JP2022525177A - 安定細菌抽出物を作製するプロセス及び医薬としてのその使用 - Google Patents

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Abstract

本発明は、経時的な安定性が実質的に増加した新規な安定細菌抽出物調製物、新規なその調製方法、これらの新規な安定細菌抽出物に基づく医薬製剤、並びに感染及び/又は炎症及び/又は新生物及び/又は細菌叢異常に起因する急性及び慢性の免疫障害を処置及び/又は防止するための新規な投与経路及び送達デバイスに関する。【選択図】図１８

Description

［001］ 本発明は、経時的な安定性が実質的に増加した新規な安定細菌抽出物調製物、新規なその調製方法、これらの新規な安定化細菌抽出物に基づく医薬製剤、並びに感染及び/又は炎症に起因する急性及び慢性の免疫障害を処置及び/又は防止するための新規な投与経路及び送達デバイスに関する。
［002］ 感染及び炎症を処置するためにヒト対象に投与でき、より広範な投与経路、例えば経口、鼻内、気管内、肺内、経粘膜、局部及び頬側、並びに患者の疾患状態及び段階(急性段階、増悪など)に容易に適応できる、液体又は固体で、経時的に安定な医薬製剤の開発に対する興味が今までになく増加している。
［003］ 細菌感染は、多くの呼吸器系の状態にしばしば関与し、抗生物質処置が一般的である。このような疾患状態及び増悪の処置における抗生物質の有効性が論じられている。これらの過度の使用は、費用の増加及び微生物の抗生物質抵抗性の増加の可能性と関連している。
［004］ いくつかの細菌株に由来する抗原を含む細菌抽出溶解調製物は、これらの生物による感染に対する抵抗性を増加することが示されている。これらの細菌抽出溶解物がそれらの効果を発揮し得る様式は、多種多様であり、まだ完全に理解されていない。多数の細菌抽出物が、免疫賦活薬及び抗腫瘍薬として用いられている。例えば、カルメット・ゲラン桿菌(Bacillus Calmette-Guerin；ＢＣＧ)、多糖類、ベータ１,３グルカン、丸山ワクチン及びビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)、エル・ラクチス(L.lactis)、エル・ファーメンタム(L.fermentum)、エル・アシドフィラス(L.acidophilus)及びエス・ラクチス(S.lactis)の抽出物を挙げることができる。このような抽出物は、いくつかの様式で免疫系を刺激すると考えられている。ある重要な様式は、リンパ球を刺激し、成長させ、サイトカインを生成することである。このようなサイトカインの生成を誘導する能力は、免疫系に対して非常に強力な効果を有する。
［005］ 特に、上気道障害の処置及び/又は防止のために、本出願人は、いくつかの細菌抽出調製物の開発に既に成功している。この点について、なかでも米国特許第９,４６３,２０９Ｂ２号に記載されるような、頻繁に気道感染の原因であるいくつかの病原体からの細菌溶解抽出物である薬物Ｂｒｏｎｃｈｏ-Ｖａｘｏｍ(登録商標)を挙げることができる。Ｂｒｏｎｃｈｏ-Ｖａｘｏｍ(登録商標)は、気道感染、再発性気道感染、例えば急性気管支炎、慢性気管支炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患及び肺気腫の防止及び予防のための、経腸経口経路を介してカプセル剤、サシェ又はドロップとして投与される免疫賦活薬である。これは、培養ヒト末梢血単核細胞からのＴＮＦ-α及びインターフェロン-γの生成を増進して、肺胞マクロファージの活性化を導き、多核白血球が細菌を死滅させることを刺激することが示されている。本出願人は、ラクトバチルス細菌抽出物も開発し、これらの細菌溶解抽出物が、感染、アレルギー、自己免疫性疾患及び炎症の処置のために経腸経口経路を介してカプセル剤として投与された場合に、有効であったことを示した(国際出願ＷＯ２０１０/０２７３４４を参照されたい)。
［006］ 気道及び肺のような粘膜表面を吸入されたウイルス、細菌及び毒素に絶えず曝露することは、免疫系に対する試練を意味する。宿主がウイルス感染に曝露され、その後、死亡率の増加につながる微生物に重感染した場合には、状況はさらに悪化する。よって、インフルエンザ(Ｈ１Ｎ１など)、ヒトライノウイルス(ＨＲＶ)、ライノシンシティアルウイルス(rhinosyncitial virus；ＲＶ)、コロナウイルス(ＣｏＶ、ＳＡＲＳ-ＣｏＶ、ＭＥＲＳ-Ｃｏｖ、ＣＯＶＩＤ-１９など)へのウイルス感染後の細菌二次感染は、呼吸器系医療が直面する緊急の問題である。
［007］ 実験的に、多数のインビボ研究が、経腸経口経路により投与された細菌抽出物Ｂｒｏｎｃｈｏ-Ｖａｘｏｍ(登録商標)が、気道感染モデルにおいて保護をもたらしたことを証明している。ほとんどの研究は、固体剤形(凍結乾燥物)及び液体細菌抽出物を用いているが、安定性に限界がある。ヒト用量(７ｍｇ乾燥重量細菌抽出物、４０ｍｇの凍結乾燥物)を用いるこのようなインビボマウスモデルの例は、インフルエンザ感染後の二次細菌及び/又はウイルス感染からの保護を増進できたことを示した(Pasqualiら、Frontiers in Medicine 2014、1、41)。
［008］ さらに、脂質、糖類及びタンパク質が豊富な「ジャンクフード」に起因し、細菌叢調節不全を導く機能性細菌叢異常(dysbiosis)(Clarence M.ら、Abstract、March 30 9、2018-St-John University、Queens)は、Ｂｒｏｎｃｈｏ-Ｖａｘｏｍ(登録商標)をマウスに補うことにより、関連する続発症及び併存疾患を減少させるとともに、正常化された。
［009］ よって、数年にわたって、Ｂｒｏｎｃｈｏ-Ｖａｘｏｍ(登録商標)は、免疫防御を刺激して、一般的な気道障害及び関連する増悪を防止するために、固体剤形(カプセル剤又はサシェ)で、経腸経路を介して投与されてきた。経口投与のために設計及び開発されてきたこれらの細菌溶解抽出物の保護効果は、腸(腸管関連リンパ組織、ＧＡＬＴ)での免疫応答を開始する。これらの器官は、感知して、気道からの肺感染を防止及び治癒するために武装した肺に免疫細胞を送る。よって、細菌溶解物は肺に直接曝露されない。これに対して、経腸経口経路を「口周囲」の代替投与経路、例えば鼻内、経鼻、吸入、噴霧及び気管内経路に変えることにより、安定化細菌溶解物の抗感染効果は、感染が起こる肺細胞又は経鼻及び周囲の粘膜に対して直接生じると考えられる。粘膜組織に達するために好ましいその他の「口周囲」経路は、感染が頻繁に開始する舌下及び頬側である。
［0010］ 本発明によると、新規な細菌抽出物製剤が、これらの代替の口周囲投与経路のために開発され、よって、感染及び炎症の可能性があるより広い経路によりよく適合する。有害抗原と無害抗原の間を区別する粘膜の能力は、病原体に対する防御及び体の自己の炎症応答により引き起こされた損傷に対する保護において重要である。
［0011］ これらの細菌溶解抽出物は、しかし、固体の形、すなわちカプセル剤及びサシェにて経腸経口経路を介して一般的に投与されてきた。代替投与経路及び/又は代替医薬製剤に移るときの主な技術的困難の一つは、これらの細菌抽出物が、特に沈降物が出現して、いくらかの物理的不安定性を示すことである。これらの細菌抽出物のこのような物理的不安定性は、製造過程、調製及び保管中に実質的に問題となり、よって、代替医薬剤形及び/又は代替投与経路、例えば鼻内、肺、気管内、粘膜、経粘膜、局部、皮膚外用、頬側、舌下、経口、肺、気管支内又は肺内の開発のために制限要因となる。このままでは法的承認に著しく影響するので、これらの代替経路及び医薬剤形のために適切な安定製剤が、治療用細菌溶解物ベースの薬物製品の成功のために不可欠である。
［0012］ よって、これらの細菌抽出物の凝集及び沈殿のいずれの問題にも対処し、改良された安定で可溶性の細菌抽出物を提供することが、製造過程の解決を改善するため、そしてより広範な投与経路及び代替医薬剤形を可能にするために重要であった。
［0013］ 重要なことに、新規な安定細菌抽出物製剤は、今回、口周囲又は経口投与のために適切な特定の送達デバイス、特に使用者にやさしい送達デバイス、例えばエアロゾル、経鼻スプレー、ネブライザー、ペンを用いてより正確な投与量で投与できるので、処置の遵守及び患者の簡便性が増加する。別の実質的な利点は、新規で安定な細菌抽出物は、液体の形で、経口経路を介して、錠剤又はカプセル剤を嚥下できない患者、例えば、特に３か月齢から６歳までの間の幼児、小児、並びに成人、例えば嚥下が困難なある程度の高齢者により容易に投与できる。細菌抽出物の代替製剤、例えばエマルジョン、マイクロエマルジョン、分散剤、クリームなどを、局部又は皮膚外用の種類の投与経路のために構想できる。
［0014］ 最後に、新規な安定細菌抽出物は、低温及び室温にて沈殿しない。細菌抽出物医薬は、よって、そのままで、通常の条件下で、患者又は薬局により保存及び保管でき、いずれの薬物送達デバイスも詰まる危険性がないので、正確で精密な用量の細菌抽出物の投与が可能になる。このような安定細菌抽出物は、また、製造過程中又は最終医薬物の処方中のいずれかにおいて、中間体薬物製品を保管するために、医薬産業にとって大きな利点となる。
［0015］ 本発明は、よって、安定性特性が改善され、よって、多様な医薬製剤及び投与経路のために適する、グラム陽性及び/又はグラム陰性細菌種から調製される細菌抽出物製剤に関する。特に、新規な安定化細菌抽出物医薬組成物は、経鼻、鼻内、気管内、粘膜、経粘膜、局部、頬側、舌下、経口、肺、気管支内及び/又は肺内投与のために処方できる。
［0016］ 本発明は、また、本発明による新規な安定化細菌抽出物を送達するための、適切な剤形及び送達システムにも関する。
［0017］ 本発明は、さらに、感染及び/又は炎症及び/又は新生物(neoplasms)及び/又は細菌叢異常に起因する急性及び慢性の免疫障害を処置及び/又は防止する方法に関する。
［0018］ 本発明は、最後に、患者への投与前の最終医薬物として、或いは医薬物製品の製造及び/又は処方中のいずれかの液体、半固体又はエアロゾルの形の下で安定細菌抽出物を調製するための新規なプロセスに関する。
図１は、アルカリ溶解後の細菌抽出物のタンジェンシャルフロー濾過(ＴＦＦ)システムの図である。この図は、濾過膜について２つの異なる構成：全ての濾過膜が同時に働く並行モードと、濾過膜が直列モードで構成されている蛇行モードを示す。 図２は、アルカリ溶解後の細菌抽出物の精製のために用いるタンジェンシャルフロー濾過(ＴＦＦ)の図である。この図は、粗細菌抽出物、精製画分、透析濾過媒体、純有機酸又は濃縮有機酸溶液、２つのポンプ、精密濾過膜ホルダー、ナノ濾過膜/限外濾過膜ホルダー、弁、膜間圧調節器(ＴＭＰ)、プロペラ、ｐＨ電極及び廃液への接続のための異なる槽を示す。一連の濾過膜は、全ての濾過膜が同時に働く並行モード、又は濾過膜が直列モードで構成されている蛇行モードで接続できる。 図３は、ウイルス肺感染の後の細菌肺感染の重感染実験の研究デザインを示す。経口経路(群２)対鼻内経路(群３及び４)によるＯＭ細菌抽出物投与と、生理食塩水鼻内(群１)の投与スケジュールを示す。 図４は、重感染後に得られ、鼻内ＯＭ細菌抽出物処置(i.n.用量Ａ＝５０マイクログラム及び用量Ｂ＝５マイクログラム)が、経口(p.o.７ミリグラム)ＯＭ細菌抽出物及び生理食塩水対照処置動物と比較して、生存率が著しく増加したことを示す結果を示す。 図５は、重感染後に得られ、予防的鼻内ＯＭ細菌抽出物処置が、全て生理食塩水対照群と比較した、鼻内(i.n.)５及び５０マイクログラムのＯＭ細菌抽出物対経口(ｐ.ｏ.)７ミリグラムＯＭ細菌抽出物の両方の投与後の臨床スコア測定を用いてここでまとめるインフルエンザ細菌感染後の罹患率及び死亡率を著しく緩和したことを示す結果を示す。 図６は、経口経路を介する７ミリグラムＯＭ細菌抽出物(ここでは、一過性の荒れた被毛として示す)対鼻内経路を介する５０マイクログラムＯＭ細菌抽出物(健常動物を示す)で処置したマウスにおいて観察される、細菌感染１日後(図３のスキームから第８日目)の併存疾患徴候の差を示す写真である。 図７は、ウイルス肺感染の後の細菌肺感染の重感染実験の研究デザインを示す。鼻内(経鼻)経路対気管内(i.t.)経路によるＯＭ細菌抽出物投与対生理食塩水対照の投与レジメンを、図に示す。 図８は、鼻内(i.n.)及び気管内(i.t.)投与を介する用量Ａ(５０マイクログラム)及びＢ(５マイクログラム)でのＯＭ細菌抽出物対鼻内(i.n.)及び気管内(i.t.)生理食塩水対照の５日後の肺組織におけるウイルス力価を示すグラフである。 図９は、５０マイクログラム(用量Ａ.I.N)及び５マイクログラム(用量Ｂ.I.N)でのＯＭ細菌抽出物又は生理食塩水(I.N.)での鼻内経路により処置したマウスの生存率を示すグラフである。 図１０は、鼻内予防的ＯＭ細菌抽出物処置が、鼻内５マイクログラム(用量Ａ)及び５０マイクログラム(用量Ｂ)の両方のＯＭ細菌抽出物対生理食塩水対照群の投与後の臨床スコア測定を用いてここでまとめるインフルエンザ細菌感染後の罹患率及び死亡率を著しく緩和したことを示すグラフである。臨床効力は、用量に比例した。 図１１は、気管内経路に従ってＯＭ細菌抽出物又は生理食塩水を投与した後のマウスの生存を示すグラフである。５０マイクログラム(用量Ａ I.T)及び５マイクログラム(用量Ｂ I.T)のＯＭ細菌抽出物。 図１２は、予防的気管内ＯＭ細菌抽出物処置が、５０マイクログラム(用量Ａ.I.T)及び５マイクログラム(用量Ｂ.I.T)の用量の投与後の臨床スコア測定を用いてここでまとめる罹患率及び死亡率を著しく緩和したことを示すグラフである。 図１３は、重感染実験の研究デザインを示す：対照群と比較した、ＯＭ細菌抽出物の鼻内(経鼻)及び経口経路に従う異なる用量及びレジメンを用いた後に肺におけるインフルエンザウイルス負荷の分析をして、ウイルス肺感染の後に細菌肺感染。群１から１１は、表６に記載する。 図１４は、ＯＭ細菌抽出物での防止的鼻内処置後の感染５日後の、経口処置と比較した、肺組織におけるウイルス力価を示すグラフである。 図１５：様々なＯＭ３１４Ａ安定細菌抽出物で予め処置した健常ドナーの肺バイオプシーに由来するヒト初代気管支上皮細胞(ＢＥＣ)のヒトライノウイルス(ＲＶ１６)感染率。(Ａ)有機酸又はＨＣｌを含むＯＭ３１４ＡでのＢＥＣ細胞の前処理を、１感染多重度(ＭＯＩ)のＲＶ-１６での感染の１日前に行った。ＲＶ-１６のｍＲＮＡ発現を、ウイルス複製の指標として用い、ＲＶ１６(１００％)に対する相対値(パーセンテージ、図１５Ａ)として表した。対照１(０％)は、非感染細胞であった。ＲＶ１６-１は、ＲＶ１６を２４時間感染させたＢＥＣ細胞であった。バーは、平均±Ｓ.Ｄを表す。試験した試料：対照１、ＲＶ１６；ＯＭ３１４Ａ試料：ＨＣＬ；１０ＨＣＬ ｃｅｎｔｒｉ.；酪酸；酪酸ｃｅｎｔｒｉ.；プロピオン酸；プロピオン酸ｃｅｎｔｒｉ.；アスパラギン酸；アスパラギン酸ｃｅｎｔｒｉ。Ｃｅｎｔｒｉ.は、非遠心分離対照物と比較された、遠心分離後に得られた試料の上清を示す。(Ｂ)３つの異なるウイルス濃度を用いての感染２４時間後のＲＶ１６タンパク質陽性ヒト初代ＢＥＣ(ｎ＝３)。(Ｃ)０.１ＭＯＩでの感染２４時間後のＢＥＣ(ｎ＝３)におけるＲＶ１６タンパク質染色に対する様々なＯＭ３１４Ａ調製物(２０μＬ/ｍＬ)でのプレインキュベーション(２４時間)の効果。バーは、平均±Ｓ.Ｅ.Ｍを表す。 図１６：ヒトＢＥＣからのインターフェロン放出をモニタリングするために用いたプロトコールを記載する実験スキーム。細胞を、第－２日に播種し、第－１日に血清を欠乏させ、図１７及び１８に示すように、ＯＭ３１４Ａ試料(ＯＭ)で２４時間刺激した。細胞上清を、ＥＬＩＳＡを用いるインターフェロンベータ及びガンマの用量決定のために、記載する時間にて回収した。 図１７：(Ａ)ＨＣＬで中和したＯＭ細菌抽出物(０.１から５０マイクログラム/ｍｌまで)でのインキュベーションの２４時間後のヒトＢＥＣによる１型インターフェロンベータ(ＩＦＮ-ベータ)分泌の用量応答。バーは、ｎ＝５ドナーの平均±Ｓ.Ｄ.を表す。＊＝２４時間と比較したｐ＜０.０１。(Ｂ)ＲＶ１６感染後２４時間にわたるヒトＢＥＣ(ｎ＝３)によるＩＦＮβ分泌。(Ｃ)非感染(ｎ＝３)ヒトＢＥＣによるＩＦＮβの分泌に対する、様々なＯＭ３１４Ａ(Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３)、ＯＭ３１４Ｂ(Ｐ４)及びＯＭ-３１４Ｃ(Ｐ５)調製物の濃度依存的影響。バーは、各条件の平均±Ｓ.Ｅ.Ｍを表す。 図１８：(Ａ)ＨＣＬで中和したＯＭ細菌抽出物(０.１から５０マイクログラム/ｍｌまで)でのインキュベーションの２４時間後のヒト肺由来初代上皮細胞(ＢＥＣ)による２型インターフェロンガンマ(ＩＦＮ-ガンマ)分泌の用量応答。バーは、ｎ＝５ドナーの平均±Ｓ.Ｄを表す。＊＝２４時間対照と比較したｐ＜０.０１。(Ｂ)ＲＶ１６感染後２４時間にわたるヒトＢＥＣ(ｎ＝３)によるＩＦＮγ分泌。(Ｃ)非感染ヒトＢＥＣによるＩＦＮγの分泌に対する、様々なＯＭ３１４Ａ(Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３)、ＯＭ３１４Ｂ(Ｐ４)及びＯＭ-３１４Ｃ(Ｐ５)調製物の濃度依存的影響。バーは、各条件の平均±Ｓ.Ｅ.Ｍを表す。 図１９は、ヒト肺由来初代上皮細胞(ＢＥＣ)による抗ウイルスベータβ-デフェンシン-１発現を示す。Ａ)は、ＲＶ１６感染後２４時間にわたるＢＥＣ(ｎ＝３)によるβ-デフェンシン-１分泌に対する感染(３つの異なる濃度)の影響を示す。(Ｂ)は、非感染ＢＥＣ(ｎ＝３)によるβ-デフェンシン-１の分泌に対するＯＭ３１４Ａ(Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３)、ＯＭ３１４Ｂ(Ｐ４)及びＯＭ-３１４Ｃ(Ｐ５)安定細菌抽出物の濃度依存的影響を示す。バーは、各条件の三つ組の平均±Ｓ.Ｅ.Ｍを表す。 図２０：ＩＣＡＭ-１ウイルス受容体発現。(Ａ)は、ＲＶ１６感染後２４時間にわたるヒト肺由来初代上皮細胞(ｎ＝３)によるＩＣＡＭ-１受容体発現を示す。(Ｂ)は、感染初代上皮細胞(ｎ＝３)によるＩＣＡＭ-１の発現に対する、ＯＭ３１４Ａ(Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３)、ＯＭ３１４Ｂ(Ｐ４)及びＯＭ-３１４Ｃ(Ｐ５)安定細菌抽出物の濃度依存的影響を示す。バーは、各条件の三つ組の平均±Ｓ.Ｅ.Ｍを表す。 図２１は、マウス野生型(ＷＴ、黒色のバー)又はＴＬＲ-４ノックアウト(ＴＬＲ４-/-、白色のバー)由来マウス骨髄由来樹状細胞(ＢＭＤＣ)からのｔｏｌｌ様受容体(ＴＬＲ)-４-依存性ＴＮＦα放出を示す。増加する希釈のＯＭ３１４Ａ安定細菌抽出物(Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３)、ＯＭ３１４Ｂ(Ｐ４)及びＯＭ-３１４Ｃ(Ｐ５)、又は同じ希釈セットを用いて対照としてＬＰＳ(２μｇ/ｍＬ)若しくは工業的バッチ(Ｉ.Ｂ＃１６１９０５７)のいずれかで細胞を刺激した。上清中のＴＮＦαの濃度のレベルを、ＥＬＩＳＡにより、誘導の１６時間後に、製造業者のプロトコールに従って測定した。 図２２は、生理食塩水溶液、通常固形飼料食を与えた通常食マウス対照(ＮＣＤ(ＮＣＤ-シャム)、２１株溶解物からの細菌抽出物で処置した通常食マウス(ＮＣＤ-ＢＥ)、生理食塩水溶液を与えた高脂質食マウス対照(ＨＦＤ-シャム)及び２１株溶解物からの細菌抽出物で処置した高脂質食マウス(ＨＦＤ-ＢＥ)における線形判別分析(ＬＤＡ)スコアを示す。 図２３：(Ａ)は、２１株溶解物からの細菌抽出物の食餌前(食餌前)、(Ｂ)通常固形飼料食後マウス(ＮＣＤ後)、(Ｃ)高脂質食後(ＨＦＤ後)のグルコース濃度のグラフを示す。体重増加について、マウスを週１回秤量した。食物消費尺度は、週の初め及び終わりにペレットを秤量することにより、週１回評価した。大きい黒色及び小さい星形の有意性の印は、ＨＦＤ-Ｌと比較したＨＦＤ-シャムである。グラフ中にそれぞれの有意性の値とともに記載するように、ＨＦＤ-ＢＥと比較したＰｌａｎｔａｒｕｍ及びＨＦＤ-シャム。 図２４は、体重及び食物消費を示す。(Ａ)は、生理食塩水溶液を与えた高脂質食シャム対照(ＨＦＤ-シャム)、２１株溶解物からの細菌抽出物で処置した高脂質食(ＨＦＤ-ＢＥ)及びエル・プランタルム(Ｌ.Ｐｌａｎｔａｒｕｍ)で処置した高脂質食(ＮＣＤ-Ｌ ｐｌａｎｔ)における、グラムで表した体重を示す。(Ｂ)は、生理食塩水溶液を与えた高脂質食シャム対照(ＨＦＤ-シャム)と、２１株溶解物からの細菌抽出物で処置した高脂質食(ＨＦＤ-ＢＥ)との間の、グラムで表した食物消費比較を示す。体重増加について、マウスを週１回秤量した。食物消費尺度は、週の初め及び終わりにペレットを秤量することにより、週１回評価した。丸で囲んだ星形の有意性の印は、グラフ中にそれぞれの有意性の値とともに記載するように、ＨＦＤ-ＢＥと比較したＨＦＤ-シャムであり、通常の星形の有意性＊の印は、ＨＦＤ-エル・プランタルムと比較したＨＦＤ-シャムである。 図２５は、生理食塩水溶液(ＨＦＤ-シャム)、２１株溶解物からの細菌抽出物(ＨＦＤ-ＢＥ)又はエル・プランタルム(ＮＣＤ-Ｌ ｐｌａｎｔ)のいずれかを与えた高脂質食(ＨＦＤ)マウスにおける、処置前(食餌前)及び８週間の処置期間の最後(食餌後)での４２匹全てのマウスにおける、インスリン負荷試験の結果を示す。単純な黒色の星形の有意性の印は、グラフに示すように、ＨＦＤ-ＢＥと比較したＨＦＤ-シャムである(ｐ＜０.０００１)。 図２６は、様々な腸管の種に対する、２１株溶解物からの細菌抽出物の影響を示す。１６ＳリボソームＲＮＡ配列決定及び分析は、実施例１０に記載するようにして行った。Ａ.クロストリジア目ラクノスピラ科ブラウティア属(Clostridiales Lachnospiraceae blautia)；Ｂ.クロストリジウム綱クロストリジア目ルミノコッカス科(Clostridia Clostridiales ruminococcaceae)ＧＣＡ-９０００６６２２５；Ｃ.クロストリジア目ルミノコッカス科ルミノコッカス科(Clsotridiales Ruminococcaceae ruminococcaceae)ＵＣＧ-０１０１；Ｄ.バクテロイデス目ムリバクラ科(Bacteroidales Muribaculaceae)無培養細菌；Ｅ.ラクノスピラ科［ユーバクテリウム］フィシカンテナ(Lachnospiraceaeae[Eubacterium]fissicantena)群；＊ｐ＜０.０５、＊＊ｐ＜０.０１、＊＊＊ｐ＜０.００１、＊＊＊＊ｐ＜０.０００１。 図２７は、溶液中の沈殿物を示すノイズのあるスペクトルを示す(不安定細菌抽出物の典型例として示す)。 図２８は、澄明な溶液を示す平滑なスペクトルを示す(安定細菌抽出物の典型例として示す)。 図２９：安定性中のプロセス１-バイオアッセイの結果は、プロセス１-Ｅ３-中和濾過物(ＯＭ３１４Ａ)が、室温(２０℃±５℃)又は４℃で少なくとも４か月間、ＴＨＰ-１上のＭＩＰ-３α分泌による同等の生物活性を示したことを示す。プロセス１ Ｔ０は、４℃及び室温(ＲＴ)にて４か月間保管したＴ４試料と比較した。 図３０：安定性中のプロセス２-バイオアッセイの結果は、プロセス２-Ｅ３-中和濾過物(ＯＭ３１４Ａ)が、室温(２０℃±５℃)又は４℃で少なくとも４か月間、ＴＨＰ-１上のＭＩＰ-３α分泌による同等の生物活性を示したことを示す。プロセス２ Ｔ０は、４℃及び室温(ＲＴ)にて４か月間保管したＴ４試料と比較した。 図３１：安定性中のプロセス３-バイオアッセイの結果は、プロセス３-Ｅ３-中和濾過物(ＯＭ３１４Ａ)が、室温(２０℃±５℃)又は４℃で少なくとも５か月間、ＴＨＰ-１上のＭＩＰ-３α分泌による同等の生物活性を示したことを示す。プロセス３ Ｔ０は、４℃及び室温(ＲＴ)にて４か月間保管したＴ５試料と比較した。 図３２：安定性中のプロセス５-バイオアッセイの結果は、プロセス５-Ｅ３-中和濾過物(ＯＭ３１４Ａ)が、室温(２０℃±５℃)又は４℃で少なくとも５か月間、ＴＨＰ-１上のＭＩＰ-３α分泌による同等の生物活性を示したことを示す。プロセス５ Ｔ０は、４℃及び室温(ＲＴ)にて４か月間保管したＴ５試料と比較した。
［0051］ 本発明は、よって、グラム陽性及び/又はグラム陰性細菌種のアルカリ溶解と、酢酸、プロピオン酸、乳酸、３-ヒドロキシプロパン酸、ピルビン酸、ブタン酸、２-ヒドロキシブタン酸、３-ヒドロキシブタン酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、それらの組合せ又はそれらの薬学的に許容される塩及びエステルから選択される１以上の特定の有機酸での中和と、その後の中和細菌抽出物の濾過による精製と、前記中和に用いた有機酸、その組合せ又はそれらの塩及びエステルの添加による最終の生理的ｐＨへの調整とによって得ることができる安定な精製細菌抽出物に関する。
［0052］ 本出願人は、溶解物のｐＨが１０を超える(ｐＨの±０.１の変動あり)アルカリ溶解の後に細菌抽出物を特定の有機酸の選択と接触させることにより、驚くべきことに優れた安定性を示す細菌抽出物が得られることを見出した。より具体的には、本発明による細菌抽出物製剤は、液体の状態で数か月にわたって物理的安定性を保持した。物理的安定性が改善されたこのような新規な細菌抽出物製剤は、よって、患者への投与のための最終医薬として、又は医薬物製品の製造若しくは処方中に、液体、半固体又はエアロゾルの形で安定に保管できる。
［0053］ 「安定」製剤は、医薬の保管中に液体の形で又は製造若しくは処方中の中間薬物製品として液体の形でその物理的安定性を本質的に保持する細菌抽出物を意味することを意図する。細菌抽出物製剤は、澄明性の目視検査により又は光散乱、サイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ)及び動的光散乱により測定して、凝集及び/又は沈殿が著しく増加しないならば、医薬製剤におけるその物理的安定性を保持する。室温における著しい沈殿又は物理的変化がないことは、４℃、－２０℃又は－８０℃にて少なくとも３か月又は４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月又は１２か月間観察される。好ましくは、１０％、好ましくは５％以下の凝集及び沈殿が形成される。
［0054］ 用語「有機酸」は、弱酸性により特徴づけられ、水の存在下で完全に解離しない有機化合物のことをいう。
［0055］ 用語「代替の投与経路」は、一般に、口周囲及び経口経路のことをいい、なかでも鼻内、気管内、粘膜、経粘膜、局部、皮膚外用、口腔粘膜、経口、舌下、肺、気管支内及び/又は肺内投与経路を含んでよい。
［0056］ 用語「ＯＭ３１４Ａ細菌抽出物」は、モラクセラ・カタラーリス(Moraxella catarrhalis)、へモフィラス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)及び/又はストレプトコッカス・サングイニス(Streptococcus sanguinis)を含む、上気道の１以上の最も頻繁な細菌病原体からのアルカリ溶解により抽出される精製細菌抽出物又は溶解物を含む多価免疫調節剤のことをいう。好ましくは、ＯＭ３１４Ａ細菌抽出物は、１以上の上記の細菌病原体の組合せのアルカリ溶解により得ることができ、最も好ましくは、８つの上記の病原体を含む。このＯＭ３１４Ａ細菌抽出物は、本発明による安定製剤において調製され、いくつかの科学的出版物及び国際公開ＷＯ２００８/１０９６６９において以前に記載された細菌抽出物の第二世代に相当する。以下において「ＯＭ細菌抽出物」と言及する細菌抽出物の第一世代は、カプセル剤及び錠剤のような固体嚥下可能製剤として患者に経口投与され、成人及び小児において気道感染の防止に効果があることが示されている。さらに、いくらかの臨床試験が行われて、この第一世代ＯＭ細菌抽出物の経腸投与(経口)が、経口により投与した場合に小児における急性気道疾病により引き起こされるアレルギー性喘息及び喘鳴発作を防止することが示されたことが証明された。ＯＭ細菌抽出物医薬の前記第一世代は、固体剤形、通常カプセル剤又はサシェで経口により、成人処置のために１日あたり７ｍｇの凍結乾燥細菌抽出物の１カプセル剤及び小児のために１日あたり３.５ｍｇの凍結乾燥細菌抽出物の１カプセル剤の投与レジメンで患者に投与される、Ｂｒｏｎｃｈｏ-Ｖａｘｏｍ(登録商標)の商品名の下で商品化されている。
［0057］ よって、ＯＭ３１４Ａ細菌抽出物は、第一世代のＯＭ細菌抽出物に反して、ＯＭ細菌抽出物を含むが、安定化されているので液体、気体又は固体の形のいずれかで任意の可能な医薬剤形で処方でき、鼻内、気管内、粘膜、経粘膜、局部、頬側、経口、舌下、肺、気管支内及び/又は肺内を含む、より広範な可能な投与経路に適切な薬物の第二世代のことをいう。
［0058］ 用語「ＯＭ３１４Ｂ細菌抽出物」は、国際公開ＷＯ２０１０/０２７３４４において記載されるようなラクトバチルス細菌株から選択される１以上の細菌種のアルカリ溶解により得ることができる多価ワクチンのことをいう。特に、安定細菌抽出物は、ラクトバチルスファーメンタム(Lactobacillus fermentum)、ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)、ラクトバチルス・プランタルム、ラクトバチルス・ジョンソニイ(Lactobacillus johnsonii)、ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)、ラクトバチルス・カゼイ・デフェンシス(Lactobacillus casei defensis)、ラクトバチルス・カゼイssp.カゼイ(Lactobacillus casei ssp. casei)、１５ラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacilus paracasei)、ラクトバチルス・ブルガリカス(Lactobacillus bulgaricus)、ラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)、ラクトバチルス・アシドフィラス(Lactobacillus acidophilus)、ラクトバチルス・ロイテリ(Lactobacillus reuteri)、ラクトバチルス・サリバリウス(Lactobacillus salivarius)、ラクトバチルス・ラクティス(Lactobacillus lactis)及び/又はラクトバチルス・デルブリュッキ(Lactobacillus delbrueckii)から選択される１以上のラクトバチルス細菌株を含み得る。ＯＭ３１４Ｂ細菌抽出物は、本発明による安定製剤で調製され、国際公開ＷＯ２０１０/０２７３４４に以前に記載されたラクトバチルス細菌抽出物の第二世代に相当する。ＯＭ３１４Ｂ細菌抽出物は、安定化されているので、鼻内、気管内、粘膜、経粘膜、局部、頬側、経口、舌下、肺、気管支内及び/又は肺内経路を含む様々な可能な投与経路に適切な、液体、気体又は固体の形のいずれかの任意の可能な医薬剤形で処方できる。
［0059］ よって、用語「ＯＭ３１４Ｃ細菌抽出物」は、国際公開ＷＯ２００８/１０９６６７に記載されるような１以上の大腸菌(Escherichia coli)細菌株のアルカリ溶解により得ることができる安定細菌抽出物のことをいう。ＯＭ３１４Ｃ細菌抽出物は、本発明による安定製剤で調製され、国際公開ＷＯ２００８/１０９６６７に以前に記載された大腸菌細菌抽出物の第二世代に相当する。ＯＭ３１４Ｃ細菌抽出物の第二世代は、安定化されているので、鼻内、気管内、粘膜、経粘膜、皮膚外用、頬側、経口、舌下、肺、気管支内及び/又は肺内を含む様々な可能な投与経路に適切な、液体、気体又は固体の形のいずれかの任意の可能な医薬剤形で処方できる。
［0060］ 用語「安定細菌抽出物製剤」は、国際公開ＷＯ２００８/１０９６６９、ＷＯ２０１０/０２７３４４又はＷＯ２００８/１０９６６７に記載されたアルカリ溶解抽出物により得ることができるが、上記のように鼻内、気管内、粘膜、経粘膜、局部、頬側、経口、舌下、肺、気管支内及び/又は肺内を含む代替経路に適切な医薬剤形に適合された任意の細菌抽出物薬物の安定化形のことをいう。
［0061］ よって、本発明による安定な精製細菌抽出物は、安定化されているので、上記のように鼻内、気管内、粘膜、経粘膜、局部、頬側、経口、舌下、肺、気管支内及び/又は肺内を含むより広い多様性の投与経路のために任意の医薬剤形において処方できる治療的免疫調節特性を有するグラム陽性及び/又はグラム陰性細菌種の任意の組合せの細菌アルカリ溶解物を含み得る。
［0062］ 第一の実施形態によると、新規な安定細菌抽出物製剤は、本出願人の国際公開ＷＯ２００８/１０９６６９に記載されるような、モラクセラ・カタラーリス、へモフィラス・インフルエンザ、クレブシエラ・ニューモニエ、スタフィロコッカス・アウレウス、ストレプトコッカス・ニューモニエ、ストレプトコッカス・ピオゲネス及び/又はストレプトコッカスサングイニスから選択される１以上の細菌種の細菌溶解物を含み得る。好ましくは、本実施形態による新規な安定細菌抽出物製剤は、本明細書において以下、安定ＯＭ３１４Ａ細菌抽出物製剤といい、以下の細菌種：モラクセラ・カタラーリス、へモフィラス・インフルエンザ、クレブシエラ・ニューモニエ、スタフィロコッカス・アウレウス、ストレプトコッカス・ニューモニエ、ストレプトコッカス・ピオゲネス及びストレプトコッカスサングイニスのアルカリ溶解により得ることができる。
［0063］ 本実施形態によると、よって、モラクセラ・カタラーリス、へモフィラス・インフルエンザ、クレブシエラ・ニューモニエ、スタフィロコッカス・アウレウス、ストレプトコッカス・ニューモニエ、ストレプトコッカス・ピオゲネス及び/又はストレプトコッカスサングイニスから選択される１以上の細菌種に由来する安定精製細菌抽出物であって、細菌株のアルカリ溶解と、酢酸、プロピオン酸、乳酸、３-ヒドロキシプロパン酸、ピルビン酸、ブタン酸、２-ヒドロキシブタン酸、３-ヒドロキシブタン酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、それらの組合せ並びに/又はその薬学的に許容される塩及びエステルから選択される１以上の有機酸での中和と、その後の中和抽出物の濾過による精製と、前記中和に用いたのと同じ有機酸又は同じその組合せの添加による最終生理的ｐＨへの調整とにより得ることができる細菌抽出物が提供される。
［0064］ 第二の実施形態によると、安定細菌抽出物製剤は、ラクトバチルス細菌株から選択される１以上の細菌種から調製される。特に、安定細菌抽出物は、出願人の国際公開ＷＯ２０１０/０２７３４４に記載されるような、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・ラムノサス、ラクトバチルス・プランタルム、ラクトバチルス・ジョンソニイ、ラクトバチルス・ヘルベティカス、ラクトバチルス・カゼイ・デフェンシス、ラクトバチルス・カゼイｓｓｐ.カゼイ、ラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・ブルガリカス、ラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・アシドフィラス、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・サリバリウス、ラクトバチルス・ラクティス及び/又はラクトバチルス・デルブリュッキから選択される１以上のラクトバチルス細菌株を含み得る。
［0065］ よって、第二の実施形態によると、１以上のラクトバチルス細菌株に由来する安定精製細菌抽出物であって、細菌株のアルカリ溶解と、酢酸、プロピオン酸、乳酸、３-ヒドロキシプロパン酸、ピルビン酸、ブタン酸、２-ヒドロキシブタン酸、３-ヒドロキシブタン酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、それらの組合せ並びに/又はその薬学的に許容される塩及びエステルから選択される１以上の有機酸での中和と、中和抽出物の濾過による精製と、前記中和に用いたのと同じ有機酸又は同じその組合せの添加による最終生理的ｐＨへの調整とにより得ることができる細菌抽出物が提供される。
［0066］ 第三の実施形態において、１以上の大腸菌細菌株に由来する安定細菌抽出物であって、前記細菌株のアルカリ溶解と、酢酸、プロピオン酸、乳酸、３-ヒドロキシプロパン酸、ピルビン酸、ブタン酸、２-ヒドロキシブタン酸、３-ヒドロキシブタン酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、それらの組合せ並びに/又はその薬学的に許容される塩及びエステルから選択される１以上の有機酸での中和と、中和抽出物の濾過による精製と、前記中和に用いたのと同じ有機酸又は同じその組合せの添加による最終生理的ｐＨへの調整とにより得ることができる細菌抽出物。特に、大腸菌細菌抽出物は、出願人の国際公開ＷＯ２００８/１０９６６７に記載されるような１以上の大腸菌細菌株を含み得る。
［0067］ この第三の実施形態によると、よって、１以上の大腸菌細菌株からの安定精製細菌抽出物であって、アルカリ溶解と、酢酸、プロピオン酸、乳酸、３-ヒドロキシプロパン酸、ピルビン酸、ブタン酸、２-ヒドロキシブタン酸、３-ヒドロキシブタン酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、それらの組合せ又はその薬学的に許容される塩及びエステルから選択される１以上の有機酸での中和と、その後の中和抽出物の濾過による精製と、前記中和に用いたのと同じ有機酸又は同じその組合せの添加による最終生理的ｐＨへの調整とにより得ることができる細菌抽出物が提供される。
［0068］ 上記の実施形態において、細菌抽出物は、上記の細菌種のそれぞれからの少なくとも１つの株を含むが、他の実施形態において、上記のリストからの１以上の特定の株は、除かれるか又は１以上の異なる株で置換されてよい。
［0069］ 上記のように、グラム+及び/又はグラム-細菌の任意の他の組合せを本発明に従って調製及び処方でき、改善された安定性特性を示し得るので、これらの特定の実施形態のいずれにも安定細菌抽出物製剤の調製を限定する意図はない。
［0070］ 典型的に、細菌抽出物は、発酵と、その後の熱不活性化及びアルカリ溶解及び濾過により調製される。発酵、アルカリ溶解及び濾過は、当該技術において既に公知であり、中でも国際公開ＷＯ２００８/１０９６６７、ＷＯ２０１０/０２７３４４及びＷＯ２００８/１０９６６９に開示される。
［0071］ 発酵は、各細菌株を、培養培地中で適切な光学密度まで成長させることにより一般的に行われる。各株について、十分な量の物質を得るために、発酵培養は、使えるシードロットから開始でき、その後に、より大きい発酵容器へ接種できる。例えば、発酵は、小さい培養、例えば０.１から１.０リットルで開始し、３０～４０℃、例えば３７℃にて約３～６時間インキュベートして、３.０～５.０の７００ｎｍでの光学密度(ＯＤ)を得ることができる。小規模培養工程の後に、１つ又は一連のより大きい発酵槽での追加の培養を、３０℃～４０℃にて３時間から２０時間の期間、例えば３～１０時間又は８時間行うことができる。
［0072］ 培養培地は、好ましくは、プリオン関連疾患(すなわち、狂牛病、スクレイピー及びクロイツフェルト・ヤコブ病)又はその他の疾患の危険性を有さず、よって、動物ベースの材料、例えば動物、例えばウシ若しくはヒツジから又はプリオンベースの疾患を伝染し得る任意の他の動物から採取された血清又は肉抽出物を含まない培地である。例えば、非動物培地、例えば植物ベースの培地、例えばダイズベースの培地、又は合成若しくは半合成培地を用いることができる。或いは、ウマ血清を用いる培地又はプリオン病を伝染しない動物種から採取された材料を含む培地を用いることができる。培養培地は、生物学的抽出物、例えば酵母エキス及びウマ血清(これらもこのような疾患の危険性を有さない)を含むこともできる。補充の増殖因子を導入して、いくつかの細菌種の成長を増進することもできる。
［0073］ 発酵の後に、各細菌株又は組合せた細菌株からのバイオマスは、加熱処理により通常不活性化され、濃縮され、凍結される。
［0074］ アルカリ溶解は、塩基性条件下で細菌細胞を溶解するために用いられ、通常、有機又は無機塩基を用いて行われる。アルカリ溶解は、単一細菌バイオマス又は細菌バイオマス若しくは発酵バッチの混合物に対して、塩基性条件下で、典型的に、水酸化物イオン、例えばＮａＯＨからの濃縮溶液を用いて行うことができる。
［0075］ アルカリ溶解は、ｐＨの±０.１の変動を有して、約１０を超えるｐＨにて好ましく行うことができる。溶解の期間は、当業者が評価でき、初期細菌バイオマス量に依存する。溶解は、３０から６０℃までの範囲、例えば３０～４０℃又は３５～４０℃、例えば３７℃の温度にて行うことができる。一般的に、溶解は、当業者に知られるように、目視観察に基づいて細菌細胞が全て破壊されたように見受けられる時に停止する。同じ属の細菌の複数の株を用いる場合、株は、一緒又は別々に溶解できる。株は、よって、溶解の前又は後に混合できる。
［0076］ 溶解中に、細菌細胞は破壊され、その成分が分解及び化学修飾される。特に、アミノ酸のラセミ化は、天然タンパク質で見い出される天然由来Ｌ-アミノ酸からＤ-アミノ酸を創出する。Ｄ-アミノ酸は、抽出物のバイオアベイラビリティの増加において有益であり得る。なぜなら、主に又は部分的にＤ-アミノ酸で構成されるタンパク質は、哺乳動物の腸において効率的に消化されないからである。よって、溶解中に化学修飾されてＤ-アミノ酸を含む抽出物中の抗原性分子は、患者の体内により長い時間残り、より強い免疫賦活活動を可能にできる。
［0077］ 溶解の後に、本発明によると、細菌溶解物は中和され、すなわち、溶解物のｐＨは、１以上の特定の有機酸の添加により、５と８の間、６と８の間、６.３と７.８の間又は６.５と７.８の間の最終ｐＨに調整され得る。前記１以上の特定の有機酸は、本発明に従って、酢酸、プロピオン酸、乳酸、３-ヒドロキシプロパン酸、ピルビン酸、ブタン酸、２-ヒドロキシブタン酸、３-ヒドロキシブタン酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、それらの組合せ並びに/又はその薬学的に許容される塩及びエステルから選択できる。
［0078］ 溶解物は、次いで、大きい細胞デブリ又は分解が不十分な任意の成分、任意の不溶性若しくは粒状材料を除いて、可溶性細菌抽出物を得るための遠心分離及び/又は濾過により精製される。遠心分離及び濾過を含む精製は、抽出物から粒状のものを除くために当該技術において公知である。例えば、溶解物は、９０００ｇで遠心分離した後に、濾過を１回以上行うことができる。典型的に、濾過は、抽出物又は混合抽出物を、１以上の濾過膜、例えば精密濾過膜(すなわち精密濾過)又は限外濾過膜(すなわち限外濾過)に通過させることを含むことができ、これは、数回の通過又はサイクルで反復できる。例えば、孔がより大きい濾過膜での連続回の濾過の後により小さい孔の濾過膜を用いる精密濾過を行うことができ、例えば０.２ミクロン濾過膜である。限外濾過も、抽出物からの可溶性材料の抽出を助けるために採用できる。例えば、限外濾過通過物をさらなる精密濾過のために再循環させる。
［0079］ タンジェンシャルフロー濾過(ＴＦＦ)法を用いて、抽出物をろ過し、より大きい細胞デブリから可溶化された分子を抽出できる。これは、当該技術において公知であり、なかでもWayne P. Olson (Separations Technology, Pharmaceutical and Biotechnology Applications、Interpharm Press, Inc.、Buffalo Grove、IL、U.S.A.、pp.126～135)に記載される。濾過ループプロセスの例を、以下の図１に示す。このようなプロセスの初めに、希釈細菌溶解物を、第一タンクに保管できる。精密濾過(ＭＦ)ループを開始でき、生成物をポンプで押し出す。得られたＭＦ残留物を再利用するが、ＭＦ通過物は、第二タンクに移すことができる。適切な濃度に達した後に、限外濾過(ＵＦ)ループを開始できる。ＵＦ通過物を、溶解物からの可溶化化合物の連続抽出のために第一タンクに再循環して戻すことができるが、ＵＦ残留物は、第二タンクに保管できる。連続抽出中に、タンク１及び２の容量は、精密濾過及び限外濾過の通過物の流速を調節することにより調整できる。いくつかのこのような抽出サイクルを、ＴＦＦ又は別の濾過方法のいずれかを用いて行うことができる。ＴＦＦを用いる実施形態において、最後のサイクルの終わりに、限外濾過ループを閉じ、精密濾過ループを単独で運転でき、ＭＦ通過物をタンク２に移す。精密濾過ループには、１.２ミクロンから０.１ミクロンの濾過膜、例えば０.６５から０.２ミクロン又は０.４５ミクロンの濾過膜を取り付けることができる。直交流は、０.６から２バール、例えば０.８と１.５バールの間又は１.０バールの膜間圧(ＴＭＰ)で、１０００リットル/時間ｍ2(ＬＨＭ)と３０００ＬＨＭの間、例えば１５００と２５００ＬＨＭの間又は２０００ＬＨＭであり得る。限外濾過ループには、１０ＫＤａから１０００ＫＤａまで、例えば１０ＫＤａから１００ＫＤａまで、又は１０ＫＤａから３０ＫＤａまで、又は３０ＫＤａから１００ＫＤａまで、又は３０ｋＤａから３００ｋＤａまで、又は１００ｋＤａから３００ｋＤａまで、又は３０ｋＤａから１０００ｋＤａまで、又は１００ｋＤａから１０００ｋＤａまで、又は３００ｋＤａから１０００ｋＤａまでの濾過膜を取り付けることができる。直交流は、０.２から１.５バール、例えば０.４と１.２バールの間又は０.５バールのＴＭＰで、３０ＬＨＭと１０００ＬＨＭの間、例えば２０と５００ＬＨＭの間であり得る。
［0080］ ５から２０透析濾過容量の間を用いて、細菌細胞壁から可溶化された化合物を抽出できる。透析濾過媒体は、７と１１の間のｐＨ値に調整した水であり得る。いくつかの実施形態において、８から１５容量の間を用いる。よって、例えば、いくつかの実施形態において、５と１５サイクルの間の濾過、いくらかの場合においては８と１５サイクルの間、例えば８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５サイクルを用いることができる。
［0081］ 任意の不溶性粒子を除くことに加えて、このような濾過は、いずれの核酸も除くことも目的とする。濾過の結果として、細菌抽出物に存在する核酸の量は、１００マイクログラム/ｍＬ未満のままであり得る。しかし、単糖類、二糖類とともにより大きい糖類、例えば線状及び分岐状の多糖類、特にリポ多糖(ＬＰＳ)成分を含む糖成分は、濾過により保存できる。実際に、溶解プロセス中に、糖類(ＬＰＳ成分を含む)を、より小さい構造に開裂するか、又は異なる官能基に置換した。この点について、毒性の可能性があるＬＰＳ成分を含む糖成分は、安全性の理由から細菌抽出物から除くべきであると以前は考えられていたが(米国特許第５,４２４,２８７号を参照されたい)、本出願人は、ＬＰＳを含む糖成分は、安全に保持できることを示した。なぜなら、これらの成分は、実際に、抽出物にさらなる抗原をもたらし、よって、治療有効性を改善するからである。抽出物は、所望により、さらに希釈、濃縮又は遠心分離してよい。
［0082］ 透析濾過の後に、アルカリ精製可溶性細菌抽出物は、溶解物を中和するための１以上の特定の有機酸の添加により、本発明に従ってさらに調整された。前記有機酸は、本発明に従って、酢酸、プロピオン酸、乳酸、３-ヒドロキシプロパン酸、ピルビン酸、ブタン酸、２-ヒドロキシブタン酸、３-ヒドロキシブタン酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、それらの組合せ並びに/又はそれらの薬学的に許容される塩及びエステルから選択できる。好ましくは、細菌抽出物製剤の最終ｐＨは、５と８の間、６と８の間、６.３と７.８の間又は６.５と７.８の間に調整できる。
［0083］ このような精製可溶性細菌抽出物は、よって、本発明に従って液体として有利に保存及び保管でき、いずれの沈降又は沈殿なく澄明のままであり、よって、優れた物理的安定性を保つことができる。或いは、精製細菌抽出物は、必要であれば凍結乾燥でき、その後に治療的使用又はさらなる生薬的(ｇａｌｅｎｉｃ)プロセスのためにそれらを液体、気体又は固体の形の下で再処方できる。
［0084］ 細菌抽出物製剤を液体製剤として保存する場合、これらは、生物活性を維持しながら経時的に優れた物理的安定性を有して長期間室温にて保管できる。有利には、細菌抽出物は、室温又は４℃、－２０℃又は－８０℃にて、凝集及び沈殿を形成することなく、処方プロセス又は保管の間保管できる。本発明によると、細菌抽出物製剤中に不溶性又は可溶性いずれの凝集の形成も大きく低減できた。さらに、物理的安定性の改善がみられるだけでなく、製剤は、製造及び保管中に、実質的な生物学的成分の化学分解又は修飾なく、多糖類、リポ多糖類、タンパク質、ラセミ化アミノ酸及びその他の生物学的成分の優れた生物活性も維持できた。
［0085］ 本発明による細菌抽出物製剤は、よって、ＲＴ又は４℃、－２０℃又は－８０℃にて、少なくとも１か月又は少なくとも２か月、少なくとも３か月、少なくとも４か月、少なくとも５か月、少なくとも６か月、少なくとも７か月、少なくとも８か月、少なくとも９か月、少なくとも１０か月、少なくとも１１か月、少なくとも１２か月、少なくとも１８か月、少なくとも２４か月間の期間保管でき、前記製剤は、例えば光、温度、ｐＨ、水の影響によるか又は賦形剤及び/若しくは直接の容器閉鎖系との反応による、細菌抽出物の製造及び/又は保管中に生じる実質的な物理的変化を示さない。さらに、同じ保管条件下に置いた場合に既知の初期生物活性を有する同じ細菌抽出物製剤は、少なくとも初期生物活性を保つことができた。関連する実施形態において、細菌抽出物は、前記保管期間中にそのラベルに記載された使用期限に達していない。
［0086］ このようにして得られる治療活性可溶性細菌抽出物の主要成分の組成及び化学的特性は、精密に決定され、液体製剤において経時的に維持された。特に、上記のように、細菌抽出物に存在する核酸の量は、１００□ｇ/ｍＬ未満である。また、細菌抽出物は、０.１ｍｇ/ｍＬを超える多糖類、或いは０.１から４.５ｍｇ/ｍＬ又は０.１から４ｍｇ/ｍＬ又は０.１から４ｍｇ/ｍＬ又は０.１から３.５ｍｇ/ｍＬ又は０.６から３ｍｇ/ｍＬ又は０.３から１ｍｇ/ｍＬ、或いは０.１、０.２、０.３、０.４、０.５、０.６、０.７、０.８、０.９、１.０、１.５、２.０、２.５、３.０、３.５、４.０又は４.５ｍｇ/ｍＬから始まるか又は終わる範囲、例えば０.４から０.５ｍｇ/ｍＬの多糖類を含む。さらに、可溶化タンパク質の収率は、可溶性精製細菌抽出物中でＬｏｗｒｙにより測定でき、例えば５０％を超えるか、又は６０％を超えるか、又は５０から９０％であるか、又は６０～９０％であり得る。よって、細菌抽出物は、５～７５ｍｇ/ｍＬのタンパク質、又は１０～６５ｍｇ/ｍＬ、又は２０～４５ｍｇ/ｍＬ、又は５～４０ｍｇ/ｍＬ、又は５～２０ｍｇ/ｍＬ、又は５～１０ｍｇ/ｍＬ、又は６～８ｍｇ/ｍＬのタンパク質、或いは５、６、８、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０又は７５ｍｇ/ｍＬから始まるか又は終わる範囲；グルタミン酸(１４７.１ｇ/ｍｏｌ)から計算して１.５から２.５ｍｇ/ｍＬの遊離アミノ酸(Ａ.Ａ.)、又は１.５から２ｍｇ/ｍＬ、又は２から２.５ｍｇ/ｍＬの遊離Ａ.Ａ.、或いは１.５、１.６、１.７、１.８、１.９、２.０、２.１、２.２、２.３、２.４又は２.５ｍｇ/ｍＬから始まるか又は終わる範囲の遊離Ａ.Ａ.；並びに０.３から４.５ｍｇ/ｍＬの多糖類及び単糖類、又は０.３から４ｍｇ/ｍＬ、又は０.４から４ｍｇ/ｍＬ、又は０.５から３.５ｍｇ/ｍＬ、又は０.６から３ｍｇ/ｍＬ、又は０.３から１ｍｇ/ｍＬ、或いは０.３、０.４、０.５、０.６、０.７、０.８、０.９、１.０、１.５、２.０、２.５、３.０、３.５、４.０又は４.５ｍｇ/ｍＬから始まるか又は終わる範囲、例えば０.４から０.５ｍｇ/ｍＬの多糖類及び単糖類を含み得る。
［0087］ さらに、このような溶解は、タンパク質の部分加水分解とともに、脱アミノ化、脱アミド化及びＬからＤへのアミノ酸の部分ラセミ化をもたらす。溶解プロセス中のアミノ酸のラセミ化は、天然タンパク質で見いだされる天然由来Ｌ-アミノ酸からＤ-アミノ酸を創出する。細菌抽出物の分析研究は、ラセミ化のパーセンテージを決定した。Ｄ-アスパラギン酸、Ｄ-グルタミン酸、Ｄ-セリン、Ｄ-メチオニン、Ｄ-ヒスチジン、Ｄ-アラニン、Ｄ-アルギニン、Ｄ-フェニルアラニン、Ｄ-チロシン、Ｄ-ロイシン及びＤ-リジンを表すピークが観察された。これらの種のＤ-アミノ酸のパーセンテージは、３％から４０％までの範囲であった。よって、セリン、トレオニン、ヒスチジン、アラニン、アルギニン、チロシン、フェニルアラニン、ロイシン及び/又はリジンの１以上のラセミ化が明らかになった。上記のアミノ酸の１以上の少なくとも１０％は、ＤからＬにラセミ化され得る。Ｄ-アミノ酸は、抽出物のバイオアベイラビリティを増加するために有益であり得る。なぜなら、主に又は部分的にＤ-アミノ酸で構成されるタンパク質は、哺乳動物の腸において効率的に消化されないからである。よって、溶解中に化学修飾されてＤ-アミノ酸を含む抽出物中の抗原性分子は、患者の体内により長い時間残り、より強い免疫賦活活動を可能にできる。
［0088］ 最後に、本発明による細菌の溶解は、加水分解のために０から３００ｋＤａから０から１００ｋＤａへ、又は０から６０ｋＤａへの成分分子の分子量の削減をもたらし得る。
［0089］ 例として、細菌抽出物は、約６から８ｍｇ/ｍＬのタンパク質、１.５から２.５ｍｇ/ｍＬのアミノ酸(Ａ.Ａ.)(ＨＣｌ加水分解後に測定)並びに/又は約０.４から０.５ｍｇ/ｍＬの多糖類及び単糖類を含み得る。タンパク質濃度は、欧州薬局方２.５.３３の方法２に従ってＬｏｗｒｙアッセイにより測定される。糖濃度は、D. Herbertら、Meth.Microbiol.5B:266以下参照(1971)に従う酸加水分解及び誘導体化の後にアッセイされる。グルタメート(グルタミン酸)濃度は、Roth M.、Fluorescence reaction for amino acids、Anal. Chem.、43、880～882、(1971)に従って、アミノ酸をイソインドール誘導体に変換し、３４０ｎｍの吸光度を測定することにより測定される。
［0090］ 上記のように、マウスにおいてヒト用量(７ｍｇ乾燥重量細菌抽出物)で経口により固体の形で投与されたＯＭ細菌抽出物が、インフルエンザ感染の後に、二次細菌感染からの保護を増進できたことが実験的に証明された(Pasqualiら、Frontiers in Medicine 2014、1、41)。
［0091］ ＯＭ細菌抽出物の投与経路は、常に、経口(例えば経腸経路)により、成人処置のための用量レジメンは、１日あたり７ｍｇの凍結乾燥細菌抽出物の１カプセルであり、小児のためには１日あたり３.５ｍｇの凍結乾燥細菌抽出物の１カプセルであった。出願人は、しかし、代替の口周囲非経腸投与経路、例えば鼻内、気管内、粘膜、経粘膜、局部、頬側、舌下、肺、気管支内及び/又は肺内経路を介するＯＭ細菌抽出物の投与が、強い免疫応答をもたらし、可能性のある感染及び/炎症に対抗するためにより効果的であることを見出した。
［0092］ 重要なことに、これらの新規な口周囲投与経路の観察された優れた治療効果は、細菌抽出物薬物の投与量の実質的な減少を可能にした。用量レジメンは、成人の処置のために３.５ｍｇの凍結乾燥細菌抽出物の、及び小児のために１.７５ｍｇの凍結乾燥細菌抽出物の１日口周囲用量レジメンで、２つに分けることができた。よって、出願人は、これらの新規な口周囲投与経路が、より低い用量でより高い治療有効性をもたらしたことを証明した。
［0093］ さらに、出願人は、(本明細書に記載する安定化細菌抽出物製剤であるか又はそうでないいずれかの)細菌抽出物のこれらの新規な口周囲投与経路が、気道及び肺においてより強い免疫応答を誘発するが、遠位、例えば腸などにおいても強い免疫応答を生じることを示した。
［0094］ 特に、(安定製剤であるか又はそうでないいずれかの)細菌抽出物の口周囲投与は、感染及び/又は炎症及び/又は新生物及び/又は細菌叢異常に起因する急性及び慢性の免疫障害に対して患者を保護することを可能にする。口周囲投与経路は、よって、医療状態を通常悪化させ、慢性病変に発展する危険性を増加させるこれらの病変及び障害を処置及び/又は防止する方法において特に有用かつ効果的である。
［0095］ 本発明によると、感染は、アレルギー性鼻炎、鼻炎、上咽頭炎、副鼻腔炎、咽頭炎、扁桃炎、喉頭炎、気管炎、咽喉頭炎、インフルエンザ、呼吸器多核体ウイルス、ヒトライノウイルス(ＨＲＶ)、ライノシンシティアルウイルス(ＲＶ)、コロナウイルス(ＣｏＶ、ＳＡＲＳ-ＣｏＶ、ＭＥＲＳ-Ｃｏｖ、ＣＯＶＩＤ-１９など)、クループ、肺炎、過敏性肺臓炎、気管支肺炎、気管支炎、細気管支炎、肺炎、急性下気道感染を伴う閉塞性肺疾患、急性上気道感染を伴う閉塞性肺疾患、又は上皮繊毛運動障害及び/若しくは粘液クリアランス障害を伴う疾患を含む、上下気道感染及び/又は関連する続発症を含み得る。感染は、二次感染、非呼吸器系ウイルス感染、非呼吸器系細菌感染、全身性感染、例えば敗血症、敗血症性ショック及びウイルス誘発性合併症も含み得る。
［0096］ 本発明によると、炎症は、アレルギー性/アトピー性呼吸器系及び非呼吸器系の徴候アトピー性皮膚炎、急性及び/又は慢性関連皮膚炎、アナフィラキシー並びに食物アレルギーを含み得る。前記炎症は、皮膚障害、皮膚炎症、例えば湿疹、酒さ、アトピー性皮膚炎、乾癬、光線性障害(例えば日光誘発皮膚炎症及び発赤)皮膚萎縮症、皮膚色素脱失(ｓｋｉｎ ｄｙｓｐｉｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ)(斑(ｐａｔｃｈｅｓ/ｓｐｏｔｓ))、紫外皮膚炎(紅斑症：炎症及び皮膚発赤)、毛細血管拡張症、クーペロース又は光線角化症を含むものを含むことができ、グレーブス病、橋本病、強皮症、Ｉｇ４関連疾患又は天疱瘡から選択されるＴヘルパー２優勢自己免疫性徴候を含む炎症、及び好酸球性膀胱炎、好酸球性食道炎、好酸球性筋膜炎、好酸球性胃腸炎、好酸球増加症候群、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症、好酸球性喘息又は好酸球性肺炎から選択される好酸球性徴候を含む炎症を含むことができる。
［0097］ 本発明によると、細菌叢異常関連障害は、喘息、糖尿病、２型糖尿病、自己免疫疾患、低繊維レジメンに伴う疾患、アトピー性皮膚炎、急性及び/又は慢性関連皮膚炎、乾癬、炎症性腸疾患、大腸炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、肥満症、代謝性疾患若しくは障害、肝不全、ＮＡＳＨ、ＮＡＦＬＤ、肝線維症、腎不全、低繊維レジメンに伴う疾患を含み得る。
［0098］ 最後に、新生物は、免疫障害を伴う新生物の徴候、例えば肥満細胞症、肥満細胞白血病、Ｔヘルパー２偏向及び/又は免疫抑制腫瘍を含み得る。
［0099］ よって、第一の観点によると、本発明は、モラクセラ・カタラーリス、へモフィラス・インフルエンザ、クレブシエラ・ニューモニエ、スタフィロコッカス・アウレウス、ストレプトコッカス・ニューモニエ、ストレプトコッカス・ピオゲネス及び/又はストレプトコッカスサングイニスから選択される１以上の細菌種のアルカリ溶解により得ることができる精製細菌抽出物に関し、前記細菌抽出物は、１００マイクログラム/ｍｌ未満の核酸を含み、対象における感染及び/又は炎症及び/又は新生物及び/又は細菌叢異常に起因する急性及び慢性の免疫障害を処置及び/又は防止する方法において用いるためであり、前記精製可溶性細菌抽出物は、安定製剤であるか又はそうでないかいずれかであり、口周囲経路、特に気管内吸入、鼻内、粘膜、経粘膜、皮膚外用、頬側、舌下、肺、気管支内及び/又は肺内投与を介して、経腸経口投与のために用いられる用量より少ない用量レジメンで対象に投与される。
［00100］ 本発明は、モラクセラ・カタラーリス、へモフィラス・インフルエンザ、クレブシエラ・ニューモニエ、スタフィロコッカス・アウレウス、ストレプトコッカス・ニューモニエ、ストレプトコッカス・ピオゲネス及び/又はストレプトコッカスサングイニスから選択される１以上の細菌種のアルカリ溶解により得ることができる精製細菌抽出物にも関し、前記細菌抽出物は、１００マイクログラム/ｍｌ未満の核酸を含み、対象におけるアレルギー性鼻炎、鼻炎、上咽頭炎、副鼻腔炎、咽頭炎、扁桃炎、喉頭炎、気管炎、咽喉頭炎、インフルエンザ、呼吸器多核体ウイルス、ヒトライノウイルス(ＨＲＶ)、ライノシンシティアルウイルス(ＲＶ)、コロナウイルス(ＣｏＶ、ＳＡＲＳ-ＣｏＶ、ＭＥＲＳ-Ｃｏｖ、ＣＯＶＩＤ-１９など)、クループ、肺炎、過敏性肺臓炎、気管支肺炎、気管支炎、細気管支炎、肺炎、急性下気道感染を伴う閉塞性肺疾患、急性上気道感染を伴う閉塞性肺疾患、又は上皮繊毛運動障害及び/若しくは粘液クリアランス障害を伴う疾患を含む、上下気道感染及び/又は関連する続発症、二次感染、非呼吸器系ウイルス感染、非呼吸器系細菌感染、全身性感染、例えば敗血症、敗血症性ショック及びウイルス誘発性合併症から選択される感染を処置及び/又は防止する方法において用いるためであり、前記精製可溶性細菌抽出物は、安定製剤であるか又はそうでないかいずれかであり、口周囲経路、特に気管内吸入、鼻内、粘膜、経粘膜、皮膚外用、頬側、舌下、肺、気管支内及び/又は肺内投与を介して対象に投与される。
［00101］ 本発明は、さらに、モラクセラ・カタラーリス、へモフィラス・インフルエンザ、クレブシエラ・ニューモニエ、スタフィロコッカス・アウレウス、ストレプトコッカス・ニューモニエ、ストレプトコッカス・ピオゲネス及び/又はストレプトコッカスサングイニスから選択される１以上の細菌種のアルカリ溶解により得ることができる精製細菌抽出物にも関し、前記細菌抽出物は、１００マイクログラム/ｍｌ未満の核酸を含み、対象におけるアレルギー性/アトピー性呼吸器系及び非呼吸器系の徴候アトピー性皮膚炎、急性及び/又は慢性関連皮膚炎、アナフィラキシー並びに食物アレルギー、皮膚障害、皮膚炎症、例えば湿疹、酒さ、アトピー性皮膚炎、乾癬、光線性障害(例えば日光誘発皮膚炎症及び発赤)皮膚萎縮症、皮膚色素脱失(斑)、紫外皮膚炎(紅斑症：炎症及び皮膚発赤)、毛細血管拡張症、クーペロース又は光線角化症を含むものから選択される炎症、並びにグレーブス病、橋本病、強皮症、Ｉｇ４関連疾患又は天疱瘡から選択されるＴヘルパー２優勢自己免疫性徴候から選択される炎症、並びに好酸球性膀胱炎、好酸球性食道炎、好酸球性筋膜炎、好酸球性胃腸炎、好酸球増加症候群、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症、好酸球性喘息又は好酸球性肺炎から選択される好酸球性徴候を含む炎症を処置及び/又は防止する方法において用いるためであり、前記精製可溶性細菌抽出物は、安定製剤であるか又はそうでないかいずれかであり、口周囲経路、特に気管内吸入、鼻内、粘膜、経粘膜、皮膚外用、頬側、舌下、肺、気管支内及び/又は肺内投与を介して対象に投与される。
［00102］ 本発明は、さらに、モラクセラ・カタラーリス、へモフィラス・インフルエンザ、クレブシエラ・ニューモニエ、スタフィロコッカス・アウレウス、ストレプトコッカス・ニューモニエ、ストレプトコッカス・ピオゲネス及び/又はストレプトコッカスサングイニスから選択される１以上の細菌種のアルカリ溶解により得ることができる精製細菌抽出物にも関し、前記細菌抽出物は、１００マイクログラム/ｍｌ未満の核酸を含み、対象における喘息、糖尿病、２型糖尿病、自己免疫疾患、低繊維レジメンに伴う疾患、アトピー性皮膚炎、急性及び/又は慢性関連皮膚炎、乾癬、炎症性腸疾患、大腸炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、肥満症、代謝性疾患若しくは障害、肝不全、ＮＡＳＨ、ＮＡＦＬＤ、肝線維症、腎不全又は低繊維レジメンに伴う疾患から選択される細菌叢異常関連障害を処置及び/又は防止する方法において用いるためであり、前記精製可溶性細菌抽出物は、安定製剤であるか又はそうでないかいずれかであり、口周囲経路、特に気管内吸入、鼻内、粘膜、経粘膜、皮膚外用、頬側、舌下、肺、気管支内及び/又は肺内投与を介して対象に投与される。
［00103］ 本発明は、最後に、モラクセラ・カタラーリス、へモフィラス・インフルエンザ、クレブシエラ・ニューモニエ、スタフィロコッカス・アウレウス、ストレプトコッカス・ニューモニエ、ストレプトコッカス・ピオゲネス及び/又はストレプトコッカスサングイニスから選択される１以上の細菌種のアルカリ溶解により得ることができる精製細菌抽出物にも関し、前記細菌抽出物は、１００マイクログラム/ｍｌ未満の核酸を含み、対象における免疫障害を伴う新生物の徴候、例えば肥満細胞症、肥満細胞白血病、Ｔヘルパー２偏向及び/又は免疫抑制腫瘍から選択される新生物を処置及び/又は防止する方法において用いるためであり、前記精製可溶性細菌抽出物は、安定製剤であるか又はそうでないかいずれかであり、口周囲経路、特に気管内吸入、鼻内、粘膜、経粘膜、皮膚外用、頬側、舌下、肺、気管支内及び/又は肺内投与を介して対象に投与される。
［00104］ 第一の観点によると、抽出物は、上記の細菌種のそれぞれから少なくとも１つの株を含む。或いは、上記のリストから１以上の特定の株を除くか、又は１以上の異なる株で置換できる。好ましい口周囲ＯＭ細菌抽出物の場合、抽出物は、上気道の８つの細菌病原体、すなわちモラクセラ・カタラーリス、へモフィラス・インフルエンザ、クレブシエラ・ニューモニエ、スタフィロコッカス・アウレウス、ストレプトコッカス・ニューモニエ、ストレプトコッカス・ピオゲネス及びストレプトコッカスサングイニスから得られる。この観点による細菌抽出物は、口周囲ＯＭ３１４Ａ細菌抽出物、すなわち口周囲経路により投与される安定化された形のＯＭ細菌抽出物であってもよい。
［00105］ ＯＭ細菌抽出物は、１以上の細菌種、すなわちモラクセラ・カタラーリス、へモフィラス・インフルエンザ、クレブシエラ・ニューモニエ、スタフィロコッカス・アウレウス、ストレプトコッカス・ニューモニエ、ストレプトコッカス・ピオゲネス及びストレプトコッカスサングイニスから好ましくは１０を超えるｐＨでのアルカリ溶解と、１００マイクログラム/ｍｌ未満の核酸、少なくとも０.３ｍｇ/ｍＬの糖類、６と８ｍｇ/ｍＬの間の３０ｋＤａ未満の分子量のタンパク質、１.５と２.５ｍｇ/ｍＬの間のグルタミン酸(１４７ｇ/ｍｏｌ)に等価なアミノ酸(ＨＣｌ加水分解後に測定)、１から８０％のＬからＤにラセミ化された前記アミノ酸(このうち、１以上のラセミ化アミノ酸は、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、セリン、メチオニン、ヒスチジン、アラニン、アルギニン、フェニルアラニン、チロシン、ロイシン、リジン、バリン及びトレオニンから選択される)を含むようなその後の精製とにより得ることができる。抽出物の特性及びそれらの適切な調製方法についてのさらなる開示は、以下に示し、国際公開ＷＯ２００８/１０９６６９(その全内容は、参照により本明細書に組み込まれている)にも示されている。
［00106］ この第一の観点によると、本発明は、よって、上下気道感染、関連する続発症及び/又は二次感染、細菌叢異常及び/又は細菌叢異常関連障害を処置及び/又は防止する方法にも関し、安定化されているか又はそうでない前記口周囲ＯＭ細菌抽出物は、気管内吸入、鼻内、粘膜、経粘膜、局部、頬側、舌下、肺、気管支内又は肺内投与を介して、１日あたり０.００５ｍｇから１ｍｇの用量レジメンで、すなわち経腸経口投与のものより低い投与量で対象に投与され、最適保護を与えることにおいて効果的であった。好ましくは、この観点による細菌抽出物は、ＯＭ細菌抽出物又はその安定化された形、ＯＭ３１４Ａ細菌抽出物である。さらに、この観点によると、処置及び/又は防止される二次感染は、非呼吸器系ウイルス感染であり得る。
［00107］ 出願人は、以下の実施例において、第一の観点によるＯＭ細菌抽出物の鼻内投与が、インフルエンザウイルス感染後の肺組織内のウイルス力価を実質的に低減し、経口投与のものと比較した場合に、重感染動物の罹患率及び死亡率を、より少ない投与量で低減したことを明確に証明した。実際に、予防的処置としてのその鼻内又は気管内投与は、経腸投与経路よりも効力があることが示された。鼻内投与は、このマウスモデルにおいてインフルエンザに対して効果的な予防処置を構成し、この保護効果は、用量依存的であることが示された。出願人は、さらに、第一の観点による精製細菌抽出物の気管内又は鼻内直接投与が、これら２つのグリコサミノグリカンの長鎖アイソフォームを上方制御したことを証明し、このことにより、この細菌抽出物が、新規な有益な機構、例えば炎症の低減及び抗原提示の増加に関与していたことが証明された。
［00108］ 第一の観点によると、本発明は、よって、治療有効量のＯＭ細菌抽出物又は安定化形ＯＭ３１４Ａを口周囲経路を介して投与することを含む、感染及び/又は炎症及び/又は新生物及び/又は細菌叢異常に起因する急性及び慢性の免疫障害を処置及び/又は防止する方法に関する。
［00109］ 本発明は、特に、治療有効量のＯＭ細菌抽出物又は安定化形ＯＭ３１４Ａを口周囲経路を介して投与することを含む、アレルギー性鼻炎、鼻炎、上咽頭炎、副鼻腔炎、咽頭炎、扁桃炎、喉頭炎、気管炎、咽喉頭炎、インフルエンザ、呼吸器多核体ウイルス、ヒトライノウイルス(ＨＲＶ)、ライノシンシティアルウイルス(ＲＶ)、コロナウイルス(ＣｏＶ、ＳＡＲＳ-ＣｏＶ、ＭＥＲＳ-Ｃｏｖ、ＣＯＶＩＤ-１９など)、クループ、肺炎、過敏性肺臓炎、気管支肺炎、気管支炎、細気管支炎、肺炎、急性下気道感染を伴う閉塞性肺疾患、急性上気道感染を伴う閉塞性肺疾患、又は上皮繊毛運動障害及び/若しくは粘液クリアランス障害を伴う疾患を含む、上下気道感染及び/又は関連する続発症、二次感染、非呼吸器系ウイルス感染、非呼吸器系細菌感染、全身性感染、例えば敗血症、敗血症性ショック及びウイルス誘発性合併症から選択される感染を処置及び/又は防止する方法に関する。
［00110］ 本発明は、治療有効量のＯＭ細菌抽出物又は安定化形ＯＭ３１４Ａを口周囲経路により投与することを含む、それらに限定されないが、Ｔヘルパー１、Ｔヘルパー１７及びＴヘルパー２免疫応答間の不均衡、Ｔｒｅｇの不均衡、２型過敏症、免疫抑制、好酸球増加症、アレルギー及びアトピーを含む免疫障害を処置及び/又は防止する方法にも関する。
［00111］ 本発明は、さらに、治療有効量のＯＭ細菌抽出物又は安定化形ＯＭ３１４Ａを口周囲経路を介して投与することを含む、アレルギー性/アトピー性呼吸器系及び非呼吸器系の徴候アトピー性皮膚炎、急性及び/又は慢性関連皮膚炎、アナフィラキシー並びに食物アレルギー、皮膚障害、皮膚炎症、例えば湿疹、酒さ、アトピー性皮膚炎、乾癬、光線性障害(例えば日光誘発皮膚炎症及び発赤)皮膚萎縮症、皮膚色素脱失(斑)、紫外皮膚炎(紅斑症：炎症及び皮膚発赤)、毛細血管拡張症、クーペロース、光線角化症を含むものを含む炎症、或いはグレーブス病、橋本病、強皮症、Ｉｇ４関連疾患又は天疱瘡から選択されるＴヘルパー２優勢自己免疫性徴候を含む炎症、或いは好酸球性膀胱炎、好酸球性食道炎、好酸球性筋膜炎、好酸球性胃腸炎、好酸球増加症候群、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症、好酸球性喘息又は好酸球性肺炎から選択される好酸球性徴候を含む炎症を処置及び/又は防止する方法にも関する。
［00112］ 本発明は、さらに、治療有効量のＯＭ細菌抽出物又は安定化形ＯＭ３１４Ａを口周囲経路を介して投与することを含む、喘息、糖尿病、２型糖尿病、自己免疫疾患、低繊維レジメンに伴う疾患、アトピー性皮膚炎、急性及び/又は慢性関連皮膚炎、乾癬、炎症性腸疾患、大腸炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、肥満症、代謝性疾患若しくは障害、肝不全、ＮＡＳＨ、ＮＡＦＬＤ、肝線維症、腎不全、低繊維レジメンに伴う疾患から選択される細菌叢異常関連障害を処置及び/又は防止する方法に関する。
［00113］ 本発明は、さらに、治療有効量のＯＭ細菌抽出物又は安定化形ＯＭ３１４Ａを口周囲経路を介して投与することを含む、それらに限定されないが、Ｔヘルパー１、Ｔヘルパー１７及びＴヘルパー２免疫応答間の不均衡、Ｔｒｅｇの不均衡、２型過敏症、免疫抑制、好酸球増加症、アレルギー又はアトピーを含む免疫障害を処置及び/又は防止する方法に関する。
［00114］ 本発明は、最後に、治療有効量のＯＭ細菌抽出物又は安定化形ＯＭ３１４Ａを口周囲経路を介して投与することを含む、免疫障害を伴う新生物の徴候、例えば肥満細胞症、肥満細胞白血病、Ｔヘルパー２偏向及び/又は免疫抑制腫瘍から選択される新生物を処置及び/又は防止する方法に関する。
［00115］ 第二の観点によると、本発明は、対象における上記のような感染及び/又は炎症及び/又は新生物及び/又は細菌叢異常に起因する急性及び慢性の免疫障害を処置及び/又は防止する方法において用いるための、ラクトバチルス細菌株から選択される１以上の細菌種からのアルカリ溶解により得ることができる細菌抽出物にも関し、ラクトバチルス細菌抽出物は、安定製剤であるか又はそうでないかいずれかであり、これは、口周囲経路により、特に気管内吸入、鼻内、粘膜、経粘膜、皮膚外用、頬側、舌下、肺、気管支内及び/又は肺内投与を介して経腸経口投与のために用いる用量よりも少ない用量レジメンで対象に投与される。細菌抽出物は、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・ラムノサス、ラクトバチルス・プランタルム、ラクトバチルス・ジョンソニイ、ラクトバチルス・ヘルベティカス、ラクトバチルス・カゼイ・デフェンシス、ラクトバチルス・カゼイｓｓｐ.カゼイ、ラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・ブルガリカス、ラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・アシドフィラス、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・サリバリウス、ラクトバチルス・ラクティス及びラクトバチルス・デルブリュッキの１以上から選択される１以上のラクトバチルス細菌種を好ましくは含み得る。好ましくは、この観点による口周囲細菌抽出物は、上記のラクトバチルス細菌株から選択される１以上の細菌種からのアルカリ溶解により得ることができる細菌抽出物、又はその安定化形、すなわちＯＭ３１４Ｂ細菌抽出物である。
［00116］ この第二の観点によると、本発明は、よって、治療有効量のラクトバチルス細菌抽出物を口周囲経路を介して投与することを含む、感染及び/又は炎症及び/又は新生物及び/又は細菌叢異常に起因する急性及び慢性の免疫障害を処置及び/又は防止する方法に関する。
［00117］ 本発明は、よって、特に、治療有効量のラクトバチルス細菌抽出物を口周囲経路を介して投与することを含む、アレルギー性鼻炎、鼻炎、上咽頭炎、副鼻腔炎、咽頭炎、扁桃炎、喉頭炎、気管炎、咽喉頭炎、インフルエンザ、呼吸器多核体ウイルス、ヒトライノウイルス(ＨＲＶ)、ライノシンシティアルウイルス(ＲＶ)、コロナウイルス(ＣｏＶ、ＳＡＲＳ-ＣｏＶ、ＭＥＲＳ-Ｃｏｖ、ＣＯＶＩＤ-１９)、クループ、肺炎、過敏性肺臓炎、気管支肺炎、気管支炎、細気管支炎、肺炎、急性下気道感染を伴う閉塞性肺疾患、急性上気道感染を伴う閉塞性肺疾患、又は上皮繊毛運動障害及び/若しくは粘液クリアランス障害を伴う疾患を含む、上下気道感染及び/又は関連する続発症、二次感染、非呼吸器系ウイルス感染、非呼吸器系細菌感染、全身性感染、例えば敗血症、敗血症性ショック又はウイルス誘発性合併症から選択される感染を処置及び/又は防止する方法に関する。
［00118］ 本発明は、治療有効量のラクトバチルス細菌抽出物を口周囲経路を介して投与することを含む、それらに限定されないが、Ｔヘルパー１、Ｔヘルパー１７及びＴヘルパー２免疫応答間の不均衡、Ｔｒｅｇの不均衡、２型過敏症、免疫抑制、好酸球増加症、アレルギー及びアトピーを含む免疫障害を処置及び/又は防止する方法にも関する。
［00119］ 本発明は、さらに、治療有効量のラクトバチルス細菌抽出物を口周囲経路を介して投与することを含む、アレルギー性/アトピー性呼吸器系又は非呼吸器系の徴候、アトピー性皮膚炎、急性及び/又は慢性関連皮膚炎、アナフィラキシー或いは食物アレルギー、皮膚障害、皮膚炎症、例えば湿疹、酒さ、アトピー性皮膚炎、乾癬、光線性障害(例えば日光誘発皮膚炎症及び発赤)皮膚萎縮症、皮膚色素脱失(斑)、紫外皮膚炎(紅斑症：炎症及び皮膚発赤)、毛細血管拡張症、クーペロース又は光線角化症を含むものから選択される炎症、或いはグレーブス病、橋本病、強皮症、Ｉｇ４関連疾患又は天疱瘡から選択されるＴヘルパー２優勢自己免疫性徴候を含む炎症、或いは好酸球性膀胱炎、好酸球性食道炎、好酸球性筋膜炎、好酸球性胃腸炎、好酸球増加症候群、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症、好酸球性喘息又は好酸球性肺炎から選択される好酸球性徴候を含む炎症を処置及び/又は防止する方法に関する。
［00120］ 本発明は、さらに、治療有効量のラクトバチルス細菌抽出物を口周囲経路を介して投与することを含む、喘息、糖尿病、２型糖尿病、自己免疫疾患、低繊維レジメンに伴う疾患、アトピー性皮膚炎、急性及び/又は慢性関連皮膚炎、乾癬、炎症性腸疾患、大腸炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、肥満症、代謝性疾患若しくは障害、肝不全、ＮＡＳＨ、ＮＡＦＬＤ、肝線維症、腎不全又は低繊維レジメンに伴う疾患から選択される細菌叢異常関連障害を処置及び/又は防止する方法に関する。
［00121］ 本発明は、さらに、治療有効量のラクトバチルス細菌抽出物を口周囲経路により投与することを含む、免疫障害を伴う新生物の徴候、例えば肥満細胞症、肥満細胞白血病、Ｔヘルパー２偏向及び/又は免疫抑制腫瘍を含む新生物を処置及び/又は防止する方法に関する。
［00122］ ラクトバチルス細菌株から選択される１以上の細菌種からのアルカリ溶解により得ることができる安定細菌抽出物は、特に、鼻づまり又は鼻水を伴う感冒症状と通俗的によばれる鼻炎及び/又はアレルギー性鼻炎の処置及び/又は防止のために特に有用である。
［00123］ 第二の観点の好ましい実施形態によると、本発明は、よって、ラクトバチルス細菌株から選択される１以上の細菌種からのアルカリ溶解により得ることができる治療有効量のラクトバチルス細菌抽出物を口周囲経路を介して投与することを含む、上記のような感染及び/又は炎症及び/又は新生物及び/又は細菌叢異常に起因する急性及び慢性の免疫障害を処置及び/又は防止する方法に関する。好ましいラクトバチルス細菌抽出物は、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・ラムノサス、ラクトバチルス・プランタルム、ラクトバチルス・ジョンソニイ、ラクトバチルス・ヘルベティカス、ラクトバチルス・カゼイ・デフェンシス、ラクトバチルス・カゼイｓｓｐ.カゼイ、ラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・ブルガリカス、ラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・アシドフィラス、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・サリバリウス、ラクトバチルス・ラクティス及び/又はラクトバチルス・デルブリュッキの１以上から選択される１以上のラクトバチルス細菌種を含む。最も好ましくは、ラクトバチルス細菌抽出物は、上記のような安定化ＯＭ３１４Ｂ細菌抽出物である。
［00124］ 第二の観点による安定ラクトバチルス細菌抽出物は、よって、口周囲経路を介して、特に気管内吸入又は鼻内投与を介して、経腸経口投与に用いられる用量よりも少ない用量レジメンで投与される。
［00125］ インビボでの、ウイルス細胞力価の低減及びそれらに限定されないが、Ｈ１Ｎ１、ＲＳＶに対する抗ウイルス抗体の開始、並びにヒトＲＶに対するインビトロ有効性(ウイルス受容体ＩＣＡＭ-１の減少を伴うＩＦＮ、β-デフェンシンの誘導により例示され、よって上皮細胞へのウイルス付着の付着(喪失まで)の喪失の、ＯＭ並びに新しい安定ＯＭ３１４Ａ(Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３)、ＯＭ３１４Ｂ(Ｐ４)及びＯＭ-３１４Ｃ(Ｐ５)による誘導が確認される)をもって証明された、上皮細胞表面上のＯＭ並びに新しい安定ＯＭ３１４Ａ(Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３)、ＯＭ３１４Ｂ(Ｐ４)及びＯＭ-３１４Ｃ(Ｐ５)細菌抽出物の直接及び間接的抗ウイルス非特異的活性を考慮すると、このような口周囲投与経路が、上下気道感染、例えば鼻炎、アレルギー性鼻炎、上咽頭炎、副鼻腔炎、咽頭炎、扁桃炎、喉頭炎、気管炎、咽喉頭炎、インフルエンザ、呼吸器多核体ウイルス、インフルエンザ(Ｈ１Ｎ１など)でのウイルス感染後の細菌二次感染、ヒトライノウイルス(ＨＲＶ)、ライノシンシティアルウイルス(ＲＶ)、コロナウイルス(ＣｏＶ、ＳＡＲＳ-ＣｏＶ、ＭＥＲＳ-Ｃｏｖ、ＣＯＶＩＤ-１９など)、クループ、肺炎、気管支肺炎、気管支炎、細気管支炎、急性下気道感染を伴う閉塞性肺疾患、急性上気道感染を伴う閉塞性肺疾患、上皮繊毛運動障害及び/又は粘液クリアランス障害を伴う疾患を処置及び/又は防止する方法において特に有用かつ効果的であることが予測できる。
［00126］ これらの精製細菌抽出物は、上記のように安定化でき、よって、固体、半固体、液体又はエアロゾルの形のいずれかで安定細菌抽出物製剤として投与できる。
［00127］ 安定化細菌抽出物と薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物も提供される。これらの医薬組成物は、数か月間液体製剤で安定化及び保管でき、液体又は気化した形で患者に投与できる。或いは、これらは凍結乾燥及び/又は保管した後に、液体又はエアロゾル医薬として再処方できる。
［00128］ 本発明による安定医薬組成物は、上記の感染及び/又は炎症及び/又は新生物及び/又は細菌叢異常に起因する急性及び慢性の免疫障害を処置及び/又は防止する方法において特に有用である。
［00129］ これらの医薬組成物は、任意の形、液体、気体又はエアロゾル、半固体又は固体で数か月間安定のままであったので、鼻内、気管内、粘膜、経粘膜、局部、頬側、舌下、経口、肺、気管支内及び/又は肺内経路を介する投与のために処方できる。好ましくは、これらは、気管内吸入又は鼻内経粘膜経路により対象に投与できる。
［00130］ 液体又はエアロゾルであり、スプレー、液滴、コロイド、ミスト、雲霧状(ｎｅｂｕｌａｅ)又は微細化煙(ａｔｏｍｉｚｅｄ ｖａｐｏｒ)で処方される医薬組成物が特に好ましい。また好ましい医薬組成物は、液体又は半固体製剤、例えばエマルジョン、マイクロエマルジョン、水性分散液、油、ミルク、バルサム、フォーム、水性若しくは油性ローション、水性若しくは油性ゲル、クリーム、溶液、水アルコール溶液、水グリコール(ｈｙｄｒｏｇｌｙｃｏｌｉｃ)溶液、ヒドロゲル、セラム、軟膏(ｏｉｎｔｍｅｎｔｓ)、ムース、ペースト又は経皮パッチであり得る。ある他の好ましい実施形態において、前記組成物は、固体であり、粉剤又は粉砕可能な錠剤で処方される。
［00131］ 液体、半固体、固体及びスプレー医薬の調製において、上記の材料を、必要であれば任意の添加剤、例えばビヒクル、結合剤、香料、香味剤、甘味剤、着色剤、防腐剤、抗酸化剤、安定化剤及び界面活性剤とともに適当に用いることができる。
［00132］ 好ましい実施形態において、細菌抽出物医薬組成物は、鼻内経路を介して投与され、組成物は、エマルジョン、懸濁剤、コロイド状、ミスト、雲霧状、微細化煙又はスプレー、経鼻タンポン、粉剤、軟膏剤、クリーム、ローション剤、ゲル、ペースト、膏薬(ｓａｌｖｅ)、液剤、チンキ剤、パッチ又はストリップから選択される形であり得る。
［00133］ 別の好ましい実施形態において、細菌抽出物医薬組成物は、経口を介して投与され、ドライアイ用の点眼剤として用いられる生理的液体のプラスチック瓶に類似の単一用量(ｍｏｎｏｄｏｓｅ)プラスチック瓶のような単独用量(ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｓｅ)容器若しくは単一用量容器の形、又は単一用量アンプルの形であり得る。この好ましい実施形態による経口細菌抽出物液体製剤は、よって、安定製剤であり、前記単一用量容器中に、中和された(ｐＨ７に近い)液体製剤として長期間保つことができる。
［00134］ 本医薬組成物を調製するために、細菌抽出物を、従来の薬学的配合技術に従って、医薬的に許容される担体、補助剤及び/又は賦形剤と混合できる。薬学的に許容される担体は、任意の標準的な薬学的担体、例えばリン酸緩衝生理食塩水、水及びエマルジョン、例えば油/水又は水/油エマルジョン及び様々なタイプの湿潤剤を含む。細菌抽出物は、固体の薬学的賦形剤、例えばデンプン、セルロース、タルク、グルコース、ラクトース、ショ糖、ゼラチン、麦芽、米、穀粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、塩化ナトリウム、脱脂粉乳などを追加で含み得る。液体及び半固体賦形剤は、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノール及び石油、動物、植物又は合成起源のもの、例えばピーナッツ油、大豆油、鉱油、ごま油などを含む様々な油から選択できる。液体担体、特に注射用液剤のためのものは、水、生理食塩水、水性ブドウ糖及びグリコールを含む。担体、安定化剤及び補助剤の例について、Remington's Pharmaceutical Sciences、E. W. Martin編(Mack Publishing Company、第18版、1990)を参照されたい。医薬組成物は、安定化剤及び保存剤も含み得る。
［00135］ ある好ましい実施形態において、医薬組成物は、粉砕可能な錠剤として処方できる。この錠剤は、全体で又は例えば指の圧力で軽く粉砕して、適当なビヒクルの上にふりかけて投与できる。粉砕可能な錠剤は、直接打錠法及び賦形剤を用いて、個別のサブユニットの被覆を傷つけないようにプロセスにおいて注意しながら調製できる。粉砕可能な錠剤を調製するために適切な賦形剤は、単糖類及び二糖類、糖ポリオールなど又はそれらの組合せを含むチュアブル錠剤用に典型的に用いられるものを含む。例示的な賦形剤は、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、マルチトール、ラクトース、ショ糖、マルトース又はそれらの組合せを含む。任意の薬学的賦形剤、例えば希釈剤、滑沢剤、滑り剤(ｇｌｉｄａｎｔｓ)、香料、着色剤など、又は上記の少なくとも１つを含む組合せも、打錠マトリックス中に含むことができる。粉砕可能な錠剤は、製薬業界で知られている錠剤製造方法を用いて調製できる。
［00136］ 細菌抽出物製剤は、例えばハロゲン化金属、最も好ましくはハロゲン化銀を含むコロイドの形であってもよい。１以上の細菌抽出物と補助剤とを、コロイド粒子の中に組込むか、又はその中にカプセル化できる。或いは又はさらに、１以上の細菌抽出物と補助剤とは、コロイド粒子の表面に付着できる。有効剤と補助剤とが粒子に付着する手段は、抽出物、補助剤及びコロイド粒子の特徴に依存する。例えば、タンパク質は、粒子表面と疎水性相互作用を介して疎水性粒子に容易に吸着又は付着し、いくらかの中性乳化剤を置き換える。
［00137］ 本発明は、部分的に、上記の細菌抽出物の口周囲送達系の使用が、著しくより高い抗体力価、免疫応答の増進、並びに予防的及び治療的の両方の医薬組成物において用いる様々な抗原の免疫原性を増進するために安全で効果的なアプローチをもたらすという驚くべき発見に部分的に基づく。
［00138］ 本発明による、そして様々な実施形態において本明細書に記載する適切な投与量は、対象の状態、年齢及び種に依存して変動し、当業者が容易に決定できる。しかし、本発明によると、合計１日投与量は、大きく低減され、０.００５から１ｍｇの範囲、好ましくは０.０５から０.５ｍｇまで、最も好ましくは０.１から０.３ｍｇまでであり得、これらは単独又は分割用量として投与でき、さらに、必要とされた場合には上限を上回ることもできる。有利には、口周囲経路を介して投与される用量は、経口経腸経路を介して投与される用量よりも少ない(例えば半分の用量)。
［00139］ 別の観点は、本発明による細菌抽出物製剤の送達デバイスに関する。上下気道感染、関連する続発症及び/又は二次感染、細菌叢異常及び/又は細菌叢異常関連障害を処置及び/又は防止する方法において用いるための送達デバイスも提供される。
［00140］ 本発明によると、細菌抽出物製剤は、鼻内又は気管内経路を介して、経鼻吹込デバイス、鼻内吸入器、鼻内スプレーデバイス、アトマイザー、経鼻スプレーボトルボトル、単位用量容器、ポンプ、点滴器、スクイーズボトル、ネブライザー、定量吸入器(ＭＤＩ)、加圧式定量吸入器、吹込器、二方向デバイス、ドーズアンプル、鼻パッド、鼻スポンジ及び鼻カプセルにより投与できる。
［00141］ 経鼻スプレーは、液体又は固体経鼻スプレーであり得る。細菌抽出物製剤は、エアロゾル又は非エアロゾルの形で投与できる。経鼻送達デバイスは、鼻腔に正確な有効投与量を投与するために定量できる。経鼻送達デバイスは、単独単位送達又は複数単位送達のためであり得る。
［00142］ 細菌抽出物製剤をエアロゾルとして投与する場合、これらは、標準的な手順を用いて調製できる。例えば、エアロゾルスプレーは、適切な噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、炭化水素、圧縮空気、窒素、二酸化炭素又はその他の適切な気体を用いて、加圧容器から発生できる。投与量単位は、定量された量を送達するための弁を設けることにより決定できる。ポンプスプレーディスペンサーは、定量された用量又は特定の粒子若しくは液滴サイズを有する用量を供給できる。エアロゾル剤は、空気(又は気体)中の液体の滴又は固体の粉末のいずれかの懸濁物又は分散物であり得る。液体の滴は、液体、例えば水又は非水性溶媒中の薬物の溶液、懸濁液及び分散液から形成できる。エアロゾルは、任意の適切な装置、例えばＭＤＩ、ネブライザー又はミストスプレー器において生成できる。
［00143］ 本発明によるエアロゾルは、適切な機械的装置を用いて吹き入れ又は吸入できる。装置は、例えば、リザーバ、及びスプレーの形で薬学的用量を噴出するように適合された装置であるスプレー器を含み得る。投与すべきいくつかの用量を、所望により溶液若しくは懸濁液で、又は固体粒子製剤、例えば固体微粒子混合物でリザーバ中に含めることができる。
［00144］ ネブライザー装置は、液体の形の治療剤がミストとして噴霧されることを可能にする高速空気の流れを生成する。治療剤は、液体の形、例えば適切なサイズの粒子の溶液又は懸濁液で処方される。粒子は、ミクロン化されている。用語「ミクロン化」は、約１０μｍ未満の直径を有する粒子を約９０％以上有すると定義される。適切なネブライザー装置は、例えばＰＡＲＩ ＧｍｂＨ(Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ)により市販されている。他のネブライザー装置は、Ｒｅｓｐｉｍａｔ(Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ)及び例えば米国特許第７,５６８,４８０号及び６,１２３,０６８号並びにＷＯ９７/１２６８７に開示されているものを含む。
［00145］ ＤＰＩ装置を用いて、吸気の間に患者の気流中に分散され得る易流動性粉末の形で細菌抽出物を投与できる。外部エネルギー源を有するＤＰＩ装置も用いることができる。易流動性粉末を達成するために、細菌抽出物製剤は、適切な賦形剤(例えばラクトース)と組み合わせることができる。乾燥粉末組合せは、例えば、約１μｍと１００μｍの間の粒子サイズを有する乾燥ラクトースを、ベンゾジアゼピンのミクロン化粒子と組合せ、乾燥ブレンドすることにより作製できる。或いは、ベンゾジアゼピンは、賦形剤なしで処方できる。製剤を、乾燥粉末ディスペンサーに、又は乾燥粉末送達デバイスで用いるための吸入カートリッジ若しくはカプセルに装填する。市販されているＤＰＩ装置の例は、Ｄｉｓｋｈａｌｅｒ(ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈ ｌｉｎｅ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ、Ｎ.Ｃ.)(米国特許第５,０３５,２３７号)；Ｄｉｓｋｕｓ(ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ)(米国特許第６,３７８,５１９号；Ｔｕｒｂｕｈａｌｅｒ(ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、Ｄｅｌ.)(米国特許第４,５２４,７６９号)；及びＲｏｔａｈａｌｅｒ(ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ)(米国特許第４,３５３,３６５号)を含む。
［00146］ ＭＤＩ装置を用いて、測定された量の細菌抽出物製剤を、圧縮噴射気体を用いて発射できる。ＭＤＩ投与用の製剤は、液化噴射剤中の細菌抽出物製剤の溶液又は懸濁液を含む。噴射剤の例は、ヒドロフルオロアルカン(ＨＦＡ)、例えば１,１,１,２-テトラフルオロエタン(ＨＦＡ１３４ａ)及び１,１,１,２,３,３,３-ヘプタフルオロ-ｎ-プロパン(ＨＦＡ２２７)並びにクロロフルオロカーボン、例えばＣＣｌ3Ｆを含む。ＭＤＩ投与用のＨＦＡ製剤のさらなる成分は、共溶媒、例えばエタノール、ペンタン、水；並びに界面活性剤、例えばソルビタントリオレエート、オレイン酸、レシチン及びグリセリンを含む。細菌抽出物製剤は、ＭＤＩ装置の一部を形成するエアロゾル剤キャニスターに装填できる。
［00147］ 細菌抽出物製剤は、鼻腔に、粉末、例えばマイクロスフェアとして、経鼻吹き入れ器を介して送達できる。細菌抽出物製剤は、固体表面、例えば担体に吸収され得る。粉末又はマイクロスフェアは、乾燥した、空気により分配され得る形で投与できる。粉末又はマイクロスフェアは、吹き入れ器の容器内に保管できる。或いは、粉末又はマイクロスフェアは、カプセル、例えばゼラチンカプセルに、又は経鼻投与のために適合するその他の単独用量単位に充填できる。
［00148］ 細菌抽出物製剤は、経鼻スプレーアプリケータを通して送達される。組成物は、鼻内スプレー投与デバイス又はアトマイザーに入れられ、鼻孔の粘膜への送達のために対象の鼻孔にそれをスプレーすることにより投与できる。治療効果のために所望の全身性又は限局性のレベルを達成するために十分な量が投与される。
［00149］ 細菌抽出物製剤は、さらに、気管内経路を介して、気道、すなわち肺への経口吸入により投与できる。このような気管内は、固体又は液体をエアロゾル化し、口及びのどを介して肺にエアロゾルを送達することを必要とする。医薬の粒子は、乾燥粉末エアロゾル又は液体エアロゾルとして肺に投与できる。乾燥粉末エアロゾルは、乾燥粉末吸入器(ＤＰＩ)吸入装置を用いて肺に通常投与される。乾燥粉末吸入器は、呼吸作動式乾燥粉末吸入器、例えば米国特許第７,４３４,５７９号に記載されるものを含み得る。定量吸入器は、噴射剤、混合噴射剤若しくは混合溶媒、噴射剤及び/又はその他の賦形剤に懸濁された医薬を、コンパクト加圧エアロゾルディスペンサー中に含む。ＭＤＩ製品は、数百までの定量された医薬を発射できる。各作動は、典型的に２５と１００マイクロリットルの間の容量中の数マイクログラム(ｍｃｇ)からミリグラム(ｍｇ)までの有効成分を含み得る。
［00150］ 上記のように、別のタイプの液体エアロゾル分散装置は、噴射、振動するメッシュ又は医薬の粒子を含む懸濁物をエアロゾル化するためのその他の手段を用いるネブライザーである。
［00151］ 本発明による細菌抽出物製剤は、補助剤、浸透増進剤及び/又は溶媒をさらに含み得る。例えば、鼻内送達について、浸透増進剤を用いて、鼻粘膜を通しての組成物の浸透を増進できる。１以上のヒドロキシ基を含む化合物を、浸透増進剤として用いることができる。これらのヒドロキシ基含有化合物のいくつかは、組成物において溶媒としても機能する。浸透増進剤として用い得るヒドロキシ基含有化合物の非限定的な例は、アルコール類(例えばエタノール)、ジオール(例えばプロピレングリコール、１,２-プロパンジオールとしても知られる；１,３-プロパンジオール；１,３-ブタンジオール、１,２-ブタンジオール、２,３-ブタンジオール及び１,４ブタンジオールを含むブチレングリコール；ヘキシレングリコール；ジプロピレングリコール；１,５-ペンタンジオール；１,２-ペンタンジオール；１,８-オクタンジオール；エトヘキサジオール；ｐ-メンタン-３,８ジオール；２-メチル-２,４-ペンタンジオール)；トリオール(例えばグリセリン)、ポリオール(ポリエチレングリコール若しくはＰＥＧ、ポリプロピレングリコール、ポリソルベート及びソルビタンエステルを含む、例えば複数のヒドロキシ基を含む適切な高分子；並びに適切な糖アルコール)、シクリトール(例えばピニトール、イノシトール(ｉｎｓｏｉｔｏｌ))、環状ジオール(例えばシクロヘキサンジオール)、芳香族ジオール(例えばヒドロキノン、ビスフェノールＡ、レゾルシノール及びカテコール)を含む。
［00152］ 当業者は、本教示を他の浸透増進剤に当てはめることもできることを認識する。本発明において有用な他の浸透増進剤の非限定な例は、様々な薬局方概論において一般に安全と認められる(Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ Ａｓ Ｓａｆｅ；ＧＲＡＳ)単純な長鎖エステルを含む。これらは、単純な脂肪族、非飽和又は飽和エステルを含み得る。このようなエステルの非限定な例は、ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸ミリスチル、パルミチン酸オクチルなどを含む。他の浸透増進剤の非限定的な例は、アルコール類(例えば短鎖及び長鎖アルコール)、多価アルコール、アミン及びアミド、尿素、アミノ酸及びそれらのエステル、アミド、ピロリドン及びその誘導体、テルペン、脂肪酸及びそれらのエステル、大環状化合物、スルホキシド、界面活性剤、塩化ベンジルジメチルアンモニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、シネオール、コカミドプロピルベタイン、コカミドプロピルヒドロキシスルタイン、塩化ドデシルピリジニウム、ドデシルアミン、ヘキサデシルトリメチルアンモニオプロパンスルホネート、リモネン、リノール酸(ＯＡ)、リノレン酸(ＬＡ)、メントール、ラウリン酸メチル、メチルピロリドン、Ｎ-デシル-２-ピロリドン、ＮＬＳ、硫酸ニコチン、ノニル-ｌ,３-ジオキソラン、臭化オクチルトリメチルアンモニウム、オレイルベタイン、ＰＰ、ポリエチレングリコールドデシルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート(Ｔｗｅｅｎ２０又はポリソルベート２０)、ＳＬＡ、オレイン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、オクチル硫酸ナトリウム(ＳＯＳ)、ソルビタンモノラウレート(Ｓ２０)、テトラカイン及びＴｒｉｔｏｎＸ-１００を含む。増進剤は、適切であるべきである。当業者は、適合しないか又は粘膜に対して刺激性がある物質を避けるべきであることも認識している。
［00153］ 本組成物において用い得る薬学的に許容される溶媒又は賦形剤の例は、参考文献、例えばHandbook of Pharmaceutical Excipients (第5版、Pharmaceutical Press、London and American Pharmacists Association、Washington、2006)で見出すことができる。本組成物において用い得る薬学的に許容される溶媒の非限定的な例は、それらに限定されないが、プロピレングリコール(１,２-ジヒドロキシプロパン、２-ヒドロキシプロパノール、メチルエチレングリコール、メチルグリコール又はプロパン-１,２-ジオールとしても知られる)、エタノール、メタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、グリセロール、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、グリコール、クレモフォアＥＬ又は任意の形のポリエトキシル化ひまし油、ジプロピレングリコール、ジメチルイソソルビド、炭酸プロピレン、Ｎ-メチルピロリドン、グリコフロール、テトラエチレングリコール、プロピレングリコール脂肪酸エステル及びそれらの混合物を含む。
［00154］ 特に好ましくは、上下気道感染、関連する続発症及び/又は二次感染、細菌叢異常及び/又は細菌叢異常関連障害の処置及び/又は防止の方法において用いるための前記製剤を含む細菌抽出物製剤又は医薬組成物であって、気管内吸入により又は鼻内経粘膜経路により対象に投与されるものである。
［00155］ 鼻内投与された細菌抽出物は、鼻咽頭関連リンパ組織(ＮＡＬＴ)又は腸管関連リンパ組織(ＧＡＬＴ)に影響し、その後、腸由来Ｂ及びＴ細胞並びにマクロファージを気管支随伴リンパ組織に行かせ、このことが、気道におけるこれらの病原体に対する免疫応答を導き得るようである。
［00156］ 本発明は、治療有効量の本発明の安定細菌抽出物を口周囲経路を介して対象に投与することを含む、ウイルス感染及び/又はアレルギー疾患若しくは障害、例えば喘息、慢性閉塞性肺疾患及びアレルギー若しくは自己免疫のウイルス誘発性増悪を処置、防止又は減弱する方法にも関する。
［00157］ 喘息状態は、ステロイド抵抗性喘息、好中球性喘息又は非アレルギー性喘息であり得る。アレルギー性疾患又は障害は、好酸球性疾患又は障害、特に小結節、好酸球増加症、好酸球性リウマチ、皮膚炎、腫脹(ＮＥＲＤＳ)からなる群より選択される疾患又は障害であり得る。
［00158］ 本発明は、治療有効量の本発明の安定細菌抽出物を口周囲経路を介して対象に投与することを含む、それらに限定されないが、喘息、鼻炎、皮膚炎、薬物反応、好酸球性疾患若しくは障害、食道及び胃腸のアレルギーからなる群より選択されるアレルギー性疾患又は障害を含む、アレルギー性疾患又は障害の処置及び/又は防止、或いはアレルギー性疾患又は障害に罹患する対象の状態の改善の方法に関する。
［00159］ 本発明は、最後に、安定性が増進された細菌抽出物の調製のための新規な抽出プロセスを提供する。安定性が改良された細菌抽出物を調製するプロセスは、以下の工程を含む：
ａ．適切な培地中で各細菌株種を培養する工程と、
ｂ．ｐＨの±０.１の変動で好ましくは１０を超える初期ｐＨにて各株を溶解する工程と、
ｃ．工程(ｂ)で得られた抽出物のｐＨを、酢酸、プロピオン酸、乳酸、３-ヒドロキシプロパン酸、ピルビン酸、ブタン酸、２-ヒドロキシブタン酸、３-ヒドロキシブタン酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、それらの組合せ、又はそれらの薬学的に許容される塩及びエステルから選択される１以上の有機酸を加えることにより、１又は２単位減少させる工程と、
ｄ．工程(ｃ)の生成物を、少なくとも１回精密濾過膜に通し、生成物を限外濾過膜上に保持して、精製可溶性抽出物を得る工程と、
ｅ．最終ｐＨを、工程(ｂ)で用いた有機酸又はその組合せを加えることにより約７(±１.０)に調整する工程と、
ｆ．薬学的に許容される賦形剤又はビヒクルを加える工程。
［00160］ 本発明の第一の観点によると、細菌抽出物は、モラクセラ・カタラーリス、へモフィラス・インフルエンザ、クレブシエラ・ニューモニエ、スタフィロコッカス・アウレウス、ストレプトコッカス・ニューモニエ、ストレプトコッカス・ピオゲネス及び/又はストレプトコッカスサングイニスから選択される１以上の細菌種から得られる。好ましくは、本観点による細菌抽出物は、第一世代のＯＭ細菌抽出物薬物と同様に、上気道の８つの細菌病原体、すなわちモラクセラ・カタラーリス、へモフィラス・インフルエンザ、クレブシエラ・ニューモニエ、スタフィロコッカス・アウレウス、ストレプトコッカス・ニューモニエ、ストレプトコッカス・ピオゲネス及びストレプトコッカスサングイニスに由来する。
［00161］ 本発明の第二の観点によると、細菌抽出物は、ラクトバチルス細菌株、例えばラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・ラムノサス、ラクトバチルス・プランタルム、ラクトバチルス・ジョンソニイ、ラクトバチルス・ヘルベティカス、ラクトバチルス・カゼイ・デフェンシス、ラクトバチルス・カゼイｓｓｐ.カゼイ、ラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・ブルガリカス、ラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・アシドフィラス、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・サリバリウス、ラクトバチルス・ラクティス及びラクトバチルス・デルブリュッキから選択される１以上の細菌種から得られる。
［00162］ 本発明の第三の観点によると、細菌抽出物は、国際公開ＷＯ２００８/１０９６６７に記載されるように、１以上の大腸菌細菌株から得られる。
［00163］ 溶解は、６０℃の温度にて４０時間から１０日間の期間行うことができる。また、プロセスにおいて用い得る精密濾過膜は、０.４５ミクロンであり、限外濾過膜は、３０ＫＤａである。さらに、プロセスの(ｃ)部は、タンジェンシャルフロー濾過を含み、ここで、タンジェンシャルフロー濾過は、５から１５サイクル行うことができる。
［00164］ さらに、本発明は、上記のプロセスにより得ることができる細菌抽出物製剤生成物及び/又は医薬組成物に関する。
実施例１：アルカリ抽出物を安定化するプロセス
実施例１.１：安定細菌抽出物(ＯＭ３１４Ａ)の調製のための有機酸の添加 アルカリＯＭ３１４Ａ細菌抽出物をｐＨ５.０にに酸性化するために必要な酸及びｐＨ７.０に調整するためのＮａＯＨ １Ｎの量を、まず予め測定した。
２５ｍＬのＯＭ３１４Ａアルカリ濃縮物を、５０ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブに入れた。測定されるそのままのｐＨは、通常、ｐＨ約１０.５である。そのままのｐＨの測定の後に、小さいマグネティックスターラをチューブに入れ、６００ｒｐｍでの撹拌を開始する。必要量の各選択された有機酸を、ｐＨ５.０(５.０±０.２)に達するまで段階的に少しずつ入れる。各選択された有機酸の容量及び重量を記録する。酸性抽出物を、次いで、５０００ｇにて５分間遠心分離し、上清を、０.２μｍ濾過膜を通して濾過する。安定化細菌抽出物のｐＨを、次いで、ＮａＯＨ １Ｎを用いてｐＨ７.０±０.２に調整し、用いたＮａＯＨ １Ｎの容量を記録する。
第二の一連の調製において、３５ｍＬのＯＭ３１４Ａアルカリ濃縮物を、ｐＨ５.０(５.０±０.２)に達するまで段階的に少しずつ加える各選択された有機酸の必要量を用いて、ｐＨ１０.５からｐＨ５.０(５.０±０.２)まで調整した。酸の容量及び重量を記録する。酸性抽出物を、次いで、５０００ｇにて５分間遠心分離し、上清を、０.２μｍ濾過膜を通して濾過する。安定化細菌抽出物のｐＨを、次いで、ＮａＯＨ １Ｎを用いてｐＨ７.５±０.２に調整し、用いたＮａＯＨ １Ｎの容量を記録する。同様の手順を、滅菌層流キャビネットにおいて行って、安定化細菌抽出物の滅菌試料を調製する。
２５ｍＬ又は３５ｍＬのアルカリ性ＯＭ３１４Ａ細菌抽出濃縮物を、５０ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブに入れた。各酸を、予備測定において決定されたように予め決定した容量に基づいて又は秤量しながら加えた。酸性化は、最初、ｐＨ５.０まで行ったが、沈殿物が形成された。第二工程において、ｐＨを７.０±０.２及びそれぞれ７.５±０.２に調整した。有機酸でｐＨ５に調整し、ｐＨ７.０及びそれぞれ７.５にさらに調整したいくつかの溶液は、澄明なままであり、室温にて全観察期間中安定であったが、４～８℃では、数週間の保管後に沈殿物が形成された。
以下の表１は、３５ｍＬ溶液のＯＭ３１４Ａ細菌抽出物についてｐＨを７.５に調整するために用いた有機酸及び容量をまとめる。
Figure 2022525177000002
実施例１.２.無機カチオンの除去
実施例７.１に以前に記載された有機酸安定化ＯＭ３１４Ａ抽出物に存在する無機二価カチオンを除去するために、２５ｍｇのシュウ酸アンモニウム(１ｍｇ/ｍＬ)を加えた。強い乳白色の沈殿物が形成される。沈殿物を５０００ｇにて５分間遠心分離し、澄明な上清を、０.２μｍ濾過膜で濾過する。澄明な試料を、ＮａＯＨ １Ｎを用いてｐＨ７.０±０.１に調整する。このプロセスの困難性は、スケールアップであり、これは、遠心分離を必要とするであろう。さらに、シュウ酸塩は、鼻内又は口周囲製剤に適さないであろう。
実施例１.３.小分子及び無機塩の同時除去並びに有機酸安定化細菌抽出物の高分子画分の濃縮
ｐＨ１０.０から１１.０の間のアルカリ細菌抽出物を、４つの槽、２つのポンプ、２つの濾過膜、２つの膜間圧(ＴＭＰ１及びＴＭＰ２圧力調節弁)及び４つの回転弁間の接続を示す図である図２に模式図で示す精製ユニットに加えた。膜間圧(ＴＭＰ)：フィードから濾過メンブレンの濾液側までの平均印加圧。ＴＭＰ［バール］＝［(残留物での圧力＋濾液での圧力)/２］-濾液での圧力。ＴＭＰ１及びＴＭＰ２弁は、濾過膜の濾液側での圧力を生じ、これは、膜間圧(ＴＭＰ)を、適当な圧力レベルに調節する。
精密濾過：この設定において通常０.４５から０.２μｍであるこの濾過膜は、粒子を除くために用いられ、可溶性(非粒子状)物質を濾過膜の孔に通過させる。
限外濾過又はナノ濾過：これらの濾過膜は、ある範囲のカットオフを有する非常に小さい穴を有する(カットオフ値：ダルトン単位(１Ｄａ＝質量単位、１ｋＤａ＝１０００質量単位)で分子量で表す孔サイズ。１０ｋＤａの濾過膜は、孔より大きい物質又は１０ｋＤａより大きい分子を保持する。
(http://www.merckmillipore.com/CH/de/ps-learning-centers/ultrafiltration-learning- center/optimization-process-simulation/d#eb.qB.ZWQAAAFAUV8ENHoL,nav?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google. com%2F#tmpを参照されたい)。
実施例１.４：本発明による有機酸が包埋された安定化細菌抽出物を導く５工程プロセスの例(図２)
工程１：細菌細胞壁、細胞壁断片及び可溶性物質を含むアルカリ細菌抽出物(ｐＨ１０から１１)を、ポンプ１並びに槽３(図２)に接続された精密濾過０.４５μｍ膜及び０.４５μｍ通過物が装填された槽２(図２)に加えた。槽３を、ポンプ２(図２)、及び１０ＫＤ通過物を槽２に戻す限外濾過１０ＫＤ(ｋＤａｌｔｏｎ)ナノ濾過膜に接続する。小分子及び希釈水酸化ナトリウムを含む通過物を、細菌抽出物活性水溶性有効成分の槽２(図２)における連続抽出のために用いる。
槽２における細菌抽出物の初期容量の一方の半分を、精密ろ過し、０.４５μｍ通過物を槽３に通過させた。
工程２：第二濾過ユニットの電源を次いで入れ(ポンプ２)、５槽３から出てくる１０ｋＤａ通過物を、弁３を用いて槽２に戻した。槽２にある粗細菌抽出物の細菌可溶性成分の連続抽出を、細菌抽出物の初期容量の合計１０倍で１０ＫＤ通過物を抽出することにより行った。
工程３：この工程は、槽３にある低分子量成分を除去するために行った。透析濾過プロセスを、ＴＭＰ１調節の微調整とともに槽１をポンプ１に接続することにより開始して、槽２の容量を一定レベルに維持した。槽１は、透析濾過媒体として、水酸化ナトリウムでｐＨ１０.８から１１.０に調整した水を含んだ。透析濾過プロセス中に、槽３の限外濾過通過物を弁３及び最適流速に調整したＴＭＰ２を用いて廃液に接続した。槽３中の精製細菌抽出物に存在する望ましくない低分子量成分を除去するために、合計で５倍容量の透析濾過媒体が必要であった。
工程４：槽３に存在する精製抽出物の濃縮工程を、槽１とポンプ１との接続を解除した後に行った。槽３中の精製抽出物画分を、初期容量の半分に濃縮するとともに、通過物は弁３を介して廃液に行った。
工程５：濃縮精製細菌抽出物は、包埋有機酸塩を形成するために、有機酸の添加により安定化した。このプロセスは、ポンプ２及び弁２を閉じた後に行った。純液体有機酸又は固体有機酸それぞれの予め決めた容量、有機酸の濃縮溶液の予め決めた容量を、槽４から槽３へ弁４を介して加えて、７.５±０.２のｐＨ値に達した。ｐＨ調整のために、有機酸の添加中にプロペラの電源を入れ、槽３に装填したｐＨ電極を介してｐＨを調整した。
工程６：ｐＨ７.５にて有機酸塩の形で濃縮精製細菌画分を含む槽３を、滅菌槽５(滅菌バッグ又は熱滅菌ステンレス鋼槽)に接続した滅菌ラインに装填した滅菌０.２μｍ濾過膜ユニットを用いてインライン式で滅菌した。
液体製剤の最終的な使用及び経路(エアロゾル又は固体としての鼻内、吸入)に依存して、ポンプ２及び弁３を介して廃液に接続した限外濾過を用いてさらなる濃縮を行って、初期容量の２５％に達した。有機酸塩の存在により、噴霧乾燥プロセス、液滴及びエアロゾルとしての直接使用を可能にする高濃縮精製画分が達成できた。
類似のｐＨ(７.５±０.５)の生成物を、包埋塩を形成する異なる有機酸を用いて得た。
同じプロセスを、それぞれ３ｋＤ、１０ｋＤ、３０ｋＤ、１００ｋＤ、３００ｋＤポリスルホンタンジェンシャルフロー濾過膜とともに、代替タンジェンシャルフロー濾過膜設計として１０ｋＤ、３０ｋＤ、１００ｋＤ、３００ｋＤカットオフを用いる中空繊維を用いて反復した。
プロセスは、まず、濃縮工程(５００ｍＬに達する２倍から、２００ｍＬ容量に達する５倍濃縮まで)を用いて１Ｌ実験室スケールにて最初は行い、不要な小分子を、ｐＨ１０.５からｐＨ１１.０のＮａＯＨ-水溶液を用いる透析濾過工程により洗い流し、限外濾過の所望の残留物を、２倍にさらに濃縮した。次いで、有機酸を加えて、抽出物中に存在する正荷電基とｐＨ７.５±０.５にて塩を形成して、調製物を安定化した。同様に、高分子量画分の濃縮を、異なるカットオフを用いる低分子量画分を除去する限外濾過膜、それぞれ３ｋＤ、１０ｋＤ、３０ｋＤ、１００ｋＤ、３００ｋＤ、１０００ｋＤのそれぞれの限外濾過膜での濃縮工程を用いて行った。
以下の表に列挙する有機酸を、７.５±０.５の目標ｐＨ値で加えた。細菌抽出物の正荷電可溶性高分子量画分の包埋有機酸塩を、プロセス中、高分子量画分内に保った。
同様の手順を、１０Ｌ、１００Ｌ及び最後に４００Ｌで行って、１０ｋＤカットオフを用いてパイロット及び工業的バッチサイズを調製した。
好ましくは、低分子量塩及び分子を限外濾過により除去して、細菌抽出物の抗ウイルス特性が増進された濃縮高分子量画分を導くことができる。ｐＨ１０.８での５００ｍＬ細菌抽出物を、１０ｋＤａポリスルホン限外濾過膜を装填した実験室スケールの限外濾過システムに加えた。５００ｍＬの初期容量をおよそ１２０から１４０ｍＬの４倍に濃縮した後に、ｐＨ１１±０.２でのＮａＯＨ-水を用いる透析濾過を行った。５容量の透析濾過の後に、残留物を１００ｍＬまで濃縮して減らし、水で最終容量を１２５ｍＬに調整した後に、１０ｍＬのアリコートに異なる有機酸を加えた。
プロセスを、異なる細菌抽出物、例えばＯＭアルカリ抽出物精製画分、スタフィロコッカス、ストレプトコッカス、ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)、ラクトバチルスのアルカリ抽出物からのグラム陽性細菌精製画分、並びに大腸菌、クレブシエラ(Klebsiella)、ブランハメラ(Branhamella)、へモフィラス(Hemophilus)株のアルカリ抽出物のグラム陰性細菌精製画分を用いて行った。以下の表２は、ｐＨを７.５に調整するために用いた有機酸をまとめる。低分子量成分の除去後の細菌アルカリ抽出物精製画分を、以下の有機酸を用いてｐＨ７.５に調整し、その安定性を評価した。
Figure 2022525177000003
実施例１.５：小分子及び無機塩の同時除去、並びにラクトバチルス・ファーメンタムの有機酸安定化細菌抽出物の高分子量画分の濃縮(ＯＭ３１４Ｂ)。
１Ｌの容量のｐＨ１０.５±０.３のラクトバチルス・ファーメンタムのアルカリ細菌抽出物を、０.４５μｍ精密濾過膜及び１０ｋＤａｌｔｏｎカットオフの第二限外濾過膜を備えた限外濾過システムに加えた。細菌抽出物を、実施例７.３及び図１に記載するように、両方の濾過膜を用いて精製した。第一工程は、濃縮工程であり、その後に、抽出媒体として１０容量の通過物１０ｋＤを用いる連続抽出を行った。
次いで、５容量のＮａＯＨ水溶液を用いる透析濾過プロセスが、ｐＨ１０に調整した。
最終の４倍濃縮工程を加えた後に、包埋塩を形成する異なる有機酸を加えた。
プロセスは、まず濃縮工程(５倍、およそ２００ｍＬまで減らす)を用いて１Ｌスケールにて行い、不要な小分子を、５容量のｐＨ１０.５のＮａＯＨ-水溶液を用いる透析濾過工程により洗い流した。次いで、以下の表３に列挙する有機酸を加えて、抽出物中に存在する正荷電基と塩を形成して、調製物を安定化した。同様に、高分子量画分の濃縮を、他のカットオフを用いる低分子量画分を除去する限外濾過膜、それぞれ３ｋＤ、１０ｋＤ、３０ｋＤ、１００ｋＤ、３００ｋＤのそれぞれのポリスルホン濾過膜での濃縮工程を用いて行った。
以下の表に列挙する有機酸を、７.５±０.２の目標ｐＨ値で加えた。細菌抽出物の正荷電可溶性高分子量画分の包埋有機酸塩を、プロセス中、高分子量画分内に保った。
他の例において、プロセスを、以下のポリスルホン限外濾過膜カットオフ、それぞれ３ｋＤ、３０ｋＤ、１００ｋＤ、３００ｋＤを用いて反復した。
別の例において、低分子量塩及び分子を限外濾過により除去して、ラクトバチルス・ファーメンタム抽出物の抗ウイルス特性が増進された濃縮高分子量画分を導いた。ｐＨ１０.８での５００ｍＬラクトバチルス・ファーメンタムアルカリ抽出物を、１０ｋＤａｌｔｏｎポリスルホン限外濾過膜を装填した実験室スケールの限外濾過システムに加えた。５００ｍＬの初期容量をおよそ１２０から１４０ｍＬの４倍に濃縮した後に、ｐＨ１０.８から１１.０のＮａＯＨ-水を用いる透析濾過を行った。５容量の透析濾過の後に、高分子量画分(残留物)を１００ｍＬまで濃縮して減らし、水で最終容量を１２５ｍＬに調整した後に、１０ｍＬのアリコートに異なる有機酸を加えて、物理的安定性及び抗ウイルス活性を評価した。
以下の表３に、ラクトバチルス・ファーメンタム抽出物画分＞１０ｋＤａｌｔｏｎのｐＨを７.５に調整するために用いた有機酸を列挙する。
Figure 2022525177000004
他の例において、プロセスを、精密濾過中空繊維０.４５μｍ及び０.２μｍ並びに３０ｋＤ及び１００ｋＤのカットオフを有する限外濾過中空繊維をよりよい流速及びより短いプロセス時間を有するタンジェンシャルフロー濾過膜設計の代替として用いて反復した。
同様の手順を、１０Ｌ、１００Ｌ及び最後に４００Ｌで行って、１０ｋＤカットオフを用いるパイロット及び工業的バッチサイズを調製した。
実施例１.６：ラクトバチルス・ファーメンタムＩ３９２９ｐ(ＯＭ３１４Ｂ)についてのプロセス及び分析的特徴決定
実施例１.６.１ プロセス４ラクトバチルス・ファーメンタムＩ３９２９ｐ
溶解：ラクトバチルス・ファーメンタムＩ３９２９ｐバイオマスを、室温にて一晩融解した。行った溶解は、溶解１ｋｇあたり２５ｇのデシケーション時の合計乾燥重量(ＲＳ)を含む２ｋｇの合計質量を用いる溶解であった。バイオマスの必要量(バイオマスＲＳ結果に依存する)を、２５００ｍＬのミニ樽(参照：Ｓｅｍａｄｅｎｉ第６８６３号)に入れ、２ｋｇ ｑｓｐを、４０℃±５℃の予備加熱した精製水を用いて作製した。この溶液のｐＨを、次いでＮａＯＨ １０Ｎを用いて１０.０±０.１に調整した(ｐＨ：９.９８、２.８ｍＬのＮａＯＨ １０Ｎを用いて調整)。
アルカリ溶解を、(１ｃｍの生成物の渦を有するように)撹拌しながら４０℃±１℃の暖かい部屋に移した。４時間±５分の溶解の後に、ｐＨを調節した(溶解の最後のｐＨ：９.２８)。
溶解の最後の溶解物に相当する試料(「プロセス４-Ｅ１-溶解物」とよぶ)は、この工程にて行った。
濾過１：生成物の濾過のための設備は、図(図２)に従って準備した。濾過システムは、２つの濾過ループからなる。第一精密濾過(ＭＦと呼ぶ)は、タンク(図２の槽２)、ポンプ(図２のポンプ１)及び０.４５μｍのカットオフポイントの濾過システム(図２の精密濾過膜)からなる。第二ループ、限外濾過(ＵＦと呼ぶ)は、タンク(図２の槽３)、ポンプ(図２のポンプ２)及び３０ｋＤａのカットオフポイントの濾過システム(図２の限外濾過膜)からなる。濾過は、２０００ｍＬの実行容量を有する実験室スケールで行った。
プロセスの開始前に、濾過システムを、数バッチにわたる再現性について確認した。生成物の正しい濾過能力を証明するために、濾過システムに対して標準化透水性(ＮＷＰ)を行った。
生成のために用いた溶解物を、１ｃｍの生成物の渦を有するように撹拌した。生成物の温度を室温に冷却しながら、濾過プロセスが開始するのを待った。このプロセスにおいて、初期ｐＨ調整はなく、よって、濾過プロセスは直ちに開始した。
初期濃縮工程：濾過の第一工程に用いた生成物は、以下のパラメータを有した：溶解後のｐＨ調整なし(ｐＨ：９.２８)、温度３８℃、１ｃｍの生成物の渦を有するように撹拌した。
ＭＦループポンプ(図２のポンプ１)を、４０％のプロセススピードで開始して、生成物をシステムに充填した。この工程が一旦完了すると、ＭＦループでの生成物の再循環を開始し、ポンプスピードを、プロセススピードの７５％に達するように定期的に増加した。再循環することにより、親水性濾過システムが、システム内に存在する気泡を消去することにより馴化される。
流速及び圧力が安定した時に、濾過システムは、馴化されたと考えた。次いで、ＭＦループの通過物弁を開けて、０.５の濃縮係数(圧入力：２７０ｍｂａｒ、通過物流速：７５ｍＬ/分)で生成物の初期濃縮を行った。初期濃縮中に、ポンプ(図２のポンプ１)スピードは、プロセススピードの１００％(６００ｍＬ/分に相当する１００ｒｐｍ)まで徐々に増加した。
この工程と並行して、ＵＦループを馴化した。ＵＦループポンプ(図２のポンプ２)をプロセススピードの４０％で開始して、生成物をシステムに充填した。この工程が一旦完了すると、ＵＦループへの生成物の再循環を開始し、ポンプスピードを、プロセススピードの７５％に達するように定期的に増加した。再循環により、親水性濾過システムが、システム内に存在する気泡を消去することにより馴化される。
透析濾過：１/２(０.５×)濃度係数に達した時に、ＵＦ通過物を開けて、生成物の透析濾過を開始した(圧入力：７９３ｍｂａｒ、通過物流速：５３ｍＬ/分)。生成物の最適な抽出を得るために、図２の弁１により制御されるＭＦ ＴＭＰ(膜間圧)を、８５０ｍｂａｒに設定しなければならなかった(圧入力：１０６０ｍｂａｒ、通過物流速：４７ｍＬ/分)。
透析濾過中に、ＵＦポンプ(図２のポンプ２)のスピードを、通過物フローＭＦと等しいＵＦ通過物フローに達するように設定した。実際に、ＭＦタンク(図２の槽２)での容量は、透析濾過工程中にできるだけ安定に保たなければならなかった。
透析濾過は、サイクルにより行った。初期濃縮の最後に、ＭＦタンク(図２の槽２)にある容量が存在していた。この容量がＭＦ濾過システムを一旦通過すると、１サイクルとなった。このプロセスにおいて、透析濾過は５サイクルを必要とした。
最終濃縮：５透析濾過サイクルの最後に、ＵＦポンプを停止した。ＭＦ入力圧が増加し始めたときに、ＭＦポンプを終了した。この第一濾過工程の最後に、興味対象の生成物は、０.４５μｍより小さいサイズの要素を含んでいた。
濾過２：採集した興味対象の生成物(質量：９９６.０ｇ)は、次いで、３０ｋＤａカットオフのＵＦループ(図２の槽３、ポンプ２及び限外濾過膜)での５サイクルの精製の第二段階を経た。３０ｋＤａ通過物を、廃液に向けて開けた弁を用いて捨てた(図２)。３０ｋＤａ残留物の容量は、この精製の第二濾過工程中、透析濾過のためにｐＨ１０.０にてＮａＯＨ ０.００１Ｎ溶液を加えることにより、一定に維持した。ＵＦループポンプ(図２のポンプ２)を、プロセススピードの４０％にて開始して、生成物をシステムに充填した。
この工程が一旦完了すると、ＵＦループでの生成物の再循環を開始し、ポンプスピードを、プロセススピードの７５％に達するように定期的に増加した。再循環することにより、親水性濾過システムがシステム内に存在する気泡を消去することにより馴化される。
濾過システムが一旦馴化されると、ＵＦ通過物を開けて、生成物の濾過２を開始した(圧入力：６４０ｍｂａｒ、通過物流速：１０８ｍＬ/分)。生成物の最適な抽出を得るために、図２の弁２及び３により制御されるＵＦ ＴＭＰ(膜間圧)を、８５０ｍｂａｒに設定しなければならなかった(圧入力：９００ｍｂａｒ、通過物流速：１３４ｍＬ/分)。
濾過２工程中に、ＵＦタンク(図２の槽３)の容量を、できるだけ安定に保たなければならなかった。よって、ＵＦタンク(図２の槽３)のレベルが減少するにつれて、ＮａＯＨ ０.００１Ｍ溶液を添加した。加えたＮａＯＨ ０.００１Ｍ透析濾過溶液の容量に相当する５サイクルは、採集した興味対象の生成物の容量の５倍に等しい(５サイクルの透析濾過)。
濾過２工程の最後に、最終生成物を採集し(質量：９５１.４ｇ)、次いで２つの等分に分けた。この第二濾過工程の最後に、興味対象の生成物は、０.４５μｍより小さく、３０ｋＤａより高いサイズの要素を含んでいた。
中和前の濾過物に相当する試料(「プロセス４-Ｅ２-濾過物」と呼ぶ)は、この工程にて行った。
濾過物の第一部分を、次いで、プロピオン酸１％でｐＨ７.０±０.２にて中和し(０.５ｍＬのプロピオン酸１％でｐＨ７.１３に調整)、次いで、０.２μｍポリエーテルスルホン(ＰＥＳ０.２μｍ)滅菌メンブレンを用いる濾過を用いてバイオセーフティキャビネットの下で滅菌した。
プロセスの最後の中和濾過物に相当する試料(「プロセス４-Ｅ３-中和濾過物(プロピオン酸)」ＯＭ３１４Ｂと呼ぶ)は、この工程にて行った。
同時に、濾過物の第二部分を、９つの等分にさらに分けた。これらの部分のそれぞれを、次いで、塩酸２.５％(ｐＨ：７.０７)又は有機酸(ＯＭ３１４Ｂ)：ギ酸１/１００(ｐＨ：７.１６)、酢酸１/１００(ｐＨ：７.１６)、３-ヒドロキシ-ブタン酸１/１００(ｐＨ：７.１４)、アスパラギン酸０.１％(ｐＨ：７.１８)、乳酸１/５０(ｐＨ：７.０９)、グルタミン酸０.１％(ｐＨ：７.１４)、ピルビン酸１/１００(ｐＨ：７.１６)、アスコルビン酸０.１％(ｐＨ：７.１８))で７.０±０.２に中和した。
最後に、異なる生成物を、ＰＥＳ０.２μｍ滅菌メンブレンを用いる濾過を用いてバイオセーフティキャビネットの下で滅菌した。
プロセスの最後の異なる中和濾過物に相当する試料(「プロセス４-Ｅ４-中和濾過物(酸の名称)」と呼ぶ)は、この工程にて行った。
Figure 2022525177000005
実施例１.６.２ 分析的特徴決定法
ａ)乾燥重量法(溶解物)
溶解物の乾燥残渣は、熱重量分析の原理の後にハロゲンデシケーションを行うことにより決定した。測定操作の最初に、試料の重量を規定し、試料を、次いで、内蔵ハロゲンヒータを用いて迅速に加熱し、湿気を蒸発させた。乾燥中に、装置は、試料を連続的な様式で秤量した。乾燥が一旦終了すると、乾燥残渣の重量が表示された。
約２から５ｇの溶解物(Ｍ)を正確に秤量した。以下のパラメータを用いた：加熱モード：累進的；停止モード：一定重量；最終温度：１０５℃。分析が一旦終了すると、得られた残渣の最終質量(ｍ)を表示する秤量チケットが自動的に印刷された。乾燥残渣(ｍｇ/ｇで表す)＝(ｍ/Ｍ)×１,０００。測定は、試料に対して直接(合計)、及び５,０００×ｇにて５分間の遠心分離後(上清)に対して行った。
ｂ)乾燥重量法(濾過物)
濾過物の乾燥重量は、欧州薬局方２.２.３２に従って、１０５℃(オーブン)にて１６時間乾燥した約５ｇの濾過物を用いて行った。結果は、ｍｇ/ｇで表した。
ｃ)Ｌｏｗｒｙ法
このアッセイは、アルカリ性酒石酸銅溶液及びＦｏｌｉｎ試薬(欧州薬局方２.５.３３に基づく)とタンパク質との反応に基づいた。比色反応を導く２つの工程があった：アルカリ性媒体中でのタンパク質と銅との間の反応、及び銅処理タンパク質によるＦｏｌｉｎ試薬のその後の還元。タンパク質は、７５０ｎｍの最大吸収を有する特徴的な青色を有する還元種を生じるＦｏｌｉｎ試薬の還元をもたらした。結果は、ウシ血清アルブミンタンパク質(ＢＳＡ)標準曲線に対して表した。
試料調製：１.９ｍＬのリン酸緩衝液ｐＨ１１(１Ｌの水について３.５５ｇのＮａ2ＨＰＯ4及び４１ｍＬの０.１Ｍ ＮａＯＨ)を、１００μＬの各試料に加え、ボルテックスした。ＢＳＡ標準物質調製：ＢＳＡ溶液を、リン酸緩衝液で希釈して、０と４２０μｇ/ｍＬとの間に６点を有する標準曲線を準備した。手順：２０μＬの試料及び標準溶液を、９６ウェルマイクロプレートに入れた。２５μＬのＡ試薬(Ｂｉｏ-Ｒａｄ(登録商標)Ｌｏｗｒｙキット)を、各ウェルに直ちに加え、室温にて１０分間インキュベートした。２００μＬのＢ試薬(Ｂｉｏ-Ｒａｄ(登録商標)Ｌｏｗｒｙキット)を加え、混合し、室温にて２０分間インキュベートした。混合の後に、吸光度を７５０ｎｍにて読み取った。結果：タンパク質濃度は、標準曲線から計算した：タンパク質濃度(ｍｇ/ｍＬ)＝［(ｙ－ｂ)/ａ］＊試料希釈度、ｙ＝試料の吸光度、ａ＝校正曲線の傾き；ｂ＝校正曲線の原点での縦座標であり、結果をｍｇタンパク質/ｍＬとして表す。
ｄ)全糖法
アンスロンと硫酸媒体中で加熱された場合、炭水化物は、６２５ｎｍにて吸収する発色団を形成する。
グルコース標準物質調製：Ｄ-グルコースを精製水に溶解及び希釈して、０と１００(μｇ/ｍＬ)の間に５点を有する標準曲線を準備した。手順：試験する０.１ｍＬの溶液(すなわち濃縮物)と０.９ｍＬの精製水とを、氷浴中のチューブに入れた。５.０ｍＬのアンスロン試薬(１００ｍＬの８５％硫酸中の１６０ｍｇのアンスロン)を加え、激しく振とうした。溶液を沸騰水浴中で１５分間加熱し、次いで氷浴中で冷却し、時々振とうした。溶液を室温にて１５分間放置した。チューブをボルテックスし、溶液を測定セル中に移して、室温で３０分間放置した後に、６２５ｎｍにて吸光度を測定した。結果：炭水化物濃度は、標準曲線から計算した：炭水化物含量(ｍｇ/ｍＬ)＝(［(ｙ－ｂ)/ａ］＊１０)/(１,０００)、ｙ＝試料の吸光度；ａ＝校正曲線の傾き；ｂ＝校正曲線の原点での縦座標であり、結果をｍｇ炭水化物/ｍＬとして表す。
ｅ)全ＲＮＡアッセイ
全ＲＮＡ精製及びアッセイを、供給業者の推奨に従ってＲＮｅａｓｙ(登録商標)ミニキットデータシートに基づいて行った。簡単に述べると、６００μＬの細菌抽出物を、ＲＮｅａｓｙ(登録商標)スピンカラムに移し、８,０００×ｇにて１５秒遠心分離した。次いで、７００μＬのＲＷ１緩衝液をＲＮｅａｓｙ(登録商標)カラムに加え、８,０００×ｇにて１５秒遠心分離して、スピンカラムメンブレンを洗浄した。同じ工程を、５００μＬのＲＰＥ緩衝液を用いて２回行い、８,０００×ｇにて１５秒及び８,０００×ｇにて２分間連続して遠心分離した。いずれの可能性のあるＲＰＥ緩衝液の持ち越しを排除するために、スピンカラムをフルスピードで１分間遠心分離した。ＲＮＡを溶出するために、３０μＬのＲＮアーゼフリー水をスピンカラムメンブレンに直接加え、カラムを８,０００×ｇにて１分間遠心分離した。精製全ＲＮＡは、ＮａｎｏＤｒｏｐ(ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ)分光光度計を用いて２６０ｎｍにて検出した。
ｆ)全ＤＮＡアッセイ
全ＤＮＡ精製及びアッセイを、供給業者の推奨に従ってＤＮｅａｓｙ(登録商標)血液及び組織キットデータシートに基づいて行った。簡単に述べると、６００μＬの細菌抽出物をＤＮｅａｓｙ(登録商標)ミニスピンカラムに移し、６,０００×ｇにて１分間遠心分離した。次いで、５００μＬのＡＷ１緩衝液をＤＮｅａｓｙ(登録商標)ミニカラムに加え、６,０００×ｇにて１分間遠心分離した。５００μＬのＡＷ２緩衝液を加え、スピンカラムを２０,０００×ｇにて３分間遠心分離して、ＤＮＡメンブレンを乾燥させた。１００μＬのＡＥ緩衝液をＤＮｅａｓｙ(登録商標)メンブレンに加え、１分間インキュベートし、６,０００×ｇにて１分間遠心分離して、ＤＮＡを溶出した。最大ＤＮＡ収率のために、溶出を１回繰り返した。精製全ＤＮＡは、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計を用いて２６０ｎｍにて検出した。
ｇ)リムルスアメーバ様細胞溶解物ＬＡＬアッセイ
内毒素アッセイを、供給業者の推奨に従ってＰｉｅｒｃｅ(商標)発色内毒素定量(Ｑｕａｎｔ)キットデータシートに基づいて行った。全ての試料を１：１０に希釈して、試料の固有の色が吸光度の読み取り値を変更しないようにした。簡単に述べると、内毒素標準溶液(範囲０.１～１.０ＥＵ/ｍＬ)を、内毒素ストック溶液(１０ＥＵ/ｍＬ)から調製した。５０μＬの内毒素標準、ブランク(内毒素フリー水)及び試料をウェルごとに入れた。５０μＬの再構成したアメーバ様細胞溶解物試薬を加え、プレートを３７℃にて１５分間インキュベートした。１００μＬの発色基質溶液をウェルごとに加え、３７℃にて６分間インキュベートした。ちょうど６分で、５０μＬの停止溶液(２５％酢酸)を加えた。アッセイ完了の直後に光学密度を４０５ｎｍにて測定した。
ｈ)アミノ酸法：
Ｄ-及びＬ-アミノ酸は、逆相高性能液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)により決定した。電子レンジで試料を加水分解した後に、アミノ酸を、キラルチオールＮ-イソブチリル-Ｌ-システインとともにｏ-フタルアルデヒドを用いて誘導体化した。検出は、３３８ｎｍにてＵＶ検出により行った。(Bruckner，H.、T. Westhauser、H. Godel. Liquid chromatographic determination of D- and L-amino acids by derivatization with O-phthaldialdehyde and N-isobutyryl-L-cysteine. J. Chromatography A、1995、711、201～21)。
標準溶液を、塩酸(ＨＣｌ)０.０１Ｎ中に２.５μｍｏｌ/ｍＬにて異なるアミノ酸を用いて調製した：アスパラギン酸(Ａｓｐ)、セリン(Ｓｅｒ)、グルタミン酸(Ｇｌｕ)、ヒスチジン(Ｈｉｓ)、アルギニン(Ａｒｇ)、トレオニン(Ｔｈｒ)、アラニン(Ａｌａ)、チロシン(Ｔｙｒ)、バリン(Ｖａｌ)、メチオニン(Ｍｅｔ)、リジン(Ｌｙｓ)、イソロイシン(Ｉｌｅ)、ロイシン(Ｌｅｕ)、フェニルアラニン(Ｐｈｅ)、グリシン(Ｇｌｙ)、シスチン(Ｃｙｓ))。これらの溶液を、ｐＨ９.２にて０.１Ｍ四ホウ酸ナトリウム十水和物緩衝液を用いて０.５μｍｏｌ/ｍＬに希釈した。チューブにおいて、２.０ｍＬの試料溶液を２.０ｍｌの水、２４０μｌの１-ドデカンチオール及び８ｍＬのＨＣｌ２５％に加えた。これらを電子レンジ中で１８０℃、１３２０ワットにて１５分間加水分解した。溶液を室温に放置し、５μｍにて濾過した。５０.０μｌを乾燥蒸発させ、１００μｌのＨＣｌ０.０１Ｎで再構成した。試料及び標準溶液を、１０℃のＨＰＬＣシステム中に保ち、以下の注入モードで注入した：５.０μｌのｐＨ９.２の０.１Ｍ四ホウ酸ナトリウム十水和物緩衝液、２.０μｌの誘導体化溶液(１.０ｍｌメタノール中に可溶化した２３ｍｇのフタルアルデヒド及び５０ｍｇのＮ-イソブチリル-Ｌ-システイン)、２.０μｌの試料又は標準溶液を、オートサンプラーにより抜き取り、５回混合し、注入した。ＨＰＬＣカラムは、Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ Ｃ１８、５μｍ、４.６×２５０ｍｍと、Ｓｕｐｅｌｃｏ ＬＣ１８、５μｍ、４.６×２０ｍｍプレカラムであった。溶出のために、ｐＨ５.９に調整した２３ｍＭ酢酸ナトリウム(溶離液Ａ)及びメタノール-アセトニトリル混液(１２：１、ｖ/ｖ)(溶離液Ｂ)から勾配を形成した。勾配は、１ｍｌ/分の流速で、４５分間での４％Ｂから３３％Ｂ、次いで３０分間での５６％Ｂまで(及び８５％Ｂまでのすすぎ工程)から形成した。遊離アミノ酸も、ＨＰＬＣバイアル中でＥ２-濾過物溶液を直接用いてＨＣｌ加水分解工程なしで各試料について別に試験し、遊離アミノ酸は、加水分解なしでは検出されなかった。
ｉ)安定性中に得られた分光光学的結果
中和濾過物溶液を、室温(２０℃±５℃)又は４℃にて安定性に付した。各時点にて、溶液の吸光度を３００と７００ｎｍの間で記録した。スペクトルプロフィールを、ノイズあり(例えば図２７、溶液中の沈殿物を示す)又は平滑(例えば図２７)として目視で評価した。吸光度は、定量評価のために３２０ｎｍにて抽出した。
ｊ)リリース時の結果
全てのＥ２-濾過物溶液をプロセスの後に凍結し、分析前に４℃にて一晩融解した。
実施例１.６.３.リリース時(Ｔ０)のプロセス４ラクトバチルス・ファーメンタムＩ３９２９ｐ最終試料の分析的特徴決定
Figure 2022525177000006
Figure 2022525177000007
Figure 2022525177000008
塩酸で中和したＷＯ２００８/１０９６６９に記載される工業的バッチ(ＯＭ-１３-ＢＶ)(ＨＣＬ工業的バッチ１６１９０６４)は、中和直後のＴ０にて既に開始する沈殿物を示した。
プロセス４-Ｅ４-中和濾過物は、４℃又は室温にて少なくとも６か月物理的に安定であった。これらは、これらの条件において１２か月間安定であると考えられる。
安定性中に得られたＭｉｐ３-アルファ(ＣＣＬ２０)の結果：
ケモカイン(Ｃ-Ｃモチーフ)リガンド２０(ＣＣＬ２０)又は肝臓活性化調節ケモカイン(ＬＡＲＣ)又はマクロファージ炎症タンパク質-３(ＭＩＰ-３-アルファ、ＣＣＬ２０)は、ＣＣケモカインファミリーに属する小サイトカインである。これは、リンパ球について強く走化性であり、好中球を弱く誘引する。ＣＣＬ２０は、粘膜リンパ様組織の形成及び機能に、これらの組織を囲む上皮細胞に向かうリンパ球及び樹状細胞の化学誘引を介して関与する。ＣＣＬ２０は、ケモカイン受容体ＣＣＲ６に結合し、それを活性化することにより、その標的細胞に対する効果を誘発する。
ＴＨＰ-１株化細胞は、ＡＴＣＣコレクション＃ＴＩＢ-２０２から購入した。ＴＨＰ-１株化細胞は、急性単球性白血病の１歳男子の末梢血に由来した。ＴＨＰ-１ワーキングセルバンクのバイアルを、このバイオアッセイにおいて、分化後のマクロファージ様細胞として用いた。
中和濾過物溶液を、室温(２０℃±５℃)又は４℃にて安定性に付した。試料を異なる時点で採取し、さらなるバイオアッセイのために凍結した。全ての溶液(Ｔ０及び安定性時点)を、分析前に４℃にて一晩融解した。
分化：ＴＨＰ-１細胞を、ホルボール１２-ミリステート１３-アセテート(ＰＭＡ)を用いて、細胞懸濁物中(１×１０6細胞/ｍＬ)に１００ｎｇ/ｍＬのＰＭＡの最終濃度になるように分化させた。１００.０μＬ/ウェルのＰＭＡ細胞懸濁物を、９６ウェル細胞培養プレートの各ウェルに分配した。細胞を、３７℃にて７２時間インキュベートした。
刺激：１０点の系列希釈(３.１６倍の系列希釈)を、ディープウェルプレート中の培地を用いて行った：２μｇ/ｍＬから０.０６μｇ/ｍＬまでのＰＡＭ３ＣＳＫ４(ＭＩＰ-３α分泌についての参照陽性対照)。６点の系列希釈(３.１６倍の系列希釈)を、ディープウェルプレート中の培地を用いて行った：ディープウェルの最初のウェルへの２００μＬの試験試料＋４００μＬの培地、次いで１９０μＬを４１０μＬの培地で希釈した(３.１６倍)。１００μＬ/ｗの上清を細胞とともにプレートから取り出した。１００.０μＬ/ｗの培地を細胞とともにプレートの各ウェルに分配した。プレートを３７℃にて２４時間インキュベートした。
上清の採集：各ウェル中の７５μＬの上清を採集し、９６ＰＰマイクロプレートに分配した。プレートを密閉し、ＥＬＩＳＡアッセイを行うまで超低温フリーザに保管した。ＥＬＩＳＡ試験：マイクロプレートウェルを、１００.０μＬ/ウェルの抗ヒトＭＩＰ-３α(捕捉抗体)で被覆した。プレートを密閉箔で覆い、適当にインキュベートした。インキュベーションの完了後に、自動化マイクロプレート洗浄機を用いて洗浄工程を行った。飽和工程の日に、上清プレートを＋４℃にて融解した。飽和工程：２５０.０μＬ/ウェルの試薬希釈剤を加え(ＰＢＳ中の１％ＢＳＡ)、プレートを適当にインキュベートした。飽和工程中に、上清及び標準物質ＭＩＰ-３αの系列希釈を準備した。標準曲線を、各ＥＬＩＳＡプレートについて行った。インキュベーションの完了後に、洗浄工程を行い、試料をウェルに分配し、プレートを適当にインキュベートした。インキュベーションの完了後に、洗浄工程を行い、ビオチン化ヤギ抗ヒトＭＩＰ-３α(検出抗体工程)を分配した。プレートを適当にインキュベートした。インキュベーションの完了後に、洗浄工程を行い、ストレプトアビジン-ＨＲＰコンジュゲートを分配した。プレートを適当にインキュベートした。インキュベーションの完了後に、洗浄工程を行い、酵素基質を添加し、ＯＤを４５０ｎｍにて読み取った。ブランクの減算及び５４０ｎｍでの波長補正を、ＥＬＩＳＡキットの供給業者の推奨に従って行った。
安定性中のプロセス４-バイオアッセイの結果は、プロセス４-Ｅ３-中和濾過物が、室温(２０℃±５℃)又は４℃にて少なくとも１か月の間安定であったことを示す。
実施例１.７ １８大腸菌株の多価アルカリ溶解物混合物
実施例１.７.１. プロセス第５番 １８大腸菌株の多価アルカリ溶解物混合物(ＯＭ３１４Ｃ)
アルカリ溶解：ＷＯ２００８/１０９６６７に記載される１８株のアルカリ溶解物の大腸菌混合物の一部を、生成において回収し、２５００ｍＬミニ樽(参照：Ｓｅｍａｄｅｎｉ第６８６３号)に保管した。
溶解の最後の溶解物に相当する試料(「プロセス５-Ｅ１-溶解物」と呼ぶ)は、この工程にて行った。
濾過１：生成物の濾過の設備は、図(図２)に従って準備した。濾過システムは、２つの濾過ループからなった。第一精密濾過(ＭＦと呼ぶ)は、タンク(図２の槽２)、ポンプ(図２のポンプ１)及び０.４５μｍのカットオフポイントの濾過システム(図２の精密濾過膜)からなる。第二ループ、限外濾過(ＵＦと呼ぶ)は、タンク(図２の槽３)、ポンプ(図２のポンプ２)及び３０ｋＤａのカットオフポイントの濾過システム(図２の限外濾過膜)からなる。濾過は、２０００ｍＬの実行容量を有する実験室スケールで行った。
プロセスの開始前に、濾過システムが、複数バッチにわたって再現性を有することを確認しなければならなかった。生成物の正しい濾過能力を証明するために、濾過システムに対してＮＷＰ(標準化透水性)を行った。
生成のために用いた溶解物を、精製水でまず４倍に希釈した(５００.８ｇの溶解物及び１５０２.７ｇの精製水)。生成物を、１ｃｍの生成物の渦を有するように撹拌した。生成物の温度を室温に冷却しながら、濾過プロセスが開始するのを待った。このプロセスにおいて、ｐＨ１０.５～１０.８にｐＨを調整した(２.１ｍＬの純ピルビン酸を用いてｐＨ１０.６８に調整)。
初期濃縮：濾過の第一工程に用いた生成物は、以下のパラメータを有した(ｐＨ：１０.６８)、温度２９℃、１ｃｍの生成物の渦を有するように撹拌した)。ＭＦループポンプ(図２のポンプ１)を、４０％のプロセススピードで開始して、生成物をシステムに充填した。この工程が一旦完了すると、ＭＦループでの生成物の再循環を開始し、ポンプスピードを、プロセススピードの７５％に達するように定期的に増加した。再循環することにより、親水性濾過システムがシステム内に存在する気泡を消去することにより馴化される。
流速及び圧力が安定した時に、濾過システムは、馴化されたと考えた。次いで、ＭＦループの通過物弁を開けて、０.５の濃縮係数(圧入力：２００ｍｂａｒ、通過物流速：８９ｍＬ/分)で生成物の初期濃縮を行った。初期濃縮中に、ポンプ(図２のポンプ１)スピードは、プロセススピードの１００％(６００ｍＬ/分に相当する１００ｒｐｍ)まで徐々に増加した。
この工程と並行して、ＵＦループを馴化した。ＵＦループポンプ(図２のポンプ２)をプロセススピードの４０％で開始して、生成物をシステムに充填した。この工程が一旦完了すると、ＵＦループへの生成物の再循環を開始し、ポンプスピードを、プロセススピードの７５％に達するように定期的に増加した。再循環により、親水性濾過システムが、システム内に存在する気泡を消去することにより馴化される。
透析濾過：０.５濃度係数に達した時に、ＵＦ通過物を開けて、生成物の透析濾過を開始した(圧入力：７８６ｍｂａｒ、通過物流速：８０ｍＬ/分)。生成物の最適な抽出を得るために、図２の弁１により制御されるＭＦ ＴＭＰ(膜間圧)を、８５０ｍｂａｒに設定しなければならなかった(圧入力：９５０ｍｂａｒ、通過物流速：６０ｍＬ/分)。
透析濾過中に、ＵＦポンプ(図２のポンプ２)のスピードを、通過物フローＭＦと等しいＵＦ通過物フローに達するように設定した。実際に、ＭＦタンク(図２の槽２)での容量は、透析濾過工程中にできるだけ安定に保たなければならなかった。
透析濾過は、サイクルにより行った。初期濃縮の最後に、ＭＦタンク(図２の槽２)にある容量が存在していた。この容量がＭＦ濾過システムを一旦通過すると、１サイクルとなった。このプロセスにおいて、透析濾過は５サイクルを必要とした。
最終濃縮：５透析濾過サイクルの最後に、ＵＦポンプを停止した。ＭＦ入力圧が増加し始めたときに、ＭＦポンプを終了した。この第一濾過工程の最後に、興味対象の生成物は、０.４５μｍより小さいサイズの要素を含んでいた。
濾過２：採集した興味対象の生成物(質量：１１４６.３ｇ)は、次いで、３０ｋＤａカットオフポイントのＵＦループ(図２の槽３、ポンプ２及び限外濾過膜)での５サイクルの精製の第二段階を経た。通過物は、図２で述べたように廃液であった。この精製の第二濾過工程中、ｐＨ１０.０にてＮａＯＨ ０.００１Ｎ溶液を加えることにより、一定容量を維持した。
ＵＦループポンプ(図２のポンプ２)を、プロセススピードの４０％にて開始して、生成物をシステムに充填した。この工程が一旦完了すると、ＵＦループでの生成物の再循環を開始し、ポンプスピードを、プロセススピードの７５％に達するように定期的に増加した。再循環することにより、親水性濾過システムがシステム内に存在する気泡を消去することにより馴化される。
濾過システムが一旦馴化されると、ＵＦ通過物を開けて、生成物の濾過２を開始した(圧入力：６５０ｍｂａｒ、通過物流速：７６ｍＬ/分)。生成物の最適な抽出を得るために、図２の弁２及び３により制御されるＵＦ ＴＭＰ(膜間圧)を、８５０ｍｂａｒに設定しなければならなかった(圧入力：９６０ｍｂａｒ、通過物流速：１０５ｍＬ/分)。
濾過２工程中に、ＵＦタンク(図２の槽３)の容量を、できるだけ安定に保たなければならなかった。よって、ＵＦタンク(図２の槽３)のレベルが減少するにつれて、ＮａＯＨ溶液を添加した。加えたＮａＯＨ溶液の容量に相当する５サイクルは、採集した興味対象の生成物の容量の５倍に等しい。
濾過２工程の最後に、最終生成物を採集し(質量：１０４２.７ｇ)、次いで２つの等分に分けた。この第二濾過工程の最後に、興味対象の生成物は、０.４５μｍより小さく、３０ｋＤａより高いサイズの要素を含んでいた。中和前の濾過物に相当する試料(「プロセス５-Ｅ２-濾過物」と呼ぶ)は、この工程にて行った。
濾過物の第一部分を、次いで、ピルビン酸１/１００でｐＨ７.０±０.２にて中和し(３ｍＬのピルビン酸１/１００でｐＨ７.０８に調整)、次いで、ＰＥＳ０.２μｍ滅菌メンブレンを用いる濾過を用いてバイオセーフティキャビネットの下で滅菌した。
プロセスの最後の中和濾過物に相当する試料(「プロセス５-Ｅ３-中和濾過物(ピルビン酸)」、ＯＭ３１４Ｃと呼ぶ)は、この工程にて行った。
同時に、濾過物の第二部分を、９つの等分にさらに分けた。これらの部分のそれぞれを、次いで、塩酸２.５％(ｐＨ：７.０９)又は有機酸(ＯＭ３１４Ｃ)：ギ酸１/１００(ｐＨ：７.１１)、酢酸１/１００(ｐＨ：６.９７)、３-ヒドロキシ-ブタン酸１/１００(ｐＨ：７.０３)、アスパラギン酸０.１％(ｐＨ：７.０９)、乳酸１/１００(ｐＨ：７.１５)、グルタミン酸０.１％(ｐＨ：７.１０)、プロピオン酸１/１００(ｐＨ：７.１０)、純アスコルビン酸(ｐＨ：７.０４))で７.０±０.２に中和した。最後に、異なる生成物を、ＰＥＳ０.２μｍ滅菌メンブレンを用いる濾過を用いてバイオセーフティキャビネットの下で滅菌した。
プロセスの最後の異なる中和濾過物に相当する試料(「プロセス５-Ｅ４-中和濾過物(酸の名称)」と呼ぶ)は、この工程にて行った。
Figure 2022525177000009
実施例１.７.２. 分析的特徴決定
分析方法は、１.６.２に記載する。
リリース時(Ｔ０)のプロセス５最終試料の分析的特徴決定
Ｅ２-濾過物溶液をプロセスの後に凍結し、分析前に４℃にて一晩融解した。
Figure 2022525177000010
Figure 2022525177000011
ａ)安定性中に得られた分光光学的結果
Figure 2022525177000012
塩酸で中和したＷＯ２００８/１０９６６９に記載される工業的バッチ１６１９０６４(ＯＭ-１３-ＢＶ)は、Ｔ０にて開始する沈殿物を示した。
アスコルビン酸を除いて、プロセス５-Ｅ４-中和濾過物は、４℃又は室温にて少なくとも６か月物理的に安定であった。これらは、これらの条件において１２か月間安定であると考えられる。
安定性中に得られたＭｉｐ３-アルファ(ＣＣＬ２０)の結果：
図３２：安定性中のプロセス５-バイオアッセイの結果は、プロセス５-Ｅ３-中和濾過物が、室温(２０℃±５℃)又は４℃にて少なくとも５か月の間ＴＨＰ-１でのＭＩＰ-３α分泌による匹敵する生物活性を示したことを示す。プロセス５ Ｔ０を、４℃及び室温(ＲＴ)にて４か月間保管したＴ５試料と比較した。
実施例１.８ プロセス３：ストレプトコッカスｐｎ.７４６６アルカリ溶解物(ＯＭ３１４Ａ)
実施例１.８.１ プロセス３：ストレプトコッカスｐｎ.７４６６
アルカリ溶解：２７９４ｋｇのストレプトコッカス・ニューモニエ７４６６バイオマス(バッチ１４１８１２３-箱３４及び３５)を溶解バレル中で室温にて一晩融解した。２４０ｇのＮａＯＨ １０Ｎ及び４２９３ｇの８ｇ/ＬのＮａＣｌ溶液を加えて、７３２７ｇの合計重量の溶解を得た。アルカリ溶解を、１５０ｒｐｍ±５ｒｐｍで撹拌しながら３７℃±２.５℃の暖かい部屋に８日間移した。３時間００±３０分間の溶解の後に、Ｊ０ ＯＤを制御した。試料を１００倍希釈し、分光光度計で７００ｎｍにて読み取った(読み取りＯＤ：０.２５８及び最終ＯＤ：２５.８)。各作業日に、撹拌(１５０ｒｐｍ±５ｒｐｍ)、暖かい部屋の温度(３７.０℃±２.５℃)及びｐＨを制御した(Ｊ１ ｐＨ：１２.６３/Ｊ２ ｐＨ：１２.６２/Ｊ５ ｐＨ：１２.５９/Ｊ６ ｐＨ：１２.６５/Ｊ７ ｐＨ：１２.６９/Ｊ８ ｐＨ：１２.７１)。ｐＨがプロセス範囲内に入らないならば、ＮａＯＨ １０Ｎを用いて調整しなければならなかった(Ｊ１：１０ｍＬのＮａＯＨ １０Ｎ/Ｊ２：１０ｍＬのＮａＯＨ １０Ｎ/Ｊ５：１０ｍＬのＮａＯＨ １０Ｎ/Ｊ６：１０ｍＬのＮａＯＨ １０Ｎ/Ｊ７：１０ｍＬのＮａＯＨ １０Ｎ)。
溶解の最後に、Ｊ８ ＯＤを制御した。試料を５倍希釈し、分光光度計で７００ｎｍにて読み取った(読み取りＯＤ：０.０９２及び最終ＯＤ：０.４６)。Ｊ０とＪ８との間のデルタＯＤは、１２.８を超えなければならなかった(デルタＯＤ：２５.３４)。
このストレプトコッカス・ニューモニエ７４６６溶解の一部を回収し、２５００ｍＬミニ樽(参照：Ｓｅｍａｄｅｎｉ第６８６３号)に保管した。溶解の最後の溶解物に相当する試料(「プロセス３-Ｅ１-溶解物」と呼ぶ)は、この工程にて行った。
濾過１：生成物の濾過の設備は、図(図２)に従って準備した。濾過システムは、２つの濾過ループからなった。第一精密濾過(ＭＦと呼ぶ)は、タンク(図２の槽２)、ポンプ(図２のポンプ１)及び０.４５μｍのカットオフポイントの濾過システム(図２の精密濾過膜)からなる。第二ループ、限外濾過(ＵＦと呼ぶ)は、タンク(図２の槽３)、ポンプ(図２のポンプ２)及び１０ｋＤａのカットオフポイントの濾過システム(図２の限外濾過膜)からなる。濾過は、２０００ｍＬの実行容量を有する実験室スケールで行った。
プロセスの開始前に、濾過システムが、複数バッチにわたって再現性を有することを確認しなければならなかった。生成物の正しい濾過能力を証明するために、濾過システムに対してＮＷＰ(標準化透水性)を行った。
生成のために用いた溶解物を、精製水でまず２倍に希釈した(１０００.０ｇの溶解物及び１０００.０ｇの精製水)。生成物を、１ｃｍの生成物の渦を有するように撹拌した。生成物の温度を室温に冷却しながら、濾過プロセスが開始するのを待った。このプロセスにおいて、ｐＨ１０.５～１０.８にｐＨを調整した(１５ｍＬの純３-ヒドロキシ-ブタン酸を用いてｐＨ１０.６８に調整)。
初期濃縮：濾過の第一工程に用いた生成物は、以下のパラメータを有した(ｐＨ：１０.６８)、温度２９℃、１ｃｍの生成物の渦を有するように撹拌した)。ＭＦループポンプ(図２のポンプ１)を、４０％のプロセススピードで開始して、生成物をシステムに充填した。この工程が一旦完了すると、ＭＦループでの生成物の再循環を開始し、ポンプスピードを、プロセススピードの７５％に達するように定期的に増加した。再循環することにより、親水性濾過システムがシステム内に存在する気泡を消去することにより馴化される。
流速及び圧力が安定した時に、濾過システムは、馴化されたと考えた。次いで、ＭＦループの通過物弁を開けて、０.５の濃縮係数(圧入力：２１０ｍｂａｒ、通過物流速：５０ｍＬ/分)まで生成物の初期濃縮を行った。初期濃縮中に、ポンプ(図２のポンプ１)スピードは、プロセススピードの１００％(６００ｍＬ/分に相当する１００ｒｐｍ)まで徐々に増加した。
この工程と並行して、ＵＦループを馴化した。ＵＦループポンプ(図２のポンプ２)をプロセススピードの４０％で開始して、生成物をシステムに充填した。この工程が一旦完了すると、ＵＦループへの生成物の再循環を開始し、ポンプスピードを、プロセススピードの７５％に達するように定期的に増加した。再循環により、親水性濾過システムが、システム内に存在する気泡を消去することにより馴化される。
透析濾過：０.５濃度係数に達した時に、ＵＦ通過物を開けて、生成物の透析濾過を開始した(圧入力：６８０ｍｂａｒ、通過物流速：４７ｍＬ/分)。生成物の最適な抽出を得るために、図２の弁１により制御されるＭＦ ＴＭＰ(膜間圧)を、８５０ｍｂａｒに設定しなければならなかった(圧入力：９９５ｍｂａｒ、通過物流速：４６ｍＬ/分)。
透析濾過中に、ＵＦポンプ(図２のポンプ２)のスピードを、通過物フローＭＦと等しいＵＦ通過物フローに達するように設定した。実際に、ＭＦタンク(図２の槽２)での容量は、透析濾過工程中にできるだけ安定に保たなければならなかった。
透析濾過は、サイクルにより行った。初期濃縮の最後に、ＭＦタンク(図２の槽２)にある容量が存在していた。この容量がＭＦ濾過システムを一旦通過すると、１サイクルとなった。このプロセスにおいて、透析濾過は５サイクルを必要とした。
最終濃縮：５透析濾過サイクルの最後に、ＵＦポンプを停止した。ＭＦ入力圧が増加し始めたときに、ＭＦポンプを終了した。この第一濾過工程の最後に、興味対象の生成物は、０.４５μｍより小さいサイズの要素を含んでいた。
濾過２：採集した興味対象の生成物(質量：９４５.７ｇ)は、次いで、１０ｋＤａカットオフポイントのＵＦループ(図２の槽３、ポンプ２及び限外濾過膜)での５サイクルの精製の第二段階を経た。通過物は、図２で述べたように廃液であった。この精製の第二濾過工程中、ｐＨ１０.０にてＮａＯＨ ０.００１Ｎ溶液を加えることにより、一定容量を維持した。
ＵＦループポンプ(図２のポンプ２)を、プロセススピードの４０％にて開始して、生成物をシステムに充填した。この工程が一旦完了すると、ＵＦループでの生成物の再循環を開始し、ポンプスピードを、プロセススピードの７５％に達するように定期的に増加した。再循環することにより、親水性濾過システムがシステム内に存在する気泡を消去することにより馴化される。
濾過システムが一旦馴化されると、ＵＦ通過物を開けて、生成物の濾過２を開始した(圧入力：６９０ｍｂａｒ、通過物流速：３７ｍＬ/分)。生成物の最適な抽出を得るために、図２の弁２及び３により制御されるＵＦ ＴＭＰ(膜間圧)を、８５０ｍｂａｒに設定しなければならなかった(圧入力：９４５ｍｂａｒ、通過物流速：５２ｍＬ/分)。
濾過２工程中に、ＵＦタンク(図２の槽３)の容量を、できるだけ安定に保たなければならなかった。よって、ＵＦタンク(図２の槽３)のレベルが減少するにつれて、ＮａＯＨ溶液を添加した。加えたＮａＯＨ溶液の容量に相当する５サイクルは、採集した興味対象の生成物の容量の５倍に等しい。
濾過２工程の最後に、最終生成物を採集し(質量：９３１.７ｇ)、次いで２つの等分に分けた。この第二濾過工程の最後に、興味対象の生成物は、０.４５μｍより小さく、１０ｋＤａより高いサイズの要素を含んでいた。中和前の濾過物に相当する試料(「プロセス３-Ｅ２-濾過物」と呼ぶ)は、この工程にて行った。
濾過物の第一部分を、次いで、３-ヒドロキシ-ブタン酸１/１００でｐＨ７.２±０.２にて中和し(１０ｍＬの３-ヒドロキシ-ブタン酸１/１００でｐＨ７.２５に調整)、次いで、ＰＥＳ０.２μｍ滅菌メンブレンを用いる濾過を用いてバイオセーフティキャビネットの下で滅菌した。
プロセスの最後の中和濾過物に相当する試料(「プロセス３-Ｅ３-中和濾過物(３-ヒドロキシ-ブタン酸)」と呼ぶ)は、この工程にて行った。
同時に、濾過物の第二部分を、９つの等分にさらに分けた。これらの部分のそれぞれを、次いで、塩酸２.５％(ｐＨ：７.１９)又は有機酸(ＯＭ３１４Ａ)：ギ酸１/１００(ｐＨ：７.１６)、酢酸１/１００(ｐＨ：７.１６)、ピルビン酸１/１００(ｐＨ：７.１４)、アスパラギン酸１/１００(ｐＨ：７.１９)、乳酸１/１００(ｐＨ：７.０６)、グルタミン酸０.１％(ｐＨ：７.１３)、プロピオン酸１/１００(ｐＨ：７.２０)、純アスコルビン酸(ｐＨ：７.２０))で７.２±０.２に中和した。最後に、異なる生成物を、ＰＥＳ０.２μｍ滅菌メンブレンを用いる濾過を用いてバイオセーフティキャビネットの下で滅菌した。
プロセスの最後の異なる中和濾過物に相当する試料(「プロセス３-Ｅ４-中和濾過物(酸の名称)」と呼ぶ)は、この工程にて行った。
Figure 2022525177000013
実施例１.８.２ 分析的特徴決定
分析方法は、１.６.２に記載する。
リリース時(Ｔ０)のプロセス３最終試料の分析的特徴決定
Ｅ２-濾過物溶液をプロセスの後に凍結し、分析前に４℃にて一晩融解した。
リリース時(Ｔ０)の結果：
Figure 2022525177000014
Figure 2022525177000015
ａ)安定性中に得られた分光光学的結果
Figure 2022525177000016
ＷＯ２００８/１０９６６９に記載される工業的バッチ１６１９０６４を塩酸で中和し、Ｔ０で開始する沈殿物を示した。アスコルビン酸を除いて、プロセス３-Ｅ４-中和濾過物は、４℃又は室温にて少なくとも３か月物理的に安定であった。
ｂ)安定性中に得られたＭｉｐ３-アルファ(ＣＣＬ２０)の結果：
図３１：安定性中のプロセス３-バイオアッセイの結果は、プロセス３-Ｅ３-中和濾過物が、室温(２０℃±５℃)又は４℃にて少なくとも５か月の間ＴＨＰ-１でのＭＩＰ-３α分泌により匹敵する生物活性を示したことを示す。プロセス３ Ｔ０を、４℃及び室温(ＲＴ)にて５か月間保管したＴ５試料と比較した。
実施例１.９、２１株多価溶解物安定細菌抽出物ＯＭ３１４Ａ)
実施例１.９.１ ２１株多価溶解物細菌抽出物製剤の安定化のためのプロセス１
溶解：２１株多価溶解物の一部を、生成において回収し、２５００ｍＬミニ樽(参照：Ｓｅｍａｄｅｎｉ第６８６３号)に保管した。
溶解の最後の溶解物に相当する試料(「プロセス１-Ｅ１-溶解物」と呼ぶ)は、この工程にて行った。
濾過１：生成物の濾過の設備は、図(図２)に従って準備した。濾過システムは、２つの濾過ループからなった。第一精密濾過(ＭＦと呼ぶ)は、タンク(図２の槽２)、ポンプ(図２のポンプ１)及び０.４５μｍのカットオフポイントの濾過システム(図２の精密濾過膜)からなる。第二ループ、限外濾過(ＵＦと呼ぶ)は、タンク(図２の槽３)、ポンプ(図２のポンプ２)及び１０ｋＤａのカットオフポイントの濾過システム(図２の限外濾過膜)からなる。濾過は、２０００ｍＬの実行容量を有する実験室スケールで行った。
プロセスの開始前に、濾過システムが、複数バッチにわたって再現性を有することを確認しなければならなかった。生成物の正しい濾過能力を証明するために、濾過システムに対してＮＷＰ(標準化透水性)を行った。
生成のために用いた溶解物を、精製水でまず２倍に希釈した(１０００.６ｇの溶解物及び９９９.９ｇの精製水)。生成物を、１ｃｍの生成物の渦を有するように撹拌した。生成物の温度を室温に冷却しながら、濾過プロセスが開始するのを待った。このプロセスにおいて、ｐＨ１０.５～１０.８にｐＨを調整した(純アスパラギン酸を用いてｐＨ１０.７７に調整)。
初期濃縮：濾過の第一工程に用いた生成物は、以下のパラメータを有した(ｐＨ：１０.７７)、温度２５℃、１ｃｍの生成物の渦を有するように撹拌した)。ＭＦループポンプ(図２のポンプ１)を、４０％のプロセススピードで開始して、生成物をシステムに充填した。この工程が一旦完了すると、ＭＦループでの生成物の再循環を開始し、ポンプスピードを、プロセススピードの７５％に達するように定期的に増加した。再循環することにより、親水性濾過システムがシステム内に存在する気泡を消去することにより馴化される。
流速及び圧力が安定した時に、濾過システムは、馴化されたと考えた。次いで、ＭＦループの通過物弁を開けて、０.５の濃縮係数(圧入力：３００ｍｂａｒ、通過物流速：４３ｍＬ/分)まで生成物の初期濃縮を行った。初期濃縮中に、ポンプ(図２のポンプ１)スピードは、プロセススピードの１００％(６００ｍＬ/分に相当する１００ｒｐｍ)まで徐々に増加した。
この工程と並行して、ＵＦループを馴化した。ＵＦループポンプ(図２のポンプ２)をプロセススピードの４０％で開始して、生成物をシステムに充填した。この工程が一旦完了すると、ＵＦループへの生成物の再循環を開始し、ポンプスピードを、プロセススピードの７５％に達するように定期的に増加した。再循環により、親水性濾過システムが、システム内に存在する気泡を消去することにより馴化される。
透析濾過：０.５濃度係数に達した時に、ＵＦ通過物を開けて、生成物の透析濾過を開始した(圧入力：７３０ｍｂａｒ、通過物流速：５８ｍＬ/分)。生成物の最適な抽出を得るために、図２の弁１により制御されるＭＦ ＴＭＰ(膜間圧)を、８５０ｍｂａｒに設定しなければならなかった(圧入力：１０１０ｍｂａｒ、通過物流速：５８ｍＬ/分)。
透析濾過中に、ＵＦポンプ(図２のポンプ２)のスピードを、通過物フローＭＦと等しいＵＦ通過物フローに達するように設定した。実際に、ＭＦタンク(図２の槽２)での容量は、透析濾過工程中にできるだけ安定に保たなければならなかった。
透析濾過は、サイクルにより行った。初期濃縮の最後に、ＭＦタンク(図２の槽２)にある容量が存在していた。この容量がＭＦ濾過システムを一旦通過すると、１サイクルとなった。このプロセスにおいて、透析濾過は５サイクルを必要とした。
最終濃縮：５透析濾過サイクルの最後に、ＵＦポンプを停止した。ＭＦ入力圧が増加し始めたときに、ＭＦポンプを終了した。この第一濾過工程の最後に、興味対象の生成物は、０.４５μｍより小さいサイズの要素を含んでいた。
濾過２：採集した興味対象の生成物(質量：１２３２.７ｇ)は、次いで、１０ｋＤａカットオフポイントのＵＦループ(図２の槽３、ポンプ２及び限外濾過膜)での５サイクルの精製の第二段階を経た。通過物は、図２で述べたように廃液であった。この精製の第二濾過工程中、ｐＨ１０.０にてＮａＯＨ ０.００１Ｎ溶液を加えることにより、一定容量を維持した。
ＵＦループポンプ(図２のポンプ２)を、プロセススピードの４０％にて開始して、生成物をシステムに充填した。この工程が一旦完了すると、ＵＦループでの生成物の再循環を開始し、ポンプスピードを、プロセススピードの７５％に達するように定期的に増加した。再循環することにより、親水性濾過システムがシステム内に存在する気泡を消去することにより馴化される。
濾過システムが一旦馴化されると、ＵＦ通過物を開けて、生成物の濾過２を開始した(圧入力：６５５ｍｂａｒ、通過物流速：３７ｍＬ/分)。生成物の最適な抽出を得るために、図２の弁２及び３により制御されるＵＦ ＴＭＰ(膜間圧)を、８５０ｍｂａｒに設定しなければならなかった(圧入力：９１７ｍｂａｒ、通過物流速：５７ｍＬ/分)。
濾過２工程中に、ＵＦタンク(図２の槽３)の容量を、できるだけ安定に保たなければならなかった。よって、ＵＦタンク(図２の槽３)のレベルが減少するにつれて、ＮａＯＨ溶液を添加した。加えたＮａＯＨ溶液の容量に相当する５サイクルは、採集した興味対象の生成物の容量の５倍に等しい。
濾過２工程の最後に、最終生成物を採集し(質量：１２３７.０ｇ)、次いで２つの等分に分けた。この第二濾過工程の最後に、興味対象の生成物は、０.４５μｍより小さく、１０ｋＤａより高いサイズの要素を含んでいた。中和前の濾過物に相当する試料(「プロセス１-Ｅ２-濾過物」と呼ぶ)は、この工程にて行った。
濾過物の第一部分を、次いで、アスパラギン酸０.１％でｐＨ７.２±０.２にて中和し(６５ｍＬのアスパラギン酸０.１％でｐＨ７.２０に調整)、ＰＥＳ０.２μｍ滅菌メンブレンを用いる濾過を用いてバイオセーフティキャビネットの下で滅菌した。
プロセスの最後の中和濾過物に相当する試料(「プロセス１-Ｅ３-中和濾過物(アスパラギン酸)」ＯＭ３１４Ａと呼ぶ)は、この工程にて行った。
同時に、濾過物の第二部分を、９つの等分にさらに分けた。これらの部分のそれぞれを、次いで、塩酸０.２５％(ｐＨ：７.１９)又は有機酸(ＯＭ３１４Ａ)：ギ酸１/１００(ｐＨ：７.１６)、酢酸１/１００(ｐＨ：７.２０)、ピルビン酸１/１００(ｐＨ：７.１２)、３-ヒドロキシ-ブタン酸１/１００(ｐＨ：７.１７)、乳酸１/１００(ｐＨ：７.１９)、グルタミン酸０.１％(ｐＨ：７.０９)、プロピオン酸１/１００(ｐＨ：７.１１)、純アスコルビン酸(ｐＨ：７.２０))で７.２±０.２に中和した。最後に、異なる生成物を、ＰＥＳ０.２μｍ滅菌メンブレンを用いる濾過を用いてバイオセーフティキャビネットの下で滅菌した。
プロセスの最後の異なる中和濾過物に相当する試料(「プロセス１-Ｅ４-中和濾過物(酸の名称)」、ＯＭ３１４Ａと呼ぶ)は、この工程にて行った。
Figure 2022525177000017
実施例１.９.２.分析的特徴決定
分析方法は、１.６.２に記載する。
ａ)リリース時の結果：
Ｅ２-濾過物溶液をプロセスの後に凍結し、分析前に４℃にて一晩融解した。
Figure 2022525177000018
Figure 2022525177000019
安定性中に得られた分光光学的結果
Figure 2022525177000020
ＷＯ２００８/１０９６６９において２１株溶解物として記載される工業的バッチ１６１９０６４を、塩酸で中和し、Ｔ０で開始する沈殿物を示した。アスコルビン酸を除いて、プロセス１-Ｅ４-中和濾過物は、４℃又は室温にて少なくとも３か月物理的に安定であった。
ｂ)安定性中に得られたＭｉｐ３-アルファ(ＣＣＬ２０)の結果：
図２９：安定性中のプロセス１-バイオアッセイの結果は、プロセス１-Ｅ３-中和濾過物が、室温(２０℃±５℃)又は４℃にて少なくとも４か月の間ＴＨＰ-１でのＭＩＰ-３α分泌による匹敵する生物活性を示したことを示す。プロセス１ Ｔ０を、４℃及び室温(ＲＴ)にて４か月間保管したＴ４試料と比較した。
実施例１.９ ヘモフィラス・インフルエンザ８４６７(ＯＭ３１４Ａ)
実施例１.１０.１ プロセス２：ヘモフィラス・インフルエンザ８４６７
溶解：１３３９６ｋｇのヘモフィラス・インフルエンザ８４６７バイオマス(バッチ１４１９１１０-箱１０、１１、１２及び１３)を溶解バレル中で室温にて一晩融解した。６９２ｇのＮａＯＨ １０Ｎ及び１２９２０ｇの８ｇ/ＬのＮａＣｌ溶液を加えて、２７００８ｇの合計重量の溶解を得た。アルカリ溶解を、１５０ｒｐｍ±５ｒｐｍで撹拌しながら３７℃±２.５℃の暖かい部屋に５日間移した。３時間００±３０分間の溶解の後に、Ｊ０ ＯＤを制御した。試料を２００倍希釈し、分光光度計で７００ｎｍにて読み取った(読み取りＯＤ：０.２７３及び最終ＯＤ：５４.６)。各作業日に、撹拌(１５０ｒｐｍ±５ｒｐｍ)、暖かい部屋の温度(３７.０℃±２.５℃)及びｐＨを制御した(Ｊ１ ｐＨ：１１.８７/Ｊ２ ｐＨ：１１.７４/Ｊ５ ｐＨ：１１.４５)。ｐＨがプロセス範囲内に入らないならば、ＮａＯＨ １０Ｎを用いて調整しなければならなかった(Ｊ１：２０ｍＬのＮａＯＨ １０Ｎ/Ｊ２：２０ｍＬのＮａＯＨ １０Ｎ)。溶解の最後に、Ｊ８ ＯＤを制御した。試料を１００倍希釈し、分光光度計で７００ｎｍにて読み取った(読み取りＯＤ：０.１６９及び最終ＯＤ：１６.９)。Ｊ０とＪ５との間のデルタＯＤは、１３.１を超えなければならなかった(デルタＯＤ：３７.７)。このヘモフィラス・インフルエンザ８４６７溶解の一部を回収し、２５００ｍＬミニ樽(参照：Ｓｅｍａｄｅｎｉ第６８６３号)に保管した。溶解の最後の溶解物に相当する試料(「プロセス２-Ｅ１-溶解物」と呼ぶ)は、この工程にて行った。
濾過１：生成物の濾過の設備は、図(図２)に従って準備した。濾過システムは、２つの濾過ループからなった。第一精密濾過(ＭＦと呼ぶ)は、タンク(図２の槽２)、ポンプ(図２のポンプ１)及び０.４５μｍのカットオフポイントの濾過システム(図２の精密濾過膜)からなる。第二ループ、限外濾過(ＵＦと呼ぶ)は、タンク(図２の槽３)、ポンプ(図２のポンプ２)及び１０ｋＤａのカットオフポイントの濾過システム(図２の限外濾過膜)からなる。濾過は、２０００ｍＬの実行容量を有する実験室スケールで行った。
プロセスの開始前に、濾過システムが、複数バッチにわたって再現性を有することを確認しなければならなかった。生成物の正しい濾過能力を証明するために、濾過システムに対してＮＷＰ(標準化透水性)を行った。
生成のために用いた溶解物を、精製水でまず４倍に希釈した(４９９.９ｇの溶解物及び１５００.２ｇの精製水)。生成物を、１ｃｍの生成物の渦を有するように撹拌した。生成物の温度を室温に冷却しながら、濾過プロセスが開始するのを待った。このプロセスにおいて、ｐＨ調整はなく、よって、濾過プロセスは直ちに開始した。
初期濃縮：濾過の第一工程に用いた生成物は、以下のパラメータを有した(ｐＨ：１１.２３)、温度３２℃、１ｃｍの生成物の渦を有するように撹拌した)。ＭＦループポンプ(図２のポンプ１)を、４０％のプロセススピードで開始して、生成物をシステムに充填した。この工程が一旦完了すると、ＭＦループでの生成物の再循環を開始し、ポンプスピードを、プロセススピードの７５％に達するように定期的に増加した。再循環することにより、親水性濾過システムがシステム内に存在する気泡を消去することにより馴化される。
流速及び圧力が安定した時に、濾過システムは、馴化されたと考えた。次いで、ＭＦループの通過物弁を開けて、０.５の濃縮係数(圧入力：３２５ｍｂａｒ、通過物流速：４５ｍＬ/分)で生成物の初期濃縮を行った。初期濃縮中に、ポンプ(図２のポンプ１)スピードは、プロセススピードの１００％(６００ｍＬ/分に相当する１００ｒｐｍ)まで徐々に増加した。
この工程と並行して、ＵＦループを馴化した。ＵＦループポンプ(図２のポンプ２)をプロセススピードの４０％で開始して、生成物をシステムに充填した。この工程が一旦完了すると、ＵＦループへの生成物の再循環を開始し、ポンプスピードを、プロセススピードの７５％に達するように定期的に増加した。再循環により、親水性濾過システムが、システム内に存在する気泡を消去することにより馴化される。
透析濾過：０.５濃度係数に達した時に、ＵＦ通過物を開けて、生成物の透析濾過を開始した(圧入力：８８０ｍｂａｒ、通過物流速：６３ｍＬ/分)。生成物の最適な抽出を得るために、図２の弁１により制御されるＭＦ ＴＭＰ(膜間圧)を、８５０ｍｂａｒに設定しなければならなかった(圧入力：１１６３ｍｂａｒ、通過物流速：６８ｍＬ/分)。
透析濾過中に、ＵＦポンプ(図２のポンプ２)のスピードを、通過物フローＭＦと等しいＵＦ通過物フローに達するように設定した。実際に、ＭＦタンク(図２の槽２)での容量は、透析濾過工程中にできるだけ安定に保たなければならなかった。
透析濾過は、サイクルにより行った。初期濃縮の最後に、ＭＦタンク(図２の槽２)にある容量が存在していた。この容量がＭＦ濾過システムを一旦通過すると、１サイクルとなった。このプロセスにおいて、透析濾過は５サイクルを必要とした。
最終濃縮：５透析濾過サイクルの最後に、ＵＦポンプを停止した。ＭＦ入力圧が増加し始めたときに、ＭＦポンプを終了した。この第一濾過工程の最後に、興味対象の生成物は、０.４５μｍより小さいサイズの要素を含んでいた。
濾過２：採集した興味対象の生成物(質量：１０３９.１ｇ)は、次いで、１０ｋＤａカットオフポイントのＵＦループ(図２の槽３、ポンプ２及び限外濾過膜)での５サイクルの精製の第二段階を経た。通過物は、図２で述べたように廃液であった。この精製の第二濾過工程中、ｐＨ１０.０にてＮａＯＨ ０.００１Ｎ溶液を加えることにより、一定容量を維持した。
ＵＦループポンプ(図２のポンプ２)を、プロセススピードの４０％にて開始して、生成物をシステムに充填した。この工程が一旦完了すると、ＵＦループでの生成物の再循環を開始し、ポンプスピードを、プロセススピードの７５％に達するように定期的に増加した。再循環することにより、親水性濾過システムがシステム内に存在する気泡を消去することにより馴化される。
濾過システムが一旦馴化されると、ＵＦ通過物を開けて、生成物の濾過２を開始した(圧入力：６５０ｍｂａｒ、通過物流速：４４ｍＬ/分)。生成物の最適な抽出を得るために、図２の弁２及び３により制御されるＵＦ ＴＭＰ(膜間圧)を、８５０ｍｂａｒに設定しなければならなかった(圧入力：９６０ｍｂａｒ、通過物流速：７２ｍＬ/分)。
濾過２工程中に、ＵＦタンク(図２の槽３)の容量を、できるだけ安定に保たなければならなかった。よって、ＵＦタンク(図２の槽３)のレベルが減少するにつれて、ＮａＯＨ溶液を添加した。加えたＮａＯＨ溶液の容量に相当する５サイクルは、採集した興味対象の生成物の容量の５倍に等しい。
濾過２工程の最後に、最終生成物を採集し(質量：１０３３.９ｇ)、次いで２つの等分に分けた。この第二濾過工程の最後に、興味対象の生成物は、０.４５μｍより小さく、１０ｋＤａより高いサイズの要素を含んでいた。
中和前の濾過物に相当する試料(「プロセス２-Ｅ２-濾過物」と呼ぶ)は、この工程にて行った。
濾過物の第一部分を、次いで、プロピオン酸１/１００でｐＨ７.２±０.２にて中和し(４.２ｍＬのプロピオン酸１/１００でｐＨ：７.１８に調整)、次いで、ＰＥＳ０.２μｍ滅菌メンブレンを用いる濾過を用いてバイオセーフティキャビネットの下で滅菌した。
プロセスの最後の中和濾過物に相当する試料(「プロセス２-Ｅ３-中和濾過物(プロピオン酸)」ＯＭ３１４Ａと呼ぶ)は、この工程にて行った。
同時に、濾過物の第二部分を、９つの等分にさらに分けた。これらの部分のそれぞれを、次いで、塩酸０.２５％(ｐＨ：７.０９)又は有機酸(ＯＭ３１４Ａ)：ギ酸１/１００(ｐＨ：７.１３)、酢酸１/１００(ｐＨ：７.２０)、ピルビン酸１/１００(ｐＨ：７.１５)、アスパラギン酸０.１％(ｐＨ：７.１２)、乳酸１/１００(ｐＨ：７.１９)、グルタミン酸０.１％(ｐＨ：７.２１)、３-ヒドロキシ-ブタン酸１/１００(ｐＨ：７.１６)、純アスコルビン酸(ｐＨ ７.２５))で７.２±０.２に中和した。最後に、異なる生成物を、ＰＥＳ０.２μｍ滅菌メンブレンを用いる濾過を用いてバイオセーフティキャビネットの下で滅菌した。
プロセスの最後の異なる中和濾過物に相当する試料(「プロセス２-Ｅ４-中和濾過物(酸の名称)」と呼ぶ)は、この工程にて行った。
Figure 2022525177000021
実施例１.１０.２.分析的特徴決定
分析方法は、１.６.２に記載する。
リリース時(Ｔ０)の結果：
Ｅ２-濾過物溶液をプロセスの後に凍結し、分析前に４℃にて一晩融解した。
Figure 2022525177000022
Figure 2022525177000023
ａ) 安定性中に得られたＭｉｐ３-アルファ(ＣＣＬ２０)の結果：
図３０：安定性中のプロセス２-バイオアッセイの結果は、プロセス２-Ｅ３-中和濾過物が、室温(２０℃±５℃)又は４℃にて少なくとも４か月の間ＴＨＰ-１でのＭＩＰ-３α分泌による匹敵する生物活性を示したことを示す。プロセス２ Ｔ０を、４℃及び室温(ＲＴ)にて４か月間保管したＴ４試料と比較した。
実施例１.１１-２１株細菌溶解抽出物３０ｋＤａ(ＢＥ３０ｋＤ、ＯＭ３１４Ａ)
実施例１.１１.１ プロセス６：２１株細菌溶解抽出物３０ｋＤａ(ＢＥ３０ｋＤ、ＯＭ３１４Ａ)
溶解：２１株細菌多価溶解物(ＷＯ２００８/１０９６６９において２１株溶解物と記載される工業的バッチ１６１９０６４)の一部を、生成において回収し、２５００ｍＬミニ樽(参照：Ｓｅｍａｄｅｎｉ第６８６３号)に保管した。
濾過１：生成物の濾過の設備は、図(図２)に従って準備した。濾過システムは、２つの濾過ループからなった。第一精密濾過(ＭＦと呼ぶ)は、タンク(図２の槽２)、ポンプ(図２のポンプ１)及び０.４５μｍのカットオフポイントの濾過システム(図２の精密濾過膜)からなる。第二ループ、限外濾過(ＵＦと呼ぶ)は、タンク(図２の槽３)、ポンプ(図２のポンプ２)及び３０ｋＤａのカットオフポイントの濾過システム(図２の限外濾過膜)からなる。濾過は、２０００ｍＬの実行容量を有する実験室スケールで行った。
プロセスの開始前に、濾過システムが、複数バッチにわたって再現性を有することを確認しなければならなかった。生成物の正しい濾過能力を証明するために、濾過システムに対してＮＷＰ(標準化透水性)を行った。
生成のために用いた溶解物を、精製水でまず２倍に希釈した(１０００.２ｇの溶解物及び１０００.１ｇの精製水)。生成物を、１ｃｍの生成物の渦を有するように撹拌した。生成物の温度を室温に冷却しながら、濾過プロセスが開始するのを待った。このプロセスにおいて、ｐＨ１０.５～１０.８にｐＨを調整した(純アスパラギン酸を用いてｐＨ１０.７３に調整)。
初期濃縮：濾過の第一工程に用いた生成物は、以下のパラメータを有した(ｐＨ：１０.７３)、温度２５℃、１ｃｍの生成物の渦を有するように撹拌した)。ＭＦループポンプ(図２のポンプ１)を、４０％のプロセススピードで開始して、生成物をシステムに充填した。この工程が一旦完了すると、ＭＦループでの生成物の再循環を開始し、ポンプスピードを、プロセススピードの７５％に達するように定期的に増加した。再循環することにより、親水性濾過システムがシステム内に存在する気泡を消去することにより馴化される。
流速及び圧力が安定した時に、濾過システムは、馴化されたと考えた。次いで、ＭＦループの通過物弁を開けて、０.５の濃縮係数(圧入力：２３５ｍｂａｒ、通過物流速：５２ｍＬ/分)で生成物の初期濃縮を行った。初期濃縮中に、ポンプ(図２のポンプ１)スピードは、プロセススピードの１００％(６００ｍＬ/分に相当する１００ｒｐｍ)まで徐々に増加した。
この工程と並行して、ＵＦループを馴化した。ＵＦループポンプ(図２のポンプ２)をプロセススピードの４０％で開始して、生成物をシステムに充填した。この工程が一旦完了すると、ＵＦループへの生成物の再循環を開始し、ポンプスピードを、プロセススピードの７５％に達するように定期的に増加した。再循環により、親水性濾過システムが、システム内に存在する気泡を消去することにより馴化される。
透析濾過：０.５濃度係数に達した時に、ＵＦ通過物を開けて、生成物の透析濾過を開始した(圧入力：７３４ｍｂａｒ、通過物流速：５２ｍＬ/分)。生成物の最適な抽出を得るために、図２の弁１により制御されるＭＦ ＴＭＰ(膜間圧)を、８５０ｍｂａｒに設定しなければならなかった(圧入力：１０１０ｍｂａｒ、通過物流速：４８ｍＬ/分)。
透析濾過中に、ＵＦポンプ(図２のポンプ２)のスピードを、通過物フローＭＦと等しいＵＦ通過物フローに達するように設定した。実際に、ＭＦタンク(図２の槽２)での容量は、透析濾過工程中にできるだけ安定に保たなければならなかった。
透析濾過は、サイクルにより行った。初期濃縮の最後に、ＭＦタンク(図２の槽２)にある容量が存在していた。この容量がＭＦ濾過システムを一旦通過すると、１サイクルとなった。このプロセスにおいて、透析濾過は５サイクルを必要とした。
最終濃縮：５透析濾過サイクルの最後に、ＵＦポンプを停止した。ＭＦ入力圧が増加し始めたときに、ＭＦポンプを終了した。この第一濾過工程の最後に、興味対象の生成物は、０.４５μｍより小さいサイズの要素を含んでいた。
濾過２：採集した興味対象の生成物(質量：１１７９.６ｇ)は、次いで、３０ｋＤａカットオフポイントのＵＦループ(図２の槽３、ポンプ２及び限外濾過膜)での５サイクルの精製の第二段階を経た。通過物は、図２で述べたように廃液であった。この精製の第二濾過工程中、ｐＨ１０.３にてＮａＯＨ ０.００１Ｎ溶液を加えることにより、一定容量を維持した。
ＵＦループポンプ(図２のポンプ２)を、プロセススピードの４０％にて開始して、生成物をシステムに充填した。この工程が一旦完了すると、ＵＦループでの生成物の再循環を開始し、ポンプスピードを、プロセススピードの７５％に達するように定期的に増加した。再循環することにより、親水性濾過システムがシステム内に存在する気泡を消去することにより馴化される。
濾過システムが一旦馴化されると、ＵＦ通過物を開けて、生成物の濾過２を開始した(圧入力：６７０ｍｂａｒ、通過物流速：６７ｍＬ/分)。生成物の最適な抽出を得るために、図２の弁２及び３により制御されるＵＦ ＴＭＰ(膜間圧)を、８５０ｍｂａｒに設定しなければならなかった(圧入力：９２０ｍｂａｒ、通過物流速：８８ｍＬ/分)。
濾過２工程中に、ＵＦタンク(図２の槽３)の容量を、できるだけ安定に保たなければならなかった。よって、ＵＦタンク(図２の槽３)のレベルが減少するにつれて、ＮａＯＨ溶液を添加した。加えたＮａＯＨ溶液の容量に相当する５サイクルは、採集した興味対象の生成物の容量の５倍に等しい。
濾過２工程の最後に、最終生成物を採集した(質量：１０７０.５ｇ)。この第二濾過工程の最後に、興味対象の生成物は、０.４５μｍより小さく、３０ｋＤａより高いサイズの要素を含んでいた。
濾過物を、次いで、アスパラギン酸０.１％でｐＨ７.２±０.２にて中和し(１８０ｍＬのアスパラギン酸０.１％でｐＨ７.１９に調整)、次いで、ＰＥＳ０.２μｍ滅菌メンブレンを用いる濾過を用いてバイオセーフティキャビネットの下で滅菌した。
プロセスの最後の中和濾過物に相当する試料(「プロセス６-Ｅ３-中和濾過物(アスパラギン酸)」、ＯＭ３１４Ａと呼ぶ)は、この工程にて行った。
実施例２：鼻内、気管内、吸入及び口周囲使用のための安定製剤
実施例２.１：ＯＭ３１４Ａ安定化細菌抽出物の鼻内製剤
有機酸安定化ＯＭ３１４Ａ細菌抽出物の高分子量画分(＞１０ｋＤ)を、５ｍｇ乾燥重量/ｍＬ(１から２０ｍｇ/ｍＬの範囲)の最終濃度にて滅菌生理食塩水(注射用水中に０.９％ＮａＣｌ)を用いてｐＨ７.５に調整し、０.２μｍ濾過により滅菌した。最終溶液を、経鼻スプレー医療装置バイアル(１０ｍＬ、１から２５ｍＬの範囲)に、０.２５ｍｇの有機酸安定化ＯＭ細菌抽出物(用量あたり０.０２５から０.１ｍＬの範囲)を含む０.０５ｍＬの典型的な用量で加えた。
治療的用量：これらの製剤を用いて、０.０５から１ｍｇまでを含む投与あたり０.０２５から０.１ｍＬまでの範囲の一日一回用量及び一日二回用量を達成できる。
実施例２.２：ラクトバチルス・ファーメンタム安定化細菌抽出物２０(ＯＭ３１４Ｂ)の鼻内製剤
有機酸安定化ラクトバチルス・ファーメンタム細菌抽出物(ＯＭ３１４Ｂ)の高分子量画分(＞１０ｋＤ)を、５ｍｇ乾燥重量/ｍＬ(１から２０ｍｇ/ｍＬの範囲)の最終濃度にて滅菌生理食塩水(注射用水中に０.９％ＮａＣｌ)を用いてｐＨ７.５に調整し、０.２μｍ濾過により滅菌した。最終溶液を、経鼻スプレー医療装置バイアル(１０ｍＬ、１から２５ｍＬの範囲)に、０.２５ｍｇの有機酸安定化ラクトバチルス・ファーメンタム精製細菌抽出物(用量あたり０.０２５から０.１ｍＬの範囲)を含む０.０５ｍＬの典型的な用量で加えた。
治療的用量：これらの製剤を用いて、０.０５から１ｍｇまでを含む投与あたり０.０２５から０.１ｍＬまでの範囲の一日一回用量及び一日二回用量を達成できる。
実施例２.３：大腸菌安定化細菌抽出物(ＯＭ３１４Ｃ)の鼻内製剤
有機酸安定化大腸菌細菌抽出物の高分子量画分(＞１０ｋＤ)を、５ｍｇ乾燥重量/ｍＬ(１から２０ｍｇ/ｍＬの範囲)の最終濃度にて滅菌生理食塩水(注射用水中に０.９％ＮａＣｌ)を用いてｐＨ７.５に調整し、０.２μｍ濾過により滅菌した。最終溶液を、経鼻スプレー医療装置バイアル(１０ｍＬ、１から２５ｍＬの範囲)に、０.２５ｍｇの有機酸安定化大腸精製菌細菌抽出物(用量あたり０.０２５から０.１ｍＬの範囲)を含む０.０５ｍＬの典型的な用量で加えた。
治療的用量：これらの製剤を用いて、０.０５から１ｍｇまでを含む投与あたり０.０２５から０.１ｍＬまでの範囲の一日一回用量及び一日二回用量を達成できる。
実施例２.４：ＯＭ３１４Ａ細菌安定化抽出物の液滴スプレーとしての吸入製剤
有機酸安定化ＯＭ３１４Ａ細菌抽出物の高分子量画分(＞１０ｋＤ)を、５ｍｇ乾燥重量/ｍＬ(１から２０ｍｇ/ｍＬの範囲)の最終濃度にて滅菌生理食塩水(注射用水中に０.９％ＮａＣｌ)を用いてｐＨ７.５に調整し、０.２μｍ濾過により滅菌した。最終溶液を、スプレー吸入器医療装置バイアル(１０ｍＬ、１から２５ｍＬの範囲)に、０.５ｍｇの有機酸安定化ＯＭ細菌抽出物(用量あたり０.０５から０.４ｍＬの範囲)を含む０.１ｍＬの典型的な用量で加えた。
治療的用量：これらの製剤を用いて、０.０５から８ｍｇまでを含む投与あたり０.０５から０.４ｍＬまでの範囲の一日一回用量及び一日二回用量を達成できる。
実施例２.５：ラクトバチルス・ファーメンタム細菌安定化抽出物(ＯＭ３１４Ｂ)の液滴スプレーとしての吸入製剤
有機酸安定化ラクトバチルス・ファーメンタム細菌抽出物(ＯＭ３１４Ｂ)の高分子量画分(＞１０ｋＤ)を、５ｍｇ乾燥重量/ｍＬ(１から２０ｍｇ/ｍＬの範囲)の最終濃度にて滅菌生理食塩水(注射用水中に０.９％ＮａＣｌ)を用いてｐＨ７.５に調整し、０.２μｍ濾過により滅菌した。最終溶液を、スプレー吸入器医療装置バイアル(１０ｍＬ、１から２５ｍＬの範囲)に、０.５ｍｇの有機酸安定化ラクトバチルス・ファーメンタム精製細菌抽出物(用量あたり０.０５から０.４ｍＬの範囲)を含む０.１ｍＬの典型的な用量で加えた。
治療的用量：これらの製剤を用いて、０.０５から８ｍｇまでを含む投与あたり０.０５から０.４ｍＬまでの範囲の一日一回用量及び一日二回用量を達成できる。
実施例２.６：ＯＭ３１４Ａ安定化細菌抽出物の固体粒子としての吸入製剤
有機酸安定化ＯＭ３１４Ａ細菌抽出物の高分子量画分(＞１０ｋＤ)を、１０ｍｇ乾燥重量/ｍＬ(１から２０ｍｇ/ｍＬの範囲)の最終濃度にて滅菌生理食塩水(注射用水中に０.９％ＮａＣｌ)及びリスト＊からの１以上の賦形剤を用いてｐＨ７.５に調整し、０.２μｍ濾過により滅菌した。一例において、１０ｍｇ/ｍＬの細菌抽出物の溶液を、マンニトール(２５ｍｇ/ｍＬ)、ラクトース(２５ｍｇ/ｍＬ)及びステアリン酸Ｍｇ(１ｍｇ/ｍＬ)と混合した。
噴霧乾燥の後に、粉末を打錠した(１２ｍｇ錠剤)。粉砕可能錠剤を、医療装置(粒子サイズ範囲１から７μｍ)に分配し、１２ｍｇ錠剤からの吸入用量は、２ｍｇ細菌抽出物であった。
吸入のための典型的な賦形剤は、それらに限定されないが、ラクトース、グルコース、マンニトール、トレハロース、ステアリン酸Ｍｇ、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＭＰＣ、コレステロール、ロイシン、トリロイシン、ポロキサマー、胆汁酸塩類、キトサン、トリメチルキトサン、ＰＬＧＡである(検討のために、G. Pilcer、K. Amighi、International Journal of Pharmaceutics、2010、392、1～19を参照されたい)。
実施例２.７：ラクトバチルス・ファーメンタム安定化細菌抽出物(ＯＭ３１４Ｂ)の固体粒子としての吸入製剤
有機酸安定化ラクトバチルス・ファーメンタム細菌抽出物(ＯＭ３１４Ｂ)の高分子量画分(＞１０ｋＤ)を、１０ｍｇ乾燥重量/ｍＬ(１から２０ｍｇ/ｍＬの範囲)の最終濃度にて滅菌生理食塩水(注射用水中に０.９％ＮａＣｌ)及びリスト＊からの１以上の賦形剤を用いてｐＨ７.５に調整し、０.２μｍ濾過により滅菌した。一例において、１０ｍｇ/ｍＬの細菌抽出物の溶液を、マンニトール(２５ｍｇ/ｍＬ)、ラクトース(２５ｍｇ/ｍＬ)及びステアリン酸Ｍｇ(１ｍｇ/ｍＬ)と混合した。
噴霧乾燥の後に、粉末を打錠した(１２ｍｇ錠剤)。粉砕可能錠剤を、医療装置(粒子サイズ範囲１から７μｍ)に分配し、１２ｍｇ錠剤からの吸入用量は、２ｍｇ細菌抽出物であった。
吸入のための典型的な賦形剤は、それらに限定されないが、ラクトース、グルコース、マンニトール、トレハロース、ステアリン酸Ｍｇ、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＭＰＣ、コレステロール、ロイシン、トリロイシン、ポロキサマー、胆汁酸塩類、キトサン、トリメチルキトサン、ＰＬＧＡである(検討のために、G. Pilcer、K. Amighi、International Journal of Pharmaceutics、2010、392、1～19を参照されたい)。
実施例３：新規な細菌抽出物製剤のより高い安定性の証拠
実施例１.１、１.２、１.３、１.４に従って調製した抽出物及び実施例２.１、２.２、２.３、２.４、２.５に従う製剤を、酢酸、プロピオン酸、乳酸、３-ヒドロキシプロパン酸、ピルビン酸、ブタン酸、２-ヒドロキシブタン酸、３-ヒドロキシブタン酸、グルタミン酸、アスパラギン酸及びそれらの組合せから選択される異なる有機酸を用いてｐＨ６.６、６.７、６.８、６.９、７.０、７.１、７.２、７.３、７.４、７.５、７.６に調整する。
５℃±３℃及び室温２０℃から２５℃に保管した細菌抽出物の１０安定性を、第０日(ｐＨ調整後１５分と１２０分の間)から及び３０、６０、９０、１８０、３６０日後の異なる時点にて沈殿の存在について目視観察する。
定量は、第０日(ｐＨ調整後１５分と１２０分の間)から及び３０、６０、９０、１８０、３６０日後の異なる時点にて決定する５５０、６００、６５０、７００ｎｍでの吸光度を測定することにより、可視分光測光法を用いて行う。分光測光法は、水試料に対して行う。
安定性は、吸光度の変化として表し、プロセス、用いた有機酸又は有機酸の組合せ並びに最終ｐＨ値に依存する。
実施例４：最初のインフルエンザ感染後の致死量以下の細菌感染の動物モデルにおける、ＯＭ鼻内対経口投与の予防的及び治癒的有効性
ＯＭ細菌抽出物(２１株溶解物からの細菌抽出物)の安定口周囲の形を、動物モデルにおいてＯＭ細菌抽出物の口周囲投与を実験的に試験する目的のために、即席で調製した。この即席口周囲の形は、経時的に安定であるが、結果は、洞察を提供し、口周囲投与の実質的な治療利点を証明した。
即席口周囲ＯＭ細菌抽出物の鼻内投与の、インフルエンザウイルス感染後の肺組織におけるウイルス力価の低減並びに(２)重感染動物(致死量以下のインフルエンザウイルス感染とその後の致死量以下の細菌感染で処置した動物)の罹患率及び死亡率の低減における有効性を、ＯＭ細菌抽出物の経口投与のものと比較した(図３)。
雌性ＢＡＬＢ/ｃマウス(８週齢、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ)に、ケタミン及びキシラソール(ｘｙｌａｓｏｌ)の腹腔内注射により麻酔をかけ、５０ｕｌ ＰＢＳの容量中の１００ＰＦＵのインフルエンザＡ/プエルトリコ８/３４株を鼻内接種した。インフルエンザ感染後第６日に、細菌スタータ培養を開始し、その後、インフルエンザ感染後第７日に、対数期成長への増殖を行った。
経口投与のために、３２０μＬのＯＭ濃縮物を、１日あたり動物あたり３６０ｍｇ/ｋｇのＯＭ凍結乾燥物の有効成分となるように経管栄養により投与し、これは、マウスあたり７.２ｍｇの有効成分の１日投与となった(図３)。ＬＰＳの鼻内投与のために(ＣＯＰＤモデルを行う範囲内で)、用いた用量は、鼻あたり用量あたり７マイクログラムのＬＰＳであった。文献において、鼻あたり１マイクログラムのＬＰＳの投与は、アレルギー性炎症から保護すると報告されている。試験スケジュールは、以下の表２３にまとめる。
Figure 2022525177000024
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン５.０ｄを用いて統計を行った。Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を、ウイルス負荷に対して行った。両側ＡＮＯＶＡを、体重、体温及び臨床スコアに対して行った。
曲線の比較を生存について行った。全体として、ＯＭ細菌抽出物処置は、重感染モデルにおいて罹患率及び致死率に対してマウスを保護した。この保護効果は、鼻内処置で最も顕著であり、このことは、ＯＭ細菌抽出物の粘膜投与が、その有効性(図４、５)及び二次細菌感染後の併存疾患(図６)を大きく改善できたことを示唆した。
実施例５：最初のインフルエンザ感染後の致死量以下の細菌感染の動物モデルにおける、鼻内及び気管内ＯＭ細菌抽出物投与の予防的有効性。
図７に概説するこの研究は、(１)インフルエンザウイルス感染後の肺組織におけるウイルス力価の低減(図８)並びに(２)臨床スコアにより証明される重感染動物(致死量以下のインフルエンザウイルス感染とその後の致死量以下の細菌感染で処置した動物)の罹患率及び死亡率の低減(図１０及び１２)についての予防的処置レジメンとしてのＯＭ細菌抽出物(２１株溶解物からの細菌抽出物)の鼻内及び気管内投与の有効性を証明した。２つの異なる用量のＯＭ細菌抽出物、用量Ａ(投与あたり５０マイクログラムの有効成分)及び用量Ｂ(投与あたり５マイクログラムの有効成分)を試験した。
雌性ＢＡＬＢ/ｃマウス(８週齢、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ)に、ケタミン及びキシラソールの腹腔内注射により麻酔をかけ、ＰＢＳの容量中の１００ＰＦＵのインフルエンザＡ/プエルトリコ８/３４株を鼻内接種した。
マウスを各群１５匹の６郡に分けた。群１には、生理食塩水滴剤を鼻内(i.n.)経路を介して第ｄ７、ｄ５及びｄ３日に投与した(予防的対照)。群２には、予防用量ＡのＯＭ細菌抽出物を鼻内経路を介して第ｄ７、ｄ５及びｄ３日に投与した。群３には、予防用量ＢのＯＭ細菌抽出物を鼻内(i.n.)経路を介して第－７、－５及び－３日に投与した。群４には、第－７、－５及び－３日に生理食塩水スプレーを気管内(i.t.)投与した。群５には、予防用量ＡのＯＭ細菌抽出物を気管内経路を介して第－７、－５及び－３日に投与した。群６には、予防用量ＢのＯＭ細菌抽出物を気管内経路を介して第－７、－５及び－３日に投与した。
時点あたりマウスあたり５０マイクログラム有効成分(２.２マイクロリットルのＯＭ細菌抽出濃縮物となる用量Ａ)及び５マイクログラム有効成分(０.２２マイクロリットルのＯＭ細菌抽出物となる用量Ｂ)を用いるＯＭ細菌抽出物投与。
インフルエンザ感染後第６日に、細菌スタータ培養を開始し、その後、インフルエンザ感染後第７日に、対数期成長への増殖を行った。
研究の設計及び投与スケジュールを、以下の表２４とともに図７に示す。
Figure 2022525177000025
動物に、ケタミン及びキシラソールの腹腔内注射により麻酔をかけ、合計容量５０マイクロリットル中の、生理食塩水で希釈した５０マイクログラムの有効成分(２.２マイクロリットルのＯＭ細菌抽出濃縮物となる用量Ａ)又は５マイクログラム有効成分(０.２２マイクロリットルのＯＭ細菌抽出濃縮物となる用量Ｂ)のいずれかを用いてＯＭ細菌抽出物を鼻内又は気管内投与した。
動物に、ケタミン及びキシラソールの腹腔内注射により麻酔をかけ、合計容量５０マイクロリットル中の、生理食塩水で希釈した５０マイクログラムの有効成分(２.２マイクロリットルのＯＭ細菌抽出濃縮物となる用量Ａ)又は５マイクログラム有効成分(０.２２マイクロリットルのＯＭ細菌抽出濃縮物となる用量Ｂ)のいずれかを用いてＯＭ細菌抽出物を鼻内又は気管内投与した。
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン５.０ｄを用いて統計を行った。Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を、ウイルス負荷に対して行った。両側ＡＮＯＶＡを、体重、体温及び臨床スコアに対して行った。
曲線の比較を生存について行った(図８及び１０)。
ＯＭ細菌抽出物(ＯＭ用量Ｂ I.N.：５マイクログラム及びＯＭ用量Ａ I.N.：５０マイクログラムの用量)の鼻内投与を介する動物の予防的処置は、ＰＲ８感染後５日で測定した肺組織におけるウイルス力価の低減をもたらした(図８)。この低減は、鼻内経路による５０マイクログラム用量ＯＭ細菌抽出物においてより優勢であったが、気管内経路によりウイルス粒子を一掃するために５マイクログラムが十分であった。
ウイルス力価の結果と同様に、予防的鼻内ＯＭ細菌抽出物処置は、インフルエンザ細菌感染後の罹患率及び死亡率の著しい緩和をもたらした。経鼻処置あたり５０マイクログラム用量のＯＭ細菌抽出物は、９０％の生存(ＯＭ用量Ａ I.N.)を、経鼻処置あたり５マイクログラム用量のＯＭ細菌抽出物は、４０％の生存(ＯＭ用量Ｂ I.N.)をもたらしたが、経鼻処置による生理食塩水対照(生理食塩水I.N.)は、感染後第６日目に死亡した動物の保護をもたらさなかった(図９)。生存結果に匹敵して、臨床スコア及び体重喪失測定は、５０マイクログラム用量のＯＭ細菌抽出物で処置した動物において、生理食塩水処置動物と比較して著しく低減した(図９)。５０マイクログラム用量ＯＭ細菌抽出物処置動物と一致して、５マイクログラム用量処置動物も、生理食塩水対照動物と比較して臨床スコア及び体重喪失が低減した。しかし、５マイクログラム鼻内用量については有効性がより低かった。
動物の予防的５マイクログラム用量ＯＭ細菌抽出物気管内処置は、対照生理食塩水気管内処置動物で見いだされたウイルス力価測定と比較して、ＰＲ８感染後５日で測定された肺組織におけるウイルス力価の最もよい低減をもたらした(図８)。罹患率及び死亡率に関して、ＯＭ細菌抽出物処置の気管内５０マイクログラム用量(ＯＭ用量Ａ I.T.)及び５マイクログラム用量(ＯＭ用量Ｂ I.T.)はともに、第１０日目まで用量に比例する効果をもって、生理食塩水対照処置動物(３０％)と比較して生存率が増加した(７０％)(図１１)。このことは、生理食塩水対照群と比較して、ＯＭ細菌抽出物処置動物の気管内５０マイクログラム及び５マイクログラム用量の両方について同等に低減された臨床スコア測定とともにまとめられる(図１２)。
まとめると、予防的経鼻ＯＭ細菌抽出物投与は、重感染動物の罹患率及び死亡率の著しい低減と、インフルエンザ感染後の肺組織におけるウイルス力価の低減とをもたらした。この結果は、鼻内経路を介して投与された５０マイクログラム用量ＯＭ細菌抽出物処置レジメンの後に特に明確であった。驚くべきことに、予防的気管内ＯＭ細菌抽出物処置は、罹患率及び死亡率の最もよい緩和をもたらし、５マイクログラム用量を用いて有効性がより高かったが、これは、表面肺曝露がより深いことにより説明できる。
これらの結果は、鼻内及び気管内の両方の投与が、呼吸器系疾患、例えば喘息、ＣＯＰＤ及びその他の病原体のＯＭ細菌抽出物治療処置のために有効性が高い投与経路であることを明確に示した。
実施例６：致死量以下のインフルエンザ感染の動物モデルにおける、本発明による細菌抽出物の鼻内投与についての新規な処置レジメン
本研究(図１３)は、インフルエンザウイルス感染後の肺組織におけるウイルス力価の低減における、即席調製ＯＭ細菌抽出物(２１株溶解物からの細菌抽出物)の鼻内投与の有効性を示した。本研究は、ＯＭ細菌抽出物の用量応答関係も証明した。本研究は、２つの異なる多重用量レジメン(６用量及び３用量)の比較、及び鼻内処置レジメンと経口による投与との間の比較をさらに提供した。雌性７週齢ＢＡＬＢ/ｃマウス(特定病原体除去；ＳＰＦ)を、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、ケージあたり合計５匹のマウスでケージに無作為に割り当てた。マウスは、毎週モニタリングし、研究開始(研究第０日目)前７日間、施設に慣れさせた。動物は、研究第０日目に８週齢であった。飲料水及び食物は、自由に摂取させた。マウスを１３群に分けた：群１から１１は、有効成分ＯＭ細菌抽出物(ＯＭ)を鼻内投与された。群１２は、水対照(３２０μＬ水対照、経口による、毎日、第－１０日から第－１日)であり、群１３は、陰性対照(致死量以下のインフルエンザウイルス感染のみ)であった。表２５及び２６は、図１３に模式的に示す異なる群及び処置プロトコールを示す。
Figure 2022525177000026
Figure 2022525177000027
上の研究プロトコールに明記した日に、マウスを入れたプレキシガラスチャンバーに麻酔薬であるイソフルランＰｒｏｖｅｔ ＡＧ、カタログ番号：２２２２)を送達する目盛り付き気化器システム(ＶＩＰ３００、Ｐｒｏｖｅｔ、Ｖｅｔ.Ｍｅｄ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｌｙｓｓａｃｈ、ＣＨ)を用いて、マウスに麻酔をかけた。麻酔をかけた動物に、次いで、合計容量５０マイクロリットルのＯＭ細菌抽出物試験物質を投与し、これは、１００ｕｌマイクロピペットを用いて両方の鼻孔に少しずつ流しいれた。
ウイルス物質(Ｖｉｒａｐｕｒ(Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ)から得たインフルエンザウイルスＰＲ８株(Ａ/プエルトリコ/８/３４、Ｈ１Ｎ１))を、－７５℃±１０℃で保管し、投与前に解凍した。一旦解凍すると、物質は、Ａ/ＰＲ/８/３４について１００ＰＦＵ/５０μｌに相当する冷ＰＢＳ(４℃)で希釈した。希釈ウイルスは、マウスに投与するまで氷上で保った。動物に、体重１ｋｇあたり９.７５ｍｇのキシラソール及び４８.７５ｍｇのケタソール(Ｋｅｔａｓｏｌ)の腹腔内注射により麻酔をかけ、各動物は、鼻内接種により５０μｌウイルス溶液を受けた。
第５日に、動物を、ペントバルビタール(Ｓｔｒｅｕｌｉ Ｐｈａｒｍａ ＡＧ、Ｕｚｎａｃｈ、Ｃａｔ：１１７０１３９Ａ)の致死量腹腔内注射により犠牲にした直後に、組織を単離した(肺)。単離した肺葉を、定量ＰＣＲによる肺組織におけるウイルス負荷の定量のために準備した。肺葉を単離し、ＲＮＡを、ＴＲＩ試薬(Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ)を用いて調製し、次いで、ＤＮアーゼ(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)で処理して、ゲノムＤＮＡ混入を回避し、その後、ＲＮＡを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)を用いる逆転写によりｃＤＮＡに変換した。ｃＤＮＡを、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ(Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ)を用いるリアルタイムＰＣＲ(ｉＣｙｃｌｅｒ；Ｂｉｏ-Ｒａｄ)により定量し、試料を、ＧＡＰＤＨ発現レベルを用いて標準化した。全てのグラフは、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン６を用いて作成し、片側ＡＮＯＶＡを適用した。誤差バーは、平均値の標準誤差(ＳＥＭ)を表す。
本研究の結果は、ＯＭ細菌抽出物の鼻内投与が、研究において用いたいずれの用量でもインフルエンザウイルスでの感染に対してマウスを効果的に保護し、鼻内経路により、経口経路と比較した場合に、より高い有効性であったことを明確に示した(図１４)。未処置対照と比較して、水及びＯＭ細菌抽出物の両方の経口群においてウイルスの管理の明らかな改善があった。さらに、この正の効果は、５マイクログラムからこの実験において評価した最新で最高の用量である１００マイクログラムまで著しく用量依存的であった。ＯＭ細菌抽出物の鼻内投与を６回受けた群は、最も小さい変動をもって最良の有効性を示したが、ＯＭ細菌抽出物を３回だけ投与されたマウスも、ウイルスに対して著しく保護された。これらのデータは、ＯＭ細菌抽出物が最も有効な投与経路を提供することを証明する鼻内投与後の以前の実験を明らかに確認した。ＯＭ細菌抽出物の３及び６回の処置を用いて明確な用量応答が証明されたので、このマウスモデルにおけるインフルエンザに対するこの非常に効果的な予防的処置においてこの用量及びレジメンが、重要であると結論付けることができる。よって、より長い合計処置期間、より多い口周囲、例えば鼻内投与の頻度及びより高い用量がより効果的であると予想できる。
実施例７：本発明による細菌抽出物の、健常ドナーを起源とする初代ヒト上皮でのライノウイルスドッキングタンパク質の発現並びに１型及び２型インターフェロン応答に対する影響
健常ドナー並びにＣＯＰＤ及び喘息患者に由来するヒト肺上皮細胞における即席調製口周囲ＯＭ細菌抽出物(２１株溶解物からの細菌抽出物)の抗ウイルス活性についての以前のデータが公開された(Roth Mら、PLoS ONE 2017、12(11)、e0188010)。
気管内経路(直接肺曝露、実施例４、５及び６)を介するＯＭ細菌抽出物による動物において証明された抗ウイルス有効性をフォローアップするために、出願人は、この直接肺曝露を、ヒト肺起源からの初代気管支上皮細胞(ｈＢＥＣ)を用いて評価した。気管内経路によるマウスにおいて得られた結果を模倣するために、ヒト気管支肺上皮細胞を、２１株溶解物からの新しい安定ＯＭ細菌抽出物製剤(ＯＭ３１４Ａ(Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３)、ＯＭ３１４Ｂ(Ｐ４)及びＯＭ-３１４Ｃ(Ｐ５))に直接曝露して、肺細胞からの抗ウイルス開始有効性応答を評価した。初代上皮肺細胞に対する直接抗ウイルス効果を考慮して、これらの研究により、動物における鼻内及び気管内投与により以前に示唆されたように(実施例４、５及び６)、肺がＯＭ細菌抽出物の第一標的器官であることが確認された。
本研究において、出願人は、ＯＭ細菌抽出物への細胞曝露の結果及びライノウイルス感染に対するその保護効果を、分子ベースで証明した。このために、タンパク質、ｍＲＮＡ発現及び免疫蛍光に対する実験を行った。検出は、ＥＬＩＳＡ及び免疫蛍光技術(トリパンブルー排除染色を用いる直接細胞計数)、並びに数人の健常ドナー、ＣＯＰＤ患者及び喘息患者の肺を起源とするヒト肺上皮細胞培養に対するＲＴ-ＰＣＲを用いて行った。
ＢＥＣ単離及び特徴決定：気管支組織の小片(２×２×２ｍｍまでの１×１×１ｍｍ)を、ＢＥＣ特異的培地Ｃｎｔ-ＰＲ-Ａ(ＣｅｌｌｎＴｅｃｈ、Ｂｅｒｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ)で予め湿らせた細胞培養槽に入れた。培地を二日ごとに交換し、分裂細胞の機械的振とうにより細胞を継代した。細胞は、Ｅ-カドヘリン及びパンケラチンでの陽性染色並びにフィブロネクチンについての陰性染色により特徴決定した(Roth Mら、PLoS One. 2017;12:e0188010)。
本研究において、出願人は、選択されたセットの新しい安定ＯＭ細菌抽出物製剤の優れた結果及びライノウイルス感染に対するその防止的抗ウイルス効果を分子ベースで証明した。実験的読み出しは、定量的ウイルス負荷変化、並びにそれらに限定されないが、可溶性メディエータ、例えば１型及び２型インターフェロンを含むｈＢＥＣにより生成される抗感染性及び抗炎症性メディエータであった。これらの生物学的効果を、以下の方法により測定した：ウイルス負荷についてＲＴ-ＰＣＲによるｍＲＮＡ検出、及び１型インターフェロン(ＩＦＮ-ベータ及びＩＩ型インターフェロンガンマ)についてＥＬＩＳＡによる可溶性メディエータの検出。ＲＶ１６ ｍＲＮＡの決定は、ＲＶ１６に対するパーセンテージｍＲＮＡ、及びＲＶ１６のｍＲＮＡ発現率として表される抗ウイルス効果を用いて、表２７に列挙する異なる製剤について行った。
実施例７.１：抗ウイルス結果
試験した様々な新しい安定ＯＭ細菌抽出物製剤(ＯＭ３１４Ａ(Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３)、ＯＭ３１４Ｂ(Ｐ４)及びＯＭ-３１４Ｃ(Ｐ５))を用いて得られた結果は、標準的ＯＭ細菌抽出物ＨＣｌ製剤と同様又はそれより改善された抗ウイルス効果を示す(図１５Ａ)。このシリーズにおいて、抗ウイルス効果は、製造精製プロセスにいくつかの酸が組み込まれた新しい製剤を用いて試験した(図１５Ｃ)。「ＨＣｌ」と表示される不安定な液体製剤と比較して、新しい安定製剤は、同等又はよりよい抗ウイルス有効性を証示した。１例を除いて、用いたＯＭ３１４Ａ(Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３)、ＯＭ３１４Ｂ(Ｐ４)及びＯＭ-３１４Ｃ(Ｐ５)細菌抽出物に依存して、ＨＣｌ製剤と同等又はよりよい有効性が示された(図１５ＡにおけるＨＣＬ及び図ＣにおけるＩ.Ｂ.についてのＲＶ１６ ｍＲＮＡのパーセンテージを、他の試料調製物と比較されたい)。
Figure 2022525177000028
実施例７.２：１型及び２型インターフェロン
第一世代のＯＭ細菌抽出物による１型インターフェロン-ベータ生成の誘導は、初代骨髄由来樹状細胞(ＤＣ)に対するマウス実験細胞モデルにおいて以前に記載されている(Dangら、Sci Rep. 2017 Mar 6;7:43844)。簡単に述べると、健常ドナー、喘息及びＣＯＰＤ患者から採取したヒトＢＥＣ細胞を、第－２日目に播種し、血清を第－１日目に枯渇させ、０、２４及び４８時間にＯＭ３１４Ａ(Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３)、ＯＭ３１４Ｂ(Ｐ４)及びＯＭ-３１４Ｃ(Ｐ５)(濃度１０マイクログラム/ｍＬ)で、スキームに記載するようにして刺激した(図１６)。細胞上清を、次いで、ＥＬＩＳＡを用いて、インターフェロンベータ及びガンマの量について示す時間にて、回収した。
以前のＯＭ細菌抽出物を用いるＢＥＣによる元来のＩＦＮベータ及びガンマ分泌と比較して(図１７Ａ及び１８Ａ、新しいＯＭ３１４Ａ(Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３)、ＯＭ３１４Ｂ(Ｐ４)及びＯＭ-３１４Ｃ(Ｐ５)安定化生成物は、１型インターフェロンベータ及び２型インターフェロンガンマを、図１７Ｃ及び１８Ｃにおいて同様又はより優れた程度に誘導できた(Ｉ.Ｂ.を他の生成物と比較されたい)。用いたプロセスに依存して、いくらかの著しい違いが観察された。本研究において、全てのＯＭ３１４安定細菌抽出物の用量範囲誘導インターフェロン放出は、５名のドナーに基づいて行った。５名のドナーの平均インターフェロン値は、図１７Ｂ及び１８Ｂに示す。特に、そしてＩＦＮ依存的放出がＯＭ細菌抽出濃縮物から得られた図１７Ａ及び１８Ａとは対照的に、最大２０マイクロリットルの容量を図１７Ｃ及び１８Ｃにおいて用い、この容量は、標準ＯＭ細菌抽出物のより低い量に相当する。インターフェロンアルファは、ヒトＢＥＣ細胞に対してインビトロにおいて、ＯＭ細菌抽出物によっても、新しい安定ＯＭ３１４Ａ(Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３)、ＯＭ３１４Ｂ(Ｐ４)及びＯＭ-３１４Ｃ(Ｐ５)によっても誘導されなかった(データは示さず)。
実施例８：ヒト肺バイオプシーを起源とする初代ヒト上皮細胞(ＢＥＣ)上のベータβ-デフェンシン-１及びＩＣＡＭ-１の発現の変化に対する本発明による細菌抽出物の保護抗ウイルス効果。
実施例８.１：β-デフェンシン-１及びＩＣＡＭ-１
実施例８について、かつ元の細菌抽出物ＯＭを用いて得られた以前のデータとの系統的比較の後に新しい安定ＯＭ３１４Ａ(Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３)、ＯＭ３１４Ｂ(Ｐ４)及びＯＭ-３１４Ｃ(Ｐ５)調製物の評価をさらに追及するために、我々は、ヒトＢＥＣに対してであるが、ＯＭ細菌抽出物により以前に誘導された他の抗ウイルス特徴を用いて発表された以前のデータを確認することを狙いとした(Rothら、2017)。これは、新しい安定ＯＭ３１４Ａ(Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３)、ＯＭ３１４Ｂ(Ｐ４)及びＯＭ-３１４Ｃ(Ｐ５)調製物が、工業的バッチ(Ｉ.Ｂ.＃１６１９０５７)と同等又は優れた程度にヒト肺由来初代上皮細胞(ＢＥＣ)による抗ウイルスベータβ-デフェンシン-１発現を誘導する能力を示す図１９において証明する。同様に、この抗ウイルス有効性も、これらの細胞の表面上のライノウイルスＩＣＡＭ-１の減少を用いて証明される。図２０Ｂは、新しい安定ＯＭ３１４Ａ(Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３)、ＯＭ３１４Ｂ(Ｐ４)及びＯＭ-３１４Ｃ(Ｐ５)調製物が、工業的バッチ(Ｉ.Ｂ.＃１６１９０５７)と同じ程度にヒトＢＥＣによるＩＣＡＭ-１ウイルス受容体発現を減少させる能力を示す。よって、両方の場合において、この新しく調製した安定細菌抽出物ＯＭ３１４が、プロセス、細菌抽出物含量に依存して同様の又は優れた差をもって、以前のＯＭ細菌標準物の効力及び有効性を維持する能力が確認される。
実施例９：マウス骨髄由来樹状細胞からのＴＮＦαの放出により証明及びモニタリングされた、本発明による細菌抽出物が、アダプター及びＴＬＲ-依存性エフェクタータンパク質ＭｙＤ８８を活性化する能力。
実施例９.１：ＢＭＤＣ調製
新しく調製した安定細菌抽出物ＯＭ３１４Ａ(Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３)、ＯＭ３１４Ｂ(Ｐ４)及びＯＭ-３１４Ｃ(Ｐ５)が自然免疫の活性化に対する同じ又は優れたレベルの有効性を維持する能力に対する調査をさらに拡大するために、我々は、Dangら(Sci Rep. 2017 Mar 6;7:43844)において広く例証されるＯＭ細菌標準物の抗炎症性及び調節性の効果を元々は証明したものと同じ研究を行った。このために、単一であるが集約的なタイプの研究を行った。なぜなら、これは、活性化の際の全ての必要な細胞性成分を用いるからである。表面受容体(ＴＬＲ)、ＯＭ細菌抽出物が保護を誘導するために必須のエフェクタータンパク質(ＭｙＤ８８)、並びに切断及び細胞質から核への転位の際にサイトカイン放出を誘導する転写因子(ＮＦｋＢ)、ここで培地中の転写及びサイトカイン放出を測定する(ＴＮＦα)。このために、、マウスの骨に由来する初代骨髄由来樹状細胞を用いた。骨髄(ＢＭ)細胞を、６～１０週齢野生型Ｃ５７/ＢＬ６又は様々なＴＬＲノックアウトマウス(ここでは、ＴＬＲ４ノックアウト(ＴＬＲ４-/-)及びＷＴマウスだけを示す)の大腿骨及び脛骨から、骨を氷冷ＰＢＳでフラッシュすることにより抽出した。ＢＭＤＭのその後の細胞処理並びに樹状細胞(ＢＭＤＣ)へのそれらの成熟及び分化は、Dangら、2017に従って行った。培養の純度は、細胞を抗マウスＣＤ１１ｃ及び抗マウスＭＨＣＩＩ抗体で染色することにより決定し、ＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣＩＩｈｉｇｈ細胞のパーセンテージを、フローサイトメトリにより分析した。
実施例９.２：ＢＭＤＣ刺激及びサイトカイン放出の測定
ＢＭＤＣを、９６ウェル組織培養プレートにおいて、２×１０5細胞/ウェルの密度にて播種し、Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ ＳｃｉｅｎｃｅからのＬＰＳ(４μｇ/ｍＬ)又は異なる濃度の新しく調製した安定細菌抽出物ＯＭ３１４Ａ(Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３)、ＯＭ３１４Ｂ(Ｐ４)及びＯＭ-３１４Ｃ(Ｐ５)を用いて１６時間刺激した。図２１にあるように、異なる濃度(５０～１６００μｇ/ｍＬ)の工業的バッチ(Ｉ.Ｂ.＃１６１９０５６ＯＭ)の細菌抽出物を用いた(左上の隅)。ＴＮＦ-αサイトカインの濃度を、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅからのＴＮＦ-αキットを用いて製造業者の指示に従ってＥＬＩＳＡキットにより、細胞フリー上清において測定した。図２１に例証するように、１つ(３-ヒドロキシ-ブタン酸Ｐ３)以外の全ての新しく調製した安定細菌抽出物ＯＭ３１４Ａ(Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３)、ＯＭ３１４Ｂ(Ｐ４)及びＯＭ-３１４Ｃ(Ｐ５)は、野生型正常マウスからの対照(Ｉ.Ｂ.)と同じ程度にＢＭＤＣからＴＮＦ-α分泌を誘導できた。興味深いことに、この分泌は、いくつかの場合では、同等又はよりよく(濃度依存的)、このことは、これらの異なる細菌抽出物起源の選択的応答の重要性を証明した。付随して、新しい安定細菌抽出物ＯＭ３１４Ａ Ｐ３、Ｐ４及びＰ５は、ＢＭＤＣからのＴＮＦ-α放出を誘導するためにＴＬＲ４受容体を必要としなかった。なぜなら、このサイトカインは、このＴＬＲ４の不在下(ＴＬＲ４-/-)でも分泌されたからである。ＬＤＡは、異なる生物が異なる群を支配し、ｉ)ＢＥ(２１株溶解物からの細菌抽出物)が、ＨＦＤマウスにおいて有害な細菌群から守り、ｉｉ)群多様性を増加させることを明らかにした。
実施例１０：本発明による細菌抽出物の口周囲投与が、高脂質食で維持された動物における腸細菌叢異常を逆戻りさせる能力。
実施例１０.１：細菌叢の平衡の重要性、細菌叢異常の有害な結果、及び分類学によるマイクロビオーム分析。
特定の細菌叢パターンは変動し、多くの外的要因、例えば食餌、年齢、遺伝的性質及び薬物療法に依存する(Dieterichら、Med Sci (Basel). 2018;6(4):116. 2018年12月14日公開、doi:10.3390/medsci6040116)。研究は、マイクロビオームが恒常性にどのように貢献できるかを示す時代のまだ初期にあるが、マイクロビオーム細菌叢異常があるいくつかの医療状態に導く精密な機構の解明、均衡のとれたマイクロビオームを維持することの重要性は、最高であり、このような平衡異常を元に戻すための製品が緊急に必要とされている。したがって、腸内細菌叢の好ましくない群を好ましい微生物エコシステムに回復させることは、ヒト疾患を防止し得る(Young VBら、BMJ 2017;356: j831。妊娠中に高脂質食(ＨＦＤ)を消費することの脂肪毒性効果を評価することを狙いとする研究において、我々は、８週間のＨＦＤの消費は、腸細菌叢異常、酸化的ストレス、炎症の増加及び炎症により駆動される早産(ＰＴＢ)の危険性の増加を導くことを最近示した。したがって、そして本実施例において、我々は、本発明の細菌抽出物が、ＨＦＤ誘導性腸細菌叢異常並びに代謝及び免疫状態に対する関連する有害な影響を逆にする能力を決定することとした。分類学からの結果により、図２２に示すような線形判別分析(ＬＤＡ)スコアを決定することができた。この図は、特定の微生物に対する細菌溶解物特異的影響を示す。ＨＦＤ対照マウス(ＨＦＤシャム)に存在する望ましくないクロストリジウム目、ファーミキューテス門、クロストリジウム科及びブラウティア種は、細菌抽出物(ＨＦＤ-ＢＥ)を与えたマウスにおいて回復し、正常固形飼料対照食マウス(ＮＣＤ-シャム)においてもより少ない程度で回復した。さらに、ＨＦＤの消費により欠乏した望ましい生物のレベルの増加も、細菌溶解物を与えたマウス(ＨＦＤ-ＢＥ及びＮＣＤ-ＢＥ)の細菌叢内容物中で同定された。選択されたセットの種の増加及び減少を示す標準の分類学的分析とは異なって、図２２に示すＬＤＡスコアは、４群(ＮＣＤ-シャム、ＮＣＤ-ＢＥ、ＨＦＤ-シャム、ＨＦＤ-ＢＥ)のそれぞれの独特の種を示す。ＬＤＡは、異なる生物が異なる群を支配し、ｉ)ＢＥ(２１株溶解物からの細菌抽出物)が、ＨＦＤマウスにおいて有害な細菌群から守り、ｉｉ)群多様性を増加させることを明らかにし、よって、本発明からの細菌溶解物の正の効果が確認される。
実施例１０.２：方法、動物、食物消費、耐糖能、インスリン抵抗性及び食餌
２つの異なるマウス株：Ｃ５７ＢＬ/６及びＣＤ１を本研究を通して用いた。Ｃ５７ＢＬ/６マウスは、高脂質食(ＨＦＤ)を与えた場合に肥満、高血糖性及びインスリン抵抗性になることが知られている利点を有する近交系株である。一方、ＣＤ１マウスは、ＨＦＤを消費した後に穏やかな代謝機能障害を有するが、非近交系である利点を有するので、ＨＦＤに対するいずれの特異体質反応も回避される。マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ(Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ、ＵＳＡ)から購入した。各株の同数の雄性及び雌性マウスを、Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｃｅｎｔｅｒにおいて２４℃にて、各１２時間の明暗サイクルで、個別に換気されたケージに入れ、食物及び水を自由に与える。６０％脂質、高飽和脂質含量、ラード及び大豆油から主に由来する脂質を含む食餌を、ＨＦＤマウスに与え、１３.３％の脂質を含むＮＣＤを、ＮＣＤマウスに与える。食物及び水は、自由に与える。ＯＭ細菌抽出物を、口周囲経路により、鼻内経路を介して(０.０５ｍＬ)ピペットにより１４日間与えるか、又はマウスの口に(≦０.１５ｍＬ)直接経口経路を介して毎日４及び８週間与える。「シャム処置」(陰性対照)を受けるマウスは、０.０５ｍＬの水(鼻内)を１日１回１４日間ピペットにより、又はマウスの口に(≦０.１５ｍＬ)直接経口経路を介して毎日４及び８週間与える。陽性対照。腸細菌叢異常を逆にするプロバイオティクスであるラクトバチルス・プランタルムを、２×１０８ＣＦＵ/ｍＬをその飲用水に６日間加えることにより陽性対照マウスに投与する。腸マイクロビオームに対するＯＭ細菌抽出物の効果の分析：糞便試料を回収し、１６Ｓ ｒＲＮＡを配列決定により分析する。配列決定の後に、試料中の機能的遺伝子を特徴決定し、微生物共同体の機能的遺伝子間の差を、Ｋｙｏｔｏ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅｓ(ＫＥＧＧ)経路分析を用いて分析する。これらの遺伝子のタンパク質機能分類を、Ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ Ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ Ｇｒｏｕｐ(ＣＯＧ)ファミリー情報を用いて予測する。代謝状態に対するＯＭ細菌抽出物の影響の分析：耐糖能試験(ＧＴＴ)及びインスリン負荷試験(ＩＴＴ)を、８週間の期間の最初及び最後に全てのマウスに対して行った。マウスを８時間絶食させ、次いで、インスリンを含むか又は含まない２.０ｇ/ｋｇグルコースの腹腔内注射を負荷し、グルコースレベルを０、１５、３０及び６０分にて測定する。
実施例１０.３：様々な属に対する２１細菌溶解物からの細菌抽出物(ＢＥ)の影響
図２２にまとめるデータに追加し、そしてそれをさらに埋めるために、ＢＥにより誘導される属におけるいくつかの変化の例を、図２６に示す。この例において、ＢＶは、有害な属に対する正の効果(成長の低減)を示し、同時に、真正の属に対する好ましい成長を示した。この図に、５つの例を示す。(Ａ)ＢＥは、ＨＦＤにより引き起こされるクロストリジア目ラクノスピラ科ブラウティア属を低減する。(Ｂ)ＢＥは、ＨＦＤにより誘導されるクロストリジウム綱クロストリジア目ルミノコッカス科ＧＣＡ-９０００６６２２５属を低減する。(Ｃ)ＢＥは、ＮＣＤ及びＨＦＤの両方のマウスにおけるクロストリジア目ルミノコッカス科ルミノコッカス科ＵＣＧ-０１０１を低減する。(Ｄ)ＢＥは、ＨＤＦにより欠乏したバクテロイデス目ムリバクラ科無培養細菌を回復する。(Ｅ)ＢＥは、ラクノスピラ科［ユーバクテリウム」フィシカンテナ群を低減する。
実施例１１：耐糖能を改善するための細菌抽出物の口周囲投与の能力
実施例１１.１：２１株溶解物からの細菌抽出物の食餌前(食餌前)、通常固形飼料食後マウス(ＮＣＤ後)、高脂質食後(ＨＦＤ後)のグルコース濃度の試験
細菌抽出物による腸細菌叢異常の修正に加えて、耐糖能を、これらの糖尿病マウスにおいて調べた。このパラメータは、臨床的見地から重要である。図２３Ｂ、エル・プランタルム(腸細菌叢異常の再編成を改善するために陽性対照として通常用いられる)以外の２１株溶解物からの細菌抽出物を与えた通常固形飼料対照食マウス(ＮＣＤ-ＢＥ)は、より低いグルコース濃度により示されるように、耐糖能が著しく増加した。同様に、この効果は、図２３Ｃに示すように、２１株溶解物からの細菌抽出物を与えた高脂質食マウス(ＨＦＤ-ＢＥ)においても、より少ない程度で示された。
実施例１１.２：体重及び食物消費の評価
図２４において、両方のパラメータを対照として試験した。結果は、２１株溶解物からの細菌抽出物を与えた高脂質食マウス(ＨＦＤ-ＢＥ)は、体重上昇が著しく減少したことを示す。このことは、これらの高脂質食マウスにおいて例示される(図２４Ａ)。これに付随して、この体重の不在は、測定され、ここで対照として表す食物消費に影響せずに発生した(図２４Ｂ)。興味深いことに、この影響は、このような措置において通常用いられるエル・プランタルムよりも効果的であった。
実施例１１.３：インスリン負荷の評価
高脂質食(ＨＤＦ)レジメンに曝露された糖尿病マウスにおける２１株溶解物からの細菌抽出物(ＢＥ)での処置から得られる耐糖能に対する上記の保護的結果を考慮して、我々は、インスリンのレベルがその保護的目的のために改変されるのかをさらに調べた。図２５は、参照として設定した処置前(食餌前)の全てのマウス(４２)及び高脂質食マウス(ＨＦＤ)における最後の８週間の処置期間の後(食餌後)におけるインスリン負荷を証明する。インスリン抵抗性の減少を示すエル・プランタルム(ＮＣＤ-Ｌ-ｐｌａｎｔ.)を与えた通常固形飼料マウスについて予期されるように(図２５Ｂ)、２１溶解物からのＨＦＤ-ＢＥ細菌抽出物を与えたマウスは、高脂質マウスにおいて著しく、全ての時点にてインスリン抵抗性を示した。２１溶解物からの細菌抽出物によるこの保護効果は、全て糖尿病患者において測定される標準的パラメータの正の再編成を示すグルコースデータ及び以前の数字からの体重上昇の不在と一致する。よって、２１株溶解物からの細菌抽出物(ＢＥ)が、このようなレジメンを受けている慢性ＨＦＤマウスにおける保護的腸細菌叢異常を誘導するだけでなく、２１株溶解物からの細菌溶解物による保護に向けて全て正に影響する体重、グルコース及びインスリンで例示されるその関連する続発症も誘導することが確認された。

Claims (32)

  1. グラム陽性又はグラム陰性細菌種からの細菌抽出物であって、前記細菌種のアルカリ溶解と、酢酸、プロピオン酸、乳酸、３-ヒドロキシプロパン酸、ピルビン酸、ブタン酸、２-ヒドロキシブタン酸、３-ヒドロキシブタン酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、それらの組合せ並びに/又は薬学的に許容されるそれらの塩及びエステルから選択される１以上の有機酸での中和と、その後の中和抽出物の濾過による精製と、前記中和に用いた有機酸又はその組合せの添加による最終生理的pHへの調整とにより取得可能な細菌抽出物。
  2. ０～300kDa又は０～100kDa又は０～60kDaの分子量成分の割合が減少している請求項１に記載の細菌抽出物。
  3. 前記アルカリ溶解が10を超えるpH(ただし、pHは±0.1の変動を有し得る)にて行われる、請求項１又は２に記載の細菌抽出物。
  4. 最終pHが５～８、６～８、6.3～7.8又は6.5～7.8に調整される、請求項１～３のいずれか１項に記載の細菌抽出物。
  5. 前記１以上の細菌種がモラクセラ・カタラーリス、へモフィラス・インフルエンザ、クレブシエラ・ニューモニエ、スタフィロコッカス・アウレウス、ストレプトコッカス・ニューモニエ、ストレプトコッカス・ピオゲネス及び/又はストレプトコッカスサングイニスから選択される、請求項１～４のいずれか１項に記載の細菌抽出物。
  6. 前記１以上の細菌種がラクトバチルス細菌株から選択される、請求項１～５のいずれか１項に記載の細菌抽出物。
  7. 前記ラクトバチルス株がラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・ラムノサス、ラクトバチルス・プランタルム、ラクトバチルス・ジョンソニイ、ラクトバチルス・ヘルベティカス、ラクトバチルス・カゼイ・デフェンシス、ラクトバチルス・カゼイssp.カゼイ、ラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・ブルガリカス、ラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・アシドフィラス、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・サリバリウス、ラクトバチルス・ラクティス及び/又はラクトバチルス・デルブリュッキの１以上を含む、請求項６に記載の細菌抽出物。
  8. 前記１以上の細菌種が大腸菌細菌株から選択される、請求項１～７のいずれか１項に記載の細菌抽出物。
  9. 前記安定な精製細菌抽出物が100マイクログラム/ml未満の核酸、少なくとも0.1mg/mLの糖を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の細菌抽出物。
  10. 室温、４℃、－20℃又は－80℃にて液体形態で安定である請求項１～９のいずれか１項に記載の細菌抽出物。
  11. 請求項１～１０のいずれか１項に記載の細菌抽出物と、薬学的に許容される賦形剤又はビヒクルとを含む医薬組成物。
  12. 固体、半固体、液体又はエアロゾル製剤の形態である請求項１１に記載の医薬組成物。
  13. 鼻内、気管内、粘膜、経粘膜、皮膚外用、口腔粘膜、舌下、経口、肺、気管支内及び/又は肺内投与経路用に製剤化された請求項１１又は１２に記載の医薬組成物。
  14. 液体又はエアロゾルであり、スプレー、液滴、コロイド、ミスト、雲霧状及び/又は微細化煙に製剤化された請求項１１～１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  15. 液体又は半固体であり、エマルジョン、マイクロエマルジョン、水性分散液、油、ミルク、バルサム、フォーム、水性若しくは油性ローション、水性若しくは油性ゲル、クリーム、溶液、水アルコール溶液、水グリコール溶液、ヒドロゲル、セラム、軟膏、ムース、ペースト又は経皮パッチの形態に製剤化された請求項１１～１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  16. 固体であり、粉剤及び/又は粉砕可能な錠剤に製剤化された請求項１１～１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  17. 感染及び/又は炎症及び/又は新生物及び/又は細菌叢異常に起因する急性及び慢性の免疫障害を治療及び/又は防止する方法に使用する請求項１１～１６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  18. 前記免疫障害がＴヘルパー１、Ｔヘルパー17及びＴヘルパー２免疫応答間の不均衡、Tregの不均衡、２型過敏症、免疫抑制、好酸球増加症、アレルギー及びアトピーから選択される、請求項１７に記載の方法に使用する医薬組成物。
  19. 前記感染が、上下気道感染及び/又は関連する続発症、例えばアレルギー性鼻炎、鼻炎、上咽頭炎、副鼻腔炎、咽頭炎、扁桃炎、喉頭炎、気管炎、咽喉頭炎、インフルエンザ、呼吸器多核体ウイルス、ライノウイルス、コロナウイルス、クループ、肺炎、過敏性肺臓炎、気管支肺炎、気管支炎、細気管支炎、肺炎、急性下気道感染を伴う閉塞性肺疾患、急性上気道感染を伴う閉塞性肺疾患、又は上皮繊毛運動障害及び/若しくは粘液クリアランス障害を伴う疾患から選択される、請求項１７に記載の方法に使用する医薬組成物。
  20. 前記感染が、二次感染、インフルエンザでのウイルス感染後の細菌二次感染、非呼吸器系ウイルス感染、非呼吸器系細菌感染、全身性感染、例えば敗血症、敗血症性ショック又はウイルス誘発性合併症を含む、請求項１７に記載の方法に使用する医薬組成物。
  21. 前記炎症が、アレルギー性/アトピー性呼吸器系及び非呼吸器系の徴候アトピー性皮膚炎、急性及び/又は慢性関連皮膚炎、アナフィラキシー又は食物アレルギーから選択される、請求項１７に記載の方法に使用する医薬組成物。
  22. 細菌叢異常関連障害が、肥満症、喘息、糖尿病、自己免疫疾患、低繊維食餌に伴う疾患、アトピー性皮膚炎、急性及び/又は慢性関連皮膚炎、乾癬、代謝性疾患、例えばNASH及びNAFLD並びに/又は肝線維症から選択される、請求項１７に記載の方法に使用する医薬組成物。
  23. 前記炎症が、皮膚障害、皮膚炎症、例えば湿疹、酒さ、アトピー性皮膚炎、乾癬、日光誘発皮膚炎症及び発赤を含む光線性障害、皮膚萎縮症、皮膚色素脱失、紫外皮膚炎、紅斑症、毛細血管拡張症、クーペロース又は光線角化症を含むものから選択される、請求項１７に記載の方法に使用する医薬組成物。
  24. 前記炎症が、Ｔヘルパー２優勢自己免疫性徴候、例えばグレーブス病、橋本病、強皮症、Ig4関連疾患又は天疱瘡から選択される、請求項１７に記載の方法に使用する医薬組成物。
  25. 前記炎症が、好酸球徴候、例えば好酸球性膀胱炎、好酸球性食道炎、好酸球性筋膜炎、好酸球性胃腸炎、好酸球増加症候群、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症、好酸球性喘息又は好酸球性肺炎から選択される、請求項１７に記載の方法に使用する医薬組成物。
  26. 前記新生物が、(請求項１７に列挙されるような)免疫障害を伴う新生物の徴候、例えば肥満細胞症、肥満細胞白血病、Ｔヘルパー２偏向及び/又は免疫抑制腫瘍から選択される、請求項１７に記載の方法に使用する医薬組成物。
  27. 細菌叢異常関連障害が、潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患、クローン病、大腸炎、代謝障害、肥満症、２型糖尿病、NASH及び/又はNAFLDを含む肝不全、肝線維症、腎不全、自己免疫疾患又は低繊維食餌に伴う疾患から選択される、請求項１７に記載の方法に使用する医薬組成物。
  28. 気管内、鼻内、気管内、粘膜、経粘膜、皮膚外用、口腔粘膜、舌下、経口、肺、気管支内及び/又は肺内経路により対象に投与される、請求項１７～２７のいずれか１項に記載の方法に使用する医薬組成物。
  29. 前記対象がヒト又は非ヒト動物対象である、請求項１７～２８のいずれか１項に記載の方法に使用する医薬組成物。
  30. 請求項１１～１６のいずれか１項に記載の医薬組成物を含む送達デバイスであって、経鼻吹込デバイス、鼻内吸入器、鼻内スプレーデバイス、アトマイザー、経鼻スプレーボトル、単位用量容器、ポンプ、点滴器、スクイーズボトル、ネブライザー、定量吸入器(MDI)、加圧式定量吸入器、吹込器、二方向デバイス、ドーズアンプル、鼻パッド、鼻スポンジ及び鼻カプセルを含む群より選択される送達デバイス。
  31. ヒト対象における上下気道感染、関連する続発症及び/又は二次感染、細菌叢異常及び細菌叢異常関連障害を処置及び/又は防止する方法に使用する請求項３０に記載の送達デバイス。
  32. 以下の工程を含む、請求項１１～１６のいずれか１項に記載の医薬組成物の製造方法：
    ａ．適切な培養培地中で各細菌株種を培養する工程と、
    ｂ．10を超える初期pHにて各株を溶解する工程と、
    ｃ．工程(ｂ)で得られた抽出物のpHを、酢酸、プロピオン酸、乳酸、３-ヒドロキシプロパン酸、ピルビン酸、ブタン酸、２-ヒドロキシブタン酸、３-ヒドロキシブタン酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、それらの組合せ又はそれらの薬学的に許容される塩及びエステルから選択される１以上の有機酸を加えることにより１又は２単位減少させる工程と、
    ｄ．工程(ｃ)の生成物を、少なくとも１回精密濾過膜に通し、生成物を限外濾過膜上に保持して、精製可溶性抽出物を得る工程と、
    ｅ．最終pHを、工程(ｂ)で用いた有機酸又はその組合せを加えることにより約７(±1.0)に調整する工程と、
    ｆ．薬学的に許容される賦形剤又はビヒクルを加える工程。
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