JP5465676B2 - 連鎖球菌属を培養するための発酵プロセスおよび連鎖球菌属由来の莢膜多糖(cp)を得るための精製プロセス - Google Patents
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Description
本発明は、細菌培養の分野におけるものであり、好ましくは、細菌莢膜多糖の生産を改善するための培養条件の最適化および新規な精製方法に関する。
莢膜多糖(cp)は、種々の細菌性疾患に関与している細菌の表面上に見られる重要な免疫原である。この特徴により、莢膜多糖は、ワクチンの設計において重要な成分となっている。莢膜多糖は、特に、担体タンパク質と連結させると、免疫応答の誘起に有用であることが示されている(参考文献1)。
本発明者らは、製造規模で連鎖球菌属から莢膜多糖(cp)を生産するための方法を提供することにより、発酵プロトコルの単純化のための必要性を満たした。一部の特定の実施形態において、炭素源の線形添加時のpH平衡化のためのアルゴリズムが排除され、他の実施形態では、培地の不必要な成分が除外された。連鎖球菌属の好ましい種はStreptococcus agalactiaeであり、これは、ランスフィールドのB群連鎖球菌属またはGBS、特に、菌株090、H36b、CBJ111、もしくはM781とも称される。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
(項目1)
(a)cpを発現する連鎖球菌属菌株の播種材料を準備すること、および(b)該菌株を発酵によって培養することを含み、前記培養は、培養培地への炭素源の線形添加を含み、該培養培地のpHをモニタリングすることにより該培養を制御するためのアルゴリズムを使用しない、製造規模での莢膜多糖(cp)の生産のための連鎖球菌属の培養方法。
(項目2)
さらに、莢膜多糖を回収する工程(c)を含む、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記連鎖球菌属菌株が、さらにStreptococcus agalactiaeを含む、項目1または項目2に記載の方法。
(項目4)
前記Streptococcus agalactiae菌株が090、H36b、CBJ111、またはM781である、項目3に記載の方法。
(項目5)
前記播種材料の光学密度(OD)が約0.6と約1.8の間である、項目1〜4のいずれか1項に記載の方法。
(項目6)
前記培養培地のpHが約6.0と約7.5の間である、項目1〜5のいずれか1項に記載の方法。
(項目7)
前記pHが約7.3である、項目6に記載の方法。
(項目8)
前記培養培地の温度が約34℃と約38℃の間である、項目1〜7のいずれか1項に記載の方法。
(項目9)
前記温度が約36℃である、項目8に記載の方法。
(項目10)
前記炭素源が、さらにグルコースを含む、項目1〜9のいずれか1項に記載の方法。
(項目11)
前記培養が、さらに、ODが指定レベルに達したら前記炭素源の線形添加が開始されるように培養培地のODをモニタリングすることを含む、項目1〜10のいずれか1項に記載の方法。
(項目12)
前記指定レベルが、cpの高容積生産が達成されるように選択される、項目11に記載の方法。
(項目13)
前記指定レベルが約9.8と約10.2の間である、項目11または項目12に記載の方法。
(項目14)
前記指定レベルが約10である、項目13に記載の方法。
(項目15)
前記培養が、さらに、ODが第1および第2の即時添加レベルに達したら、前記炭素源の線形添加の前に酵母抽出物の2回の即時添加が開始されるように培養培地のODをモニタリングすることを含む、項目11〜14のいずれか1項に記載の方法。
(項目16)
前記第1および第2の即時添加レベルが、cpの高容積生産が達成されるように選択される、項目15に記載の方法。
(項目17)
前記第1の即時添加レベルが約2.8と約3.2の間である、項目16に記載の方法。
(項目18)
前記第1の即時添加レベルが約3.0である、項目17に記載の方法。
(項目19)
前記第2の即時添加レベルが約4.3と約4.7の間である、項目16〜18のいずれか1項に記載の方法。
(項目20)
前記第2の即時添加レベルが約4.5である、項目19に記載の方法。
(項目21)
前記培養培地が、リン酸源、ミネラル源、炭素源、ビタミン源、および連鎖球菌属を増殖させるアミノ酸源を含む規定培地であり、前記ビタミン源が以下の7種類のビタミンのリスト:ビオチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、リボフラビン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシンおよび葉酸から選択される6種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち2種類はパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドでなければならない、項目1〜20のいずれか1項に記載の方法。
(項目22)
前記培養培地が、酵母抽出物、リン酸源、炭素源、ビタミン源、および任意選択で連鎖球菌属を増殖させるアミノ酸源を含む複合培地であり、前記ビタミン源が以下の5種類のビタミンのリスト:ビオチン、ナイアシンアミド、リボフラビン、塩酸チアミンおよび塩酸ピリドキシンから選択される4種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち1種類はビオチンでなければならない、項目1〜20のいずれか1項に記載の方法。
(項目23)
連鎖球菌属菌株、リン酸源、炭素源、ビタミン源、および連鎖球菌属を増殖させるアミノ酸源を含む培養培地であって、前記ビタミン源が以下の7種類のビタミンのリスト:ビオチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、リボフラビン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシンおよび葉酸から選択される6種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち2種類はパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドでなければならない、培養培地。
(項目24)
前記連鎖球菌属がStreptococcus agalactiaeである、項目23に記載の培養培地。
(項目25)
前記リン酸源が、K 2 HPO 4 、KH 2 PO 4 、Na 2 HPO 4 ・H 2 O、NaH 2 PO 4 ・H 2 O、またはNaClからなる、項目23または項目24に記載の培養培地。
(項目26)
前記炭素源がグルコースである、項目23〜25のいずれか1項に記載の培養培地。
(項目27)
前記ビタミン源が、以下の7種類のビタミンのリスト:ビオチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、リボフラビン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシンおよび葉酸のうちの6種類以下からなり、2種類はパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドでなければならない、項目23〜26のいずれか1項に記載の培養培地。
(項目28)
前記ビタミン源が、以下の7種類のビタミンのリスト:ビオチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、リボフラビン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシンおよび葉酸のうちの5種類以下からなり、2種類はパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドでなければならない、項目23〜26のいずれか1項に記載の培養培地。
(項目29)
前記ビタミン源が、以下の7種類のビタミンのリスト:ビオチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、リボフラビン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシンおよび葉酸のうちの4種類以下からなり、2種類はパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドでなければならない、項目23〜26のいずれか1項に記載の培養培地。
(項目30)
前記ビタミン源が、以下の7種類のビタミンのリスト:ビオチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、リボフラビン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシンおよび葉酸のうちの3種類以下からなり、2種類はパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドでなければならない、項目23〜26のいずれか1項に記載の培養培地。
(項目31)
前記ビタミン源がパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドからなる、項目23〜26のいずれか1項に記載の培養培地。
(項目32)
前記アミノ酸源が、以下の19種類のアミノ酸のリスト:アラニン、アルギニン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、アスパラギン酸、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンのうちの19種類以下からなり、15種類は、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンでなければならない、項目23〜31のいずれか1項に記載の培養培地。
(項目33)
前記アミノ酸源が、以下の19種類のアミノ酸のリスト:アラニン、アルギニン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、アスパラギン酸、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンのうちの18種類以下からなり、15種類は、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンでなければならない、項目23〜31のいずれか1項に記載の培養培地。
(項目34)
前記アミノ酸源が、以下の19種類のアミノ酸のリスト:アラニン、アルギニン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、アスパラギン酸、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンのうちの17種類以下からなり、15種類は、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンでなければならない、項目23〜31のいずれか1項に記載の培養培地。
(項目35)
前記アミノ酸源が、以下の19種類のアミノ酸のリスト:アラニン、アルギニン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、アスパラギン酸、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンのうちの16種類以下からなり、15種類は、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンでなければならない、項目23〜31いずれか1項に記載の培養培地。
(項目36)
前記アミノ酸源が、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンからなる、項目23〜31いずれか1項に記載の培養培地。
(項目37)
連鎖球菌属菌株、酵母抽出物、リン酸源、炭素源、ビタミン源、および任意選択で連鎖球菌属を増殖させるアミノ酸源を含む培養培地であって、前記ビタミン源が、以下の5種類のビタミンのリスト:ビオチン、ナイアシンアミド、リボフラビン、塩酸チアミンおよび塩酸ピリドキシンから選択される4種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち1種類はビオチンでなければならない、培養培地。
(項目38)
前記連鎖球菌属がStreptococcus agalactiaeである、項目37に記載の培養培地。
(項目39)
前記ビタミン源が、以下の5種類のビタミンのリスト:ビオチン、ナイアシンアミド、リボフラビン、塩酸チアミンおよび塩酸ピリドキシンから選択される4種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち1種類はビオチンでなければならない、項目37または項目38に記載の培養培地。
(項目40)
前記ビタミン源が、以下の5種類のビタミンのリスト:ビオチン、ナイアシンアミド、リボフラビン、塩酸チアミンおよび塩酸ピリドキシンから選択される3種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち1種類はビオチンでなければならない、項目37または項目38に記載の培養培地。
(項目41)
前記ビタミン源が、以下の5種類のビタミンのリスト:ビオチン、ナイアシンアミド、リボフラビン、塩酸チアミンおよび塩酸ピリドキシンから選択される2種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち1種類はビオチンでなければならない、項目37または項目38に記載の培養培地。
(項目42)
前記ビタミン源がビオチンからなる、項目37または項目38に記載の培養培地。
(項目43)
付着性フィルターを用いた濾過工程を含む、Streptococcus agalactiaeから莢膜多糖を精製するための方法。
(項目44)
前記莢膜多糖を沈殿させるためのカチオン系デタージェント処理工程、その後の該莢膜多糖の再可溶化工程を含まない、項目43に記載の方法。
(項目45)
前記付着性フィルターがタンパク質付着性フィルターである、項目43または項目44に記載の方法。
(項目46)
前記付着性フィルターがカーボンフィルターである、項目43〜45のいずれか1項に記載の方法。
(項目47)
付着性フィルターを用いた濾過工程の前に、以下の工程:
(i)夾雑タンパク質および/または核酸のアルコール沈殿;ならびに
(ii)ダイアフィルトレーション
を行なう、項目43〜46のいずれか1項に記載の方法。
(項目48)
付着性フィルターを用いた濾過工程の後に、以下の工程:
(iv)再−N−アセチル化;
(v)ダイアフィルトレーション
を行なう、項目43〜47のいずれか1項に記載の方法。
(項目49)
(a)莢膜多糖を含む粗製分離物を準備すること;
(b)該粗製分離物をアルコール溶液と接触させることによって形成されたアルコール沈殿物を取り出すこと;
(c)莢膜多糖を保持したまま低分子量化合物を除去するために濾過すること;および
(d)タンパク質付着性フィルターを用いてタンパク質夾雑物を除去し、精製莢膜多糖を生成すること
を含む、精製莢膜多糖の生産方法。
(項目50)
さらに、前記精製莢膜多糖を再−N−アセチル化する工程(e)を含む、項目49に記載の方法。
(項目51)
さらに、前記精製莢膜多糖を沈殿させる工程(f)を含む、項目50に記載の方法。
(項目52)
さらに、前記莢膜多糖を一成分として有するワクチンを製剤化する工程(g)を含む、項目51に記載の方法。
(項目53)
工程(b)が、核酸夾雑物を沈殿させるが莢膜多糖は沈殿させないのに充分な濃度までアルコール溶液を添加することを含む、項目49〜52のいずれか1項に記載の方法。
(項目54)
前記アルコール溶液がエタノールを含む、項目53に記載の方法。
(項目55)
前記アルコール溶液が、さらにCaCl 2 を含む、項目53または項目54に記載の方法。
(項目56)
前記アルコール溶液が約10%と約50%の間のエタノール濃度まで添加される、項目54または項目55に記載の方法。
(項目57)
前記アルコール溶液が約30%のエタノール濃度まで添加される、項目56に記載の方法。
(項目58)
前記タンパク質付着性フィルターが活性炭フィルターである、項目49〜57のいずれか1項に記載の方法。
本発明者らは、製造規模での高収率のcpが、任意の連鎖球菌属菌株でフィードバッチ式培養、すなわち、有限容量の新鮮培地中への菌体播種によって開始され、該菌体を培養した後、1回の回収によって終結され、付加的な栄養素は、最初の供給源の栄養素を消費させてから培養物に添加する培養を用いて得られ得ることを見い出した。かかる高収率は、連続式培養を用いて得られるものと同等であるか、またはより良好である。さらに、本明細書において開示した方法は、連続式培養の安定性と汚染の問題を有する傾向がない。さらに、本発明者らは、不純物が有意に改善されるとともに、プロトコルが単純で製造規模が廉価に維持される最適化精製プロトコルを開発した。
用語「連鎖球菌属」は、S.agalactiae(GBS)、S.pyogenes(GAS)、S.pneumoniae(pneumococcus)およびS.mutansから選択され得る細菌をいう。あるいはまた、連鎖球菌属は、S.thermophilusまたはS.lactisであってもよい。好ましくは、連鎖球菌属はGBSである。使用される連鎖球菌属がGBSである場合、好ましくは、選択される血清型は1a、1b、3、4または5である。好ましくは、使用されるGBS菌株は090(1a)、7357(1b)、H36b(1b)、DK21(2)、M781(3)、2603(5)、またはCJB111(5)である。図3A〜B参照。使用される連鎖球菌属がS.pneumoniaeである場合、好ましくは、選択される血清型は、4、6B、9V、14、18C、19Fおよび23Fのうちの1種類以上または全部である。また、好ましくは血清型1が選択され得る。好ましくは、選択される血清型は、1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19Fおよび23Fの1種類以上または全部である。
GBSの生産は、4つの部:(1)各cpの発酵による生産とその一次回収;(2)精密濾過の透過物の精製;(3)乾燥精製cpの構築;および(4)複合糖質生体分子の特性評価に分けられ得る。
播種材料の培養は、121℃でオートクレーブを用いて滅菌した振盪フラスコ内で行なわれ得る。播種材料には、複合培地(酵母抽出物、Na2HPO4・2H2O、NaH2PO4・H2O、およびグルコース一水和物(中性pHおよそ7.3を有する)からなる)、ビタミン溶液(NaOH中に希釈したチアミン、リボフラビン、ピリドキシンHCl、およびナイアシンアミドからなる)、およびビオチン溶液が含まれる。好ましい実施形態において、ビタミン溶液は除外され、ビオチン溶液がビタミン補給物として使用される。
本発明は、フィードバッチ式プロセスを用いた製造規模での連鎖球菌属の改善された培養方法を提供する(図6〜18参照)。フィードバッチ式培養は、固定容量フィードバッチ式または可変容量フィードバッチ式のいずれかであり得る。固定容量フィードバッチ式培養では、限定的基質を、培養物を希釈することなく供給する(例えば、濃縮液もしくはガス状物を使用、または透析の使用による)。可変容量フィードバッチ式培養では、発酵期間において、基質供給量によって容量を変更する。
連鎖球菌属種の増殖の維持に適した任意の型の液状培養培地が使用され得る。好ましい培地としては、複合培地(コロンビア寒天培地(broth)、LB、Todd−Hewitt、OC培地、血液寒天培地またはブレインハートインフュージョンなど);半規定培地(MCDMなど);連鎖球菌属用の化学的に規定される培地(M1、MC、FMC(参考文献11)、またはC−48(参考文献12)など);ならびに必要な栄養要求性成分を含む真核生物細胞株の培養のために構成した培地(RPMI、スペント培地、マッコイ培地およびイーグル培地など)が挙げられる。典型的な培養培地には、酵母抽出物、ならびに増殖に不可欠な他の要素、例えば、脂質(リノール酸もしくはオレイン酸などの長鎖脂肪酸)、ステロイド類(コレステロールなど)、プリンおよびピリミジン、ミネラル類、ビタミン類ならびに増殖因子、アミノ酸(L−および/またはD−体)および/または化学元素もしくは無機イオン(Fe、K、Mg、Mn、Ca、Co、Cu、Pおよび/またはZnなど)が含まれる。培地の濃度を増大させることによって、より高いODが得られ得、cpの高容積生産がもたらされ得る。したがって、複合培地は、好ましくは、酵母抽出物、リン酸源、炭素源、ビタミン源、および任意選択で連鎖球菌属を増殖させるアミノ酸源を含み、ビタミン源が、ビオチンと、任意選択でナイアシンアミド、リボフラビン、塩酸チアミンおよび塩酸ピリドキシンから選択される1種類以上のビタミンとからなる。
使用される炭素源の型は必須事項ではない。好ましくは、主な炭素源は、グルコース、フルクトース、ラクトース、スクロース、マルトデキストリン、デンプン、イヌリン、グリセロール、植物油(大豆油など)、炭化水素、アルコール(メタノールおよびエタノールなど)、有機酸(酢酸類など)からなる群より選択される。より好ましくは、炭素源は、グルコース、グリセロール、ラクトース、フルクトース、スクロースおよび大豆油から選択される。用語「グルコース」は、グルコースシロップ、すなわち、グルコースオリゴマーを含むグルコース組成物を包含する。炭素源は培養物に、固形物または液状物として添加され得る。好ましくは、炭素源は、細胞に対する浸透圧ストレス(これにより、過剰供給がもたらされることになり得る)が回避されるように制御する。これは、通常、発酵持続期間に必要とされる炭素源すべてを、初期バッチ式培養物に添加しないことにより行なわれる。また、炭素源は、培養制限および色素生成がもたらされ得る枯渇が回避されるように制御する(参考文献13)。
使用される窒素源の型は必須事項ではない。好ましくは、窒素源は、尿素、水酸化アンモニウム、アンモニウム塩(硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、塩化アンモニウムおよび硝酸アンモニウムなど)、他の硝酸塩、アミノ酸(グルタミン酸類およびリシンなど)、酵母抽出物、酵母自己分解物、酵母窒素塩基、タンパク質水解産物(例えば限定されないが、ペプトン、カゼイン水解産物、例えば、トリプトンおよびカザミノ酸)、大豆ミール、Hy−Soy、トリプシンによる大豆ブロス、綿実粕、麦芽抽出物、コーンスティープリカーならびに糖蜜から選択される。より好ましくは、窒素源は、水酸化アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムおよびリン酸アンモニウムから選択される。最も好ましくは、窒素源は水酸化アンモニウムである。窒素源としての水酸化アンモニウムの使用は、水酸化アンモニウムが、さらにpH調整剤としての機能を果たし得るという利点を有する。
上記のように、リンを培養培地に添加してもよい。リンは、塩の形態であり得、特に、リン酸塩(上記のようなリン酸アンモニウムなど)またはポリリン酸塩として添加され得る。ポリリン酸塩が使用される場合、これは、ポリリン酸ナトリウムなどのリン酸ガラスの形態であり得る(参考文献14)。かかるリン酸ガラスは、その可溶性特性が、混合時に沈殿を生じないで栄養素濃縮培地が調製され得るようなものであるため、有用である。
培養温度は30〜45℃(例えば、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44℃に)維持される。好ましくは、該温度は約36℃である。したがって、一定の培養温度が維持されるのを確保するため、培養物の入った槽を加熱または冷却することが必要であり得る。該温度は、倍加時間(td)を制御するために使用され得、したがって、所与の培養プロセスでは、該温度は、異なる相(すなわち、バッチ相、フィードバッチ相および炭素供給相)において異なり得る。
細菌からの莢膜糖の調製方法は、当該技術分野でよく知られており、例えば、参考文献15、16、17などを参照のこと。GBSの場合では、以下の方法が使用され得る(参考文献18も参照のこと)。特に、本発明の莢膜多糖の精製方法が使用され得る。上記のように、このような本発明の方法には、以下の工程の1つ以上が含まれ得る。
一般的に、細菌の培養中に培養培地中に放出される莢膜多糖は少量であり、したがって、出発材料は、遠心分離した細菌培養物由来の上清みであり得る。しかしながら、より典型的には、出発材料は、莢膜をもつ細菌自体(または細菌ペプチドグリカンを含有する物質)を、莢膜糖が放出されるように処理することによって調製される。cpは細菌から種々の方法によって、例えば、化学的、物理的または酵素的処理によって放出され得る。したがって、多糖の水性調製物を、最初のタンパク質/核酸沈殿反応の前に処理してもよい。
培養後に得られた連鎖球菌属莢膜糖は、一般的に純粋ではなく、細菌の核酸とタンパク質が夾雑している。このような夾雑物は、逐次、RNアーゼ、DNアーゼおよびプロテアーゼで一晩処理することによって除去され得る。しかしながら、好ましい択一例として、このような夾雑物を酵素的に除去するのではなく、アルコール沈殿が使用され得る。必要であれば(例えば、塩基抽出後)、該物質を、通常、沈殿の前に中和する。
ダイアフィルトレーション工程が使用されてもよい。例えば、該方法が、上記のアルコール沈殿およびカチオン交換を含む場合、この工程は、タンパク質および/または核酸の沈殿後に行なわれ得る。同様に、該方法が、後述するカチオン系デタージェント処理工程を含む場合、このダイアフィルトレーション工程は、デタージェント媒介性沈殿の前に行なわれ得る。付着性フィルターを用いた濾過(例えば、タンパク質付着性フィルターによる濾過)を含む本発明の方法では、このダイアフィルトレーション工程は、該濾過の前に行なわれ得る。典型的には、ダイアフィルトレーション工程は、タンパク質および/または核酸の沈殿の後であって、デタージェント媒介性沈殿または付着性フィルター(例えば、タンパク質付着性フィルター)を用いた濾過の前に使用される。
可溶性多糖を沈殿させるための多くの手法が当該技術分野で知られている。該糖は、任意選択で、1種類以上のカチオン系デタージェントを用いて沈殿させてもよいが、精製の好ましい実施形態では、タージェント沈殿を除外する。莢膜糖と群特異的糖の混合物をカチオン系デタージェントで処理すると、莢膜糖の優先的な沈殿がもたらされ、それにより、群特異的糖による夾雑が好都合かつ簡便に最小化される。
任意選択のデタージェント沈殿工程が使用される場合、多糖(典型的には、カチオン系デタージェントとの複合体の形態)は、水性媒体またはアルコール系媒体のいずれかに再可溶化され得る。水性再可溶化では、沈殿物中のCTA−カチオンが、一般的に、金属カチオンで置き換えられ、アルコール系再可溶化では、CTA−カチオンは一般的に保持される。水性またはアルコール系の再可溶化の選択は、GBS多糖が得られた血清型およびこの段階でなお存在する夾雑物(あれば)に依存し得る。例えば、場合によっては沈殿ペレット中に色素が存在し、これは、アルコール系再可溶化の後、炭素濾過によって有効に除去され得る。
好ましい実施形態において、莢膜多糖の精製は、さらに、タンパク質および/またはDNA夾雑物を、タンパク質および/またはDNAは付着するが、莢膜多糖は付着しないか、もしくはわずかに弱く付着するフィルター(例えば、タンパク質付着性フィルター)を用いた濾過によって除去する工程を含む。かかるフィルターの好ましい例は、カーボンフィルターである。好適な付着性フィルターは上記のものである。
再−N−アセチル化工程は、例えば、付着性フィルターを用いた濾過工程後、または実施する場合は、さらなる濾過工程後に行なわれ得る。再−N−アセチル化は、GBS莢膜糖内のシアル酸残基が、例えば上記の塩基処理中に脱−N−アセチル化された場合、好都合であり得る。再−N−アセチル化の制御は、例えば、無水酢酸(CH3CO)2Oを含む5%重炭酸アンモニウムなどの試薬を用いて簡便に行なわれ得る[Wesselsら(1989)Infect Immun 57:1089−94]。
さらなるダイアフィルトレーション工程は、例えば、再−N−アセチル化後に行なわれ得る。ダイアフィルトレーションは、「ダイアフィルトレーション」という標題のセクションにおいて上記のようにして行なわれ得る。
多糖は、好ましくは最終的に、コンジュゲーションの準備ができた乾燥粉末として調製される。
細菌の培養および莢膜多糖の調製後、該糖を担体タンパク質(1つまたは複数)にコンジュゲートさせる。一般に、担体との糖の共有結合性コンジュゲーションにより、糖がT非依存性抗原からT依存性抗原に変換され、したがって免疫記憶のための初期抗原刺激が可能になるため、糖の免疫原性が増強される。コンジュゲーションは、小児用ワクチンに特に有用であり(例えば、参考文献22)、よく知られた手法である(例えば、参考文献23〜31に概説)。
上記の工程を含めるとともに、本発明の方法に、さらに、さらなる工程を含めてもよい。例えば、該方法は、莢膜糖を細菌から調製した後であってコンジュゲーションの前に、莢膜糖の解重合工程を含むものであり得る。解重合によって糖の鎖長が短くなり、GBSには良好でない場合があり得る。連鎖球菌属、特にGBSでは、糖が長鎖であるほど、短鎖のものより免疫原性が大きくなる傾向にある(参考文献71)。
任意の肺炎球菌血清群について、個々のコンジュゲートは上記のようにして調製され得る。
本発明の方法によって調製されたコンジュゲートを、薬学的に許容され得る担体と合わせてもよい。かかる担体としては、それ自体は、該組成物を受ける個体に対して有害な抗体生成を誘導しない任意の担体が挙げられる。好適な担体は、典型的には、大型のゆっくりと代謝される巨大分子、例えば、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、アミノ酸ポリマー、アミノ酸コポリマー、スクロース、トレハロース、ラクトース、および脂質凝集体(油滴またはリポソームなど)などである。かかる担体は当業者には充分わかる。また、ワクチンには、例えば、水、生理食塩水、グリセロールなどの希釈剤を含めてもよい。また、例えば、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝物質などの補助物質を存在させてもよい。滅菌されたパイロジェンフリーのリン酸緩衝生理食塩水は典型的な担体である。薬学的に許容され得る賦形剤の詳細な論考は参考文献75において入手可能である。
本発明におけるアジュバントとしての使用に適したミネラル含有組成物組成物としては、アルミニウム塩およびカルシウム塩(またはその混合物)などのミネラル塩が挙げられる。本発明は、ミネラル塩、例えば、水酸化物 (例えば、オキシ水酸化物)、リン酸塩(例えば、ヒドロキシリン酸塩、オルトリン酸塩)、硫酸塩など(例えば、参考文献76の第8章および第9章参照)、または異なるミネラル化合物の混合物を含み、該化合物には、任意の適当な形態(例えば、ゲル、結晶性、アモルファスなど)が採用され、吸着が好ましい。また、ミネラル含有組成物を金属塩の粒子として構築してもよい(参考文献77)。
本発明におけるアジュバントとしての使用に適した油性乳剤組成物としては、スクアレン−水乳剤、例えば、MF59(参考文献76の第10章参照;参考文献78も参照のこと)(5%スクアレン、0.5%Tween80、および0.5%Span85、マイクロフルイダイザーを用いてサブミクロン粒子に構築)が挙げられる。また、完全アジュバントアジュバント(CFA)および不完全アジュバントアジュバント(IFA)も使用され得る。
サポニン製剤もまた、本発明におけるアジュバントとして使用され得る。サポニンは、広範な植物種の樹皮、葉、茎、根、さらには花にも見られるステロールグリコシドおよびトリテルペノイドグリコシドの異種群である。Quillaia saponaria Molina樹木の樹皮由来のサポニンは、アジュバントとして広く研究されている。また、サポニンは、Smilax ornata(sarsaprilla)、Gypsophilla paniculata(brides veil)、およびSaponaria officianalis(soap root)から商業的に入手することもできる。サポニンアジュバント製剤としては、QS21などの精製製剤、ならびにISCOMなどの脂質製剤が挙げられる。QS21は、STIMULON(TM)として市販されている。
ビロソームおよびウイルス様粒子(VLP)もまた、本発明におけるアジュバントとして使用され得る。このような構造体は、一般的に、任意選択でリン脂質と会合または構築されたウイルス由来の1種類以上のタンパク質を含む。これらは、一般的に、非病原性であり、非複製性であり、一般的に天然ウイルスゲノムを全く含まない。ウイルスタンパク質は、組換えにより作製されたものであってもよく、完全体ウイルスから単離されたものであってもよい。ビロソームまたはVLPにおける使用に適したこのようなウイルスタンパク質としては、インフルエンザウイルス(HAまたはNAなど)、B型肝炎ウイルス(コアまたはキャプシドタンパク質など)、E型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、シンドビスウイルス、ロタウイルス、口蹄疫ウイルス、レトロウイルス、ノーウォークウイルス、ヒトパピローマウイルス、HIV、RNA−ファージ、Qβ−ファージ(外被タンパク質など)、GA−ファージ、fr−ファージ、AP205ファージ、およびTy(レトロトランスポゾンTyタンパク質p1など)に由来するタンパク質が挙げられる。VLPは、参考文献86〜91にさらに論考されている。ビロソームは、例えば参考文献92にさらに論考されている。
本発明における使用に適したアジュバントは、細菌誘導体または微生物誘導体、例えば、腸内細菌リポ多糖(LPS)の非毒性誘導体、リピドA誘導体、免疫賦活性オリゴヌクレオチドならびにADP−リボシル化毒素およびその無毒化誘導体などを包含する。
本発明におけるアジュバントとしての使用に適したヒト免疫調節因子としては、サイトカイン、例えば、インターロイキン(例えば、IL−1、IL−2、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−12(参考文献125)など)(参考文献126)、インターフェロン(例えば、インターフェロン−γ)、マクロファージコロニー刺激因子、および腫瘍壊死因子などが挙げられる。好ましい免疫調節因子はIL−12である。
生体接着剤および粘膜接着剤もまた、本発明におけるアジュバントとして使用され得る。好適な生体接着剤としては、エステル化ヒアルロン酸ミクロスフェア(参考文献127)または粘膜接着剤、例えば、ポリ(アクリル酸)、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖およびカルボキシメチルセルロースの架橋誘導体が挙げられる。キトサンおよびその誘導体もまた、本発明におけるアジュバントとして使用され得る(参考文献128)。
ミクロ粒子もまた、本発明におけるアジュバントとして使用され得る。生分解性であり非毒性である材料(例えば、ポリ(α−ヒドロキシ酸)、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物(arthydride)、ポリカプロラクトンなど)、ポリ(ラクチド−コ−グリコリド)で形成されたミクロ粒子(すなわち、約100nm〜約150μmの直径、より好ましくは約200nm〜約33μmの直径、最も好ましくは約500nm〜約10μmの直径の粒子)が好ましく、任意選択で処理され、負電荷を有する表面(例えば、SDSで)または正電荷を有する表面(例えば、カチオン系デタージェント(CTABなど)で)を有する。
アジュバントとしての使用に適したリポソーム製剤の例は、参考文献129〜131に記載されている。
本発明における使用に適したアジュバントは、ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル(参考文献132)を包含する。かかる製剤は、さらに、オクトキシノールと組み合わされたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤(参考文献133)、ならびに少なくとも1種類のさらなる非イオン系界面活性剤(オクトキシノールなど)と組み合わされたポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはエステル界面活性剤(参考文献134)を包含する。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群:ポリオキシエチレン−9−ラウリルエーテル(ラウレス9)、ポリオキシエチレン−9−ステオリル(steoryl)エーテル、ポリオキシエチレン(theylene)−8−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−4−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−35−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−23−ラウリルエーテルから選択される。
PCPP製剤は、例えば、参考文献135および136に記載されている。
本発明におけるアジュバントとしての使用に適したムラミルペプチドの例としては、N−アセチルムラミル−L−トレオニル−D−イソグルタミン(thr−MDP)、N−アセチルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミン(ノル−MDP)、およびN−アセチルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミル−L−アラニン−2−(1’−2’−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ヒドロキシホスホリルオキシ)−エチルアミンMTP−PE)が挙げられる。
本発明におけるアジュバントとして使用するのに適したイミダゾキノロン化合物の例としては、イミキモド(TM)およびその相同物(例えば、レシキモド3M(TM))が挙げられ、参考文献137および138にさらに記載されている。
また、本発明は、該組成物を患者に投与することを含む、患者の処置方法を提供する。患者は、疾患のリスクがある患者自体であってもよく、妊娠女性(先天性免疫処置)であってもよい。患者は好ましくはヒトである。ヒトは、任意の年齢、例えば、<2歳、2〜11歳、11〜55歳、>55歳などであり得る。
本発明の方法はまた、連鎖球菌コンジュゲートを1種類以上の以下の他の抗原:
− Haemophilus influenzae B由来糖抗原(例えば、参考文献145の第14章)
− Neisseria meningitidisの血清群B精製由来タンパク質抗原
− Neisseria meningitidisの血清群B由来の外膜調製物
− A型肝炎ウイルス由来抗原、例えば、不活化ウイルス(例えば、46、147)
− B型肝炎ウイルス由来抗原、例えば、表面および/またはコア抗原(例えば、147、148)
− ジフテリア抗原、例えば、ジフテリアトキソイド(例えば、参考文献145の第13章)
− 破傷風抗原、例えば、破傷風トキソイド(例えば、参考文献145の第27章)
− Bordetella pertussis由来抗原、例えば、百日咳ホロトキシン(PT)およびB. pertussis由来線維状赤血球凝集素(FHA)(任意選択で、ペルタクチンおよび/または凝集原2や3との組み合わせも)(例えば、参考文献149および150;参考文献145の第21章)
− ポリオ抗原(1種類または複数種)(例えば、151、152)例えば、IPV(参考文献145の第24章)
− 麻疹、流行性耳下腺炎および/または風疹抗原(例えば、参考文献145の第19、20および26章)
−インフルエンザ抗原(1種類または複数種)(例えば、参考文献145の第17章)、例えば、血球凝集素および/またはノイラミニダーゼ表面タンパク質
− Moraxella catarrhalis由来抗原(例えば、153)
− Streptococcus agalactiae(B群連鎖球菌属)由来タンパク質抗原(例えば、154、155)
− Streptococcus pyogenes(A群連鎖球菌属)由来抗原(例えば、155、156、157)
− Staphylococcus aureus由来抗原(例えば、158)
と混合する工程を含むものであり得る。
本明細書における方法を例示するため、GBS疾患を有する患者から単離したStreptococcus agalactiae 090、H36b、M781、およびCBJ111(これらから、4つの代表的な血清型(Ia、Ib、III、およびV)が得られる)を試験した。
A)播種材料調製プロセスの開発
3種類のGBS血清型の培養試験を、1000mLの播種材料培養物:8g/LのNa2HPO4二水和物(Merck)、2g/LのNa2HPO4一水和物(Merck)、17g/Lの自己分解型酵母抽出物(Difco laboratories)、1mg/Lのビオチン(Merck)および33g/LのD−グルコース一水和物(Merck)を入れた5000mL容のバッフルなしの振盪フラスコにおいて行なった。化合物はすべて逆浸透水(ROW)に溶解させ、0.22μm孔径膜フィルター(Nalgene)に通す濾過によって滅菌し、次いで、オートクレーブ内で122℃で30分間滅菌した5000mL容三角フラスコに無菌的に添加した。
槽を満たし、培養培地を滅菌する前、発酵槽の計器(pH電極およびpO2メーター)を、標準的な方法を用いて較正した。
GBSによるcpの発現は、細菌病原体の莢膜内の他のものの場合と同様、構成的ではなく、インビトロでの培養中および種々の感染部位から単離された初代培養物において種々である(参考文献173)。かかる観察結果にもかかわらず、GBSにおけるこの表面発現炭水化物抗原の調節についてはほとんどわかっていない。連続式培養における菌体増殖速度は、既に、莢膜多糖の生産を調節する主要因子であることが報告され、III型莢膜多糖の増殖速度依存性生産は、増殖制限栄養素とは独立して起こった。実際、cpの生産は、菌体を高速(1.4時間−1)の質量倍加時間で保持した方が、低速(11時間−1)培養よりも多かった(参考文献174)。
増殖速度が一貫して低下するようなったとき(これは、pH制御グルコース相の開始から3時間後に起こった)、培養物を回収した。培養物を、直ちに、周囲温度で45分間7741×gにて遠心分離した(AvantiTM遠心分離機J−20 XPI Beckmam coulter)。上清みを除去し、グルコースアッセイ用に−20℃で保存し、回収重量を測定した。
培養物を回収した後、槽および付属機器を除染した。まず、発酵槽にROWを満たし、4M水酸化ナトリウムを手作業で添加することによりpHを12に上げた。水を80℃まで30分間加熱し、熱の均一な分散が確保される0.2バールの圧力および200rpmでの攪拌を維持することにより消毒を行なった。消毒が終了したら、水酸化ナトリウムを含む水を回収し、pH値が5〜7の範囲に低下するまで発酵槽をROWで洗浄した。一般的に、所望のpHに達するまで3回の洗浄が必要であった。発酵槽を空にし、プローブおよび付属機器をそのポートから外し、播種および追加栄養素や腐食性薬剤の移送のためのセプタムコネクター、ならびに試料の取り出しおよび保存のためのビンを、オートクレーブ内で30分間122℃にて別々に滅菌した。再度、発酵槽にROWを満たし、121℃で30分間滅菌した。
A)菌株および培養培地
Streptococcus agalactiaeIII型菌株M781(最初に、GBS髄膜炎を有する新生児から単離された)を、Carol J. Baker氏によりご提供頂いた。M781菌株細胞は、改変型の化学的に規定される培地(最初は、A群連鎖球菌のために開発(参考文献174))中で培養した。バッチ式培養試験に使用した化学的に規定される培地の組成を表1に示す。
菌株M781による莢膜多糖の発現に関する予備実験を、バッチ式培養において行なった。
供給は、下記の式:
生物体の増殖因子要求量を、個々の栄養素を規定培地から除外すること、および得られた培地によって増殖が補助され得るかどうかを調べることによって求めた。この試験は、100mLの化学的に規定される培地(表1参照)を入れた500mL容のバッフルなしの振盪フラスコ内で行なった。
A)増殖の測定
試料を採取したらすぐに、波長590nmにおける培養物のOD読み取ることによってバイオマスの含有量をモニターした(Novaspec II分光測光器−Pharmacia bioteck)。0.10〜0.50の間隔内の吸光度の値を読み取るため、試料の希釈を行なった。
グラム染色により、2つの主要な細胞壁の型が識別される。少量のペプチドグリカンおよび特徴的にはリポ多糖を含有する細胞壁を有する細菌種はグラム陰性であり、一方、比較的大量のペプチドグリカンを含有し、リポ多糖を含まない細胞壁を有する細菌はグラム陽性である。この方法を、研究室規模とパイロット規模の両方で使用し、種培養物および発酵槽培養物は純粋であるという確証を得た。
培養上清み中において、1cmの光路長および340nm(NADPH)における溶液の吸光度を測定し、これを、純粋なグルコースのアッセイによって作成した標準曲線と比較することにより、グルコース消費量を比色分析によって調べた。
N−アセチル−D−ノイラミン酸(シアル酸)は、真核細胞の炭水化物構造体(糖タンパク質および糖脂質)の一成分として高頻度に見られる酸性の糖である。原核生物細胞でも、シアル酸は、いくつかの病原性細菌属のcpの一構成成分として見い出された[10]。実際、GBSの血清型特異的cpは、以下の糖:N−アセチル−ノイラミン酸あるいはシアル酸、グルコース、ガラクトースおよびN−アセチルグルコサミンの反復単位を含む。シアル酸は多糖の不可欠な成分であるため、その定量的測定を使用し、Svennerholmによる化学的方法の設定(参考文献176)に従って血清型特異的cp生産をモニターした。
A)播種材料調製プロセスの開発
GBSの血清型特異的cpを生産するための発酵プロセスにおいて、500mLの培地を入れた2000mL容振盪フラスコを播種材料培養物の調製に使用した。しかしながら、このようなフラスコは、パイロット規模および生産規模には適していなかった。したがって、4種類のGBS菌株(090、H36b、M781、およびCJB111)の挙動を、パイロット規模に適した播種材料調製プロセスを開発するための新たなフラスコにおいて試験した。次いで、この手順を使用し、cGMPに従う第I相治験前のロットを作製した。
i)複合培養培地にビタミン溶液を添加する必要性の確認
GBSは栄養要求性生物であるため、その増殖に必要とされる特定の有機化合物(アミノ酸やビタミンなど)を合成する能力をもたない。このため、WO07/052168に記載のような、動物起源の成分を含まない低コスト複合培地が開発された。この複合培養培地を加熱によって滅菌し、ビオチンと、0.5g/Lのチアミン、リボフラビン、ニコチン酸およびピリドキシンを含む0.1M水酸化ナトリウムとメタノールのビタミン溶液とを添加した。
菌体増殖速度は、以前に、cp生産を調節する主要因子であることが報告され、III型cpの増殖速度依存性生産は増殖制限化合物とは独立して起こった(参考文献173)。しかしながら、炭素源の枯渇は、色素形成および莢膜多糖生産量低下の原因であることがわかった。栄養環境およびcp生産に有利な増殖速度を維持するため、WO07/052168に記載のような複雑なフィードバッチ式発酵プロセスが開発された。この複雑なフィードバッチ式プロセスは、細菌の倍加時間を低減させる対数増殖手法と、グルコースを使用し、最後の3時間でcp生産性が増大するpH−stat手法の両方を組み合わせたものである。このプロセスは、バッチ式手法の利点と連続式手法の利点を併せ持つものであった。実際、フィードバッチ式発酵では、指数増殖期の長期化による高い菌体密度および発酵中の基質付加条件に対する制御が達成される。しかしながら、複雑なフィードバッチ式手法の使用には、アルゴリズムにより発酵を管理するソフトウェアの使用が必要とされ、このソフトウェアの使用には、GMP基準に準拠するためのアルゴリズムの妥当性確認が必要とされる。したがって、該アルゴリズムの使用を回避するため、発酵プロセスを単純化した。
GBSのcpを生産するための以前に開発された発酵プロセスを検証し、最適化した。増殖およびcp生産量をH36b菌株でモニターし、それにより各パラメータを個々に変更し、対照培養と比較した。DOT試験、温度およびpHを報告した。
Streptococcus agalactiaeは、酸素が存在する場合、有気呼吸によってATPを合成する通性嫌気性生物である;しかしながら、嫌気性増殖に切り替えることもできる。
また、増殖およびcp生産量を、36℃の標準温度に対して温度を2℃上昇または低下させることによって温度を変更することによりモニターした。
また、元のpH7.3を7.0〜7.5に変更することにより、pH値を最適化するための実験も行なった。pHを7.0に維持した場合、最終ODは、23.5から28.8に増大し、平均生産性は1.52g/L.hであった。しかしながら、cp濃度は540mg/Lから412mg/Lに低下した。
また、2つの圧力:0.2バールと0.5バールでの発酵プロセスを比較することにより、圧力を最適化するための実験を行なった。圧力を0.5に維持した場合、最終ODは23.5に維持され、平均生産性は1.5g/L.hであった。しかしながら、cp濃度は、540mg/Lから272mg/Lに減少した。
先の実施例で用いた複合培養培地は、組成が完全に既知のものでない有機系供給源(例えば、酵母抽出物)を含むものであったため、発酵プロセスの性能における変動を観察した。生産性を維持しつつ変動を少なくするためのアプローチの一例は、複合培地を、主に無機化合物からなる化学的に規定される培地に置き換えることである。この置き換えにより、発酵プロセスを制御し、また多糖の精製を単純化することが可能になる。
フィードバッチ式プロセスの開発では、典型的には、まず、微生物を解析して最良の非生物(abiotic)条件、種々の増殖相、消費成分および生産成分、バイオマスと生産物形成との関係、増殖に対する制限基質、ならびに比増殖速度と制限基質濃度との関係を確認しなければならない。しかしながら、GBSに関する挙動情報は、既に、複合培養培地を開発するために行なわれた試験からわかっていた。複合培養培地でのGBS増殖に対して先の実施例で開発されたpHおよび温度の至適条件を、上記の表1に示す化学的に規定される培地に拡張した。
菌株M781による増殖に関する予備実験を、500mL容三角フラスコを用いてバッチ式培養にて行なった。菌体は対数期に8時間維持され、倍加時間は45分であった(μmax=0.91時間−1)。この最初の増殖相後、比増殖速度は低下し始め、菌体は2時間減速相であった。最終光学密度は1.5前後であり、対数期は、光学密度が0.7前後になったとき終了した。
次に、GBS増殖を2L容発酵槽においてモニターした。この条件下では、培養培地のpHを、2M水酸化ナトリウムの自動添加によって一定のpH7.3に維持した。
ほぼ既知の酵母抽出物培地の組成に基づき、複合培地プロセスで使用した栄養源の濃度とバッチ規定培地の組成との比較を行ない、GBSが15前後の最終ODに達するのに必要とされる種々の化合物間のおよその比率を調べ、増殖に対する制限化合物を特定した。複合培地を伴いプロセスでは、17g/Lの酵母抽出物をバッチ用培地に含め、供給時は19g/Lを添加した。したがって、Streptococcus agalactiaeは36g/Lが利用可能であった。
フィードバッチ式発酵は、典型的には、バッチ様式として開始し、一定のバイオマス濃度または基質消費後、発酵槽に制限基質溶液を供給する。そのため、栄養素培地は、単純な組成を有するものでなければならない。この研究の目的は、制限化合物が特定され、かつ増殖速度に影響しないバッチ用培地を開発することであった。
フィードバッチ用規定培地を開発するため、制限化合物を1種類ずつ添加し、増殖に対するその効果を評価した。
フィードバッチ式発酵のためのストラテジーは、増殖制限基質を、GBSが基質を消費する速度と同じ速度で供給することであった。
生物には、自己栄養体であれ従属栄養体であれ、増殖のために、該生物が利用可能な栄養素から合成することができない少量の一定の必須有機化合物が必要とされ得る。
アミノ酸を1種類ずつ培地から除くことにより、L−アラニン、L−アスパラギン酸、L−グルタミンおよびL−プロリンは不可欠であることがわかった(図20および表4参照)。これらのアミノ酸は、対照培養では、常に80%より大きい濁度値をもたらした。しかしながら、任意の他のアミノ酸の非存在下では、培養培地中で増殖は起こらなかった。
ビタミンを個々に培養培地から除くことにより、パントテン酸カルシウムとナイアシンアミドは不可欠であることがわかった(表5および図21)。ビオチン、葉酸、ピリドキシン、リボフラビンおよびチアミンを除いた実験では、濁度値は65%よりも大きかった。パントテン酸塩とナイアシンアミドのみを添加すると、対照と同じ最終ODが観察された。
この実施例により、先の実施例の教示が、連鎖球菌属細菌の血清型特異的莢膜多糖の製造規模生産に適用されることが確認される。
i)培養培地
播種材料の培養を、温度(オートクレーブプログラム番号1分/最大40分間、121℃、表6)によって滅菌し、ILの複合培地(17g/Lの酵母抽出物Difco、8g/LのNa2HPO4・2H2O、2g/LのNaH2PO4・H2O、および33g/Lの一水和型グルコース、Nalgeneフィルター商品使い捨てシステムを用いた0.2μm濾過によって滅菌、3M NaOH を用いてpHを7.3±0.1に調整)、10mLのビタミン溶液(チアミン、リボフラビン、ピリドキシンHCl、およびナイアシンアミド、各々0.05g/L、0.1M NaOH中で希釈、0.2μm濾過によって滅菌)ならびに5mLのビオチン溶液(ビオチン0.2g/L、0.2μm濾過によって滅菌)を入れた(播種の直前に添加)4つの5L容振盪フラスコにおいて行なった。
各フラスコに、−70℃の冷凍庫から即時的に解凍した2.75±0.25mLの作業種菌株を播種した。培養物は、インキュベータ(IN−L0641)内で4±1時間、200±10rpmで攪拌しながら35±1℃で維持した。この期間後、バイオマス濃度を、590nmにおけるODを測定すること、およびグラム染色を行なうことにより評価した。OD590nm値が1.2〜0.6に達したとき、およびグラム染色が一致したとき(グラム陽性球菌のみ)、4つのフラスコの内容物を、300L容のB. Braun Biotech/Chemap発酵槽(ID VS−L0530)のインキュベーションラインと連結された5L容の熱滅菌(オートクレーブプログラム番号1分/最大)ビン内にプールした。
播種材料の調製の重要な可変量を、表7および表8に示す。
使用後、フラスコおよび5L容ビンを加熱滅菌し(オートクレーブプログラム番号8、汚れサイクル、表6の仕様参照)、クリーニングした。
i)培地の調製および設備機器
空の300L容発酵槽の機械的配管およびガスフィルターを滅菌した(プログラムSEAL2およびEXFC2)。次いで、プローブを確認し、較正する。pHプローブは、pH値7および10を有する2種類のバッファー溶液を用いて較正した。酸素プローブ(prove)の正確な適用は、0%点で窒素および100%点で空気の気流を伴ってプローブを水中に入れることにより確認した。その較正は、発酵槽内部で行なった。
播種前に、ビオチン溶液(IL、0.2g/Lのビオチン、0.2μm濾過によって滅菌)を添加した。次いで、播種材料の4つのフラスコの内容物を入れた5L容ビンを用いて300L容発酵槽への播種を行なった。
− 培養温度は36±1℃に制御した。
− 発酵槽内部の過圧は0.2バールに設定した。
− pHは7.3±0.1に設定し、4M NaOHを用いて調整した。pH値は発酵により自然に低下したため、酸性溶液を用いたpH補正はしなかった。
− 初期攪拌は50rpmに設定し、初期空気流は20L/分に設定した。
− 発酵槽内の起泡剤レベルを可視的にモニターし、必要であれば、消泡剤PPG 2500を用いて調整した。
− 溶存酸素圧(DOT)は
攪拌(50〜350rpmの範囲の値)
・ 空気流(20〜100L/分の範囲の値)
・ 酸素流(0〜100L/分の範囲の値)
によって段階的に調節して30%に設定した
バッチ相の発酵中、播種の2時間後に試料を採取し、OD590nmを測定した。試料は、OD590nmが3に達するまで15分ごとに採取した。この目標ODの時点で、最初の対数増殖期フィードバッチ式添加を、3.6Lの酵母抽出物溶液(150g/L)を用いて開始し、該集団を300分の倍加時間に維持した。
発酵プロセスの重要な可変量を、表9および表10に示す。
バイオマスを300L容発酵槽から取り出したら、200LのROWを発酵槽内に添加することにより消毒を開始した。次いで、3M NaOHを発酵槽内に、pHが11に達するまで添加した。温度を80℃に30分間維持した。周囲温度まで冷却後、発酵槽の内容物を、下側の床面に置いた廃棄物槽内に廃棄した。
i)設備機器の準備
生理食塩水(約100L、9g/LのNaCl、0.2μm濾過によって滅菌)を入れた槽を、300L容発酵槽をAlfa−Laval遠心分離機(ID CT−L0526)に連結する移送ラインに接続した。遠心分離中、この水をバイオマスペレットの洗浄に使用した。次いで、移送ラインを、バイオマスのセパレータおよび回収槽と同様に加熱滅菌した。発酵が終了した後すぐに遠心分離を開始するため、
発酵の前と後に設備機器の準備を行なった。
連続流遠心分離プロセスは、以下のサイクルで構成した:
− 100L/時の流速での7分間のバイオマス遠心分離(手動調整)。バイオマスを発酵槽から移送ラインを経由して、発酵槽内の過圧力0.6バールでセパレータに移した。
− 100L/時の流速で生理学的用水を用いた3分間の洗浄(手動調整)。
− ペレットの廃棄
このサイクルは、通常、全バイオマスが処理されるまで繰り返した。上清みは収集さず代わりに廃棄物槽に供給した。プロセス中、ペレットを槽(VS−L0536)内に収集し、次いで、0.3バールの過圧力によって、シリコーン製コネクターを経由して100L容化学的処理用廃棄用滅菌バッグに移した。
発酵プロセスの重要な可変量を表11に示す。
遠心分離および廃棄用バッグへのペレットの移送後、移送ライン、セパレータおよびバイオマスの回収槽を加熱滅菌し、クリーニングした。移送ラインおよびセパレータは、発酵槽内で周囲温度にて、100Lの1M NaOHを用いてクリーニングし、次いで、100L/時の流速で移送ラインを経由してセパレータに移した。回収槽は、槽の上側がクリーニングされるようにスプレーボールによって、槽内に20Lの1M NaOHを30分間循環させることによりクリーニングした。このクリーニング工程後、pH値が5〜7の範囲に低下するまで槽をROWで洗浄した。
i)菌体ペレットの不活化
菌体ペレットの化学的処理により、菌体が不活化され、菌体からのcpの放出が可能となった。この処理は、理論濃度0.8M NaOHが得られるようにペレットに4M NaOH溶液を添加すること(蠕動ポンプによりチューブを経由して)を伴った。添加する4M NaOHの重量は、1Lの重量は1kgであるため、バイオマスの重量を4で除算することにより得た。この工程は、一体型攪拌器システムを有し、Levtech Sartorius System(ID AG−10645、サーモスタットによる平衡および攪拌器)内に廃棄される100L容の廃棄用バッグ内で行なった。温度は、ペレットが37℃に維持されるように調節し、次いで、180rpmで指定された時間攪拌した。12時間で充分、該微生物は不活化された。菌体莢膜からのcpの放出には36時間が適当であった。他の実験では、1時間で充分、該微生物が不活化されることがわかり、菌体莢膜からのcpの放出には24時間が適当であった。したがって、この工程は、合計36時間または24時間が適当である。
発酵プロセスの重要な可変量を表12に示す。
蠕動ポンプとともにシリコーン製チューブを使用し、0.1Mである終濃度が得られるように1MのTRISバッファー溶液を添加する。添加するTRISの重量は、不活化するバイオマスの重量を9で除算することにより計算される。この添加の重要性は、中和中のペレットのpH変動を回避することであった。したがって、pHを、廃棄用バッグ内に廃棄されるpHプローブを用いて制御した。最終pH値7.5〜8.5が得られるように6M HClを添加した。
CaCl2と30%エタノールで化学的に処理したバイオマスに対し、上清み中に放出された多糖を回収するため、および菌体残渣ならびにタンパク質および核酸の沈殿物を除去するために精密濾過を行なった。
精密濾過および透析は、Sartorius Sartocon II plus holder(廃棄用収納部を有する)、および4つのHydrosartカセット(0.22μm、0.6m2、これは総表面積2.4m2を提示する)を用いて行なった。このシステムを、90Nmのトルクレンチを用いて固定した。
− 供給口圧力:2.0±0.2バール
− 透過物の弁を5分間閉鎖し、次いで、広く開放
蒸留水を使用し、pHが5〜7に達するまでシステムを洗浄(was)し、この時点で、システムを20Lの生理食塩水(0.9g/LのNaCl、0.2μm濾過を用いて滅菌)により、以下の条件でpH5〜7が得られるように洗浄した。
− 供給口圧力:Pin=2.0±0.2バール
− 透過物圧力:Pperm=0バール(弁開放)
− 保持液の弁閉鎖
精密濾過の前に、カセットを透析バッファー溶液(34.77g/LのNaCl、4.49g/LのTRIS、10.93g/LのCaCl2、6M HClを用いて7.8±0.1にpH調整、WFI qsp 74.4%の最終容量、最終容量まで96%エタノール、0.2μm濾過によって滅菌)により調整した。
処理済みバイオマスの入った廃棄用バッグのチューブの排出口を、精密濾過ハウジングの供給口に接続した。このハウジングの保持液排出口を、処理用バイオマスを再循環させるために処理済みバイオマスを内包する廃棄用バッグに接続した。透過物排出口を、200L容使い捨て滅菌バッグに接続し、透過物を収集した。
− 供給口圧力:Pin=2.0±0.2バール
− 透過物圧力:Pperm=0.6±0.1バール
バイオマスを10倍に濃縮し、保持液を3倍容量のバッファーに対して透析した。精密濾過システム内の循環正確に測定するためには、保持液の重量は、10kg未満でなければならない。そのため、保持液を、バイオマスの重量が10±0.5kgになるまで濃縮した。次いで、透析を連続工程にて行なった。使用するバッファー溶液の重量は、理論濃度係数10で除算し、所望の透析サイクル数を乗算したCaCl2−エタノール混合物の重量から計算した。
200L容廃棄用バッグ内への回収前に、精密濾過システムの排出口の2000cm2 Sartobran P 0.22μmフィルターを用いた濾過によって透過物を滅菌した。最終生成物を周囲温度で保持した後、精製部に放出させた。
精密濾過および透析の重要な可変量を表13に示す。
精密濾過後、供給口を、100Lの生理食塩水の入った槽に接続し、使い捨てカセットおよびハウジングを洗浄した。次いで、20Lの1M NaOHを用いてシステムを消毒し、透過物および保持液を、以下の条件を維持したまま、30分間再循環させるために供給口に接続した。
− 供給口圧力:Pin=2.0±0.2バール
− 透過物の弁を5分間閉鎖し、次いで、広く開放
次いで、システムおよび配管を空にし、透過物および保持液のpH値が5〜7の範囲になるまで蒸留水で洗浄した。この目標pHで、システムを分解した。
3種類のGBS菌株、M781(血清型III)、H36b(血清型Ib)および090(血清型Ia)に対応するパイロット規模での実験の発酵プロフィール解析し、H36b菌株を用いて同一のプロセスで30L容発酵槽(B. Braun Biotech Biostat)にて研究室規模で行なった対照発酵と比較した。
3回の予備試験操作および対照発酵中、増殖速度(μ)および集団倍加時間(td)を評価した。値は図22ならびに表14に報告した。
発酵の終了時、cpのシアル酸化合物の濃度の測定に基づいた比色分析法を用いてcpの濃度を評価した。この結果に基づき、培養中に生産されたcp量を、cp濃度に発酵槽内部の最終容量(参照発酵では20L、パイロット規模の発酵槽では215L)を乗算することにより算出した。また、後述する発酵関連解析法に示したようにして、容積生産性および比生産性も計算した。値は表15に報告した。
発酵プロセスは、規模拡大における潜在的な変動を回避するため、および発酵槽内の夾雑のリスクを低減するための2つの様式で単純化した。
この一連の予備試験操作の発酵プロフィールを解析し、最初の一連のものと比較し、
単純化プロセスがパイロット規模においてなんら影響はないことを確認した。
この一連の操作の増殖速度および集団倍加時間(表16)もまた、最初の一連の予備試験操作と非常に類似しており、有意な変動は観察されなかった。
この2つの一連のパイロット規模試験操作の間、許容基準および関連する試料採取計画により、重要な処理工程の重要なプロセス内対照が規定された。最初のプロセス内対照は播種前のフラスコのOD590nmであり、これは、研究室規模で観察されたような発酵槽内での培養開始時の潜在的なラグ相を回避するために好ましくは0.6〜1.8である。以下のプロセス内対照は培養物純度と関連していた。フラスコ培地のグラム染色ならびにプールしたビンおよび発酵槽の培地のプレート上への延展を行ない、この環境に夾雑物はないことを確認した。別のグラム染色および培養の終了時、発酵槽内部の培地のプレート上への延展を行ない、プロセス中に夾雑がないことを確認した。ペレットの不活化は、不活化の36時間後、0.8M NaOH中のペレットをプレート上に延展することにより確認した。表18に示したその他のプロセス内対照を使用し、cp精製収率を計算した。種々のパラメータ(PO2、空気流、O2流速、攪拌、pH、温度)のプロフィールを開発し、これは、発酵プロセスの再現性の良好な指標であった。
この試験操作のOD590nmプロフィールは、互いに、ならびにこの実施例の先の試験操作で観察された一般的なプロフィールと非常に類似していた(図24参照)。
第1のプロセス内対照は播種前のフラスコのOD590nmであり、菌株090の0.80と菌株M781の1.50の間の範囲であった。発酵槽での培養開始時のラグ相は観察されなかった。フラスコ培養物の純度解析は、グラム染色(グラム陽性球菌のみが示される)ならびに培養の終了時、プールしたビンおよび発酵槽の培地(同様にグラム陽性球菌のみが示される)によって確認した。0.8M NaOH中のペレットの不活化を、不活化の36時間後にプレート上に延展した。
バイオマスの測定。発酵中、バイオマスの含有量は、波長590nmにおける培養物の光学密度の測定によってモニターされる。試料の希釈物は、0.300〜0.600の範囲内で吸光度の値が読み取れるように調製されなければならない。回収物の湿潤重量は、16000×gで25分間の遠心分離後に測定される。
・10OD.mLの量を遠心分離(16000×g、5分、4℃) [標準化]
・ペレットを1mLのPBSで洗浄および遠心分離機(16000×g、5分、4℃) [洗浄]
・ペレットに500mcLのNaOH(2N、65℃、1時間)を添加 [加水分解]
・1時間後、500mcLのHCl(2N、4℃)で中和 [中和]
・菌体残屑を遠心分離(16000×g、30分、4℃)によって除去 [精製]
・上清みを濾過(0.22ミクロン)によって滅菌 [滅菌]
・100mLを900mLのH2Oで希釈 [希釈]
標準曲線の作成。菌株COH1−13(莢膜なし)の培養物を試料と同様にして調製する。希釈工程は、既知量のシアル酸ストック溶液を添加して1、5、10、15、20〜30mg/mLの終濃度を得ることを特徴とする(100mLの上清み+xmLのシアル酸SS+900〜xmLのH2O)。
・血清型の補正因子を適用 [比CP含有量(mg/LOD)]
・培養物のODを乗算[容量容積CP含有量(mcg/mLまたはmg/L)]
・回収容量を乗算[総生産CP(mg)]
実施例6−精製
この実施例では、莢膜多糖に関して以前に可能であった純度レベルよりもずっと高い純度レベルがもたらされる例示的な精製プロトコルを示す。
天然GBS V型多糖を、以下のプロセス工程を用いて細菌から抽出し、精製した。
解析方法
湿式化学的アッセイ:糖含有量を、シアル酸湿式化学的アッセイ(Svennerholm,L. Biochem. Biophys. Acta 1957,24、604)によって調べた。試料をHCl中、80℃で90分間加水分解し、NaOHで中和し、DIONEX(TM)システム内にインジェクトした。データは、CHROMELEON(TM)ソフトウェアによって処理される。PA1ガードを有するCarboPac PA1カラム(流速1.0ml/分)にて、90:10〜60:40 0.1M NaOH、0.1M酢酸Na:0.1M NaOH、0.5M NaNO3の数分間の線形勾配を用いて糖を溶出した。
この手順により、該型の多糖を連鎖球菌から精製するための新規で単純な、高速で有効な方法が提供される。該プロセスは、DNアーゼ、RNアーゼおよびプロテアーゼ処理の使用を伴わないことが好都合である。生産物は高収率で回収されるが、主な潜在的な夾雑物(タンパク質、核酸およびB群多糖)はすべて1%w/w未満に低減される。この新しい精製方法は、このような莢膜多糖から誘導される臨床用物質および市販用物質の製造に使用され得る。
この実施例は、莢膜多糖に関して以前に可能であった純度レベルよりもずっと高い純度レベルがもたらされるさらなる例示的な精製プロトコルを示す。
天然GBS V型多糖を、以下のプロセス工程を用いて細菌から抽出し、精製した。
Claims (15)
- 付着性フィルターを用いた濾過工程を含む、Streptococcus agalactiaeから莢膜多糖を精製するための方法であって、該方法は、該莢膜多糖を沈殿させるためのカチオン系デタージェント処理工程、その後の該莢膜多糖の再可溶化工程を含まない、方法。
- 前記付着性フィルターがタンパク質付着性フィルターである、請求項1に記載の方法。
- 前記付着性フィルターがカーボンフィルターである、請求項1または2に記載の方法。
- 前記カーボンフィルターは、マトリックス内に固定化された活性炭を含む、請求項3に記載の方法。
- 付着性フィルターを用いた前記濾過工程の前に、以下の工程:
(i)夾雑タンパク質および/または核酸のアルコール沈殿;ならびに
(ii)ダイアフィルトレーション
を行なう、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。 - 前記ダイアフィルトレーションが、タンジェンシャルフローダイアフィルトレーションである、請求項5に記載の方法。
- 2サイクルのタンジェンシャルフローダイアフィルトレーションが行われ、最初のダイアフィルトレーションサイクルと2回目のダイアフィルトレーションサイクルとの間に、該最初のダイアフィルトレーションサイクルの保持液が、酢酸/酢酸ナトリウム溶液で処理される、請求項6に記載の方法。
- 付着性フィルターを用いた前記濾過工程の後に、以下の工程:
(iv)再−N−アセチル化;および
(v)ダイアフィルトレーション
を行なう、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。 - 前記ダイアフィルトレーションが、タンジェンシャルフローダイアフィルトレーションである、請求項8に記載の方法。
- 2サイクルのタンジェンシャルフローダイアフィルトレーションが行われ、最初のダイアフィルトレーションサイクルと2回目のダイアフィルトレーションサイクルとの間に、該
最初のダイアフィルトレーションサイクルの保持液が、酢酸/酢酸ナトリウム溶液で処理される、請求項9に記載の方法。 - 前記Streptococcus agalactiaeは、血清型1a、1b、3、4または5から選択される、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 付着性フィルターを用いた前記濾過の後に、0.45/0.2μmフィルターを用いたさらなる濾過が行なわれる、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記Streptococcus agalactiaeから精製された莢膜多糖が、担体タンパク質にコンジュゲートされる、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記担体タンパク質は、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、またはジフテリア毒素のCRM197変異型である、請求項13に記載の方法。
- 前記コンジュゲートされたものは、薬学的に許容され得る担体と組み合わせられる、請求項13または14に記載の方法。
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