JP2009521213A - トランス−１０，シス−１２オクタデカジエン酸を製造する方法 - Google Patents

トランス−１０，シス−１２オクタデカジエン酸を製造する方法 Download PDF

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Abstract

この出願は、トランス-10,シス-12共役リノール酸をトランスジェニック微生物中で産生させる方法に関し、その方法は：(a) 該微生物中にトランス-10,シス-12共役リノール酸イソメラーゼをコードする少なくとも1種の核酸分子を導入し、(b) (a)で得られたトランスジェニック微生物を培養し、(c) 該培養液にリノール酸を添加することによってトランス-10,シス-12共役リノール酸の産生を誘導し、(d) 誘導培養液を少なくとも12時間インキュベートし、(e) 培養培地および/もしくはトランスジェニック微生物から共役リノール酸を単離する、ステップを含んでいる。

Description

本発明はトランス-10,シス-12オクタデカジエン酸を、トランス-10,シス-12共役リノール酸イソメラーゼをコードする核酸分子を発現するトランスジェニック微生物を用いて製造するための方法に関する。本発明はさらに、共役リノール酸を豊富に含む飼料又は食品、特に栄養補助食品（nutraceutical）を製造する方法に関する。
本発明はまた、共役リノール酸を豊富に含む飼料、食品、および栄養補助食品に関し、また、トランス-10,シス-12共役リノール酸イソメラーゼをコードする外来遺伝子を発現するトランスジェニック微生物及び食品又は飼料におけるプロバイオティックスとしてのその使用に関する。本発明のさらに別の1実施形態は、本発明の方法で製造される発酵油、および医薬品の製造のための該発酵油の使用に関する。
脂肪酸とトリグリセリドは食品業界、動物栄養、化粧品、および医薬品分野において様々な用途がある。それらが遊離の飽和もしくは不飽和脂肪酸であるか、または飽和もしくは不飽和脂肪酸の含量の多いトリグリセリドであるかに応じて、それらは非常に広範な用途に適しており、従って、例えば、ポリ不飽和脂肪酸は栄養価を高めるために粉ミルク(baby formula)に添加される。種々の脂肪酸及びトリグリセリドは、主としてモルティエラ(Mortierella)などの微生物から、または油を産生する植物、例えば、ダイズ、ナタネ、ヒマワリ、およびその他のものなどから得られるが、通常はそれらのトリアシルグリセリドの形で得られる。あるいはまた、これらのものは、魚類などの動物から都合よく得られる。遊離脂肪酸は加水分解によって都合よく調製される。
不飽和または飽和脂肪酸を含んでいる油が好ましいか否かは、意図している目的による。すなわち、例えば、ヒトの栄養としては不飽和脂肪酸、特にポリ不飽和脂肪酸を含んだ脂質が血中のコレステロール量に好影響を与えて心臓疾患の可能性に好影響するため、好ましい。これらは様々な栄養食品や医薬品に用いられている。
特に価値が高く、需要の多い不飽和脂肪酸はいわゆる共役不飽和脂肪酸、例えば共役リノール酸などである。共役リノール酸について一連の良い作用が見出されている。すなわち、共役リノール酸の投与によってヒトや動物の体脂肪が低減し、動物の場合には体重への飼料の変換が増加する(特許文献1〜4)。また、共役リノール酸の投与によって、例えば、アレルギー(特許文献5)や癌(非特許文献1、非特許文献2)などに好ましい作用を及ぼすこともできる。
共役リノール酸(CLA)は、2箇所の共役二重結合を有するリノール酸(LA)の位置異性体および幾何異性体のファミリーを含んでいる。大多数の生物活性はシス-9,トランス-11CLA(c9,t11 CLA)異性体およびトランス-10,シス-12CLA異性体(t10, c12 CLA)について報告されたもので、生物活性としては、抗癌性、抗アテローム性動脈硬化性、抗糖尿病誘発性、抗肥満性、免疫増強反応、および骨形成への正の作用が挙げられる(Belury, 2002; Parizaら, 1999; Parizaら, 2000)。最近の多くの研究では特にt10,c12CLA異性体がヒトおよび動物で体脂肪量を減らし、脂肪のない身体組織を増加させることによって身体の組成を変える能力があることが示されている。げっ歯類に餌としてt10,c12CLA異性体を与えた研究では、体脂肪が減少し、身体の水分量が上昇し、身体のタンパク質量が上昇し、体の灰分が上昇した(Parkら, 1999；de Deckereら, 1999)。マウスの組織培養では、t10,c12CLA異性体はリポタンパク質リパーゼ活性を低下させ、細胞内トリグリセリド濃度を減少させた(Parkら, 1999)。他のマウスの研究では、この異性体が肝臓のステアロイル-CoAデサチュラーゼのmRNAの発現を減らし(Leeら, 1998)、マウスの脂肪細胞中のステアロイル-CoAデサチュラーゼ活性（脂肪の合成を抑制できる）の発現を低下させる(Choiら, 2000)ことが示されている。さらに、Ostrowskiら(1999)は、共役リノール酸(異性体の混合物で、約30%のt10,c12CLAを含む)を成長過程にあるブタに摂取させると、脂肪の少ない組織が増加し、脂肪の蓄積が減少することを示し、Brownら(2003)はt10,c12CLA異性体がヒトの前脂肪細胞および成熟した脂肪細胞においてトリグリセリドの蓄積とPPAR-γ発現を特異的にダウンレギュレートすることを明らかにした。53名の健康な男性と女性の1群にヒトCLAを補充すると(4.2 g/日；c9,t11およびt10,c12CLAは等量)、体脂肪の比率を、オリーブ油を摂取させた対照群と比較して3.8%減少させた(SmedmenとVessby, 2001)。同じような結果はBlanksonら(2000)も観察しており、彼らは、>3.4g CLA/日の投与量(c9,t11およびt10,c12CLAは等量)で12週間治療後に体重超過および肥満のヒトにおける体脂肪量を対照群と比較して有意に低下させたことを報告している。同様に、Thomら(2001)は12週間の試験でそれに匹敵する結果を得ている。t10,c12CLAはまた、乳牛の乳脂肪合成の低下に関連する異性体である。t10,c12CLA異性体を4日間、第4胃内に投与すると乳脂肪％を42%低減し、乳脂肪収量を44%低下したが、c9,t11CLAでは乳脂肪に影響を及ぼさなかった(Baumgardら, 2000)。t10,c12CLA異性体が乳脂肪の合成を阻害する作用機作は不明であるが、de novo脂肪酸合成に関与する主要な酵素（例えばアセチル-CoAカルボキシラーゼや脂肪酸合成酵素など）の活性または合成の阻害が関わっていると考えられる(Baumgardら, 2000)。従って、CLAが健康増進に重要な役割を果たし、特にt10,c12CLA異性体が体重超過と肥満の動物及びヒト被験者の治療に有用であろうということを示唆する証拠がある。この異性体を富化し、機能性食品に組み入れることによって毎日摂取することができるようにすれば、それらの状態の予防と治療に大きな可能性を有するものとなろう。
t10,c12およびc9,t11CLA異性体の双方とも抗癌作用を示すことが報告されている。特に、皮膚腫瘍の発生および噴門洞の腫瘍形成を阻害すること、および化学的に誘発させた皮膚腫瘍の増殖ならびに乳房および大腸の腫瘍発生を阻害することが示されている(Belury, 2002)。CLAが多くの生理学的作用を示す機序については依然として十分に判明はしていないが、少なくとも2つの異なるモデルが提案されている。一方のモデルは、CLAはアラキドン酸プールを低下させてその下流のエイコサノイド産物の産生の低減（炎症や癌に関与しているサイトカインの産生をモジュレートする）をもたらすことを示唆している。もう一方のモデルは、脂質の酸化、脂肪細胞の分化、エネルギーバランス、およびアテローム形成を制御することが知られている遺伝子の発現を調節することを含む(Beluri, 2002; Parizaら, 2000)。
CLAは、リノール酸もしくはリノレン酸を含有している植物油、またはリノール酸およびリノレン酸のアルカリ異性化で、合成によって製造することができる。2つの反応は、アルカリ条件下180℃で油を加熱して触媒され、トリグリセリド脂質の骨格からの脂肪酸エステル結合の加水分解を行うと、遊離の脂肪酸が産生され、共役していない不飽和脂肪酸が2つ以上の適切な二重結合で共役する(特許文献6)。この方法では約20〜35%のシス-9,トランス-11CLAと、ほぼ同じ量のトランス-10,シス-12CLAが産生されるが、これらの異性体を他の異性体に比べて富化することは、分別結晶法を用いることにより可能である。さらに、産生される他の異性体は主としてトランス,トランス異性体である。
共役脂肪酸、例えば共役リノール酸の化学的調製法は、特許文献7および特許文献8にも述べられている。
CLAは天然にはルーメンバクテリアによるリノール酸の生物水素化の際に中間産物として形成され、したがって、CLAの天然のソースは反芻動物のミルクおよび脂肪である。乳脂肪中のCLA異性体の主なものはc9,t11CLAで、これは乳脂肪中のCLA全体の80〜90%を占めるのに対し、t10,c12CLA異性体は約1%存在するにすぎない(Jensen 2002)。ルーメンミクロフローラの他にリノール酸をc9,t11CLA異性体に変換する能力を有する培養物の範囲は既知である。ビフィドバクテリアのいくつかの株はCLA、主としてシス-9,トランス-11異性体を産生しうることが示されている(Coakleyら, 2003；Rosberg-Codyら, 2004)。CLA異性体、主としてc9,t11CLA異性体の生合成を行うことが報告されているその他生物種としては、乳製品のスターターカルチャー(starter culture)として用いられるプロピオニバクテリア(Jiangら, 1998)、ラットの腸内フローラの株(Chinら, 1994)、およびいくつかのラクトバシラス（Lactobacillus）種の株(Linら, 1999)が挙げられる。ビフィドバクテリアの多数の株が基質としての遊離のリノール酸からCLAを生合成しうることがNordgren(1999)によって見出されている。特許文献9では、食品グレードの細菌、とりわけ乳製品のスターターカルチャーの中に見出される細菌株（発酵法によってin vitroでCLAを産生する能力を有する）の使用を報告している。
しかし、バイオテクノロジーの技法でCLAを産生するために用いることのできる細菌株は少数にすぎず、それらの株は大規模で手間のかかるスクリーニングを行うことによってのみ同定しうる。このことは、入手しうる細菌株の大多数は、(i)遊離のリノール酸からCLAを産生させることができない、および/または(ii)これらの株の増殖速度は培地中の遊離のリノール酸によって劇的に阻害される、という事実によるものである。特許文献10は、試験した22種類の細菌株のうち、遊離リノール酸からCLAを産生することができたのは4株にすぎず、供試株のうちの19株では増殖速度は、培地中の遊離のリノール酸によって50%超阻害されたことを開示する。不運なことに、遊離のリノール酸からCLAを産生することができることが見出された4種の細菌株は培地中のリノール酸に感受性であった。さらに、確認された細菌株によって産生されるCLAの70〜90%はc9,t11/t9,c11-18:2異性体で示されるものであることが見出され、トランス-10,シス-12オクタデカジエン酸は全く検出されなかった。t10,c12CLAを産生することのできるものとして知られている種は、プロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)(Verhulstら, 1987)、およびルーメンバクテリアのメガスフェラ・エルスデニ（Megasphera elsdenii）Y J-4(Kimら, 2000)のみである。
これらの結果は、CLA、特にトランス-10,シス-12オクタデカジエン酸の、経済的に見て魅力的なレベルでのバイオテクノロジーによる産生のための細菌株又は方法の同定についてのニーズが依然として存在することを示している。
特許文献11では、ラクトバシラス・レウテリ（Lactobacillus reuteri）から得られるリノール酸イソメラーゼについて述べている。この酵素活性はリノール酸を6種類のCLA種に変換するが、それらは次のとおりである：(シス,トランス)-9,11-CLA、(トランス,シス)-10,12-CLA、(シス,シス)-9,11-CLA、(シス,シス)-10,12-CLA、(トランス,トランス)-9,11-CLA、および(トランス,トランス)-10,12-CLA。
上述のイソメラーゼを用いることの不都合な点は、反応の収量が非常に低いこと、産生されるCLAの純度が工業規模の方法用としては十分に高くはないこと、およびその方法が低い空時収量でのみ行われることである。これは経済的に魅力的でない方法である。
従って、上述の不都合な点を持たないようなCLAの産生用の単一で経済的なバイオテクノロジーを用いた方法は依然として大いに求められている。
WO 94/16690 WO 96/06605 WO 97/46230 WO 97/46118 WO 97/32008 WO 99/32604 米国特許第3,356,699号 米国特許第4,164,505号 WO 99/29886 WO 00/29886 WO 99/32604 Banniら, Carcinogenesis, Vol.20, 1999:1019-1024 Thompsonら, Cancer Res., Vol.57, 1997:5067-5072
したがって、本発明の目的は、共役リノール酸、特にトランス-10,シス-12オクタデカジエン酸の微生物中での産生に効率的な方法を提供することである。本発明のさらに別の目的は、共役リノール酸の発酵法による効率的な産生に用いることのできる微生物を同定することである。
本発明者らは上述の目的が、CLAイソメラーゼ、特にトランス-10,シス-12共役リノール酸イソメラーゼをコードする核酸分子を発現するラクトバシラス科（Lactobacillaceae）、ストレプトコッカス科（Streptococcaceae）、プロピオニバクテリア科（Propionibacteriaceae）、エンテロバクテリア科（Enterobacteriaceae）、およびビフィドバクテリア科（Bifidobacteriaceae）に属するトランスジェニック微生物によって達成されることを見出した。
上述の生物体が、（トランス-10,シス-12）共役リノール酸イソメラーゼをコードする核酸分子を発現する際に、共役リノール酸、特にトランス-10,シス-12オクタデカジエン酸をリノール酸から産生することができることは予測していない結果であったが、それは、上述の微生物の多くではその野生型の細胞の増殖が培地中の遊離のリノール酸で阻害されるからである。したがって、当業者であれば、これらの生物体を共役リノール酸の産生用の発酵プロセスで用いることができると直感的に予測しなかったであろう。さらにいっそう驚くべきことであったのは、トランス-10,シス-12共役リノール酸イソメラーゼの発現は、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）中で発現させた際、トランスジェニック生物が添加したリノール酸の50％をトランス-10,シス-12共役リノール酸へと変換することを可能にし、この菌に続いてE.コリ（E.coli）とラクトバシラス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）によっても、それぞれ40%および30%の変換率であったことである。
本発明の要旨
したがって、本発明の第1の主題は、トランス-10,シス-12共役リノール酸をトランスジェニック微生物中で産生させる方法に関し、該方法は：
(a) 該微生物中にトランス-10,シス-12共役リノール酸イソメラーゼをコードする少なくとも1種の核酸分子を導入し、
(b) (a)で得られたトランスジェニック微生物を培養し、
(c) 該培養液にリノール酸を添加することによってトランス-10,シス-12共役リノール酸の産生を誘導し、
(d) その誘導した培養液を少なくとも12時間インキュベートし、そして
(e) 培養培地および/もしくは微生物から共役リノール酸を単離する、
ステップを含んでいる。
好ましい1実施形態においては、前記トランス-10,シス-12共役リノール酸イソメラーゼは次の1配列によって特徴付けられる：
i. 配列番号1に記載の配列、または
ii. 配列番号1に記載の配列の少なくとも50個の連続した塩基対を有する配列、または
iii. 配列番号1に記載の配列の少なくとも100個の連続した核酸塩基対の配列と少なくとも80%の同一性を有する配列、または
iv. 配列番号1に記載の核酸分子の少なくとも50個の連続した塩基対の核酸断片と高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする配列、または
v. 配列番号2に示されたアミノ酸配列と少なくとも75%の同一性を有するポリペプチドをコードし、かつトランス-10,シス-12共役リノール酸イソメラーゼをコードする配列。
特に好ましい1実施形態においては、前記トランス-10,シス-12共役リノール酸イソメラーゼはルーメンバクテリアから、好ましくはメガスフェラ・エルスデニ（Megashera elsdenii）Y J-4から単離されたものである。
さらに、本発明は、前記トランス-10,シス-12共役リノール酸イソメラーゼをコードする核酸分子を、プロピオニバクテリウム（Propionibacterium）属に属する微生物、好ましくはプロピオニバクテリウム・アクネス（Propionibacterium acnes）から単離されたものである、上記方法に関する。
好ましい実施形態では、上述のステップ(a)から(e)に従ってトランスジェニック微生物内で共役リノール酸を産生させる方法であって、(a)で用いられる微生物が、ラクトバシラス科（Lactobacillaceae）、ストレプトコッカス科（Streptcoccaceae）、プロピオニバクテリア科（Propionibacteriaceae）、エンテロバクテリア科（Enterobacteriaceae）、およびビフィドバクテリア科（Bifidobacteriaceae）からなる群から選択された科に属し、好ましくは用いられる微生物がラクトコッカス属（Lactococcus）、ラクトバシラス属（Lactobacillus）、プロピオニバクテリウム属（Propionibacterium）、エシェリキア属（Escherichia）、およびビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）からなる群から選択された属に属し、より好ましくは該微生物がラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）、ラクトバシラス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）、およびエシェリキア・コリ（Escherichia coli）からなる群から選択されたものであることを特徴とする、前記方法に関する。
本発明の好ましい1実施形態においては、上述のステップ(a)から(e)に従ってトランスジェニック微生物中で共役リノール酸を産生させるための方法は、光学密度(OD600)が少なくとも0.1である微生物培養液にリノール酸を添加することを特徴とする。
特に好ましい1実施形態においては、本発明は上述のステップ(a)から(e)に従ってトランスジェニック微生物中で共役リノール酸を産生させるための方法であって、リノール酸の生物変換率が10%よりも高いことを特徴とする、前記方法に関する。
さらに、本発明は共役リノール酸を豊富に含む飼料もしくは食品、または栄養補助食品の製造方法であって、用いられる共役リノール酸が上述の方法に従って産生されたものである、前記製造方法に関する。
本発明はさらに、共役リノール酸を豊富に含む飼料、食品、および栄養補助食品であって、共役リノール酸が上述の方法に従って製造されたものである、前記飼料、食品、および機能性食品に関する。
さらに、本発明はトランス-10,シス-12共役リノール酸イソメラーゼをコードする核酸分子を発現するトランスジェニック微生物であって、その核酸分子が次の1配列：(i)配列番号1に記載の配列、または(ii)配列番号1に記載の配列の少なくとも50個の連続した塩基対を有する配列、または(iii)配列番号1に記載の配列の少なくとも100個の連続した核酸塩基対の配列と少なくとも80%の同一性を有する配列、または(iv)配列番号1に記載の核酸分子の少なくとも50個の連続した塩基対の核酸断片と高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする配列、または(v)配列番号2に示されたアミノ酸配列と少なくとも75%の同一性を有するポリペプチドをコードする配列、によって特徴付けられ、該核酸配列が好ましくはルーメンバクテリアから、より好ましくはメガスフェラ・エルスデニ（Megashera elsdenii）から、さらにより好ましくはメガスフェラ・エルスデニ（Megashera elsdenii）Y J-4から、またはプロピオニバクテリウム属（Propionibacterium）に属する微生物から、好ましくはプロピオニバクテリウム・アクネス（Propionibacterium acnes）から単離されたものであり、該核酸分子が少なくとも1つの異種のプロモーター配列と機能しうる形で連結されたものである、前記トランスジェニック微生物に関する。
さらに好ましい1実施形態においては、本発明は本発明のトランスジェニック微生物、好ましくはラクトコッカス属（Lactococcus）、ラクトバシラス属（Lactobacillus）、プロピオニバクテリウム属（Propionibacterium）、エシェリキア属（Escherichia）、およびビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）からなる群から選択された属に属する微生物、より好ましくはビフィドバクテリウム・ブレベ（Bifidobacterium breve）、ビフィドバクテリウム・デンティウム（Bifidobacterium dentium）、およびビフィドバクテリウム・シュードカテヌラツム（Bifidobacterium pseudocatenulatum）からなる群から選択された微生物の、食品および飼料中のプロバイオティクスとしての使用に関する。
さらに、本発明は上述の本発明の方法に従ってトランスジェニック微生物中に産生される発酵油(fermented oil)に関する。
本発明はさらに、上述の本発明の方法に従って製造された発酵油の、癌の治療のための医薬品の製造のための使用に関する。
一般的な定義
本発明が記載される特定の方法論、プロトコール、細胞株、細菌の種や属、構築物、および試薬自体に限定されるものではないことは理解されるべきである。本明細書中および付属の特許請求の範囲に用いられている単数形の「a」および「the」は、文脈中で明確にそうでないことを断っていない限りはそれらの複数のものをも含むことに留意しなければならない。従って、例えば、「ベクター(a vector)」とは1つ以上のベクターであり、当業者には既知の、それと等価のものを含んでいる。
本明細書で用いている「約」という用語は、およそ、ざっと、近傍、またはある値のあたりであることを意味している。「約」という用語がある数値の範囲と共に用いられる場合には、そこに示した数値の境界をその上下に拡大することによってその範囲を修飾する。一般的には、本明細書では「約」という用語は、数値を、記載した値の上と下に20%の偏差、好ましくは10%の上下(その値より高いまたはより低い)に修飾するために用いられる。本明細書で用いている「または」とは、ある特定のリストのいずれか1つのメンバーを意味する。
本明細書で用いている「動物」という用語は分類学的に動物界に属するものとされた生物を意味する。好ましい動物としては四肢動物（陸上の脊椎動物）および魚類の目の脊椎動物である。特に好ましいのは、鳥網（鳥類）および哺乳網（哺乳類）であり、現生人類(ホモサピエンス)は特に好ましい哺乳類として含まれる。非常に好ましい動物としては、イノシシ（イノシシ科）、ウシ（ウシ科）、キジおよび類縁の鳥（キジ科）、アヒル、ガチョウ、およびハクチョウ（ガンカモ科）、ウマ（ウマ科）、コイ科（コイ科）、およびマス科（サケ科）の動物である。これらのファミリーで最も好ましいのは、家庭動物(domestic animals)および牧場動物(farm animals)と呼ばれている動物である。本発明では家庭動物とは、独立生活をしているものではなく、ヒトに飼い慣らされ、主として住居内でヒトに飼われている動物を意味する。特に好ましい家庭動物としてはネコとイヌが挙げられる。本発明で牧場動物とはヒトによって、経済的な目的のために飼われている動物を意味する。特に好ましい牧場動物としては家畜種のウシ（Bos taurus）、家畜のニワトリ（Gallus gallus domesticus）、家畜のブタ、家畜のヒツジ（Ovis ammon aries）、および家畜種のハイイロガン（Anser anser）が挙げられる。
本明細書で、共役リノール酸、好ましくはトランス-10,シス-12共役リノール酸の産生に関連して用いている「生物変換率」という用語は、特定の発酵期間後、または発酵プロセスの最後の時点で共役リノール酸に変換された遊離のリノール酸の量（%）を意味する。例えば、トランス-10,シス-12共役リノール酸イソメラーゼを発現するトランスジェニックのL.ラクティス(lactis)細胞の培養液に0.5 mg/mLのリノール酸を添加し、インキュベーションを72時間続けた後、ブロスから採取したサンプルから脂肪酸の抽出を行う。そのサンプル中のCLA/LAの比は、GLC(ガス液体クロマトグラフィー)を用いて求められる。サンプル中のCLA/LAの比率が1:1である場合には、生物変換率は50%である。
「細胞」とは単一の細胞を意味する。「細胞(cells)」とは細胞の集団を意味する。その集団は1種類の細胞のタイプを含む純粋な集団とすることができる。同様に、前記集団は2種類以上の細胞タイプを含んだものとすることができる。本発明では、ある１つの細胞集団に含まれ得る細胞タイプの数に制限を設けていない。これらの細胞は同調培養させることも同調させないことも可能で、同調させることが好ましい。
コーディング領域またはコーディング配列(CDS)とは、遺伝子に関連して用いられる場合には、あるmRNA分子の翻訳の結果としてできる発生期のポリペプチドで見出されるアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を意味する。真核生物では、コーディング領域の境界は5'側ではイニシエーターとなるメチオニンをコードするヌクレオチドトリプレット「ATG」、3'側では終始コドンを指定する3種のトリプレット(すなわち、TAA、TAG、TGA)のうちの1つとなっている。
「共役リノール酸」(CLA)とは、リノール酸の位置異性体および幾何異性体の混合物であって、そのような異性体には7位と9位、9位と11位、10位と12位、または11位と13位に二重結合がある。シス-9,トランス11異性体およびトランス-10,シス-12異性体は特に興味深い異性体であるが、それはこれらの異性体に多くの有益な作用があるからである。これらの異性体は位置的に異なることができ(主として7位と9位、9位と11位、または10位と12位)(Haら,"Anticarcinogens from fried ground beef:heat-altered derivatives of linoleic acid", Carcinogenesis, 1987 Dec;8(12):1881-7)、また幾何的に異なることができる(シス-シス、シス-トランス、トランス-シス、トランス-トランス)。CLAの個々の異性体のうちでシス-9,トランス-11オクタデカジエン酸は最も生物学的に活性なものと考えられているが、それは、細胞膜のリン脂質、肝臓のリン脂質およびトリグリセリド中に組み込まれている主要な異性体だからである(Kramerら,"Distribution of conjugated linoleic acid(CLA) isomers in tissue lipid classes of pigs fed a commercial CLA mixtuire determined by gas chromatography and silver ion-high-performance liquid chromatography", Lipids, 1998 Jun;33(6):549-58)。この異性体はCLA異性体の混合物を餌として与えられた動物の細胞膜のリン脂質画分中に取り込まれる唯一の異性体である(Haら,"Inhibition of benzo(a)pyrene-induced neoplasia by conjugated dienoic derivatives of linoleic acid", Cancer Res. 50:1097-1101(1990)；Ipら,"Mammary cancer prevention by conjugated dienoic derivatives of linoeic acid", Cancer Res. 51:6118-6124(1991))。この異性体はまた、CLAの主要な食物形態であり、ミルク、乳製品、および食肉を含む反芻動物由来の脂肪から得られる(Chinら,"Dietary sources of conjugated dienoic isomeres of linoleic acid, a newly recognized class of anticarcinogens", J. Food Comp. and Anal. 5:185-197(1992)。トランス-10,シス-12オクタデカジエン酸およびトランス-10,シス-12CLAという用語は本明細書では相互に交換可能な形で用いている。
共役リノール酸イソメラーゼ(CLA)は、リノール酸または共役リノール酸異性体の異性体化を触媒するタンパク質であり、ある1つの炭素原子の位置の二重結合を別の1つの炭素原子の位置へと移し、可能なCLA異性体のうちの1種を形成することを特徴としている。
本発明の文脈で用いられているトランス-10,シス-12共役リノール酸イソメラーゼとは、リノール酸のトランス-10,シス-12オクタデカジエン酸への異性体化を触媒する酵素を意味する。このトランス-10,シス-12オクタデカジエン酸イソメラーゼおよびトランス-10,シス-12CLAイソメラーゼという用語は本明細書中で相互に交換可能な形で用いている。
本発明の方法に関して用いている「培養」とは、制御された条件下での液体培養における微生物の増殖を意味する。プロセス中に用いる生物体の如何によって増殖条件は非常に異なるものとなる可能性があり、一般的にはそのような条件は当業者には既知である。原則としては、微生物は、液体培地中で増殖し、その培地は、炭素源（通常は糖の形態）、窒素源（通常は酵母抽出物などの有機窒素源または硫酸アンモニウムなどの塩の形態）、リン酸水素カリウムなどのリン酸源、鉄塩、マンガン塩、マグネシウム塩などの微量元素、および、必要に応じてビタミンを含有しており、温度は0℃から100℃、好ましくは10℃から65℃、15℃から55℃、より好ましくは20℃から50℃、25℃から45℃の間、特に好ましいのは30℃から40℃であり、酸素を通気させつつ用いる。微生物は好気的条件または嫌気的条件下で増殖させることができる。液体培地のpHはある固定した値を維持させること、すなわち、培養を行っている間にpHを調節することができる。pHの範囲は、pH2からpH9、好ましくは4から8.5、4.5から8、より好ましくは5から7.5、5.5から7とすべきである。しかし、微生物はまた、pHの調節を行わずに培養することもできる。培養は、バッチ式、半バッチ式で行うことができ、または栄養素を培養の開始時点で連続的に供給することができ、または半連続的、もしくは連続的に栄養を添加することができる。そのような方法については例えばScardovi V (1986)Bifidobacterium and Genus Lactobacillus、"Bergey's Mannual of Systematic Bacteriology" [編者：N.M.PHA Sneath、M.E.Sharpe、J.G.Holt], Baltimore, Williams & Wilkins中に見出すことができる。
「発現」とは、遺伝子産物の生合成を意味する。例えば、構造遺伝子の場合には、発現には、構造遺伝子のmRNAへの転写および、任意に、その後のmRNAの1種以上のポリペプチドへの翻訳が含まれる。
本明細書で用いている「発酵油」という用語は、発酵の間に微生物によって産生される画分を含有している油および脂肪酸を意味している。発酵とは、増殖培地で微生物の大規模増殖を意味すべく用いられる。この用語を本発明の文脈で用いる場合には好気性と嫌気性の代謝の区別はしない。「発酵油」という用語は微生物、特にその微生物の細胞膜または発酵ブロスから回収/単離することのできる(例えば実施例8を参照)脂肪酸画分を意味する。
機能的に等価なもの：本発明では、核酸配列が配列番号1の天然のまたは人工的な突然変異体であることは理解されなければならない。突然変異は、前記配列の発現産物のリノール酸イソメラーゼ活性を減弱させない、1種以上の核酸の挿入、欠失、または置換であることができる。これらの機能的に等価なものは、配列番号1に記載の配列と、少なくとも80%、好ましくは85%、より好ましくは90%、最も好ましくは95%超、非常に特別に好ましくは98%の同一性を有するが、100%未満であるような同一性を有しており（該同一性は配列番号1に示した配列の少なくとも100個の連続した塩基対、好ましくは少なくとも150個の連続した塩基対、より好ましくは少なくとも200個の連続した塩基対にわたって決定される）、かつ配列番号2に示す配列と本質的に同じ酵素活性を有している。
機能的に等価なものとしては、とりわけ前記配列のホモログがある。ホモログという用語は共役リノール酸イソメラーゼに関連して用いる場合には、配列番号1に示した核酸配列のオルソログおよびパラログを意味する。これらのオルソログまたはパラログは、配列番号2とアミノ酸レベルで60%超、好ましくは65%、70%、75%、80%、より好ましくは85%、90%、95%、または最も好ましくは95%超の配列の同一性を共有しているタンパク質をコードしており（該同一性は配列番号2に記載される配列の少なくとも100個の連続したアミノ酸、好ましくは少なくとも150個の連続したアミノ酸、より好ましくは少なくとも200個の連続したアミノ酸にわたって決定される）、かつ配列番号2に示した配列と本質的に同じ酵素活性を有している。
上述の機能的に等価なものは、プロピオニバクテリウム・アクネス（Propionibacterium acnes）から得られるトランス-10,シス-12共役リノール酸イソメラーゼ(配列番号1)と比較して、酵素活性または生物変換率が低下しているかまたは増大している可能性がある。そのような場合、その機能的に等価なものの酵素活性または生物変換率は、プロピオニバクテリウム・アクネス（Propionibacterium acnes）から得たトランス-10,シス-12共役リノール酸イソメラーゼ(配列番号1)で得られた参照値と条件を代えずに比較したとき、その参照値よりも少なくとも50%高い、好ましくは少なくとも100%高い、特に好ましくは少なくとも300%高い、非常に特別に好ましくは少なくとも500%高い。
「機能的にまたは機能しうる形で連結された」とは、例えば、調節エレメント(例えばプロモーター)と、発現される核酸配列、および、妥当であればさらに別の調節エレメント(例えばターミネーターなど)との、それらの各調節エレメントが該核酸配列の発現を可能にする、修飾する、容易にする、またはその他の点で影響を及ぼすように意図した機能を果たすような連続配置を意味しているものと理解すべきである。発現は、前記核酸配列の配置の如何によるが、センスRNAまたはアンチセンスRNAとの関連で生じる。この目的を達成するために、化学的な意味で直接的な連結は必ずしも必要ではない。遺伝子制御配列（例えばエンハンサー配列など）も、遠く離れた位置、または全く別の他のDNA分子から標的配列に対してその機能を発揮させることができる。本明細書中で共役リノール酸イソメラーゼに関連して用いている機能的に連結された、「機能しうる形で連結された」、「機能しうる形での組み合わせ」、および「機能しうる順番で」という用語は、イソメラーゼのうちの少なくとも1種の核酸配列への、該DNA分子を保有している宿主細胞中でイソメラーゼが産生または合成されうるような、連結を意味する。プロピオニバクテリウム・アクネス（Propionibacterium acnes）から得られたトランス-10,シス-12共役リノール酸イソメラーゼ(配列番号1)がプロモーターと機能しうる形で連結されている発現構築物は、実施例に示している。機能しうる形での連結、および発現カセットは、通常の組換えおよびクローニング技法で作製することができるが、それらについては、例えば、Maniatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook, J., (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY)、Silhavy, T.J., Berman, M.L., Enquist, L.W. (1984) Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY)、Ausubel, F.M.ら(1987)Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience、およびGelvinら, (1990)Plant Molecular Biology Manual中に記載されている。しかし、例えば特定の制限酵素切断部位を有するリンカーとして、またはシグナルペプチドとして作用する別の配列も、2つの配列の間に配置させることができる。配列の挿入も融合タンパク質の発現をもたらしうる。好ましくは、プロモーターと発現されるべき核酸配列の連結からなる発現構築物は、ベクターに組み込まれた形で存在することができ、また細菌のゲノム中に、例えば形質転換によって挿入することができる。
「遺伝子」とは、前記ポリペプチドの発現を何らかの様式で調節することのできる適切な調節配列に機能しうる形で連結されたコーディング領域を意味する。遺伝子としては、コーディング領域(オープンリーディングフレーム：ORF)の前(上流)および後(下流)の、DNAの翻訳されない調節領域(例えば、プロモーター、エンハンサー、リプレッサー、その他)、ならびに適切な場合には、個々のコーディング領域(すなわちエクソン)の間にある介在配列(すなわちイントロン)をも含む。遺伝子はまた、RNA転写産物上に存在する、該配列の5'末端および3'末端の双方に位置している配列をも含むことができる。これらの配列は「隣接」配列または領域と呼ばれる(これらの隣接配列はmRNA転写産物上に存在する非翻訳配列の5'または3'に位置する)。5'隣接領域はプロモーラーやエンハンサーなどの調節配列を含むことができ、それらが遺伝子の転写を制御するかまたは転写に影響を及ぼす。3'隣接領域は、転写の終了、転写後の切断、およびポリアデニル化を指令する配列を含むことができる。
本明細書で用いている生物のゲノムおよびゲノムDNAとは、DNA（または一部のウイルスについてはRNA）中にコード化されている、ある生物の全遺伝情報である。これには遺伝子と非コーディング配列の双方が含まれる。「染色体DNA」または「染色体DNA配列」という用語は、細胞サイクルの状態とは無関係な、細胞のゲノムDNAと理解されるべきである。従って、染色体DNAは様々な形態の構造をとることができ、凝集された、またはコイルを形成しない形態でありうる。染色体DNAへの挿入は、当業者には既知の種々の方法で証明かつ分析することができ、例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)分析、サザンブロット分析、蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)、およびin situ PCRなどが挙げられる。
ある核酸配列に関して「異種」とは、自然界では連結しない、または自然界では異なる位置で連結する核酸配列に連結するヌクレオチド配列を意味する。
本明細書で用いている「ハイブリダイズする」とは、「核酸配列の鎖を塩基対形成を介して相補鎖に接合する任意のプロセス」(Cooms 1994, Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, New York, NY)が含まれる。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの強さ(すなわち、核酸間の会合の強さ)は、核酸間の相補性の程度、用いた条件のストリンジェンシー、形成されたハイブリッドのTm、および核酸内のG:C比などの要因によって影響を受ける。本明細書で用いている「Tm」という用語は「融解温度」という意味で用いられている。融解温度は、二本鎖の核酸分子の集団が半分解離して一本鎖となる温度である。核酸のTmを計算する式は当該分野でよく知られている。標準的な参照文献に示されているように、Tm値の簡単な推定は、次の式で計算することができる：Tm=81.5+0.41(% G+C)、これは核酸が1M NaClの水溶液中にある場合である[例えば、AndersonとYoung, Quantitative Filter Hybridization, Nucleic Acid Hybridization(1985)を参照]。他の参照文献ではより精巧な計算法が取り上げられており、それらは構造的および配列の特徴をTmの計算の際に考慮に入れている。当業者であれば、低いストリンジェンシー条件または高いストリンジェンシー条件のいずれかとするために多数のハイブリダイゼーションの条件を用いることができることは十分に承知している；例えばプローブの長さや性質(DNA、RNA、塩基組成)、標的の性質(DNA、RNA、塩基組成、溶液中に存在するか固定化されているかなど)、および塩類やその他の成分の濃度(例えば、ホルムアミド、硫酸デキストラン、ポリエチレングリコールの有無など)などの要因を考慮し、ハイブリダイゼーション溶液を変えて、低い、または高いハイブリダイゼーションのストリンジェンシー条件を作り出すことができる。当業者であれば、より高いストリンジェンシーは、本発明のイントロンのヌクレオチド配列と他の核酸配列との間の非特異的結合を低減または排除するために好ましいが、より低いストリンジェンシーは、本発明のヌクレオチド配列に対して様々な相同性を有するより多数の
核酸配列を検出するには好ましいということを承知している。そのような条件については、例えば、Sambrook(Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY(1989))またはCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1989) 6.3.1-6.3.6に記載されている。好ましいハイブリダイゼーション条件は本発明の詳細な説明の項に開示している。
「同一性」は、核酸に関連して用いる場合には、相補性の程度を意味する。2つの核酸の間の同一性とは、いずれの場合も配列の全長にわたる核酸配列の同一性を意味するものと理解され、それはプログラムアルゴリズムGAP(Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetic Computer Group(GCG), Madison, USA)を用いて比較することによって計算され、そのパラメーターは次のとおり設定される：
Gap Weight: 12, Length Weight: 4
Average Match: 2.912, Average Mismatch: -2.003
例えば、配列番号1の配列と核酸レベルで少なくとも95%の同一性を有する配列は、配列番号1の配列と上述のプログラムアルゴリズムにより上述のパラメーターの設定で比較したとき、少なくとも95%の同一性を有することを意味していると理解される。部分的同一性(すなわち、100%未満の部分的な同一性)や完全な同一性(すなわち100%の完全な同一性)がありうる。
「誘導する」とは、本発明の方法に関連して用いる場合には、細胞培養物の(i)リノール酸、または(ii)発現誘導剤（これは共役リノール酸イソメラーゼの発現を駆動するために用いたプロモーターが誘導性プロモーターである場合）による接種を指す。
「導入する」とは、細胞に関して用いる場合には、組換えDNA発現構築物を細菌細胞中に導入することを意味する。「導入する」という用語は例えば、トランスフェクション、形質導入、または形質転換などの方法を包含する。
「単離する」という用語は、本発明の方法に従って産生された共役リノール酸に関連して用いられる場合には、(i)発酵油、または(ii)脂肪酸/脂質画分、または(iii)共役リノール酸を抽出する方法、あるいは(iv)トランス-10,シス-12共役リノール酸を、発酵ブロス、細菌のペレット/細菌の細胞膜、または発酵ブロスの遠心後の上清から抽出する方法を意味する(実施例を参照)。単離はバッチ式操作またはフェドバッチ式操作で行うことができる。バッチ式の操作では、その操作で用いられる全成分が操作の開始時に該プロセス用の容器中に加えられ、発酵プロセスの間には物質の追加や取り出しは行われない。フェドバッチ式操作では、発酵プロセスの間に物質の追加や回収を行うことができる。
本明細書で用いている「微生物」という用語は、Woeseによって定義されている酵母種および細菌を意味し(Woeseら,"Towards a natural system of organisms;proposal for the domains Archaea, Bacteria, and Eucarya", Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1990) 87:4576-4579)、好ましくは、ラクトバシラス科（Lactobacillaceae）、ストレプトコッカス科（Streptococcaceae）、プロピオニバクテリア科（Propionibacteriaceae）、エンテロバクテリア科（Enterobacteriaceae）、およびビフィドバクテリア科（Bifidobacteriaceae）からなる群から選択された科に属する微生物を指し、より好ましくは使用される微生物はラクトコッカス属（Lactococcus）、ラクトバシラス属（Lactobacillus）、プロピオニバクテリウム属（Propionibacterium）、エシェリキア属（Escherichia）、およびビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）からなる群から選択された属し、特に好ましくは該微生物はラクトバシラス・ラクティス（Lactococcus lactis）、ラクトバシラス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）、およびエシェリキア・コリ（Escherichia colito）からなる群から選択され、ラクトバシラス種、ビフィドバクテリウム種、ラクトコッカス種、および酵母を含んでいる。
「核酸」とは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはそれらのポリマーもしくはハイブリッドで、一本鎖または二本鎖形態、センスまたはアンチセンスの形態のものを意味する。特に断らない限りは、特定の核酸配列は暗に、その保存的に改変された変異体(例えば、縮重コドンの置換)および相補的配列、ならびに明確にそのように示したものをも包含する。「核酸」という用語は、「遺伝子」、「cDNA」、「DNA」、「mRNA」、「オリゴヌクレオチド」、および「ポリヌクレオチド」を記載するために用いることができる。
本明細書で用いている「核酸配列」とは、あるDNA断片(オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ゲノムDNA、cDNA、その他)のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド（ヌクレオチド）の連続的配列を意味し、DNA配列決定技術によって、ヌクレオチドを表現する略号、文字、記号、または語のリストとして利用しうるものとなる。
本明細書で用いている「核酸分子」とは、ゲノムDNA、適切なベクターもしくはプラスミド中に存在する、物理的なDNA分子を意味する。核酸分子は核酸配列によって規定される。
「栄養補助食品」という用語は、栄養および医薬品の組み合わせであり、ヒトの健康に有益な作用があると考えられる食品を意味する。栄養補助食品は食品または食品の一部であって医学的または健康上の有益性（疾病の予防および治療が含まれる）を提供する任意の物質を言う。そのような製品は、単離された栄養素、栄養補助食品、および特定の規定食から、遺伝子工学で作られたデザイナー食品、ハーブ製品、およびシリアル、スープ、および飲料などの加工された食品に至る範囲のものでありうる。
細菌培養液の光学密度(または吸光度)とは、該培養液の濁度(光学的濃度)である。光学密度の測定には、細胞懸濁液を通過する600 nmの波長の光の量を分光光度計を用いて測定する。濁度は多かれ少なかれ細胞数または細胞の質量と直接的に関連している。光学密度は細胞濃度に直接的に比例している。高い光学密度は細菌濃度が高いことによって生ずる。分光光度計では、あるサンプルを通過する光が光電セルによって測定される。サンプルの細胞密度が増加するにつれて、すなわちより濁度が高くなるにつれて、より多い量の光が散乱され、光電セルに届かなくなる。これは光学密度（OD）または吸光度(A)ユニットに関して測定される。
OD(A)=log I0/I
[式中、I0はサンプルに入射する光であり、Iは透過光；サンプルを通過して光電セルに到達した光の量である。]
細胞の数または質量と光学密度の読み出しとを関連づける標準曲線を作成することができる、すなわち、種々の量の微生物を含有している一連のサンプルについて光学密度と細胞数(または両)の双方を測定する。通常はサンプルの光学密度は細胞密度と直接的に相関している。(Klett-Summerson カロリーメーター、1 A ユニット=500 Klettユニット)
Figure 2009521213
それ以外は条件を変えずにとは、例えば、比較しようとする発現構築物のうちの1つによって開始される発現が、追加の遺伝子制御配列、例えばエンハンサー配列と組み合わせることによって改変されず、同一の増殖条件下、同一の発生ステージで、同一の環境(例えば同一の植物種)で行われることを意味している。
プロバイオティックスとは、生存微生物、（ラクトバシラス種、ビフィドバクテリウム種、ラクトコッカス種、および酵母が含まれる）であって、摂取されると腸内フローラのバランスを改善することによって宿主に有益な影響を及ぼすことのできるものと定義される。
下記はプロバイオティックスとして用いられる種々の細菌と酵母について記載している。
ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）
ビフィドバクテリア（Bifidobacteria）はヒトおよび動物の大腸の常在菌である。新生児、特に母乳栄養の新生児では、生後数日以内にビフィドバクテリアがコロニーを形成する。ビフィドバクテリアが初めて単離されたのは母乳栄養児の糞便からであった。腸内のこれらの細菌の集団は、高齢となるまで比較的安定で、高齢になると減少するようである。ビフィドバクテリアの集団は多数の因子によって影響を受け、そのような因子としては、食事、抗生物質、およびストレスが含まれる。ビフィドバクテリアはグラム陽性の嫌気性菌である。ビフィドバクテリアは非運動性であり、非胞子形成性であり、カタラーゼ陰性である。ビフィドバクテリアは種々の形態をとり、それらには短い湾曲した桿菌形態、こん棒状の桿菌形態、二つに分岐したY字の桿菌形態が含まれる。これらの名称はしばしばY字形態または二分(bifid)形態で存在するという観察に由来している。これらのDNAのグアニンとシトシンの含量は54モル%から67モル%の間である。ビフィドバクテリアは、グルコン酸を分解する際を除いてはCO2を生成せずに酢酸と乳酸を産生する糖分解性生物である。ビフィドバクテリアはまた、乳酸菌(LAB)にも分類されている。現在までのところ、30種のビフィドバクテリアが単離されている。プロバイオティックスとして用いられるビフィドバクテリアは、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（Bifidobacterium adolescentis）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Bifidobacterium animalis）、ビフィドバクテリウム・サーモフィルム（Bifidobacterium thermophilum）、ビフィドバクテリウム・ブレベ（Bifidobacterium breve）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Bifidobacterium infantis）、およびビフィドバクテリウム・ラクティス（Bifidobacterium lactis）などである。プロバイオティックスとして用いられる具体的なビフィドバクテリア株としては、ビフィドバクテリウム・ブレベ（
Bifidobacterium breve）Yakult株、ビフィドバクテリウム・ブレベ（Bifidobacterium breve）RO7O、ビフィドバクテリウム・ラクティス（Bifidobacterium lactis）Bb12、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）RO23、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）RO71、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Bifidobacterium infantis）RO33、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）BB536、およびビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）SBT-2928が含まれる。
ラクトバシラス（Lactobacillus）
乳酸桿菌（Lactobacilli）はヒトの腸および膣の常在菌である。乳酸桿菌はグラム陽性の通性嫌気性菌である。乳酸桿菌は非胞子形成性であり、非有鞭毛桿菌または球桿菌である。乳酸桿菌のDNAのグアニンとシトシンの含量は32モル％から51モル％の間である。乳酸桿菌は耐気性か嫌気性のいずれかで、完全に発酵性である。ホモ発酵性の場合には、ブドウ糖が主に発酵されて乳酸となる。乳酸桿菌はまた乳酸菌(LAB)にも分類されている。現在までのところ、ラクトバシラス（Lactobacillus）属の56種が同定されている。プロバイオティックスとして用いられる乳酸桿菌としては、ラクトバシラス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバシラス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、ラクトバシラス・ブルガリカス（Lactobacillus bulgaricus）、ラクトバシラス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバシラス・セロビオスス（Lactobacillus cellobiosus）、ラクトバシラス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）、ラクトバシラス・カルバタス（Lactobacillus curvatus）、ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバシラス（Lactobacillus）GG(ラクトバシラス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）またはラクトバシラス・カゼイ（Lactobacillus casei）亜種ラムノサス（rhamnosus）)、ラクトバシラス・ガッセリ（Lactobacillus gasseri）、ラクトバシラス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）、ラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、およびラクトバシラス・サリバラス（Lactobacillus salivarus）が含まれる。ラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）299v株はサワードー（sour dough）を起源とする。ラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）自体はヒトを起原とする。ラクトバシラス（Lactobacillus）の他のプロバイオティックス株としては、ラクトバシラス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）BG2FO4、ラクトバシラス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）INT-9、ラクトバシラス・ｐランタラム（Lactobacillus plantarum）ST31、ラクトバシラス・レウテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバシラス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）LA1、ラクトバシラス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）NCFB 1748、ラクトバシラス・カゼイ・シロタ（Lactobacillus casei Shirota）、ラクトバシラス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）NCFM、ラクトバシラス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）DDS-1、ラクトバシラス・デルブルウエスキー（Lactobacillus delbrueckii）亜種デルブルウエスキー（delbrueckii）、ラクトバシラス・デルブルウエスキー（Lactobacillus delbrueckii）亜種ブルガリカス2038型、ラクトバシラス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）SBT-2062、ラクトバシラス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、ラクトバシラス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）UCC 118、およびラクトバシラス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）亜種パラカゼイ（paracasei）F19がある。
ラクトコッカス（Lactococcus）
乳酸球菌（Lactococci）はグラム陽性で通性嫌気性菌である。乳酸球菌は乳酸菌(LAB)にも分類されている。ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）(以前はストレプトコッカス・ラクティス（Streptococcus lactis）として知られていた)は乳製品中に見出され、ミルクの酸敗の原因として一般的である。プロバイオティックスとして用いられている、または開発中である乳酸球菌としては、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）亜種クレモリス（cremoris）(ストレプトコッカス・クレモリス（Streptococcus cremoris）)、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）亜種ラクティス（lactis）NCDO 712、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）亜種ラクティス（lactis）NIAI 527、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）亜種ラクティス（lactis）NIAI 1061、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）亜種ラクティス・バイオバー・ジアセチルラクティス（lactis biovar diacetylactis）NIAI 8 W、およびラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）亜種ラクティス・バイオバー・ジアセチルラクティス（lactis biovar diacetylactis ）ATCC 13675が含まれる。
本明細書で用いているプロモーター、プロモーターエレメント、またはプロモーター配列とは、対象となるヌクレオチド配列と連結されたときにその対象のヌクレオチド配列のmRNAへの転写を制御することのできるDNA配列を意味している。従って、プロモーターは、ある遺伝子のための発現制御エレメント（そこにRNAポリメラーゼが特異的に結合しその遺伝子のRNA合成(転写)を開始する）を提供するDNA配列上の認識部位である。プロモーターは典型的には、必ずしもそうでなくともよいが、対象のヌクレオチド配列の5'(すなわち上流)に位置している(例えば、構造遺伝子の転写開始部位の近傍)。「構成的」という用語は、それがプロモーターに関して用いられる場合には、そのプロモーターがそれと機能しうる形で連結された核酸配列の転写を、刺激(例えば、熱ショック、化学物質、光など)なしに指令することができることを意味している。典型的には、構成的プロモーターはトランスジーンの発現を実質的にどのような生理学的条件の細胞においても指令することができる。これに対して「調節性」プロモーターは、刺激(例えば、熱ショック、化学物質、光など)の存在下で、機能しうる形で連結された核酸配列の転写レベルを指令することができるものであり、その転写レベルは、刺激のない状態での、機能しうる形で連結された核酸配列の転写レベルとは異なる。細菌内で機能するプロモーター配列とは、原理的には、細菌細胞内で遺伝子、特に外来遺伝子の発現を支配しうるあらゆるプロモーターを意味するものと理解されるべきである。この関連では、発現は、例えば構成的、誘導性、または発生依存性(development-dependent)であることができる。構成的プロモーターとは、RNAポリメラーゼの結合と翻訳開始の速度がほぼ一定で外部刺激に対して比較的影響されないプロモーターである。用いることのできるプロモーターは、構成的プロモーター、例えば、cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacIq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、λ-PR、またはλ-PLプロモーターがあり、それらの全てが、グラム陰性細菌中で都合よく用いることができる。その他の有益な調節配列は、例えばグラム陽性細菌においては、amyおよびSPO2プロモーターが、酵母または真菌中においてはADC1、MFα、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADHプロモーターが含まれる。原理的には、上述のとおり、調節配列を有する天然の細菌のプロモーターは全て本発明の方法に用いることができる。さらに、合成のプロモーターも都合よく用いることができる。
本明細書では、ポリペプチド、ペプチド、オリゴペプチド、遺伝子産物、発現産物、およびタンパク質は、連続したアミノ酸残基のポリマーまたはオリゴマーを指すべく交換可能な形で用いられている。
例えば、核酸配列(発現構築物、発現カセット、または該核酸配列を含んでいるベクター)に関して、組換えまたはトランスジェニックDNA発現構築物とは、実験操作によって生じるそのような構築物全てを意味し、その際
a) 該核酸配列、または
b) 該核酸配列(a)と機能しうる形で連結された遺伝子制御配列、例えばプロモーター、または
c) (a)および(b)
は、その天然の遺伝子的環境中での位置にないか、または実験操作によって改変されており、改変の例としては1つ以上のヌクレオチド残基の置換、付加、欠失、反転、または挿入が挙げられる。天然の遺伝子的環境とは、起源の生物における天然の染色体遺伝子座、またはゲノムライブラリーにおけるその存在を意味する。ゲノムライブラリーの場合には、核酸配列の天然の遺伝子的環境が少なくとも部分的に保持されていることが好ましい。その環境は核酸配列に少なくとも片側で隣接しており、配列の長さが少なくとも50bp、好ましくは少なくとも500bp、特に好ましくは少なくとも1,000bp、非常に特別に好ましくは少なくとも5,000bpである。天然の発現構築物、例えば、プロモーターと対応する遺伝子との天然の組み合わせは、非天然の、合成「人工」法、例えば突然変異誘発などの方法で改変すれば、トランスジェニック発現構築物となる。そのような方法については、既に記載されている(US5,565,350; WO 00/15815)。組換えポリペプチドまたはタンパク質とは、組換えDNA技法で作製された、すなわち、所望のポリペプチドまたはタンパク質をコードする外来の組換えDNA構築物によって形質転換された細胞から産生されたポリペプチドまたはタンパク質を意味する。組換え核酸及びポリペプチドは、天然には存在しないが人為的に改変された、変化させた、突然変異させた、または操作された分子をも含んでもよい。本発明の1実施形態においては、組換えDNA発現構築物は1つ以上の核酸分子の発現に寄与する。本発明の組換えDNA発現構築物は細菌内で機能するプロモーター、細菌内で機能する追加の調節もしくは制御エレメントまたは配列、ならびに細菌内で機能するターミネーターを包含するものであることが好都合である。さらに、組換え発現構築物は、例えば、正または負の選択マーカー、レポーター遺伝子、本発明の発現カセット、ベクターもしくは組換え生物の産生、増幅、もしくは機能に影響を及ぼすリコンビナーゼもしくはエンドヌクレアーゼの発現に寄与する発現カセットなどの、追加の機能エレメントを含んでもよい。さらに、組換え発現構築物は、細菌中への導入後に対象の遺伝子座で相同組換え(HR)事象を誘導するために十分な長さを有する、対象とする細菌遺伝子と相同な核酸配列を含むことができる。本発明の組換えトランスジェニック発現カセット(または該トランスジェニック発現カセットを含んでいるトランスジェニックベクター)は文献に記載されているような通常の組換えおよびクローニング技法によって作製することができる(例えば、Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY)；Silhavy, 1984, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY；およびAusubel 1987, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience)。本発明の発現カセットの細菌中への導入は、上述の核酸、プロモーター、ターミネーター、調節もしくは制御エレメント、ならびに機能性エレメントを含んでいるベクターを用いて都合よく行うことができる。
調節配列とは、転写因子などの調節タンパク質が結合し、それによって所与の遺伝子の転写率に影響を与える、プロモーター、エンハンサー、もしくはその他のDNAセグメントを意味する。
ルーメンバクテリアという用語は、消化過程の多くが細菌によって行われる反芻動物(ヒツジ、ヤギ、ウシ、シカなど)の第1胃または胃腸管から単離しうる細菌を意味する。
本明細書で用いている構造遺伝子とは、mRNAに転写され、その後翻訳されてある特定のポリペプチドに特徴的なアミノ酸配列となるDNA配列を指すものとする。
本明細書で用いている「形質転換する」または「形質転換」とは、遺伝物質(例えばトランスジーン)を細胞中に導入することを意味する。細胞の形質転換は安定なものもしくは一過性のものとすることができる。「一過性形質転換」または「一過性に形質転換された」とは、1つ以上のトランスジーンが、宿主細胞のゲノムにそのトランスジーンが組み込まれることなく、細胞中に導入されることを意味している。「一過性形質転換体」という用語は、1つ以上のトランスジーンが一過性に組み込まれた細胞を意味する。これに対して、「安定な形質転換」または「安定に形質転換された」とは、1つ以上のトランスジーンの、細胞のゲノム中への導入と組み込みを意味し、好ましくはそれによって染色体中に組み込まれて安定に遺伝される。細胞の安定な形質転換は細胞のゲノムDNAと核酸配列（これは1つ以上のトランスジーンと結合することのできる）とのサザンブロットハイブリダイゼーションによって検出することができる。あるいはまた、細胞の安定な形質転換は、細胞のゲノムDNAのポリメラーゼ連鎖反応によってトランスジーン配列を増幅して検出することもできる。「安定な形質転換態」という用語は、1つ以上のトランスジーンがゲノムDNAに安定に組み込まれた細胞を意味する。従って、安定な形質転換体は一過性形質転換体と以下の点で区別することができる：安定な形質転換体から得たゲノムDNAには1つ以上のトランスジーンが含まれており、一過性形質転換体から得られたゲノムDNAにはトランスジーンは含まれていない。形質転換は、ベクターの形態での遺伝物質の細菌細胞への導入を含み、そのベクターは染色体外での複製と遺伝子発現を含む。これらのベクターは宿主生物内で自律的に複製することができる。
「トランスジェニック」または「組換え」とは、細胞に関連して用いられる場合には、トランスジーンを含んでいる細胞、またはゲノムがトランスジーンの導入によって変化している細胞を意味する。トランスジェニック細胞はいくつかの方法で作製することができ、そのような方法としては、核酸(通常はDNA)を含む「トランスジーン」を標的細胞中に導入すること（上記の通り）、または人の介入により、例えばここに述べている方法などによって、トランスジーンを標的細胞の染色体に組み込むことを含む。反芻動物では、当業者であれば、下記の刊行物中に適切な方法を見出すことができる：
Figure 2009521213
ラクトコッカス（Lactococcus）およびラクトバシラス（Lactobacillus）の場合には、当業者であれば下記の刊行物中に適切な方法を見出すことができる：
Figure 2009521213
癌治療に関して本明細書で用いている「治療」とは、本発明の方法を用いて産生された発酵油、好ましくは精製共役リノール酸、より好ましくはトランス-10,シス-12オクタデカジエン酸を含んでいる医薬品の治療的な用途を意味する。かかる治療的用途とは、広義で理解されるべきであり、例えば該医薬品の(i)癌細胞の形成の防止、(ii)癌細胞の増殖の低減または停止、および/もしくは(iii)癌細胞が身体全体へと拡散することの防止のための用途を含んでいる。
「野生型」、「天然」、または「天然物起源の」とは、ある生物、ポリペプチド、または核酸配列に関して、該生物、ポリペプチド、または核酸配列が天然に生じているものであるか、または、変化していない、突然変異していない、または人為的に操作されていない少なくとも1つの天然の生物、ポリペプチド、または核酸配列が入手可能であることを意味している。
「ベクター」とは宿主細胞中で複製することのできるDNA分子である。プラスミドとコスミドは例示的なベクターである。さらに、「ベクター」および「ビヒクル」という用語は、1つの細胞から別の細胞へDNAセグメント(1つまたは複数)を移送する核酸分子に関しては相互に交換可能な形で用いられるが、その際に細胞は必ずしも同一の生物に属している必要はない(例えば、アグロバクテリウム細胞から植物細胞へのDNAセグメントの移送)。
本明細書で用いている「発現ベクター」という用語は、所望のコーディング配列と、ある特定の宿主生物内での該機能しうる形で連結されたコーディング配列の発現に必要な適切な核酸配列とを含んでいる、組換えDNA分子を意味する。
本発明の詳細な説明
本発明の教示するところによってトランスジェニック微生物中でのトランス-10,シス-12オクタデカジエン酸の産生が可能となる。
本発明の第1の実施形態は、トランスジェニック微生物中でのトランス-10,シス-12共役リノール酸の産生方法に関し、該方法は、
(a) 該微生物中にトランス-10,シス-12共役リノール酸イソメラーゼをコードする少なくとも1種の核酸分子を導入し、
(b) (a)で得られたトランスジェニック微生物を培養し、
(c) 該培養液にリノール酸を添加することによってトランス-10,シス-12共役リノール酸の産生を誘導し、
(d) その誘導した培養液を少なくとも12時間インキュベートし、
(e) 培養培地および/もしくは微生物から共役リノール酸を単離する、
ステップを含む。
好ましい1実施形態においては、本発明は、上述のステップ(a)から(e)に従ってトランスジェニック微生物中で共役リノール酸を産生させる方法であって、産生された共役リノール酸が、少なくとも30%、好ましくは少なくとも40%、より好ましくは少なくとも50%、特に好ましくは少なくとも60%、非常に特別に好ましくは少なくとも70%、最も好ましくは少なくとも80％のトランス-10,シス-12オクタデカジエン酸を含む様々なCLA異性体の混合物であることを特徴とする、前記方法に関する。
さらに、トランス-10,シス-12オクタデカジエン酸の異性体の純度は当業者には既知の方法、例えば結晶化などによってさらに都合よく高めることができる。
本発明のさらに好ましい1実施形態においては、ステップ(a)に記載のように微生物中に導入される核酸分子は、リノール酸(シス-9,シス-12オクタデカジエン酸)をトランス-10,シス-12オクタデカジエン酸へと変換することのできる共役リノール酸イソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、その核酸分子は、
i. 配列番号1に記載の配列を有する核酸分子、または
ii. (i)に記載の核酸分子によってコードされるポリペプチドと機能的に等価なもの、例えば次のもの：
a. 配列番号1に記載の配列のうちの少なくとも50、好ましくは少なくとも75、より好ましくは少なくとも100、特に好ましくは少なくとも125、非常に特別に好ましくは少なくとも150の連続した塩基対を有している核酸分子、
b. 配列番号1に記載の配列の、少なくとも100、好ましくは少なくとも125、より好ましくは少なくとも150、特に好ましくは少なくとも175、非常に特別に好ましくは少なくとも200の連続した核酸塩基対の配列にわたって、少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、特に好ましくは少なくとも95%、非常に特別に好ましくは少なくとも98%の同一性を有する核酸分子、または
c. 配列番号1に記載の核酸分子の少なくとも50、好ましくは少なくとも100、より好ましくは少なくとも150、特に好ましくは少なくとも200、非常に特別に好ましくは少なくとも500の連続した塩基対の核酸断片と高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸分子、または
d. 配列番号2に示されたアミノ酸配列と少なくとも75%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、特に好ましくは少なくとも95%、非常に特別に好ましくは少なくとも98%の同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
から選択される。
(i)および(ii)で定義した核酸配列は、原理的には全ての微生物から同定でき、単離することができる。配列番号1またはそのホモログ/機能的に等価なものは、細菌から都合よく単離することができ、その細菌は、好ましくは共役脂肪酸を産生することができるものである。使用し得る細菌としてはグラム陰性菌およびグラム陽性細菌が挙げられる。本発明の核酸分子は、好ましくは、プロピオニバクテリウム（Propionibacterium）、ラクトコッカス（Lactococcus）、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）、またはラクトバシラス（Lactobacillus）などのグラム陽性細菌、好都合にはビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）から、当業者に既知の方法で単離される。
配列番号1で示した配列の機能的誘導体はさらに、例えば、少なくとも75%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、特に好ましくは少なくとも95%、非常に特別に好ましくは少なくとも98%の同一性を有するアレル変異体を意味するものと理解されるべきである。同一性は「一般的な定義」の項に記載のとおり計算されたかまたは、PileUpのような追加のコンピュータープログラムによって計算した(J. Mol. Evolution, 25(1987), 351-360, Higginsら、CABIOS, 5(1989):151-153)。上述の核酸由来のアミノ酸配列は配列番号2に記載している。アレル変異体としては、特に、配列番号1に示す配列からヌクレオチドの欠失、挿入、または置換によって得ることのできる機能的変異体が含まれ、その結果得られる合成タンパク質の酵素活性は保持されている。
上述の共役リノール酸イソメラーゼと機能的に等価なものは、核酸データベースのホモロジーサーチを介するか、または配列番号1に記載の核酸分子の少なくとも50、好ましくは少なくとも100、より好ましくは少なくとも150、特に好ましくは少なくとも200、非常に特別に好ましくは少なくとも500の連続した塩基対の断片と、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とを用いたDNAハイブリダイゼーション(ゲノムDNAライブラリーのスクリーニング)を介して、同定することができる。本発明の好ましい1実施形態においては、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は下記のように選択することができる：
ハイブリダイゼーションバッファーはホルムアミド、NaCl、およびPEG 6000(ポリエチレングリコール、分子量6000)を含んでいる。ホルムアミドは二本鎖核酸分子に対して不安定化作用を有しており、そのことによって、ハイブリダイゼーションバッファー中で用いると、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを下げることなくハイブリダイゼーションの温度を42℃まで下げることができる。NaClはDNA二本鎖の復元率およびDNAプローブのその相補的DNA標的とのハイブリダイゼーション効率によい影響を与える。PEGはハイブリダイゼーションバッファーの粘性を増加させ、そのことは原理的にはハイブリダイゼーションの効率に負の影響を与える。ハイブリダイゼーションバッファーの組成は次のとおりである：
250 mM リン酸ナトリウムバッファー pH 7.2
1 mM EDTA(エチレンジアミン四酢酸)
7 % SDS (g/V) (ドデシル硫酸ナトリウム)
250 mM NaCl (塩化ナトリウム)
10 μg/mL 一本鎖DNA
5 % ポリエチレングリコール(PEG) 6000
40% ホルムアミド
好ましくは、ハイブリダイゼーションは42℃で一晩かけて行う。午前中にハイブリダイズさせたフィルターを2 X SSC＋0.1% SDSで1回あたり10分間、3回洗う。ハイブリダイゼーションは、少なくとも50、60、70、または80bp、好ましくは少なくとも90bpの断片を用いて都合よく行うべきである。特に好ましい1実施形態においては、ハイブリダイゼーションは上述の条件で核酸配列全体を用いて行うべきである。
当業者であれば下記の教科書でハイブリダイゼーションについてのさらに詳細な情報を見出すことができる：
Figure 2009521213
本発明のアミノ酸配列は、配列番号2に示すアミノ酸配列を含むか、または1つ以上のアミノ酸残基の置換、反転、挿入、もしくは欠失によってその配列から得ることのできる配列であって、配列番号2に示しすタンパク質の酵素活性が保持されているかもしくは実質的に低下していないものを含む、タンパク質を意味するものと理解されるべきである。「実質的に低下していない」という用語は、出発酵素の酵素活性の少なくとも10%、好ましくは20%、特に好ましくは30%を依然として保持している全ての酵素を意味しているものと理解されるべきである。例えば、特定のアミノ酸を、類似の物理化学的性質(空間的な位置関係、塩基性度、疎水性など)を有する他のアミノ酸で置換することができる。例えば、アルギニン残基はリジン残基の替わりとして交換することができ、バリン残基はイソロイシン残基の替わりとして、アスパラギン酸残基はグルタミン酸残基の替わりとして交換することができる。あるいは、その配列を1個以上のアミノ酸を付加もしくは除去した配列と交換することができ、またはそれらの方策（measure）の2つ以上のものを互いに組み合わせることができる。
特に好ましい1実施形態においては、前記トランス-10,シス-12共役リノール酸イソメラーゼは、ルーメンバクテリア、好ましくはメガスフェラ・エルスデニ（Megashera elsdenii）YJ-4から単離したものである。本発明のさらに好ましい1実施形態においては、トランス-10,シス-12共役リノール酸イソメラーゼをコードする核酸分子はプロピオニバクテリウム（Propionibacterium）、好ましくはプロピオニバクテリウム・アクネス（Propionibacterium acnes）から単離したものである。
本発明の非常に特別に好ましい1実施形態においては、前記トランス-10,シス-12共役リノール酸イソメラーゼはプロピオニバクテリウム・アクネス（Propionibacterium acnes）から単離した、受託番号CQ766028のトランス-10,シス-12共役リノール酸イソメラーゼである(配列番号1)。
本発明の好ましい1実施形態においては、上述の核酸分子は、組換えもしくはトランスジェニックDNA発現構築物(「一般的な定義」の項で定義している)の部分である。組換えもしくはトランスジェニックDNA発現構築物は、配列番号1に示された配列、もしくは配列番号1に記載の核酸分子によってコードされるポリペプチドの機能的に等価なもの（上記(ii)で定義される）であって、好ましくは遺伝子発現を増加させるために、1以上の調節シグナルと機能しうる形で連結されているものを意味すると理解されるべきである。それらの調節配列は、例えば、インデューサーもしくはレプレッサーが結合して前記核酸の発現を調節する配列である。それらの新規の調節配列に加えて、またはそれらの配列に代えて、実際の構造遺伝子の上流のそれらの配列の天然の調節が依然として存在してもよく、また、所望により、天然の調節のスイッチが切られ、該遺伝子の発現が増加するように遺伝子的に変化させてもよい。しかし、遺伝子構築物の発現をより単純な構造とする（すなわち、該配列またはその誘導体の上流に追加の調節シグナルは挿入されず、その調節を含む天然のプロモーターは除去されない）こともできる。その代わりに、天然の調節配列を突然変異させて調節が起こらないようにし、遺伝子の発現が増大するようにすることもできる。活性を増大させるために、そのような変化したプロモーターも天然の遺伝子の上流のそれらのプロモーターのもともとの位置に置くこともできる。さらに、遺伝子構築物は、プロモーターと機能しうる形で連結した1以上のいわゆるエンハンサー配列を含むことができるのが好ましく、それらによって前記核酸配列の発現を増大させることができる。また、DNA配列の3'末端に、さらに別の調節エレメントまたはターミネーターなどの追加の有利な配列を挿入することもできる。遺伝子構築物中に1つ以上の共役リノール酸イソメラーゼ遺伝子のコピーが含まれてもよい。
本発明の方法に有利な調節配列は、例えば、cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、laclq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、λ-PRなどのプロモーター中に、またはλ-PLプロモーター中に含まれており、それらの全てはグラム陰性細菌中で都合よく用いられる。その他の有利な調節配列は、例えば、グラム陽性細菌プロモーターのamyおよびSPO2中に、酵母もしくは真菌のプロモーターであるADC1、MFα、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH中に含まれる。
原理的には、上述のような調節配列を有する天然のプロモーターの全てを本発明の方法に用いることができる。さらに、合成プロモーターも都合よく用いることができる。
前記組換えもしくはトランスジェニックDNA発現構築物は、その遺伝子の発現のために、3'および/もしくは5'末端調節配列を付加して発現を増加させることができ、それらの配列は選択した宿主生物、および1種または複数の遺伝子に応じて最適な発現が行えるように選択される。
これらの調節配列は特定の遺伝子の発現を可能にすることを意図している。このことは、例えば宿主生物の如何によって、誘導後にのみ、その遺伝子が発現されるかもしくは過剰発現されること、またはその遺伝子が直ちに発現されるおよび/もしくは過剰発現されることを意味していてもよい。
調節配列または因子は、この目的のために、導入した遺伝子の発現に有益な作用を有し、それにより発現を増加することが好ましい。従って、調節エレメントでの増強は、強力な転写シグナル、例えばプロモーターおよび/もしくはエンハンサーなどを用いることによって、転写のレベルで都合よく生じさせることができる。しかし、例えば、RNAの安定性を改善することによって、翻訳を増大させることもできる。
組換えもしくはトランスジェニック発現構築物はまた、生物中に導入されるべき別の遺伝子を含んでもよい。それらの遺伝子は本発明のイソメラーゼ遺伝子のものと別個の調節下であることができるし、または同じ調節領域下であることもできる。それらの遺伝子として、例えば、他の生合成遺伝子が挙げられ、それらは脂肪酸および脂質生合成の遺伝子であることが有利であるが、それらによって例えばリノール酸などのイソメラーゼ出発物質の合成を増加させることができる。
生物中での異種遺伝子の最適な発現には、生物の特異的なコドン使用頻度に従って核酸配列を改変することが有利である。コドン使用頻度については関連する生物の他の既知の遺伝子のコンピューター解析に基づいて容易に確立することができる。
宿主生物、例えば、酵母や細菌などの微生物中での発現のために、核酸分子断片が都合よくベクター（例えばプラスミド、ファージ、またはその他のDNA）中に挿入され、ベクターは宿主内での該遺伝子の最適な発現を可能にする。適切なプラスミドの例としては、大腸菌(E.coli)では、pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、λgt11、またはpBdCI、ストレプトマイセス（Streptomyces）では、pIJ101、pIJ364、pIJ702、またはpIJ361、バシラス（Bacillus）では、pUB110、pC194、またはpBD214、コリネバクテリウム（Corynebacterium）では、pSA77またはpAJ667、真菌ではpALS1、pIL2、またはpBB116、酵母では、2∝M、pAG-1、YEp6、YEp13、またはpEMBLYe23、または上述のプラスミドの誘導体が挙げられる。ここで言及したプラスミドは可能なプラスミドの少数の選択である。その他のプラスミドは当業者にはよく知られており、例えば、Cloning Vectors(Pouwels, P.H.ら, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018)という書籍中に見出すことができる。適切な植物ベクターについては、とりわけ、Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press), Chapter 6/7, pp.71-119中に記載されている。
プラスミドに加えて、ベクターがさらに、当業者には既知のその他のベクターの全てを意味していることは理解されるべきであり、それらとしては、例えば、ファージ、ISエレメント、線状もしくは環状DNAが挙げられる。これらのベクターは宿主生物内で自律的に複製することができるか、または染色体に組み込まれて複製される。自律的に複製するものが好ましい。
ベクターは、本発明の核酸配列の少なくとも１コピー含んでいることが好都合である。含まれているその他の遺伝子を発現させるために、核酸断片はさらに3'および/もしくは5'末端調節配列を含むことにより発現を増加させることが好都合であり、それらの配列は選択した宿主生物、および1種または複数の遺伝子に応じて最適な発現が行えるように選択される。
これらの調節配列によって遺伝子の標的化発現が可能となるはずである。宿主生物の如何によって、標的化発現とは、例えば、誘導後にのみ、その遺伝子が発現されるおよび/もしくは過剰発現されること、またはその遺伝子が直ちに発現されるおよび/もしくは過剰発現されることを意味していてもよい。
調節配列または因子は、好ましくは導入した遺伝子の発現に有益な作用を有し、それにより発現を増大することができる。従って、調節エレメントでの増強は、強力な転写シグナル（例えばプロモーターおよび/もしくはエンハンサーなど）を用いることによって、転写レベルで都合よく起こすことができる。しかし、さらに、例えばmRNAの安定性を改善することによって、翻訳を増大させることもできる。
別の1実施形態においては、本発明の遺伝子構築物は生物内に線状DNAの形態で導入して、宿主生物のゲノム中に非相同または相同組換えによって組み込むことができることが好都合である。この線状DNAは線状化プラスミドからなるものとすることができ、またはベクターとして核酸断片のみからなるもの、または本発明の核酸配列からなるものとすることができる。
本発明の核酸配列は、核酸構築物中に少なくとも1つのレポーター遺伝子とともにクローニングされ、核酸構築物がゲノム中に導入されることが好都合である。このレポーター遺伝子は、増殖アッセイ、蛍光アッセイ、化学アッセイ、生物発光アッセイ、または耐性アッセイを介して、または光度測定を介して、容易に検出しうるはずである。使用しうるレポーター遺伝子の例としては、抗生物質(例えば、アンピシリン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、エリスロマイシン)に対する抵抗性を付与する遺伝子、ヒドロラーゼ遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子、生物発光遺伝子、糖代謝遺伝子、もしくはヌクレオチド代謝遺伝子、またはUra3遺伝子、Ilv2遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β-ガラクトシダーゼ遺伝子、gfp遺伝子、2-デオキシグルコース-6-リン酸ホスファターゼ遺伝子、β-グルクロニダーゼ遺伝子、β-ラクタマーゼ遺伝子、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子などの生合成遺伝子が挙げられる。
さらに都合のよい1実施形態においては、本発明の核酸配列はそのまま生物内に導入してもよい。
本発明の核酸配列に加えて、他の遺伝子を生物中に導入することを意図している場合には、全ての遺伝子をレポーター遺伝子を含む1つのベクターで、または、レポーター遺伝子を含む個々の遺伝子をベクター毎に（種々のベクターを同時にまたは順次導入することができる）生物中に導入することができる。
宿主生物(トランスジェニック生物)は、本発明の核酸および/もしくは本発明の核酸構築物の少なくとも1コピー含んでいることが好都合である。
原理的には、本発明の核酸、核酸構築物、またはベクターは、生物、例えば細菌中に当業者には既知の方法で導入することができる。
微生物の場合には、当業者であれば、Sambrook, J.ら(1989), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press、F.M. Ausubelら(1994) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons、D.M. Gloverら, DNA Cloning Vol.1, (1995), IRL Press (ISBN 019-963476-9)、Kaiserら,(1994) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press、またはGuthrie ら, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, 1994, Academic Pressによる教科書中に適切な方法を見出すことができる。
本発明の方法に適切な生物もしくは宿主生物(トランスジェニック生物)は、原理的には、不飽和脂肪酸を合成することができ、かつ組換え遺伝子の発現に適した全ての生物である。そのような生物体の例としては、ラクトバシラス科（Lactobacillaceae）、ストレプトコッカス科（Streptococcaceae）、プロピオニバクテリア科（Propionibacteriaceae）、エンテロバクテリア科（Enterobacteriaceae）、およびビフィドバクテリア科（Bifidobacteriae）からなる群から選択された科に属し、好ましくは、ラクトコッカス属（Lctococcus）、ラクトバシラス属（Lactobacillus）、プロピオニバクテリウム属（Propionibacterium）、エシェリキア属（Escherichia）、およびビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）からなる群から選択された属に属し、最も好ましくは、該微生物はラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）、ラクトバシラス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）、およびエシェリキア・コリ（Escherichia coli）からなる群から選択されたものである。
当業者であれば、ファインケミカルの製造に適した他の供給源を知っており、それらも核酸分子の有用な供給源を提供する。そのような供給源としては、一般的には、全ての原核細胞または真核細胞が含まれ、好ましくは単細胞微生物、例えばクラビセプス属（Claviceps）もしくはアスペルギルス属（Aspergillus）のような真菌、またはバシラス属（Bacillus）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、ミクロコッカス属（Micrococcus）、ブレビバクテリウム属（Brevibacterium）、ロドコッカス属（Rhodococcus）、ノカルディア属（Nocardia）、カゼオバクター属（Caseobacter）、もしくはアルスロバクター属（Arthrobacter）などのグラム陽性細菌、またはエシェリキア属（Escherichia）、フラボバクテリウム属（Flavobacterium）、もしくはサルモネラ属（Salmonella）などのグラム陰性細菌、またはロドトルラ属（Rhodotorula）、ハンセヌラ属（Hansenula）、もしくはカンディダ属（Candida）などの酵母が挙げられる。
本発明の方法で特に都合よく選択される産生株は、アクチノミセス科（Actinomycetaceae）、バシラス科（Bacillaceae）、ブレビバクテリア科（Brevibacteriaceae）、コリネバクテリア科（Corynebacteriaceae）、エンテロバクテリア科（Enterobacteriacae）、ゴルドニア科（Gordoniaceae）、ミクロコッカス科（Micrococcaceae）、マイコバクテリア科（Mycobacteriaceae）、ノカルディア科（Nocardiaceae）、シュードモナス科（Pseudomonaceae）、リゾビア科（Rhizobiaceae）、ストレプトマイセス科（Streptomycetaceae）、ケタマカビ科（Chaetomiaceae）、コウガイケカビ科（Choanephoraceae）、クリプトコッカス科（Cryptococcaceae）、クスダマカビ科（Cunninghamellaceae）、デメティア科（Demetiaceae）、モニリア科（Moniliaceae）、クサレケカビ科（Mortierellaceae）、ケカビ科（Mucoraceae）、フハイカビ科（Pythiaceae）、サッカロマイセス科（Sacharomycetaceae）、ミズカビ科（Saprolegniaceae）、シゾサッカロマイセス科（Schizosacharomycetaceae）、ソダリア科（Sodariaceae）、スポロボロマイセス科（Sporobolomycetaceae）、ツベルクラリア科（Tuberculariaceae）、アデロゼシア科（Adelotheciaceae）、渦鞭毛藻科（Dinophyceae）、キンシゴケ科（Ditrichaceae）、およびパラシノフィセア科（Prasinophyceaeor）の、ハンセヌラ・アノマラ（Hansenula anomala）、カンディダ・ユーティリス（Candida utilis）、クラビセプス・パーピュレア（Claviceps purpurea）、バシラス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バシラス・サブチリス（Bacillus subtilis）、バシラス・エスピー（Bacillus sp.）、ブレビバクテリウム・アルビダン（Brevibacterium albidum）、ブレビバクテリウム・アルバム（Brevibacterium album）、ブレビバクテリウム・セリナム（Brevibacterium cerinum）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、ブレビバクテリウム・グルタミゲネス（Brevibacterium glutamigenes）、ブレビバクテリウム・イオディナム（Brevibacterium iodinum）、ブレビバクテリウム・ケトグルタミカム（Brevibacterium ketoglutamicum）、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、ブレビバクテリウム・リネンス（Brevibacterium linens）、ブレビバクテリウム・ロゼウム（Brevibacterium roseum）、ブレビバクテリウム・サッカロリチカム（Brevibacterium saccharolyticum）、ブレビバクテリウム・エスピー（Brevibacterium sp.）、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Corynebacterium acetoacidophilum）、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム（Corynebacterium acetoglutamicum）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）(マイココッカス・グルタミカム（Micrococcus glutamicum）)、コリネバクテリウム・メラッセコラ（Corynebacterium melassecola）、コリネバクテリウム・エスピー（Corynebacterium sp.）、もしくはエシェリキア・コリ（Escherichia coli）からなる属及び種、特にエシェリキア・コリ（Escherichia coli）K12およびその報告されている株から選択された微生物である。
特に好ましいのはプロバイオティックス(一般的定義の項で定義される)として分類されるかまたは用いられている細菌である。
宿主生物によって異なるが、本発明の方法で用いる生物は当業者には既知の様式で増殖もしくは培養される。一般的には、微生物は液体培地中で増殖し、その培地は、通常は糖の形で加えられる炭素源、通常は酵母抽出物などの有機窒素源の形または硫酸アンモニウムなどの塩の形で加えられる窒素源、リン酸水素カリウムなどのリン酸源、鉄塩、マンガン塩、マグネシウム塩などの微量元素、および、必要に応じてビタミンを含有しており、温度は0℃から100℃、好ましくは10℃から60℃、より好ましくは15℃から50℃であり、酸素を通気させつつ用いる。液体培地のpHはある固定値を維持させること、すなわち、培養を行っている間にpHを制御することができる。pHの範囲は、pH2からpH9の間とすべきである。しかし、微生物はまた、pHの調節を行わずに培養することもできる。培養は、バッチ式、半バッチ式、またはフェッドバッチ/連続式で行うことができる。栄養素を発酵の開始時点に供給することができ、または半連続的、もしくは連続的に栄養を添加することができる。
生物は好気的条件または嫌気的条件下で増殖させることができる。液体培地のpHはある固定値を維持させること、すなわち、培養を行っている間にpHを調節することができる。pHの範囲は、pH2からpH9、好ましくは4から8.5、4.5から8、より好ましくは5から7.5、5.5から7とすべきである。しかし、微生物はまた、pHの調節を行わずに培養することもできる。
本発明の方法の温度は0℃から100℃で行うことが好都合であり、好ましくは10℃から65℃、15℃から55℃、より好ましくは20℃から50℃、25℃から45℃、特に好ましいのは30℃から40℃であり、酸素を通気させつつ用いる。
本発明の方法(in vitro)のpHはpH 4からpH 12、好ましくは4から8.5、4.5から8、より好ましくは5から7.5、5.5から7に維持されるのが好都合である。しかし、微生物はまた、pHの調節を行わずに培養することもできる。
既知の培養方法の概略は、Chmiel(Bioprozastechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fisher Verlag, Stuttgart, 1991))の教科書、またはStorhas(Biorektoren und periphere Einrichtungen(Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994))の教科書中に見出される。用いる培養培地はそれぞれの株の要求性に適切に合致するものでなければならない。種々の微生物用の培養培地の説明はハンドブック"Manual of Methods for General Bacteriology", American Society for Bacteriology(Washington D.C., USA, 1981)に記載されている。本発明で用いることのできる培地は、上述の通り、通常は1種以上の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミン、および/もしくは微量元素を含んでいる。好ましい炭素源は、単糖、二糖、または多糖類などの糖である。非常によい炭素源の例としては、ブドウ糖、果糖、マンノース、ガラクトース、リボース、ソルボース、リブロース、乳糖、麦芽糖、ショ糖、ラフィノース、デンプン、またはセルロースが挙げられる。糖は、例えば糖蜜などの複合化合物の形や、その他の精糖の副産物を介して培地に添加することもできる。種々の炭素源の混合物を添加することも好都合でありうる。その他の炭素源となりうるものとしては、例えば、大豆油、ヒマワリ油、落花生油、および/もしくはココナッツ油などの油脂、例えば、パルミチン酸、ステアリン酸、および/もしくはリノール酸などの脂肪酸、例えば、グリセロール、メタノール、および/もしくはエタノールなどのアルコールおよび/もしくはポリアルコール、ならびに/または例えば、酢酸および/もしくは乳酸などの有機酸が挙げられる。窒素源は通常は有機もしくは無機の窒素化合物もしくはこれを含んでいる物質である。窒素源の例としては、液体もしくは気体形態のアンモニア、または硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、もしくは硝酸アンモニウムなどのアンモニウム塩、硝酸塩、尿素、アミノ酸、または複合窒素源、例えばコーンスティープリカー(corn steep liquor)、大豆ミール、大豆タンパク質、酵母抽出物、肉抽出物などが含まれる。窒素源は単独で、または混合物として添加することができる。培地に添加することのできる無機塩の化合物としては、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、コバルト、モリブデン、カリウム、マンガン、亜鉛、銅、および鉄の塩化物、リン酸塩、および硫酸塩が含まれる。
リン酸、リン酸二水素カリウム、もしくはリン酸水素二カリウム、または対応するナトリウム含有塩をリン源として用いることができる。金属イオンを溶液中に維持するためにキレート剤を培地に添加することができる。特に適切なキレート剤としては、カテコールもしくはプロトカテクエート(protocatechuate)などのジヒドロキシフェノール、またはクエン酸などの有機酸が挙げられる。本発明で微生物の培養用に用いられる発酵培地には、通常、その他の増殖因子、例えばビタミンや増殖促進剤を含ませることができ、そのようなものとしては、例えば、ビオチン、リボフラビン、チアミン、葉酸、ニコチン酸、パントテナート、およびピリドキシンなどが挙げられる。増殖因子および塩類は、複雑な培地成分、例えば酵母抽出物、糖蜜、コーンスティープリカーなどに由来することが多い。培養培地に適切な前駆体をさらに添加することができる。培地成分の正確な組成は、特定の実験によって大きく異なり、それぞれの具体的な場合に応じて個々に選択される。培地の最適化に関する情報は、"Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach"(P.M. Rhodes, P.F.Stanbury編, IRL Press(1997), pp53-73, ISBN 0 19 963577 3)という教科書から得られる。増殖培地は商業的販売業者から購入することもでき、例えばStandard 1培地(Merck)、またはBHI(Brain heart infusion, DIFCO)などがある。培地の全成分は加熱によるか(1.5 barで121℃20分間)または滅菌ろ過によって滅菌する。それらの成分は一緒に滅菌するか、または必要があれば別々に滅菌される。培地の全成分は培養開始時点で存在するようにしておくことができ、または任意で連続的にもしくはバッチ式で添加することができる。培養の温度は通常は15℃から45℃で、好ましくは25℃から40℃で、実験の間一定に保つかまたは変えることができる。培地のpHは5から8.5の範囲、好ましくは約7とすべきである。培養時のpHは、培養の間、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、もしくはアンモニア水などの塩基性化合物、またはリン酸もしくは硫酸などの酸性化合物を添加
することによって制御することができる。発泡は、例えば脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を用いることによって制御することができる。プラスミドの安定性は培地に例えば抗生物質などの選択的作用を有する適切な物質を添加することによって維持することができる。好気的条件は、培養液中に酸素、または環境空気などの酸素を含有している気体の混合物を導入することによって維持される。培養液の温度は通常は20℃から45℃、好ましくは25℃から40℃である。培養は所望の産物が最大限に形成されるまで継続される。このような目的は通常は10時間から160時間以内に達成される。
本発明の方法のために、増殖細胞を用いることができ、そのような細胞には、本発明の核酸、核酸構築物、またはベクターが含まれる。また、静止細胞または破壊細胞を用いることもできる。破壊細胞とは、例えば、溶剤による処理によって透過性となった細胞、または酵素処理、機械的処理(例えばフレンチプレスもしくは超音波)、もしくは他の方法によって破壊された細胞を意味する。このようにして得られた粗抽出物は本発明の方法に適切である。精製した、もしくは部分精製した酵素も本方法で用いることができる。同様に好適なのは、固定化した微生物または酵素でそれらは反応において都合よく用いることができる。
本発明の方法に遊離の生物または酵素を用いる場合には、例えばろ過または遠心分離によって抽出前に適宜除去される。固定化した生物または酵素を用いればこの除去操作が不要であることは好都合であるが、遊離したものの混入は依然として起こりうる。
主たる出発物質であるリノール酸は反応混液にバッチ式、半バッチ式、または連続的に添加することができる。発酵プロセスのための出発物質（好ましくはリノール酸である）の濃度は、3mg/mL以下、好ましくは2 mg/mL以下、より好ましくは1 mg/mL以下、特に好ましくは0.5 mg/mL以下である。本発明の非常に特別に好ましい1実施形態においては、トランス-10,シス-12オクタデカジエン酸の産生を誘導するために用いるリノール酸の濃度は0.1から0.5 mg/mL、好ましくは0.4から0.5 mg/mL、より好ましくは0.3から0.4 mg/mL、特に好ましくは0.2から0.3 mg/mL、最も好ましくは0.1から0.2 mg/mLの範囲である。
本発明の別の好ましい1実施形態においては、リノール酸は微生物培養液に添加されるが、その培養液は光学密度(OD600)が、少なくとも0.1、好ましくは少なくとも0.2、より好ましくは少なくとも0.3、もしくは0.31、0.32、0.33、0.34、0.35、0.36、0.37、0.38、0.39、特に好ましくは少なくとも0.4、もしくは0.41、0.42、0.43、0.44、0.45、0.46、0.47、0.48、0.49、非常に特別に好ましくは少なくとも0.5、もしくは0.51、0.52、0.53、0.54、0.55、0.56、0.57、0.58、0.59、0.6である。しかし、リノール酸は光学密度(OD600)が0.6を超える微生物培養液に添加することもできる。
本発明の好ましい1実施形態においては、CLAの単離の前に、誘導させた培養液を少なくとも12から18時間、好ましくは少なくとも18から24時間、より好ましくは少なくとも24から30時間、特に好ましくは少なくとも30から42時間、最も好ましくは少なくとも42から72時間インキュベートする。
上述の作業を行うと、本発明の方法の産物(共役不飽和脂肪酸、特にCLA、好ましくはトランス-10,シス-12オクタデカジエン酸)は、その反応に用いたリノール酸の量に基づいて、20から100%、好ましくは30から100%、特に好ましくは50から100%、より特に好ましくは60から100%、70から100%、80から100%、90から100%の収量で単離することができる。さらに、その産物は高い異性体純度を有するが、さらに必要があれば結晶化によってその純度を都合よく高めることができる。本発明の方法では主要産物としてトランス-10,シス-12オクタデカジエン酸が得られる。
産生される脂肪酸は生物から当業者であれば既知の方法によって単離することができる。例えば、抽出、塩析沈殿、および/もしくは種々のクロマトグラフィー法を介する。微生物の発酵の場合には、上述の脂肪酸は、培地および/もしくは細胞内に蓄積する可能性がある。本発明の方法で微生物を用いる場合には、発酵ブロスを培養後に処理することができる。要求事項によって異なるが、バイオマスの全てもしくはいくらかを発酵ブロスから、例えば、遠心分離、ろ過、デカンティングまたはそれらの方法の組合せなどの分離方法によって取り除くことができ、あるいは、バイオマスを発酵ブロス中に残すこともできる。その後、例えば、ロータリーエバポレーター、薄層エバポレーター、フォーリングフィルムエバポレーターなどの既知の方法を用いて、逆浸透法により、またはナノ濾過によって、発酵ブロスを減らすか、または濃縮することができる。その後、さらに、製剤化のための化合物、例えばトウモロコシデンプンやシリケートなどを都合よく添加することができる。その後、この濃縮された発酵ブロスを、好ましくは製剤化のための化合物とともに、凍結乾燥、スプレードライ、スプレー造粒、またはその他の方法で加工することができる。好ましくは、脂肪酸または脂肪酸組成物は、微生物などの生物から、またはその生物を増殖させた培地から、または該生物と培地の双方から、既知の方法、例えば抽出、蒸留、結晶化、クロマトグラフィー、もしくはそれらの方法の組み合わせによって単離される。これらの精製方法は単独で、または分離および/もしくは濃縮方法などの上述の方法と組み合わせで用いることができる。
産物を含有している組成物を、例えばシリカゲルプレート上での薄層クロマトグラフィーやFlorisilカラム(Bouhours, J.F., J. Chromatogr., 1979, 169, 462)などのクロマトグラフィーに供することができ、そのような場合には、所望の産物または不純物はクロマトグラフィー樹脂上に全てもしくは部分的に残る。これらのクロマトグラフィーステップは、必要に応じて同一のまたは異なるクロマトグラフィー樹脂を用いて反復することができる。当業者であれば、適切なクロマトグラフィー樹脂およびそれらの最も有効な使用法については熟知している。脂肪酸を精製する別の方法としては、例えば尿素の存在下での結晶化が挙げられる。これらの方法は互いに組み合わせることができる。
単離した化合物の同一性と純度は先行技術によって測定することができる。そのような技術としては、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、分光学的方法、質量分析(MS)、染色法、薄層クロマトグラフィー、NIRS、酵素アッセイ、または微生物学的アッセイなどが挙げられる。これらの分析法はPatekら, (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60:133-140；Malakhovaら, (1996) Biotekhnologiya, 11:27-32；およびSchmidtら, (1998) Bioprocess Engineer. 19:67-70；Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996) Vol.A27, VCH；Weinheim，pp.89-90, pp.521-540, pp.540-547, pp559-566, pp.575-581,およびpp.581-587；Michal, G.(1999) Biochemical Pathways:An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley & Sons；Fallon, A.ら, (1987) Applications of HPLC in Biochemistry, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology Vol.17中に要約されている。
特に好ましい1実施形態においては、本発明は、上述のステップ(a)から(e)に従ったトランスジェニック微生物中での共役リノール酸の産生方法であって、操作または発酵手順(バッチ式もしくはフェッドバッチ式)におけるリノール酸の生物変換率(一般的定義の項で定義している)が、ラクトバシラス属（Lactobacillus）に属する細菌については、10%超、好ましくは20%超、より好ましくは30%超であり、エシェリキア属（Escherichia）に属する細菌については、10%超、好ましくは20%超、より好ましくは30%超、特に好ましくは40%超であり、ラクトコッカス属（Lactococcus）に属する細菌については、10%超、好ましくは20%超、より好ましくは30%超、特に好ましくは40%超、非常に特別に好ましくは50%超であることを特徴とする、前記方法に関する。
さらに、本発明は、共役リノール酸を豊富に含む飼料もしくは食品または栄養補助食品の製造方法であって、共役リノール酸が上述の方法に従って産生される、前記方法に関する。
さらに、本発明は共役リノール酸を豊富に含んだ飼料、食品、および栄養補助食品に関し、その際、共役リノール酸は上述の方法に従って産生される。
本発明の組成物は、広範な栄養的、治療的、および薬理学的に用途を提供する。そのような用途としては、動物での体脂肪の低減；動物の筋肉量の増大；動物の飼料効率の増加；ヒトでの体重低減；動物でのアレルギー反応の減衰；動物での免疫刺激による体重減少の防止；動物での骨のミネラル含量の増加；動物での骨格異常の防止；および動物の血中コレステロール量の低減が含まれる。
前記飼料または食品、好ましくは飼料または食品用の添加物として用いられる調製品は、上述の方法に従って産生された共役リノール酸、好ましくは発酵油もしくは精製共役リノール酸異性体の混合物、より好ましくは、精製トランス-10,シス-12オクタデカジエン酸に加えて、追加の成分を含むことができる。追加の成分の選択は、調製品の選択された分野の用途によって左右され、通常は当業者には既知である。本発明の範囲内で考慮される追加の成分は、例えば、次のような物質である：追加の有機酸、カロチノイド、微量元素、抗酸化剤、ビタミン、酵素、アミノ酸、ミネラル、乳化剤、安定化剤、保存剤、固化防止剤、および/もしくは調味料。
前記物質のクラスの代表例として、欧州の規則、例えば現行のEC Directive 95/2/ECによる食品添加物の各有効なリストから考慮することができる。
以下に本発明の調製品を製造するために適した追加の成分を列記する。
これらの成分は、それらの様々な性質に従って、および選択された分野の用途における役割に応じて様々な量で添加される。選択された分野の用途に応じたそのような物質クラスの量的混合比、およびさらには有利な組合せは当業者に既知である。
使用に好ましい有機酸としては、ギ酸、プロピオン酸、乳酸、酢酸、およびクエン酸が挙げられ、特に好ましいのはギ酸、プロピオン酸、または乳酸である。
本発明の関連で、カロチノイドとは、1つまたは2つのイオノン環が9個の二重結合を有する炭素鎖によって結合されており、植物もしくは動物起源のいずれかでありうる、テトラテルペンを指すものとする。カロチノイドはまた、酸素化キサントフィルを意味するものとする。例としてあげられるものは、α-、β-、γ-カロチン、ビキシン（ixin）、ノルビキシン、カプサンシン、カプソルビン、リコピン、β-アポ-8-カロテナール、カロチン酸エチルエステル、およびキサントフィル、フラボキサンチン、ルテイン、クリプトアキサンチン、ルビキサンチン、ビオラキサンチン、ロドキサンチン、およびカンタキサンチンである。
本発明の調製品は、例えば、次の微量元素を含むことができる：クロム、鉄、フッ素、ヨウ素、コバルト、銅、マンガン、モリブデン、ニッケル、セレニウム、バナジウム、亜鉛、もしくはスズ。
以後に列記されているEを付した番号は食品添加物についてDirective 95/2/EEC中で用いられている呼称である。
用いることのできる抗酸化剤としては、例えば、アスコルビン酸(ビタミンC, E 300)、L-アスコルビン酸ナトリウム(E 301)、L-アスコルビン酸カルシウム(E 302)、パルミチン酸アスコルビル(E 304)、ブチル化ヒドロキシアニソール(E 320)、ブチル化ヒドロキシトルエン(E 321)、EDTAカルシウム二ナトリウム(E 385)、没食子酸塩、例えば没食子酸プロピル(E 310)、没食子酸オクチル(E 311)、没食子酸ドデシル(没食子酸ラウリル)(E 312)、イソアスコルビン酸(E 315)、イソアスコルビン酸ナトリウム(E 316)、レシチン(E 322)、乳酸(E 270)、多価リン酸塩、例えばジリン酸(E 450)、トリリン酸(E 451)、ポリリン酸(E 452)、二酸化イオウ(E 220)、亜硫酸ナトリウム(E 221)、重亜硫酸ナトリウム(E 222)、二亜硫酸ナトリウム(E 223)、亜硫酸カリウム(E 224)、亜硫酸カルシウム(E 226)、亜硫酸水素カルシウム(E 227)、二亜硫酸カリウム(E 228)、セレニウム、トコフェロール類(ビタミンE、E 306)、例えばα-トコフェロール(E 307)、γ-トコフェロール(E 308)、δ-トコフェロール(E 309)および全てのトコトリエノール類、塩化スズ(II)(E 512)、クエン酸(E 330)、クエン酸ナトリウム(E 331)、カロチノイド、ビタミンA、およびクエン酸カリウム(E 332)が挙げられる。
考慮の対象となるビタミン類は、脂溶性ビタミンのみならず水溶性ビタミンも含まれる。脂溶性ビタミンの例としては、ビタミンA(レチノール)、ビタミンD(カルシフェロール)、ビタミンE(トコフェロールおよびトコトリエノール)、ビタミンK(フィロキノンおよびメナキノン)が挙げられ、好ましいのは、ビタミンAとEである。
水溶性ビタミンの例としては、ビタミンB1(チアミン)、ビタミンB2(リボフラビン)、ビタミンB5(パントテン酸)、ビタミンB6(ピリドキシン)、ビタミンB12(コバラミン)、ビタミンC(アスコルビン酸)、ビタミンH(ビオチン)、葉酸、およびナイアシンが挙げられ、好ましいのはビタミンB2とビタミンCである。本発明の調製品は酵素を含むこともできる。例として挙げられるのは、アミラーゼ、プロテアーゼ、およびインベルターゼである。
本発明の関連で考慮の対象となるアミノ酸は、例えば、グルタミン酸、L-カルニチン、L-グルタミン、L-タウリン、L-アスパラギン酸、L-グリシン、L-リジン、DL-フェニルアラニン、L-トリプトファン、チロシン、L-アルギニン、L-システイン、L-ロイシン、L-メチオニン、L-アラニン、L-セリン、L-トレオニン、L-シトルリン、L-バリン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-オルニチン、またはL-プロリンである。
特に好ましいのは必須アミノ酸で、例えば、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-リジン、L-メチオニン、DL-フェニルアラニン、L-トレオニン、L-トリプトファン、およびL-バリンで、より一層好ましいのは動物の栄養に重要なアミノ酸であるL-リジン、DL-メチオニン、またはL-トレオニンである。
本発明の関連で、ミネラルとしては、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、リン、鉄、および亜鉛が挙げられる。
乳化剤としては、例えば、次の物質を用いることができる：E 420 ソルビトール、E 420ii ソルビトールシロップ、E 421 マンニトール、E 422 グリセロール、E 431 ステアリン酸ポリオキシエチレン(40)、E 432 ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート/ポリソルベート20、E 433 ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート/ポリソルベート 80、E 434 ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート/ポリソルベート 40、E 435 ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート/ポリソルベート 60、E 436 ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート/ポリソルベート 65、E 440 ペクチン、E 440i ペクチン、E 440ii アミド化ペクチン、E 442 アンモニウムホスファチド、E 444 ショ糖酢酸イソ酪酸エステル、E 445 ルートロジン(root rosin)のグリセロールエステル、E 450 ジホスフェート、E 450i 二リン酸二ナトリウム、E 450ii 二リン酸三ナトリウム、E 450iii 二リン酸四ナトリウム、E 450iv 二リン酸二カリウム、E 450v 二リン酸四カリウム、E 450vi 二リン酸二カルシウム、E 450vii 二リン酸二水素カルシウム、E 451 トリホスフェート、E 451i 三リン酸五ナトリウム、E 451ii 三リン酸五カリウム、E 452 ポリホスフェート、E 452i ポリリン酸ナトリウム、E 452ii ポリリン酸カリウム、E 452iii ポリリン酸ナトリウムカルシウム、E 452iv ポリリン酸カルシウム、E 460 セルロース、E 460i 微結晶性セルロース、E 460ii セルロース粉末、E 461 メチルセルロース、E 463 ヒドロキシプロピルセルロース、E 464 ヒドロキシプロピルメチルセルロース、E 465 メチルエチルセルロース、E 466 カルボキシメチルセルロース、E 469 酵素的に加水分解したカルボキシメチルセルロース、E 470a 脂肪酸のナトリウム塩、カリウム塩、およびカルシウム塩、E 470b 脂肪酸のマグネシウム塩、E 471 脂肪酸のモノおよびジグリセリド、E 472a 脂肪酸のモノおよびジグリセリドの酢酸エステル、E 472b 脂肪酸のモノおよびジグリセリドの乳酸エステル、E 472c 脂肪酸のモノおよびジグリセリドのクエン酸エステル、E 472d 脂肪酸のモノおよびジグリセリドの酒石酸エステル、E 472e 脂肪酸のモノおよびジグリセリドのモノおよびジアセチル酒石酸エステル、E 472f 脂肪酸のモノおよびジグリセリドの酢酸エステルと酒石酸エステルの混合物、E 473 脂肪酸のショ糖エステル、E 474 ショ糖グリセリド、E 475 脂肪酸のポリグリセロールエステル、E 476 ポリリシノール酸ポリグリセロール、E 477 脂肪酸のプロピレングリコールエステル、E 479 脂肪酸のモノおよびジグリセリドと相互作用させた熱酸化大豆油、E 481 ステアロイル-2-ラクチル酸ナトウム、E 482 ステアロイル-2-ラクチル酸カルシウム、E 483 酒石酸ステアリル、E 491 モノステアリン酸ソルビタン、E 492 トリステアリン酸ソルビタン、E 493 モノラウリン酸ソルビタン、E 494 モノオレイン酸ソルビタンまたはE 495 モノパルミチン酸ソルビタン。
安定化剤は食物の濃度および組成を保つ物質である。例としては、次のものが挙げられる：アスコルビン酸(E 300)、カルバミド(E 927b)、乳酸鉄(II)(E 585)、グルコン酸鉄(E 579)、グリセロールエステル(E 445)、レシチン(E 322)、メタ酒石酸(E 353)、ペクチン(E 440)、ショ糖酢酸イソ酪酸エステル(E 444)、および塩化スズ(II)(E 512)。
保存剤は食品を微生物の有害作用から防護することによって、食品の貯蔵寿命を延長する物質である。例としては次のものが挙げられる： E 200 ソルビン酸、E 201 ソルビン酸ナトリウム、E 202 ソルビン酸カリウム、E 203 ソルビン酸カルシウム、E 210 安息香酸、E 211 安息香酸ナトリウム、E 212 安息香酸カリウム、E 213 安息香酸カルシウム、E 214 p-ヒドロキシ安息香酸エチル/PHBエステル、E 215 エチルp-ヒドロキシ安息香酸ナトリウム/PHBエチルエステルナトリウム塩、E 216 p-ヒドロキシ安息香酸プロピル/PHBプロピルエステル、E 217 プロピルp-ヒドロキシ安息香酸ナトリウム/PHBプロピルエステルナトリウム塩、E 218 p-ヒドロキシ安息香酸メチル/PHBメチルエステル、E 219 メチルp-ヒドロキシ安息香酸ナトリウム/PHBメチルエステルナトリウム塩、E 220 二酸化硫黄、E 221 亜硫酸ナトリウム、E 222 亜硫酸水素ナトリウム/重亜硫酸ナトリウム、E 223 メタ重亜硫酸ナトリウム/重亜流酸ナトリウム、E 224 メタ重亜硫酸カリウム/亜硫酸カリウム、E 226 亜硫酸カルシウム、E 227 亜硫酸水素カルシウム、E 228 亜硫酸水素カリウム/亜硫酸水素カリウム、E 230 ビフェニル/ジフェニル、E 231 オルトフェニルフェノール、E 232 オルトフェニルフェノールナトリウム、E 233 チアベンダゾール、E 234 ナイシン、E 235 ナタマイシン、E 239 ヘキサメチレンテトラミン、E 242 二炭酸ジメチル、E 249 亜硝酸カリウム、E 250 亜硝酸ナトリウム、E 251 硝酸ナトリウム、およびE 252 硝酸カリウム。
本発明の関連で、固化防止剤は、天然のまたは合成の物質であって、粒子が互いに凝集および付着することを防止することによって、食品の流動性(flowability)を増大させるものである。例としては次のものが挙げられる：E 530 酸化マグネシウム、E 535 フェロシアン酸ナトリウム、E 536 フェロシアン酸カリウム、E 541 酸性リン酸アルミニウムナトリウム、E 551 二酸化ケイ素、E 552 ケイ酸カルシウム、E 553ai ケイ酸マグネシウム、E 553aii 三ケイ酸マグネシウム(アスベスト不含)、E 553b タルク(アスベスト不含)、E 554 ケイ酸アルミニウムナトリウム、および E 556 ケイ酸アルミニウムカルシウム。
本発明の関連で、調味料とは、天然のまたは合成の物質で食品の風味を和らげるまたは強めることのできる物質である。そのようなものには香料も含まれる。例としては次のようなものが挙げられる：E 620 グルタミン酸、E 621 グルタミン酸一ナトリウム、E 622 グルタミン酸一カリウム、E 623 ジグルタミン酸カルシウム、E 624 グルタミン酸モノアンモニウム、E 625 ジグルタミン酸マグネシウム、E 626 グアニル酸、E 627 グアニル酸二ナトリウム、E 628 グアニル酸二カリウム、E 629 グアニル酸カルシウム、E 630 イノシン酸、E 631 イノシン酸二ナトリウム、E 632 イノシン酸二カリウム、E 633 イノシン酸二カルシウム、E 634 5-リボヌクレオチドカルシウム、E 635 5-リボヌクレオチド二ナトリウム、E 640 グリシン、およびE 650 酢酸亜鉛。
1実施形態においては、本発明で用いる調製品は助剤を含むことができる。本発明で用いる助剤とは、製品の性質、例えば粉化挙動、流動性、水分吸収能、および保存安定性などを改善するのに役立つ物質を指す。助剤は糖類、例えば乳糖もしくはマルトース-デキストリンなどをベースとしたもの、穀類もしくはマメ類、例えばコーンコブミール、小麦ふすま、および大豆ミールなどをベースとしたもの、無機塩をベースとしたもの、とりわけカルシウム塩、マグネシウム塩、ナトリウム塩、またはカリウム塩、およびD-パントテン酸またはその塩(化学的にまたは発酵により製造されたD-パントテン酸塩)であることができる。
さらに別の1実施形態においては、本発明で用いる調製品は担体を含むことができる。適切な担体は「不活性な」担体物質、すなわち、本発明の調製品中に用いられている成分と有害な相互作用を示さない物質である。担体物質は助剤としての各用途、例えば、食品や動物の飼料中で安全でなければならないことは明らかである。適切な担体物質は無機の担体のみならず有機の担体もある。適切な担体物質としては次のものが挙げられる：低分子量の無機または有機化合物、および比較的高分子量の天然または合成起源の有機化合物。適切な低分子量の無機の担体の例としては、塩類、例えば塩化ナトリウム、炭酸カルシウム、硫酸ナトリウム、および硫酸マグネシウム、ケイ藻土もしくはケイ酸、またはケイ酸誘導体、例えば二酸化ケイ素、シリケート、もしくはシリカゲルが挙げられる。適切な有機の担体の例としては、特に糖類、例えばブドウ糖、果糖、ショ糖、およびデキストリンならびにデンプン製品が挙げられる。比較的高分子量の有機の担体の例としては、デンプン、およびセルロース調製物、例えば特にトウモロコシデンプン、コーンコブミール、米粉の外皮（ground rice hulls)、セモリナ麦のフスマ、もしくは穀粉、例えばコムギ、ライムギ、オオムギ、およびオーツムギの粉もしくはフスマ、およびそれらの混合物が挙げられる。
本発明の使用調製品はさらに別の成分、担体、および助剤を混合して含むことができる。
前記調製品中の共役リノール酸の重量分率は広範囲に変えることができ、通常は選択した適用分野(例えば家畜の畜産、家畜の飼育、またはヒトの栄養)からの実際的な考察に従って適応される。
調製品は最も単純には成分を混合することによって製造される。同様に、これらは個々の成分の溶液を混合し、その後、適切な場合には溶媒を除去することによって製造することができる。
様々な成分の混合物は互いに任意の重量比で存在することができる。
混合物の最も単純な形態は、成分をミキサー中に一緒に入れることである。そのようなミキサーは当業者には既知であり、例えば、Ruberg社(vertical twin-shaft mixer(type HM(10-50 000L))、ring-layer mixer-pelletizer(type RMG)、continuous agglomerator dryer(type HMTK)、vertical single-shaft mixer(type VM(10-50 000L))、container mixer(type COM(50-4000L)が挙げられる。さらに別のミキサーがLodige社、Drais社、Engelsmann社から入手することができる。これらのミキサーはバッチ式または連続的に作動させることができる。バッチ式のミキサーでは、通常は混合する全ての成分が所望の比率で投入された後、数分間から数時間の適切な時間をかけて混合される。混合時間と混合の強さは、構成が混合物中で均一な分布となるように特定される。連続的混合の場合には、成分は連続的に添加され、適切な場合にはプレミキシング後に添加される。連続ミキサーでは、滞留時間および混合の強さは、成分が混合物中で均一な分布となるように選択される。連続的混合の場合には混合時間がより短いことが多く、混合の強さはバッチ式の混合よりも強い。混合は慣用的に室温で行われるが、用いる物質によってはより高い、またはより低い温度で行うこともできる。
好ましい1実施形態においては、調製品は固体形態である。用途の条件によっては、調製品は平均粒子径が10μmから5000μmの、好ましくは平均粒子径が20μmから1000μmの粉末とすることができる。
得られた粉末製品の粒子径分布はMalvern Instruments GmbH製の装置であるMastersizer Sで調べることができる。
成分の混合物は、純粋にブレンドしたものとすることが可能であり、すなわち各物質は、適切な場合にはさらに添加剤を添加して、所望の粒子径と濃度比で混合され、それらの物質はさらに、必要に応じて例えばコーティングすることによって保護することもできる。さらに、芯鞘型構造（すなわち1種の成分が芯として内部にあり、別の成分が鞘として外側にあるか、またはその逆である構造）を用いることができる。当然のことながら、これらの構造をとる場合には、さらに必要があればコーティングを施すことができる。また、各物質をともに担体物質または防護コロイドの共有マトリクス(shared matrix)中にカプセル化することも考えられる。これらの例は当業者には既知であり、例えば、R.A. Morten, Fat-Soluble Vitamins, Pergamon Press, 1970, pp.131-145中に記載されている。
粉末は、当業者に知られる結晶化、沈殿、乾燥、ペレット化、または凝集法で、または現行の教科書中に記載されている固体形成のためのその他の方法で、製造することができる。
食品中に組み入れるCLAの正確な量は、その食品の意図している用途、用いるCLAの形態、および摂取経路によって異なる。また、その量は異性体の比率に依存しうる。しかし、前記食品は、その食品の重量比で、約0.05から約1%、または約0.1%から約0.9%、または約0.2%から約0.8%、または約0.3%から0.7%、または0.4%から0.6%のCLA当量を含むようにする。別の1実施形態においては、前記食品は、その重量比で、約1から約10%、または約2%から約8%、または約3%から約7%、または4%から約6%のCLA当量を含むようにする。CLA含量は1回の摂取量中の総カロリーに基づいたCLA量として、例えば100カロリーの摂取量あたり0.03から3 gのCLAなどと表現することもできる。あるいは、CLAの量は、食品中の脂質または脂肪に対するパーセンテージとして、例えば、食品中の脂質の0.3%から100%などと表現することもできる。
共役リノール酸を含有するのに適した別の飼料および/もしくは食品については米国特許第6,042,869号(実施例2から9)および米国特許第5,760,082号(実施例2から5)中に記載されている。ここに引用した特許の内容は本明細書中に参照により組み入れる。
CLAの種々の製剤については他の特許に記載されている。欧州特許出願EP779033 A1（これは本明細書中に参照により組み入れる）は、0.05から20%(重量比)のCLA残留物を含有する食用のファット・スプレッドを開示している。その特許では、遊離脂肪酸の市販の混合物(リノール酸含量が95.3%)を、エチレングリコール中でNaOHによるアルカリ異性化に供した。遊離脂肪酸は、10量部のヤシ油およびリパーゼと混合することによってトリグリセリド中に取り込まれた。その混合物を45℃で48時間撹拌し、リパーゼと遊離の脂肪酸を除去した。この組成物70量部と29量部の水、0.5量部のホエータンパク質粉末、0.1量部の塩、および少量の香料とクエン酸(pH 4.5を得るため)を混合し、加工してファット・スプレッドを得た。その他の、安全で有効な量のCLAを含有している食品はPCT公開WO 97/46118(Cookら)中に開示されており、これは本明細書中に参照により組み入れる。その特許では、ヒトへの非経口投与用の液状食品で粒子径が約0.33〜0.5μmの粒子を含んでいるものが開示されている。この乳剤は0.5 mg/gmから10 mg/gmのCLA、または食品脂質をベースとした量で0.3%から100%のCLA、または100カロリーの摂取量あたり0.03gmから0.3gmのCLAを含んでいる。この出願は、類似の量のCLAを、2.66gmのタンパク質、5.46gmの脂肪、10.1gmの炭水化物、133gmの水、およびRDA(Recommended Daily Allowance)量のビタミンとミネラルを含有している粉ミルクも開示している。別の例として、高タンパク質、ビタミン、およびミネラルの栄養補助剤として有用な低残査(low-residue)の液状腸内栄養製品が開示されている。この栄養補助剤は製品の重量比で0.05%から5%、または含有脂質のうちの0.3%から約100%、または100カロリーあたり約0.03から0.3gmのCLAを含んでいる。さらに、ある代表的な製剤の140カロリーは、7.5gmの固形卵白、0.1gmのCLA、27.3gｍの炭水化物（ショ糖または加水分解したトウモロコシデンプンなど）、1.9gmの水、およびRDA量のビタミンとミネラルを含むことができる。
さらに本発明は、トランス-10,シス-12共役リノール酸イソメラーゼをコードする上述の核酸分子を発現するトランスジェニック微生物であって、該核酸分子が次の配列：
(i) 配列番号1に記載の配列を有する核酸分子、または
(ii) (i)に記載の核酸分子によってコードされるポリペプチドと機能的に等価なものに由来する配列、例えば、
e. 配列番号1に記載の配列の少なくとも50個、好ましくは少なくとも75個、より好ましくは少なくとも100個、特に好ましくは少なくとも125個、非常に特別に好ましくは少なくとも150個の連続した塩基対を有する核酸分子、または
f. 配列番号1に記載の配列の、少なくとも100、好ましくは少なくとも125、より好ましくは少なくとも150、特に好ましくは少なくとも175、非常に特別に好ましくは少なくとも200の連続した核酸塩基対の配列にわたって、少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、特に好ましくは少なくとも95%、非常に特別に好ましくは少なくとも98%の同一性を有する核酸分子、または
g. 配列番号1に記載の核酸分子の少なくとも50、好ましくは少なくとも100、より好ましくは少なくとも150、特に好ましくは少なくとも200、非常に特別に好ましくは少なくとも500の連続した塩基対の核酸断片と高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸分子、または
h. 配列番号2に示されたアミノ酸配列と少なくとも75%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、特に好ましくは少なくとも95%、非常に特別に好ましくは少なくとも98%の同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子、
によって特徴付けられ、その際、該核酸配列が好ましくはルーメンバクテリアから、より好ましくはメガスフェラ・エルスデニ（Megashera elsdenii）から、最も好ましくはメガスフェラ・エルスデニ（Megashera elsdenii）Y J-4から、またはプロピオニバクテリウム属（Propionibacterium）に属する微生物、好ましくはプロピオニバクテリウム・アクネス（Propionibacterium acnes）から単離されたものであり、該核酸分子が少なくとも1つの異種のプロモーター配列と機能しうる形で連結されたものである、トランスジェニック微生物に関する。
さらに好ましい1実施形態においては、本発明は、本発明のトランスジェニック微生物、好ましくは上述のラクトコッカス属（Lactococcus）、ラクトバシラス属（Lactobacillus）、プロピオニバクテリウム属（Propionibacterium）、エシェリキア属（Escherichia）、およびビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）からなる群から選択された属に属する微生物、より好ましくはビフィドバクテリウム・ブレベ（Bifidobacterium breve）、ビフィドバクテリウム・デンティウム（Bifidobacterium dentium）、およびビフィドバクテリウム・シュードカテヌラツム（Bifidobacterium pseudocatenulatum）からなる群から選択された微生物の、食品および飼料中のプロバイオティクスとしての使用に関する。
さらに、本発明は、上述の本発明の方法に従ってトランスジェニック微生物中に産生される発酵油に関する。好ましい1実施形態においては、前記発酵油は、発酵ブロスから単離されたもので、主としてトランス-10,シス-12オクタデカジエン酸および9,12-オクタデカジエン酸からなり、トランス-10,シス-12オクタデカジエン酸が、少なくとも20%、30%、40%、好ましくは少なくとも50%、55%、60%、より好ましくは少なくとも65%、70%、75%、特に好ましくは少なくとも80%、85%、90%、非常に特別に好ましくは少なくとも91%、92%、93%、94%、95%まで富化されている。脂肪酸画分、好ましくはCLA画分を精製するために、前記発酵油をさらに加工することができる(実施例参照)。
本発明はさらに、上述の本発明の方法で製造した発酵油の次のような使用に関する：
1. 米国特許第3,585,400号(Cookら)に記載されているように(本明細書中に参照により組み入れる)、1型またはIgE型過敏症によって媒介される動物のアレルギー反応を、CLAを約0.1から1.0%の濃度で投与して白血球数を維持することにより減弱させるための使用。この特許は、0.25%のCLAを含んだ飼料または対照の飼料を2週間与えられたモルモットを、過剰免疫のために2週目及び3週目に卵白アルブミンで免疫した。CLA摂取がアレルゲンに誘導される気管収縮に何らかの影響を及ぼすか調べるために超融合（superfusion)モデル系を用いた。CLAを飼料として与えたモルモットから得られた気管は対照のモルモットの気管よりも超融合系でより安定であった。アレルゲンをモルモットの気管に注入すると、CLAを飼料としたモルモットの組織では気管収縮の程度がより少なかった。CLAを飼料としたモルモットの白血球細胞数は対照のモルモットと比較して増加しており、対照のモルモットでの白血球数が2.4 x 106±0.3であったのに対し、CLAを飼料としたモルモットでは3.5 x 106±0.6であった。
2. 動物の体脂肪を低減させるための使用。米国特許第5,554,646号(Cookら)（参照により本明細書中に組み入れる）は、動物の体脂肪を低減させるためのCLAの使用を開示している。この方法では、体重の減少を生じさせるために十分な、安全でかつ有効な量のCLAが動物に飼料として与えられる。0.5%CLAを含有する飼料を与えられたマウスは、その飼料摂取期間の終わりの時点での総脂肪含量は、0.5%コーン油含有の飼料を摂取した対照のマウスでの脂肪含量より有意に低かった。体脂肪を低減させるために投与されるCLAの正確な量は、動物種、用いるCLAの形態、および投与経路によって異なる。通常はその量は動物の体重1kgあたり約0.001gから約1gの範囲である。
3. 動物の体重増加および飼料効率を高めるための使用。CLAのこのような栄養としての使用は米国特許第5,428,072号(Cookら)に開示されている。この特許では、動物に安全でかつ有効な量のCLAを飼料として与えると、その動物の体重増加および飼料効率が高められることが示されている。0.5%のCLAを補充した飼料を与えられたニワトリの群では、CLAを摂取したニワトリの方が試料摂取量が少なかったにも関わらず、0.5%のリノール酸を添加した飼料を与えられた対照のニワトリと同等の体重増加を示した。
4. 免疫刺激による食欲不振と体重減少の防止のための使用。成長の増進、免疫刺激(例えばエンドトキシンへの暴露)による食欲不振および体重減少の防止、ならびに異化ホルモン（例えばIL-1）の副作用の防止のためのCLAの使用は、米国特許第5,430,066号(Cookら)中に開示されている（参照により本明細書中に組み入れる）。0.5%のCLAを添加した飼料を与え、その後エンドトキシンを注射してチャレンジしたニワトリは、エンドトキシンバクロ後に、対照の飼料を与えられた群では体重増加が見られなかったのに対し、CLA群では体重増加が認められた。同様な結果が0.5%のCLAを含有する飼料を与えたラットと0.5%のコーン油を含有する対照の飼料を与えたラットとの比較において得られた。開示される調製品と投与量の範囲は、米国特許第5,554,646号中に開示されたものと同一であった。
5. 動物でCD-4細胞およびCD-8細胞のレベルを維持または上昇させるための使用。CD-4細胞およびCD-8細胞のレベルを維持または上昇させるために、ならびに腫瘍壊死因子(TNF)の産生もしくは体外からの投与、またはウイルスに起因する動物の有害作用を防止または軽減するために動物を治療する方法であって、その動物に安全で有効な量のCLAを投与することからなる前記の方法は、米国特許第5,674,902号(Cookら)中に開示されている（参照により本明細書中に組み入れる）。マウスに対照の飼料または0.5%のCLAのいずれかを与えた後、TNFの注射でチャレンジした。CLAを摂取したマウスでは対照のマウスより体重減少が少なかった。同様に、0.5%CLAの飼料を与えられ、その後に弱毒化した生きた鳥類ポックスウイルスを飛膜(wing web)に注射してチャレンジしたニワトリでは、対照の飼料を与えられたニワトリよりも体重増加が多かった。0.5%のCLA飼料を与えられたニワトリでは、対照の飼料を与えられたニワトリと比較して、CD-4細胞およびCD-8細胞％が顕著に上昇した。
6. 動物の血液中脂質プロフィールを改善するための使用。欧州特許出願779,033 A1(Lievenseら)（参照により本明細書中に組み入れる）は、血液中の脂質プロフィールを改善するためのCLAの使用を開示している。簡潔に記せば、ハムスターにその総カロリーの1.5%の比率でトリグリセリドに組み入れたファット・スプレッド形態のCLAを含有する飼料を与えた。CLAを与えたハムスターでは、総コレステロールの低下、HDLコレステロールの低下、およびLDLコレステロールの低下が認められた。
7. 癌治療用の医薬品または治療剤の製造のための使用。L.ラクティス（lactis）およびE.コリ（coli）によって産生された発酵油のヒトSW480癌細胞に対する抗増殖作用を、本発明の発明者が調べ、その結果は、t10,c12CLA異性体の癌細胞に及ぼす細胞傷害作用を明確に示している。t10,c12CLAによる細胞増殖阻害は用量依存性で、t10,c12CLAが20μg/mLの濃度で最も強い細胞傷害性が見られた。L.ラクティス（lactis）のt10,c12CLAは大部分の癌細胞を殺滅し、最も高い濃度(20μg/mL)で処理した場合には生存細胞は8%未満であったが、これに対して対照のエタノールでは殺滅が見られず(=100%)、大腸菌(E.coli)によって産生された発酵t10,c12CLAとともにインキュベートすると約20%まで細胞数の低下が見られた。CLA異性体は、SW480細胞で細胞の生存性の低下し、アポトーシスを刺激することがこれまでに報告されている。Millerら(2002)の研究では、t10,c12CLA異性体は最も強力な異性体で、c9,t11CLAでは生存細胞を40〜52%減少させたのに対し、47〜61%減少させた。CLAはMCF-7乳癌細胞株の増殖を阻害することも示されている(Schultzら, 1992；O'Sheaら, 1999)。MCF-7細胞を20μg/mLのt10,c12CLA異性体で8日間処理すると、細胞数の15%の減少が観察されたが、同じ量のc9,t11CLA異性体は、同じ条件で細胞の生存性を60%減少させた(O'Sheaら, 1999)。別の研究では、t10,c12異性体は、16μg/mLを用いて4日間インキュベートした後、SW480およびMCF-7細胞株の双方において、50〜60%生存率を減少させた(Millerら, 2001)。これに対して、同じ量のリノール酸はSW480細胞の生存率を23%増加させた。未発酵の対照リノール酸および純粋なリノール酸(Sigma)は細胞生存率に対してわずかな作用のみを有した。
医薬品および治療剤は、動物、好ましくはヒトの、アレルギー反応、体脂肪の増加、免疫刺激に起因する食欲不振および体重減少、血液脂質プロフィール、および癌の予防のみならず、治療にも用いられる作用剤を意味している。
例えば、アレルギー反応、体脂肪の増加、免疫刺激による食欲不振および体重減少、血液脂質プロフィール、および癌の治療では、前記調製品は、当業者に一般的に知られ、かつ適切な様式で製剤化することができ、慣用の技術を使用することによって医薬剤形の製造に使用することができる。そのような技術については、例えば"Remington's Pharmaceutical Science Handbook", Mark Publishing Co., New York, USA, 第17版, 1985中に記載されている。そのような医薬剤形または食品添加物は、液剤、粉末剤、プレミックス(premix)、錠剤、カプセル剤、または懸濁剤であることができる。
製薬に用いる量は、通常はヒトの摂取量として約1,000 ppmから約10,000 ppmのCLAの範囲であろう。しかし、用いることのできる上限量は、CLAに毒性がないので、重要ではない。この用途やその他の用途のためのCLAも様々な形態で調製することができる。これらは医薬希釈剤および活性エステルと組合せたCLAの非毒性のナトリウムまたはカリウム塩を含む。CLAはまた、動物の飼料やヒトに摂取される食品中に直接的に組み入れて、動物またはヒトの食品の重量の約0;01%から2%以上となるようにすることができる。
配列
1. 配列番号1
プロピオニバクテリウム・アクネス（Propionibacterium acnes）から単離したトランス-10,シス-12共役リノール酸イソメラーゼの核酸配列(受託番号CQ766028)
2. 配列番号2
プロピオニバクテリウム・アクネス（Propionibacterium acnes）から単離したトランス-10,シス-12共役リノール酸イソメラーゼのアミノ酸配列(受入番号CQ766028)
3. 配列番号3
PCRプライマーERcoPAI1の核酸配列
Figure 2009521213
4. 配列番号4
ERcoPAI2の核酸配列
Figure 2009521213
5. 配列番号5
ベクターpNZ44-coPAIの核酸配列
実施例
下記の実施例は本発明の特定の好ましい実施形態および態様を示しさらに説明するために提示するものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
下記の実験の開示において(および本発明についての上記所与の記載において)、下記の略号を用いる：M(モル濃度)；mM(ミリモル)；μM(マイクロモル)；nM(ナノモル濃度)；mol(モル)；mmol(ミリモル)；μmol(マイクロモル)；nmol(ナノモル)；gm(グラム)；mg（ミリグラム）；μg(マイクログラム)；pg(ピコグラム)；L(リットル)；mL(ミリリットル)；μL(マイクロリットル)；cm(センチメートル)；mm(ミリメートル)；μm(マイクロメートル)；nm(ナノメートル)；℃(摂氏温度)；MQ(milli-Q水；電気抵抗が18.2オームの純水を提供するためにさらに揮発性物質が除去された脱イオン水)；PSI(ポンド/平方インチ)；cDNA(コピーDNAまたは相補的DNA)；DNA(デオキシリボ核酸)；ssDNA(一本鎖DNA)；dsDNA(二本鎖DNA)；dNTP(デオキシリボヌクレオチド三リン酸)；RNA(リボ核酸)；PBS(リン酸緩衝化生理食塩液)；OD(光学密度)；HEPES(N-[2-ヒドロキシエチル]ピペラジン-N-[2-エタンスルホン酸])；HBS(HEPES緩衝化生理食塩液)；SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)；Tris-HCl(トリス[ヒドロキシメチル]アミノメタンハイドロクロライド)；DMSO(ジメチルスルホキシド)；EGTA(エチレングリコール-ビス(β-アミノエチルエーテル)N,N,N',N'-四酢酸)；EDTA(エチレンジアミン四酢酸)。
実施例１：培養および培地
ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）NZ9800(ナイシンを産生しないnisA遺伝子に欠失があるのでナイシンを産生できず、かつnisRKシグナル伝達遺伝子が染色体中に組み込まれているL.lactis NZ9700誘導体)をグルコース含有(0.5% w/v)のM17(Difco laboratories, Detroit, Michigan, USA)ブロスおよび/もしくは寒天中、30℃で培養した。プロバイオティック株であるラクトコッカス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）亜種のパラカゼイ（paracasei） NFBC 338(Lb. paracasei NFBC 338)は、以前にヒトの胃腸管(GIT)から単離されたもので、University College Cork, Irelandから厳格な物質移転合意書のもとに入手したものであった。Lb.パラカゼイ（paracasei）NFBC 338は、通常、一晩(約17時間)MRSブロス(Oxoid Ltd., Hampshire, UK)中で培養し、嫌気的条件下、Anaerocult Aガスパック(Merck, Darmstedt, Germany)を収めた嫌気ジャーを用いて37℃でインキュベートした。プラスミドpNZ44を保持するL.ラクティス（lactis）は、選択マーカーとしてのクロラムフェニコール(5μg/mL)の存在下で通常通り培養した。ベクターpMSP3535を保持するLb.パラカゼイ（paracasei）NFBCは、選択マーカーとしてのエリスロマイシン(10μg/mL)とともに通常通り培養した。プラスミドpNZ44を保持するE.コリ（coli）TOP 10(Invitrogen)は、クロラムフェニコール(20μg/mL)を補充したLB(Luria-Bertani)培地中で培養した。ヒト結腸癌細胞はAmerican Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA, USA)から入手した。t10,c12CLA異性体(純度98%+)はMatreya(Matreya Inc., PA, USA)から入手した。特に断らない限りは、細胞培養培地および添加剤はSigma Aldrich Ireland Ltd.(Dublin, Ireland)から購入した。SW480細胞は5%(v/v)ウシ胎児血清、0.2mM L-グルタミン、1mM HEPES、および1ユニット/mLのペニシリンおよびストレプトマイシンを補充したDulbecco's Minimum Essential Medium(DMEM)中で維持した。SW480細胞は96ウェルプレート中37℃で、要求されている95%空気と5%CO2の気流による加湿空気下、pH7.2〜7.4で維持した。
実施例２：DNA操作
オリジナルの構築物pC33.1-coPAI(植物のベクター中にリノール酸イソメラーゼ遺伝子を含む；BASF, Germany)からt10,c12共役リノール酸を産生させるための完全長のリノール酸イソメラーゼ(coPAI)遺伝子を増幅するために、2種類のオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。ERcoPAI1と名付けた正方向プライマー(配列番号3)は、PstI制限部位およびリボソーム結合部位(RBS)を含んでおり、4つの余剰塩基を5'末端に、7つの余剰塩基をRBSと前記遺伝子の開始部位との間に含んでいる；
Figure 2009521213
ERcoPAI2と名付けた逆方向プライマー(配列番号4)は、KpnI制限部位および3つの余剰塩基を5'末端に含んでいる；
Figure 2009521213
1278 bpのcoPAI遺伝子をEppendorf Masercycler Gradient(Eppendorf)中で、High Fidelity Expandを供給会社(Roche Diagnostics Limited, East Sussex, England)の記載のとおり用い、鋳型として200ngのプラスミドDNA(pC33.1-coPAI)を用いて増幅した。ＰＣＲ反応は、1μLの各プライマー、3mM MgCl2、5μLの10 x Expandバッファー、1μL dNTP、および0.75μLのExpand DNAを含有する50μLの総量で行った。PCR条件は次のとおりとした；2分、15秒の変性(94℃)、30秒のアニーリング(55℃)、2分の伸長(72℃)を10サイクル、その後15秒(94℃)、30秒(55℃)、2分＋5秒/サイクルを20サイクル、最後に72℃7分を1サイクル。このPCR反応混合液を1%(w/v)アガロースゲル上で分析して得られたPCR断片を可視化した。プラスミドDNAをコリ（E.coli）TOP 10、L.ラクティス（lactis）NZ9800、およびLb.パラカゼイ（paracasei）NFBC338から単離するために、Qiagen Plasmid Mini kit(Qiagen, West Sussex, UK)を用いたが、L.ラクティス（lactis）とLb.パラカゼイ（paracasei）については1つの小さな変更、すなわちバッファーP1に40mg/mLのリゾチームを添加し、37℃で20分間(L.ラクティス（lactis）)および2時間(Lb.パラカゼイ（paracasei）)インキュベートしたことを含んだ。PCR産物はQiaquick PCR Purification Kit(Qiagen)を用いて精製した。2種類のプラスミドpNZ8048(PnisAプロモーターを含むナイシン誘導性プラスミド)およびpNZ44(pNZ8048の誘導体で、PnisAプロモーターが、構成的L.ラクティス（lactis）染色体プロモーターであるP44で置換されている)、ならびに、coPAI遺伝子断片をPstIおよびKpnIで制限消化した後、連結反応を15℃でT4 DNAリガーゼを供給会社(New England Biolabs, MA, USA(NEB)の記載のとおり用いて行った。構築物は図1に示している。組換えプラスミドは同一の酵素で二度消化して正しいクローンであることを確認した後、L.ラクティス（lactis） NZ9800にエレクトロポレートした。正しい配列であることを確認した後、その遺伝子をpNZ8048-coPAIからPstIおよびXbaI制限酵素を用いて切り出し(図1)、ラクトバシラス（Lactobacillus）のナイシン誘導性ベクターpMSP3535の同じ部位中に連結した。エレクトロコンピテントなL.ラクティス（lactis）をde Ruyterらが報告している方法に従って調製しかつ形質転換し、エレクトロコンピテントなLb.パラカゼイ（paracasei）NFBC 338細胞は3.5X SMEB(1Mショ糖、3.5mM MgCl2)を用いてLuchanskyらの報告しているとおりに調製した。配列分析はDNAStarソフトウェア(DNAStar, Madison, Wisconsin, USA)を用いて行った。
実施例3：CLA産生のスクリーニング
シス-9,トランス-11およびトランス-10,シス-12CLAの標準品はMatreya(Matreha Inc., PA, ISA)から購入し、リノール酸はSigma(Sigma Chemical, MO, US)から購入した。L.ラクティス（lactis）、Lb.パラカゼイ（paracasei）、およびE.コリ（coli）のクローンを遊離のリノール酸(0.1〜0.5mg/mL)をトランス-10,シス-12CLAに変換する能力について、次のとおり調べた；一晩培養物の1%接種物を10 mLのブロスに移し入れ、培養液がOD600nm 約0.5となるまでインキュベートした。次いで、リノール酸(0.1〜0.5mg/mL)を培養液に添加し、誘導性培養物を30〜50ng/mLのナイシン(2.5%(w/v)のナイシンを含む乳固形分(milk solid)から調製したもの、Sigma N-5764)で誘導させた後、さらに48〜72時間インキュベートした。時間実験にかける培養物はより多量のブロス中で増殖させ、10mLのサンプルを12時間毎に採取した。48〜72時間のインキュベーション後にその培養液を遠心分離し、脂肪酸を上清から抽出し、窒素流のもとで乾燥させた後、既に報告されているとおりに(Coakleyら, 2003)、メチル化し、ガス液体クロマトグラフィー(GLC)で分析した。パーセンテージで表した変換率は全て、培養物を含む条件と同じ時間、培養物なしにインキュベートした後に培地から回収及び抽出されたリノール酸の量（利用可能なリノール酸の100％を表す）に関連している。
実施例4：発酵油の調製
E.コリ（coli）pNZ44-coPAIおよびL.ラクティス（lactis）pNZ44-coPAIクローンを500 mLの各培地中に接種し(1%一晩培養物)、OD600=0.5まで増殖させた後、リノール酸(0.5 mg/mL)を添加し、インキュベーションを72時間続けた。リノール酸(0.5 mg/mL)を含有する未接種の培地からなるリノール酸対照も調製し、37℃で72時間インキュベートした後、脂肪酸を抽出した。対照のサンプルは各発酵物から3重に調製し、未発酵のリノール酸対照品も、既に報告されているとおりに(Coakleyら, 2003)、メチル化し、GLCで分析して、サンプル中に存在するCLA/リノール酸の比を計算した。
実施例5：発酵油のヒトSW480結腸癌細胞に及ぼす抗増殖活性
リノール酸（0.5mg/ml）を含有する各培地中で培養物(L. ラクティス（lactis）pNZ44-coPAIおよびE.コリ（coli）pNZ44-coPAI)を発酵した後に抽出した油の抗増殖活性を調べるために、ヒト結腸癌細胞SW 480を種々の濃度の発酵油の存在下で培養した。まず1x104個の細胞をウェルに蒔き、37℃で24時間培養して細胞を表面上に付着させた後、5〜20μgのt10,c12CLA(発酵油、およびエタノール中のt10,c12CLA標準品から)およびリノール酸(対照の未発酵油およびSigmaの標準品)5〜25μg/mL培地で処理した。L.ラクティス（lactis）とE.コリ（coli）の双方から得た発酵油は、リノール酸とt10,c12CLAの混合物（約1.35：1の比）で含んでいた。対照のフラスコにはエタノールを補充して最終濃度を0.1%(v/v)とした。5日間インキュベートした後、細胞の生存率を測定し、相対細胞数をMTS法(Promega Corporation, Madison, WI, USA)（これは増殖中の生細胞数を求めるための比色法、または、MTSテトラゾリウム化合物とともにインキュベーションした後の細胞傷害性アッセイである）を用いて測定した。MTSとともに2時間インキュベートした後、96ウェルプレートリーダーを用いて492nmで吸光度を記録した。処理後の細胞の生存率(%)はエタノール対照（100%を表す）と相対的に表す。t10,c12CLA標準品(Matreya)（2回を3重に行った）を除いて各処理について3つの独立した実験を3重に行い、各処理間の有意差はStudentのt検定を用いて調べた(p<0.001)。
実施例6：配列分析
プロピオニバクテリウム・アクネス（Propionibacterium acnes）からの1278bp遺伝子(登録番号CQ766028)は、t10,c12CLA産生のための425個のアミノ酸のリノール酸イソメラーゼタンパク質をコードする(配列番号1)。このイソメラーゼの分子量は49,077Daである。データベース中の配列との比較は、クローニングしたイソメラーゼタンパク質がアミノオキシダーゼとして知られているタンパク質とその配列の大部分にわたってかなりの相同性を示すことを明らかにした(〜aa25-400；NCBO Conserved Domain Search, Marchler-Bauerら, 2005)。このイソメラーゼはプロピオニバクテリウム・アクネス（Propionibacterium acnes）からの推定アミノオキシダーゼ(登録番号Q6A8X5_PROAC;EXPASY/UniProtKBデータベース)と96%の同一性を示したが、その次のベストマッチのタンパク質である植物オリザ・サティバ（Oryza sativa）(ジャポニカ（japonica）栽培品種群、登録番号Q7XR12_ORYSA;EXPASY/UniProtKBデータベース)とはアミノ酸145〜423にわたってわずかに26%の同一性を示した。整列させた領域には、それらのタンパク質のフラビン結合部位が含まれている。フラビン含有アミンオキシダーゼファミリーはフィトエンヒドロゲナーゼおよびその関連酵素をさらに含んでいる。アミノ酸残基10〜39の間の領域に位置しているNAD/FAD結合ドメインが同定された(PROSITEデータベース)。このイソメラーゼタンパク質は可溶性で、タンパク質の位置としては細胞質内と予測されている(PSORTb, British Columbia, Canada; SOSUI, Mitaku Group, Tokyo, Japan)。a.a.10-26にかけて推定膜貫通ヘリックスが検出された(HMMTOP;Tmpred)。しかし、種々のデータベースから得られた結果の間に明確な一貫性がないので、これらの結果はかなり相反するものである。a.a.1-23の間に推定シグナルペプチドが同定されたInterProScan(European Bioinformatics Institute, Cambridge, UK)除き、シグナルペプチドは検出されなかった。
実施例7：リノール酸の生物変換
pNZ44-coPAI構築物を保持しているL.ラクティス（lactis）は、ベクターpNZ44のみを含むL.ラクティス（lactis）の対照培養物（CLAへの変換は検出されなかった）と比較して、遊離のリノール酸をt10,c12CLAへと変換することを示した(表1)。L.ラクティス（lactis）pNZ44-coPAIは遊離のリノール酸の50%超程度をt10,c12CLAへと変換した(表1、図3)。L.ラクティス（lactis）が最初にリノール酸（0.4〜0.5mg/ml）と共にインキュベートされる場合に十分に増殖しないと考え、リノール酸は培養液がOD600=0.5となったときに添加した。この時点で、培養物は依然としてリノール酸に対する感受性をこの濃度で示していた。遊離のリノール酸の濃度をより低くすると(0.1および0.2mg/mL)、CLAへの変換率はより大きくなることが観察された。lactobacilliベクターとcoPAI遺伝子とを含むLb.パラカゼイ（paracasei）NFBC 338（pMSP3535-coPAI）は、OD600=0.5の時点で50ng/mLのナイシンで誘導し、リノール酸(0.5mg/mL)と48時間インキュベートした後、リノール酸(培養物なしにインキュベートした後に対照培地で回収されたもの)のほぼ30%を変換した。しかしLb.パラカゼイ（paracasei）NFBC 338 pMSP3535-coPAIの非誘導細胞によるt10,c12CLA産生は、誘導細胞によって得られたものと近いことを示し、ナイシンで誘導した培養では28.9%であったのに対し24.4%であった。pNZ44-coPAI構築物を含むE.コリ（coli）細胞は、リノール酸(0.5 mg/mL)の存在下で72時間インキュベートした後、回収された対照LAの約40%を変換したが、E.コリ（coli）pNZ44（対照ベクター）ではCLAは全く産生されなかった(表1、図2および4)。
Figure 2009521213
実施例8：微生物からの脂質の単離
ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）株を500mLのcys-MRS(0.05%(w/v)(L-システインヒドロクロリド(純度98%、Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo, USA)をMRS培地中に添加)中で0.5mg/mLのリノール酸(Sigma Chemical Co.)を添加して増殖させ、基質の生物変換を評価した。リノール酸は2%(v/v)Tween 80を含有した蒸留水中の30mg/mLのストック溶液として添加した。このリノール酸ストック溶液はあらかじめ0.45mmのMinisartフィルターで除菌ろ過し、−20℃の暗所で保管していたものである。菌株を37℃で42時間、嫌気的にインキュベートした。インキュベーション後、細菌上清中の脂肪酸を次のとおり抽出した：450mLの細菌上清に、225mLのイソプロパノール(純度99%、Aikem Chemicals Ltd.,Cork, Ireland)を添加し、30秒間ボルテックスした。この混合物にヘキサンを添加し(最初に170mLを添加しボルテックス混合した後、さらに340mLのヘキサンを添加)、ボルテックスし、960x gで5分間遠心分離した。この結果得られた上清(脂質を含むヘキサン層)をガラスチューブに取り、窒素気流下、45℃でヘキサンを2〜3mLまで乾燥させた。脂質は−20℃、窒素下で保管した。細菌上清の脂肪酸組成とリノール酸のCLAへの変換レベルは、内部標準(C13:0 トリデカン酸(純度99%、Sigma Chemical Co.)を添加し、既に報告されているとおり(Stantonら, 1997)、メチル化し、ガス液体クロマトグラフィー(GLC)後に評価した。
実施例9：脂肪酸メチルエステル(FAME)の調製とGLC分析
ヘキサン中の脂質抽出物を、既に報告されているとおり(Stantonら, 1997)、酸触媒でメチル化した後GLCで分析した。
ヒマワリ油や大豆油などの油の中の遊離脂肪酸は、酸と塩基を触媒として2NメタノールKOH(Sigma Chemicals Co.)を用いて室温でメチル化した後に、得られた脂肪酸濃度との差として計算した。GLCは内部標準C13:0を基準として行った。FAMEの分離はChrompack CP Sil 88カラム(Chrompack, Middleburg, The Netherlands、内径100m x 0.25mm、膜厚0.20μm)で、キャリアーガスとしてヘリウムを37 psiの圧力で用いて行った。インジェクターの温度は10分間225℃の一定温度に保ち、検出器の温度は250℃であった。カラムオーブンは最初の温度を140℃で8分間とし、その後8.5℃/分で上昇して最終温度が200℃となるようにプログラムし、その温度を41分間保持した。集めたデータを記録し、Minichrom PCシステム(VG Data System, Manchester, UK)で分析した。トランス-10,シス-12CLA異性体は、CLA mix(Nu-Chek-Prep. Inc., Elysian, MN)を基準として保持時間から同定した。CLAへの変換％およびブロス中に残存するリノール酸は、用いた種々の培養物による接種及びこれらとのインキュベーション後にブロス中に存在するCLAとリノール酸の量を、インキュベーション前のスパイクドブロス（spiked broth）中に存在するリノール酸量で割ることによって計算した。
実施例10：上清の脂質抽出
CLAまたはLAのいずれか接種した培養液の10mLを15mL遠心管(Sarstedt, Numbrecht, Germany)に移した後、遠心分離をSanyo Mistral 2000R 遠心機を用いて、室温(20℃)で20分間、2197 x gで遠心分離した。上清4mLに0.75mgのC 13:0(トリデカン酸, Sigma, 純度99%)を内部標準として脂質抽出前に添加し、抽出は次のとおり行った：2mLのイソプロパノール(Aikem Chemicals Ltd.,Cork, Ireland、純度99%)および1.5mLのヘキサン(LabScan Ltd., Dublin, Ireland、純度99%)を上清に添加し、ボルテックス混合した後、さらに3mLのヘキサンを添加し、その混合物をボルテックスで再度混合した後、2197 x gで5分間遠心分離した。上層(脂肪酸を含有しているヘキサン層)を全てネジ蓋付きガラス試験管に移し、N2ガス下で乾燥させた。試験管は、GLC(ガス液体クロマトグラフィー)分析のための脂肪酸メチルエステル(FAME)の調製まで−20℃で保管した。GLCを行った後、結果はブロス1mLあたりの脂肪酸のmgとして計算した。
実施例11：ペレットの脂質抽出
上清を取り除いた後、10mLの増殖培地からの細菌細胞(ペレット)を、1mLの生理食塩液(0.137 M NaCl、7.0 mM K2HPO4、2.5mM KH2PO4)中に加えて再懸濁することによって洗い、ボルテックスで混合した後、3632 x gで30分間遠心分離した。上清を取り除いた後、ペレットを再度1mLの生理食塩液中に再懸濁し、その後、3632 x gで15分間遠心分離し、上清を再度取り除いた。その細胞を再度1mLの生理食塩液に再懸濁し、その液に0.75mgのC 13:0(上清について上述したもの)を内部標準として添加した後、GLC分析のためにFAMEを調製した。GLCを行った後、結果を十分に増殖させた培養液1mLからの脂肪酸のmgとして計算し、脂肪酸mg/mLとして表した。
実施例12：脂肪酸メチルエステル(FAME)の調製
酸を触媒としたメチル化（これは遊離の脂肪酸及びトリグリセリドが結合した脂肪酸の双方の誘導体化をもたらす）を下記のとおり行った：ネジ蓋付きガラス試験管中の上清およびペレットから抽出した脂質(上記節に記載される)をメタノール中の4%メタノールHCl(v/v)(Supelco Inc., Bellefonte, PA, USA)12mLに再懸濁し、ボルテックスで10秒間混合した。メタノールHCl中の脂質を、10分ごとにボルテックス混合しつつ60℃で1時間インキュベートした。ヘキサンを飽和させた水2mLおよび5mLのヘキサンを溶液に添加し、ボルテックスで30秒間混合した後、30分間静置した。次いでFAMEを含有している澄明な最上層を試験管に移し、ヘキサンを飽和させた水2mLを添加し、その溶液を再度ボルテックス混合し、30分間静置した。その後、最上層を新しい試験管に移し、この層に0.5gの無水硫酸ナトリウム(Sigma、純度99%)を添加してボルテックスで5秒間混合することによってメチル化反応を停止させた。1時間後、最上層を取り、GLC分析まで−20℃で保管した。
実施例13：GLC分析
遊離の脂肪酸は、炎イオン化検出器(FID)およびSeptun Programmable Injector(SPI)を装備したガス液体クロマトグラフ(GLC-Varian 3400, Varian, Harbor City, CA, USA)を用いて、脂肪酸メチルエステル(FAME)として分析した。脂肪酸の定量は内部標準(C 13:0)を基準として行った。脂肪酸の分離はChrompack CP Sil 88カラム(Chrompack, Middleburg, The Netherlands、内径100m x 0.25 mm、膜厚0.20m)で、キャリアーガスとしてヘリウムを33psiの圧力で用いて行った。インジェクターの温度は10分間225℃の一定温度に保ち、検出器温度は250℃であった。カラムオーブンは最初の温度を140℃で8分間とし、その後8.5℃/分で上昇して最終温度が200℃となるようにプログラムし、その温度を41分間保持した。
集めたデータを記録し、Minichrom PCシステム(VG Data System, Manchester, UK)で分析した。トランス-10,シス-12CLA異性体は、CLA標準品(Matreya, PA, USA)を基準として保持時間によって同定し、トランス-11,C18:1およびステアリン酸(SigmaChemical Co., St. Louis, MO, USA)はそれらの標準品を基準として同定した。CLA異性体のピークの補正係数を計算するために、内部標準C13:0を、次の式：CfI=(AIS x WtI)/(AI x WtIS)を用いて行った（この式でCfIは実際のCLA異性体の補正係数、AISは内部標準(C 13:0)の面積、AIはCLAピークの面積、WtIはCLA異性体の重量、およびWtISは内部標準の重量である）。CLAの量はmg/mLブロスで表した。個々の脂肪酸の応答係数は、C 18:0の面積に応答係数1.00を割り当て、これに対して相対的に計算した。ブロス中のCLAへの変換率(%)と残存リノール酸％は、用いた培養物で接種した後にブロス中に存在するCLAとリノール酸の量を、インキュベーション前のスパイクドブロス中に存在するリノール酸量で割ることによって計算した。パーセンテージで表した変換率は全て、培養物を含む条件と同じ時間、培養物なしにインキュベートした後に培地から回収及び抽出されたリノール酸の量（利用可能なリノール酸の100％を表す）に関連している。
実施例14：ヒト結腸癌細胞SW480に対する発酵油の抗増殖活性
L.ラクティス（lactis）pNZ44-coPAIおよびE.コリ（coli）pNZ44-coPAIによるリノール酸の発酵後に産生された油の抗増殖作用を調べるために、ヒト結腸癌細胞SW480を、リノール酸とt10,c12CLAの混合物（約1.35:1の比）からなる抽出された発酵油の存在下で培養した。37℃で72時間インキュベートした後にLBブロスから抽出した対照のリノール酸、リノール酸(Sigma、95%)、および純粋な合成t10,c12CLA異性体(Matrerya)もSW480細胞と共に培養して発酵油の効果対純粋な異性体の効果を比較し、さらに添加した油の濃度が、リノール酸が癌細胞に対して細胞傷害作用を示し始める濃度よりも低かったことも確認した。リノール酸はSW480癌細胞に対して42.8μg/mL培地(152.5μM)で抗増殖作用を有し、16.9μg/mL培地(60.2μM)でもわずかに増殖作用を有することが示されているので(Millerら, 2003)、リノール酸が細胞増殖を阻害する場合の閾値濃度を超えないように、5〜20μg/mL培地の濃度のt10,c12CLA(発酵油サンプル)(同じ油サンプル中の6.7〜27μgのリノール酸/mL培地と等価)を選択した。5〜20μg/mLのt10,c12CLAとの5日間のインキュベート後に、SW480癌細胞の増殖は、対照のリノール酸未発酵油と比較して有意に低減していた(p<0.001)。5〜20μg/mLのt10,c12CLAで処理した後の細胞生存率は、72.6%±13.6%(5μg/mL)〜7.9%±4.5%(20μg/mL)(L.ラクティス（lactis）CLA)、および80.7%±6.8%(5μg/mL)〜19.6%±11.8%(20μg/mL)(E.コリ（coli）CLA)まで低下しており、これに対して対照の非発酵LAは、99.1%±10.0%(5μg/mL)〜95.4%±7.8%(20μg/mL)の低下であった(図5および6)。リノール酸の最高濃度(25μg/mL)でインキュベートした後の細胞数は、癌細胞に対するわずかな抗増殖作用を有し、未発酵の対照リノール酸で処理した場合の細胞生存率は76%±18.4%、純粋な(95%)Sigmaリノール酸を用いた場合には細胞生存率は93.2%±20.8%であった。全ての図はエタノール対照＝100%細胞生存率と関連している。対照の油(未発酵のリノール酸)とL.ラクティス（lactis）およびE.コリ（coli）からの発酵油(t10,c12CLA)との間には全ての濃度で細胞生存率に有意な差が認められた(p<0.001)。対照のリノール酸(未発酵油)及び純粋なリノール酸での処理後の細胞生存率には有意差は認められなかった。同様に、E.コリ（coli）t10,c12CLA(発酵油)及び純粋なt10,c12CLA(Matreya)での処理後の細胞生存率には全ての濃度で有意差は認められなかった。しかし、10〜15μg/mLの濃度(p<0.001)及び20μg/mLの濃度(p<0.01)での処理（L.ラクティス（lactis）t10,c12CLA及び純粋なt10,c12CLA）間には、細胞生存率に有意差が認められた。
参考文献
Figure 2009521213
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pNZ44-coPAI構築物(配列番号5)。 L.ラクティス（lactis） pNZ44-coPAIおよびL.ラクティス（lactis） pNZ44(C)を0.2 mg/mLのリノール酸と共に72時間インキュベートした後の、上清(A)および膜(B)のGLCクロマトグラム。(D)t10,c12CLA標準品のGLCクロマトグラム。(E)構築物pMSP3535-coPAI(非誘導)およびpMSP3535(F)を保持するLb.パラカゼイ(paracasei) NFBC 338を0.5 mg/mLのリノール酸と共に48時間インキュベートした後の上清のクロマトグラム。(G)E. コリ（coli） pNZ44-coPAIおよびpNZ44(H)と共に0.5mg/ml LA中で72時間インキュベートした後の上清のGLCクロマトグラム。ピーク1＝リノール酸、ピーク2＝t10,c12CLA。 0.2 mg/mLのリノール酸（LA）と共に72時間インキュベートしたL. ラクティス（lactis） pNZ44-coPAIによる、膜中の脂肪酸蓄積およびCLA産生対LA使用率。培養物はOD600=0.5の時点でLA中でインキュベートした。 0.5 mg/mLのリノール酸（LA）と共に72時間インキュベートしたE.コリ（coli） pNZ44-coPAIによる、膜中の脂肪酸蓄積およびCLA産生対LA使用率。 5〜25μgの発酵油/脂肪酸/mL培地で処理したSW480細胞の、5日間のインキュベーション後の細胞生存率。データは対照のエタノール（100%と設定する）に対する％として表した。(A)LB培地から37℃で72時間のインキュベーション後に抽出したLA対照油のGLCプロフィールと、(B)LA対照油での処理後のSW480の細胞生存率。(C)0.5 mg/mLのLA中でL.ラクティス（lactis） pNZ44-coPAIを72時間増殖させた後のGM17培地のGLCプロフィールと、(D)L.ラクティス（lactis） t10,c12CLA(発酵油)で処理した後の細胞生存率。(E)0.5 mg/mLのLA中でのE.コリ（coli） pNZ44-coPAIの増殖後のLB培地のGLCプロフィールと、(F)E.コリ（coli）t10,c12CLA(発酵油)での処理後の細胞生存率。(G)純粋な合成t10,c12CLA異性体(Matreya)で処理した後の細胞生存率、および(H)リノール酸(Sigma)で処理した後の細胞生存率。対照の油(未発酵のリノール酸)と比較したとき、****は有意差(p<0.001)である値を示し、***は有意差(p<0.01)である値を示し、**は有意差(p<0.05)である値を示し、*は有意差(p<0.1)である値を示す。 種々の油/脂肪酸と共に5日間インキュベートした後の、ヒト結腸癌細胞SW840の顕微鏡所見。(A)リノール酸未発酵対照油、5μg/mL培地(倍率100x)、および(B)25μg/mL培地(200x)。(C)E.コリ(coli) t10,c12CLA(発酵油)、5μg/mL培地(100x)、および(D)20μg/mL培地(200x)。(E)L.ラクティス(lactis)t10,c12CLA(発酵油)、5μg/mL培地(100x)、および(F)20μg/mL培地(200x)。

Claims (20)

  1. (a) 微生物中にトランス-10,シス-12共役リノール酸イソメラーゼをコードする少なくとも1種の核酸分子を導入し、
    (b) (a)で得られたトランスジェニック微生物を培養し、
    (c) その培養液にリノール酸を添加することによってトランス-10,シス-12共役リノール酸の産生を誘導し、
    (d) その誘導した培養液を少なくとも12時間インキュベートし、
    (e) 培養培地および/もしくはトランスジェニック微生物から共役リノール酸を単離する、
    ステップを含む、トランス-10,シス-12共役リノール酸をトランスジェニック微生物中で産生させる方法。
  2. トランス-10,シス-12共役リノール酸イソメラーゼをコードする核酸分子が：
    i. 配列番号1に記載の配列、または
    ii. 配列番号1に記載の配列の少なくとも50個の連続した塩基対を有する配列、または
    iii. 配列番号1に記載の配列の少なくとも100個の連続した核酸塩基対の配列と少なくとも80%の同一性を有する配列、または
    iv. 配列番号1に記載の核酸分子の少なくとも50個の連続した塩基対の核酸断片と高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする配列、または
    v. 配列番号2に示されたアミノ酸配列と少なくとも75%の同一性を有するポリペプチドをコードし、かつトランス-10,シス-12共役リノール酸イソメラーゼをコードする配列
    によって特徴付けられる、請求項１に記載の方法。
  3. トランス-10,シス-12共役リノール酸イソメラーゼをコードする核酸分子がルーメンバクテリアから単離されたものである、請求項2に記載の方法。
  4. トランス-10,シス-12共役リノール酸イソメラーゼがメガスフェラ・エルスデニ（Megashera elsdenii）から単離されたものである、請求項3に記載の方法。
  5. トランス-10,シス-12共役リノール酸イソメラーゼをコードする核酸分子が、プロピオニバクテリウム（Propionibacterium）属に属する微生物から単離されたものである、請求項3に記載の方法。
  6. トランス-10,シス-12共役リノール酸イソメラーゼがプロピオニバクテリウム・アクネス（Propionibacterium acnes）から単離されたものである、請求項5に記載の方法。
  7. 請求項1記載のステップ(a)で用いられる微生物がラクトバシラス科（Lactobacillaceae）、ストレプトコッカス科（Streptococcaceae）、プロピオニバクテリア科（Propionibacteriaceae）、エンテロバクテリア科（Enterobacteriaceae）、およびビフィドバクテリア科（Bifidobacteriaceae）からなる群から選択された科に属するものである、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
  8. トランスジェニック微生物がラクトコッカス属（Lactococcus）、ラクトバシラス属（Lactobacillus）、プロピオニバクテリウム属（Propionibacterium）、エシェリキア属（Escherichia）、およびビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）からなる群から選択された属に属するものである、請求項7に記載の方法。
  9. トランスジェニック微生物がラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）、ラクトバシラス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）、およびエシェリキア・コリ（Escherichia coli）の種からなる群に属するものである、請求項8に記載の方法。
  10. リノール酸が、光学密度(OD600)が少なくとも0.1である微生物培養液に添加される、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
  11. リノール酸の生物変換率が10%より高い率である、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
  12. 共役リノール酸を豊富に含む飼料または食品の製造のための、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
  13. 共役リノール酸を豊富に含む栄養補助食品の製造のための、請求項12に記載の方法。
  14. 共役リノール酸が請求項1〜13のいずれか1項に記載する方法に従って製造されたものであることを特徴とする、共役リノール酸を豊富に含む飼料、食品、および栄養補助食品。
  15. 少なくとも1つの異種プロモーター配列と機能しうる形で連結されている、請求項2〜6のいずれか1項に記載のトランス-10,シス-12共役リノール酸イソメラーゼをコードする核酸分子を発現するトランスジェニック微生物。
  16. 食品および飼料中のプロバイオティックスとしての、請求項15に記載のトランスジェニック微生物の使用。
  17. 微生物がラクトコッカス属（Lactococcus）、ラクトバシラス属（Lactobacillus）、プロピオニバクテリウム属（Propionibacterium）、エシェリキア属（Escherichia）、およびビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）からなる群から選択された属に属するものである、請求項16に記載の使用。
  18. 微生物がビフィドバクテリウム・ブレベ（Bifidobacterium breve）、ビフィドバクテリウム・デンティウム（Bifidobacterium dentium）、およびビフィドバクテリウム・シュードカテヌラツム（Bifidobacterium pseudocatenulatum）からなる群から選択されたものである、請求項17に記載の使用。
  19. 請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法で製造される発酵油。
  20. 癌の治療用の医薬品の製造のための、請求項19に記載の発酵油の使用。
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