ES2341863T3 - Proceso para la produccion de un polisacarido capsular para su uso en vacunas de conjugado. - Google Patents
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Abstract
Método para la recuperación de un polisacárido de un caldo de fermentación, y donde la recuperación incluye: - utilizar un detergente catiónico para precipitar el polisacárido o parte de los contaminantes del sobrenadante para obtener una primera fracción de polisacárido; - utilizar alcohol para precipitar el polisacárido de la primera fracción de polisacárido para obtener una segunda fracción de polisacárido; - someter la segunda fracción de polisacárido a una precipitación de alcohol en presencia de un detergente aniónico, por lo cual el alcohol está presente en una concentración que es inferior a la concentración en la que el polisacárido se precipita; - la precipitación del polisacárido de la fracción soluble utilizando alcohol para obtener un precipitado de polisacárido; - disolver el precipitado de polisacárido y someterlo a concentración y diafiltración.
Description
Proceso para la producción de un polisacárido
capsular para su uso en vacunas de conjugado.
La presente invención se refiere a la producción
y recuperación de polisacáridos capsulares bacterianos y su uso para
la producción de vacunas conjugadas.
La primera etapa al hacer una vacuna es la de
separar la actividad que produce la enfermedad, de la que induce la
inmunidad. En la práctica esto significa aislar o crear un
organismo, o parte de uno, que es incapaz de causar enfermedad
avanzada, pero que todavía retiene los antígenos responsables de
inducir la respuesta inmunitaria del huésped.
Distinguimos dos grupos principales de vacunas:
las vacunas de organismo entero y vacunas de subunidades. Las
vacunas de organismo entero se producen matando/inactivando o
atenuando/debilitando los organismos. Las vacunas de subunidades
incluyen vacunas basadas en por ejemplo antígenos de proteínas y
antígenos de carbohidratos.
Las vacunas antibacterianas producidas
utilizando antígenos de carbohidratos se pueden componer de un
polisacárido purificado (capsular) del organismo patógeno. Ejemplos
de tales vacunas son: las vacunas polisacáridas
Haemophilus influenzae tipo b (Hib), Neisseria meningitidis (A, C, W y Y), Salmonella tifi (VI), y Streptococcus pneumoniae (23 diferentes serotipos).
Haemophilus influenzae tipo b (Hib), Neisseria meningitidis (A, C, W y Y), Salmonella tifi (VI), y Streptococcus pneumoniae (23 diferentes serotipos).
Las vacunas polisacáridas parecían no proteger a
los niños menores de 2 años de edad y no inducir memoria de la
célula T a largo plazo. Por lo tanto, se introdujo una nueva
generación de vacunas conjugadas polisacáridas de conjugado. Las
vacunas conjugadas parecían ser inmunogéneticas en niños jóvenes e
inducir una memoria a largo plazo. Las vacunas conjugadas se
producen principalmente al adjuntar el polisacárido a un portador de
proteína.
La primera vacuna conjugada que se introdujo
mundialmente se dirigió contra la Haemophilus influenzae tipo
b (Hib). La Haemophilus influenzae tipo b causa pulmonía y
meningitis, principalmente en niños jóvenes.
Se extiende por gotitas a través de la tos,
estornudos y en condiciones de vida de superpoblación. Se estima que
causa de 2 a 3 millones de casos de enfermedad cada año y
aproximadamente 450.000 muertes, la gran mayoría de ellas en los
países en vías de desarrollo.
Varias vacunas contra la Hib ya están en uso
difundido en los países más desarrollados, donde prácticamente han
erradicado la enfermedad. Las vacunas están entre las más seguras
actualmente en uso. Los estudios han confirmado la eficacia de estas
vacunas en países menos desarrollados, pero relativamente pocos de
ellos han empezado el uso rutinario en niños. La vacuna Hib es una
de las vacunas más infrautilizada debido a su coste relativamente
alto en comparación con las vacunas utilizadas rutinariamente en el
programa regular de inmunización infantil.
Los procesos de producción utilizados hoy en día
son relativamente caros, e incluyen una larga fase de cultivo de
aproximadamente 16-18 horas, véase p. ej. US
4,644,059 y el periodo para el cultivo es basado típicamente en los
parámetros arbitrarios, tal como el tiempo o la densidad óptica,
véase p. ej. US 4,220,717. De esta manera, no es posible compensar
los cambios en condiciones del cultivo y los rendimientos
sub-óptimos de polisacárido son el resultado inevitable. De forma
adicional, se utilizan productos químicos fuertes tal como fenol
para recuperar el polisacárido, véase p. ej. US 4,695624 y EP 0 528
635.
A fin de contribuir al objetivo de la WHO (World
Health Organization) y GAVI (Global Alliance for vaccines and
Immunization), para poner las vacunas conjugadas Hib a disposición
de todos los niños del mundo y a fin de dar a la gente en los países
en vías de desarrollo una oportunidad de acceder a la
tecnología-Hib, se tiene que desarrollar, patentar y
autorizar un proceso de producción relativamente simple y fácilmente
ampliable a escala a estos países bajo términos razonables. La
vacuna producida debe cumplir los requisitos WHO pertinentes.
La Figura 1: Concentración de OD_{590}, pH y
polirribosil ribitol fosfato (PRP) durante un cultivo de prueba en
una escala de 40 1.
La Figura 2: Proceso de purificación simple de
polirribosil ribitol fosfato (PRP).
La presente invención se refiere a un método
para recuperar un polisacárido de un caldo de fermentación como en
la reivindicación 1.
El método para producir el polisacárido
comprende:
- -
- cultivar una bacteria encapsulada en un medio de cultivo adecuado a un PH y temperatura adecuada
- -
- ajustar el pH del medio de cultivo a un valor constante con base o ácido hasta su ajuste con base o ácido respectivamente ya no es posible
- -
- retardar la lisis de las células, preferiblemente por enfriamiento a temperatura inferior a la utilizada para el cultivo
- -
- recuperar opcionalmente, el polisacárido del medio de cultivo.
\vskip1.000000\baselineskip
Una de las ventajas del método de producción del
polisacárido es que los polisacáridos capsulares, es decir antígeno
capsular extraído de una bacteria patógena, se puede obtener en un
rendimiento elevado (aproximadamente 200-400 mg/l)
en un tiempo muy corto. La optimización adicional del medio y/o
método de cultivo (discontinuo alimentado
(fed-batch) en vez de discontinuo (batch)) por
supuesto resultará en una concentración polisacárida mucho más alta.
Mientras que los métodos del estado de la técnica para producir
polisacáridos capsulares requieren entre aproximadamente 16 y 18
horas de fermentación, en el presente método, la fermentación se
puede completar típicamente, es decir el momento óptimo para la
terminación se alcanza, dentro de entre aproximadamente 6 y 14
horas, preferiblemente se completa en aproximadamente 7, 8, 9, 10 o
11 horas. Típicamente no llevará más de aproximadamente 12 a 14
horas. Los tiempos exactos por supuesto dependen de las bacterias y
cepas utilizadas y pueden diferir ligeramente dependiendo de la
"condición física" de las bacterias. En este contexto, la
"condición física" de las bacterias se refiere entre otros, a
la calidad del inoculo y se refleja en p. ej. la duración de la fase
de latencia del cultivo.
Otras ventajas del método son que el método es
sencillo, reproducible y rentable y da rendimientos óptimos, incluso
después de un cambio en las condiciones de cultivo. Además, las
bacterias se cultivan utilizando un medio simple que no contiene
componentes de origen animal, salvo la hemina. Esto da como
resultado un medio limpio, que es una ventaja grande, porque la
tendencia hoy día es minimizar la transferencia de enfermedad
animal, tal como BSE, utilizando cuantos más medios libres de
componentes animales posibles.
Otra ventaja más es que también es muy flexible,
en cuanto a que, tan pronto se empieza el enfriamiento, la lisis de
las células se retrasa y la cosecha del polisacárido se puede hacer
en cualquier momento conveniente, siempre y cuando se empiece dentro
de aproximadamente 24 horas, preferiblemente dentro de
aproximadamente 8, 10, 12, 14 o 16 horas, más preferiblemente dentro
de aproximadamente 2, 4 o 6 horas después de empezar el
enfriamiento. El experto en la materia entenderá que cuanto más alta
sea la temperatura después del enfriamiento, más rápido se tendrá
que comenzar la cosecha, para obtener mejores resultados. En una
forma de realización, la cosecha se empieza aproximadamente 1.5
horas después de la reducción de la temperatura. El método se
perfecciona sin problemas sustanciales especialmente porque la
cosecha es basada en un parámetro físico (pH) y no en algo
arbitrario como p. ej. el tiempo o densidad óptica (OD). Además el
método resulta en una masa de polisacárido muy estable que se puede
purificar utilizando un proceso relativamente simple. El proceso de
purificación se basa en el sobrenadante concentrado, por lo tanto la
cantidad de materiales auxiliares es mínima. La purificación resulta
en un polisacárido purificado que es estable durante un tiempo largo
y que supera todos los requisitos WHO.
Los polisacáridos capsulares se pueden extraer
de cualquier bacteria encapsulada, sea Gram-negativa
o Gram-positiva. Ejemplos no limitativos de
bacterias, que se pueden utilizar, son cepas de Streptococcus,
Staphylococcus, Enterococcus, Bacillus, Corinebacterium, Listeria,
Clostridium, Haemophilus, Pneumococcus, Neisseria y
Escherichia. Los polisacáridos capsulares de Haemophilus
influenzae, Streptococcus pneumoniae y Neisseria
meningitidis son de particular interés para los seres humanos.
La Haemophilus influenzae en especial se ha utilizado
ampliamente, véase p. ej. Rosenberg et al. (1961) J. Biol.
Chem. 236: 2845 y Zamenhof et al. (1953) J. Biol. Chem.
203:695. Se puede utilizar cualquier cepa de Haenzofilus
influenzae tipo b (Hib). Ejemplos de cepas adecuadas incluyen la
cepa Hib de referencia, Eagan y la cepa A760705.
Los métodos para cultivar estas bacterias son
bien conocidos en la técnica, por ejemplo de Meritt et al.
(2000) J Biotechnology 81: 189. En general, un medio de cultivo
adecuado está basado en aminoácidos y/o extracto de levadura o
peptona, cloruro sódico (NaCl) y glucosa, complementado con NAD y
hemina y tamponado utilizando un tampón fosfato. Preferiblemente, el
medio no debe contener componentes de origen animal salvo hemina. Un
pH adecuado es generalmente un pH entre aproximadamente 6 y 8,
preferiblemente aproximadamente 6.5 y 7.5 o aproximadamente 6.8 y
7.2. La temperatura de cultivo es típicamente aproximadamente
30-37ºC, preferiblemente entre aproximadamente 35 y
37ºC.
Según el método, el pH se mantiene constante en
un valor deseado utilizando ya sea ácido o base. Se puede utilizar
cualquier base o ácido que se utiliza de forma convencional para
ajustar el pH en cultivos de células. Las bases y ácidos adecuados
incluyen NaOH, preferiblemente en una concentración de
aproximadamente 1-5 mol/L y HCl, preferiblemente en
forma concentrada.
En cierto momento, el pH ya no se puede ajustar
más utilizando el ácido o base seleccionado, porque el pH muestra
ahora una tendencia a disminuir o aumentar respectivamente. Este
momento corresponde aproximadamente a la fase logarítmica tardía
(véase también la Fig. 1). El pH se monitoriza sin ajuste adicional.
La disminución o aumento del pH se ralentizará después de algún
tiempo, normalmente aproximadamente 2-4 horas
después de que los ajustes del pH se hayan interrumpido si se
cultiva a aproximadamente 35ºC. A temperaturas inferiores, esto
llevará más tiempo. Justo antes de que la reducción o aumento
empiece a ralentizarse, que será previsible de la puesta a prueba (a
diferencia de p. ej. la densidad óptica), se termina la fermentación
y el caldo de cultivo se cosecha. La fermentación se termina
preferiblemente por enfriamiento, ya que esto tiene muchas ventajas.
En primer lugar, no implica el uso de productos químicos fuertes,
como el formaldehído, que también se puede utilizar para la
terminación. En segundo lugar, es una manera muy económica de
terminar el crecimiento, porque no implica materiales adicionales.
En tercer lugar, tiene la ventaja concomitante de que la posibilidad
de lisis se minimiza durante la cosecha. Ya que la cosecha es un
proceso que típicamente no se completa en pocos minutos, el
enfriamiento le da la flexibilidad y tiempo para cosechar bajo
circunstancias óptimas y en el momento óptimo. Cosechar más temprano
puede dar lugar por ejemplo a un rendimiento un 50% inferior de
polisacáridos, dependiendo del tiempo de cosecha (véase por ejemplo
la Fig. 1). Cosechar en un momento posterior contaminará la fracción
polisacárida, porque las células habrán lisado y todo tipo de
material celular habrá acabado en el medio del cual se aislará el
polisacárido. (véase por ejemplo la Fig. 1). Estas contaminaciones
celulares complicarán cualquier aislamiento y procedimiento de
purificación adicional del polisacárido.
A fin de terminar la fermentación para su
cosecha, la temperatura se baja preferiblemente a por debajo de
30ºC, más preferiblemente a por debajo de 25ºC, de la forma más
preferible a por debajo de 20ºC. La cosecha real, es decir el
vaciado del fermentador, puede empezar en los minutos después de que
la fermentación se haya terminado, pero el enfriamiento hace el
procedimiento muy flexible y permite un retraso de varias horas a la
conveniencia de la persona que cosecha. No hay necesidad de esperar
durante la noche, lo que es casi inevitable si el formaldehído se
utiliza para matar células. En una forma de realización, la cosecha
se empieza al menos 2 horas después de que se haya terminado la
fermentación. En otra forma de realización, la cosecha se empieza al
menos 3, 4, 5 o 6 horas después de que se haya terminado el
crecimiento.
La cosecha se hace típicamente por centrifugado,
y se sigue opcionalmente por la inactivación, concentración y
preferiblemente diafiltración del sobrenadante. El centrifugado es
preferiblemente a una velocidad de aproximadamente
3000-6000 r.p.m. El centrifugado se sigue
opcionalmente por la inactivación. La inactivación, que se hace para
matar cualquier tipo de vida microbiana, se puede realizar
utilizando formaldehído, preferiblemente en una concentración final
que no excede el 0,1% (p/v) durante toda la noche a aproximadamente
2 a 8ºC. En una forma de realización se utilizó un 0,04% p/p de
formaldehído para inactivar el sobrenadante. El sobrenadante
concentrado se puede almacenar antes de la recuperación del
polisacárido, preferiblemente por congelación, de la forma más
preferible por congelación a \leq-20ºC, donde se
mantendrá estable durante al menos dos años si se produce según este
método. En una forma de realización, se mantuvo estable durante al
menos tres años.
En una forma de realización, la producción
polisacárida durante la fermentación se estimó utilizando un ELISA y
típicamente fue de entre aproximadamente 200 y 400 mg/l en el
sobrenadante, y fue de masa molecular relativa bastante elevada
(700-800 kDa).
\vskip1.000000\baselineskip
El polisacárido se puede recuperar del medio,
normalmente de su sobrenadante, utilizando técnicas del estado de la
técnica. La recuperación puede dar lugar a un polisacárido
parcialmente, sustancialmente o completamente purificado.
Preferiblemente, se obtiene un producto que contiene más del 80%,
85%, 90% o 95% del polisacárido inicial. No obstante, la
fermentación según el método de la solicitud también permite un
proceso de recuperación muy simple, que también se puede utilizar en
combinación con procesos de producción polisacárida del estado de la
técnica. Este simple proceso de recuperación y purificación se
caracteriza por el hecho de que no se utilizan productos químicos
fuertes tal como el fenol. Por otra parte, no hay necesidad de
centrifugado de alta velocidad o ultracentrifugado, o cromatografía.
Esto hace la purificación económicamente atractiva, porque no hay
necesidad de invertir en un centrifugador de alta velocidad (extra)
o ultracentrifugador o en material de columna caro. El proceso
comprende cuatro simples fases de precipitación, que no se tienen
que repetir varias veces, como es frecuente en el caso de esquemas
de purificación del estado de la técnica (Tanizaki et al.
(1996), J. Microbiol. Meth., 27, 19-23) y que duran
cada una un máximo de 24 horas. En una forma de realización, la
precipitación se realiza convenientemente durante la noche, es decir
durante 15-18 horas.
Este simple proceso de recuperación
comprende:
a) utilizar un detergente catiónico para
precipitar el polisacárido o parte de los contaminantes del
sobrenadante para obtener una primera fracción polisacárida;
b) utilizar alcohol para precipitar el
polisacárido de la primera fracción polisacárida para obtener una
segunda fracción polisacárida;
c) someter la segunda fracción polisacárida a
una precipitación de alcohol en la presencia de un detergente
aniónico, por lo cual el alcohol está presente en una concentración
que está por debajo de la concentración en la que precipita el
polisacárido;
d) precipitar el polisacárido de la fracción
soluble utilizando alcohol para obtener un precipitado de
polisacárido;
e) disolver el precipitado polisacárido y
someterlo a concentración y diafiltración.
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El detergente catiónico en a) es preferiblemente
Cetavlon (bromuro de hexadeciltrimetil amonio, preferiblemente en
una concentración final de aproximadamente 0,01-1%
(p/v). El detergente aniónico en c) es preferiblemente desoxicolato
de sodio (DOC), preferiblemente en una concentración final de
aproximadamente 0,1-1% (p/v). El alcohol que se
utiliza en las fases de precipitación es preferiblemente etanol,
preferiblemente en una concentración final de aproximadamente
60-74% (v/v) en b); de aproximadamente
10-50% (v/v) en c); y de aproximadamente
60-85% (v/v) en e). En cada fase, los sólidos y
fluidos (también referidos como granulados y sobrenadantes) se
separan por cualquiera o una combinación de centrifugación,
decantación y filtración. Después de la última precipitación de
alcohol, el gránulo se separa preferiblemente del sobrenadante por
decantación y no por centrifugación. En cualquier fase, se puede
disolver gránulo con polisacárido precipitado en cualquier solvente
o líquido conveniente, por ejemplo utilizando agua o 1 mol de NaCl.
Este proceso de recuperación simplificado que se puede utilizar para
todo tipo de polisacáridos también es parte de la invención.
Preferiblemente, la purificación se realiza
utilizando sobrenadante concentrado. La cantidad de detergente y/o
etanol necesario se basa en el volumen del concentrado. Entonces el
polisacárido purificado se mantiene estable durante al menos dos
años a \leq-20ºC. En una forma de realización, el
polisacárido purificado se mantuvo estable durante al menos tres
años.
En una forma de realización, el polisacárido se
recupera por un proceso que comprende un 0.65% (p/v) de
precipitación de cetavlon, un 72% (v/v) de precipitación de etanol,
un 32% (v/v) de precipitación de etanol en presencia de 0,5% (p/v)
de DOC y un 64% (v/v) de precipitación de etanol, preferiblemente
después de la clarificación.
En otra forma de realización, el polisacárido se
purifica utilizando un 0,04% (p/v) de precipitación de cetavlon en
a). Entonces el polisacárido se mantendrá en el sobrenadante. La
precipitación de alcohol se puede realizar añadiendo alcohol
directamente al sobrenadante. El resto del proceso es como se
menciona anteriormente.
En otra forma de realización más, el proceso de
recuperación comprende un 0.65% (p/v) de precipitación de cetavlon
además de un 0,04% (p/v) de precipitación de cetavlon. El 0,04%
(p/v) de precipitación de cetavlon puede por ejemplo utilizarse para
purificar de forma adicional el polisacárido obtenido después de la
fase del 64%(v/v) de etanol.
El alcohol en c) se puede añadir antes o después
de la adición del detergente. De forma alternativa, se añade
simultáneamente, es decir separadamente al mismo tiempo o como una
mezcla. Preferiblemente, el alcohol se añade después del
detergente.
Una combinación del método de fermentación y de
recuperación de la invención permite la alta pureza del
polisacárido. Por ejemplo, el polisacárido capsular de
Haemophilus influenzae tipo b aislado según esta combinación
de métodos de la invención, reúne todas las especificaciones de
polisacárido purificado para utilizar en la producción de vacunas
Hib conjugadas.
Preferiblemente, la fracción polisacárida
purificada contiene al menos un 90% (p/p) de polisacárido, más
preferiblemente al menos un 94, 95 o 96% (p/p) de polisacárido,
basado en el peso seco. El contenido de endotoxina es
preferiblemente menos de 10 Ul/microgramo, más preferiblemente menos
de 8, menos de 5, menos de 2 o menos de 1 Ul/microgramo, de la forma
más preferible, es menos de 0,5 o menos de 0,2 Ul/microgramo de
fracción polisacárida. El contenido de ácido nucleico es
preferiblemente menos del 1% (p/p), más preferiblemente menos de 0,8
(p/p).
\vskip1.000000\baselineskip
Un polisacárido que se produce utilizando el
método de la solicitud se puede utilizar para aumentar la habilidad
del sistema inmunológico humano o animal para combatir las
infecciones. En particular, se puede utilizar para la preparación de
una composición farmacéutica para su administración a un sujeto
humano o animal. El polisacárido o un conjugado del mismo se
administra preferiblemente por vía parenteral, p. ej. por inyección
o infusión por vía intravenosa, intraperitoneal, intramuscular,
intraarterial o intralesional. El polisacárido o un conjugado del
mismo se puede combinar con un medio o vehículo de entrega
farmacéuticamente aceptable por técnicas convencionales conocidas en
la técnica. Los métodos para preparar las composiciones
parenteralmente administrables son bien conocidas en la técnica y se
describen en más detalle en varias fuentes, que incluyen, por
ejemplo, Remington's pharmaceutical Sciences, Ed. AR Gennaro, 20ª
Edición, 2000, Williams & Wilkins, PA, EEUU. El polisacárido se
administra preferiblemente en una dosis terapéuticamente efectiva,
es decir una que aumentará la capacidad del sistema inmunológico
humano o animal para combatir las infecciones.
Preferiblemente, se utiliza para la producción
de una vacuna, por ejemplo una vacuna conjugada polisacárida. Los
métodos para producir vacunas conjugadas se conocen en la técnica y
se describen en p. ej. Ada et al (2003) Clin. Microbiol.
Infect. 9(2): 79-85, Dick et al (1986)
Contributions to Microbiology and Immunology, vol. 10: Conjugate
Vaccines: 48-114, y Jennings et al (1994)
Neoglycoconjugates: Preparation and Applications:
325-371. Aunque hay ligeras variaciones en los
métodos utilizados para producir vacunas conjugadas, los métodos de
producción típicamente comprenden:
- -
- la activación del polisacárido y/o el portador de proteína
- -
- la conjugación del polisacárido (activado) al portador de proteína (activado)
- -
- la purificación opcional, del conjugado de proteína-polisacárido
- -
- la formulación opcional, del conjugado de proteína-polisacárido.
\vskip1.000000\baselineskip
El polisacárido se puede reducir de tamaño a una
masa molecular consistente antes de la conjugación, utilizando
métodos controlados de despolimerización conocidos en la técnica.
Los métodos adecuados de despolimerización comprenden la oxidación
de los dioles vecinales, los sometidos a ultrasonidos, e hidrólisis
ácida o alcalina. La hidrólisis alcalina se puede efectuar
convenientemente en un tampón, a fin de asegurar la estabilidad del
pH a lo largo de la reacción. Un tampón alcalino adecuado es el
tampón bicarbonato-carbonato, 0,1 a 1 mol/L a un pH
por encima de 9, preferiblemente por encima de un pH de 10. Estas
reacciones de despolimerización se pueden llevar a cabo a
temperatura ambiente, pero preferiblemente en el frío, tal como de 2
a 8ºC, para minimizar reacciones adicionales indeseadas, y
preferiblemente bajo agitación vigorosa.
El polisacárido se puede activar antes de la
conjugación o antes de la reducción de tamaño por métodos de
activación conocidos en la técnica, tal como por ejemplo utilizando
un reactivo cianilante (Kohn et al (1986) Appl. Biochem.
Biotechnol. 9: 285 305). Los agentes cianilantes adecuados incluyen
bromuro cianógeno (CNBr), tetrafluoroborato de
1-ciano-4-(dimetilamino)-piridinio
(CDAP), tetrafluoroborato de
N-ciano-N,N,N-trietilamonio
(CTEA), y p-nitrofenilcianato (pNPC). De forma
alternativa, los grupos terminales aldehídos se pueden formar en el
polisacárido vía la rotura oxidativa de los dioles vecinales y
entonces se puede efectuar la conjugación por aminación reductiva
con un reactivo de reducción adecuado, tal como cianoborohiduro de
sodio. El portador de proteína también se puede activar antes de la
conjugación por métodos de activación conocidos en la técnica, tal
como por ejemplo utilizando un reactivo halógeno alquilante
(Bernatowicz et al (1986) Anal. Biochem. 155(1):
95-102.). Tal reactivo adecuado es el éster de
N-hidroxisuccinimida de ácido bromoacético.
El polisacárido se puede conjugar al portador de
proteína directamente o después de la activación (adicional) vía
moléculas separadoras o enlazadoras, introducidas bien en el
polisacárido (activado) y/o en el portador de proteína (activado).
Por ejemplo, después de la activación del polisacárido con un agente
cianilante, se pueden introducir separadores de (di)amino o
aminoácidos, tal como cistamina o glicina en el polisacárido.
Algunos separadores del diamino se pueden reducir adicionalmente
para generar grupos de tiol libre (De Weers et al (1998)
Bioconjugate Chem. 9(3): 309-315.). Otro
separador adecuado es la dihidrazida de ácido adípico (ADH) (Chu
et al (1983) Infect. Immun. 40(1):
245-256). De forma alternativa, estos separadores se
pueden introducir sobre el portador de proteína por una reacción de
amidación.
La eliminación de un exceso de separadores se
puede efectuar por métodos de purificación conocidos en la técnica,
tal como cromatografía de permeación en gel, precipitación
diferencial, y diafiltración. Un sistema de diafiltración adecuado
hace uso del principio de filtración de flujo tangencial sobre
membranas microporosas. Las soluciones tamponadas salinas han
demostrado facilitar este proceso de purificación. Una solución
adecuada es un tampón fosfato, de aproximadamente 0,01 a 0,2 mol/L,
con cloruro sódico o la sal equivalente, aproximadamente 0,5 a 3
mol/L. Con tal método, un separador tal como ADH se puede eliminar a
niveles de contaminación por debajo de aproximadamente 0,05 a 0,5%
(p/p) de la ADH ligada al polisacárido. Tal descontaminación se
puede monitorizar por el uso de cromatografía de permeación en gel
de alto rendimiento (HP-GPC), con un detector de UV
establecido en una onda baja, tal como aproximadamente de 210 a 230
nm. Entonces se hace la cuantificación de ADH residual a través del
uso de una calibración estándar. Después de la introducción de
separadores sobre el polisacárido, la conjugación a la proteína
portadora se puede efectuar por la mediación de un reactivo de la
amidación de carbodiimida. Un reactivo de amidación adecuado es
N-(3-dimetilaminopropil)-N'-clorhidrato
de etilcarbodiimida (EDC), que se puede suplementar con
N-hidroxisuccinimida (NHS) para facilitar la
reacción. De forma alternativa, los enlaces de tioéter se pueden
formar por condensación entre un polisacárido tiolado y un portador
de proteína acetilado con halógeno, sin la ayuda de un reactivo
adicional.
Una reacción de la conjugación mediada por
carbodiimida puede tener lugar en un pH ligeramente ácido,
típicamente de pH 4 a 6, así asegurando la amidación preferencial de
los grupos separadores de hidracida sobre los grupos amino que se
encuentran en el portador de proteína. En una forma de realización,
la reacción de conjugación se desarrolla en un tampón adecuado, a
fin de asegurar la estabilidad del pH a lo largo de la reacción.
Esto obvia la necesidad de tener que acceder a o invertir en un
medidor de pH equipado con valorador automático a fin de hacer
adiciones ácidas regulares. En una forma de realización preferida,
se utiliza un tampón desprovisto de grupos carboxílicos que
reaccionan con carbodiimidas, así perjudicando la reacción de
conjugación deseada. Por ejemplo, se puede utilizar un tampón que se
compone de ácido 2-morfolinoetanosulfónico (MES), de
0,05 a 0,2 mol/L, y cloruro sódico, de 0,2 a 1 mol/L, a un pH de 5.5
a 6.1. La reacción de conjugación se puede aplacar por la adición de
alcali o un tampón alcalino, que eleva el pH de la mezcla reactiva a
aproximadamente pH 7 o por encima, así impidiendo o ralentizando
drásticamente la amidación mediada por carbodiimida adicional. Un
tampón alcalino adecuado es un tampón fosfato, de aproximadamente
0,1 a 0,4 mol/L, a pH 8 a 9, añadido en cantidad suficiente como
para neutralizar la mezcla reactiva a aproximadamente pH 7.
La eliminación de polisacárido y proteína no
reaccionados se puede efectuar por métodos de purificación conocidos
en la técnica, tal como cromatografía de permeación en gel,
cromatografía de interacción hidrofóbica, precipitación diferencial,
y diafiltración. Un sistema de cromatografía de permeación en gel
adecuado hace uso de Sepharose CL-4B, Sephacryl S
500 HR (Amersham), o medios de gel equivalentes, con una solución
salina neutra tamponada como eluyente. Un sistema de cromatografía
de interacción hidrofóbica adecuado hace uso de butil, octil-, o
Fenil Sepharose 6 Fast Flow (Amersham), o medios equivalentes de
gel, con una solución de sulfato amónico neutra tamponada como
eluyente de unión. Un sistema de precipitación diferencial adecuado
hace uso de soluciones concentradas de sulfato amónico. El
polisacárido y proteína residual no-reaccionado se
puede detectar y cuantificar utilizando cromatografía de permeación
en gel de alto rendimiento (HP-GPC), con un detector
de UV establecido en 280 nm., y un detector de índice de refracción
diferencial. El polisacárido residual no reaccionado también se
puede cuantificar por un ensayo colorimétrico específico después de
la precipitación del conjugado.
La preparación de conjugados también se describe
en US 4,356,170, US 4,644,059, US 4,673,574, US 4,695,624, US
4,902,506, US 7,667,170, EP 0 161 188, EP 0 477 508 y EP 0 848
011.
El polisacárido, que es preferiblemente un
poliribosil ribitol fosfato (PRP), se puede acoplar a cualquier
portador de proteína. Los portadores de proteína adecuados aumentan
su inmunogenicidad e incluyen proteínas de membrana inmunogénicas,
subunidades de proteína vírica, polipéptidos sintéticos y otras
proteínas inmunogénicas. De la forma más preferible, el portador de
proteína es un toxoide. Los toxoides bien conocidos utilizados en
vacunas conjugadas son toxoide de tétanos y toxoide de difteria.
El polisacárido producido se puede utilizar para
producir una vacuna monovalente. Un ejemplo adecuado de una vacuna
monovalente es un polisacárido o una vacuna conjugada sólo contra
Haemophilus influenzae tipo b (Hib). De forma alternativa, el
polisacárido de la invención se puede utilizar para producir una
vacuna multivalente. Se puede utilizar por ejemplo para producir una
vacuna tetravalente, tal como
difteria-tétanos-polio-Hib
o
difteria-pertussis-tétanos-Hib,
o una vacuna pentavalente, tal como
difteria-pertussis-tétanos-polio-Hib,
o
difteria-pertussis-tétanos-hepatitis
B-Hib.
La vacuna se puede formular de cualquier manera
conveniente. Por ejemplo, una vacuna Hib monovalente se puede
liofilizar o en forma líquida, con o sin la adición de un
estabilizador, tal como la lactosa, o de un adyuvante, tal como
fosfato de aluminio.
Quedará claro al experto en la materia que el
método de producción también puede ser utilizado para la producción
polisacárida de otros microorganismos que contienen
polisacáridos.
\vskip1.000000\baselineskip
Una cepa de Haemophilus Influenzae tipo b
(A760705) aislada en Amsterdam se cultivó utilizando un biorreactor
de 50 1 (volumen de trabajo de 40 l) con un sistema de control NOVO.
Esta cepa se identificó como una Haenzophilus Influenzae tipo
b utilizando pruebas de uso común, tal como inmuno y
serotipificación, y pruebas de morfología. El biorreactor se llenó
primero con el medio basal (compuesto 1 a 5 en la tabla 1 disuelto
en 35.5 l) antes de esterilizarlo en el sitio durante 20 minutos a
110ºC. Justo antes de la inoculación se añadió la cantidad apropiada
de soluciones estándar al medio (véase la tabla 2). El biorreactor
se inoculó utilizando 11 precultivos, cultivado a una escala de 3.5
utilizando el mismo medio y un lote de siembra congelada a -70ºC de
la cepa Hib.
El pH se mantuvo constante a 7.0 utilizando 5
mol/L NaOH. La temperatura se mantuvo constante a 35ºC. El oxígeno
disuelto (OD) se mantuvo constante al 30% utilizando aire y oxígeno
a través de la cámara de aire utilizando un flujo de gas de 5 l/min.
La velocidad del agitador se aumentó gradualmente de 300 a 700
r.p.m.
Se tomaron diferentes muestras utilizando un
dispositivo automuestreador. El cultivo se monitorizó midiendo la
densidad óptica a 590 nm (OD_{590}), concentración de pH y PRP
(véase la figura 1). Para monitorizar la lisis del cultivo se
controló una cepa Gram de un número de muestras.
Primero la concentración PRP aumentó a alrededor
de 320 mg/l, que era más o menos paralela al crecimiento. El pH
comenzó a aumentar después de aproximadamente 7 horas de cultivo, la
OD_{590} estaba en su óptimo y era igual a 6.88. Después de
aproximadamente 12 horas de cultivo el PRP era más o menos constante
a 330 mg/l mientras el pH aumentó adicionalmente, la OD_{590}
disminuyó adicionalmente y la lisis de las células empezó
lentamente. Después de 16 horas de cultivo las células no estaban
todavía totalmente lisadas y el pH era igual a 7.92.
\vskip1.000000\baselineskip
Después de un par de horas más a temperatura
ambiente, se notó la lisis total de las células, el pH era igual a
8.43 y el OD_{590} a 4.08. La concentración de PRP era igual a 480
mg/l, debido a la lisis total.
\vskip1.000000\baselineskip
Este experimento tenía la intención de
monitorizar el cultivo de Hib, el sobrenadante no se purificó según
el proceso anteriormente descrito.
El tiempo óptimo de cosecha de este cultivo fue
después de alrededor de 10 horas de cultivo. Para posponer la lisis,
el cultivo se pudo haber enfriado a una temperatura inferior a la
temperatura de cultivo, y se pudo haber secretado algún PRP más
durante el enfriamiento. La cosecha en la fase exponencial supondría
un rendimiento de PRP bajo.
\vskip1.000000\baselineskip
PRP se produjo bajo las condiciones del Ejemplo
1 en una escala de 350. El cultivo no se continuó hasta el lisado de
todas las células pero se detuvo después de 8.3 horas a un pH de
7.43 y una OD_{590} de 4.4 empezando el enfriamiento utilizando
agua corriente a través de la camisa del biorreactor. El cultivo se
cosechó 1.5 horas más tarde utilizando un centrifugador continuo. Al
principio de la cosecha la concentración de PRP en el sobrenadante
era igual a 277-377 mg/l, y la temperatura del
cultivo era igual a 19ºC. El sobrenadante se inactivo añadiendo una
solución de 2.7 mol/l de formaldehído al sobrenadante hasta una
concentración de aproximadamente 0,1% (v/v). El sobrenadante se
concentró a aproximadamente 9.61 y diafiltró utilizando PBS. El
sobrenadante concentrado se almacenó a \leq -20ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se purificó 1.5 l de sobrenadante concentrado
del Ejemplo 2 utilizando el proceso de la figura 2 cuatro meses
después del cultivo.
Después de la purificación, se liofilizaron 12
frascos con contenido cada uno de 30 ml de PRP líquido puro para
determinar la pureza basada en la masa seca (WHO TRS 814 anexo 1
1991 y TRS 897 anexo 1, 2000).
Todas las muestras (líquidas y liofilizadas,
incluyendo muestras IPC) se analizaron por PRP, ácidos nucleicos y
contenido de proteína. También se analizó PRP purificado utilizando
HP-GPC (Hennessey et al (1993) J. Liq.
Chromatogr. 16(8): 1715 1729), RMN (Lemercinier et al
(2000) Biolgicals 28(3): 175-183), y
espectroscopia UV. La determinación de ribosa (reacción de orcinol:
Ashwell et al (1957) Meth. Enzymol. III:
73-105), fósforo (Ames et al (1966) Meth.
Enzymol. VIII: 115-118), y proteína residual (Lowry
et al (1951) J. Biol. Chem. 193: 265-275), se
hizo por ensayos colorimétricos. La endotoxina se midió con el
ensayo LAL.
Véase la tabla 3 para la composición del PRP
purificado. El PRP tenía una masa molecular relativa de 765 kDa. El
PRP reunió todas las especificaciones de WHO de polisacárido
purificado para utilizar en la producción de vacunas Hib conjugadas.
El rendimiento de purificación basado en el ensayo orcinol era igual
al 80%. La concentración DOC en el producto final era inferior a 5
\mug/ml (límite de detección) y el formaldehído inferior a 0,005
nmol/L.
El PRP (1,023 g; endotoxina: 0,02 Ul por \mug
de PRP) se concentró a \sim10 g/l con la ayuda de un sistema de
filtración de flujo tangencial, equipado con un cartucho de filtro
de límite de peso molecular de 100 kDa (MWCO). Recuperación: 999 mg
(98%). Entonces se transfirió el concentrado de PRP a un recipiente
revestido, y enfrió a \sim4ºC. Entonces se añadió rápidamente un
volumen igual de tampón de bicarbonato/carbonato de sodio (0,4
mol/L, pH 10.5) previamente enfriado, y se mantuvo la resultante
mezcla reactiva a \sim4ºC bajo vigorosa agitación (\sim400
r.p.m.) durante 90 minutos. La reducción media de la masa molecular
relativa (M_{r}) del PRP se monitorizó por
HP-GPC.
Al final de esta fase de degradación alcalina,
se añadió (2,2 ml por g de PRP) CNBr (5 mol/L en acetonitrilo). Las
precedentes condiciones se mantuvieron durante otros 10 minutos. A
partir de entonces, se añadieron rápidamente tres volúmenes de
reactivo de ADH previamente enfriado (18 g por g PRP), 30 g/l en
solución de bicarbonato (1 mol/L). Las precedentes condiciones se
mantuvieron durante otras \sim16 h (a pH \sim9).
Entonces se concentró el PRP activado
(PRP-ADH) a -20 g/l, con el sistema TFF, equipado
con un cartucho de filtro de 10 kDa MWCO. Entonces tuvo lugar una
diafiltración para eliminar el exceso de reactivos, principalmente
ADH. La primera fase hizo uso de \sim20 volúmenes de tampón de
fosfato sódico (0.1 mol/L, pH 7.2; con NaCl, 1.5 mol/L). El progreso
de la eliminación de exceso de ADH se siguió por
HP-GPC a 215 nm, en relación a una curva de
calibración estándar. Cuando el exceso de ADH estaba por debajo de
0,05% (p/p) de la ADH total, la diafiltración continuó con \sim5
volúmenes de tampón MES (0.1 mol/L, pH 6.1; con NaCl, 0.5 mol/L).
Entonces se concentró el PRP-ADH a una
concentración estimada de -25 g/l. Entonces se analizó el
PRP-ADH por ribosa y grupos amino (TNBS reaction:
Habeeb et al (1966) Anal. Biochem. 14:
328-336), y se almacenó a entre 2 y 8ºC.
Recuperación: 764 mg (75%). Proporción de activación: 25 unidades de
repetición (RU) de PRP por grupo ADH, o 1,9% (p/p) ADH.
\vskip1.000000\baselineskip
El toxoide tétanico (TTd; 1,327 g; 1,623 Lf/mg
PN; 1,900 Lf/ml) se concentró a -20 g/l, con el sistema TFF
(cartucho de filtro de 10 kDa MWCO). Entonces tuvo lugar la
diafiltración, en parte para eliminar el exceso de componentes del
medio, con \sim5 volúmenes de tampón MES (pH 6.1). Entonces se
concentró el TTd a una concentración estimada de \sim30 g/l. El
TTd concentrado se analizó por contenido de proteína (reacción
Lowry), y almacenó a entre 2 y 8ºC. Recuperación: 1.186 g (89%).
Entonces se transfirió el
PRP-ADH concentrado (707 mg) a un reactor con
camisa, y enfrió a \sim4ºC. Entonces se añadió TTd concentrado
(786 mg), y la resultante mezcla reducida a \sim4ºC, bajo
agitación suave (-200 r.p.m.), para impedir la formación de espuma.
Entonces se añadió (1 g por g TTd) reactivo EDC previamente
enfriado, 100 g/l en tampón MES (pH 6.1). Finalmente, se añadió
tampón MES (pH 6.1) para completar el volumen total. Esta mezcla
reactiva (PRP/TTd proporción de 0.93 p/p) se mantuvo a \sim4ºC,
bajo agitación suave. La reacción se detuvo a las 3 h 30, cuando el
nivel residual de TTd alcanzó el 4,4%, según se midió por
HP-GPC a 280 nm. La reacción se aplacó por la
adición de un volumen igual de tampón de fosfato sódico (0,1 mol/L,
pH 8.0; con EDTA, 0,005 mol/L), y entonces se almacenó a entre 2 y
8ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
La mezcla de conjugación se clarificó en una
unidad de filtro incorporado de 0.45 \mum. Entonces se purificó en
cinco partes iguales en una columna de GPC (diámetro de 4,4 cms, 45
cm de altura de lecho compacto), rellena de Sepharose
CL-4B (Amersham Pharmacia Biotech), y se eluyó con
tampón de fosfato sódico (0,1 mol/L, pH 7.0; con EDTA, 0,005 mol/L)
a una velocidad de flujo de 6 ml/min. La elución se vigiló con el
índice de refracción diferencial, UV (226 nm), y detectores de
conductividad. Las fracciones se recogieron cada 2 minutos durante
\sim0.9 CV. Entonces se analizaron las fracciones de la primera
ejecución por ribosa, y contenido de proteínas (Reacción de BCA:
Smith et al (1985) Anal. Biochem. 150(1):
76-85), y se almacenaron a entre 2 y 8ºC. Las
fracciones correspondientes al primer valor máximo con contenido de
ribosa (187 mg PRP) y proteína (440 mg TTd), y con una proporción
homogénea de PRP/TTd (0,43 p/p), se agruparon de todas las
ejecuciones (agrupación 1): esta es la agrupación conjugada de alta
M_{r} utilizada más tarde para la preparación de vacunas. Las
fracciones restantes que comprenden principalmente PRP no conjugado,
también se agruparon (agrupación 2) para calcular el balance de
masa: esta agrupación contiene conjugado de baja y media M_{r},
PRP-ADH libre (es decir, no conjugado), y TTd libre.
El balance de masa era de: un 78% de PRP, y un 76% de TTd, basado en
cantidades de materias primas de conjugación (véase la tabla 4).
Entonces la agrupación conjugada de alta M_{r} (agrupación 1) se
concentró a -4 g/l, con el sistema TFF (cartucho de filtro de 10 kDa
MWCO). Entonces tuvo lugar la diafiltración, con \sim10 volúmenes
de tampón Tris (0,02 mol/L; pH 7.0). Entonces se concentró el
conjugado de tampón-intercambiado (PRPTTd) a \sim1
g/l, y esterilizó por filtración en una unidad de filtro incorporado
de 0,22 \mum. La masa estéril de PRPTTd concentrada fue analizada
por HP-GPC, y para el contenido de ribosa, y de
proteína (Reacción de BCA), y entonces se almacenó a entre 2 y 8ºC.
Recuperación: 170 mg de PRP (22%), y 372 mg de TTd (45%). La
proporción de PRP/TTd final fue de 0,46 (p/p) (Especificación WHO:
0.3-0.6) y el contenido de endotoxina de 6.58 Ul por
\mug PRP. El análisis de PRP libre (Guo et al (1998)
Biologicals 26 (1): 33-38) dio un 12,7%
(Especificación de WHO: <20%). Entonces se estudió la estabilidad
de la masa estéril concentrada de PRPTTd durante un total de seis
meses mientras se almacenó a entre 2 y 8ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En otro experimento estéril, se formuló masa
estéril de PRPTTd concentrada (121 mg PRP; 348 mg TTd; PRP/TTd en
una proporción de 0.35 p/p; 1.9% PRP libre, endotoxina 7.27 Ul por
\mug de PRP) con tampón Tris y sacarosa, en preparación para la
liofilización. La vacuna en masa se diluyó con tampón Tris, (0,1
mol/L; pH 7.0), entonces se añadió sacarosa (0,5 mol/L), y se añadió
agua para inyección para completar el volumen total. Las partes de
1,4 ml se transfirieron a frascos de dosis múltiple de vacuna, y
entonces tuvo lugar la liofilización. Debido a las pérdidas
inherentes al proceso de llenado automático, finalmente se
obtuvieron -1.500 frascos de dosis múltiple, para un total de 7.500
dosis inyectables (es decir, 5 por frasco). Cada frasco contenía de
8-12 \mug de PRP por ml de dosis humana, para ser
reconstituido con solución NaCl. Entonces se estudió la estabilidad
de la vacuna PRPTTd liofilizada durante 18 meses (previsto para un
total de 36 meses), a temperatura ambiente normal, y bajo
condiciones de tensión a 37ºC (véase la tabla 5). La temperatura de
transición del estado vítreo (medido por DSC) se mantuvo alta a
aproximadamente 63ºC, y se mantuvo constante, demostrando que la
vacuna liofilizada estaba en un estado físico estable. Para la
determinación de PRP libre, la sacarosa se tuvo que eliminar primero
por intercambio de tampón, utilizando dispositivos de
ultrafiltración centrífuga (10 kDa de MWCO). La estabilidad de la
masa estéril de PRPTTd concentrada también se estudió durante un
total de seis meses (véase la tabla 5). Durante estos estudios, la
M_{r} se mantuvo constante, y no se observó ningún aumento
significativo de PRP libre.
\newpage
\global\parskip0.900000\baselineskip
Esta lista de referencias citada por el
solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información
del lector. No forma parte del documento de patente europea. La
misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin
embargo no asume responsabilidad alguna por eventuales errores u
omisiones.
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Claims (5)
1. Método para la recuperación de un
polisacárido de un caldo de fermentación, y donde la recuperación
incluye:
- -
- utilizar un detergente catiónico para precipitar el polisacárido o parte de los contaminantes del sobrenadante para obtener una primera fracción de polisacárido;
- -
- utilizar alcohol para precipitar el polisacárido de la primera fracción de polisacárido para obtener una segunda fracción de polisacárido;
- -
- someter la segunda fracción de polisacárido a una precipitación de alcohol en presencia de un detergente aniónico, por lo cual el alcohol está presente en una concentración que es inferior a la concentración en la que el polisacárido se precipita;
- -
- la precipitación del polisacárido de la fracción soluble utilizando alcohol para obtener un precipitado de polisacárido;
- -
- disolver el precipitado de polisacárido y someterlo a concentración y diafiltración.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Método según la reivindicación 1, donde el
polisacárido se obtiene de haemophilus influenzae tipo b.
3. Método según una cualquiera de las
precedentes reivindicaciones, donde el detergente aniónico es
deoxicolato de sodio.
4. Método según una cualquiera de las
precedentes reivindicaciones, donde el detergente catiónico es
hexadeciltrimetil bromuro de amonio.
5. Método según una cualquiera de las
precedentes reivindicaciones, donde el alcohol es etanol.
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