり得る。固定容量フィードバッチ式培養では、限定的基質を、培養物を希釈することなく供給する(例えば、濃縮液もしくはガス状物を使用、または透析の使用による)。可変容量フィードバッチ式培養では、発酵期間において、基質供給量によって容量を変更する。
本発明は、フィードバッチ式プロセスを用いた製造規模での連鎖球菌属の改善された培養方法を提供する(図6〜18参照)。フィードバッチ式培養は、固定容量フィードバッチ式または可変容量フィードバッチ式のいずれかであり得る。固定容量フィードバッチ式培養では、限定的基質を、培養物を希釈することなく供給する(例えば、濃縮液もしくはガス状物を使用、または透析の使用による)。可変容量フィードバッチ式培養では、発酵期間において、基質供給量によって容量を変更する。
300L容発酵槽内での発酵プロセス中、好ましい条件は以下のとおり:培養温度は36±1℃に設定、発酵槽内部の過圧はおよそ0.2バールに設定、pHは7.3±0.1に設定し、4M NaOHを用いて調整、初期攪拌は50rpmに設定、初期空気流は20L/分に設定、発酵槽内の起泡剤レベルは、可視的にモニタリングし、必要であれば消泡剤PPG 2500を用いて調整、溶存酸素圧(tension)(DOT)は30%に設定し、攪拌(50〜350rpm)によってカスケード状に調節、空気の空気流(20〜100L/分、および酸素流(0〜100L/分)である。
本発明は、指定のODレベルでの2回の酵母抽出物の即時添加後、培養培地への炭素源の線形添加を提供する。試料は、播種後の2時間の発酵のバッチ相中に採取し、OD590nmを測定する。試料を15分ごとに、OD590nmが3に達するまで採取し、この時点で最初の即時バッチ添加を、150g/Lの酵母抽出物溶液を用いて開始する。最初の添加のおよそ45分後、OD590nmを再度測定する。試料を15分ごとに、OD590nmが5に達するまで採取し、この時点で、第2の即時バッチ添加を、150g/Lの酵母抽出物溶液を用いて開始する。OD590nmが10〜12に達したら、線形添加を開始する。この線形添加時では、試料を1時間ごとに採取し、OD590nmを測定する。線形添加をおよそ3時間持続させ、この時点で、パラメータの自動制御を停止する。攪拌は100rpmに、および温度は30℃に調節する。
培養培地
連鎖球菌属種の増殖の維持に適した任意の型の液状培養培地が使用され得る。好ましい培地としては、複合培地(コロンビア寒天培地(broth)、LB、Todd−Hewitt、OC培地、血液寒天培地またはブレインハートインフュージョンなど);半規定培地(MCDMなど);連鎖球菌属用の化学的に規定される培地(M1、MC、FMC(参考文献11)、またはC−48(参考文献12)など);ならびに必要な栄養要求性成分を含む真核生物細胞株の培養のために構成した培地(RPMI、スペント培地、マッコイ培地およびイーグル培地など)が挙げられる。典型的な培養培地には、酵母抽出物、ならびに増殖に不可欠な他の要素、例えば、脂質(リノール酸もしくはオレイン酸などの長鎖脂肪酸)、ステロイド類(コレステロールなど)、プリンおよびピリミジン、ミネラル類、ビタミン類ならびに増殖因子、アミノ酸(L−および/またはD−体)および/または化学元素もしくは無機イオン(Fe、K、Mg、Mn、Ca、Co、Cu、Pおよび/またはZnなど)が含まれる。培地の濃度を増大させることによって、より高いODが得られ得、cpの高容積生産がもたらされ得る。したがって、複合培地は、好ましくは、酵母抽出物、リン酸源、炭素源、ビタミン源、および任意選択で連鎖球菌属を増殖させるアミノ酸源を含み、ビタミン源が、ビオチンと、任意選択でナイアシンアミド、リボフラビン、塩酸チアミンおよび塩酸ピリドキシンから選択される1種類以上のビタミンとからなる。
連鎖球菌属種の増殖の維持に適した任意の型の液状培養培地が使用され得る。好ましい培地としては、複合培地(コロンビア寒天培地(broth)、LB、Todd−Hewitt、OC培地、血液寒天培地またはブレインハートインフュージョンなど);半規定培地(MCDMなど);連鎖球菌属用の化学的に規定される培地(M1、MC、FMC(参考文献11)、またはC−48(参考文献12)など);ならびに必要な栄養要求性成分を含む真核生物細胞株の培養のために構成した培地(RPMI、スペント培地、マッコイ培地およびイーグル培地など)が挙げられる。典型的な培養培地には、酵母抽出物、ならびに増殖に不可欠な他の要素、例えば、脂質(リノール酸もしくはオレイン酸などの長鎖脂肪酸)、ステロイド類(コレステロールなど)、プリンおよびピリミジン、ミネラル類、ビタミン類ならびに増殖因子、アミノ酸(L−および/またはD−体)および/または化学元素もしくは無機イオン(Fe、K、Mg、Mn、Ca、Co、Cu、Pおよび/またはZnなど)が含まれる。培地の濃度を増大させることによって、より高いODが得られ得、cpの高容積生産がもたらされ得る。したがって、複合培地は、好ましくは、酵母抽出物、リン酸源、炭素源、ビタミン源、および任意選択で連鎖球菌属を増殖させるアミノ酸源を含み、ビタミン源が、ビオチンと、任意選択でナイアシンアミド、リボフラビン、塩酸チアミンおよび塩酸ピリドキシンから選択される1種類以上のビタミンとからなる。
化学的に規定される培地は、好ましくは、リン酸源、ミネラル源、炭素源、ビタミン源、および連鎖球菌属を増殖させるアミノ酸源を含み、ビタミン源が、パントテン酸カルシウムと、ナイアシンアミドと、ビオチン、リボフラビン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシンおよび葉酸から選択される1種類以上のビタミンとからなる。
培養培地には、さらに、1種類以上の抗生物質および消泡剤を含めてもよい。典型的な抗生物質としては、カナマイシン、アンピシリンおよびテトラサイクリンが挙げられる。抗生物質は、抗生物質耐性遺伝子を含む特定の細菌を選択するため、および/またはグラム陽性細菌(例えば、連鎖球菌属)を選択するための選択圧力を加えるために使用され得る。したがって、これは、所望のcpを発現している細菌に対する選択圧力を維持するために使用され得る。例えば、抗生物質アズトレオナム(aztrianam)は、グラム陰性に対して有効であるが、グラム陽性細菌に対しては有効でない。消泡剤は当該技術分野で知られており、鉱油、医療用オイル、高配合ポリシロキサングリコールコポリマー、シリコーン化合物およびエマルジョン、オキシアルキル化化合物、鉱油/合成ブレンド、グリコール/エステルブレンドなどが挙げられ得る。
また、培養物には、培養を向上させる種々の他の要素、例えば、脂質(リノール酸もしくはオレイン酸などの長鎖脂肪酸など)、ステロイド類(コレステロールなど)、プリンおよびピリミジン、ビタミンならびに増殖因子、アミノ酸(L−および/またはD−体)および/または化学元素もしくは無機イオン(Fe、K、Mg、Mn、Ca、Co、Cu、Pおよび/またはZnなど)の添加を含めてもよい。
培養培地が、動物から採取された添加物(ウシ血清アルブミンなど)を含む場合、これは、培地および最終的にcpへの夾雑を回避するため、感染性海綿状脳症のない供給源から採取されたものであるべきである。
炭素源
使用される炭素源の型は必須事項ではない。好ましくは、主な炭素源は、グルコース、フルクトース、ラクトース、スクロース、マルトデキストリン、デンプン、イヌリン、グリセロール、植物油(大豆油など)、炭化水素、アルコール(メタノールおよびエタノールなど)、有機酸(酢酸類など)からなる群より選択される。より好ましくは、炭素源は、グルコース、グリセロール、ラクトース、フルクトース、スクロースおよび大豆油から選択される。用語「グルコース」は、グルコースシロップ、すなわち、グルコースオリゴマーを含むグルコース組成物を包含する。炭素源は培養物に、固形物または液状物として添加され得る。好ましくは、炭素源は、細胞に対する浸透圧ストレス(これにより、過剰供給がもたらされることになり得る)が回避されるように制御する。これは、通常、発酵持続期間に必要とされる炭素源すべてを、初期バッチ式培養物に添加しないことにより行なわれる。また、炭素源は、培養制限および色素生成がもたらされ得る枯渇が回避されるように制御する(参考文献13)。
使用される炭素源の型は必須事項ではない。好ましくは、主な炭素源は、グルコース、フルクトース、ラクトース、スクロース、マルトデキストリン、デンプン、イヌリン、グリセロール、植物油(大豆油など)、炭化水素、アルコール(メタノールおよびエタノールなど)、有機酸(酢酸類など)からなる群より選択される。より好ましくは、炭素源は、グルコース、グリセロール、ラクトース、フルクトース、スクロースおよび大豆油から選択される。用語「グルコース」は、グルコースシロップ、すなわち、グルコースオリゴマーを含むグルコース組成物を包含する。炭素源は培養物に、固形物または液状物として添加され得る。好ましくは、炭素源は、細胞に対する浸透圧ストレス(これにより、過剰供給がもたらされることになり得る)が回避されるように制御する。これは、通常、発酵持続期間に必要とされる炭素源すべてを、初期バッチ式培養物に添加しないことにより行なわれる。また、炭素源は、培養制限および色素生成がもたらされ得る枯渇が回避されるように制御する(参考文献13)。
窒素源
使用される窒素源の型は必須事項ではない。好ましくは、窒素源は、尿素、水酸化アンモニウム、アンモニウム塩(硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、塩化アンモニウムおよび硝酸アンモニウムなど)、他の硝酸塩、アミノ酸(グルタミン酸類およびリシンなど)、酵母抽出物、酵母自己分解物、酵母窒素塩基、タンパク質水解産物(例えば限定されないが、ペプトン、カゼイン水解産物、例えば、トリプトンおよびカザミノ酸)、大豆ミール、Hy−Soy、トリプシンによる大豆ブロス、綿実粕、麦芽抽出物、コーンスティープリカーならびに糖蜜から選択される。より好ましくは、窒素源は、水酸化アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムおよびリン酸アンモニウムから選択される。最も好ましくは、窒素源は水酸化アンモニウムである。窒素源としての水酸化アンモニウムの使用は、水酸化アンモニウムが、さらにpH調整剤としての機能を果たし得るという利点を有する。
使用される窒素源の型は必須事項ではない。好ましくは、窒素源は、尿素、水酸化アンモニウム、アンモニウム塩(硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、塩化アンモニウムおよび硝酸アンモニウムなど)、他の硝酸塩、アミノ酸(グルタミン酸類およびリシンなど)、酵母抽出物、酵母自己分解物、酵母窒素塩基、タンパク質水解産物(例えば限定されないが、ペプトン、カゼイン水解産物、例えば、トリプトンおよびカザミノ酸)、大豆ミール、Hy−Soy、トリプシンによる大豆ブロス、綿実粕、麦芽抽出物、コーンスティープリカーならびに糖蜜から選択される。より好ましくは、窒素源は、水酸化アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムおよびリン酸アンモニウムから選択される。最も好ましくは、窒素源は水酸化アンモニウムである。窒素源としての水酸化アンモニウムの使用は、水酸化アンモニウムが、さらにpH調整剤としての機能を果たし得るという利点を有する。
硫酸アンモニウムおよび/またはリン酸アンモニウムを窒素源として使用する場合、微生物が必要とするイオウおよび/またはリンの少なくとも一部が満たされ得る。
リン源
上記のように、リンを培養培地に添加してもよい。リンは、塩の形態であり得、特に、リン酸塩(上記のようなリン酸アンモニウムなど)またはポリリン酸塩として添加され得る。ポリリン酸塩が使用される場合、これは、ポリリン酸ナトリウムなどのリン酸ガラスの形態であり得る(参考文献14)。かかるリン酸ガラスは、その可溶性特性が、混合時に沈殿を生じないで栄養素濃縮培地が調製され得るようなものであるため、有用である。
上記のように、リンを培養培地に添加してもよい。リンは、塩の形態であり得、特に、リン酸塩(上記のようなリン酸アンモニウムなど)またはポリリン酸塩として添加され得る。ポリリン酸塩が使用される場合、これは、ポリリン酸ナトリウムなどのリン酸ガラスの形態であり得る(参考文献14)。かかるリン酸ガラスは、その可溶性特性が、混合時に沈殿を生じないで栄養素濃縮培地が調製され得るようなものであるため、有用である。
他の可変量
培養温度は30〜45℃(例えば、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44℃に)維持される。好ましくは、該温度は約36℃である。したがって、一定の培養温度が維持されるのを確保するため、培養物の入った槽を加熱または冷却することが必要であり得る。該温度は、倍加時間(td)を制御するために使用され得、したがって、所与の培養プロセスでは、該温度は、異なる相(すなわち、バッチ相、フィードバッチ相および炭素供給相)において異なり得る。
培養温度は30〜45℃(例えば、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44℃に)維持される。好ましくは、該温度は約36℃である。したがって、一定の培養温度が維持されるのを確保するため、培養物の入った槽を加熱または冷却することが必要であり得る。該温度は、倍加時間(td)を制御するために使用され得、したがって、所与の培養プロセスでは、該温度は、異なる相(すなわち、バッチ相、フィードバッチ相および炭素供給相)において異なり得る。
培養物の酸素供給量は制御され得る。酸素は、空気、富化酸素、純酸素またはその任意の組み合わせとして供給され得る。酸素濃度のモニタリング方法は当該技術分野で知られている。酸素は、特定の供給速度で送達してもよく、または培養物の溶存酸素含有量を測定し、一定の溶存酸素含有量を維持することを意図して相応して供給することにより必要時に送達してもよい。
また、攪拌または曝気の速度も制御され得る。これにより、栄養素と酸素が、培養物の入ったバイオリアクター全体に行き渡ることが確保される。栄養素溶液と個々の細胞との相対速度は、0.5m/秒前後(例えば、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9または1.0秒)でもよい。
上記のように、培養物のpHは、酸またはアルカリの添加によって制御され得る。pHは、典型的には培養中に低下するため、好ましくはアルカリが添加される。適当なアルカリの例としては、NaOHおよびNH4OHが挙げられる。
このような可変量をすべて、コンピュータ、コンピュータ補助デバイスまたは上記のような制御アルゴリズムによって制御してもよい。このような可変量の変更は、培養物の倍加時間を制御するために使用され得る。
多糖の調製
細菌からの莢膜糖の調製方法は、当該技術分野でよく知られており、例えば、参考文献15、16、17などを参照のこと。GBSの場合では、以下の方法が使用され得る(参考文献18も参照のこと)。特に、本発明の莢膜多糖の精製方法が使用され得る。上記のように、このような本発明の方法には、以下の工程の1つ以上が含まれ得る。
細菌からの莢膜糖の調製方法は、当該技術分野でよく知られており、例えば、参考文献15、16、17などを参照のこと。GBSの場合では、以下の方法が使用され得る(参考文献18も参照のこと)。特に、本発明の莢膜多糖の精製方法が使用され得る。上記のように、このような本発明の方法には、以下の工程の1つ以上が含まれ得る。
出発材料
一般的に、細菌の培養中に培養培地中に放出される莢膜多糖は少量であり、したがって、出発材料は、遠心分離した細菌培養物由来の上清みであり得る。しかしながら、より典型的には、出発材料は、莢膜をもつ細菌自体(または細菌ペプチドグリカンを含有する物質)を、莢膜糖が放出されるように処理することによって調製される。cpは細菌から種々の方法によって、例えば、化学的、物理的または酵素的処理によって放出され得る。したがって、多糖の水性調製物を、最初のタンパク質/核酸沈殿反応の前に処理してもよい。
一般的に、細菌の培養中に培養培地中に放出される莢膜多糖は少量であり、したがって、出発材料は、遠心分離した細菌培養物由来の上清みであり得る。しかしながら、より典型的には、出発材料は、莢膜をもつ細菌自体(または細菌ペプチドグリカンを含有する物質)を、莢膜糖が放出されるように処理することによって調製される。cpは細菌から種々の方法によって、例えば、化学的、物理的または酵素的処理によって放出され得る。したがって、多糖の水性調製物を、最初のタンパク質/核酸沈殿反応の前に処理してもよい。
典型的な化学的処理は塩基抽出であり(参考文献19)(例えば、水酸化ナトリウムを使用)、これにより、莢膜糖とペプチドグリカン主鎖間のホスホジエステル結合が切断され得る。しかしながら、塩基処理により莢膜糖が脱−N−アセチル化されるため、後に、再−N−アセチル化が必要であり得る。
典型的な酵素的処理は、ムタノリジンとβ−N−アセチルグルコサミニダーゼ(参考文献20)の両方の使用を伴うものである。これらは、細菌ペプチドグリカンに対して作用し、本発明での使用のための莢膜糖を放出させるだけでなく、群特異的炭水化物抗原の放出ももたらす。択一的な酵素的処理は、II型ホスホジエステラーゼ(PDE2)での処理を伴うものである。PDE2酵素により、水酸化ナトリウム(上記参照)の場合と同じリン酸基が切断され得、群特異的炭水化物抗原が切断されることなく、莢膜糖が脱−N−アセチル化されることなく莢膜糖が放出され得、それにより、下流の工程が単純化される。したがって、PDE2酵素は、莢膜糖の調製に好ましい選択肢である。
本発明のプロセスに好ましい出発材料は、脱−N−アセチル化莢膜多糖であり、これは、US 6248570(参考文献19)に記載の塩基抽出によって得られ得る。別の好ましい出発材料は、連鎖球菌属のPDE2処理生成物である。かかる材料を、後述する沈殿の前に濃縮(例えば、限外濾過)に供してもよい。
出発材料は、後述するように、夾雑タンパク質および/または核酸のアルコール沈殿に供され得る。
アルコール沈殿およびカチオン交換
培養後に得られた連鎖球菌属莢膜糖は、一般的に純粋ではなく、細菌の核酸とタンパク質が夾雑している。このような夾雑物は、逐次、RNアーゼ、DNアーゼおよびプロテアーゼで一晩処理することによって除去され得る。しかしながら、好ましい択一例として、このような夾雑物を酵素的に除去するのではなく、アルコール沈殿が使用され得る。必要であれば(例えば、塩基抽出後)、該物質を、通常、沈殿の前に中和する。
培養後に得られた連鎖球菌属莢膜糖は、一般的に純粋ではなく、細菌の核酸とタンパク質が夾雑している。このような夾雑物は、逐次、RNアーゼ、DNアーゼおよびプロテアーゼで一晩処理することによって除去され得る。しかしながら、好ましい択一例として、このような夾雑物を酵素的に除去するのではなく、アルコール沈殿が使用され得る。必要であれば(例えば、塩基抽出後)、該物質を、通常、沈殿の前に中和する。
夾雑核酸および/またはタンパク質の沈殿に使用されるアルコールは、好ましくは低級アルコール、例えば、メタノール、エタノール、プロパン−1−オール、プロパン−2−オール、ブタン−1−オール、ブタン−2−オール、2−メチル−プロパン−1−オール、2−メチル−プロパン−2−オール、ジオールなどである。適切なアルコールの選択は、過度な負担なく経験的に試験され得るが、フェノールなどのアルコールよりも、エタノールおよびイソプロパノール(プロパン−2−オール)などのアルコールが好ましい。
アルコールは多糖懸濁液に、好ましくは、最終アルコール濃度が10%〜50%(例えば、30%前後)となるように添加される。最も有用な濃度は、多糖が同時に沈殿されることなく夾雑物の充分な沈殿が達成される濃度である。至適最終アルコール濃度は、多糖が得られた細菌血清型に依存し得るが、過度な負担なく常套的な実験によって決定することができる。エタノール濃度>50%のとき、多糖の沈殿が観察された。
アルコールは、純粋な形態で添加してもよく、混和性の溶媒(例えば、水)で希釈した形態で添加してもよい。好ましい溶媒混合物はエタノール:水混合物であり、好ましい比率は、70:30前後および95:5前後(例えば、75:25、80:20、85:15、90:10)である。
また、該糖を水性金属カチオンで処理してもよい。一価および二価の金属カチオンが好ましく、錯体形成により効率的であるため、二価カチオン(例えば、Mg、Mn、Caなど)が特に好ましい。カルシウムイオンは特に有用であり、そのため、アルコール混合物は、好ましくは可溶性カルシウムイオンを含むものである。これは、糖/アルコール混合物にカルシウム塩の形態で添加され得、固形または水性形態のいずれかとして添加され得る。カルシウムイオンは、好ましくは、塩化カルシウムの使用によって供給される。
カルシウムイオンは、好ましくは、10〜500mM(例えば、約0.1M)の終濃度で存在させる。至適最終Ca濃度は、連鎖球菌属菌株および多糖が得られた血清型に依存し得るが、過度な負担なく常套的な実験によって決定することができる。
夾雑タンパク質および/または核酸のアルコール沈殿後、莢膜多糖は溶液中に残存する。沈殿物質は多糖から、遠心分離などの任意の適当な手段によって分離され得る。上清みは、後の工程でフィルターを詰まらせ得る粒子(例えば、0.22μmより大きい直径を有する沈殿粒子)を除去するために、精密濾過、特にデッドエンド濾過(垂直型濾過)に供され得る。デッドエンド濾過の択一例として、、タンジェンシャル精密濾過が使用され得る。例えば、0.2μmのセルロース膜を用いたタンジェンシャル精密濾過が使用され得る。タンジェンシャル精密濾過工程の後、典型的には、0.45/0.2μmフィルターを用いた濾過が行なわれる。
ダイアフィルトレーション
ダイアフィルトレーション工程が使用されてもよい。例えば、該方法が、上記のアルコール沈殿およびカチオン交換を含む場合、この工程は、タンパク質および/または核酸の沈殿後に行なわれ得る。同様に、該方法が、後述するカチオン系デタージェント処理工程を含む場合、このダイアフィルトレーション工程は、デタージェント媒介性沈殿の前に行なわれ得る。付着性フィルターを用いた濾過(例えば、タンパク質付着性フィルターによる濾過)を含む本発明の方法では、このダイアフィルトレーション工程は、該濾過の前に行なわれ得る。典型的には、ダイアフィルトレーション工程は、タンパク質および/または核酸の沈殿の後であって、デタージェント媒介性沈殿または付着性フィルター(例えば、タンパク質付着性フィルター)を用いた濾過の前に使用される。
ダイアフィルトレーション工程が使用されてもよい。例えば、該方法が、上記のアルコール沈殿およびカチオン交換を含む場合、この工程は、タンパク質および/または核酸の沈殿後に行なわれ得る。同様に、該方法が、後述するカチオン系デタージェント処理工程を含む場合、このダイアフィルトレーション工程は、デタージェント媒介性沈殿の前に行なわれ得る。付着性フィルターを用いた濾過(例えば、タンパク質付着性フィルターによる濾過)を含む本発明の方法では、このダイアフィルトレーション工程は、該濾過の前に行なわれ得る。典型的には、ダイアフィルトレーション工程は、タンパク質および/または核酸の沈殿の後であって、デタージェント媒介性沈殿または付着性フィルター(例えば、タンパク質付着性フィルター)を用いた濾過の前に使用される。
ダイアフィルトレーション工程は、塩基抽出またはホスホジエステラーゼが莢膜糖の放出に使用された場合、群特異的糖もまた加水分解され、元の莢膜糖よりもずっと小さな断片が得られるため、特に好都合である。このような小断片は、ダイアフィルトレーション工程によって取り出され得る。
タンジェンシャルフローダイアフィルトレーションが典型的である。したがって、濾過膜は、群特異的抗原の水解産物の通過は可能であるが、莢膜多糖は保持するものであるのがよい。10kDa〜30kDaの範囲のカットオフが典型的である。群特異的抗原の加水分解断片は、一般的に1kDa前後(5量体、8量体および11量体の糖)であるため、小さいカットオフサイズを使用するのがよいが、大きなカットオフは、莢膜糖のロスをもたらすことなく、他の夾雑物の除去を可能にするのに好都合である。
通常、少なくとも5サイクル、例えば、6、7、8、9、10、11回以上のタンジェンシャルフローダイアフィルトレーションが行なわれる。典型的には、2サイクルのタンジェンシャルフローダイアフィルトレーションが行なわれる。最初のサイクルと2回目のサイクルの間に、最初のダイアフィルトレーションサイクルの保持液を、酢酸/酢酸ナトリウム溶液で処理してもよい。得られた懸濁液を、例えば、0.45μmフィルターを用いて濾過し、沈殿物を除去してもよい。またこの懸濁液を、あるいはさらに、0.2μmフィルターを用いて濾過してもよい。
ダイアフィルトレーションの後に、0.45/0.2μmフィルターを用いたさらなる濾過を行なってもよい。
カチオン系デタージェント処理
可溶性多糖を沈殿させるための多くの手法が当該技術分野で知られている。該糖は、任意選択で、1種類以上のカチオン系デタージェントを用いて沈殿させてもよいが、精製の好ましい実施形態では、タージェント沈殿を除外する。莢膜糖と群特異的糖の混合物をカチオン系デタージェントで処理すると、莢膜糖の優先的な沈殿がもたらされ、それにより、群特異的糖による夾雑が好都合かつ簡便に最小化される。
可溶性多糖を沈殿させるための多くの手法が当該技術分野で知られている。該糖は、任意選択で、1種類以上のカチオン系デタージェントを用いて沈殿させてもよいが、精製の好ましい実施形態では、タージェント沈殿を除外する。莢膜糖と群特異的糖の混合物をカチオン系デタージェントで処理すると、莢膜糖の優先的な沈殿がもたらされ、それにより、群特異的糖による夾雑が好都合かつ簡便に最小化される。
本発明のプロセスにおける使用のための特に好ましいデタージェントは、テトラブチルアンモニア塩およびセチルトリメチルアンモニア塩(例えば、臭化物塩)である。臭化セチルトリメチルアンモニア(CTAB)は特に好ましい(参考文献21)。CTABはまた、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニア、臭化セトリモニウム、CetavlonおよびCentimideとしても知られている。他のデタージェントとしては、臭化ヘキサジメトリンおよびミリスチルトリメチルアンモニア塩が挙げられる。
デタージェント媒介性沈殿工程は、好ましくは莢膜多糖に対して選択的である。
好都合には、任意選択のデタージェント沈殿は、CTABなどの、糖内のシアル酸残基と例えばシアル酸のカルボキシル基によって相互作用するデタージェントを使用するものであるのがよい。したがって、デタージェントにより、混合集団中のシアル酸含有莢膜糖、特に長鎖の糖が優先的に沈殿され、したがって、抗原として重要なシアル酸が先の処理工程で損傷されているかもしれない糖による夾雑が最小化される。
再可溶化
任意選択のデタージェント沈殿工程が使用される場合、多糖(典型的には、カチオン系デタージェントとの複合体の形態)は、水性媒体またはアルコール系媒体のいずれかに再可溶化され得る。水性再可溶化では、沈殿物中のCTA−カチオンが、一般的に、金属カチオンで置き換えられ、アルコール系再可溶化では、CTA−カチオンは一般的に保持される。水性またはアルコール系の再可溶化の選択は、GBS多糖が得られた血清型およびこの段階でなお存在する夾雑物(あれば)に依存し得る。例えば、場合によっては沈殿ペレット中に色素が存在し、これは、アルコール系再可溶化の後、炭素濾過によって有効に除去され得る。
任意選択のデタージェント沈殿工程が使用される場合、多糖(典型的には、カチオン系デタージェントとの複合体の形態)は、水性媒体またはアルコール系媒体のいずれかに再可溶化され得る。水性再可溶化では、沈殿物中のCTA−カチオンが、一般的に、金属カチオンで置き換えられ、アルコール系再可溶化では、CTA−カチオンは一般的に保持される。水性またはアルコール系の再可溶化の選択は、GBS多糖が得られた血清型およびこの段階でなお存在する夾雑物(あれば)に依存し得る。例えば、場合によっては沈殿ペレット中に色素が存在し、これは、アルコール系再可溶化の後、炭素濾過によって有効に除去され得る。
再可溶化のための典型的な水性媒体は金属カチオンを含むものである。一価および二価の金属カチオンが好ましく、二価カチオン(例えば、Mn、Caなど)が特に好ましい。カルシウムイオンは特に有用であり、そのため、再可溶化は、好ましくは、塩化カルシウムの使用によって供給されるCaを使用するものである。10〜500mM(例えば、約0.1M)のCa濃度が好ましい。至適最終Ca濃度は、連鎖球菌属多糖が得られた血清型に依存し得るが、過度な負担なく常套的な実験によって決定することができる。
再可溶化のための典型的なアルコール系媒体は、エタノール系のものである。核酸および/またはタンパク質の沈殿に使用されるものと同じアルコールが使用され得るが、莢膜糖の沈殿に必要とされる濃度の方が一般的に高く、例えば、アルコールは、好ましくは、最終アルコール濃度が70%〜95%(例えば、およそ70%、75%、80%、85%、90%または95%)となるように添加される。至適最終アルコール濃度は、連鎖球菌属多糖が得られた血清型に依存し得る。高いアルコール濃度を得るためには、水分含有量の少ないアルコール(例えば、96%エタノール)を添加することが好ましい。
再可溶化は、典型的には室温で行なう。好ましくは、酸性条件を回避し、再可溶化は、典型的には約pH7で行なう。
再可溶化された物質は、沈殿前の懸濁液と比べて高度に精製されたものである。
該糖の調製のための好ましい方法の一例は、多糖の沈殿後、上記の低級アルコールを用いた沈殿多糖の可溶化を伴うものである。再可溶化後、夾雑物を除去するために、多糖をさらに処理してもよい。
これは、夾雑が微量であっても許容され得ない(例えば、ヒト用ワクチン作製用)状況では、特に重要である。これは、典型的には、1つ以上の濾過工程を伴い、例えば、デプス濾過、活性炭による濾過が使用され得る(サイズ濾過および/または限外濾過)。濾過して夾雑物を除去したら、多糖を、さらなる処理および/または加工処理のために沈殿させ得る。これは、カチオン交換(例えば、カルシウム塩またはナトリウム塩の添加)によって簡便に行なわれ得る。
付着性フィルターを用いた濾過
好ましい実施形態において、莢膜多糖の精製は、さらに、タンパク質および/またはDNA夾雑物を、タンパク質および/またはDNAは付着するが、莢膜多糖は付着しないか、もしくはわずかに弱く付着するフィルター(例えば、タンパク質付着性フィルター)を用いた濾過によって除去する工程を含む。かかるフィルターの好ましい例は、カーボンフィルターである。好適な付着性フィルターは上記のものである。
好ましい実施形態において、莢膜多糖の精製は、さらに、タンパク質および/またはDNA夾雑物を、タンパク質および/またはDNAは付着するが、莢膜多糖は付着しないか、もしくはわずかに弱く付着するフィルター(例えば、タンパク質付着性フィルター)を用いた濾過によって除去する工程を含む。かかるフィルターの好ましい例は、カーボンフィルターである。好適な付着性フィルターは上記のものである。
付着性フィルターを用いた濾過の後、0.45/0.2μmフィルターを用いたさらなる濾過を行なってもよい。
再−N−アセチル化
再−N−アセチル化工程は、例えば、付着性フィルターを用いた濾過工程後、または実施する場合は、さらなる濾過工程後に行なわれ得る。再−N−アセチル化は、GBS莢膜糖内のシアル酸残基が、例えば上記の塩基処理中に脱−N−アセチル化された場合、好都合であり得る。再−N−アセチル化の制御は、例えば、無水酢酸(CH3CO)2Oを含む5%重炭酸アンモニウムなどの試薬を用いて簡便に行なわれ得る[Wesselsら(1989)Infect Immun 57:1089−94]。
再−N−アセチル化工程は、例えば、付着性フィルターを用いた濾過工程後、または実施する場合は、さらなる濾過工程後に行なわれ得る。再−N−アセチル化は、GBS莢膜糖内のシアル酸残基が、例えば上記の塩基処理中に脱−N−アセチル化された場合、好都合であり得る。再−N−アセチル化の制御は、例えば、無水酢酸(CH3CO)2Oを含む5%重炭酸アンモニウムなどの試薬を用いて簡便に行なわれ得る[Wesselsら(1989)Infect Immun 57:1089−94]。
さらなるダイアフィルトレーション
さらなるダイアフィルトレーション工程は、例えば、再−N−アセチル化後に行なわれ得る。ダイアフィルトレーションは、「ダイアフィルトレーション」という標題のセクションにおいて上記のようにして行なわれ得る。
さらなるダイアフィルトレーション工程は、例えば、再−N−アセチル化後に行なわれ得る。ダイアフィルトレーションは、「ダイアフィルトレーション」という標題のセクションにおいて上記のようにして行なわれ得る。
ダイアフィルトレーションの後、0.45/0.2μmフィルターを用いたさらなる濾過を行なってもよい。
最終物質
多糖は、好ましくは最終的に、コンジュゲーションの準備ができた乾燥粉末として調製される。
多糖は、好ましくは最終的に、コンジュゲーションの準備ができた乾燥粉末として調製される。
コンジュゲートの作製
細菌の培養および莢膜多糖の調製後、該糖を担体タンパク質(1つまたは複数)にコンジュゲートさせる。一般に、担体との糖の共有結合性コンジュゲーションにより、糖がT非依存性抗原からT依存性抗原に変換され、したがって免疫記憶のための初期抗原刺激が可能になるため、糖の免疫原性が増強される。コンジュゲーションは、小児用ワクチンに特に有用であり(例えば、参考文献22)、よく知られた手法である(例えば、参考文献23〜31に概説)。
細菌の培養および莢膜多糖の調製後、該糖を担体タンパク質(1つまたは複数)にコンジュゲートさせる。一般に、担体との糖の共有結合性コンジュゲーションにより、糖がT非依存性抗原からT依存性抗原に変換され、したがって免疫記憶のための初期抗原刺激が可能になるため、糖の免疫原性が増強される。コンジュゲーションは、小児用ワクチンに特に有用であり(例えば、参考文献22)、よく知られた手法である(例えば、参考文献23〜31に概説)。
好ましい担体タンパク質は、ジフテリアトキソイドまたは破傷風トキソイドなどの細菌の毒素またはトキソイドである。ジフテリア毒素のCRM197変異型(参考文献32〜34)は、そのままでジフテリアトキソイドであるため、特に好ましい担体である。他の好適な担体タンパク質としては、N meningitidisの外側膜タンパク質(参考文献35)、合成ペプチド(参考文献36,37)、熱ショックタンパク質(参考文献38,39)、百日咳タンパク質(参考文献40,41)、サイトカイン(参考文献42)、リンホカイン(参考文献42)、ホルモン類(参考文献42)、増殖因子(参考文献42)、種々の病原体由来抗原に由来する多くのヒトCD4 T細胞エピトープを含む人工タンパク質(参考文献43)、例えば、N19(参考文献44)、H.influenzae由来のプロテインD(参考文献45,46)、肺炎球菌の表面タンパク質PspA(参考文献47)、ニューモリシン(参考文献48)、鉄取り込みタンパク質(参考文献49)、C.difficile由来のトキシンAまたはB(参考文献50)、GBS タンパク質(下記参照)(参考文献51)などが挙げられる。担体との結合は、好ましくは、例えば、担体タンパク質のリシン残基またはアルギニン残基の側鎖内の−NH2基によるものである。糖が遊離アルデヒド基を有する場合、これは担体内のアミンと反応し、還元的アミノ化によってコンジュゲートを形成し得る。かかるコンジュゲートは、糖内の酸化ガラクトース(アルデヒドが形成される)と、担体またはリンカー内のアミンが関与する還元的アミノ化を用いて作出され得る。また、結合は、例えば、システイン残基の側鎖内の−SH基によるものであり得る。
例えば、担体抑制のリスクを低減するために、1つより多くの担体タンパク質を使用することが可能である。したがって、異なる担体タンパク質が異なる連鎖球菌属菌株または血清型に対して使用され得、例えば、GBS血清Ia型の糖をCRM197にコンジュゲートさせ得、一方、血清Ib型の糖は、破傷風トキソイドにコンジュゲートさせ得る。また、1つより多くの担体タンパク質を特定の糖抗原に対して使用することも可能であり、例えば、血清型IIIの糖を2つの群に分け、一部をCRM197にコンジュゲートさせ、他の一部を破傷風トキソイドにコンジュゲートさせてもよい。しかしながら、一般には、すべての糖に対して同じ担体タンパク質を使用することが好ましい。
単一の担体タンパク質が1つより多くの糖抗原を有していてもよい(参考文献52、53)。例えば、単一の担体タンパク質が血清Ia型およびIb型の糖にコンジュゲートされ得る。この目的を達成するため、コンジュゲーション反応前に、異なる糖が混合され得る。しかしながら、一般には、各血清群が別々のコンジュゲートを有し、異なる糖は、コンジュゲーション後に混合されることが好ましい。該別々のコンジュゲートは、同じ担体のものであってもよい。
タンパク質過剰(例えば、1:5)〜糖過剰(例えば、5:1)の糖:タンパク質比(w/w)を有するコンジュゲートが好ましい。1:2〜5:1の比が好ましい(ire preferred)(1:1.25〜1:2.5の比)。また、1:1〜4:1の比も好ましい。糖鎖が長い場合、糖を重量過剰とするのが典型的である。一般に、本発明は、担体に連結された連鎖球菌属、好ましくはS.agalactiaeの莢膜糖部分を含み、糖:担体の重量比が少なくとも2:1であるコンジュゲートを提供する。
組成物に含まれる遊離担体は少量であるのがよい。所与の担体タンパク質が、本発明の組成物中に遊離形態とコンジュゲート形態の両方で存在する場合、非コンジュゲート形態は、組成物全体において、好ましくは担体タンパク質の総量の5%以下であり、より好ましくは2重量%未満で存在する。
任意の適当なコンジュゲーション反応が、必要な場合は任意の適当なリンカーとともに使用され得る。
糖は、典型的には、コンジュゲーション前に活性化または官能性付与される。活性化は、例えば、CDAP(例えば、1.−シアノ−4−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート(参考文献54、55など))などのシアニル化試薬を伴うものであり得る。他の適当な手法は、カルボジイミド、ヒドラジド、活性エステル、ノルボラン、p−ニトロ安息香酸、N−ヒドロキシスクシンイミド、S−NHS、EDC、およびTSTUを使用するものである(参考文献29の序論も参照のこと)。
リンカー基による連結は、任意の既知の手順、例えば、参考文献56および57に記載の手順を用いて行なわれ得る。結合の型の一例は、多糖の還元的アミノ化、得られたアミノ基とアジピン酸リンカー基の一端とのカップリング、次いで、タンパク質とアジピン酸リンカー基の他端とのカップリングを伴うものである(参考文献27、58、59)。他のリンカーとしては、B−プロピオンアミド(参考文献60)、ニトロフェニルエチルアミン(参考文献61)、ハロゲン化ハロアシル(参考文献62)、グリコシド結合(参考文献63)、6−アミノカプロン酸(参考文献64)、ADH(参考文献65)、C4〜C12部分(参考文献66)などが挙げられる。リンカーの使用の択一例として、直接結合が使用され得る。タンパク質との直接結合は、多糖の酸化、続いてタンパク質との還元的アミノ化(例えば、参考文献67および68に記載)を含み得る。
糖内へのアミノ基の導入(例えば、末端の=O基を−NH2で置き換えることにより)、続いてアジピン酸ジエステル(例えば、アジピン酸N−ヒドロキシスクシンイミドジエステル)での誘導体化および担体タンパク質との反応を伴うプロセスが好ましい。別の好ましい反応は、プロテインD担体でのCDAP活性化を使用するものである。
:コンジュゲーション後、遊離糖とコンジュゲート糖は分離され得る。適当な方法が多数あり、疎水性クロマトグラフィー、タンジェンシャル限外濾過、ダイアフィルトレーションなどが挙げられる(参考文献69および70なども参照のこと)。
本発明の組成物が解重合オリゴ糖を含む場合、解重合はコンジュゲーションの前に行なう、例えば、糖の活性化の前であることが好ましい。
好ましいコンジュゲーション法の一例では、糖をアジピン酸ジヒドラジドと反応させる。血清群Aでは、この段階でカルボジイミドも添加してもよい。反応期間後、ナトリウムシアノボロヒドリドを添加する。次いで、誘導体化された糖が、例えば限外濾過によって調製され得る。
次いで、誘導体化された糖を担体タンパク質(例えば、ジフテリアトキソイド)と混合し、カルボジイミドを添加する。反応期間後、コンジュゲートが回収され得る。
他の工程
上記の工程を含めるとともに、本発明の方法に、さらに、さらなる工程を含めてもよい。例えば、該方法は、莢膜糖を細菌から調製した後であってコンジュゲーションの前に、莢膜糖の解重合工程を含むものであり得る。解重合によって糖の鎖長が短くなり、GBSには良好でない場合があり得る。連鎖球菌属、特にGBSでは、糖が長鎖であるほど、短鎖のものより免疫原性が大きくなる傾向にある(参考文献71)。
上記の工程を含めるとともに、本発明の方法に、さらに、さらなる工程を含めてもよい。例えば、該方法は、莢膜糖を細菌から調製した後であってコンジュゲーションの前に、莢膜糖の解重合工程を含むものであり得る。解重合によって糖の鎖長が短くなり、GBSには良好でない場合があり得る。連鎖球菌属、特にGBSでは、糖が長鎖であるほど、短鎖のものより免疫原性が大きくなる傾向にある(参考文献71)。
コンジュゲーション後、非コンジュゲート担体タンパク質のレベルが測定され得る。この測定を行なう方法の一例は、キャピラリー電気泳動(参考文献72)(例えば、遊離溶液中)、またはミセル動電クロマトグラフィー(参考文献73)を伴うものである。
コンジュゲーション後、非コンジュゲート糖のレベルが測定され得る。この測定を行なう方法の一例は、HPAEC−PAD(参考文献69)を伴うものである。
コンジュゲーション後、コンジュゲート糖を非コンジュゲート糖から分離する工程が使用され得る。これらの糖を分離する方法の一例は、一方の成分を選択的に沈殿させる方法の使用である。例えば、デオキシコール酸塩処理によって非コンジュゲート糖を溶液中に残存させるコンジュゲート糖の選択的沈殿が好ましい(参考文献69)。
コンジュゲーション後、コンジュゲートの分子サイズおよび/またはモル質量を測定する工程が行なわれ得る。特に、分布が測定され得る。このような測定を行なう方法の一例は、サイズ排除クロマトグラフィーとともに多角度光散乱測光法および示差屈折率測定法による検出(SEC−MALS/RI)(参考文献74)を伴うものである。
コンジュゲートの組み合わせ
任意の肺炎球菌血清群について、個々のコンジュゲートは上記のようにして調製され得る。
任意の肺炎球菌血清群について、個々のコンジュゲートは上記のようにして調製され得る。
好ましくは、コンジュゲートは、血清群1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F、および23Fのうちの1種類以上について調製する。次いで、多価混合物を得るために、個々のコンジュゲートを混合してもよい。
また、選択した数のコンジュゲートを混合し、2価、3価、4価、5価、6価、7価または11価の混合物を得ることも可能である(例えば、1+3+4+5+6B+7F+9V+14+18C+19F+23F、4+6B+9V+14+18C+19F+23Fまたは1+4+6B+9V+14+18C+19F+23Fを混合など)。
GBSでは、コンジュゲートは、好ましくは血清群Ia、IbまたはIIIのうちの1種類以上から調製する。
コンジュゲートは、これらを個々に緩衝溶液に添加することにより混合され得る。好ましい溶液はリン酸緩衝生理食塩水(終濃度10mMのリン酸ナトリウム)である。最終混合物中の各コンジュゲートの好ましい濃度(糖として測定)は1〜20μg/ml、例えば5〜15μg/ml(8μg/ml前後など)である。任意選択のアルミニウム塩アジュバントは、この段階で添加され得る(例えば、最終Al3+濃度を0.4〜0.5mg/mlにするため)。
混合後、混合したコンジュゲートは滅菌濾過され得る。
医薬組成物
本発明の方法によって調製されたコンジュゲートを、薬学的に許容され得る担体と合わせてもよい。かかる担体としては、それ自体は、該組成物を受ける個体に対して有害な抗体生成を誘導しない任意の担体が挙げられる。好適な担体は、典型的には、大型のゆっくりと代謝される巨大分子、例えば、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、アミノ酸ポリマー、アミノ酸コポリマー、スクロース、トレハロース、ラクトース、および脂質凝集体(油滴またはリポソームなど)などである。かかる担体は当業者には充分わかる。また、ワクチンには、例えば、水、生理食塩水、グリセロールなどの希釈剤を含めてもよい。また、例えば、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝物質などの補助物質を存在させてもよい。滅菌されたパイロジェンフリーのリン酸緩衝生理食塩水は典型的な担体である。薬学的に許容され得る賦形剤の詳細な論考は参考文献75において入手可能である。
本発明の方法によって調製されたコンジュゲートを、薬学的に許容され得る担体と合わせてもよい。かかる担体としては、それ自体は、該組成物を受ける個体に対して有害な抗体生成を誘導しない任意の担体が挙げられる。好適な担体は、典型的には、大型のゆっくりと代謝される巨大分子、例えば、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、アミノ酸ポリマー、アミノ酸コポリマー、スクロース、トレハロース、ラクトース、および脂質凝集体(油滴またはリポソームなど)などである。かかる担体は当業者には充分わかる。また、ワクチンには、例えば、水、生理食塩水、グリセロールなどの希釈剤を含めてもよい。また、例えば、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝物質などの補助物質を存在させてもよい。滅菌されたパイロジェンフリーのリン酸緩衝生理食塩水は典型的な担体である。薬学的に許容され得る賦形剤の詳細な論考は参考文献75において入手可能である。
該組成物には、特に、反復用量形式でパッケージングされる場合、抗菌剤が含まれ得る。
該組成物に、デタージェント、例えばTween(ポリソルベート)(TWEEN 80(TM)など)を含めてもよい。デタージェントは、一般的には低レベル(例えば、>0.01%)で存在する。
該組成物に、張度を付与するためのナトリウム塩(例えば、塩化ナトリウム)を含めてもよい。10±2mg/mlの濃度のNaClが典型的である。
該組成物は、一般的にバッファーを含む。リン酸バッファーが典型的である。
該組成物には、特に、凍結乾燥される場合、または凍結乾燥物質から再構成された物質を含む場合、糖アルコール(例えば、マンニトール)または二糖(例えば、スクロースもしくはトレハロース)が、例えばおよそ15〜30mg/ml(例えば、25mg/ml)で含まれ得る。凍結乾燥用組成物のpHは、凍結乾燥前に6.1前後に調整され得る。
コンジュゲートは、他の免疫調節剤とともに投与され得る。特に、該組成物は、通常、ワクチンアジュバントを含む。本発明の組成物に使用され得るアジュバントとしては、限定されないが、以下のものが挙げられる。
A.ミネラル含有組成物
本発明におけるアジュバントとしての使用に適したミネラル含有組成物組成物としては、アルミニウム塩およびカルシウム塩(またはその混合物)などのミネラル塩が挙げられる。本発明は、ミネラル塩、例えば、水酸化物 (例えば、オキシ水酸化物)、リン酸塩(例えば、ヒドロキシリン酸塩、オルトリン酸塩)、硫酸塩など(例えば、参考文献76の第8章および第9章参照)、または異なるミネラル化合物の混合物を含み、該化合物には、任意の適当な形態(例えば、ゲル、結晶性、アモルファスなど)が採用され、吸着が好ましい。また、ミネラル含有組成物を金属塩の粒子として構築してもよい(参考文献77)。
本発明におけるアジュバントとしての使用に適したミネラル含有組成物組成物としては、アルミニウム塩およびカルシウム塩(またはその混合物)などのミネラル塩が挙げられる。本発明は、ミネラル塩、例えば、水酸化物 (例えば、オキシ水酸化物)、リン酸塩(例えば、ヒドロキシリン酸塩、オルトリン酸塩)、硫酸塩など(例えば、参考文献76の第8章および第9章参照)、または異なるミネラル化合物の混合物を含み、該化合物には、任意の適当な形態(例えば、ゲル、結晶性、アモルファスなど)が採用され、吸着が好ましい。また、ミネラル含有組成物を金属塩の粒子として構築してもよい(参考文献77)。
リン酸アルミニウムは、特に、H.influenzae糖抗原を含む組成物において特に好ましく、典型的なアジュバントは、0.84〜0.92のPO4/A1モル比を有するアモルファスヒドロキシリン酸アルミニウムである(0.6mg Al+3/mlで含む)。
低用量のリン酸アルミニウムとの吸着、例えば、50〜100μgのAl3+/コンジュゲート/用量が使用され得る。1つより多くのコンジュゲートが組成物中に存在する場合、すべてのコンジュゲートを吸着させる必要はない。
カルシウム塩としては、リン酸カルシウム(例えば、参考文献258に開示された「CAP」粒子が挙げられる。アルミニウム塩としては、水酸化物、リン酸塩、硫酸塩などが挙げられ、該塩には任意の適当な形態(例えば、ゲル、結晶性、アモルファスなど)が採用される。このような塩への吸着が好ましい。また、ミネラル含有組成物を金属塩の粒子として構築してもよい[77]。アルミニウム塩アジュバントは、より詳細に後述する。
水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムとして知られているアジュバントが使用され得る。これらの名称は慣用的であるが、便宜上使用されているものであって、いずれも、存在する実際の化合物の正確な記載ではない(例えば、参考文献76の第9章参照)。本発明では、一般にアジュバントとして使用されている任意の「水酸化物」または「リン酸塩」アジュバントが使用され得る。
「水酸化アルミニウム」として知られているアジュバントは、典型的にはオキシ水酸化アルミニウム塩であり、これは、通常、少なくとも一部分が結晶性である。オキシ水酸化アルミニウムは、式AlO(OH)で表されるものであり得、水酸化アルミニウムAl(OH)3などの他のアルミニウム化合物とは、赤外(IR)分光法によって、特に、1070cm−1における吸着バンドおよび3090〜3100cm−1における大きな肩部の存在によって識別され得る[参考文献76の第9章]。水酸化アルミニウムアジュバントの結晶化度は、半値幅(WHH)における回折バンド幅によって反映され、結晶性が不充分な粒子は、微結晶サイズが小さいため、大きく広がったラインを示す。表面積は、WHHが増大するにつれて増大し、アジュバントは、大きなWHH値を有するほど大きな抗原吸着能を有することが観察された。繊維状の形態構造(例えば、透過型電子顕微鏡写真において見られる)は、水酸化アルミニウムアジュバントに典型的である。水酸化アルミニウムアジュバントのpIは典型的には約11である、すなわち、アジュバント自体は、生理学的pHにおいて正の表面電荷を有する。水酸化アルミニウムアジュバントについて、pH7.4で1.8〜2.6mgタンパク質/mg Al+++の吸着能が報告されている。
「リン酸アルミニウム」として知られているアジュバントは、典型的にはヒドロキシリン酸アルミニウムであり、これは、多くの場合、少量の硫酸塩(すなわち、ヒドロキシリン酸アルミニウム硫酸塩)も含有している。これは、沈殿によって得られ得、沈殿時の反応条件と濃度は、塩内でヒドロキシルがリン酸基に置換される程度に影響する。ヒドロキシリン酸塩は、一般的に、0.3〜1.2のPO4/Alモル比を有する。ヒドロキシリン酸塩は厳密なAlPO4とは、ヒドロキシル基の存在によって識別され得る。例えば、3164cm−1におけるIRスペクトルバンド(例えば、200℃まで加熱した場合)は、ヒドロキシル構造の存在を示す[参考文献76の第9章]。
リン酸アルミニウムアジュバントのPO4/Al3+モル比は、一般的に、0.3〜1.2、好ましくは0.8〜1.2、より好ましくは0.95+0.1である。リン酸アルミニウムは、一般的に、特にヒドロキシリン酸塩の場合、アモルファスである。典型的なアジュバントは、0.84〜0.92のPO4/Alモル比を有するアモルファスヒドロキシリン酸アルミニウムである(0.6mg Al3+/mlで含む)。リン酸アルミニウムは、一般的に微粒状である(例えば、透過型電子顕微鏡写真において見られるようなプレート様形態構造)。粒子の典型的な直径は、任意の抗原吸着後、0.5〜20μm(例えば、約5〜10μm)の範囲である。リン酸アルミニウムアジュバントについて、pH7.4で0.7〜1.5mgタンパク質/mg Al+++の吸着能が報告されている。
リン酸アルミニウムの荷電ゼロ点(PZC)は、ヒドロキシルとのリン酸基の置換の程度に反比例し、この置換の程度は、沈殿による塩の調製に使用される反応条件および反応体の濃度に応じて異なり得る。また、PZCも、溶液中の遊離リン酸イオンの濃度を変化させること(より多くのリン酸イオン=より酸性のPZC)、またはヒスチジンバッファーなどのバッファーを添加すること(PZCがより塩基性となる)により変更される。本発明に従って使用されるリン酸アルミニウムは、一般的に、4.0〜7.0、より好ましくは5.0〜6.5、例えば約5.7のPZCを有する。
本発明の組成物を調製するために使用されるアルミニウム塩の懸濁液に、バッファー(例えば、リン酸またはヒスチジンまたはTrisバッファー)を含めてもよいが、これは必ずしも必要ではない。該懸濁液は、好ましくは滅菌されており、パイロジェンフリーである。該懸濁液は、例えば1.0〜20mM、好ましくは5〜15mM、より好ましくは約10mMの濃度で存在する遊離の水性リン酸イオンを含むものであり得る。また、該懸濁液は塩化ナトリウムを含むものであってもよい。
本発明では、DARONR1XTMのような、水酸化アルミニウムとリン酸アルミニウムの両方の混合物が使用され得る。この場合、リン酸アルミニウムは水酸化物よりも多い方がよく、例えば、重量比は少なくとも2:1、例えば、>5:1、>6:1、>7:1、>8:1、>9:1などである。
患者への投与のための組成物中のAl+++の濃度は、好ましくは10mg/ml未満、例えば、<5mg/ml、<4mg/ml、<3mg/ml、<2mg/ml、<1mg/mlなどである。好ましい範囲は0.3〜lmg/mlである。最大0.85mg/用量が好ましい。
B.油性乳剤
本発明におけるアジュバントとしての使用に適した油性乳剤組成物としては、スクアレン−水乳剤、例えば、MF59(参考文献76の第10章参照;参考文献78も参照のこと)(5%スクアレン、0.5%Tween80、および0.5%Span85、マイクロフルイダイザーを用いてサブミクロン粒子に構築)が挙げられる。また、完全アジュバントアジュバント(CFA)および不完全アジュバントアジュバント(IFA)も使用され得る。
本発明におけるアジュバントとしての使用に適した油性乳剤組成物としては、スクアレン−水乳剤、例えば、MF59(参考文献76の第10章参照;参考文献78も参照のこと)(5%スクアレン、0.5%Tween80、および0.5%Span85、マイクロフルイダイザーを用いてサブミクロン粒子に構築)が挙げられる。また、完全アジュバントアジュバント(CFA)および不完全アジュバントアジュバント(IFA)も使用され得る。
乳剤中の油滴は、一般的に5μm未満の直径であり、サブミクロン直径を有する場合でさえあり得、このような小径はマイクロフルイダイザーを用いて達成され、安定な乳剤が得られる。220nm未満の径を有する液滴は、濾過滅菌に供することができるため好ましい。
C.サポニン製剤(参考文献76の第22章参照)
サポニン製剤もまた、本発明におけるアジュバントとして使用され得る。サポニンは、広範な植物種の樹皮、葉、茎、根、さらには花にも見られるステロールグリコシドおよびトリテルペノイドグリコシドの異種群である。Quillaia saponaria Molina樹木の樹皮由来のサポニンは、アジュバントとして広く研究されている。また、サポニンは、Smilax ornata(sarsaprilla)、Gypsophilla paniculata(brides veil)、およびSaponaria officianalis(soap root)から商業的に入手することもできる。サポニンアジュバント製剤としては、QS21などの精製製剤、ならびにISCOMなどの脂質製剤が挙げられる。QS21は、STIMULON(TM)として市販されている。
サポニン製剤もまた、本発明におけるアジュバントとして使用され得る。サポニンは、広範な植物種の樹皮、葉、茎、根、さらには花にも見られるステロールグリコシドおよびトリテルペノイドグリコシドの異種群である。Quillaia saponaria Molina樹木の樹皮由来のサポニンは、アジュバントとして広く研究されている。また、サポニンは、Smilax ornata(sarsaprilla)、Gypsophilla paniculata(brides veil)、およびSaponaria officianalis(soap root)から商業的に入手することもできる。サポニンアジュバント製剤としては、QS21などの精製製剤、ならびにISCOMなどの脂質製剤が挙げられる。QS21は、STIMULON(TM)として市販されている。
サポニン組成物は、HPLCおよびRP−HPLCを用いて精製されたものである。このような手法が使用された具体的な精製画分が同定されており、QS7、QS17、QS18、QS21、QH−A、QH−BおよびQH−Cが挙げられる。好ましくは、サポニンはQS21である。QS21の作製方法は、参考文献79に開示されている。サポニン製剤には、ステロール(コレステロールなど)が含まれることがあり得る(参考文献80)。
サポニンとコレステロールの組み合わせは、免疫賦活複合体(ISCOM)と称される特殊な粒子を形成するために使用され得る(参考文献76の第23章参照)。また、ISCOMは、典型的には、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリンなどなどのリン脂質を含む。任意の既知のサポニンがISCOMに使用され得る。好ましくは、ISCOMは、QuilA、QHAおよびQHCの1種類以上を含む。ISCOMは、参考文献80〜82にさらに説明されている。任意選択で、ISCOMSは、さらなるデタージェントを含まないものであり得る(参考文献83)。
サポニン系アジュバントの開発の概説は、参考文献84および85を見るとよい。
D.ビロソームおよびウイルス様粒子
ビロソームおよびウイルス様粒子(VLP)もまた、本発明におけるアジュバントとして使用され得る。このような構造体は、一般的に、任意選択でリン脂質と会合または構築されたウイルス由来の1種類以上のタンパク質を含む。これらは、一般的に、非病原性であり、非複製性であり、一般的に天然ウイルスゲノムを全く含まない。ウイルスタンパク質は、組換えにより作製されたものであってもよく、完全体ウイルスから単離されたものであってもよい。ビロソームまたはVLPにおける使用に適したこのようなウイルスタンパク質としては、インフルエンザウイルス(HAまたはNAなど)、B型肝炎ウイルス(コアまたはキャプシドタンパク質など)、E型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、シンドビスウイルス、ロタウイルス、口蹄疫ウイルス、レトロウイルス、ノーウォークウイルス、ヒトパピローマウイルス、HIV、RNA−ファージ、Qβ−ファージ(外被タンパク質など)、GA−ファージ、fr−ファージ、AP205ファージ、およびTy(レトロトランスポゾンTyタンパク質p1など)に由来するタンパク質が挙げられる。VLPは、参考文献86〜91にさらに論考されている。ビロソームは、例えば参考文献92にさらに論考されている。
ビロソームおよびウイルス様粒子(VLP)もまた、本発明におけるアジュバントとして使用され得る。このような構造体は、一般的に、任意選択でリン脂質と会合または構築されたウイルス由来の1種類以上のタンパク質を含む。これらは、一般的に、非病原性であり、非複製性であり、一般的に天然ウイルスゲノムを全く含まない。ウイルスタンパク質は、組換えにより作製されたものであってもよく、完全体ウイルスから単離されたものであってもよい。ビロソームまたはVLPにおける使用に適したこのようなウイルスタンパク質としては、インフルエンザウイルス(HAまたはNAなど)、B型肝炎ウイルス(コアまたはキャプシドタンパク質など)、E型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、シンドビスウイルス、ロタウイルス、口蹄疫ウイルス、レトロウイルス、ノーウォークウイルス、ヒトパピローマウイルス、HIV、RNA−ファージ、Qβ−ファージ(外被タンパク質など)、GA−ファージ、fr−ファージ、AP205ファージ、およびTy(レトロトランスポゾンTyタンパク質p1など)に由来するタンパク質が挙げられる。VLPは、参考文献86〜91にさらに論考されている。ビロソームは、例えば参考文献92にさらに論考されている。
E.細菌誘導体または微生物誘導体
本発明における使用に適したアジュバントは、細菌誘導体または微生物誘導体、例えば、腸内細菌リポ多糖(LPS)の非毒性誘導体、リピドA誘導体、免疫賦活性オリゴヌクレオチドならびにADP−リボシル化毒素およびその無毒化誘導体などを包含する。
本発明における使用に適したアジュバントは、細菌誘導体または微生物誘導体、例えば、腸内細菌リポ多糖(LPS)の非毒性誘導体、リピドA誘導体、免疫賦活性オリゴヌクレオチドならびにADP−リボシル化毒素およびその無毒化誘導体などを包含する。
LPSの非毒性誘導体としては、モノホスホリルリピドA(MPL)および3−O−脱アシル化MPL(3dMPL)が挙げられる。3dMPLは、3脱−O−アシル化モノホスホリルリピドAと4、5または6アシル化鎖との混合物である。3脱−O−アシル化モノホスホリルリピドAの好ましい「小粒子」形態は、参考文献93に開示されている。かかる3dMPLの「小粒子」は、0.22μm膜で滅菌濾過されるのに充分小さい(参考文献93)。他の非毒性LPS誘導体としては、モノホスホリルリピドA模倣物、例えば、アミノアルキルグルコサミニドホスフェート誘導体(例えば、RC−529)(参考文献94,95)などが挙げられる。
リピドA誘導体としては、OM−174などの大腸菌由来のリピドAの誘導体が挙げられる。OM−174は、例えば参考文献96および97に記載されている。
本発明におけるアジュバントとしての使用に適した免疫賦活性オリゴヌクレオチドとしては、CpGモチーフを含むヌクレオチド配列(グアノシンにリン酸結合によって連結された非メチル化シトシンを含むジヌクレオチド配列)が挙げられる。パリンドローム配列またはポリ(dG)配列を含む二本鎖RNAおよびオリゴヌクレオチドもまた、免疫賦活性であることが示されている。
CpGは、ヌクレオチド修飾/類似体(ホスホロチオエート修飾など)を含むものであってもよく、二本鎖であっても単鎖であってもよい。参考文献98、99および100には、可能な類似置換(例えば、2’−デオキシ−7−デアザグアノシンでのグアノシンの置き換え)が開示されている。CpGオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は、参考文献101〜106にさらに論考されている。
CpG配列は、TLR9に対するものであり得る(モチーフGTCGTTまたはTTCGTTなど)(参考文献107)。CpG配列は、Th1免疫応答の誘導に特異的であってもよく(CpG−A ODNなど)、B細胞応答に対してより特異的であってもよい(CpG−B ODNなど(such a))。CpG−AおよびCpG−B ODNは、参考文献108〜110に論考されている。好ましくは、CpGはCpG−A ODNである。
好ましくは、CpGオリゴヌクレオチドは、5’末端が受容体の認識に利用可能となるように構築される。任意選択で、2つのCpGオリゴヌクレオチド配列をその3’末端で結合させ「イムノマー」を形成してもよい。例えば、参考文献107および111〜113を参照のこと。
細菌ADP−リボシル化毒素およびその無毒化誘導体は、本発明におけるアジュバントとして使用され得る。好ましくは、そのタンパク質は、大腸菌(大腸菌熱不安定性エンテロトキシン「LT」)、コレラ(「CT」)、または百日咳(PT」)に由来するものである。粘膜経由アジュバントとしての無毒化ADP−リボシル化毒素の使用は、参考文献114に記載されており、非経口アジュバントとしての使用は、参考文献115に記載されている。毒素またはトキソイドは、好ましくは、AとBの両方のサブユニットを含むホロトキシンの形態である。好ましくは、Aサブユニットは無毒化変異を含む;好ましくは、Bサブユニットは変異されていない。好ましくは、アジュバントは、LT−K63、LT−R72、およびLT−G192などの無毒化LT変異型である。アジュバントとしてのADP−リボシル化毒素およびその無毒化誘導体、特にLT−K63およびLT−R72の使用は、参考文献116〜123を見るとよい。アミノ酸置換の数の参照は、好ましくは、参考文献124(引用によりその全体が具体的に本明細書に組み込まれる)に示されたADP−リボシル化毒素のAおよびBサブユニットのアラインメントに基づいて行なう。
F.ヒト免疫調節因子
本発明におけるアジュバントとしての使用に適したヒト免疫調節因子としては、サイトカイン、例えば、インターロイキン(例えば、IL−1、IL−2、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−12(参考文献125)など)(参考文献126)、インターフェロン(例えば、インターフェロン−γ)、マクロファージコロニー刺激因子、および腫瘍壊死因子などが挙げられる。好ましい免疫調節因子はIL−12である。
本発明におけるアジュバントとしての使用に適したヒト免疫調節因子としては、サイトカイン、例えば、インターロイキン(例えば、IL−1、IL−2、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−12(参考文献125)など)(参考文献126)、インターフェロン(例えば、インターフェロン−γ)、マクロファージコロニー刺激因子、および腫瘍壊死因子などが挙げられる。好ましい免疫調節因子はIL−12である。
G.生体接着剤および粘膜接着剤
生体接着剤および粘膜接着剤もまた、本発明におけるアジュバントとして使用され得る。好適な生体接着剤としては、エステル化ヒアルロン酸ミクロスフェア(参考文献127)または粘膜接着剤、例えば、ポリ(アクリル酸)、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖およびカルボキシメチルセルロースの架橋誘導体が挙げられる。キトサンおよびその誘導体もまた、本発明におけるアジュバントとして使用され得る(参考文献128)。
生体接着剤および粘膜接着剤もまた、本発明におけるアジュバントとして使用され得る。好適な生体接着剤としては、エステル化ヒアルロン酸ミクロスフェア(参考文献127)または粘膜接着剤、例えば、ポリ(アクリル酸)、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖およびカルボキシメチルセルロースの架橋誘導体が挙げられる。キトサンおよびその誘導体もまた、本発明におけるアジュバントとして使用され得る(参考文献128)。
H.ミクロ粒子
ミクロ粒子もまた、本発明におけるアジュバントとして使用され得る。生分解性であり非毒性である材料(例えば、ポリ(α−ヒドロキシ酸)、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物(arthydride)、ポリカプロラクトンなど)、ポリ(ラクチド−コ−グリコリド)で形成されたミクロ粒子(すなわち、約100nm〜約150μmの直径、より好ましくは約200nm〜約33μmの直径、最も好ましくは約500nm〜約10μmの直径の粒子)が好ましく、任意選択で処理され、負電荷を有する表面(例えば、SDSで)または正電荷を有する表面(例えば、カチオン系デタージェント(CTABなど)で)を有する。
ミクロ粒子もまた、本発明におけるアジュバントとして使用され得る。生分解性であり非毒性である材料(例えば、ポリ(α−ヒドロキシ酸)、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物(arthydride)、ポリカプロラクトンなど)、ポリ(ラクチド−コ−グリコリド)で形成されたミクロ粒子(すなわち、約100nm〜約150μmの直径、より好ましくは約200nm〜約33μmの直径、最も好ましくは約500nm〜約10μmの直径の粒子)が好ましく、任意選択で処理され、負電荷を有する表面(例えば、SDSで)または正電荷を有する表面(例えば、カチオン系デタージェント(CTABなど)で)を有する。
I.リポソーム(参考文献76の第13章および第14章)
アジュバントとしての使用に適したリポソーム製剤の例は、参考文献129〜131に記載されている。
アジュバントとしての使用に適したリポソーム製剤の例は、参考文献129〜131に記載されている。
J.ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル製剤
本発明における使用に適したアジュバントは、ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル(参考文献132)を包含する。かかる製剤は、さらに、オクトキシノールと組み合わされたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤(参考文献133)、ならびに少なくとも1種類のさらなる非イオン系界面活性剤(オクトキシノールなど)と組み合わされたポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはエステル界面活性剤(参考文献134)を包含する。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群:ポリオキシエチレン−9−ラウリルエーテル(ラウレス9)、ポリオキシエチレン−9−ステオリル(steoryl)エーテル、ポリオキシエチレン(theylene)−8−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−4−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−35−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−23−ラウリルエーテルから選択される。
本発明における使用に適したアジュバントは、ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル(参考文献132)を包含する。かかる製剤は、さらに、オクトキシノールと組み合わされたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤(参考文献133)、ならびに少なくとも1種類のさらなる非イオン系界面活性剤(オクトキシノールなど)と組み合わされたポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはエステル界面活性剤(参考文献134)を包含する。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群:ポリオキシエチレン−9−ラウリルエーテル(ラウレス9)、ポリオキシエチレン−9−ステオリル(steoryl)エーテル、ポリオキシエチレン(theylene)−8−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−4−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−35−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−23−ラウリルエーテルから選択される。
K.ポリホスファゼン(PCPP)
PCPP製剤は、例えば、参考文献135および136に記載されている。
PCPP製剤は、例えば、参考文献135および136に記載されている。
L.ムラミルペプチド
本発明におけるアジュバントとしての使用に適したムラミルペプチドの例としては、N−アセチルムラミル−L−トレオニル−D−イソグルタミン(thr−MDP)、N−アセチルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミン(ノル−MDP)、およびN−アセチルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミル−L−アラニン−2−(1’−2’−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ヒドロキシホスホリルオキシ)−エチルアミンMTP−PE)が挙げられる。
本発明におけるアジュバントとしての使用に適したムラミルペプチドの例としては、N−アセチルムラミル−L−トレオニル−D−イソグルタミン(thr−MDP)、N−アセチルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミン(ノル−MDP)、およびN−アセチルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミル−L−アラニン−2−(1’−2’−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ヒドロキシホスホリルオキシ)−エチルアミンMTP−PE)が挙げられる。
M.イミダゾキノロン化合物
本発明におけるアジュバントとして使用するのに適したイミダゾキノロン化合物の例としては、イミキモド(TM)およびその相同物(例えば、レシキモド3M(TM))が挙げられ、参考文献137および138にさらに記載されている。
本発明におけるアジュバントとして使用するのに適したイミダゾキノロン化合物の例としては、イミキモド(TM)およびその相同物(例えば、レシキモド3M(TM))が挙げられ、参考文献137および138にさらに記載されている。
また、本発明は、上記において特定したアジュバントの1つ以上の態様の組み合わせを含む。例えば、以下:(1)サポニンと水中油型乳剤(参考文献139);(2)サポニン(例えば、QS21)+非毒性LPS誘導体(例えば、3dMPL)(参考文献140);(3)サポニン(例えば、QS21)+非毒性LPS誘導体(例えば、3dMPL)+コレステロール;(4)サポニン(例えば、QS2I)+3dMPL+IL−12(任意選択で+ステロール)(参考文献141);(5)3dMPLと、例えば、QS21および/または水中油型乳剤(参考文献142)との組み合わせ;(6)SAF、10%スクアラン、0.4%TWEEN80(TM)、5%プルロニック−ブロックポリマーL121、およびthr−MDP含有(サブミクロン乳剤にマイクロフルイダイズしたもの、またはボルテックスして大粒系乳剤にしたもののいずれか)、(7)RIBI(TM)アジュバント系(RAS)、(Ribi Immunochem)、2%スクアレン、0.2 TWEEN80(TM)と、モノホスホリルリピドA(MPL)、ジミコール酸トレハロース(TDM)および細胞壁骨格(CWS)からなる群の1種類以上の細菌細胞壁成分含有;好ましくはMPL+CWS(DETOX(TM));ならびに(8)1種類以上のミネラル塩(アルミニウム塩など)+LPSの非毒性誘導体(3dMPLなど)のアジュバント組成物が本発明において使用され得る。
免疫賦活剤として作用する他の物質は、参考文献76の第7章に開示されている。
水酸化アルミニウムおよび/またはリン酸アルミニウムアジュバントの使用が特に好ましく、一般的には、抗原をこのような塩に吸着させる。リン酸カルシウムは別の好ましいアジュバントである。
該組成物は、滅菌および/またはパイロジェンフリーであるのがよい。組成物は、ヒトに関して等張性であるのがよい。
組成物は、バイアルにて提示してもよく、充填済みシリンジにて提示してもよい。シリンジは、針を取り付けたものであっても、そうでなくてもよい。シリンジは単回用量の組成物を含むものであるが、バイアルは単回用量を含むものであっても反復用量を含むものであってもよい。注射用組成物は、通常、液状の溶液または懸濁液である。あるいはまた、該組成物を、注射前に液状ビヒクルで液剤または懸濁剤にするための固体形態(例えば、凍結乾燥型)で提示してもよい。
組成物は、単位用量形態または反復用量形態でパッケージングされ得る。反復用量形態には、バイアルが充填済みシリンジよりも好ましい。有効投薬容量は、常套的に確立され得るが、注射用組成物の典型的なヒト用量は0.5mlの容量を有する。
組成物が使用前に即時調製されるものであり(例えば、成分が凍結乾燥形態で提示される)、キットとして提示される場合、キットは、2つのバイアルを含むものであってもよく、1つの充填済みシリンジと1つのバイアルを含み、シリンジの内容物は、バイアルの内容物を注射前に再活性化させるために使用されるものであってもよい。
ワクチンとして使用される免疫原性組成物は、免疫学的有効量の抗原(1種類または複数種)、ならびに必要に応じて任意の他の成分を含む。免疫学的有効量により、単回用量または一連の用量の一部のいずれかでの該量の個体への投与が、処置または予防に有効であるを意図する。この量は、処置対象の個体の健康状態および体調、処置対象の個体の年齢、分類群(例えば、非ヒト霊長類、霊長類など)、個体の免疫機構が抗体を合成する能力、所望される防御の程度、ワクチンの配合、処置担当医による病状の評価、ならびに他の関連要素に応じて異なる。この量は、常套的な治験によって決定され得る比較的広い範囲になることが予測され、各連鎖球菌コンジュゲートの典型的な量は、1μg〜20μg/コンジュゲート(糖として測定)である(in between)。
したがって、本発明は、(a)上記のようなコンジュゲートを調製する工程;(b)該コンジュゲートを1種類以上の薬学的に許容され得る担体と混合する工程を含む、医薬組成物の調製方法を提供する。
さらに、本発明は、(a)上記のようなコンジュゲートを調製する工程;(b)該コンジュゲートと1種類以上の薬学的に許容され得る担体と混合する工程;および(c)コンジュゲート/担体混合物を、バイアルまたはシリンジなどの容器内にパッケージングして医薬製剤を得る工程を含む、医薬製剤の調製方法を提供する。シリンジ内への挿入は、工場または外科処置にて行なわれ得る。
また、本発明は、コンジュゲートを薬学的に許容され得る担体と混合する工程を含み、該コンジュゲートが上記のようなコンジュゲーション法のプロセスによって調製されたものである、糖−タンパク質コンジュゲートからの医薬組成物の調製方法を提供する。該コンジュゲーション法および混合工程は、大きく異なる時点で異なる人々によって異なる場所(例えば、異なる国)で行なわれてもよい。
また、本発明は、糖−タンパク質コンジュゲートを医薬製剤にパッケージングするための方法であって、該コンジュゲートが上記のようなコンジュゲーション法のプロセスによって調製されたものであるを提供する。該コンジュゲーション法およびパッケージング工程は、大きく異なる時点で異なる人々によって異なる場所(例えば、異なる国)で行なわれてもよい。
医薬用途
また、本発明は、該組成物を患者に投与することを含む、患者の処置方法を提供する。患者は、疾患のリスクがある患者自体であってもよく、妊娠女性(先天性免疫処置)であってもよい。患者は好ましくはヒトである。ヒトは、任意の年齢、例えば、<2歳、2〜11歳、11〜55歳、>55歳などであり得る。
また、本発明は、該組成物を患者に投与することを含む、患者の処置方法を提供する。患者は、疾患のリスクがある患者自体であってもよく、妊娠女性(先天性免疫処置)であってもよい。患者は好ましくはヒトである。ヒトは、任意の年齢、例えば、<2歳、2〜11歳、11〜55歳、>55歳などであり得る。
また、本発明は、治療における使用のための組成物を提供する。また、本発明は、疾患の処置のための医薬の製造における該組成物の使用を提供する。好ましくは、疾患はインフルエンザまたは肺炎である。
組成物は、一般的に、患者に直接投与される。直接送達は、非経口注射(例えば、経皮、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、もしくは組織の間隙空間に)、または直腸内、経口、膣内、眼経由(optical)、経皮、皮内、経眼、経鼻、耳内もしくは他の粘膜投与によって行なわれ得る。筋肉内投与(例えば、大腿または上腕への)が好ましい。注射は針(例えば、皮下注射針)によるものであり得るが、無針注射も択一的に使用され得る。典型的な筋肉内用量は0.5mlである。
本発明は、全身性および/または粘膜免疫を誘起するために使用され得る。
投薬処置は、単回用量スケジュールであってもよく、反復用量スケジュールであってもよい。反復用量は、初回刺激免疫処置スケジュールおよび/または追加刺激免疫処置スケジュールにおいて使用され得る。初回刺激用量スケジュールの後に、追加刺激用量スケジュールが行なわれ得る。初回刺激用量間(例えば、4〜16週間)、および初回刺激と追加刺激間の好適なタイミングは、常套的に決定され得る。
細菌感染は、身体の種々の領域を侵すため、該組成物は種々の形態で調製され得る。例えば、該組成物は注射用剤として、液状の液剤または懸濁剤のいずれかとして調製され得る。また、液状ビヒクル中の液剤または懸濁剤に適した注射前の固形形態を調製してもよい(例えば、凍結乾燥組成物)。該組成物は、経表面投与のためには、例えば、軟膏、クリーム剤または粉末剤として調製され得る。該組成物は、経口投与のためには、例えば、錠剤もしくはカプセル剤として、またはシロップ剤(任意選択でフレーバーを添加)として調製され得る。該組成物は、肺内投与のためには、例えば、微粉末またはスプレーを用いて吸入剤として調製され得る。該組成物は、坐剤または膣坐薬として調製され得る。
該組成物は、経鼻、経耳または経眼投与のためには、例えば、スプレー剤、滴剤、ゲル剤または粉末剤として調製され得る(例えば、参考文献143および144)。注射用組成物が好ましい。
本発明の組成物のさらなる抗原性成分
本発明の方法はまた、連鎖球菌コンジュゲートを1種類以上の以下の他の抗原:
− Haemophilus influenzae B由来糖抗原(例えば、参考文献145の第14章)
− Neisseria meningitidisの血清群B精製由来タンパク質抗原− Neisseria meningitidisの血清群B由来の外膜調製物
− A型肝炎ウイルス由来抗原、例えば、不活化ウイルス(例えば、46、147)
− B型肝炎ウイルス由来抗原、例えば、表面および/またはコア抗原(例えば、147、148)
− ジフテリア抗原、例えば、ジフテリアトキソイド(例えば、参考文献145の第13章)
− 破傷風抗原、例えば、破傷風トキソイド(例えば、参考文献145の第27章)
− Bordetella pertussis由来抗原、例えば、百日咳ホロトキシン(PT)およびB. pertussis由来線維状赤血球凝集素(FHA)(任意選択で、ペルタクチンおよび/または凝集原2や3との組み合わせも)(例えば、参考文献149および150;参考文献145の第21章)
− ポリオ抗原(1種類または複数種)(例えば、151、152)例えば、IPV(参考文献145の第24章)
− 麻疹、流行性耳下腺炎および/または風疹抗原(例えば、参考文献145の第19、20および26章)
−インフルエンザ抗原(1種類または複数種)(例えば、参考文献145の第17章)、例えば、血球凝集素および/またはノイラミニダーゼ表面タンパク質
− Moraxella catarrhalis由来抗原(例えば、153)
− Streptococcus agalactiae(B群連鎖球菌属)由来タンパク質抗原(例えば、154、155)
− Streptococcus pyogenes(A群連鎖球菌属)由来抗原(例えば、155、156、157)
− Staphylococcus aureus由来抗原(例えば、158)
と混合する工程を含むものであり得る。
本発明の方法はまた、連鎖球菌コンジュゲートを1種類以上の以下の他の抗原:
− Haemophilus influenzae B由来糖抗原(例えば、参考文献145の第14章)
− Neisseria meningitidisの血清群B精製由来タンパク質抗原− Neisseria meningitidisの血清群B由来の外膜調製物
− A型肝炎ウイルス由来抗原、例えば、不活化ウイルス(例えば、46、147)
− B型肝炎ウイルス由来抗原、例えば、表面および/またはコア抗原(例えば、147、148)
− ジフテリア抗原、例えば、ジフテリアトキソイド(例えば、参考文献145の第13章)
− 破傷風抗原、例えば、破傷風トキソイド(例えば、参考文献145の第27章)
− Bordetella pertussis由来抗原、例えば、百日咳ホロトキシン(PT)およびB. pertussis由来線維状赤血球凝集素(FHA)(任意選択で、ペルタクチンおよび/または凝集原2や3との組み合わせも)(例えば、参考文献149および150;参考文献145の第21章)
− ポリオ抗原(1種類または複数種)(例えば、151、152)例えば、IPV(参考文献145の第24章)
− 麻疹、流行性耳下腺炎および/または風疹抗原(例えば、参考文献145の第19、20および26章)
−インフルエンザ抗原(1種類または複数種)(例えば、参考文献145の第17章)、例えば、血球凝集素および/またはノイラミニダーゼ表面タンパク質
− Moraxella catarrhalis由来抗原(例えば、153)
− Streptococcus agalactiae(B群連鎖球菌属)由来タンパク質抗原(例えば、154、155)
− Streptococcus pyogenes(A群連鎖球菌属)由来抗原(例えば、155、156、157)
− Staphylococcus aureus由来抗原(例えば、158)
と混合する工程を含むものであり得る。
該組成物は、このようなさらなる抗原を1種類以上含むものであってもよい。
毒性タンパク質抗原は、必要な場合は無毒化され得る(例えば、化学的および/または遺伝学的手段による百日咳毒素の無毒化(参考文献150))。
ジフテリア抗原を組成物に含める場合、破傷風抗原と百日咳抗原もまた含めることが好ましい。同様に、破傷風抗原を含める場合、ジフテリアと百日咳の抗原も含めることが好ましい。同様に、百日咳抗原を含める場合、ジフテリアと破傷風の抗原も含める(includ6)ことが好ましい。したがって、DTPの組み合わせが好ましい。
組成物中の抗原は、典型的には、各々、少なくとも1g/mlの濃度で存在させる。一般に、任意の所与の抗原の濃度は、該抗原に対する免疫応答が誘起されるのに充分な濃度である。
本発明の免疫原性組成物にタンパク質抗原を使用する択一例として、該抗原をコードする核酸(好ましくはDNA、例えば、プラスミドの形態)が使用され得る。
抗原は、好ましくはアルミニウム塩に吸着させる。
該組成物中に含めるための好ましい非連鎖球菌抗原は、Haemophilus influenzae B型(Hib)を防御するものである;典型的には、これはHib莢膜糖抗原である。H. influenzae B由来糖抗原がよく知られている。
好都合には、特に小児において免疫原性を高めるため、Hib糖を担体タンパク質に共有結合によりコンジュゲートさせる。一般には、多糖コンジュゲート、特にHib莢膜多糖の調製に関して、充分に文献がある。
本発明では、任意の適当なHibコンジュゲートが使用され得る。好適な担体タンパク質は上記に記載しており、Rib糖に好ましい担体はCRM197(HbOC)、破傷風トキソイド(PRP−T)およびN. meningitidisの外膜複合体(PRP−OMP)である。
コンジュゲートの糖部分は多糖(例えば、完全長ポリリボシルリビトールリン酸(PRP))であり得るが、多糖を加水分解してオリゴ糖(例えば、分子量約1〜約5kDa)を形成することが好ましい。
好ましいコンジュゲートは、アジピン酸リンカーによってCRM197に共有結合によって連結されたHibオリゴ糖を含むものである(参考文献159、160)。破傷風トキソイドもまた好ましい担体である。
Hib抗原の投与により、好ましくは>0.15μg/ml、より好ましくは1μg/mlの抗PRP抗体濃度がもたらされる。
該組成物がHib糖抗原を含む場合、ともに水酸化アルミニウムアジュバントを含まないことが好ましい。組成物がリン酸アルミニウムアジュバントを含む場合、Hib抗原は、アジュバントに吸着させてもよく(参考文献161)、非吸着型であってもよい(参考文献162)。吸着の抑制は、抗原/アジュバントの混合時の正しいpH、適切な荷電ゼロ点を有するアジュバント、および組成物中の種々の異なる抗原の適切な混合順序(参考文献163)を選択することによりなされ得る。
本発明の組成物は、1種類より多くのHib抗原を含むものであってもよい。Hib抗原は、例えば、髄膜炎菌組成物での再構成のための凍結乾燥されたものであってもよい。したがって、Hib抗原は、髄膜炎菌コンジュゲートとは別にパッケージングしてもよく、ともに混合してもよい。
本発明の組成物に含めるための他の非連鎖球菌抗原は、性感染病(STD)由来のものである。かかる抗原により、クラミジア感染、陰部疱疹、肝炎(HCVなど)、陰部疣贅、淋病(gonorrhoeae)、梅毒および/または軟性下疳などのSTDの予防または治療が提供され得る(参考文献164)。抗原は、1種類以上のウイルス性または細菌性STDに由来するものであってもよい。本発明における使用のためのウイルス性STD抗原は、例えば、HIV、単純疱疹ウイルス(HSV−1やHSV−2)、ヒトパピローマウイルス(HPV)、および/または肝炎(HCV)に由来するものであり得る。本発明における使用のための細菌性STD抗原は、例えば、Neisseria gonorrhoeae、Chlamydia trachomatis、Treponema pallidum、Haemophilus ducreyiまたは大腸菌に由来するものであり得る。
本発明の実施には、特に記載のない限り、当該技術分野の技能の範囲内である分子生物学、微生物学、組換えDNAおよび免疫学の慣用的な手法が使用される。かかる手法は、文献に充分説明されている。例えば、DNA Cloning,第I巻および第II巻(D.N Glover編1985);Oligonucleotide Synthesis(MT Gait編,1984);Nucleic Acid Hybridization(B.D. Hames & ST Higgins編1984);Transcription and Translation(B.D. Hames & ST
Higgins編1984);Animal Cell Culture(R.I. Freshney編1986);Immobilized Cells and Enzymes(IRL Press,1986);B. Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning(1984);the Methods in Enzymologyシリーズ(Academic Press,Inc.),特に、第154巻および第155巻;Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.H. Miller and M.P. Calos編1987,Cold Spring Harbor Laboratory);Mayer and Walker編(1987),Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology(Academic Press,London);Scopes,(1987)Protein Purification:Principles and Practice,第2版(Springer−Verlag,N. Y.),Handbook of Experimental Immunology,第I〜IV巻(D.M. WeirおよびC. C. Blackwell編1986),Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,第19版(1995);Methods In Enzymology(S. ColowickおよびN. Kaplan編,Academic Press,Inc.);ならびにHandbook of Experimental Immunology,第I〜IV巻(D.M. WeirおよびC.C. Blackwell編,1986,Blackwell Scientific Publications);Sambrookら,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版,1989);Handbook of Surface and Colloidal Chemistry(Birdi,K.S.編,CRC Press,1997);Short Protocols in Molecular Biology,第4版(Ausubelら編,1999,John Wiley & Sons);Molecular Biology Techniques:An Intensive Laboratory Course,(Reamら編,1998,Academic Press);PCR (Introduction to Biotechniques Series),第2版(Newton & Graham編,1997,Springer Verlag);ならびにPetersおよびDalrymple,Fields Virology(第2版),Fieldsら(編),B.N. Raven Press,New York,NYを参照のこと。
Higgins編1984);Animal Cell Culture(R.I. Freshney編1986);Immobilized Cells and Enzymes(IRL Press,1986);B. Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning(1984);the Methods in Enzymologyシリーズ(Academic Press,Inc.),特に、第154巻および第155巻;Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.H. Miller and M.P. Calos編1987,Cold Spring Harbor Laboratory);Mayer and Walker編(1987),Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology(Academic Press,London);Scopes,(1987)Protein Purification:Principles and Practice,第2版(Springer−Verlag,N. Y.),Handbook of Experimental Immunology,第I〜IV巻(D.M. WeirおよびC. C. Blackwell編1986),Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,第19版(1995);Methods In Enzymology(S. ColowickおよびN. Kaplan編,Academic Press,Inc.);ならびにHandbook of Experimental Immunology,第I〜IV巻(D.M. WeirおよびC.C. Blackwell編,1986,Blackwell Scientific Publications);Sambrookら,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版,1989);Handbook of Surface and Colloidal Chemistry(Birdi,K.S.編,CRC Press,1997);Short Protocols in Molecular Biology,第4版(Ausubelら編,1999,John Wiley & Sons);Molecular Biology Techniques:An Intensive Laboratory Course,(Reamら編,1998,Academic Press);PCR (Introduction to Biotechniques Series),第2版(Newton & Graham編,1997,Springer Verlag);ならびにPetersおよびDalrymple,Fields Virology(第2版),Fieldsら(編),B.N. Raven Press,New York,NYを参照のこと。
本明細書では、ヌクレオチドおよびアミノ酸の標準的な略号を使用する。
本明細書で挙げた刊行物、特許および特許出願はすべて、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。
実施例
本明細書における方法を例示するため、GBS疾患を有する患者から単離したStreptococcus agalactiae 090、H36b、M781、およびCBJ111(これらから、4つの代表的な血清型(Ia、Ib、III、およびV)が得られる)を試験した。
本明細書における方法を例示するため、GBS疾患を有する患者から単離したStreptococcus agalactiae 090、H36b、M781、およびCBJ111(これらから、4つの代表的な血清型(Ia、Ib、III、およびV)が得られる)を試験した。
実施例1−5リットルおよび20リットルでの発酵
A)播種材料調製プロセスの開発
3種類のGBS血清型の培養試験を、1000mLの播種材料培養物:8g/LのNa2HPO4二水和物(Merck)、2g/LのNa2HPO4一水和物(Merck)、17g/Lの自己分解型酵母抽出物(Difco laboratories)、1mg/Lのビオチン(Merck)および33g/LのD−グルコース一水和物(Merck)を入れた5000mL容のバッフルなしの振盪フラスコにおいて行なった。化合物はすべて逆浸透水(ROW)に溶解させ、0.22μm孔径膜フィルター(Nalgene)に通す濾過によって滅菌し、次いで、オートクレーブ内で122℃で30分間滅菌した5000mL容三角フラスコに無菌的に添加した。
A)播種材料調製プロセスの開発
3種類のGBS血清型の培養試験を、1000mLの播種材料培養物:8g/LのNa2HPO4二水和物(Merck)、2g/LのNa2HPO4一水和物(Merck)、17g/Lの自己分解型酵母抽出物(Difco laboratories)、1mg/Lのビオチン(Merck)および33g/LのD−グルコース一水和物(Merck)を入れた5000mL容のバッフルなしの振盪フラスコにおいて行なった。化合物はすべて逆浸透水(ROW)に溶解させ、0.22μm孔径膜フィルター(Nalgene)に通す濾過によって滅菌し、次いで、オートクレーブ内で122℃で30分間滅菌した5000mL容三角フラスコに無菌的に添加した。
一連の振盪実験の各々について、培地(pH=7.3)に、異なる容量の解凍培養物(作業種菌株は、10%グリセロール中に−70℃で保存した)を播種し、水平型振盪器の小室(Innova 4330、偏心式 1インチ)内で、200rpmで攪拌しながら35℃でインキュベートした。
培養中の種々の時点で、590nmにおける光学密度を測定し(Spectrophotometer novaspecII−Pharmacia Biotech)、また、光学密度値が0.5以上になったとき、pH値もモニターした(pHメーターMetrohm)。対数期の期間中の倍加時間を、増殖曲線の線形部分の回帰解析によって求めた。直線の傾きは、最大比増殖速度μmax、および式td=ln2/μによる倍加時間(td)に相当する。
B)5リットルおよび20リットル容発酵槽の準備
槽を満たし、培養培地を滅菌する前、発酵槽の計器(pH電極およびpO2メーター)を、標準的な方法を用いて較正した。
槽を満たし、培養培地を滅菌する前、発酵槽の計器(pH電極およびpO2メーター)を、標準的な方法を用いて較正した。
GBSは栄養要求性生物であるため、その増殖に必要とされる特定の有機化合物(アミノ酸やビタミンなど)を合成する能力をもたない。このため、WO07/052168に記載のような、動物起源の成分を含まない低コスト複合培地が開発された。
多糖の生産に使用した基本培地は、2g/LのNa2HPO4二水和物(Merck)、16.7g/Lの自己分解型酵母抽出物(Difco laboratories)、32g/LのD−グルコース一水和物(Merck)、1mg/Lのビオチン(Merck)、0.5mg/Lの塩酸チアミン(BDH Laboratories)、0.5mg/Lのリボフラビン(Fluka)、0.5mg/Lのニコチン酸(Carlo Erba)0.5mg/Lの塩酸ピリドキシン(Sigma)および起泡の形成を抑制するための1mL.L−1ポリプロピレングリコール(BDH Laboratories)を含むものとした。
空の培養槽の滅菌は可能でないため、発酵槽に、リン酸塩、酵母抽出物およびポリプロピレングリコール(7L容発酵槽では4.2L、および30L容発酵槽では16L)を満たし、121℃で30分間インサイチュ滅菌した。滅菌中、一部液体が蒸発した。蒸発による液体の正確な減損量は培地の高さで経験的に評価されるため、滅菌前に過剰量の水を添加した(7L容発酵槽では0.5L、および30L容発酵槽では1L)。
パラレルで、D−グルコース一水和物の濃縮溶液(550g/L)とビタミン(塩酸チアミン、ニコチン酸、塩酸ピリドキシンは0.5g/L、リボフラビンは0.05g/L、およびビオチンは0.2g/L)をROWに溶解させ、0.22μm孔径膜フィルター(Nalgene)に通す濾過によって別々に滅菌し、次いで発酵槽に無菌的に添加し、発酵槽内での適正な終濃度を得た(7L容発酵槽では:300mLのD−グルコース一水和物、25mLのビオチン、5mLのビタミン溶液(塩酸チアミン、ニコチン酸、塩酸ピリドキシン)および50mLのリボフラビン;30L容発酵槽では:1000mLのD−グルコース一水和物、100mLのビオチン、17mLのビタミン溶液および170mLのリボフラビン)。
C)5Lおよび20L容発酵槽中での培養
GBSによるcpの発現は、細菌病原体の莢膜内の他のものの場合と同様、構成的ではなく、インビトロでの培養中および種々の感染部位から単離された初代培養物において種々である(参考文献173)。かかる観察結果にもかかわらず、GBSにおけるこの表面発現炭水化物抗原の調節についてはほとんどわかっていない。連続式培養における菌体増殖速度は、既に、莢膜多糖の生産を調節する主要因子であることが報告され、III型莢膜多糖の増殖速度依存性生産は、増殖制限栄養素とは独立して起こった。実際、cpの生産は、菌体を高速(1.4時間−1)の質量倍加時間で保持した方が、低速(11時間−1)培養よりも多かった(参考文献174)。
GBSによるcpの発現は、細菌病原体の莢膜内の他のものの場合と同様、構成的ではなく、インビトロでの培養中および種々の感染部位から単離された初代培養物において種々である(参考文献173)。かかる観察結果にもかかわらず、GBSにおけるこの表面発現炭水化物抗原の調節についてはほとんどわかっていない。連続式培養における菌体増殖速度は、既に、莢膜多糖の生産を調節する主要因子であることが報告され、III型莢膜多糖の増殖速度依存性生産は、増殖制限栄養素とは独立して起こった。実際、cpの生産は、菌体を高速(1.4時間−1)の質量倍加時間で保持した方が、低速(11時間−1)培養よりも多かった(参考文献174)。
最初に、GBSでの試験はすべて、増殖速度、栄養素濃度およびpHを変化させることを特徴とするバッチ式培養での菌体培養を用いて行なった。バッチ式培養での菌体が受ける増殖パラメータシフトにより、代謝の変化がもたらされ、これは菌体の組成に影響を及ぼす。連続式培養では、安定な基質、生成物およびバイオマス濃度の環境ならびに研究者によって制御される速度において、連続的な対数増殖が可能である。増殖速度条件が維持されている場合、定常状態に達する。しかしながら、連続式培養は、菌株安定性の問題および夾雑を有する傾向にあり、また、培地と栄養素を連続的に供給する必要があるため、製造規模では費用がかかるので、工業用生産では回避するのがよい。
5L−および20L規模での培養を、それぞれ、全容積6.9Lおよび31Lを有するBiostat CT5−2およびC20−3反応器(B. Braun Biotech International)において行なった。バイオリアクターには、それぞれ、各々6つのパドルを含む2〜3個の攪拌器を備え付けた。また、溶存酸素濃度(Inpro 6500シリーズ2酸素センサー;Mettler Toledo)、pH(型番Pa/2;Mettler Toledo)、温度(pt100電極、M.K. Juchleim GmbH)、起泡(型番L300/Rd.28;B. Braun Biotech International)を測定するための蒸気滅菌性プローブのためのポートを利用可能にした。操作は、MFCs/winソフトウェアパッケージ(B. Braun Biotech International)と組み合わせたDCU−3デジタル制御ユニットにより制御および記録した。バイオリアクター内に残存する消費ガス中の炭素酸素および酸素の濃度を、1310発酵槽モニター(Innova)およびGMUX−8解析装置(B. Braun Biotech International)を用いて測定した。
培養は、36℃±1℃で、0.2バールの圧力およびpO2=30±10%飽和(培地中)で行ない、これを、7L容発酵槽では100±10%〜700±10%rpm、および30L容発酵槽では50±10%〜500±10%rpmの攪拌速度、ならびに0.1および1.0v/v/m±10%の曝気速度によって制御した。培地のpHは、4M水酸化ナトリウムの添加の制御によって自動で73±0.2に維持した。温度、pHおよび攪拌などの種々のパラメータのモニタリングおよび/または制御は、PID制御ユニットにて行なった。起泡は、消泡剤乳剤(BDH Laboratories)により自動制御した。
1000mLの播種材料用滅菌培地に、適応作業種菌株容量の試験対象菌株を播種し、回転式振盪器にて振盪しながら35℃で所望の期間インキュベートした。フラスコの播種材料が対数増殖中期(ODが0.8〜1.2)に達したら、0.032の初期ODが得られるのに充分な容量のこの培養物を、新鮮バッチ用培地(4.7Lまたは17L)への播種に使用した。
バッチ相の発酵は、培養物のOD590nmが2.5(±0.5)に達するまで進行させることが可能であった。培養物が、このOD値またはその付近になったとき、酵母抽出物培地(150g/L)の最初の対数増殖期フィードバッチ式添加を開始し、45〜50分間継続して比増殖速度(ρ)0.138時間−1を維持した。0.924時間−1のμを維持するための酵母抽出物培地(150g/L)の2回目の対数増殖期フィードバッチ式添加は、最初の部の終了時、ODが4.5±0.5になったときに開始し、45〜50分間継続した。このような添加相により、細菌の倍加時間が、バッチ相に典型的な20〜25分間から、理想的な多糖生産条件に微生物を適応させることが可能となる45分間に減弱された。最終的に、生産性を増大させるため、2回目の酵母抽出物の添加終了時、ODが10.0±2になったとき、濃縮D−グルコース一水和物(550g/L)のpH調節型供給を用いて培養を3時間継続し、色素生成および莢膜多糖生産低下がもたらされ得る基質の完全な枯渇を回避した。
50mLの少量の試料を培養液から、発酵時プロセス期間の度に抜き取り、細菌の培養、グルコース消費量および多糖の生産について解析した。
D)GBSの回収および不活化
増殖速度が一貫して低下するようなったとき(これは、pH制御グルコース相の開始から3時間後に起こった)、培養物を回収した。培養物を、直ちに、周囲温度で45分間7741×gにて遠心分離した(AvantiTM遠心分離機J−20 XPI Beckmam coulter)。上清みを除去し、グルコースアッセイ用に−20℃で保存し、回収重量を測定した。
増殖速度が一貫して低下するようなったとき(これは、pH制御グルコース相の開始から3時間後に起こった)、培養物を回収した。培養物を、直ちに、周囲温度で45分間7741×gにて遠心分離した(AvantiTM遠心分離機J−20 XPI Beckmam coulter)。上清みを除去し、グルコースアッセイ用に−20℃で保存し、回収重量を測定した。
GBS多糖の精製は、最初に、cpの不活化と加水分解が必要であった。1Mの水酸化ナトリウムをペレットに添加し、0.8Mの終濃度を得た。反応混合物を37℃および120rpmで36時間インキュベートした後、血清型特異的cpの含有量を調べた。
E)発酵槽のクリーニング
培養物を回収した後、槽および付属機器を除染した。まず、発酵槽にROWを満たし、4M水酸化ナトリウムを手作業で添加することによりpHを12に上げた。水を80℃まで30分間加熱し、熱の均一な分散が確保される0.2バールの圧力および200rpmでの攪拌を維持することにより消毒を行なった。消毒が終了したら、水酸化ナトリウムを含む水を回収し、pH値が5〜7の範囲に低下するまで発酵槽をROWで洗浄した。一般的に、所望のpHに達するまで3回の洗浄が必要であった。発酵槽を空にし、プローブおよび付属機器をそのポートから外し、播種および追加栄養素や腐食性薬剤の移送のためのセプタムコネクター、ならびに試料の取り出しおよび保存のためのビンを、オートクレーブ内で30分間122℃にて別々に滅菌した。再度、発酵槽にROWを満たし、121℃で30分間滅菌した。
培養物を回収した後、槽および付属機器を除染した。まず、発酵槽にROWを満たし、4M水酸化ナトリウムを手作業で添加することによりpHを12に上げた。水を80℃まで30分間加熱し、熱の均一な分散が確保される0.2バールの圧力および200rpmでの攪拌を維持することにより消毒を行なった。消毒が終了したら、水酸化ナトリウムを含む水を回収し、pH値が5〜7の範囲に低下するまで発酵槽をROWで洗浄した。一般的に、所望のpHに達するまで3回の洗浄が必要であった。発酵槽を空にし、プローブおよび付属機器をそのポートから外し、播種および追加栄養素や腐食性薬剤の移送のためのセプタムコネクター、ならびに試料の取り出しおよび保存のためのビンを、オートクレーブ内で30分間122℃にて別々に滅菌した。再度、発酵槽にROWを満たし、121℃で30分間滅菌した。
実施例2−2リットルでの発酵
A)菌株および培養培地
Streptococcus agalactiaeIII型菌株M781(最初に、GBS髄膜炎を有する新生児から単離された)を、Carol J. Baker氏によりご提供頂いた。M781菌株細胞は、改変型の化学的に規定される培地(最初は、A群連鎖球菌のために開発(参考文献174))中で培養した。バッチ式培養試験に使用した化学的に規定される培地の組成を表1に示す。
A)菌株および培養培地
Streptococcus agalactiaeIII型菌株M781(最初に、GBS髄膜炎を有する新生児から単離された)を、Carol J. Baker氏によりご提供頂いた。M781菌株細胞は、改変型の化学的に規定される培地(最初は、A群連鎖球菌のために開発(参考文献174))中で培養した。バッチ式培養試験に使用した化学的に規定される培地の組成を表1に示す。
B)2L規模での培養
菌株M781による莢膜多糖の発現に関する予備実験を、バッチ式培養において行なった。
菌株M781による莢膜多糖の発現に関する予備実験を、バッチ式培養において行なった。
菌体の活性化のため、100mLの化学的に規定される培地(pH値=7.2、6M塩素酸(chlorhydric acid)を用いて調整)(0.22μm孔径膜フィルター(Nalgene)に通す濾過によって滅菌済み)を滅菌した500mL容三角フラスコ内に入れ、0.1mLのM781菌株解凍培養物を播種した(作業種菌株は、10%グリセロール中に−70℃で保存した)。この種培養物を、35℃にて200rpmで攪拌しながら、水平型振盪器の小室(Innova 4330、偏心式1インチ)内で9時間インキュベートした。次いで、種培養物を2.5L容のジャケット付き発酵槽(Applikon)内の1.8Lの基本培地中に播種し、このとき初期ODは0.4であった。
発酵は、デジタル測定およびApplikon Instruments製の制御ユニット(Biol controller ADI 1030、Applikon)によって制御し、データはすべてコンピュータ(BioXpertソフトウェア)によって収集した。温度は、外部サーモスタット(Haake)によって36℃に自動制御した。溶存O2を滅菌性電極(Applisens)によって測定し、150〜1000rpmの攪拌速度(Motor Controller ADI 1012)および0.1〜1.0v/v/mの曝気速度(Flow console Applikon)の自動調整によって30%より高い空気飽和に維持した。培養物のpHは、2M水酸化ナトリウム(ポンプ送達Masterflex)により、自動滴定によって7.3に維持した。
未知の増殖制限因子を用いたフィードバッチ式培養試験では、培養をバッチ培養相(1.2L)で開始した後、フィード相を行なった。最良のフィードバッチ式ストラテジーを開発するため、3つフィードバッチ式手法を各菌体増殖:(1)pH−stat、(2)DOT−stat、および(3)対数増殖について試験した。cp濃度を一定間隔でモニターした。
pH−stat法を用いた基質供給を制御するため、培養培地のpHを、培養プロセス中、蠕動ポンプ(Masterflex Concode Drive)による供給溶液の添加によって7.3に調整した。pHが設定点である7.3を超えた場合は、グルコースを枯渇させた。そのため、補給栄養素を自動添加して、pHを設定点に再調整した。
pO2−statストラテジーでは、pO2が溶存酸素の設定点40%より上まで上昇した場合はいつでも、炭素源の供給量を自動添加した。
対数増殖培養手法では、蠕動ポンプを対数期の終了時に作動させ、莢膜多糖の生産のための至適倍加時間である0.92時間−1(td=45分)の比増殖速度を維持した。
供給は、下記の式:
供給は、下記の式:
C)増殖因子要求量を特定するための振盪フラスコ試験
生物体の増殖因子要求量を、個々の栄養素を規定培地から除外すること、および得られた培地によって増殖が補助され得るかどうかを調べることによって求めた。この試験は、100mLの化学的に規定される培地(表1参照)を入れた500mL容のバッフルなしの振盪フラスコ内で行なった。
生物体の増殖因子要求量を、個々の栄養素を規定培地から除外すること、および得られた培地によって増殖が補助され得るかどうかを調べることによって求めた。この試験は、100mLの化学的に規定される培地(表1参照)を入れた500mL容のバッフルなしの振盪フラスコ内で行なった。
培養培地のpHを、6M塩素酸を用いて7.2に調整した。次いで、培養培地を0.22μm孔径膜フィルター(Nalgene)に通す濾過によって滅菌した。一連の振盪実験の各々について、培養培地に、0.1mLのM781菌株解凍培養物(作業種菌株は、10%グリセロール中に−70℃で保存した)を播種し、水平型振盪器の小室(Innova 4330、偏心式1インチ)内で、200rpmで攪拌しながら35℃でインキュベートした。18時間の培養後、590nmにおけるOD(Spectrophotometer novaspecll−Pharmacia Biotech)およびpH値(pHメーターMetrohm)を測定した。
アミノ酸とビタミンが欠乏した培地における増殖を、すべての化合物を存在させた対照培養と比較した。
実施例3-解析方法
A)増殖の測定
試料を採取したらすぐに、波長590nmにおける培養物のOD読み取ることによってバイオマスの含有量をモニターした(Novaspec II分光測光器−Pharmacia bioteck)。0.10〜0.50の間隔内の吸光度の値を読み取るため、試料の希釈を行なった。
A)増殖の測定
試料を採取したらすぐに、波長590nmにおける培養物のOD読み取ることによってバイオマスの含有量をモニターした(Novaspec II分光測光器−Pharmacia bioteck)。0.10〜0.50の間隔内の吸光度の値を読み取るため、試料の希釈を行なった。
正確に測定した容量の培養液(30mL)を、予め乾燥および重量測定しておいた50mL容のポリプロピレン製遠心分離用チューブ内に入れることにより、g/L化学的に規定される培地で規定される菌体濃度を調べた。菌体を、Avanti−TM JA−20
XPI Beckman Coulter冷蔵型遠心分離機内で、27,217×gで45分間4℃にて遠心分離した。上清みをデカンテーションし、菌体ペレットを85℃の炉内で24時間乾燥させ、重量測定した。590nmにおけるODとgCDW/L(乾燥菌体重量)バイオマスとの関係を確立した。590nmにおける1ODは、0.44gCDW/Lバイオマスであった。
XPI Beckman Coulter冷蔵型遠心分離機内で、27,217×gで45分間4℃にて遠心分離した。上清みをデカンテーションし、菌体ペレットを85℃の炉内で24時間乾燥させ、重量測定した。590nmにおけるODとgCDW/L(乾燥菌体重量)バイオマスとの関係を確立した。590nmにおける1ODは、0.44gCDW/Lバイオマスであった。
B)グラム染色
グラム染色により、2つの主要な細胞壁の型が識別される。少量のペプチドグリカンおよび特徴的にはリポ多糖を含有する細胞壁を有する細菌種はグラム陰性であり、一方、比較的大量のペプチドグリカンを含有し、リポ多糖を含まない細胞壁を有する細菌はグラム陽性である。この方法を、研究室規模とパイロット規模の両方で使用し、種培養物および発酵槽培養物は純粋であるという確証を得た。
グラム染色により、2つの主要な細胞壁の型が識別される。少量のペプチドグリカンおよび特徴的にはリポ多糖を含有する細胞壁を有する細菌種はグラム陰性であり、一方、比較的大量のペプチドグリカンを含有し、リポ多糖を含まない細胞壁を有する細菌はグラム陽性である。この方法を、研究室規模とパイロット規模の両方で使用し、種培養物および発酵槽培養物は純粋であるという確証を得た。
染色手法に関して、顕微鏡スライド上の菌体を熱固定し、塩基性染料であるクリスタルバイオレット(これは、すべての細菌細胞を青色に染色する)で染色した。次いで、菌体をヨウ素−ヨウ化カリウム溶液で処理した。これにより、ヨウ素が菌体内に進入し、クリスタルバイオレット染料とともに水不溶性複合体を形成することが可能であった。菌体を、ヨウ素−クリスタルバイオレット複合体が可溶性となるアルコール溶媒で処理した。溶媒での処理後、グラム陽性菌体のみが染色されたままであった。
染色手順後、菌体を対比染色剤サフラニンで処理し、脱色されたグラム陰性菌体を可視化した。対比染色されたグラム陰性菌体は赤色になり、一方、グラム陽性菌体は青色のままであった。対比染色剤を洗い流した後、スライドをゆっくりと加温して残留湿分(あれば)を除去した。次いで、スライドを顕微鏡ステージ上に置き、ここで、油に浸漬させたレンズを浸漬油中に沈めた。
C)グルコースアッセイ
培養上清み中において、1cmの光路長および340nm(NADPH)における溶液の吸光度を測定し、これを、純粋なグルコースのアッセイによって作成した標準曲線と比較することにより、グルコース消費量を比色分析によって調べた。
培養上清み中において、1cmの光路長および340nm(NADPH)における溶液の吸光度を測定し、これを、純粋なグルコースのアッセイによって作成した標準曲線と比較することにより、グルコース消費量を比色分析によって調べた。
D−グルコースは、酵素ヘキソキナーゼおよびATPの存在下でD−グルコース−6−リン酸にリン酸化されると同時に、ADPの形成を伴った:
このアッセイ中に存在したD−グルコースの量は1μg〜50μgであった。充分な吸光度の差を得るため、0.08〜0.5g/LのD−グルコース濃度が得られるように試料溶液を希釈した。
酵素反応を止めるために冷蔵庫内で−20℃で保存していた上清みを、ROW中で連続希釈した。50μLの希釈上清みを、周囲温度で15分間、ヘキソキナーゼ(およそ320U)とグルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ(およそ160U)を含み、NADP、ATPおよび硫酸マグネシウムを加えたトリエタノールアミンバッファー(pH=7.6)溶液10μLとともにインキュベートした。
使い捨てキュベット(1cm光路長)内でRoche手順に従って試料を調製後、分光測光測定を、室温にて340nmで空気に対して行なった。
D)莢膜多糖含有量の測定
N−アセチル−D−ノイラミン酸(シアル酸)は、真核細胞の炭水化物構造体(糖タンパク質および糖脂質)の一成分として高頻度に見られる酸性の糖である。原核生物細胞でも、シアル酸は、いくつかの病原性細菌属のcpの一構成成分として見い出された[10]。実際、GBSの血清型特異的cpは、以下の糖:N−アセチル−ノイラミン酸あるいはシアル酸、グルコース、ガラクトースおよびN−アセチルグルコサミンの反復単位を含む。シアル酸は多糖の不可欠な成分であるため、その定量的測定を使用し、Svennerholmによる化学的方法の設定(参考文献176)に従って血清型特異的cp生産をモニターした。
N−アセチル−D−ノイラミン酸(シアル酸)は、真核細胞の炭水化物構造体(糖タンパク質および糖脂質)の一成分として高頻度に見られる酸性の糖である。原核生物細胞でも、シアル酸は、いくつかの病原性細菌属のcpの一構成成分として見い出された[10]。実際、GBSの血清型特異的cpは、以下の糖:N−アセチル−ノイラミン酸あるいはシアル酸、グルコース、ガラクトースおよびN−アセチルグルコサミンの反復単位を含む。シアル酸は多糖の不可欠な成分であるため、その定量的測定を使用し、Svennerholmによる化学的方法の設定(参考文献176)に従って血清型特異的cp生産をモニターした。
シアル酸の量を測定する前、不活化試料中のcpを一部精製し、濃縮した。水酸化ナトリウム中での36時間の多糖の加水分解後、1.5mLの不活化試料を15600×gで25分間遠心分離し(Centrifuge 5415R−Eppendorf)、菌体を除去した。上清みをROW中で1:10に希釈し、次いで、セントリコン遠心フィルター(Millipore’s Ultracel YM−30再生セルロース)を用いて精製および濃縮した。濃縮は、下記の手順に従い、異方性膜によって希釈試料を限外濾過(utrafilter)することにより行なった。
試料レザバーを濾液用バイアル内に挿入した後、試料レザバーに1.5mLの水を2回添加し、2519×gで20℃にて20分間スピンさせ、セントリコンシステムを清浄にした。このシステムの準備ができたら、1.5mLの希釈試料を添加し、2519×gで30分間遠心分離した。遠心力により、溶媒と低分子量の溶質は膜を通過して濾液用バイアル内に入った。cpなどの巨大分子は、試料レザバー内部の膜上に保持された。試料容量を少なくすると、保持溶質濃度は増大した。保持液を0.5mLの0.5M NaClで3回洗浄して夾雑物を排除し、2519×gで20℃にて20分間遠心分離した。
回収のため、0.5mLの0.5mol.L−1 NaClを試料レザバーに添加した。cpを保持液用バイアルに、該バイアルを試料レザバー上に置いてこのデバイスを反転させることにより移し、次いで205×gで1分間遠心分離した。この回収プロセスを2回繰り返し、すべてのcpを回収した。
シアル酸の量を定量するため、レゾルシノール−塩酸を伴う比色分析法を使用した。この定量的アッセイのための試薬は、酸加水分解を確実にするための80mLの37%HCl、20mLの水および20μmolのCuSO45H2O(Merck)を含有する溶液中に0.2gのレゾルシノール(Merck)を含むものとした。
アッセイは、以下のようにして行なった。5〜25μgのシアル酸を含有する1mLの試料を、2mLのレゾルシノール試薬に添加した。試薬の添加後、溶液を混合し、沸騰水浴中で100℃にて20分間加熱し、この間、青紫色の発色が見られた。
チューブを室温で冷却し、Novaspec 11分光測光器を用いて554nmにおける吸光度を読み取った。光路長1cmおよび容積1mLの使い捨てキュベットを使用した。吸光度は、シアル酸5〜25μgの範囲で濃度に正比例した。
生物学的材料中の非特異的発色を補正するため、対照試料をレゾルシノールなしで操作した。シアル酸の量の計算の前に、ブランク試料の吸光度を試験試料から差し引いた。
パラレルで、0、5、10、15、20および25μgのN−アセチルシアル酸の標準溶液を、同じ条件下で調製した。N−アセチルシアル酸の標準溶液からプログラムUV LAMBDAにより誘導した等式を使用し、N−アセチルシアル酸の量を計算した。
090、H36bおよびM781の莢膜多糖は、31%(w/w)のN−アセチルシアル酸を含む。CJB111の莢膜多糖は、23%(w/w)のN−アセチルシアル酸を含む。したがって、cp濃度は、この補正因子を用いて確認され得る。cpの容積生産性を単位mg/Lで示し、比cp生産量を単位mg/L.ODで示した。
実施例4-単純化複合培地および線形添加
A)播種材料調製プロセスの開発
GBSの血清型特異的cpを生産するための発酵プロセスにおいて、500mLの培地を入れた2000mL容振盪フラスコを播種材料培養物の調製に使用した。しかしながら、このようなフラスコは、パイロット規模および生産規模には適していなかった。したがって、4種類のGBS菌株(090、H36b、M781、およびCJB111)の挙動を、パイロット規模に適した播種材料調製プロセスを開発するための新たなフラスコにおいて試験した。次いで、この手順を使用し、cGMPに従う第I相治験前のロットを作製した。
A)播種材料調製プロセスの開発
GBSの血清型特異的cpを生産するための発酵プロセスにおいて、500mLの培地を入れた2000mL容振盪フラスコを播種材料培養物の調製に使用した。しかしながら、このようなフラスコは、パイロット規模および生産規模には適していなかった。したがって、4種類のGBS菌株(090、H36b、M781、およびCJB111)の挙動を、パイロット規模に適した播種材料調製プロセスを開発するための新たなフラスコにおいて試験した。次いで、この手順を使用し、cGMPに従う第I相治験前のロットを作製した。
この実施例の第1の目的は、1000mLの培地を入れた5000mL容三角フラスコにおいて、これらの4種類のGBS菌株の増殖パラメータを見い出すこと、また、発酵槽内で適当なpH値での指数増殖後期に必要とされる至適培養時間を試験することであった。第2の目的は、菌株の増殖速度に応じて、培養期間が発酵日の前の晩(培養時間は約8時間)または発酵日の早朝(培養時間は約3時間)のいずれかに開始され得るように修正するために、フラスコへの播種に使用される作業種菌株の容量を試験することであった。
3種類のGBS血清型の試験を、1000mLの新鮮滅菌播種材料培地に播種する3mLの作業種菌株を用いて行なった。さらに、再現性を裏付けるため、各実験を2回行なった。しかしながら、得られた増殖曲線および倍加時間は類似していたため、各実験の一方の結果のみを示した。
090菌株では、菌体は指数増殖期を6.5時間維持し、倍加時間は30分であった(μmax=1.41時間−1)。したがって、6時間は、適当なpH値6.8を用いて指数増殖中期を得るのに充分であった)。この長さの時間は、発酵日の前の晩でのフラスコへの播種に充分でなかったため、この培養時間を長くするため、作業種菌株容量を0.1mLに減らした。この条件下では、細菌は指数増殖期を8.5時間維持し、倍加時間は35分であった(μmax=1.20時間−1)。したがって、この菌株の播種材料培養物の調製には8時間必要であった。
H36b菌株では、3mLの作業種菌株を用いて1回だけ実験を行なった。菌体は、すぐに指数増殖期に入り、倍加時間は25分であり(μmax=1.65時間−1)、減速相は4.5時間後に始まった。したがって、6.5前後(7+0.5)のpH値で0.8〜1.2の範囲のODを得るためには、この菌株の培地には、発酵の4時間前に播種しなければならなかった。
M781菌株では、実験を2回行ない、最初は、3mLの作業種菌株容量を使用し、次は0.1mLを使用した。3mLの作業種菌株容量を使用すると、培養時間に7.5時間が必要であった。一晩の培養(5倍加時間)を可能にするために培養時間を2.5時間長くするため、0.1mLの作業種菌株容量を使用した。時間差は30分だけであること、および倍加時間が31.4分(μmax=1.32時間−1)から27.5分(μmax=1.51時間−1)に短縮されたことが観察された。したがって、この菌株で0.1mLの作業種菌株容量を使用すると、フラスコには、発酵の8時間前に播種しなければならなかった。
CJB111菌株では、3mlの作業種菌株を用いて1回だけ実験を行なった。菌体は、すぐに指数増殖期に入り、倍加時間は21分であり(μmax=1.98時間−1)、減速相は4.5時間後に始まった。したがって、6.5前後(7.0+/−0.5)のpH値で0.8〜1.2の範囲のODを得るためには、培地には、発酵の4時間前に播種しなければならなかった。
この新しい播種材料プロセスがパイロット規模に移行され得る前に、4種類のGBS菌株の挙動をcGMP条件において試験し、播種材料調製プロセスを確認した。医薬品および医薬部外品の製造管理および品質管理の基準(第4巻)に報告のとおり:「確認試験は規定の手順に従って行なった。任意の新しい製造方式または調製方法を適合させる場合、常套的なプロセスに対する好適性が実証される工程を採用すべきである。指定の材料および設備機器を使用する規定のプロセスは、一貫して必要量の生成物が得られることが示されたものでなければならない」。各菌株の至適作業種菌株容量を用いて、新しい播種材料調製プロセスを繰り返した。増殖挙動は先の試験と同一であった。090菌株では、作業種菌株容量を0.1mLとし、ODが1±0.2でありpHが6.5±0.2である所望の範囲が得られる培養時間は8.50時間であった。H36b菌株では、作業種菌株容量を3mLとし、後期対数期が得られる培養時間は4時間であった。M781菌株では、作業種菌株容量を0.1mLとし、所望のOD範囲0.8〜1.2が得られる培養時間は7.50時間であった。CJB111菌株では、作業種菌株容量を3mLとし、所望のODが得られる培養時間は4時間であった。
この播種材料調製プロセスをパイロット規模で使用し、200L容発酵槽において0.032の初期ODを得るためには、1000mLの培地を入れたフラスコが4つ必要であった。
B)発酵プロセスの開発
i)複合培養培地にビタミン溶液を添加する必要性の確認
GBSは栄養要求性生物であるため、その増殖に必要とされる特定の有機化合物(アミノ酸やビタミンなど)を合成する能力をもたない。このため、WO07/052168に記載のような、動物起源の成分を含まない低コスト複合培地が開発された。この複合培養培地を加熱によって滅菌し、ビオチンと、0.5g/Lのチアミン、リボフラビン、ニコチン酸およびピリドキシンを含む0.1M水酸化ナトリウムとメタノールのビタミン溶液とを添加した。
i)複合培養培地にビタミン溶液を添加する必要性の確認
GBSは栄養要求性生物であるため、その増殖に必要とされる特定の有機化合物(アミノ酸やビタミンなど)を合成する能力をもたない。このため、WO07/052168に記載のような、動物起源の成分を含まない低コスト複合培地が開発された。この複合培養培地を加熱によって滅菌し、ビオチンと、0.5g/Lのチアミン、リボフラビン、ニコチン酸およびピリドキシンを含む0.1M水酸化ナトリウムとメタノールのビタミン溶液とを添加した。
GBS菌株の培養に使用された酵母抽出物は、生産プロセスおよび酵母自己分解物のプロセッシングに応じて比率が有意に異なることがあり得るが、これらのビタミンを含むものであった(表2)(参考文献177)。
cpプロセスをパイロット規模に移行させるための発酵プロセスを開発する前、先の実施例で開発したパラメータを使用し、研究室規模の発酵槽において3つのGBS血清型の増殖をモニターした。
この条件では、3時間のグルコース供給後の最終ODは、090菌株の14からH36b菌株の28.5まで異なり、これらの菌株のcp濃度は300mg/L〜550mg/Lであった。
メタノールは、安全性の理由および水酸化ナトリウム中ではビタミンの特性が低下するので回避すべきであったため、チアミン、ピリドキシンおよびニコチン酸のROW溶液を選択した。同時に、プロセスに対して第2の変更を行なった。ビタミンは熱不安定性化合物であるため、酵母抽出物培地は、オートクレーブ処理ではなく、0.22μm孔径膜フィルターに通す濾過によって滅菌し、121℃で30分間のオートクレーブを用いた滅菌ではなく、リン酸塩培地に無菌的に添加した。
新しい発酵実験は、先に記載され変更を考慮して各菌株について行なった。3つの菌株(stain)の増殖は、先の実施例で確立したプロセスと同等(H36b)またはより良好(090およびM781)であったが、培養物の色素沈着が持続した。実際、Fraileらによる論文では、細胞壁内に集積されたオレンジがかった黄色の色素の生成は、ヒト溶血性GBSの特異な特徴の1つであり、臨床試料からGBSを確認するための培養培地の使用のための基礎に供された(参考文献178)。この化学的夾雑(着色)を排除するため、精製プロセスには、Z−炭素表面を使用するさらなる工程が必要であった。
発酵終了時のcp生産量に関して、該変更により、cp濃度が、090菌株とH36b菌株では約100mg/L、およびM781菌株では300mg/L増大した。さらに、菌体乾燥重量グラムあたりのcpの割合は高くなった。これらの3種類のStreptococcus agalactiae菌株では、酵母抽出物中のビタミン濃度が、これらの菌株の栄養素必要量を満足するのに充分であったため、リボフラビンの添加は必要でなかった。
培地に添加するビタミン溶液を減らすため、ビオチンのみを用いた実験を行なった。H36bおよびM781菌株ではcp濃度はわずかに減少したが、cp生産量は、先の実施例で確立したプロセスと比べ、依然として改善されていた。複合培養培地へのビタミンの添加は、酵母抽出物中のビタミンが、該3種類の特定のGBS菌株の栄養素必要量を満足するのに充分であったため(ビオチン以外)、増殖およびStreptococcus agalactiaeのcp生産に必要でなかった。
さらに、精製データによれば、ビタミンの非存在下でのcp構造は、先の実施例で確立したプロセスで得られる構造と同等であり、アセチル化は少なく、生成物の純度は許容可能であった。
また、ビオチンを除去したときの090菌株の増殖をモニターした。この実験では、ビオチンの存在下でODが18から14に減少したとともに、cp濃度が100mg/Lよりも大きく低下した。酵母抽出物中のビオチン濃度は、このGBS菌株の増殖必要量を満足するのに充分でなかった。実際、酵母抽出物の組成によれば、ビオチンは、その他のビタミン濃度と比べて少ない量(0.25mg/100g)で存在していた。
結論として、チアミン、リボフラビン、ニコチン酸およびピリドキシンの除去は、GBSの増殖およびcp生産量に対してほとんど効果はなかった。このような理由で、該4種類のビタミンを発酵プロセスから除き、そのため、ビオチンのみを複合培養培地に添加した。CJB111では、ビオチンのみを使用する最終条件を用いた。
ii)GBSの血清型特異的莢膜多糖を得るための複雑なフィードバッチ式プロセス必要性の確認
菌体増殖速度は、以前に、cp生産を調節する主要因子であることが報告され、III型cpの増殖速度依存性生産は増殖制限化合物とは独立して起こった(参考文献173)。しかしながら、炭素源の枯渇は、色素形成および莢膜多糖生産量低下の原因であることがわかった。栄養環境およびcp生産に有利な増殖速度を維持するため、WO07/052168に記載のような複雑なフィードバッチ式発酵プロセスが開発された。この複雑なフィードバッチ式プロセスは、細菌の倍加時間を低減させる対数増殖手法と、グルコースを使用し、最後の3時間でcp生産性が増大するpH−stat手法の両方を組み合わせたものである。このプロセスは、バッチ式手法の利点と連続式手法の利点を併せ持つものであった。実際、フィードバッチ式発酵では、指数増殖期の長期化による高い菌体密度および発酵中の基質付加条件に対する制御が達成される。しかしながら、複雑なフィードバッチ式手法の使用には、アルゴリズムにより発酵を管理するソフトウェアの使用が必要とされ、このソフトウェアの使用には、GMP基準に準拠するためのアルゴリズムの妥当性確認が必要とされる。したがって、該アルゴリズムの使用を回避するため、発酵プロセスを単純化した。
菌体増殖速度は、以前に、cp生産を調節する主要因子であることが報告され、III型cpの増殖速度依存性生産は増殖制限化合物とは独立して起こった(参考文献173)。しかしながら、炭素源の枯渇は、色素形成および莢膜多糖生産量低下の原因であることがわかった。栄養環境およびcp生産に有利な増殖速度を維持するため、WO07/052168に記載のような複雑なフィードバッチ式発酵プロセスが開発された。この複雑なフィードバッチ式プロセスは、細菌の倍加時間を低減させる対数増殖手法と、グルコースを使用し、最後の3時間でcp生産性が増大するpH−stat手法の両方を組み合わせたものである。このプロセスは、バッチ式手法の利点と連続式手法の利点を併せ持つものであった。実際、フィードバッチ式発酵では、指数増殖期の長期化による高い菌体密度および発酵中の基質付加条件に対する制御が達成される。しかしながら、複雑なフィードバッチ式手法の使用には、アルゴリズムにより発酵を管理するソフトウェアの使用が必要とされ、このソフトウェアの使用には、GMP基準に準拠するためのアルゴリズムの妥当性確認が必要とされる。したがって、該アルゴリズムの使用を回避するため、発酵プロセスを単純化した。
先の実施例で確立したプロセスに従い、同じOD値を各供給の開始および即時添加の誘因として使用した。さらに、150g/Lの酵母抽出物および500g/Lのグルコース(初期バッチ容量の10%を構成)をバッチに添加した。それぞれ、OD3および4.5でのこの2回の酵母抽出物の即時添加は、必要とされる総容量の1/5および4/5を構成した。ODが10に達したとき、濃縮グルコースの線形添加を開始し、pH−stat相を置き換えた。この添加の速度は、3時間での複雑なフィードバッチ式プロセスと同じ量のグルコースを加えて計算した。
発酵は、各菌株について新しいプロセスを用いて行ない、菌体密度およびcp生産量をモニターした。090菌株では、単純化プロセスにより、複雑なフィードバッチ式プロセスと同じ結果が得られた。090菌株およびH36b菌株ではともに、増殖は複雑なフィードバッチ式手法よりも速く、プロセス終了時のODは、24から32に増大した。菌体乾燥重量グラムあたりのcp濃度およびcp量は、それぞれ、およそ300mg/Lおよび5mgcp/gCDW増大した。M781菌株では、同じ増殖およびcp生産量が観察された。したがって、発酵プロセスは、pHモニタリングなしで、グルコースの線形添加を用いて単純化され得る。CJB111では、pHモニタリングなしで単純化線形添加を伴う(sith)最終プロセスのみを行ない、プロトコルの有効性を確認した。
2回の酵母抽出物の即時添加およびグルコースの線形添加を使用するこのプロセスは、好ましいパイロット規模での方法であった。この新しいプロセスでは、アルゴリズムの使用または培養培地へのビタミン溶液の添加は必要とされなかった。酵母抽出物、リン酸塩、グルコースおよびビオチンで構成された複合培養培地は、再現性のある増殖挙動およびcp生産量がもたらされる低コストでロバストなプロセスであった。
C)発酵プロセスの事前検証
GBSのcpを生産するための以前に開発された発酵プロセスを検証し、最適化した。増殖およびcp生産量をH36b菌株でモニターし、それにより各パラメータを個々に変更し、対照培養と比較した。DOT試験、温度およびpHを報告した。
GBSのcpを生産するための以前に開発された発酵プロセスを検証し、最適化した。増殖およびcp生産量をH36b菌株でモニターし、それにより各パラメータを個々に変更し、対照培養と比較した。DOT試験、温度およびpHを報告した。
培養は36℃およびpH7.3で行ない、培地中の溶存酸素は、プロセス全体を通して30%に維持した。3時間のグルコース供給後、最終ODは25.3であり、平均生産性は1.84g/L.hであった。cp濃度および菌体乾燥重量1グラムあたりのcpの量は、それぞれ、540mg/Lおよび59mgcp/gCDWであった。
i)溶存酸素レベルの効果
Streptococcus agalactiaeは、酸素が存在する場合、有気呼吸によってATPを合成する通性嫌気性生物である;しかしながら、嫌気性増殖に切り替えることもできる。
Streptococcus agalactiaeは、酸素が存在する場合、有気呼吸によってATPを合成する通性嫌気性生物である;しかしながら、嫌気性増殖に切り替えることもできる。
まず、培地中の溶存酸素を15%に維持した。平均生産性は、1.84g/L.hから1.14g/L.hに低下したが、プロセス終了時、590nmにおいて同じOD23.2が観察された。406mg/L前後でのcp濃度は低く、乾燥菌体重量グラムあたりの生産cpが少なかった(39.8mgcp/gCDW)。
同じ発酵を、溶存酸素を60%に維持して行なった。この場合、平均生産性は1.16g/L.hであり、最終ODは20.5であった。比生産性は433mg/Lに低下し、乾燥菌体重量グラムあたりのcpの量は49mgcp/gCDWに減少した。
このような観察結果に鑑み、30%の溶存酸素をパイロット規模生産に選択し、50〜350rpmの攪拌および20〜100L/分の空気流を使用した。ガスとしては高価な酸素は、発酵プロセスの最後の1時間でのみ使用し、それにより製造プロセスのコストダウンを維持した。
ii)温度の効果
また、増殖およびcp生産量を、36℃の標準温度に対して温度を2℃上昇または低下させることによって温度を変更することによりモニターした。
また、増殖およびcp生産量を、36℃の標準温度に対して温度を2℃上昇または低下させることによって温度を変更することによりモニターした。
温度を34℃に低下させることにより、倍加時間は短くなり、平均生産性は1.84g/L.hから1.04g/L.hに低下した。しかしながら、cp濃度は60%(312mg/L)に減少し、この温度で、およそ20mgcp/gCDWが失われた。
プロセスを38℃で繰り返すと、1.84g/L.hから1.45g/L.hへの平均生産性の低下が観察された。さらに、プロセス終了時、cp濃度とcpの量/グラム乾燥菌体重量両方の有意な低下が観察された(それぞれ、267mg/Lおよび32.1mgcp/gCDW)。
発酵プロセスの温度を変更すると、GBS倍加時間が影響を受け、血清型特異的cp生産がかなり減少したため、36℃がGBS増殖およびcp生産に最適な温度であると確認された。
iii)pH値の試験
また、元のpH7.3を7.0〜7.5に変更することにより、pH値を最適化するための実験も行なった。pHを7.0に維持した場合、最終ODは、23.5から28.8に増大し、平均生産性は1.52g/L.hであった。しかしながら、cp濃度は540mg/Lから412mg/Lに低下した。
また、元のpH7.3を7.0〜7.5に変更することにより、pH値を最適化するための実験も行なった。pHを7.0に維持した場合、最終ODは、23.5から28.8に増大し、平均生産性は1.52g/L.hであった。しかしながら、cp濃度は540mg/Lから412mg/Lに低下した。
同じ発酵プロセスをpH7.5で行なった。ODについては同じ増殖挙動が観察されたが、1.08g/L.hの平均生産性が観察され、540mg/Lのから323mg/Lへのcpの容積生産性の有意な低下が認められた。したがって、発酵時プロセス中、pH7.3を維持することが、菌体密度およびcp生産に最適であった。
iii)圧力値の試験
また、2つの圧力:0.2バールと0.5バールでの発酵プロセスを比較することにより、圧力を最適化するための実験を行なった。圧力を0.5に維持した場合、最終ODは23.5に維持され、平均生産性は1.5g/L.hであった。しかしながら、cp濃度は、540mg/Lから272mg/Lに減少した。
また、2つの圧力:0.2バールと0.5バールでの発酵プロセスを比較することにより、圧力を最適化するための実験を行なった。圧力を0.5に維持した場合、最終ODは23.5に維持され、平均生産性は1.5g/L.hであった。しかしながら、cp濃度は、540mg/Lから272mg/Lに減少した。
溶存酸素、温度、pHおよび圧力の効果の試験後、先で確立された条件は、高菌体密度および血清型特異的cpの両方をもたらすための最適条件であることがわかった。
実施例4-化学的に規定される培地の開発
先の実施例で用いた複合培養培地は、組成が完全に既知のものでない有機系供給源(例えば、酵母抽出物)を含むものであったため、発酵プロセスの性能における変動を観察した。生産性を維持しつつ変動を少なくするためのアプローチの一例は、複合培地を、主に無機化合物からなる化学的に規定される培地に置き換えることである。この置き換えにより、発酵プロセスを制御し、また多糖の精製を単純化することが可能になる。
先の実施例で用いた複合培養培地は、組成が完全に既知のものでない有機系供給源(例えば、酵母抽出物)を含むものであったため、発酵プロセスの性能における変動を観察した。生産性を維持しつつ変動を少なくするためのアプローチの一例は、複合培地を、主に無機化合物からなる化学的に規定される培地に置き換えることである。この置き換えにより、発酵プロセスを制御し、また多糖の精製を単純化することが可能になる。
以前の試験(参考文献179)では、Streptococcus agalactiaeが、複合培地で得られるものとと同等の増殖速度および増殖量を補助する化学的に規定される培地中で増殖可能であることが示された。この研究の目的は、まず、代表的な血清III型であるM781 Streptococcus agalactiae菌株の増殖特性を試験し、増殖因子要求量を調べることであった。バイオマスの収率およびcp生産量を上げるため、単純なフィードバッチ式プロセスを開発した。
A)化学的に規定される培地でのGBS増殖試験
フィードバッチ式プロセスの開発では、典型的には、まず、微生物を解析して最良の非生物(abiotic)条件、種々の増殖相、消費成分および生産成分、バイオマスと生産物形成との関係、増殖に対する制限基質、ならびに比増殖速度と制限基質濃度との関係を確認しなければならない。しかしながら、GBSに関する挙動情報は、既に、複合培養培地を開発するために行なわれた試験からわかっていた。複合培養培地でのGBS増殖に対して先の実施例で開発されたpHおよび温度の至適条件を、上記の表1に示す化学的に規定される培地に拡張した。
フィードバッチ式プロセスの開発では、典型的には、まず、微生物を解析して最良の非生物(abiotic)条件、種々の増殖相、消費成分および生産成分、バイオマスと生産物形成との関係、増殖に対する制限基質、ならびに比増殖速度と制限基質濃度との関係を確認しなければならない。しかしながら、GBSに関する挙動情報は、既に、複合培養培地を開発するために行なわれた試験からわかっていた。複合培養培地でのGBS増殖に対して先の実施例で開発されたpHおよび温度の至適条件を、上記の表1に示す化学的に規定される培地に拡張した。
i)三角フラスコでのGBS増殖試験
菌株M781による増殖に関する予備実験を、500mL容三角フラスコを用いてバッチ式培養にて行なった。菌体は対数期に8時間維持され、倍加時間は45分であった(μmax=0.91時間−1)。この最初の増殖相後、比増殖速度は低下し始め、菌体は2時間減速相であった。最終光学密度は1.5前後であり、対数期は、光学密度が0.7前後になったとき終了した。
菌株M781による増殖に関する予備実験を、500mL容三角フラスコを用いてバッチ式培養にて行なった。菌体は対数期に8時間維持され、倍加時間は45分であった(μmax=0.91時間−1)。この最初の増殖相後、比増殖速度は低下し始め、菌体は2時間減速相であった。最終光学密度は1.5前後であり、対数期は、光学密度が0.7前後になったとき終了した。
ii)2L容発酵槽でのGBS増殖試験
次に、GBS増殖を2L容発酵槽においてモニターした。この条件下では、培養培地のpHを、2M水酸化ナトリウムの自動添加によって一定のpH7.3に維持した。
次に、GBS増殖を2L容発酵槽においてモニターした。この条件下では、培養培地のpHを、2M水酸化ナトリウムの自動添加によって一定のpH7.3に維持した。
菌体の活性化には、フラスコ内の先の培養物を使用した。フラスコの播種材料が指数増殖後期(OD590nm=0.5)に達したら、適応容量のこの培養物を1.8Lの新鮮培地への播種に使用し、初期OD0.4が得られた。菌体は、すぐに指数増殖期(3時間)に入り、倍加時間は42分であった(μmax=1.00時間−1)。2時間の減速相の後、ODが2.56である定常相が続いた。フラスコと発酵槽の両方で同じ倍加時間が観察された。最終ODについてわずかな改善が認められたが、バイオマスの生産収率(0.05g/L.h)は低いままであった。発酵槽で観察されたように、pHは7.3に一定に維持された。さらに、グルコースは、菌体が減速相開始に入ったときの利用可能なグルコースが5.7g/Lであったため、GBSに対して制限源ではないことが観察された。
B)制限化合物の特定
ほぼ既知の酵母抽出物培地の組成に基づき、複合培地プロセスで使用した栄養源の濃度とバッチ規定培地の組成との比較を行ない、GBSが15前後の最終ODに達するのに必要とされる種々の化合物間のおよその比率を調べ、増殖に対する制限化合物を特定した。複合培地を伴いプロセスでは、17g/Lの酵母抽出物をバッチ用培地に含め、供給時は19g/Lを添加した。したがって、Streptococcus agalactiaeは36g/Lが利用可能であった。
ほぼ既知の酵母抽出物培地の組成に基づき、複合培地プロセスで使用した栄養源の濃度とバッチ規定培地の組成との比較を行ない、GBSが15前後の最終ODに達するのに必要とされる種々の化合物間のおよその比率を調べ、増殖に対する制限化合物を特定した。複合培地を伴いプロセスでは、17g/Lの酵母抽出物をバッチ用培地に含め、供給時は19g/Lを添加した。したがって、Streptococcus agalactiaeは36g/Lが利用可能であった。
36g/Lの酵母抽出物の組成と規定培地の初期濃度との比較を、ミネラル、グルコース、ビタミンおよびアミノ酸含有量について行なった(表3参照)。ミネラル源については、現行の規定培地に存在するすべての化合物が、GBS増殖要求量を満足するのに充分であったが、カリウムは例外であり、これは、複合培地中に6.5倍多く存在した。ビタミンおよびアミノ酸源については、すべての場合において、規定培地を用いたプロセスで観察された濃度は、複合培地を用いたプロセスでの濃度よりも低かった。規定培地中のバッチ濃度と比較したときの酵母抽出物中に存在するビタミンまたはアミノ酸濃度の比率は、該諸分子の性質と比較すると不均一であった。しかしながら、酵母抽出物の正確な組成は充分には規定されない。また、この比較に用いた値は平均値であり、各成分の比率は、生産プロセスおよび酵母抽出物の処理に応じて有意に異なることがあり得る。
フィードバッチ式発酵は、典型的には、バッチ様式として開始し、一定のバイオマス濃度または基質消費後、発酵槽に制限基質溶液を供給する。そのため、栄養素培地は、単純な組成を有するものでなければならない。この研究の目的は、制限化合物が特定され、かつ増殖速度に影響しないバッチ用培地を開発することであった。
A)フィードバッチ式プロセスのためのバッチ用培地の開発
フィードバッチ用規定培地を開発するため、制限化合物を1種類ずつ添加し、増殖に対するその効果を評価した。
フィードバッチ用規定培地を開発するため、制限化合物を1種類ずつ添加し、増殖に対するその効果を評価した。
まず、表2の各ビタミンの濃度を10倍に上げた。ビタミンは、GBS増殖に非常に重要であることが観察された。菌体は、すぐに対数期に入り、これは4時間持続し、倍加時間は42分(μmax=1.00時間−1)から33分(μmax=1.26時間−1)に短くなった。3時間後、菌体は減速相(2時間)に入った後、培養5時間後に定常相に入った。最終ODは3.70であり、これは先の治験より50%高かった。ビタミンをバッチ用培地に添加するとプラスの効果が観察されたが、これは、唯一の制限化合物ではなかった。指数増殖期は3時間後に終了したが、菌体が減速相に入ったとき、6.3g/Lでグルコースはなお利用可能であった。
同じ試験を、10×ビタミンと10×アミノ酸の両方を添加することにより行なった。10×ビタミンを伴う発酵では、最終ODが高かった(OD590nm=4.5)。菌体の指数増殖期は4時間持続した。グルコースは、この場合も菌体が減速相に入ったとき4g/L存在したため、制限化合物ではないようであった。
また、10×のカリウムを初期培地に添加することにより試験を行なった。この場合、菌体が定常増殖相のとき、長い倍加時間(td=49分)および最終ODの低下(OD590nm=2.9)が観察された。初期カリウム濃度を10倍に上げると、増殖に対してマイナスの効果を有した。したがって、カリウムを阻害レベルまで添加することを回避するため、カリウムは、フィードによって、または小型のバッチにて添加する必要がある。
この試験に従い、バッチ用培地を、最初の化学的に規定される培地と同じミネラル含有量で構成したが、ビタミンおよびアミノ酸の濃度は10倍に上げた。リン酸塩および炭素源をフィード培地に添加したが、各成分の濃度を測定するため、複合培地を用いたプロセスとの新たな比較が必要であった。33g/Lのグルコースをバッチ用培地に存在させ、線形添加時に55g/Lを添加したため、同じ比率のグルコースおよび10×のカリウムを添加するために、フィード培地を、275g/Lのグルコース、10.08g/LのK2HPO4および14.8g/LのKH2PO4で構成した。500mLのこの溶液を1.2Lのバッチ用培地に添加した。
B)フィードバッチ式プロセスの開発
フィードバッチ式発酵のためのストラテジーは、増殖制限基質を、GBSが基質を消費する速度と同じ速度で供給することであった。
フィードバッチ式発酵のためのストラテジーは、増殖制限基質を、GBSが基質を消費する速度と同じ速度で供給することであった。
栄養素供給速度は、微生物の増殖速度ならびに生産物形成および副生成物の最小化のための炭素サイクルの有効性を規定することにより、フィードバッチ式発酵に影響を及ぼす。
C)B群連鎖球菌属の増殖因子要求量
生物には、自己栄養体であれ従属栄養体であれ、増殖のために、該生物が利用可能な栄養素から合成することができない少量の一定の必須有機化合物が必要とされ得る。
生物には、自己栄養体であれ従属栄養体であれ、増殖のために、該生物が利用可能な栄養素から合成することができない少量の一定の必須有機化合物が必要とされ得る。
増殖因子は、生合成において特定の役割を果たしているため、少量が菌体に必要とされる。増殖因子の必要性は、細胞内の代謝経路の阻止または欠如のいずれかにより生じる。これは、3つのカテゴリー:(1)核酸合成に必要とされるプリンおよびピリミジン;(2)タンパク質合成に必要とされるアミノ酸;ならびに(3)補酵素およびある種の酵素の官能基として必要なビタミン類に組織化される。
この研究の目的は、化合物の数を減らすことにより培養培地を単純化するため、および費用効果の高い生産プロセスを確実にするためのM781 Streptococcus agalactiae菌株の増殖因子要求量を特定することであった。
D)M781 Streptococcus agalactiae菌株のアミノ酸要求量
アミノ酸を1種類ずつ培地から除くことにより、L−アラニン、L−アスパラギン酸、L−グルタミンおよびL−プロリンは不可欠であることがわかった(図20および表4参照)。これらのアミノ酸は、対照培養では、常に80%より大きい濁度値をもたらした。しかしながら、任意の他のアミノ酸の非存在下では、培養培地中で増殖は起こらなかった。
アミノ酸を1種類ずつ培地から除くことにより、L−アラニン、L−アスパラギン酸、L−グルタミンおよびL−プロリンは不可欠であることがわかった(図20および表4参照)。これらのアミノ酸は、対照培養では、常に80%より大きい濁度値をもたらした。しかしながら、任意の他のアミノ酸の非存在下では、培養培地中で増殖は起こらなかった。
ODおよびM781菌株によるcp生産量に対する影響は、これらの4種類のアミノ酸を除いた場合、最終プロセスにおいて決定される。
E)M781 Streptococcus agalactiae菌株のビタミン要求量
ビタミンを個々に培養培地から除くことにより、パントテン酸カルシウムとナイアシンアミドは不可欠であることがわかった(表5および図21)。ビオチン、葉酸、ピリドキシン、リボフラビンおよびチアミンを除いた実験では、濁度値は65%よりも大きかった。パントテン酸塩とナイアシンアミドのみを添加すると、対照と同じ最終ODが観察された。
ビタミンを個々に培養培地から除くことにより、パントテン酸カルシウムとナイアシンアミドは不可欠であることがわかった(表5および図21)。ビオチン、葉酸、ピリドキシン、リボフラビンおよびチアミンを除いた実験では、濁度値は65%よりも大きかった。パントテン酸塩とナイアシンアミドのみを添加すると、対照と同じ最終ODが観察された。
発酵槽内でさらに実験を行なうことにより、M781 Streptococcus agalactiae菌株の増殖に必要なビタミンの特定が可能である。
実施例6-パイロット規模での生産
この実施例により、先の実施例の教示が、連鎖球菌属細菌の血清型特異的莢膜多糖の製造規模生産に適用されることが確認される。
この実施例により、先の実施例の教示が、連鎖球菌属細菌の血清型特異的莢膜多糖の製造規模生産に適用されることが確認される。
A)播種材料の培養
i)培養培地
播種材料の培養を、温度(オートクレーブプログラム番号1分/最大40分間、121℃、表6)によって滅菌し、ILの複合培地(17g/Lの酵母抽出物Difco、8g/LのNa2HPO4・2H2O、2g/LのNaH2PO4・H2O、および33g/Lの一水和型グルコース、Nalgeneフィルター商品使い捨てシステムを用いた0.2μm濾過によって滅菌、3M NaOH を用いてpHを7.3±0.1に調整)、10mLのビタミン溶液(チアミン、リボフラビン、ピリドキシンHCl、およびナイアシンアミド、各々0.05g/L、0.1M NaOH中で希釈、0.2μm濾過によって滅菌)ならびに5mLのビオチン溶液(ビオチン0.2g/L、0.2μm濾過によって滅菌)を入れた(播種の直前に添加)4つの5L容振盪フラスコにおいて行なった。
i)培養培地
播種材料の培養を、温度(オートクレーブプログラム番号1分/最大40分間、121℃、表6)によって滅菌し、ILの複合培地(17g/Lの酵母抽出物Difco、8g/LのNa2HPO4・2H2O、2g/LのNaH2PO4・H2O、および33g/Lの一水和型グルコース、Nalgeneフィルター商品使い捨てシステムを用いた0.2μm濾過によって滅菌、3M NaOH を用いてpHを7.3±0.1に調整)、10mLのビタミン溶液(チアミン、リボフラビン、ピリドキシンHCl、およびナイアシンアミド、各々0.05g/L、0.1M NaOH中で希釈、0.2μm濾過によって滅菌)ならびに5mLのビオチン溶液(ビオチン0.2g/L、0.2μm濾過によって滅菌)を入れた(播種の直前に添加)4つの5L容振盪フラスコにおいて行なった。
各フラスコに、−70℃の冷凍庫から即時的に解凍した2.75±0.25mLの作業種菌株を播種した。培養物は、インキュベータ(IN−L0641)内で4±1時間、200±10rpmで攪拌しながら35±1℃で維持した。この期間後、バイオマス濃度を、590nmにおけるODを測定すること、およびグラム染色を行なうことにより評価した。OD590nm値が1.2〜0.6に達したとき、およびグラム染色が一致したとき(グラム陽性球菌のみ)、4つのフラスコの内容物を、300L容のB. Braun Biotech/Chemap発酵槽(ID VS−L0530)のインキュベーションラインと連結された5L容の熱滅菌(オートクレーブプログラム番号1分/最大)ビン内にプールした。
iii)播種材料の調製の重要な可変量
播種材料の調製の重要な可変量を、表7および表8に示す。
播種材料の調製の重要な可変量を、表7および表8に示す。
使用後、フラスコおよび5L容ビンを加熱滅菌し(オートクレーブプログラム番号8、汚れサイクル、表6の仕様参照)、クリーニングした。
B)300L容発酵槽での培養
i)培地の調製および設備機器
空の300L容発酵槽の機械的配管およびガスフィルターを滅菌した(プログラムSEAL2およびEXFC2)。次いで、プローブを確認し、較正する。pHプローブは、pH値7および10を有する2種類のバッファー溶液を用いて較正した。酸素プローブ(prove)の正確な適用は、0%点で窒素および100%点で空気の気流を伴ってプローブを水中に入れることにより確認した。その較正は、発酵槽内部で行なった。
i)培地の調製および設備機器
空の300L容発酵槽の機械的配管およびガスフィルターを滅菌した(プログラムSEAL2およびEXFC2)。次いで、プローブを確認し、較正する。pHプローブは、pH値7および10を有する2種類のバッファー溶液を用いて較正した。酸素プローブ(prove)の正確な適用は、0%点で窒素および100%点で空気の気流を伴ってプローブを水中に入れることにより確認した。その較正は、発酵槽内部で行なった。
300L容発酵槽(プログラムFVES 2)内で基本培地(120L、2g/LのNa2HPO4・2H2O、120Lの消泡剤「PPG 2500」に対して1mL)を配合し、滅菌した。滅菌中、酸素プローブの0%値を確認し、必要であれば再度初期化した。滅菌の冷却相後、培地の温度は36℃に達し、基本培地を、17Lの酵母抽出物150g/L、9Lのグルコース一水和型550g/L、2Lのビタミン溶液(チアミン、リボフラビン、ピリドキシンHCl、およびナイアシンアミド、各々0.05g/L、0.1M NaOH中で希釈)(すべて、0.2μm濾過によって滅菌)で完全にした。次いで、培地への酸素供給後、酸素プローブの100%値を較正した。4Lの播種材料を添加した後、最終容量は発酵開始時で150Lであり、酵母抽出物の終濃度は17g/Lであり、グルコースの終濃度は33g/Lであった。これらの添加は、550mL/分の流速に相当する最大速度(400rpm)で蠕動ポンプを使用し、滅菌ラインにおいて行なった。
ii)発酵プロセスおよびプロセス内対照
播種前に、ビオチン溶液(IL、0.2g/Lのビオチン、0.2μm濾過によって滅菌)を添加した。次いで、播種材料の4つのフラスコの内容物を入れた5L容ビンを用いて300L容発酵槽への播種を行なった。
播種前に、ビオチン溶液(IL、0.2g/Lのビオチン、0.2μm濾過によって滅菌)を添加した。次いで、播種材料の4つのフラスコの内容物を入れた5L容ビンを用いて300L容発酵槽への播種を行なった。
次いで、以下のパラメータの値を確認し、必要であれば調整し、プロセス中、自動制御した。
− 培養温度は36±1℃に制御した。
− 発酵槽内部の過圧は0.2バールに設定した。
− pHは7.3±0.1に設定し、4M NaOHを用いて調整した。pH値は発酵により自然に低下したため、酸性溶液を用いたpH補正はしなかった。
− 初期攪拌は50rpmに設定し、初期空気流は20L/分に設定した。
− 発酵槽内の起泡剤レベルを可視的にモニターし、必要であれば、消泡剤PPG 2500を用いて調整した。
− 溶存酸素圧(DOT)は
攪拌(50〜350rpmの範囲の値)
・ 空気流(20〜100L/分の範囲の値)
・ 酸素流(0〜100L/分の範囲の値)
によって段階的に調節して30%に設定した
バッチ相の発酵中、播種の2時間後に試料を採取し、OD590nmを測定した。試料は、OD590nmが3に達するまで15分ごとに採取した。この目標ODの時点で、最初の対数増殖期フィードバッチ式添加を、3.6Lの酵母抽出物溶液(150g/L)を用いて開始し、該集団を300分の倍加時間に維持した。
− 培養温度は36±1℃に制御した。
− 発酵槽内部の過圧は0.2バールに設定した。
− pHは7.3±0.1に設定し、4M NaOHを用いて調整した。pH値は発酵により自然に低下したため、酸性溶液を用いたpH補正はしなかった。
− 初期攪拌は50rpmに設定し、初期空気流は20L/分に設定した。
− 発酵槽内の起泡剤レベルを可視的にモニターし、必要であれば、消泡剤PPG 2500を用いて調整した。
− 溶存酸素圧(DOT)は
攪拌(50〜350rpmの範囲の値)
・ 空気流(20〜100L/分の範囲の値)
・ 酸素流(0〜100L/分の範囲の値)
によって段階的に調節して30%に設定した
バッチ相の発酵中、播種の2時間後に試料を採取し、OD590nmを測定した。試料は、OD590nmが3に達するまで15分ごとに採取した。この目標ODの時点で、最初の対数増殖期フィードバッチ式添加を、3.6Lの酵母抽出物溶液(150g/L)を用いて開始し、該集団を300分の倍加時間に維持した。
最初の添加のおよそ45分後、OD590nmを測定した。OD590nmが5に達するまで、試料を15分ごとに採取した。この目標ODの時点で、2回目の対数増殖期フィードバッチ式添加を、酵母抽出物溶液(150g/L)を用いて開始し、50分の倍加時間に維持した。
この2回目の対数増殖期フィードバッチ式添加の終了時、pH−statフィードバッチ式添加を行なった。pH値が7.18を超えたとき、一水和型グルコース溶液(550g/L)を添加した。この添加中、試料を1時間ごとに採取し、OD590nmを測定した。
発酵は、最後の添加のおよそ3時間後に終了した。次いで、パラメータの自動制御を停止した。攪拌は100rpmに、および温度は30℃に調節した。
iii)発酵プロセスの重要な可変量
発酵プロセスの重要な可変量を、表9および表10に示す。
発酵プロセスの重要な可変量を、表9および表10に示す。
バイオマスを300L容発酵槽から取り出したら、200LのROWを発酵槽内に添加することにより消毒を開始した。次いで、3M NaOHを発酵槽内に、pHが11に達するまで添加した。温度を80℃に30分間維持した。周囲温度まで冷却後、発酵槽の内容物を、下側の床面に置いた廃棄物槽内に廃棄した。
次いで、200LのROWを添加し、Standard Operating Procedures(SOP)に従ってプログラム(FVES 2)を作動させることにより滅菌を行なった。滅菌の冷却相後、pHプローブと酸素プローブを発酵槽から取り出し、それぞれ、3M KCl溶液およびROW中に保持した。
発酵槽は、最後に200Lの1M NaOHを用いて洗浄し、100rpmで少なくとも30分間攪拌した。洗浄後、この200LのNaOHを劇物槽内に入れて空にし、発酵槽の上側がクリーニングされるように、さらに100LのNaOHをスプレーボールによって該槽内に入れた。この100Lを、ローブポンプを用いて最低30分再循環させた。このクリーニング工程後、pHが5〜7の範囲に低下するまで発酵槽をROWで洗浄した。
C)バイオマスの遠心分離
i)設備機器の準備
生理食塩水(約100L、9g/LのNaCl、0.2μm濾過によって滅菌)を入れた槽を、300L容発酵槽をAlfa−Laval遠心分離機(ID CT−L0526)に連結する移送ラインに接続した。遠心分離中、この水をバイオマスペレットの洗浄に使用した。次いで、移送ラインを、バイオマスのセパレータおよび回収槽と同様に加熱滅菌した。発酵が終了した後すぐに遠心分離を開始するため、
発酵の前と後に設備機器の準備を行なった。
i)設備機器の準備
生理食塩水(約100L、9g/LのNaCl、0.2μm濾過によって滅菌)を入れた槽を、300L容発酵槽をAlfa−Laval遠心分離機(ID CT−L0526)に連結する移送ラインに接続した。遠心分離中、この水をバイオマスペレットの洗浄に使用した。次いで、移送ラインを、バイオマスのセパレータおよび回収槽と同様に加熱滅菌した。発酵が終了した後すぐに遠心分離を開始するため、
発酵の前と後に設備機器の準備を行なった。
ii)連続流遠心分離プロセス
連続流遠心分離プロセスは、以下のサイクルで構成した:
− 100L/時の流速での7分間のバイオマス遠心分離(手動調整)。バイオマスを発酵槽から移送ラインを経由して、発酵槽内の過圧力0.6バールでセパレータに移した。− 100L/時の流速で生理学的用水を用いた3分間の洗浄(手動調整)。
− ペレットの廃棄
このサイクルは、通常、全バイオマスが処理されるまで繰り返した。上清みは収集さず代わりに廃棄物槽に供給した。プロセス中、ペレットを槽(VS−L0536)内に収集し、次いで、0.3バールの過圧力によって、シリコーン製コネクターを経由して100L容化学的処理用廃棄用滅菌バッグに移した。
連続流遠心分離プロセスは、以下のサイクルで構成した:
− 100L/時の流速での7分間のバイオマス遠心分離(手動調整)。バイオマスを発酵槽から移送ラインを経由して、発酵槽内の過圧力0.6バールでセパレータに移した。− 100L/時の流速で生理学的用水を用いた3分間の洗浄(手動調整)。
− ペレットの廃棄
このサイクルは、通常、全バイオマスが処理されるまで繰り返した。上清みは収集さず代わりに廃棄物槽に供給した。プロセス中、ペレットを槽(VS−L0536)内に収集し、次いで、0.3バールの過圧力によって、シリコーン製コネクターを経由して100L容化学的処理用廃棄用滅菌バッグに移した。
iii)遠心分離の重要な可変量
発酵プロセスの重要な可変量を表11に示す。
発酵プロセスの重要な可変量を表11に示す。
iv)設備機器の滅菌およびクリーニング
遠心分離および廃棄用バッグへのペレットの移送後、移送ライン、セパレータおよびバイオマスの回収槽を加熱滅菌し、クリーニングした。移送ラインおよびセパレータは、発酵槽内で周囲温度にて、100Lの1M NaOHを用いてクリーニングし、次いで、100L/時の流速で移送ラインを経由してセパレータに移した。回収槽は、槽の上側がクリーニングされるようにスプレーボールによって、槽内に20Lの1M NaOHを30分間循環させることによりクリーニングした。このクリーニング工程後、pH値が5〜7の範囲に低下するまで槽をROWで洗浄した。
遠心分離および廃棄用バッグへのペレットの移送後、移送ライン、セパレータおよびバイオマスの回収槽を加熱滅菌し、クリーニングした。移送ラインおよびセパレータは、発酵槽内で周囲温度にて、100Lの1M NaOHを用いてクリーニングし、次いで、100L/時の流速で移送ラインを経由してセパレータに移した。回収槽は、槽の上側がクリーニングされるようにスプレーボールによって、槽内に20Lの1M NaOHを30分間循環させることによりクリーニングした。このクリーニング工程後、pH値が5〜7の範囲に低下するまで槽をROWで洗浄した。
D)菌体ペレットの化学的処理
i)菌体ペレットの不活化
菌体ペレットの化学的処理により、菌体が不活化され、菌体からのcpの放出が可能となった。この処理は、理論濃度0.8M NaOHが得られるようにペレットに4M NaOH溶液を添加すること(蠕動ポンプによりチューブを経由して)を伴った。添加する4M NaOHの重量は、1Lの重量は1kgであるため、バイオマスの重量を4で除算することにより得た。この工程は、一体型攪拌器システムを有し、Levtech Sartorius System(ID AG−10645、サーモスタットによる平衡および攪拌器)内に廃棄される100L容の廃棄用バッグ内で行なった。温度は、ペレットが37℃に維持されるように調節し、次いで、180rpmで指定された時間攪拌した。12時間で充分、該微生物は不活化された。菌体莢膜からのcpの放出には36時間が適当であった。他の実験では、1時間で充分、該微生物が不活化されることがわかり、菌体莢膜からのcpの放出には24時間が適当であった。したがって、この工程は、合計36時間または24時間が適当である。
i)菌体ペレットの不活化
菌体ペレットの化学的処理により、菌体が不活化され、菌体からのcpの放出が可能となった。この処理は、理論濃度0.8M NaOHが得られるようにペレットに4M NaOH溶液を添加すること(蠕動ポンプによりチューブを経由して)を伴った。添加する4M NaOHの重量は、1Lの重量は1kgであるため、バイオマスの重量を4で除算することにより得た。この工程は、一体型攪拌器システムを有し、Levtech Sartorius System(ID AG−10645、サーモスタットによる平衡および攪拌器)内に廃棄される100L容の廃棄用バッグ内で行なった。温度は、ペレットが37℃に維持されるように調節し、次いで、180rpmで指定された時間攪拌した。12時間で充分、該微生物は不活化された。菌体莢膜からのcpの放出には36時間が適当であった。他の実験では、1時間で充分、該微生物が不活化されることがわかり、菌体莢膜からのcpの放出には24時間が適当であった。したがって、この工程は、合計36時間または24時間が適当である。
ii)不活化に重要な可変量
発酵プロセスの重要な可変量を表12に示す。
発酵プロセスの重要な可変量を表12に示す。
蠕動ポンプとともにシリコーン製チューブを使用し、0.1Mである終濃度が得られるように1MのTRISバッファー溶液を添加する。添加するTRISの重量は、不活化するバイオマスの重量を9で除算することにより計算される。この添加の重要性は、中和中のペレットのpH変動を回避することであった。したがって、pHを、廃棄用バッグ内に廃棄されるpHプローブを用いて制御した。最終pH値7.5〜8.5が得られるように6M HClを添加した。
2M CaCl2および96%エタノール溶液を添加し、タンパク質および核酸をペレット状に沈殿させた。最終のCaCl2濃度は0.05Mであり、エタノールは30%であった。添加する2M CaCl2の重量は、中和するバイオマスの重量を19で除算することにより得、96%エタノールの重量は、CaCl2で中和するバイオマスの重量を3.1で除算することにより得た。
E)処理済みペレットの精密濾過および透析
CaCl2と30%エタノールで化学的に処理したバイオマスに対し、上清み中に放出された多糖を回収するため、および菌体残渣ならびにタンパク質および核酸の沈殿物を除去するために精密濾過を行なった。
CaCl2と30%エタノールで化学的に処理したバイオマスに対し、上清み中に放出された多糖を回収するため、および菌体残渣ならびにタンパク質および核酸の沈殿物を除去するために精密濾過を行なった。
i)設備機器の準備
精密濾過および透析は、Sartorius Sartocon II plus holder(廃棄用収納部を有する)、および4つのHydrosartカセット(0.22μm、0.6m2、これは総表面積2.4m2を提示する)を用いて行なった。このシステムを、90Nmのトルクレンチを用いて固定した。
精密濾過および透析は、Sartorius Sartocon II plus holder(廃棄用収納部を有する)、および4つのHydrosartカセット(0.22μm、0.6m2、これは総表面積2.4m2を提示する)を用いて行なった。このシステムを、90Nmのトルクレンチを用いて固定した。
カセットを、20Lの1M NaOHを用いて消毒し、ローブポンプを用いた0.2μm濾過によって滅菌し、システム内の圧力を確保および調節した。次いで、保持液および透過物を、以下の条件で30分間再循環させた。
− 供給口圧力:2.0±0.2バール
− 透過物の弁を5分間閉鎖し、次いで、広く開放
蒸留水を使用し、pHが5〜7に達するまでシステムを洗浄(was)し、この時点で、システムを20Lの生理食塩水(0.9g/LのNaCl、0.2μm濾過を用いて滅菌)により、以下の条件でpH5〜7が得られるように洗浄した。
− 供給口圧力:Pin=2.0±0.2バール
− 透過物圧力:Pperm=0バール(弁開放)
− 保持液の弁閉鎖
精密濾過の前に、カセットを透析バッファー溶液(34.77g/LのNaCl、4.49g/LのTRIS、10.93g/LのCaCl2、6M HClを用いて7.8±0.1にpH調整、WFI qsp 74.4%の最終容量、最終容量まで96%エタノール、0.2μm濾過によって滅菌)により調整した。
− 供給口圧力:2.0±0.2バール
− 透過物の弁を5分間閉鎖し、次いで、広く開放
蒸留水を使用し、pHが5〜7に達するまでシステムを洗浄(was)し、この時点で、システムを20Lの生理食塩水(0.9g/LのNaCl、0.2μm濾過を用いて滅菌)により、以下の条件でpH5〜7が得られるように洗浄した。
− 供給口圧力:Pin=2.0±0.2バール
− 透過物圧力:Pperm=0バール(弁開放)
− 保持液の弁閉鎖
精密濾過の前に、カセットを透析バッファー溶液(34.77g/LのNaCl、4.49g/LのTRIS、10.93g/LのCaCl2、6M HClを用いて7.8±0.1にpH調整、WFI qsp 74.4%の最終容量、最終容量まで96%エタノール、0.2μm濾過によって滅菌)により調整した。
ii)精密濾過および透析
処理済みバイオマスの入った廃棄用バッグのチューブの排出口を、精密濾過ハウジングの供給口に接続した。このハウジングの保持液排出口を、処理用バイオマスを再循環させるために処理済みバイオマスを内包する廃棄用バッグに接続した。透過物排出口を、200L容使い捨て滅菌バッグに接続し、透過物を収集した。
処理済みバイオマスの入った廃棄用バッグのチューブの排出口を、精密濾過ハウジングの供給口に接続した。このハウジングの保持液排出口を、処理用バイオマスを再循環させるために処理済みバイオマスを内包する廃棄用バッグに接続した。透過物排出口を、200L容使い捨て滅菌バッグに接続し、透過物を収集した。
透過物用の弁は、最初は閉鎖し、ペレットを精密濾過システム内で循環させた。次いで、この弁を開放し、ローブポンプの速度を、以下の条件が得られるように制御した。
− 供給口圧力:Pin=2.0±0.2バール
− 透過物圧力:Pperm=0.6±0.1バール
バイオマスを10倍に濃縮し、保持液を3倍容量のバッファーに対して透析した。精密濾過システム内の循環正確に測定するためには、保持液の重量は、10kg未満でなければならない。そのため、保持液を、バイオマスの重量が10±0.5kgになるまで濃縮した。次いで、透析を連続工程にて行なった。使用するバッファー溶液の重量は、理論濃度係数10で除算し、所望の透析サイクル数を乗算したCaCl2−エタノール混合物の重量から計算した。
− 供給口圧力:Pin=2.0±0.2バール
− 透過物圧力:Pperm=0.6±0.1バール
バイオマスを10倍に濃縮し、保持液を3倍容量のバッファーに対して透析した。精密濾過システム内の循環正確に測定するためには、保持液の重量は、10kg未満でなければならない。そのため、保持液を、バイオマスの重量が10±0.5kgになるまで濃縮した。次いで、透析を連続工程にて行なった。使用するバッファー溶液の重量は、理論濃度係数10で除算し、所望の透析サイクル数を乗算したCaCl2−エタノール混合物の重量から計算した。
iii)透過物の濾過による滅菌
200L容廃棄用バッグ内への回収前に、精密濾過システムの排出口の2000cm2
Sartobran P 0.22μmフィルターを用いた濾過によって透過物を滅菌した。最終生成物を周囲温度で保持した後、精製部に放出させた。
200L容廃棄用バッグ内への回収前に、精密濾過システムの排出口の2000cm2
Sartobran P 0.22μmフィルターを用いた濾過によって透過物を滅菌した。最終生成物を周囲温度で保持した後、精製部に放出させた。
iv)精密濾過および透析の重要な可変量
精密濾過および透析の重要な可変量を表13に示す。
精密濾過および透析の重要な可変量を表13に示す。
v)設備機器のクリーニング
精密濾過後、供給口を、100Lの生理食塩水の入った槽に接続し、使い捨てカセットおよびハウジングを洗浄した。次いで、20Lの1M NaOHを用いてシステムを消毒し、透過物および保持液を、以下の条件を維持したまま、30分間再循環させるために供給口に接続した。
− 供給口圧力:Pin=2.0±0.2バール
− 透過物の弁を5分間閉鎖し、次いで、広く開放
次いで、システムおよび配管を空にし、透過物および保持液のpH値が5〜7の範囲になるまで蒸留水で洗浄した。この目標pHで、システムを分解した。
精密濾過後、供給口を、100Lの生理食塩水の入った槽に接続し、使い捨てカセットおよびハウジングを洗浄した。次いで、20Lの1M NaOHを用いてシステムを消毒し、透過物および保持液を、以下の条件を維持したまま、30分間再循環させるために供給口に接続した。
− 供給口圧力:Pin=2.0±0.2バール
− 透過物の弁を5分間閉鎖し、次いで、広く開放
次いで、システムおよび配管を空にし、透過物および保持液のpH値が5〜7の範囲になるまで蒸留水で洗浄した。この目標pHで、システムを分解した。
精密濾過および透析中に透過物の滅菌に使用したSartobran P フィルターの完全性試験を行なった後、バッチを精製部に放出させた。
F)発酵プロフィールの説明
3種類のGBS菌株、M781(血清型III)、H36b(血清型Ib)および090(血清型Ia)に対応するパイロット規模での実験の発酵プロフィール解析し、H36b菌株を用いて同一のプロセスで30L容発酵槽(B. Braun Biotech Biostat)にて研究室規模で行なった対照発酵と比較した。
3種類のGBS菌株、M781(血清型III)、H36b(血清型Ib)および090(血清型Ia)に対応するパイロット規模での実験の発酵プロフィール解析し、H36b菌株を用いて同一のプロセスで30L容発酵槽(B. Braun Biotech Biostat)にて研究室規模で行なった対照発酵と比較した。
3つのパイロット規模の発酵のOD590nmプロフィールは、互いに非常に、ならびに対照発酵と類似していた(図22参照)。該微生物の増殖の一般的なプロフィールは、以下の様式で説明され得る:バッチ相はおよそ2.5時間持続し、3であるOD590nmがもたらされた。酵母抽出物溶液(F1、150g/L)の最初の対数増殖フィード添加はおよそ45分間持続し、5であるOD590nmがもたらされた。酵母抽出物溶液(F2、150g/L)の2回目の対数増殖フィード添加はおよそ45分間持続し、およそ10であるOD590nmがもたらされた。一水和型グルコース(F3、550g/L)の3回目のpH−statフィード添加はおよそ3時間持続した。
G)増殖速度および集団倍加時間の評価
3回の予備試験操作および対照発酵中、増殖速度(μ)および集団倍加時間(td)を評価した。値は図22ならびに表14に報告した。
3回の予備試験操作および対照発酵中、増殖速度(μ)および集団倍加時間(td)を評価した。値は図22ならびに表14に報告した。
H)莢膜多糖生産の評価
発酵の終了時、cpのシアル酸化合物の濃度の測定に基づいた比色分析法を用いてcpの濃度を評価した。この結果に基づき、培養中に生産されたcp量を、cp濃度に発酵槽内部の最終容量(参照発酵では20L、パイロット規模の発酵槽では215L)を乗算することにより算出した。また、後述する発酵関連解析法に示したようにして、容積生産性および比生産性も計算した。値は表15に報告した。
発酵の終了時、cpのシアル酸化合物の濃度の測定に基づいた比色分析法を用いてcpの濃度を評価した。この結果に基づき、培養中に生産されたcp量を、cp濃度に発酵槽内部の最終容量(参照発酵では20L、パイロット規模の発酵槽では215L)を乗算することにより算出した。また、後述する発酵関連解析法に示したようにして、容積生産性および比生産性も計算した。値は表15に報告した。
発酵プロセスは、規模拡大における潜在的な変動を回避するため、および発酵槽内の夾雑のリスクを低減するための2つの様式で単純化した。
まず、チアミン、リボフラビン、ピリドキシンHCl、およびナイアシンアミド(各々0.05g/L、0.1M NaOH中に希釈、0.2μm濾過によって滅菌)を含有するビタミン溶液を、播種材料および発酵槽の培地から除いた。実際、研究室の結果では、このようなビタミンの添加は、GBSの増殖に必要でないことが示され、cp生産量に対する影響は無視できるものであった。
第2に、フィード相発酵時のパラメータを変更した。酵母抽出物添加の2つの対数増殖期フィード相を2回の即時添加に置き換え、グルコース添加のpH−statフィード相を線形添加に置き換えた。最初の即時添加(F1)は、3.6Lの酵母抽出物溶液の添加、150g/L(蠕動ポンプ使用、550mL.min−1の流速、OD590nmが2.5〜3の範囲のとき)で構成した。2回目の即時添加(F2)は、13.4Lの酵母抽出物溶液の添加、150g/L(蠕動ポンプ使用、550mL.min−1の流速、OD590nmが4.5〜5の範囲のとき)で構成した。3回目の線形添加(F3)は、17Lのグルコース溶液の添加(蠕動ポンプ使用、95mL.min−1の流速、OD590nmが10〜12の範囲のとき)で構成した。
J)発酵プロフィールの説明および先の操作との比較
この一連の予備試験操作の発酵プロフィールを解析し、最初の一連のものと比較し、
単純化プロセスがパイロット規模においてなんら影響はないことを確認した。
この一連の予備試験操作の発酵プロフィールを解析し、最初の一連のものと比較し、
単純化プロセスがパイロット規模においてなんら影響はないことを確認した。
3つのパイロット規模の発酵のOD590nmプロフィールは、互いに、ならびに最初の一連の予備試験操作で観察された一般的なプロフィールと非常に類似していた(図23参照)。このプロフィール間の類似性により、プロセスの変更が、研究室規模で示された該微生物の増殖に対して影響しないことが強調される。
K)増殖速度、集団倍加時間および莢膜多糖生産の評価
この一連の操作の増殖速度および集団倍加時間(表16)もまた、最初の一連の予備試験操作と非常に類似しており、有意な変動は観察されなかった。
この一連の操作の増殖速度および集団倍加時間(表16)もまた、最初の一連の予備試験操作と非常に類似しており、有意な変動は観察されなかった。
この2つの一連のパイロット規模試験操作の間、許容基準および関連する試料採取計画により、重要な処理工程の重要なプロセス内対照が規定された。最初のプロセス内対照は播種前のフラスコのOD590nmであり、これは、研究室規模で観察されたような発酵槽内での培養開始時の潜在的なラグ相を回避するために好ましくは0.6〜1.8である。以下のプロセス内対照は培養物純度と関連していた。フラスコ培地のグラム染色ならびにプールしたビンおよび発酵槽の培地のプレート上への延展を行ない、この環境に夾雑物はないことを確認した。別のグラム染色および培養の終了時、発酵槽内部の培地のプレート上への延展を行ない、プロセス中に夾雑がないことを確認した。ペレットの不活化は、不活化の36時間後、0.8M NaOH中のペレットをプレート上に延展することにより確認した。表18に示したその他のプロセス内対照を使用し、cp精製収率を計算した。種々のパラメータ(PO2、空気流、O2流速、攪拌、pH、温度)のプロフィールを開発し、これは、発酵プロセスの再現性の良好な指標であった。
i)一般的な発酵プロフィールの説明および先の操作との比較
この試験操作のOD590nmプロフィールは、互いに、ならびにこの実施例の先の試験操作で観察された一般的なプロフィールと非常に類似していた(図24参照)。
この試験操作のOD590nmプロフィールは、互いに、ならびにこの実施例の先の試験操作で観察された一般的なプロフィールと非常に類似していた(図24参照)。
この一連の操作の増殖速度および集団倍加時間(表18)は、予備試験操作と同等であった。より詳しくは、3つの試験操作の添加相の増殖速度は、先に報告した増殖速度の最小値と最大値の間であった。しかしながら、M781の培養中のF3相および090の培養中のF2相の増殖速度は、先に報告した最小値よりもわずかに低かった(それぞれ、0.15<0.18、および0.62<0.65)が、OD590nm最終値に対しては何も起こらず、先の試験操作時に得られたOD590nmの極値間であった(菌株090およびH36bの最初の予備試験操作で、それぞれ14および25.1)。
第1のプロセス内対照は播種前のフラスコのOD590nmであり、菌株090の0.80と菌株M781の1.50の間の範囲であった。発酵槽での培養開始時のラグ相は観察されなかった。フラスコ培養物の純度解析は、グラム染色(グラム陽性球菌のみが示される)ならびに培養の終了時、プールしたビンおよび発酵槽の培地(同様にグラム陽性球菌のみが示される)によって確認した。0.8M NaOH中のペレットの不活化を、不活化の36時間後にプレート上に延展した。
4つの試験操作時の種々のパラメータ(PO2、空気流、O2流速、攪拌、pH、温度)のプロフィールは、予備試験操作で報告した一般的なプロフィールと同等であった。
バイオマスの測定。発酵中、バイオマスの含有量は、波長590nmにおける培養物の光学密度の測定によってモニターされる。試料の希釈物は、0.300〜0.600の範囲内で吸光度の値が読み取れるように調製されなければならない。回収物の湿潤重量は、16000×gで25分間の遠心分離後に測定される。
莢膜多糖含有量の測定。GBSの血清型特異的莢膜多糖は、以下の糖:NANA:N−アセチル−ノイラミン酸またはシアル酸;GLUCグルコース;GAL:ガラクトースおよびNAGA:N−アセチル−グルコサミンの反復単位で構成されている。シアル酸含有量は、Svennerholm(SvennerholmL.,(1957)Biochem. Biophys. ACTA 24:604−611)によって設定された化学的方法を用いて測定され得る。反復単位の組成は血清型により異なるため、各血清型には異なる補正因子を適用しなければならない。
・10OD.mLの量を遠心分離(16000×g、5分、4℃) [標準化]
・ペレットを1mLのPBSで洗浄および遠心分離機(16000×g、5分、4℃) [洗浄]
・ペレットに500mcLのNaOH(2N、65℃、1時間)を添加 [加水分解]
・1時間後、500mcLのHCl(2N、4℃)で中和 [中和]
・菌体残屑を遠心分離(16000×g、30分、4℃)によって除去 [精製]
・上清みを濾過(0.22ミクロン)によって滅菌 [滅菌]
・100mLを900mLのH2Oで希釈 [希釈]
標準曲線の作成。菌株COH1−13(莢膜なし)の培養物を試料と同様にして調製する。希釈工程は、既知量のシアル酸ストック溶液を添加して1、5、10、15、20〜30mg/mLの終濃度を得ることを特徴とする(100mLの上清み+xmLのシアル酸SS+900〜xmLのH2O)。
化学反応。試薬の出発材料:A=レゾルシノール(2%、H2O);B=CuSO4・5H2O(0.1M、H2O)。新鮮試薬は以下のとおりに混合する:10mLのA+0.25mLのB+H2O(Vfin=20mL)→+HCl(37%)(Vfin=100mL)。混合された試薬は、4℃で1週間安定である。1mLの試薬を1mLの希釈試料に添加し、90℃で40分間インキュベートし、564nmにおける吸光度を読み取る。
定量。標準曲線を用いて試料中のNANAの量を調べる。
・血清型の補正因子を適用 [比CP含有量(mg/LOD)]
・培養物のODを乗算[容量容積CP含有量(mcg/mLまたはmg/L)]
・回収容量を乗算[総生産CP(mg)]
実施例6−精製
この実施例では、莢膜多糖に関して以前に可能であった純度レベルよりもずっと高い純度レベルがもたらされる例示的な精製プロトコルを示す。
・血清型の補正因子を適用 [比CP含有量(mg/LOD)]
・培養物のODを乗算[容量容積CP含有量(mcg/mLまたはmg/L)]
・回収容量を乗算[総生産CP(mg)]
実施例6−精製
この実施例では、莢膜多糖に関して以前に可能であった純度レベルよりもずっと高い純度レベルがもたらされる例示的な精製プロトコルを示す。
GBS Ia、Ib、IIIおよびV型多糖の単離および精製
天然GBS V型多糖を、以下のプロセス工程を用いて細菌から抽出し、精製した。
天然GBS V型多糖を、以下のプロセス工程を用いて細菌から抽出し、精製した。
細菌の発酵:GBS V型菌株(例えば、CJB111)を複合培地で培養した。任意の培養方法が使用され得るが、本明細書に開示したような発酵培養が好ましい。
発酵バイオマスの不活化および多糖抽出(塩基処理):必要であれば、バイオマスを室温になるまで加熱してもよい。水酸化ナトリウム(4M)を、回収したバイオマスに終濃度0.8Mまで添加し、均一になるまで混合した。続いて、この懸濁液を、混合しながら、37℃で36時間インキュベートした。
バイオマスの中和:塩基処理での抽出後、1M TRIS−塩基(121.14g/mol)を、終濃度50mMまで添加し(52.6mL/1Lの塩基混合物)、懸濁液を均質になるまで混合した。混合物のpHを、HCl(6M)(濃縮酸の1:1希釈物)で7.8に調整した。
アルコール沈殿:2M CaCl2を終濃度0.1Mまで添加し(52.6mL/1Lの中和混合物)、懸濁液を均質になるまで混合した。エタノール(96%(v/v))を終濃度30%(v/v)エタノール(428mL/1L)まで添加し、懸濁液を均質になるまで混合した。
タンジェンシャル精密濾過:アルコール沈殿による上清みを、0.2μmのセルロース膜(Sartorius Sartocon Hydrosart 0.1m2)上で、NaCl(0.5M)+CaCl2(0.1M)+エタノール30%(v/v)を含む透析バッファー(pH7.8に緩衝化)に対するタンジェンシャル精密濾過によって回収した。精密濾過では10透析容量を使用した。透過物は、0.45/0.2μm フィルターを用いて濾過し、透過物を滅菌した(Sartorius Sartobranフィルター)。注:択一例として、保持液を遠心分離によって清澄化し(上清み液が保持される)、2〜8℃で保存してもよい。
タンジェンシャルダイアフィルトレーション30kDa:保存中に形成された微粒状物質を排除するため、該物質を0.45/0.2μmフィルター(Sartobranフィルター)で濾過した。該物質を、30kDaのセルロース膜(Sartorius Sartocon Hydrosart 0.1m2)上で、25容量のTRIS 50mM+NaCl 0.5M(pH8.8に緩衝化)に対して、次いで、10容量のNa2CO2 0.3M+NaCl 0.3M(pH8.8に緩衝化)に対してダイアフィルトレーションした。圧力設定:ΔP[Pin−Pout]<0.7バール、TMP[(Pin+Pout)/2]>1.0(例えば、Pin=2バール、Pout=1バール)。保持液は、0.45/0.2μmフィルター(Sartorius Sartobranフィルター)を用いて濾過滅菌した。次いで、該物質を必要時まで2〜8℃で保存した(最大15日間)。
デプス濾過:CUNO BioCap 2000 1300cm2上でのデプス濾過膜(または小規模調製ではCUNO Z−Carbon R52SP フィルター)を適用し、残留タンパク質夾雑物を除去した。使用する膜またはフィルターの数は、比率:0.5cm2/mg残留タンパク質に基づいて規定した。
CUNO膜を用いた例:蠕動ポンプを使用し、膜を>9.0LのNa2CO3 300mM+NaCl 0.3M(pH8.8に緩衝化)で、350±50mL/分の流速で洗浄した。物質の容量が1.6L未満の場合、懸濁液をNa2CO3 0.3M+NaCl
0.3M(pH8.8に緩衝化)で適正な容量に希釈した。該物質を濾過され、続いて、フィルターを2.5LのNa2CO3 0.3M+NaCl 0.3M(pH8.8に緩衝化)で洗浄した。異なる膜で得られた物質を合わせた。収集された物質を新しい膜(先の数の1/5)上で濾過し、2.5LのNa2CO3 0.3M+NaCl 0.3M(pH8.8に緩衝化)で洗浄した。該物質を0.45/0.2μmフィルター(Sartorius Sartobranフィルター)を用いて濾過滅菌した。該物質を必要時まで2〜8℃で保存した(最大15日間)。
0.3M(pH8.8に緩衝化)で適正な容量に希釈した。該物質を濾過され、続いて、フィルターを2.5LのNa2CO3 0.3M+NaCl 0.3M(pH8.8に緩衝化)で洗浄した。異なる膜で得られた物質を合わせた。収集された物質を新しい膜(先の数の1/5)上で濾過し、2.5LのNa2CO3 0.3M+NaCl 0.3M(pH8.8に緩衝化)で洗浄した。該物質を0.45/0.2μmフィルター(Sartorius Sartobranフィルター)を用いて濾過滅菌した。該物質を必要時まで2〜8℃で保存した(最大15日間)。
多糖の再−N−アセチル化:該物質を、Na2CO3(0.3)M+NaCl(0.3M)(pH8.8に緩衝化)で、2mgの多糖/mL(レゾルシノールシアル酸アッセイによって推定)に希釈した。無水酢酸のストック溶液を、以下の比率:8.3mLの無水酢酸+8.3mLのエタノール96%+983.4mLの水で調製した。新鮮無水酢酸ストック溶液を、2mg/mLに希釈した多糖溶液に、>22:1無水酢酸:多糖反復単位の比率まで添加した。該物質を、混合しながら2時間室温でインキュベートした。この2時間の終了時、pHを確認し、約8.8であることを確認した。
タンジェンシャルダイアフィルトレーション30kDaによる再−N−アセチル化多糖の精製:保存中に形成された微粒状物質を排除するため、該物質を0.45/0.2μmフィルター(Sartobranフィルター)で濾過した。注:遠心分離による清澄化も許容され得る。該物質を、30kDaセルロース膜(Sartocon Hydrosart 0.1m2)上で、13容量の酢酸ナトリウム10mMに対して、AP[Pin−Pout]<0.7バール、TMP[(Pin+Pout)/2]>1.0(例えば、Pin=2バール、Pout=1バール)の圧力設定でダイアフィルトレーションした。該物質を0.45/0.2μmフィルター(Sartorius Sartobranフィルター)で濾過滅菌した。該物質を必要時まで2〜8℃で保存した(最大15日間)。
多糖の回収:CaCl2 2Mを終濃度0.1Mが得られるように添加し(52.6mL/1Lの中和混合物)、懸濁液を均質になるまで混合した。エタノール(96%(v/v))を終濃度80%(v/v)(4L/1Lの溶液の比率)まで添加し、懸濁液を均質になるまで混合した。沈殿物を新鮮エタノール96%(各々、約50mL)で洗浄した(2〜3回)。沈殿物を、3000×gで10分間の遠心分離によって収集し、真空乾燥させて粉末にした。
解析方法
湿式化学的アッセイ:糖含有量を、シアル酸湿式化学的アッセイ(Svennerholm,L. Biochem. Biophys. Acta 1957,24、604)によって調べた。試料をHCl中、80℃で90分間加水分解し、NaOHで中和し、DIONEX(TM)システム内にインジェクトした。データは、CHROMELEON(TM)ソフトウェアによって処理される。PA1ガードを有するCarboPac PA1カラム(流速1.0ml/分)にて、90:10〜60:40 0.1M NaOH、0.1M酢酸Na:0.1M NaOH、0.5M NaNO3の数分間の線形勾配を用いて糖を溶出した。
解析方法
湿式化学的アッセイ:糖含有量を、シアル酸湿式化学的アッセイ(Svennerholm,L. Biochem. Biophys. Acta 1957,24、604)によって調べた。試料をHCl中、80℃で90分間加水分解し、NaOHで中和し、DIONEX(TM)システム内にインジェクトした。データは、CHROMELEON(TM)ソフトウェアによって処理される。PA1ガードを有するCarboPac PA1カラム(流速1.0ml/分)にて、90:10〜60:40 0.1M NaOH、0.1M酢酸Na:0.1M NaOH、0.5M NaNO3の数分間の線形勾配を用いて糖を溶出した。
遊離シアル酸は、試料を加水分解せずに水中に1.0mg/mlで可溶化した多糖試料をインジェクトすることにより測定した。このようにして、遊離シアル酸を結合シアル酸から分離することが可能であった。図29は、0.5μg/mlにおける多糖試料および標準品(灰色線)のオーバーレイである。多糖試料では、遊離シアル酸は検出されない。再生工程でのピークは、加水分解されていない多糖であった。遊離シアル酸は、免疫応答と関連しているため、重要なパラメータである。
残留タンパク質含有量は、MicroBCA(TM)市販キット(Pierce)によって調べた。残留核酸含有量は、Sheldon,E.L.ら Biochem. Biophys. Res. Comm. 1989,156(1)、474によって公表された方法に従って測定した。
残留B群多糖含有量は、ラムノース残基を測定し、HPAEC−PAD解析に基づいた方法を使用することにより調べた。ラムノースは、B群炭水化物の特異的な糖であり、型多糖には見られない。これを用いて、莢膜多糖精製後の夾雑炭水化物残渣の濃度を調べた。アッセイした試料は、図30の精製GBS III型多糖であった。試料には、ラムノースピークは存在せず、これは、他の炭水化物夾雑物の非存在を示す。灰色のクロマトグラムは、ラムノース標準品を試料に添加することにより得たものである。試料および標準品は、2N TFA中で100℃で3.0時間加水分解させ、次いでSpeedVacにてエバポレーションし、450μlのH2Oで再構成した。ラムノース標準曲線の範囲は、1.0〜10.0μg/mlである。クロマトグラフィー条件は:PA1ガードを有するCarboPac PA1カラム、流速1.0ml/分のNaOH 12mMを15分間、続いてNaOH 500mMでの5分間の再生、次いで、NaOH 12mM中で25分間の再平衡化とした。
クロマトグラフィー解析:該型の多糖のおおよその分子量を、PBSで平衡化し、デキストランで較正したSUPEROSE(TM)6 HR 10/30カラム(GE Healthcare)でのHPLCによって推定した。
NMR解析:精製多糖の試料を、この粉末を1mLの重水(D2O,Aldrich)に均一濃度まで溶解することにより調製した。試料のアリコート(750μL)を5mmNMRチューブ(Wilmad)に移した。1H NMR実験を25℃で、Bruker
600MHz分光測光計において、5mmブロードバンドプローブ(Bruker)を用いて記録した。データの取得および処理には、XWINNMRソフトウェアパッケージ(Bruker)を使用した。1−DプロトンNMRスペクトルは、32スキャンによる標準的な1パルス実験を用いて収集した。トランスミッターはHDO周波数(4.79ppm)に設定した。1H NMRスペクトルは、定量物質において、各シグナル(5×縦緩和時間T1)の充分な回収が確保される全再循環時間を用いて取得した。
600MHz分光測光計において、5mmブロードバンドプローブ(Bruker)を用いて記録した。データの取得および処理には、XWINNMRソフトウェアパッケージ(Bruker)を使用した。1−DプロトンNMRスペクトルは、32スキャンによる標準的な1パルス実験を用いて収集した。トランスミッターはHDO周波数(4.79ppm)に設定した。1H NMRスペクトルは、定量物質において、各シグナル(5×縦緩和時間T1)の充分な回収が確保される全再循環時間を用いて取得した。
2−Dホモ−およびヘテロ−相関NMRスペクトルを記録し、1−DプロトンNMRプロフィールに割り当てた(図25〜28参照)。また、ピークの割り当てを公表データ(Michon,F.;Chalifour,R.;Feldman,R.;Wessels,M.;Kasper,D.L.;Gamian,A.;Pozsgay,V.;Jennings,H.J.Infect Immun 1991,59,1690および関連論文)との比較によって確認した。
結果および考察
この手順により、該型の多糖を連鎖球菌から精製するための新規で単純な、高速で有効な方法が提供される。該プロセスは、DNアーゼ、RNアーゼおよびプロテアーゼ処理の使用を伴わないことが好都合である。生産物は高収率で回収されるが、主な潜在的な夾雑物(タンパク質、核酸およびB群多糖)はすべて1%w/w未満に低減される。この新しい精製方法は、このような莢膜多糖から誘導される臨床用物質および市販用物質の製造に使用され得る。
この手順により、該型の多糖を連鎖球菌から精製するための新規で単純な、高速で有効な方法が提供される。該プロセスは、DNアーゼ、RNアーゼおよびプロテアーゼ処理の使用を伴わないことが好都合である。生産物は高収率で回収されるが、主な潜在的な夾雑物(タンパク質、核酸およびB群多糖)はすべて1%w/w未満に低減される。この新しい精製方法は、このような莢膜多糖から誘導される臨床用物質および市販用物質の製造に使用され得る。
生産物の純度は、表24に報告したとおりに確認された。
実施例7−精製
この実施例は、莢膜多糖に関して以前に可能であった純度レベルよりもずっと高い純度レベルがもたらされるさらなる例示的な精製プロトコルを示す。
この実施例は、莢膜多糖に関して以前に可能であった純度レベルよりもずっと高い純度レベルがもたらされるさらなる例示的な精製プロトコルを示す。
GBS Ia型、Ib型、III型およびV型多糖の単離および精製
天然GBS V型多糖を、以下のプロセス工程を用いて細菌から抽出し、精製した。
天然GBS V型多糖を、以下のプロセス工程を用いて細菌から抽出し、精製した。
細菌の発酵:GBS V型菌株(例えば、CJB111)を複合培地で培養した。任意の培養方法が使用され得るが、本明細書に開示したような発酵培養が好ましい。
発酵バイオマスの不活化および多糖抽出(塩基処理):必要であれば、バイオマスを室温になるまで加熱してもよい。水酸化ナトリウム(4M)を、回収したバイオマスに終濃度0.8Mまで添加し、均一になるまで混合した。続いて、この懸濁液を、混合しながら、37℃で36時間インキュベートした。
バイオマスの中和:塩基処理での抽出後、1M TRIS−塩基(121.14g/mol)を、終濃度50mMまで添加し(52.6mL/1Lの塩基混合物)、懸濁液を均質になるまで混合した。混合物のpHを、HCl(6M)(濃縮酸の1:1希釈物)で7.8に調整した。
アルコール沈殿:2M CaCl2を終濃度0.1Mまで添加し(52.6mL/1Lの中和混合物)、懸濁液を均質になるまで混合した。エタノール(96%(v/v))を終濃度30%(v/v)エタノール(428mL/1L)まで添加し、懸濁液を均質になるまで混合した。
タンジェンシャル精密濾過:アルコール沈殿による上清みを、0.2μmのセルロース膜(Sartorius Sartocon Hydrosart 0.1m2)上で、NaCl(0.5M)+CaCl2(0.1M)+エタノール30%(v/v)を含む透析バッファー(pH7.8に緩衝化)に対するタンジェンシャル精密濾過によって回収した。精密濾過では10透析容量を使用した。透過物は、0.45/0.2μmフィルターを用いて濾過し、透過物を滅菌した(Sartorius Sartobranフィルター)。注:択一例として、保持液を遠心分離によって清澄化し(上清み液が保持される)、2〜8℃で保存してもよい。
タンジェンシャルダイアフィルトレーション30kDa:保存中に形成された微粒状物質を排除するため、該物質を0.45/0.2μmフィルター(Sartobranフィルター)で濾過した。該物質は、まず、30kDaセルロース膜(Sartorius Sartocon Hydrosart 0.6m2)を用いて20容量のTRIS 50mM、NaCl 0.5M(pH8.8)に対するダイアフィルトレーション工程、次いで10容量のリン酸Na 10mM(pH7.2)に対するダイアフィルトレーション工程によって精製した。圧力設定:Pin=3バール、Pout=1バール)。最初のダイアフィルトレーション工程の保持液を10kgに希釈し、次いで、pH4.0の酢酸/酢酸ナトリウム溶液(2L)で処理した。この処理で得られた懸濁液を、沈殿物を除去するためにGFPlus 0.45μm膜(Sartorius)を用いて濾過し、次いで、0.2μm膜フィルター(Sartobran Sartorius)を用いてもう一度濾過した。pHを4.4±0.1の値に維持した。次いで、濾過した生産物を、再度、Na2CO3 0.3M、NaCl 0.3M(pH8.8)に対してダイアフィルトレーションした。0.45/0.2フィルターを用いたさらなる濾過後、該物質を必要時まで2〜8℃で(最大15日間)保存した。
CUNO膜での付着濾過:CUNO Z−Carbon R53SLP8 カートリッジを用いて濾過を行なった。蠕動ポンプを使用し、カートリッジを専用ホルダー内に取り付け、次いで、>20.0LのWFIで流速580±40mL/分にて洗浄した。次いで、カートリッジを>20.0LのNa2CO3 0.3M、NaCl 0.3M(pH8.8)で同じ流速にて洗浄した。物質の容量が20Lが未満の場合は、Na2CO3 0.3M、NaCl 0.3M(pH8.8に緩衝化)で所望の容量まで希釈した。次いで、該物質を濾過し、滅菌バッグ内に収集した。ホルダーに、20LのNa2CO3 0.3 M5 NaCl 0.3M(pH8.8)を満たし、濾過を行なって6Lの濾過生産物を収集した。次いで、該物質を、0.45/0.2μmフィルターを用いて濾過した。該物質を使用時まで2〜8℃で(最大15日間)保存した。
多糖の再−N−アセチル化:Z−Carbon濾過物質を、無水酢酸/エタノール溶液で処理し、再−N−アセチル化させた。1Lの多糖溶液で処理する必要がある反応性混合物を、以下の割合:4.15mLの無水酢酸+4.15mLの96%エタノールを用いて調製した。反応溶液を攪拌下、室温で2時間インキュベートした。この2時間の終了時、pHを確認し、pHを確認し、約7であることを確認した。
タンジェンシャルダイアフィルトレーション30kDaによる再−N−アセチル化多糖の精製:該物質を、30kDa セルロース膜(0.1m2 Sartocon Hydrosart)上で、13容量のリン酸カリウム10mM(pH7.2)に対して、ΔP[Pin−Pout]<0.7バール、TMP[(Pin+Pout)/2]>1.0(例えば、Pin=2バール、Pout=1バール)の圧力設定でダイアフィルトレーションした。次いで、該物質を、0.45/0.2μmフィルターを用いて濾過した。該物質を必要時まで−20℃で保存した。
Claims (42)
- (a)莢膜多糖(cp)を発現する連鎖球菌属菌株の播種材料を準備すること、および(b)該菌株を発酵によって培養することを含み、前記培養は、培養培地への炭素源の線形添加を含み、該培養培地のpHをモニタリングすることにより該培養を制御するためのアルゴリズムを使用しない、製造規模での莢膜多糖(cp)の生産のための連鎖球菌属の培養方法。
- さらに、前記莢膜多糖を回収する工程(c)を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記連鎖球菌属菌株が、さらにStreptococcus agalactiaeを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記Streptococcus agalactiae菌株が090、H36b、CBJ111、またはM781である、請求項3に記載の方法。
- 前記播種材料の光学密度(OD)が約0.6と約1.8の間である、請求項1に記載の方法。
- 前記培養培地のpHが約6.0と約7.5の間である、請求項1に記載の方法。
- 前記pHが約7.3である、請求項6に記載の方法。
- 前記培養培地の温度が約34℃と約38℃の間である、請求項1に記載の方法。
- 前記温度が約36℃である、請求項8に記載の方法。
- 前記炭素源が、さらにグルコースを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記培養が、さらに、ODが指定レベルに達したら前記炭素源の線形添加が開始されるように培養培地のODをモニタリングすることを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記指定レベルが、cpの高容積生産が達成されるように選択される、請求項11に記載の方法。
- 前記指定レベルが約9.8と約10.2の間である、請求項11に記載の方法。
- 前記指定レベルが約10である、請求項13に記載の方法。
- 前記培養が、さらに、ODが第1および第2の即時添加レベルに達したら、前記炭素源の線形添加の前に酵母抽出物の2回の即時添加が開始されるように培養培地のODをモニタリングすることを含む、請求項11に記載の方法。
- 前記第1および第2の即時添加レベルが、cpの高容積生産が達成されるように選択される、請求項15に記載の方法。
- 前記第1の即時添加レベルが約2.8と約3.2の間である、請求項16に記載の方法。
- 前記第1の即時添加レベルが約3.0である、請求項17に記載の方法。
- 前記第2の即時添加レベルが約4.3と約4.7の間である、請求項16に記載の方法。
- 前記第2の即時添加レベルが約4.5である、請求項19に記載の方法。
- 前記培養培地が、リン酸源、ミネラル源、炭素源、ビタミン源、およびアミノ酸源を含む、連鎖球菌属を増殖させる規定培地であり、前記ビタミン源が以下の7種類のビタミンのリスト:ビオチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、リボフラビン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシンおよび葉酸から選択される6種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち2種類はパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドでなければならない、請求項1に記載の方法。
- 前記培養培地が、酵母抽出物、リン酸源、炭素源、ビタミン源、および任意選択でアミノ酸源を含む、連鎖球菌属を増殖させる複合培地であり、前記ビタミン源が以下の5種類のビタミンのリスト:ビオチン、ナイアシンアミド、リボフラビン、塩酸チアミンおよび塩酸ピリドキシンから選択される4種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち1種類はビオチンでなければならない、請求項1に記載の方法。
- 連鎖球菌属菌株、リン酸源、炭素源、ビタミン源、およびアミノ酸源を含む、連鎖球菌属を増殖させるための培養培地であって、前記ビタミン源が以下の7種類のビタミンのリスト:ビオチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、リボフラビン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシンおよび葉酸から選択される6種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち2種類はパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドでなければならない、培養培地。
- 前記連鎖球菌属がStreptococcus agalactiaeである、請求項23に記載の培養培地。
- 前記リン酸源が、K 2 HPO 4 、KH 2 PO 4 、Na 2 HPO 4 ・H 2 O、NaH 2 PO 4 ・H 2 O、またはNaClからなる、請求項23に記載の培養培地。
- 前記炭素源がグルコースである、請求項23に記載の培養培地。
- 前記ビタミン源が、以下の7種類のビタミンのリスト:ビオチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、リボフラビン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシンおよび葉酸のうちの6種類以下からなり、2種類はパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドでなければならない、請求項23に記載の培養培地。
- 前記ビタミン源が、以下の7種類のビタミンのリスト:ビオチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、リボフラビン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシンおよび葉酸のうちの5種類以下からなり、2種類はパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドでなければならない、請求項23に記載の培養培地。
- 前記ビタミン源が、以下の7種類のビタミンのリスト:ビオチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、リボフラビン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシンおよび葉酸のうちの4種類以下からなり、2種類はパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドでなければならない、請求項23に記載の培養培地。
- 前記ビタミン源が、以下の7種類のビタミンのリスト:ビオチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、リボフラビン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシンおよび葉酸のうちの3種類以下からなり、2種類はパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドでなければならない、請求項23に記載の培養培地。
- 前記ビタミン源がパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドからなる、請求項23に記載の培養培地。
- 前記アミノ酸源が、以下の19種類のアミノ酸のリスト:アラニン、アルギニン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、アスパラギン酸、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンのうちの19種類以下からなり、15種類は、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンでなければならない、請求項23に記載の培養培地。
- 前記アミノ酸源が、以下の19種類のアミノ酸のリスト:アラニン、アルギニン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、アスパラギン酸、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンのうちの18種類以下からなり、15種類は、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンでなければならない、請求項23に記載の培養培地。
- 前記アミノ酸源が、以下の19種類のアミノ酸のリスト:アラニン、アルギニン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、アスパラギン酸、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンのうちの17種類以下からなり、15種類は、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンでなければならない、請求項23に記載の培養培地。
- 前記アミノ酸源が、以下の19種類のアミノ酸のリスト:アラニン、アルギニン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、アスパラギン酸、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンのうちの16種類以下からなり、15種類は、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンでなければならない、請求項23に記載の培養培地。
- 前記アミノ酸源が、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンからなる、請求項23に記載の培養培地。
- 連鎖球菌属菌株、酵母抽出物、リン酸源、炭素源、ビタミン源、および任意選択でアミノ酸源を含む、連鎖球菌属を増殖させるための培養培地であって、前記ビタミン源が、以下の5種類のビタミンのリスト:ビオチン、ナイアシンアミド、リボフラビン、塩酸チアミンおよび塩酸ピリドキシンから選択される4種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち1種類はビオチンでなければならない、培養培地。
- 前記連鎖球菌属がStreptococcus agalactiaeである、請求項37に記載の培養培地。
- 前記ビタミン源が、以下の5種類のビタミンのリスト:ビオチン、ナイアシンアミド、リボフラビン、塩酸チアミンおよび塩酸ピリドキシンから選択される4種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち1種類はビオチンでなければならない、請求項37に記載の培養培地。
- 前記ビタミン源が、以下の5種類のビタミンのリスト:ビオチン、ナイアシンアミド、リボフラビン、塩酸チアミンおよび塩酸ピリドキシンから選択される3種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち1種類はビオチンでなければならない、請求項37に記載の培養培地。
- 前記ビタミン源が、以下の5種類のビタミンのリスト:ビオチン、ナイアシンアミド、リボフラビン、塩酸チアミンおよび塩酸ピリドキシンから選択される2種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち1種類はビオチンでなければならない、請求項37に記載の培養培地。
- 前記ビタミン源がビオチンからなる、請求項37に記載の培養培地。
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