JP2003503059A - 破傷風毒素ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 破傷風毒素（ＴｅＮＴ）フラグメントＣまたはそれの免疫原性フラグメントを含むポリペプチドであって、該破傷風毒素フラグメントＣまたはそれの免疫原性フラグメントがループ領域において突然変異を含んでおり、該突然変異が、破傷風毒素フラグメントＣもしくはそれの免疫原性フラグメントのガングリオシドへの結合性の低下、および／または破傷風毒素フラグメントＣもしくはそれの免疫原性フラグメントの一次運動ニューロンへの結合性の低下、および／または破傷風毒素フラグメントＣもしくはそれの免疫原性フラグメントが逆行性輸送を受ける能力における低下を生じさせるポリペプチド。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の分野） 本発明は、破傷風毒素（ｔｅｔａｎｕｓ ｔｏｘｉｎ：ＴｅＮＴ）のフラグメ
ントＣに由来するポリペプチドと、ワクチン組成物におけるこのポリペプチドの
使用に関する。

【０００２】 （発明の背景） 破傷風は、微生物破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）によっ
て惹起される非常に感染性のある全世界に及ぶ疾患である。その胞子は、開放創
（ｏｐｅｎ ｗｏｕｎｄ）に対する感染症の主要原因であるハウスダスト中や土
壌中において、無期限に休眠状態で存在することができる。汚染動物の糞便はこ
の疾患が蔓延する原因にもなり、さらに以前には感染していなかった局所を汚染
させることがある。

【０００３】 破傷風感染は常に傷ついたヒトや動物にとってリスクとなり、たいていは大き
な疼痛を伴い、死亡の原因となることさえある。そこで、原因物質が細菌である
ことが発見された１９世紀には、有効なワクチンの開発に大きな努力が費やされ
てきた。ヒト被検者において最初のワクチン接種が実行されて成功が収められた
のは１９２６年であり、このとき使用されたワクチンは無毒性にするための処理
が施された天然の破傷風毒素を含有していた。

【０００４】 破傷風毒素は最初のワクチンのためのターゲットを提供したが、これは破傷風
の症状の原因が宿主細胞に感染する細菌ではなく、むしろ細菌細胞の溶解後に遊
離される強力な神経毒素であることが明らかになっていたためである。

【０００５】 インビボでは軽鎖および重鎖の両方を含む単一（親）ペプチドが合成される。
細菌細胞が溶解すると、内生タンパク質は以前から存在するジスルフィド架橋間
でペプチドを開裂してジスルフィド架橋によって連結された２個のペプチド鎖を
生じさせる。

【０００６】 パパインは重鎖を開裂させて軽鎖と重鎖の一部から構成されるフラグメントＢ
（１００ｋＤａ）、および重鎖の残りから構成されるフラグメントＣ（５０ｋＤ
ａ）を生じさせる。どちらのフラグメントも保護を提供できるが、未開裂毒素に
よる汚染を原因とする残留毒性に関連している可能性があることが証明されてい
る。

【０００７】 破傷風毒素（ｔｅｔａｎｕｓ ｔｏｘｉｎ：ＴｅＮＴ）はボツリヌス毒素（ｂ
ｏｔｕｌｉｎｕｍ ｔｏｘｉｎ：ＢｏＮＴｓ）を含むクロストリジウム神経毒素
（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ：ＣＮＴｓ）ファミリーに属
する毒素である。クロストリジウム神経毒素はシナプス小胞と細胞膜との融合に
関係するタンパク質のタンパク分解性開裂によってシナプス前神経細胞からの神
経伝達物質の遊離を阻害する。この開裂は亜鉛依存性メタロプロテアーゼをコー
ドするクロストリジウム神経毒素の５０ｋＤａのＬ鎖によって触媒される。クロ
ストリジウム神経毒素の総合的な構造的特性および機能的特性は極めて類似して
おり、類似のサブユニット構造および３０〜４０％のアミノ酸同一性を有してい
る（Ｍｉｎｔｏｎ，１９９５年）。末梢神経系内に残留するボツリヌス毒素とは
対照的に、破傷風毒素は逆行性軸索輸送（ｒｅｔｒｏｇｒａｄｅ ａｘｏｎａｌ
ｔｒａｎｓｐｏｒｔ）によって中枢神経系へ運ばれ、それからシナプス経由で
抑制性介在ニューロン内へ分布させられる。これら毒素の区別可能な作用部位と
、それにあるこれら２種の疾患の区別可能な臨床症状を説明するのは、ボツリヌ
ス毒素と比較した破傷風毒素の差別的細胞トラフィッキング（ｄｉｆｆｅｒｅｎ
ｔｉａｌ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）である。

【０００８】 破傷風毒素およびボツリヌス毒素が、感受性細胞に結合するメカニズムは、組
織標本、一次細胞培養および細胞系を含む様々なインビトロ系において試験され
てきた。これらの試験、および他の試験は、破傷風毒素およびボツリヌス毒素が
膜受容体に結合し、毒素のＬ鎖のサイトゾル作用が起こる前に吸収されてしまう
ことを証明している。破傷風毒素の結合およびトラフィッキングに関係するステ
ップは詳細には特徴付けられていないが、小胞再取り込み中のシナプス小胞の取
り込みを通しての吸収を含んでいると思われる。ニューロン組織への破傷風毒素
の結合は、インビボでのＨｃの逆行性輸送およびインビトロでのラット脳膜並び
に一次神経細胞および神経芽細胞腫細胞系に結合する能力によって証明されるよ
うに、Ｃ末端５０ｋＤａドメイン（フラグメントＣとしても知られている、Ｈｃ
ドメイン）を含んでいる。脊髄細胞に添加すると、ＶＡＭＰ−２開裂の阻害およ
び神経筋伝導の拮抗作用によって証明されるように破傷風毒素 Ｈｃフラグメン
トは破傷風毒素の取り込みをブロックしたが、これはＨｃの結合が機能的である
ことを示している。Ｈｃフラグメントだけはインビボで逆行性輸送を受ける能力
を保持するので、ＣＮＳへの異種タンパク質の担体として使用されている。

【０００９】 ガングリオシドへの破傷風毒素結合が最初に証明されて以降、多くの試験がイ
ンビトロおよびインビボアッセイを使用してガングリオシドへのクロストリジウ
ム神経毒素の結合を特性付けることを試みてきた。破傷風毒素および分離Ｈｃフ
ラグメントはどちらもガングリオシドＧＤ１ｂおよびＧＴ１ｂと結合するが、Ｇ
Ｍ１とは結合しないことは明確に証明されており、これは結合にはガングリオシ
ド内にポリシアル酸が必要であることを示している。細胞表面上にガングリオシ
ドが必要であることは、培養クロム親和細胞と破傷風毒素およびボツリヌス毒素
に対する感受性を増加させたＧＤ１ｂまたはＧＴ１ｂとののインキュベーション
によって証明された。ガングリオシド合成の阻害剤であるフモニシン（ｆｕｍｏ
ｎｉｓｉｎ）の存在下で増殖させた一次脊髄ニューロンの処理を含んでいた最近
の実験は、グリシン遊離およびＶＡＭＰ反応性の保持のカリウム誘発性刺激の遮
断の欠如によって証明されたように、フモニシン処理細胞が、破傷風毒素に対し
て非感受性になることを証明している。さらにその上、フモニシン処理細胞は外
生的ガングリオシドの添加後に破傷風毒素への感受性を再獲得した。しかし多く
の実験的証拠は、ガングリオシドが破傷風毒素およびボツリヌス毒素に対する単
独受容体であることに関しては一致していない。例えば、ボツリヌス毒素および
破傷風毒素はどちらもガングリオシドに結合するが、体内での作用部位は相違し
ており、ポリシアロガングリオシドは神経細胞組織上では独自には存在しておら
ず、さらにラット脳膜および神経細胞系への破傷風毒素結合は、プロテアーゼ感
受性を有する。そこで、毒素がガングリオシドおよびタンパク質受容体の両方と
相互作用することを惹起する二重受容体モデルが提案されてきた。このモデルを
支持して、シナプス小胞の内腔に局在するシナプトタグミンＩＩはボツリヌス毒
素セロタイプＢ、並びにセロタイプＡおよびＢに対するタンパク質受容体である
と同定されている。一次脊髄運動ニューロンおよびＮＧＦ（神経成長因子）分化
ＰＣ１２細胞を使用した架橋結合実験は、１５ｋＤａ糖タンパク質が破傷風毒素
に対する可能性あるニューロン受容体であると同定した（Ｈｅｒｒｅｒｏｓら、
Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、印刷中）。この受容体は破傷風毒素のＨｃ
ドメインのカルボキシル末端側にしか結合しない。

【００１０】 現在認可されているワクチンは、溶解破傷風菌細胞から入手された不活性化毒
素に基づいている。十分な毒素を入手するためには大量の細胞培養を必要とする
が、これは細胞残屑で汚染された毒素を生じさせる傾向がある。結果として生じ
た毒素は通常はホルムアルデヒドを用いた処理によって無毒化（トキソイド化）
されるが、グルタールアルデヒドを用いて無毒化することもできる。しかし、ど
ちらの処理も毒素を無害にはするが、毒素と細胞汚染物質との接合を導く可能性
があり、これはかわるかわる可能性のある有害な臨床反応をもたらす可能性があ
る。

【００１１】 破傷風毒素に対する構造遺伝子はクローニングかつシークケンスされており（
Ｆａｉｒｗｅａｔｈｅｒら、１９８６）、これは組み換え破傷風毒素の産生を可
能にした。破傷風毒素のフラグメントＣを基剤とする組み換えワクチンについて
は当分野において記載されている（例えば、ＷＯ−Ａ−９０１５８７１および欧
州特許第Ａ−２０９２８１号を参照）。しかし、そのようなワクチンはガングリ
オシド結合活性を保持している。ガングリオシド結合に免疫された個体における
毒性が関連しているという決定的証拠はないが、ガングリオシド結合活性が低下
した破傷風毒素ポリペプチドを入手することは望ましいであろう。

【００１２】 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現した欠失変異体を使用したＨｃフラグメ
ントのガングリオシド結合特性に関する試験は、ＨｃのＮ末端領域が欠けた一部
の変異体はまだガングリオシドおよび神経細胞に結合するが、カルボキシル末端
アミノ酸が欠けている変異体は結合することができないことを証明している。Ｈ
ａｌｐｅｒｎらによる試験（ＨａｌｐｅｒｎおよびＬｏｆｔｕｓ，１９９３）は
、ガングリオシドおよび神経細胞両方の結合におけるＨｃのカルボキシル末端の
１０個のアミノ酸（１３０６〜１３１５番目の残基）が重要な役割を果たすこと
を示唆した。ＨｃをＧＴ１ｂガングリオシド光親和性リガンドに結合させた試験
は、Ｈｃのカルボキシル末端の３４個のアミノ酸から構成されるペプチド（１２
８２−１３１５）内のＨｉｓ−１２９３の修飾を解明した（Ｓｈａｐｉｒｏら、
１９９７）。この結果は、標識されていないＧＴ１ｂガングリオシドを使用した
阻害試験と一緒に考察すると、ガングリオシドＧＴ１ｂへの結合に対してはＨｃ
の３４個のアミノ酸から構成されるペプチドが十分である可能性があることを示
唆した。

【００１３】 変異分子を大腸菌内で産生させ、精製し、ガングリオシド結合、細胞結合およ
びインビボ逆行性輸送検定においてアッセイした。我々の試験結果は、ガングリ
オシド結合のために必要な特定残基を同定し、さらにガングリオシド結合は低下
しているが一次神経細胞に結合して逆行性軸索輸送を受ける能力は保持している
一定の変異体を同定している。

【００１４】 （発明の要約） 我々は、近年報告された三次元構造によって提供される構造情報（Ｕｍｌａｎ
ｄら、１９９７）を使用して破傷風毒素の一連の特定部位変異体を作成した。変
異分子を大腸菌内で産生させ、精製し、ガングリオシド結合、細胞結合およびイ
ンビボ逆行性輸送アッセイにおいて検定した。我々の試験結果は、ガングリオシ
ド結合におけるＨｉｓ−１２９３についての役割を確証している。しかし我々は
さらにまた、その欠失変異がＨｉｓ−１２９３単独について入手される結果より
ガングリオシド結合における大きな低下を導く、ガングリオシドに結合するため
に必要な破傷風毒素フラグメントＣの他の領域を同定した。典型的には、これら
の領域はβシートの２つのセクションを結合するループ領域である。我々の試験
結果はさらにまた、ガングリオシド結合は低下しているが一次神経細胞に結合し
て逆行性軸索輸送を受ける能力は保持している一定の変異体を同定している。

【００１５】 従って、本発明は、破傷風毒素（ＴｅＮＴ）フラグメントＣまたはそれの免疫
原性フラグメントを含むポリペプチドであって、その破傷風毒素フラグメントＣ
またはそれの免疫原性フラグメントがループ領域において突然変異を含んでおり
、その突然変異が破傷風毒素フラグメントＣまたはそれの免疫原性フラグメント
のガングリオシドへの結合における低下を生じさせるポリペプチドを提供する。

【００１６】 本発明はさらにまた、破傷風毒素（ＴｅＮＴ）フラグメントＣまたはそれの免
疫原性フラグメントを含むポリペプチドであって、その破傷風毒素フラグメント
Ｃまたはそれの免疫原性フラグメントがループ領域において突然変異を含んでお
り、その突然変異が破傷風毒素フラグメントＣまたはそれの免疫原性フラグメン
トの一次運動ニューロン（ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎｅ）への結合の低下を生じさせ
るポリペプチドを提供する。

【００１７】 本発明はさらにまた、破傷風毒素（ＴｅＮＴ）フラグメントＣまたはそれの免
疫原性フラグメントを含むポリペプチドであって、その破傷風毒素フラグメント
Ｃまたはそれの免疫原性フラグメントがループ領域において突然変異を含んでお
り、その突然変異が破傷風毒素フラグメントＣまたはそれの免疫原性フラグメン
トの逆行性輸送の低下を生じさせるポリペプチドを提供する。

【００１８】 好ましくは、突然変異は破傷風毒素フラグメントＣ（またはそれの免疫原性フ
ラグメント）のガングリオシドへの結合の低下および一次運動ニューロンへの結
合の低下および／または逆行性輸送を受ける能力の低下を生じさせる。

【００１９】 好ましくは、前記ループ領域は２枚のβシート間の全長の野生型配列内に存在
する。より好ましくは、前記ループ領域は破傷風毒素フラグメントＣのアミノ酸
配列の１２１４〜１２１９番目および１２７１〜１２８２番目のアミノ酸残基か
ら選択される。

【００２０】 好ましくは、前記突然変異は少なくとも１つの欠失変異、より好ましくは破傷
風毒素フラグメントＣのアミノ酸配列のΔ１２１４〜１２１９、Δ１２７４〜１
２７９およびΔ１２７１〜１２８２から選択される少なくとも１つの欠失変異で
ある。

【００２１】 本発明はさらに、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供
する。

【００２２】 本発明はさらにまた、調節塩基配列に動作可能に連結された本発明のポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。好ましくは、調
節塩基配列は宿主細胞におけるポリペプチドの発現を可能にする。典型的には、
宿主細胞は細菌、または動物の、より好ましくは霊長類およびヒトを含む哺乳動
物の細胞である。

【００２３】 本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドおよびベクターは、Ｃｌｏｓｔｒｉ
ｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ（破傷風）感染症の予防（もしくはそれに対する感受性
の低下）またはそれに対する治療において使用することができる。従って、別の
態様では、本発明は製薬学的に容認可能な担体または希釈剤と一緒に、本発明の
ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはベクターを含む医薬組成物を提供する。

【００２４】 本発明はさらに、有効量の本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはベ
クターをヒトまたは動物に投与するステップを含むヒトまたは動物における破傷
風菌感染症を治療または予防する方法を提供する。

【００２５】 本発明はさらに、破傷風菌感染症の例えば予防（もしくはそれに対する感受性
の低下）または治療のような療法において使用するために本発明のポリペプチド
を提供する。さらに提供されるのは、破傷風菌感染症の予防（もしくはそれに対
する感受性の低下）または治療において使用するための薬剤の製造における本発
明のポリペプチドの使用である。

【００２６】 また別の態様では、本発明は破傷風毒素ポリペプチド内のエピトープを認識す
る抗体を産生するための方法において、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチ
ドまたはベクターの使用を提供する。例えば、本発明はその方法が哺乳動物に本
発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはベクターを投与するステップを含
む破傷風毒素ポリペプチド内のエピトープを認識する抗体を産生するための方法
を提供する。当分野において知られている様々な方法によって産生するそのよう
な抗体は、本発明の上記の方法によって産生した有効量の抗体をヒトまたは動物
に投与するステップを含むヒトまたは動物における破傷風菌感染症を治療または
予防する方法において使用することができる。

【００２７】 さらにまた別の態様では、本発明はその方法がポリペプチドの表面に露出する
ループ領域に存在する１個以上のアミノ酸残基を修飾するステップを含む破傷風
毒素フラグメントＣポリペプチドのガングリオシドへの結合親和性を低下させる
ための方法を提供する。さらに提供されるのは、前記方法によって産生するポリ
ペプチドである。

【００２８】 （発明の詳細な説明） 一般にここで言及する技法は当分野においてよく知られているが、特にＳａｍ
ｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８９）およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒ
ｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５），Ｊ
ｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓを参照することができる。

【００２９】 Ａ．破傷風毒素ポリペプチド 破傷風毒素に対する構造遺伝子はクローニングおよびシークエンシングされて
いる（Ｆａｉｒｗｅａｔｈｅｒら、１９８６；Ｅｉｓｅｌら、１９８６（データ
ベース受入番号Ｎｏ．ＢＴＣＬＴＮおよびｇ６９６４７））。アミノ酸配列は引
用されている。フラグメントＣはパパイン開裂によって生成される５０ｋＤａポ
リペプチドであり、Ｃ末端に４５１個のアミノ酸を含む、または実質的に相当す
る。用語「フラグメントＣ」および「Ｈｃ」はここでは置き換え可能に使用され
ている。下記の説明ではここで説明する破傷風毒素の配列に基づいてナンバーリ
ングされたアミノ酸を採用しているが、本発明は他の菌株の破傷風菌（わずかに
相違するアミノ酸ナンバリングを有する可能性がある）において所見されるフラ
グメントＣ変異株についても同等に適用できると理解されなければならない。

【００３０】 本発明のポリペプチドは、ガングリオシドへ結合する力、および／または一次
運動ニューロンへ結合する力、および／または逆行性輸送を受ける力を低下させ
るために修飾されている破傷風毒素フラグメントＣまたはそれの免疫原性フラグ
メントを含む。特に、本発明のポリペプチドは２つのβシート間で所見されるル
ープ領域に突然変異を含む。破傷風毒素フラグメントＣの３Ｄ（三次元）構造は
Ｕｍｌａｎｄら（１９９７）によって決定され、その構造座標は参照番号１ａｆ
９を付けてタンパク質データ銀行に寄託されている。Ｕｍｌａｎｄら（１９９７
）によって提示された構造情報（特に図１ａを参照）を使用すると、当業者であ
れば候補ループ領域を同定することができる。好ましくは、これらのループは分
子の表面上に露出している。これらはその後突然変異させ、例えば実施例に記載
した結合アッセイを使用してガングリオシド結合について試験することができる
。ガングリオシド結合に関係することが証明されているそのような２つのループ
は実施例の項に記載されている。第１ループはほぼ１２１４〜１２１９番目のア
ミノ酸から構成され、第２ループはほぼ１２７１〜１２８２番目のアミノ酸から
構成されている。

【００３１】 ループ領域における突然変異は、置換、挿入および／または欠失変異であって
もよい。好ましくは、突然変異は欠失変異、より好ましくは実質的に特定ループ
領域全部を除去する欠失変異である。アミノ酸配列を修飾する技法は、例えばＰ
ＣＲ特定突然変異誘発のように当分野においてよく知られている。

【００３２】 本発明の突然変異破傷風毒素ポリペプチドは、野生型破傷風毒素と比較して５
０％未満、より好ましくは４０、３０、２０または１０％未満、最も好ましくは
５％未満のガングリオシド結合活性を有することが好ましい。ガングリオシド結
合活性は、例えば実施例で説明するようにインビトロで測定することができる。

【００３３】 あるいはまた、または好ましくは付け加えて、本発明の突然変異の破傷風毒素
ポリペプチドは野生型破傷風毒素と比較して５０％未満、より好ましくは４０、
３０、２０または１０％未満、最も好ましくは５％未満の神経細胞結合活性を有
することが好ましい。神経細胞結合活性は、例えば実施例で説明するように測定
することができる。

【００３４】 さらに、本発明の突然変異ポリペプチドはそれらが由来する野生型配列（すな
わち、全長フラグメントＣ配列またはそれの免疫原性フラグメント）の少なくと
も５０％、より好ましくは少なくとも７０、８０または９０％の免疫原性を保持
することが好ましい。免疫原性は、典型的には例えばＥＬＩＳＡまたはウェスタ
ン・ブロッティング法のようなインビトロ技法の使用によって測定できる。ある
いはまた、または付け加えて、免疫原性は本発明のポリペプチドで動物を免疫し
、さらにその後ＥＬＩＳＡまたはウェスタン・ブロッティング法のどちらかによ
って、または引続いて活性毒素を用いて個体を攻撃免疫するステップによってイ
ンビボで測定することもできる。

【００３５】 特に好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドは、その破傷風毒素フラグ
メントＣまたはそれの免疫原性フラグメントが１２１４〜１２１９番目および／
または１２７１〜１２８２番目のアミノ酸残基に突然変異を含んでいる破傷風毒
素フラグメントＣまたはそれの免疫原性フラグメントを含む。特に、本発明のポ
リペプチドはその破傷風毒素フラグメントＣまたはそれの免疫原性フラグメント
が１２１４〜１２１９番目および／または１２７４〜１２７９番目のアミノ酸残
基、より好ましくは１２７１〜１２８２番目のの欠失変異を含んでいる破傷風毒
素フラグメントＣまたはそれの免疫原性フラグメントを含む。

【００３６】 また別の好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドは残基Ｈｉｓ−１２９
３での修飾、好ましくは例えばＨｉｓ→ＡｌａまたはＨｉｓ→Ｓｅｒのような置
換を含む。

【００３７】 エピトープを含む破傷風毒素フラグメントＣのフラグメントもまた本発明のポ
リペプチドにおいて使用することができる。これらのフラグメントは、少なくと
も５もしくは６個のアミノ酸、好ましくは少なくとも１０個のアミノ酸、より好
ましくは少なくとも１５、２０、２５、５０もしくは１００個のアミノ酸を含む
であろう。特に好ましいフラグメントは、優れたＢ細胞エピトープである約９４
３〜１０２３番目のアミノ酸、および優れたＴ細胞エピトープである約９４６〜
９６６番目のアミノ酸を含む。すべてのアミノ酸のナンバリングは全長である毒
素遺伝子に関連している。

【００３８】 破傷風毒素フラグメントＣのアミノ酸配列はさらに本発明のポリペプチドを提
供するように修飾することができる。例えば、これは本発明のポリペプチドの免
疫原性を増強させるために実施できる。アミノ酸置換は、修飾されたポリペプチ
ドがエピトープを保持していることを前提に、例えば１、２もしくは３から１０
、２０もしくは３０までの置換から作製できる。

【００３９】 同類置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｓｕｂｓｉｔｕｔｉｏｎ）は、例えば
下記の表に従って作製できる。

【００４０】 第２欄における同一ブロックおよび好ましくは第３欄における同一列のアミノ
酸は相互に置換することができる。

【００４１】

【表１】

【００４２】 本発明のポリペプチドはさらにまた、典型的にはＮ末端またはＣ末端、好まし
くはＮ末端に異種アミノ酸配列を含むことができる。異種配列（ｈｅｔｅｒｏｌ
ｏｇｏｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、細胞内または細胞外タンパク質ターゲティ
ングに影響を及ぼす配列（例えばリーダー配列）を含むことができる。異種配列
はさらに本発明のポリペプチドの免疫原性を増加させる、および／またはポリペ
プチドの同定、抽出および／または精製を容易にする配列を含むことができる。
特に好ましいまた別の異種配列は、好ましくはＮ末端である例えばポリヒスチジ
ンのようなポリアミノ酸配列である。少なくとも１０個のアミノ酸、好ましくは
少なくとも１７個のアミノ酸、しかし５０個未満のアミノ酸のポリヒスチジン配
列が特に好ましい。

【００４３】 その他の異種アミノ酸配列には、例えば細菌またはウイルスのような他の病原
体からの免疫原性配列が含まれる。その例には、病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）
、Ｎｅｉｓｅｒｒｉａ ｓｐ．（ナイセリア属）、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ（百
日咳菌）、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（クロストリジウム・ディフィシル）、Ｓａ
ｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐ．（サルモネラ属）、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓ
ｐ．（カンピロバクター属）、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ（熱帯熱マラリア原虫
）、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスおよびヒト乳頭腫ウイルスが含まれる
。好都合なことに、これらの免疫原性配列は中断させることが望ましいループ領
域（例えば、１２１４〜１２１９番目のアミノ酸）内に挿入することができる。

【００４４】 本発明のポリペプチドは、典型的には例えば下記で説明するような組み換え手
段によって作製する。しかし、ポリペプチドはさらにまた例えば固相合成法のよ
うな当業者によく知られている技法を使用する合成手段によって作製することも
できる。本発明のポリペプチドはさらにまた、例えば抽出および精製において役
立たせるために融合タンパク質として産生させることもできる。

【００４５】 融合タンパク質パートナーの例には、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ
（ＧＳＴ）、６ｘＨｉｓ、ＧＡＬ４（ＤＮＡ結合および／または転写活性化ドメ
イン）およびβ−ガラクトシダーゼが含まれる。さらに、例えばトロンビン開裂
部位のような融合タンパク質配列の除去を許容する融合タンパク質パートナーと
関心あるタンパク質配列（ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｉｎｔｅ
ｒｅｓｔ）との間のタンパク質分解性開裂部位を含むことも好都合な可能性があ
る。好ましくは、融合タンパク質は関心タンパク質配列の機能を妨害しないであ
ろう。

【００４６】 本発明のポリペプチドは実質的に孤立した形態であってよい。タンパク質をタ
ンパク質の予定の目的を妨害しない担体または希釈剤と混合することができ、そ
れでもまだ実質的に孤立した形態であると見なせることは理解されるであろう。
本発明のポリペプチドは、さらに実質的に精製された形態であってもよく、その
場合には調製物中のタンパク質の例えば概して９０％以上（９５％、９８％また
は９９％）が本発明のポリペプチドである調製物中にタンパク質を含むであろう
。

【００４７】 Ｂ．ポリヌクレオチドおよびベクター 本発明のポリヌクレオチドは本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を含
む。本発明のポリヌクレオチドはＤＮＡまたはＲＮＡを含むことができる。それ
らはさらに、それらの中に合成ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドを含むポリ
ヌクレオチドであってよい。オリゴヌクレオチドへの多数の様々なタイプの修飾
方法は当分野において知られている。これらには、メチルホスホネートおよびホ
スホロチオエート・バックボーン、分子の３’末端および／または５’末端での
アクリジン鎖またはポリリシン鎖の添加が含まれる。本発明の目的のためには、
ここで記載されたポリヌクレオチドは当分野において利用できるいずれかの方法
によって修飾することができる。そのような修飾は、本発明のポリヌクレオチド
のインビボ活性または寿命を高めるために実施することができる。

【００４８】 本発明の好ましいポリヌクレオチドは、さらにまた上記の本発明のポリペプチ
ドのいずれかをコードするポリヌクレオチドを含んでいる。当業者には、非常に
多数の異なるポリヌクレオチドが遺伝コードの縮重の結果として同一ポリペプチ
ドをコードできることは理解されるであろう。

【００４９】 本発明のポリヌクレオチドは組み換え複製可能ベクター内に組み込むことがで
きる。このベクターは適合する宿主細胞内で核酸を複製するために使用すること
ができる。従って、また別の実施形態では、本発明は本発明のポリヌクレオチド
を複製可能なベクター内に導入するステップ、そのベクターを適合する宿主細胞
内に導入するステップ、さらにその宿主細胞をベクターの複製を発生させる条件
下で増殖させるステップによって本発明のポリヌクレオチドを作製する方法を提
供する。このベクターは宿主細胞から回収することもできる。適切な宿主細胞に
は、例えば大腸菌のような細菌、酵母、哺乳動物細胞系および例えば昆虫Ｓｆ９
細胞のような他の真核細胞系が含まれる。

【００５０】 好ましくは、ベクター内の本発明のポリヌクレオチドは宿主細胞によって暗号
配列（ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の発現を提供できる調節配列に動作可
能に連結されている。つまり、ベクターは発現ベクターである。用語「動作可能
に連結されている」は、ここに記載されたコンポーネントがそれらの予定された
方法で機能することを許容する関係にある並列を意味する。暗号配列へ「動作可
能に連結されている」調節配列は、暗号配列の発現が制御配列と適合する条件下
で達成されるような方法で連結されている。

【００５１】 そのようなベクターは本発明のポリペプチドの発現を提供するために上記で説
明した適切な宿主細胞内に形質転換またはトランスフェクトすることができる。
このプロセスは、ポリペプチドをコードする暗号配列のベクターによる発現を提
供するための条件下で、上記のように発現ベクターを用いて形質転換された宿主
細胞を培養する、および任意で発現されたポリペプチドを回収するステップを含
むことができる。

【００５２】 これらのベクターは、例えば、複製の起源、任意で前記ポリヌクレオチドの発
現のためのプロモーターおよび任意でプロモーターの調節因子を用いて提供され
るプラスミドまたはウイルスベクターであってよい。これらのベクターは、１個
以上の選択可能なマーカー遺伝子、例えば、細菌プラスミドの場合は、アンピシ
リン耐性遺伝子または哺乳動物ベクターについてはネオマイシン耐性遺伝子を含
有することができる。ベクターは、例えばＲＮＡの産生のためにインビトロで使
用でき、または宿主細胞をトランスフェクトもしくは形質転換するために使用で
きる。このベクターは、さらに例えば、遺伝子療法においてインビボで使用する
ために適合させることもできる。

【００５３】 プロモーター／エンハンサーおよびその他の発現調節シグナルはそれに対して
発現ベクターが設計されている宿主細胞と適合性であるように選択できる。例え
ば、原核生物プロモーター、特に大腸菌株（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）
ＨＢ１０１）において使用するために適切なプロモーターを使用できる。本発明
の特に好ましい実施形態においては、ｈｔｒＡまたはｎｉｒＢプロモーターを使
用できる。本発明のポリペプチドの発現がインビトロまたはインビボのどちらか
の哺乳動物細胞内で実施される場合は、哺乳動物プロモーターを使用できる。組
織特異的プロモーターもまた使用できる。例えば、モロニーマウス白血病ウイル
ス末端反復配列（ＭＭＬＶ ＬＴＲ）、プロモーターラウス肉腫ウイルス（ＲＳ
Ｖ）ＬＴＲプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（
ＣＭＶ）ＩＥプロモーター、単純ヘルペスウイルスプロモーターまたはアデノウ
イルスプロモーターのようなウイルスプロモーターもまた使用できる。これらの
プロモーターはすべてが当分野において容易に入手できる。

【００５４】 Ｃ．宿主細胞 本発明のベクターおよびポリヌクレオチドは、ベクター／ポリヌクレオチドを
複製するためおよび／または本発明のポリヌクレオチドによってコードされた本
発明のポリペプチドを発現するために宿主細胞内に導入することができる。適切
な宿主細胞には、例えば、大腸菌および枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のよう
な真性細菌のような原核細胞、および例えば酵母、昆虫または哺乳動物細胞のよ
うな真核細胞が含まれる。

【００５５】 本発明のベクター／ポリヌクレオチドは、トランスフェクション、形質転換お
よび電気泳動法のような当分野において知られている様々な技法を使用して適切
な宿主細胞内に導入することができる。本発明のベクター／ポリヌクレオチドを
動物に投与しなければならない場合は、例えばレトロウイルス類、単純ヘルペス
ウイルスおよびアデノウイルスのような組み換えウイルスベクターを用いての感
染、核酸の直接注射およびバイオリスティック形質転換のような数種の技法が当
分野において知られている。

【００５６】 Ｄ．タンパク質の発現および精製 本発明のポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチドを発
現させるために使用できる。宿主細胞は、本発明のタンパク質の発現を許容する
適切な条件下で培養できる。本発明のポリペプチドの発現は、それらが連続的に
産生されるような構成要素でもいいし、または発現を開始させるための刺激に対
する誘導性であってもよい。誘導性発現の場合は、タンパク質産生は、例えば培
地に対して、例えばデキサメタゾンまたはＩＰＴＧのような誘導物質を添加する
ことによって必要とされたときに開始される。破傷風毒素フラグメントＣポリペ
プチドを産生するための適切な方法はＷＯ−Ａ−９０１５８７１号および欧州特
許第Ａ−２０９２８１号に記載されている。

【００５７】 本発明のポリペプチドは、酵素、化学および／または浸透圧溶解および物理的
破壊を含む当分野において知られている様々な技法によって宿主細胞から抽出で
きる。

【００５８】 ポリペプチドの精製は、任意選択的に例えばイムノアフィニティクロマトグラ
フィー、イオン交換クロマトグラフィー等を含むアフィニティクロマトグラフィ
ーのようなよく知られている技法を使用して実施できる。特に好ましい技法は、
本発明のポリペプチドをポリヒスチジン標識（例、６ｘＨｉｓ）を有する融合タ
ンパク質として発現させ、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して
細胞抽出液を精製することである。融合タンパク質配列に基づく様々な他の類似
のアフィニティクロマトグラフィーシステムは当分野において知られている。

【００５９】 本発明のポリペプチドは、さらにまた例えばＴｎＴ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅ
ｇａ）ウサギ網状赤血球系のようなインビトロ無細胞系中で、組み換え的に産生
させることもできる。

【００６０】 Ｅ．投与 本発明のポリペプチドは、直接注射によって投与できる。好ましくは、これら
のポリペプチドは、ヒトまたは獣医学的に使用することのできる医薬組成物を製
造するために、製薬学的に容認可能な担体または希釈剤と結合される。適切な担
体および希釈剤には、例えばリン酸緩衝生理食塩液のような等張生理食塩液が含
まれる。組成物は非経口、筋肉内、静脈内、皮下、眼内または経皮的投与用に調
製されてよい。典型的には、各ポリペプチドは、０．０１〜３０μｇ／ｋｇ（体
重）、好ましくは０．１〜１０μｇ／ｋｇ（体重）、より好ましくは０．１〜１
μｇ／ｋｇ（体重）の用量で投与される。さらにまた、下記のように破傷風菌感
染症を治療または予防する際に本発明のポリペプチドを使用して調製された抗体
を使用することもできる。中和抗体、または破傷風菌抗原に対する特異性を保持
しているそれらのフラグメント（断片）を本発明のポリペプチドに類似する方法
によって投与することができる。

【００６１】 本発明のポリヌクレオチドは、好ましくはさらに宿主細胞ゲノムに一致する隣
接配列（ｆｌａｎｋｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含む裸核酸構成体として直接
に投与することができる。発現カセットが裸核酸として投与される場合は、投与
される核酸の量は典型的には１μｇ〜１０ｍｇ、好ましくは１００μｇ〜１ｍｇ
の範囲内である。

【００６２】 哺乳動物細胞による裸核酸構成体の取り込みは、例えばトランスフェクション
剤を使用する数種の既知のトランスフェクション法によって増強される。これら
の物質の例には陽イオン物質（例、リン酸カルシウムおよびＤＥＡＥ−デキスト
ラン）およびリポフェクタント（例、リポフェクタム（登録商標）およびトラン
スフェクタム（登録商標））が含まれる。典型的には、核酸構成体は組成物を製
造するためにトランスフェクション剤と混合される。

【００６３】 特に好ましい実施形態では、本発明のヌクレオチドは、本発明のポリペプチド
が典型的には患者に経口投与された形質転換細菌株および生きている細菌によっ
て発現するように、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐ．の弱毒化菌株内に導入される
。

【００６４】 好ましくは、本発明のポリペプチドまたはベクターは、医薬組成物を製造する
ために製薬学的に容認可能な担体または希釈剤と結合される。適切な担体および
希釈剤には、例えば、リン酸緩衝生理食塩液のような等張生理食塩液が含まれる
。組成物は非経口、筋肉内、静脈内、皮下、眼内または経皮的な投与用に調製さ
れてよい。

【００６５】 ここで記載する投与経路および用量は、単なる指針であることが意図されてい
るが、それは熟練の当業者であれば特定の患者および条件に合わせて最適な投与
経路および用量を決定できるからである。

【００６６】 Ｆ．ワクチン類の調製 ワクチンは本発明の１種以上のポリペプチドから調製できる。１種以上の活性
成分として１種以上の免疫原性ポリペプチドを含有するワクチンの調製は当業者
には知られている。典型的には、そのようなワクチン類は、溶液または懸濁液の
どちらかとしての注射可能物質として調製する。注射前に液体中に溶解または懸
濁させるために適切な固形剤として調製することもできる。調製物をさらにまた
乳化したり、またはタンパク質をリポソーム内に被包化することもできる。免疫
原性活性成分はしばしば製薬学的に容認可能かつ活性成分と適合性がある賦形剤
と混合される。適切な賦形剤は、例えば水、生理食塩液、デキストロース、グリ
セロール、エタノール等およびそれらの組合せである。

【００６７】 さらに、所望の場合は、ワクチンには、例えば湿潤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝
剤、および／またはワクチンの有効性を増強するアジュバントのような少量の補
助物質を含めることができる。有効な可能性があるアジュバントの例には次のも
のが含まれるが、それらに限定されない。水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−
ムラミール−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−ア
セチル−ノル−ムラミルＬ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ１１６３７
、ｎｏｒ−ＭＤＰと呼ばれる）、Ｎ−アセチルムラミルＬ−アラニル−Ｄ−イソ
グルタミル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセ
ロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ１９８３５Ａ、
ＭＴＰ−ＰＥと呼ばれる）、および２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ（トゥイーン）
８０エマルジョン中に細菌から抽出された３種の構成要素であるモノホスホリル
脂質Ａ、トレハロースジミコレートおよび細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ
）を含有するＲＩＢＩ。

【００６８】 さらにアジュバントおよびその他の含有成分の例には、水酸化アルミニウム、
リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウム（ミョウバン）、硫酸ベリリウ
ム、シリカ、カオリン、炭素、油中水型エマルジョン、水中油型エマルジョン、
ムラミールジペプチド、細菌内毒素、脂質Ｘ、コリネバクテリウム・パルブム（
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）（瘡プロピオニバクテリウム
群）、百日咳菌、ポリリボヌクレオチド、アルギン酸ナトリウム、ラノリン、リ
ゾレシチン、ビタミンＡ、サポニン、リポソーム類、レバミゾール、ＤＥＡＥ−
デキストラン、ブロックコポリマー類またはその他の合成アジュバント。そのよ
うなアジュバントは、例えばメルク・アジュバント（Ｍｅｒｃｋ Ａｄｊｕｖａ
ｎｔ）６５（Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ製、ローウェー、ニュージャ
ージー州）またはフロイント不完全アジュバントおよび完全アジュバント（Ｄｉ
ｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製、デトロイト、ミシガン州）のような様々
な入手源から市販で入手できる。

【００６９】 典型的には、アンフィゲン（Ａｍｐｈｉｇｅｎ）（水中油型）、アルヒドロゲ
ル（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ）（水酸化アルミニウム）またはアンフィゲンとアル
ヒドロゲルの混合物のようなアジュバントを使用する。ヒトに使用するために承
認されているのは水酸化アルミニウムだけである。

【００７０】 免疫原とアジュバントの比率は、両方が有効量で存在する限りにおいて広範囲
に渡って変化させることができる。例えば、水酸化アルミニウムはワクチン混合
物の約０．５％の量で存在することができる（Ａｌ₂Ｏ₃基剤）。有益にも、ワク
チン類は０．２〜２００μｇ／ｍｌ、好ましくは５〜５０μｇ／ｍｌ、最も好ま
しくは１５μｇ／ｍｌの範囲内の最終濃度の免疫原を含有するように調製する。

【００７１】 調製後には、ワクチンを無菌容器に収容することができ、この容器はその後密
閉して例えば４℃のような低温で保管するが、または凍結乾燥してもよい。凍結
乾燥は安定化形での長期保存を許容する。

【００７２】 アジュバントの有効性は、さらに様々なアジュバントを含むワクチン内のこの
ポリペプチドの投与の結果として生じる破傷風毒素抗原配列を含有する免疫原性
ポリペプチドに対して向けられる抗体の量を測定することによって測定すること
ができる。

【００７３】 ワクチンは、従来通りに、例えば皮下または筋肉内のいずれかの注射によって
非経口投与する。他の投与様式のために適切な追加の調製物には座剤、および一
部の場合には経口調製物が含まれる。座剤については、伝統的結合剤および担体
には例えばポリアルキレングリコール類またはトリグリセリド類が含まれる。そ
のような座剤は０．５％〜１０％、好ましくは１％〜２％の範囲内で活性成分を
含有する混合物から形成することができる。経口調製物には、例えば製薬学的等
級のマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナ
トリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等のような通常使用される賦形剤が含
まれる。これらの組成物は溶液、懸濁液、錠剤、ピル剤、カプセル剤、徐放性調
製物または粉剤の剤形を取り、１０％〜９５％、好ましくは２５％〜７０％の活
性成分を含有する。ワクチン組成物を凍結乾燥する場合は、凍結乾燥物質は例え
ば懸濁液として、投与前に復元することができる。復元は、好ましくは緩衝剤中
で行う。

【００７４】 患者への経口投与用のカプセル剤、錠剤およびピル剤には、例えばユードラギ
ット（Ｅｕｄｒａｇｉｔ）「Ｓ」、ユードラギット「Ｌ」、酢酸セルロース、酢
酸フタル酸セルロースまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースを含む腸溶コ
ーティングを含むことができる。

【００７５】 本発明のポリペプチドは中性形または塩形としてワクチン内に調製することが
できる。製薬学的に容認可能な塩類には、酸添加塩（ペプチドの遊離アミノ基を
用いて形成されている）および例えば塩酸もしくはリン酸のような無機酸または
例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸およびマレイン酸のような有機酸を用いて形成さ
れている塩類が含まれる。遊離カルボキシル基と一緒に形成される塩類はまた例
えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウ
ムもしくは水酸化第二鉄のような無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメ
チルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジンおよびプロカインのよう
な有機塩基から引き出してもよい。

【００７６】 Ｇ．ワクチンの用量および投与 ワクチンは投与調製物と適合する方法で、および予防的および／または治療的
に有効であるような量で投与する。一般に１回の投与当たり抗原５μｇ〜２５０
μｇである投与する量は、治療する対象、抗体を合成する対象の免疫系の能力、
および所望の保護の程度に依存する。好ましい範囲は１回の投与当たり約２０μ
ｇ〜約４０μｇである。

【００７７】 適切な用量サイズは約０．５ｍｌである。従って、筋肉内注射のための用量は
、例えば、０．５％水酸化アルミニウムとの混合物中に２０μｇの免疫原を含有
する０．５ｍｌを含有むであろう。

【００７８】 投与するために必要な活性成分の正確な量は医師の判定に左右され、各対象に
対して固有である可能性がある。

【００７９】 ワクチンは単回投与スケジュールで、または好ましくは複数回投与スケジュー
ルで与えることができる。複数回投与スケジュールは、ワクチン摂取の一次経過
が１〜１０回の個別投与を用いて行われ、その後例えば第２回投与のために１〜
４ヵ月後に、および必要であればさらに数ヵ月後に免疫反応を維持および／また
は強化するために必要な引続いての時間間隔で投与される別の投与が行われるス
ケジュールである。用量レジメンは同様に、少なくとも一部には個体の必要によ
って決定され、医師の判定に依存するであろう。

【００８０】 さらに、１種以上の免疫原性破傷風毒素抗原を含有するワクチンは例えば免疫
グロブリン類のような他の免疫調節物質と結合して投与することができる。

【００８１】 Ｈ．本発明のポリペプチドに対する抗体の調製 上記のように調製された免疫原性ポリペプチドは、ポリクローナルおよびモノ
クローナル両方の抗体を製造するために使用できる。ポリクローナル抗体が所望
である場合は、１種以上の破傷風毒素エピトープを有する免疫原性ポリペプチド
を用いて選択した哺乳動物（例、マウス、ウサギ、ヒツジ、ウマ等）を免疫する
。免疫した動物からの血清を収集し、既知の手順に従って処理する。破傷風毒素
エピトープに対するポリクローナル抗体を含有する血清が他の抗原に対する抗体
を含有している場合は、ポリクローナル抗体はイムノアフィニティ・クロマトグ
ラフィーによって精製できる。ポリクローナル抗血清を産生およびプロセッシン
グするための技法は当分野において知られている。

【００８２】 本発明のポリペプチド中の破傷風毒素エピトープに対して向けられたモノクロ
ーナル抗体もまた当業者であれば容易に産生することができる。ハイブリドーマ
によってモノクローナル抗体を製造するための一般的方法はよく知られている。
不滅化抗体産生細胞系は細胞融合、または例えば発癌性ＤＮＡを用いてのＢリン
パ球の直接形質転換、またはエプスタインバーウイルスを用いてのトランスフェ
クションのような他の技法によって作製することができる。破傷風毒素エピトー
プに対して産生した一連のモノクローナル抗体は、例えばイソタイプおよびエピ
トープ親和性のような種々の特性についてスクリーニングすることができる。

【００８３】 また別の方法には、例えばファージが極めて様々な相補性決定領域（ＣＤＲｓ
）を伴ってそれらの被膜表面上でｓｃＦｖフラグメントを発現するファージ表示
ライブラリーをスクリーニングすることが含まれる。この技法は当分野において
よく知られている。

【００８４】 破傷風毒素エピトープに対して向けられているモノクローナルおよびポリクロ
ーナル両方の抗体は特に診断において有用であり、さらに中和抗体は受動免疫療
法において有用である。特にモノクローナル抗体は、抗イディオタイプ抗体を立
てるために使用することができる。抗イディオタイプ抗体は、それに対して保護
が所望される感染性物質の抗原の「内部イメージ」を有する免疫グロブリンであ
る。

【００８５】 抗イディオタイプ抗体を立てるための技法は当分野において知られている。こ
れらの抗イディオタイプ抗体はさらにまた破傷風菌の治療のため、並びに破傷風
菌抗原の免疫原性領域を解明するためにも有用な可能性がある。

【００８６】 本発明のために、用語「抗体」には、これと反対に特定されていない限り、標
的抗原に対する結合活性を保持している完全抗体のフラグメントが含まれる。そ
のようなフラグメントには、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）およびＦ（ａｂ’）₂フラグメ
ント、並びに一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）が含まれる。さらにその上、これらの抗体
およびそれらのフラグメントは例えば欧州特許第Ａ−２３９４００号に記載され
ているように人体適応化抗体であってよい。

【００８７】 下記の実施例を参照しながら本発明を説明するが、これらの実施例は説明を目
的としていて限定することは意図していない。実施例は図面に関連している。よ
り詳細には図面を参照されたい。

【００８８】 [実施例] 方法 [細菌株およびプラスミドの構造] 下記で説明するプラスミドに対する宿主として大腸菌菌株ＢＬ２１（λＤＥ３
，ｏｍｐＴ，ｈｓｄＳ_B（ｒ_B−ｍ_B−），ｇａｌ，ｄｃｍ）を使用した。プラス
ミドｐＫＳ１はＴ７プロモーターの制御下で破傷風毒素のＨｃフラグメントの発
現のためのコドン最適化遺伝子を含有する。これはテンプレートとしてのｐＴＥ
Ｔｔａｃ２１５（Ｍａｋｏｆｆら、１９８９）並びに遺伝子の５’および３’末
端で各々ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ部位を導入するオリゴヌクレオチド５’ＧＡ
ＧＣＡＴＡＴＧＡＡＡＡＡＣＣＴＴＧＡＴおよび５’ＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＴ
ＣＧＴＴＧＧＴＣＣＡを使用した１３５７ｂｐフラグメントのＰＣＲ増幅（Ｐｆ
ｕポリメラーゼ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ケンブリッジ、英国）によって作製し
た。プラスミドｐＪＣ６を形成するために、ベクターｐＣＲＳｃｒｉｐｔ（Ｓｔ
ｒａｔａｇｅｎｅ製）内へのＰＣＲ産物の鈍端ライゲーション（れんさはんのう
ｇ後に、Ｑｉａｅｘ ＩＩゲル精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、ウェストサセックス
、英国）を使用したアガロースゲル電気泳動法によってＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩフ
ラグメントを精製し、さらに事前にＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いて分解され
ていたｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ製、ケンブリッジ、英国）内にサブクロー
ニングした（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、イ
ーストサセックス、英国）。ＤＮＡ操作は標準手順によって実施した。

【００８９】 [突然変異およびＤＮＡシークエンシング] 突然変異はクイックチェンジ（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ）（登録商標）特定部位
突然変異キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）を使用して実施した。突然変異Ｈｃ
分子を作成するためには、対の相補的オリゴヌクレオチドを使用した（表１）。
単一アミノ酸突然変異を含有する変異体（Ｍ１５、Ｍ２４、Ｍ６６７、Ｍ５６４
およびＭ５７）を作製するために、テンプレートＤＮＡとしてのｐＫＳ１ととも
に下記のサイクルを使用した。ステップ１は９５℃で３０秒、ステップ２は９５
℃で３０秒、ステップ３は５５℃で１分、ステップ４は６８℃で１２分。ステッ
プ２〜４を１２サイクル繰り返した。

【００９０】

【表２】

【００９１】 欠失変異（Ｍ５、Ｍ１３、Ｍ１８およびＭ５８）を含有する分子を作成するた
めには、下記のサイクルにおいてテンプレートＤＮＡとしてのｐＫＳ１と一緒に
より長い伸長時間を使用した。ステップ１は９５℃で３０秒、ステップ２は９５
℃、３０秒、ステップ３：５５℃、１分、ステップ４：６８℃、１８分。ステッ
プ２〜４を１８サイクル繰り返した。変異体Ｍ３７および二重変異体Ｍ４０を作
成するためには、テンプレートとしてＭ２８突然変異ＤＮＡを使用する以外は同
一のサイクル条件を使用した。

【００９２】 [ＤＮＡシークエンシング] ＨｃをコードするｐＫＳ１の全インサートおよび変化した領域における全変異
体のＤＮＡ配列を自動化ＤＮＡシークエンシングによって決定した。

【００９３】 [組換えＨｉｓ標識タンパク質の精製] ２５０ｍｌのカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢブロスにｐＫＳ
１を含有する大腸菌 ＢＬ２１細胞のオーバーナイト培養５ｍｌまたは突然変異
Ｈｃ遺伝子をコードする誘導体を接種した。ＯＤ₆₅₀＝０．８で、野生型または
突然変異Ｈｃタンパク質の発現を最終濃度１ｍＭまでのイソプロピル−β―ガラ
クトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加によって誘発した。３７℃での培養を３．５
時間継続し、その後４，０００ｇ、１５分間の遠心分離によって細胞を回収した
。細胞ペレットを冷凍して−２０℃で保存した。Ｈｉｓ標識タンパク質を精製す
るために、細胞ペレットはリゾチーム（１ｍｇ／ｍｌ）（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）および１０ｍＭ イミダゾール（Ｓｉ
ｇｍａ、ドーセット、英国）を含有する１０ｍｌの緩衝液Ａ（３００ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、５０ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄、ｐＨ８．０）中に再懸濁させた。

【００９４】 ５５０Ｗ超音波処理機（Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ ＸＬ２
０２０、Ｈｅａｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ製、ニューヨーク、米国）を使用して細胞を
１５秒のオン、１５秒のオフのパルスで４．５分間、フラットなチッププローブ
を用いて氷上で超音波分解した。１３，０００ｇ、２０分間の遠心分離後、５０
０μｌのＮｉ−ＮＴＡアガロース樹脂を添加し、その混合物を４℃で１６時間回
転させながら培養した。その後その樹脂を２００ｇで遠心分離し、２０ｍＭイミ
ダゾールを含有する１０ｍｌの緩衝液Ａ中に再懸濁させた。遠心分離および再懸
濁は２度繰り返した。その樹脂を５ｍｌの緩衝液Ａ中に再懸濁させ、ディスポー
ザブルのプラスチック製カラム（Ｂｉｏｒａｄ製、ハーツ、英国）内に注入し、
液体を排出させた。溶出緩衝液（２５０ｍＭイミダゾールを含有する緩衝液Ａ）
の適用によってＨｉｓ標識タンパク質を溶出した。溶出分画のタンパク質濃度は
ＯＤ₂₈₀での測定によってモニタリングした。ピーク分画をプールし、緩衝液Ａ
中で透析し、Ｍｉｃｒｏ ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ製、チェス
ター、英国）を使用してタンパク質濃度を測定した。細菌培養１リットル当たり
２０〜３２ｍｇの精製タンパク質を入手した。

【００９５】 [Ｈｃタンパク質のビオチン化] Ｈｃタンパク質のビオチン化はＥＺ−Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−
ビオチン化キット（Ｐｉｅｒｃｅ製）を使用して実施した。

【００９６】 [インビトロでのガングリオシド結合] （ｉ）直接結合アッセイ タンパク質のガングリオシドへの直接結合は次のように測定した。５０μｌの
メタノール中の１０μｇ／ｍｌウシのガングリオシドＧＴ１_b（Ｓｉｇｍａ製、
ドーセット、英国）をＥＬＩＳＡプレート（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ
ｓ製、ペーズリー、英国）に塗り広げ、一晩乾燥するに任せた。０．０５％Ｔｗ
ｅｅｎ ２０を含有するリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）（ＰＢＳ／Ｔ）中で３分ず
つ２回洗浄した後、１００μｌのブロッキング液（３％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ製）
を含有するＰＢＳ）を添加し、さらにプレートを３７℃で１時間ブロックした。
その後の全インキュベーションは５０μｌの用量で３７℃で行い、全洗浄はＰＢ
Ｓ／Ｔ中で３分間行い、３回繰り返した。タンパク質並びに一次抗体および二次
抗体は３％ＢＳＡを含有するＰＢＳ／Ｔ中に希釈させた（ＰＢＳ／ＴＢ）。

【００９７】 ブロッキングおよび洗浄後、プレートは１０μｇ／ｍｌ（タンパク質）の初期
濃度から開始して野生型Ｈｉｓ標識ＨＣまたは突然変異Ｈｉｓ標識Ｈｃの二重希
釈を行いながら２時間インキュベートした。洗浄後、１：１０００で希釈したウ
サギポリクローナル抗Ｈｃ抗体（Ｆａｉｒｗｅａｔｈｅｒら、１９８６）を１時
間添加した。洗浄後、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼに接合させたヒツ
ジ抗ウサギ抗体を二次抗体として添加した。プレートはｏ−フェニレンジアミン
ジヒドロクロリド（Ｓｉｇｍａ製）を用いて展開させた。これらのプレートはＣ
ｅｒｅｓ ９００ Ｈｄｉ ＥＬＩＳＡリーダー（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒ
ｕｍｅｎｔｓ製）において４９０ｎｍで読み取った。各データポイントは、タン
パク質を添加せずに入手された平均値を減じた後の２回ずつの測定値の平均値を
表している。突然変異のタンパク質のＧＴ１ｂ結合活性（表２）は野生型Ｈｃタ
ンパク質の結合の百分率として表されており、野生型Ｈｃタンパク質の半最高結
合（ｈａｌｆ ｍａｘｉｍａｌ ｂｉｎｄｉｎｇ）を表す４９０ｎｍで１．５の
光学密度を生じさせるために必要なタンパク質濃度から計算した。

【００９８】 非特異的結合の陰性対照には、細胞とＨｃタンパク質または一次抗体のどちら
かを除く全試薬とのインキュベーションが含まれた。

【００９９】 （ｉｉ）競合アッセイ 直接結合アッセイの変形を下記のように実施した。ガングリオシドによるプレ
ートの塗布およびブロッキングは直接アッセイと同様であり、すべてのその後の
インキュベーションは５０μｌ用量で３７℃で実施した。全洗浄はＰＢＳ／Ｔ中
で３分間であり、これを３回繰り返した。タンパク質および二次抗体はＰＢＳ／
ＴＢ中で希釈した。容量２５μｌ中で３４０μｇ／ｍｌの濃度の一定量のビオチ
ン化Ｈｉｓ標識Ｈｃ（上記で説明した通りに調製する）を２５μｌの試験タンパ
ク質と濃度を低下させながら（最高濃度５００μｇ／ｍｌ）混合した。５０μｌ
のビオチン化Ｈｃ／未標識タンパク質の混合液をガングリオシド被覆プレートに
添加し、プレートを２時間インキュベートした。プレートを再度洗浄し、ストレ
プタビジン−ＨＲＰ（Ｄａｋｏ製）と一緒にインキュベートし、１時間に渡り１
：５００に希釈した。洗浄後、ｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロリド（ＯＰ
Ｄ、Ｓｉｇｍａ製）を用いてプレートを展開し、ＥＬＩＳＡプレートリーダーで
４９０ｎｍで読み取った。

【０１００】 [Ｎ１８細胞への変異体の結合] Ｎ１８ ＲＥ−１０５細胞（ＥＣＡＣＣ番号８８１１２３０１）を、４ｍＭグ
ルタミン（Ｓｉｇｍａ製）、１０％ＦＢＳおよび１００μペニシリン、１００μ
ｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を補充
したＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）中で培養した。間接免
疫蛍光検査で使用する１日前に、０．５ｍｌ中の３×１０⁴の細胞を５μｇ／ｍ
ｌポリ−Ｌ−リシンを用いて一晩かけて前処理した８ウエルＬａｂＴｅｋ仕切り
付きスライド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）の各ウエル内で前もっ
て処理した。その後の全インキュベーションは４℃で実施した。全洗浄は０．１
％ＢＳＡを含有する４℃のＰＢＳ（ＰＢＳ／Ｂ）中で行い、３分間ずつ３回繰り
返した。細胞は野生型または突然変異タンパク質（５μｇ／ｍｌ）と一緒に２時
間インキュベートした。洗浄後、細胞を５％標準ブタ血清を含有するＰＢＳ／Ｂ
中で３０分間インキュベートし、その後ウサギポリクローナル抗Ｈｃ抗体と一緒
に３０分間インキュベートし、５％標準ブタ血清を含有するＰＢＳ／Ｂ中で１：
５００で希釈した。細胞を再び洗浄し、ＰＢＳ／Ｂ中で１：５００で希釈したＦ
ＩＴＣ複合ヒツジ抗ウサギ血清（Ｄａｋｏ製）と一緒に１時間インキュベートし
た。洗浄後、細胞をグリセロール／ＰＢＳ（Ｃｉｔｉｆｌｕｏｒ、Ａｇａｒ Ｓ
ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製、ハーロー、英国）中の抗衰弱剤上に載せ、Ｚｅｉｓｓ
５１０共焦点顕微鏡を用いた蛍光顕微鏡検査によって可視化した。

【０１０１】 [ラット脊髄運動ニューロンの精製] ラット脊髄運動ニューロンは、以前に説明したようにＥ１４ラット胎仔から精
製した。要約すると、腹側脊髄を切開し、０．０２５％トリプシン（ＧＩＢＣＯ
−ＢＲＬ、米国）を用いて３７℃で１０分間解離させ、粉砕した。ＢＳＡクッシ
ョン、およびその後メトリザミド密度勾配を通して細胞を遠心分離した。ＢＳＡ
クッションを通して間期細胞およびペレット細胞を収集し、０．５％ＢＳＡを含
む５０μｌのリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）にＥ１４でラット運動ニューロン
によって特異的に発現するｐ７５低親和性神経成長因子（ＮＧｆ）受容体を認識
する５０μｌのマウス抗ラットｐ７５ハイブリドーマ上清を加えた中に再懸濁さ
せた。細胞をｐ７５ハイブリドーマ上清と一緒に１２℃で１５分間インキュベー
トし、ＰＢＳ−ＢＳＡを用いて洗浄し、ＢＳＡクッションを通して遠心分離した
。ペレットを８０μｌのＰＢＳ−ＢＳＡ中に再懸濁させ、２０μｌのヒツジ抗マ
ウスＩｇＧ磁気マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、ベルギッシ
ュグラートバッハ、ドイツ）と一緒に１２℃で１５分間インキュベートした。Ｂ
ＳＡクッションを通してのもう１回の遠心分離後、細胞を５００μｌのＰＢＳ−
ＢＳＡ中に再懸濁させ、Ｍｉｎｉ Ｍａｃｓマグネットおよび大型細胞分離カラ
ム（Ｍｉｌｅｔｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ製）を使用して磁気セルソーティングによ
って精製した。精製した運動ニューロンをポリオルニチンおよびラミニン（Ｓｉ
ｇｍａ製、英国）が塗り広げられたカバーガラス上に４０，０００ｃｅｌｌｓ／
カバーガラスの密度で播種した。培養をＢ２７サプリメント（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲ
Ｌ製、米国）、２％ウマ血清、０．５ｍＭ Ｌ−グルタミン、２５μＭ ２−メ
ルカプトエタノール（Ｆｌｕｋａ製、英国）、１０ｎｇ／ｍｌのラット毛様体神
経栄養因子および１００ｐｇ／ｍｌのラットグリア細胞系由来神経栄養因子（ど
ちらもＲ ＆ Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ製、米国）を含有するＮｅｕｒｏｂａｓａｌ
培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ製、米国）中
の３７℃で加湿した７．５％ＣＯ₂インキュベーター内で保持した。最初の４日
間の培養では、培地にＬ−グルタミン酸塩（２５μＭ）を添加した。

【０１０２】 [野生型および突然変異Ｈｃタンパク質の一次運動ニューロンへの結合] カバーガラス上の細胞を４℃へ１５分間冷却し、その後ハンクス液（２０ｍＭ
Ｈｅｐｅｓ−Ｎａ、ｐＨ７．４、０．４４ｍＭ ＫＨ₂ＰＯ₄、０．４２ｍＭ
ＮＡ₂ＨＰＯ₄、５．３６ｍＭ ＫＣｌ、１１３６ｍＭ ＮａＣｌ、０．８１ｍＭ
ＭｇＳＯ₄、１．２６ｍＭ ＣａＣｌ₂、６．１ｍＭグルコース）を用いて洗浄
し、さらに４℃で１時間Ｈａｎｋｓ／０．１％ＢＳＡ中で濃度５μｇ／ｍｌでの
野生型または突然変異Ｈｃとのインキュベーションを実施した。ハンクス液を用
いての２回の洗浄後、細胞を室温で１５分間、ＰＢＳに溶解した３．７％パラホ
ルムアルデヒド中で固定した。ＰＢＳを用いて２回洗浄した後、細胞をＰＢＳ中
の５０ｍＭ ＮＨ₄Ｃｌと一緒に２０分間インキュベートし、ＰＢＳを用いて再
び２回洗浄し、２％ＢＳＡ、０．２５％ブタ皮膚ゼラチン、０．２％グリシン、
１０％ウシ胎仔血清を用いて１時間ブロックした。細胞をＰＢＳ中で２回洗浄し
、１％ＢＳＡ、０．２５％ゼラチンを含有するＰＢＳ中で１：５００に希釈した
ウサギ抗Ｈｃポリクローナル抗血清と一緒に１時間インキュベートした。さらに
ＰＢＳを用いて２時間洗浄した後、細胞をＰＢＳ中に１：１０００で希釈したＦ
ＩＴＣ接合ブタ抗ウサギ血清（Ｄａｋｏ）を用いて３０分間インキュベートした
。ＰＢＳを用いての４回の洗浄後、Ｍｏｗｉｏｌ ４−８８（Ｈａｒｃｏ製）の
スライド上にカバーガラスを載せ、４℃で保管し、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ５１０共
焦点顕微鏡を使用して蛍光検査によって解析した。

【０１０３】 [野生型および突然変異Ｈｃタンパク質の逆行性輸送] １０週齢のＢ６Ｄ２Ｆ１マウスをハーラン−オーラック（Ｈａｒｌａｎ−Ｏｌ
ａｃ）から入手し、２：１の比率でベタラー（Ｖｅｔａｌａｒ）（１００ｍｇ／
ｍｌ）およびＲｏｍｐｕｎ（ロンプン）（２０ｍｇ／ｍｌ）を筋肉内注射するこ
とによって麻酔をかけた。全身麻酔下で、１群３匹ずつのマウスの下に３３ゲー
ジ注射針を備えた２５μｌハミルトン型シリンジを使用して２２μｌのＰＢＳま
たは７０〜８５μｇのタンパク質を含有するＰＢＳを注射した。全動物は直ちに
回復し、注射されたタンパク質が脳幹へ輸送させるように２４時間放置した。深
い麻酔下で、ＰＢＳ、およびその後にＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドを用
いた経心的潅流（ｔｒａｎｓｃａｒｄｉａｃ ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）によってマ
ウスを致死させた。脳を切開し、４％ホルムアルデヒド中で少なくとも１時間死
後固定した後、４℃の１５％スクロース／ＰＢＳ中へ移して少なくとも１６時間
放置した。実験１（図６、パネルａ−ｃ）では、脳をＴｉｓｓｕｅ−Ｔｅｄに載
せクリオスタットを使用して２０μｍスライスに切片作製した。実験２（図６、
パネルｄ−ｈ）では、脳を切片作製前に液体窒素中で凍結した。

【０１０４】 [舌下神経核における野生型および突然変異Ｈｃの免疫染色] ポリ−Ｌ−リシン（Ｓｉｇｍａ製）を事前に塗り広げたスライド上に切片を収
集した。引続いての全洗浄はＰＢＳ中で５分間かけて行い、３回繰り返した。ワ
ックスペンを用いて輪切り後、切片を洗浄した。ＰＢＳ／５％標準ブタ血清（Ｄ
ａｋｏ製）を用いて３０分間ブロックした後、切片を１：５００に希釈したウサ
ギ抗Ｈｃポリクローナル抗体を含有するＰＢＳ／１％ＢＳＡ／０．１％Ｔｒｉｔ
ｏｎＸ−１００と一緒に２時間インキュベートした。洗浄後、切片をＰＢＳ中で
１：５００に希釈したビオチン化ブタ抗ウサギ抗体（Ｄａｋｏ製）と一緒に２時
間インキュベートした。再び洗浄した後、切片をＰＢＳ中で１：５００に希釈し
たペルオキシダーゼ接合アビジンと一緒に２時間インキュベートした。切片を洗
浄し、０．０４％ＮｉＣｌ₂および０．０１％Ｈ₂Ｏ₂を含むＰＢＳ中のジアミノ
ベンジジン（０．０５％）を用いて展開させた。切片を蒸留水中で洗浄し、１％
ニュートラルレッドを用いて対比染色し、脱水して、スライド上に載せた。顕微
鏡写真を撮影する前に、スライドを−５０℃で保存した。

【０１０５】 [実施例１ ガングリオシド結合におけるＨｃのＮおよびＣ末端が果たす役割] Ｈｃフラグメント破傷風毒素の三次元構造に関する検討（Ｕｍｌａｎｄら、１
９９７）は、単一鎖によって連結されているＮ−末端ゼリーロールドメインとＣ
−末端βトレフォイルドメインの２つのドメインを解明している（図１）。これ
らのドメインは各々その大部分が分子から突き出たループによって結合されたβ
シートから構成されている。

【０１０６】 我々は以前に実施した研究で多数のｍａｌＥ−Ｈｃ融合タンパク質の神経細胞
結合を解析した。破傷風毒素（Ｋ８６５−Ｄ１３１５）およびＭ３３８（Ｎ９４
４−Ｄ１３１５）の全Ｈｃドメインを含有するタンパク質Ｍ１４５３は一次後根
神経節細胞へ強く結合するが、他方このアッセイではＭ１３２１（Ｋ８６５−Ｈ
１２７１）は結合を表示しなかった。この試験では、Ｍ１４５３およびＭ３３８
がどちらも同等に良好にＧＴ１ｂガングリオシドに結合することが発見されたが
、他方Ｍ１３２１は検出可能な結合を有さなかった。これらの結果は、Ｍ３３８
には不在のＨｃの最初の８０個のアミノ末端残基がガングリオシドまたは細胞結
合にとって必須ではないが、他方Ｍ１３２１に不在のカルボキシル末端ドメイン
はこれらの活性のために必須であると思われることを確証している。

【０１０７】 ＨｃのＣ末端領域の欠失変異はＶ１３０６−Ｄ１３１５がガングリオシド結合
および神経細胞結合にとって重要であることを同定した。このペプチドはβトレ
フォイル構造内で始まり、このドメインおよびレクチン様ドメインを分割する裂
け目で終了する（図１）。さらに詳細にガングリオシドＧＴ１ｂ結合に含まれる
Ｈｃの領域を解析するために、一連の突然変異Ｈｃタンパク質をＨｉｓ標識融合
タンパク質として作成した（表２）。突然変異Ｈｉｓ標識タンパク質を大腸菌
ＢＬ２１中で発現させ、ニッケルアガロース・アフィニティクロマトグラフィ−
を使用して精製した。我々の最初の一連の変異体はＨｃのＣ末端領域において作
成した。１０個のＣ末端残基（Δ１３０６−１３１５）が欠けている変異体Ｍ５
は、野生型レベルの８０％でＧＴ１ｂ結合を表示したが、変異体Ｍ１３（Δ１３
１１−１３１５）は野生型Ｈｃから識別不能な結合レベルを有していた（表２）
。これらの１０個の残基内の個々のアミノ酸の役割を判定するために、単一アミ
ノ酸置換を含有する数種の変異体を作成し、ＧＴ１ｂガングリオシド結合を測定
した。これらの突然変異タンパク質Ｔ１３０８Ａ、Ｄ１３０９ＡおよびＥ１３１
０Ａはすべてが野生型ＨｃのＧＴ１ｂ結合活性の８０〜１００％を保持していた
（表２）。βトレフォイルドメイン内の多数の他の単一アミノ酸置換もまた作成
したが、すべての例においてタンパク質はＧＴ１ｂ結合活性の野生型レベルを有
することが発見された（データは示されていない）。

【０１０８】 [実施例２ 低いガングリオシド結合を表示するＨｃの変異体] ガングリオシドＧＴ１ｂ結合に関係するＨｃ分子の他の残基を同定するために
、我々はカルボキシル末端βトレフォイルドメイン内でβシートを結合するルー
プを含む領域を調査することを選択した。これらの領域は表面を露出しており、
細胞の表面上のリガンドと相互作用する可能性が高いと思われる。βトレフォイ
ルドメイン内の２つのβシートを結合するループの６個の残基Ｍ２８（ΔＱ１２
７４−Ｐ１２７９）または１２個の残基Ｍ３７（ΔＨ１２７１−１２８２）のい
ずれかが欠けた変異体を作成した（図１）。精製タンパク質をガングリオシドＧ
Ｔ１ｂ結合についてアッセイした。変異体Ｍ２８は野生型ＨｃフラグメントのＧ
Ｔ１ｂ結合活性の５．１９％しか保持していないが、他方変異体Ｍ３７は一層低
いレベルの結合を表示し、野生型Ｈｃフラグメントの活性の１．０６％しか有し
ていなかった（図２および表２）。つまり、６個の残基の欠失変異は野生型ガン
グリオシド結合の５％において生じ、１２個の残基の欠失変異は野生型結合の１
％においてしか生じなかった。

【０１０９】 第２の表面露出ループはβトレフォイルドメイン内の２つのβシートを結合し
ているＤ１２１４−Ｎ１２１９の領域で同定された。変異体Ｍ５８（ΔＤ１２１
４−Ｎ１２１９）は、野生型Ｈｃフラグメントの０．６％のレベルで実質的に低
下したガングリオシドＧＴ１ｂ結合を示した（図２および表２）。

【０１１０】

【表３】

【０１１１】 これらの結果は、方法の項に記載した競合アッセイを使用して確証された。従
って、我々の試験結果は破傷風毒素 Ｈｃ分子においてβシートを結合する２つ
のループのいずれか一方における欠失変異がガングリオシドへ結合する分子の能
力を劇的に低下させることを証明している。

【０１１２】 誘導ガングリオシドを用いての破傷風毒素の光親和性標識付けはＨｉｓ−１２
９３がガングリオシド結合に関与していることを証明した。我々は結合において
この残基が果たす役割をセリンおよびアラニン両方への突然変異によって試験し
た。これらの変異体はどちらも結合を低下させたので（野生型のそれぞれが４３
％へおよび１５％へ）、これは結合におけるＨｉｓ−１２９３の重要性を確証し
ている。Ｈｉｓ−１２９３は我々がここでやはり結合に関与していることを証明
したＨｉｓ−１２７１〜ＡＳＰ−１２７２に空間的に近い。Ｈｉｓ−１２９３→
ＳｅｒおよびΔＨｉｓ−１２７１からＡｓｐ−１２８２を含む二重変異体を作成
し、顕著に低い結合を示すことが発見された（野生型レベルの４．２％）（表２
および図２参照）。

【０１１３】 我々はさらにまた変異体Ｈｃタンパク質がＮ１８神経細胞へ結合する能力につ
いても調査した（方法の項を参照）。

【０１１４】 [実施例３ 一次運動ニューロンへの結合はヒスチジン１２９３変異体によっ
て維持されるが、ループ変異体では低下する。]

【０１１５】 突然変異Ｈｃタンパク質のガングリオシド結合活性が神経細胞への結合と関連
しているかどうかを判定するために、我々は一次ラット脊髄運動ニューロンへの
結合を試験した。結合は、ポリクローナル抗Ｈｃ抗体および蛍光標識二次抗体を
使用して可視化した。野生型Ｈｃおよび変異Ｍ５（ΔＶ１３０６−Ｄ１３１５）
タンパク質はどちらも一次脊髄運動ニューロンに強力に結合することが証明され
た。これらの結果は、Ｈｃのカルボキシル末端の１０個の残基が神経細胞への結
合にとって不可欠ではないことを示唆している。これとは対照的に、ループ突然
変異Ｍ５８（ΔＤ１２１４−Ｎ１２１９）が脊髄運動ニューロンへ結合する能力
は、一次運動ニューロンの非常に弱い染色によって可視化されたように非常に大
きく低下した。第２ループにおいて試験した１２個のアミノ酸欠失を含有する変
異体Ｍ３７（ΔＨ１２７１−Ｄ１２８２）もまた同一ループ領域内で６個のアミ
ノ酸欠失を含有する変異体Ｍ２８（ΔＱ１２７４−Ｐ１２７９）と同様に、一次
脊髄細胞への極めて大きな結合の低下を示した。変異体Ｍ５８、Ｍ３７およびＭ
２８については、ガングリオシドＧＴ１ｂの低下した結合（図２）は神経細胞へ
の低下した結合と一致しており、これはループ１２１４−１２１９および１２７
４−１２７９内の残基がガングリオシドおよび細胞結合の両方にとって重要であ
ることを示唆している。

【０１１６】 ヒスチジン１２９３変異体の細胞結合活性についてもまた一次運動ニューロン
を使用して試験した。Ｈ１２９３ＡおよびＨ１２９３Ｓ突然変異タンパク質はど
ちらも入手された強力な染色パタンに判定されるように野生型Ｈｃタンパク質と
同様に強力に一次細胞へ結合すると思われた。これは野生型レベルの１２−４３
％への結合活性の低下が明確に観察されたガングリオシドＧＴ１ｂについて入手
された結果（表２）とは対照的である。従って、ガングリオシドＧＴ１ｂ結合に
おける大きな低下はこれらの突然変異タンパク質が一次神経細胞へ結合する能力
を低下させない。選択した変異体のガングリオシド結合、細胞結合および逆行性
輸送（下記参照）活動は表３に要約されている。

【０１１７】

【表４】

【０１１８】 [実施例４ 逆行性輸送活性は、ヒスチジン１２９３によっては保持されるが
、ループ変異体では破棄される。]

【０１１９】 我々の変異体の生物学的活性に関する機能試験として、我々はマウスにおいて
末梢ニューロンから中枢神経系へタンパク質が逆行性輸送を受ける能力を調査し
た。これは破傷風毒素のＨｃフラグメントの明確に認識された特性であり、破傷
風毒素が中枢神経系のより高度の中心へ輸送される能力を反映する。このアッセ
イのために、マウスの舌に野生型または突然変異タンパク質を注射し、タンパク
質が脳幹内の舌下神経核へ輸送される能力を可視化した。野生型Ｈｃタンパク質
は２４時間後に舌下神経核において検出したが、これとは対照的に変異体Ｍ２８
（ΔＱ１２７４−Ｐ１２７９）を検出することはできず、これはこの変異体が逆
行性輸送において不完全であることを示している。Ｍ２８の染色の欠如は、ＰＢ
Ｓを使用した陰性対照について所見された場合と同様であった。この結果はＭ２
８の低下したガングリオシド結合活性（図２および表２）および一次運動神経細
胞への低下した結合と一致している。

【０１２０】 第２実験において、我々はループ変異体Ｍ５８（Δ１２１４−１２１９）もま
た、非注射マウスに類似する染色の欠如により、逆行性輸送を受けるのに失敗す
ることを発見した。これらの結果は、１２７４〜１２７９番目および１２１４〜
１２１９番目の残基が、ガングリオシド結合および細胞結合における役割に一致
して、逆行性輸送に不可欠であることを示唆している。Ｃ末端突然変異Ｍ５（Δ
Ｖ１３０６−Ｄ１３１５）および野生型Ｈｃタンパク質について入手された陽性
染色は、Ｈｃのカルボキシル末端の１０個の残基がガングリオシド結合、細胞結
合または逆行性輸送にとって不可欠ではないことを示している。最後に、逆行性
輸送におけるヒスチジン１２９３の役割についても試験した。Ｈ１２９３Ａタン
パク質は舌下神経核の染色によって可視化されたように逆行性輸送を受けたが、
これはヒスチジン１２９３が逆行性輸送活性のために絶対的には必要とはされな
いことを示唆している。Ｐ．Ｆｉｓｈｍａｎによって別のヒスチジン１２９３変
異体（Ｈ１２９３Ｓ）の逆行性輸送を示している同様の結果が入手されている（
個人的見解である）。

【０１２１】 [参考文献]

【表５】

【０１２２】

【化１】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 破傷風毒素フラグメントＣの構造の三次元表示である。

【図２】 様々な破傷風毒素フラグメントＣ変異体について野生型と比較したガングリオ
シドへの結合率を示した図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｐ 31/04 ４Ｃ０８６ Ｃ０７Ｋ 14/33 ４Ｃ０８７ Ａ６１Ｐ 31/04 16/12 ４Ｈ０４５ Ｃ０７Ｋ 14/33 Ｃ１２Ｎ 1/21 16/12 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 1/21 21/02 Ｃ 15/02 Ｃ１２Ｒ 1:19 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 シンハ，カサリン イギリス国、エスダブリュー７ ２エイワ イ ロンドン、サウス・ケンジントン、イ ンペリアル・カレッジ、デパートメント・ オブ・バイオケミストリー Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA13 BA31 BA50 CA04 DA06 EA04 GA11 HA01 HA15 4B064 AG27 AG30 AG31 CA02 CA10 CA19 CA20 CC24 CE02 CE10 DA01 4B065 AA23Y AA26X AB01 AC14 BA02 CA24 CA45 4C084 AA02 BA02 BA22 CA04 DA33 NA14 ZB352 4C085 AA03 AA13 AA14 BA12 CC04 CC05 CC07 CC21 DD22 DD33 GG03 GG04 4C086 AA01 AA02 AA03 AA04 EA16 MA01 MA04 NA14 ZB35 4C087 AA01 AA02 BC34 CA12 NA14 ZB35 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA11 DA76 DA83 EA29 EA31 EA52 FA72 FA74 GA21

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 破傷風毒素フラグメントＣまたはそれの免疫原性フラグメン
   トを含むポリペプチドであって、該破傷風毒素フラグメントＣまたはそれの免疫
   原性フラグメントがループ領域において突然変異を含み、 該突然変異が、 破傷風毒素フラグメントＣもしくはそれの免疫原性フラグメントのガングリオ
   シドへの結合性の低下、および／または 破傷風毒素フラグメントＣもしくはそれの免疫原性フラグメントの一次運動ニ
   ューロンへの結合性の低下、および／または 破傷風毒素フラグメントＣもしくはそれの免疫原性フラグメントが逆行性輸送
   を受ける能力の低下 を生じさせることを特徴とするポリペプチド。
2. 【請求項２】 前記ループ領域が、破傷風毒素フラグメントＣのアミノ酸配
   列の１２１４〜１２１９番目および１２７２〜１２８２番目のアミノ酸残基から
   選択されることを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。
3. 【請求項３】 前記突然変異が、少なくとも１つの欠失変異であることを特
   徴とする請求項１または２に記載のポリペプチド。
4. 【請求項４】 前記欠失変異が、破傷風毒素フラグメントＣのアミノ酸配列
   の１２１４番目〜１２１９番目、１２７４番目〜１２７９番目および１２７１番
   目〜１２８２番目から選択されることを特徴とする請求項３に記載のポリペプチ
   ド。
5. 【請求項５】 請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチドをコードする
   ポリヌクレオチド。
6. 【請求項６】 宿主細胞におけるポリヌクレオチドの発現を許容する調節配
   列に動作可能に連結された請求項５に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
7. 【請求項７】 請求項６に記載のベクターを含む宿主細胞。
8. 【請求項８】 細菌である請求項７に記載の宿主細胞。
9. 【請求項９】 希釈するために製薬学的に容認可能な担体と一緒に請求項１
   〜４のいずれかに記載のポリペプチド、請求項５に記載のポリヌクレオチドまた
   は請求項６に記載のベクターを含む医薬組成物。
10. 【請求項１０】 希釈するために製薬学的に容認可能な担体と一緒に請求項
    １〜４のいずれかに記載のポリペプチド、請求項５に記載のポリヌクレオチドま
    たは請求項６に記載のベクターを含むワクチン組成物。
11. 【請求項１１】 ヒトまたは動物に有効量の請求項１〜４のいずれかに記載
    のポリペプチド、請求項５に記載のポリヌクレオチドまたは請求項６に記載のベ
    クターを投与するステップを含むヒトまたは動物における破傷風菌感染症を治療
    する方法、または予防する方法、または破傷風菌感染症に対する感受性を低下さ
    せる方法。
12. 【請求項１２】 破傷風毒素ポリペプチド内のエピトープを認識する抗体を
    産生する方法における請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチド、請求項５
    に記載のポリヌクレオチドまたは請求項６に記載のベクターの使用。
13. 【請求項１３】 動物に対して、請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプ
    チド、または請求項５に記載のポリヌクレオチド、または請求項６に記載のベク
    ターを投与するステップを含む、破傷風毒素ポリペプチド内のエピトープを認識
    する抗体を産生する方法。
14. 【請求項１４】 請求項１２または１３に従って産生した有効量の抗体をヒ
    トまたは動物に投与するステップを含むヒトまたは動物における破傷風菌感染症
    を治療する方法。
15. 【請求項１５】 ポリペプチドの表面露出ループ領域に存在する１個以上の
    アミノ酸残基を修飾するステップを含むガングリオシドに対する破傷風毒素フラ
    グメントＣポリペプチドの結合親和性を低下させる方法。
16. 【請求項１６】 請求項１５の方法によって産生されたポリペプチド。