JP2003517844A - クラミジア抗原および対応するdna断片ならびにその使用 - Google Patents
クラミジア抗原および対応するdna断片ならびにその使用Info
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Abstract
Description
できるクラミジア(Chlamydia)omp P6前駆体および対応するDNA分子に
関する。
られるタンパク質と構造的および機能的に類似するいくつかの膜タンパク質を含
む三層の外膜をはじめ、グラム陰性菌との形態的および構造的類似性を示す。そ
れらは、代謝上不活性であるが感染力のある細胞外段階と、複製はするが感染力
のない細胞内段階からなる独自の二相性生活環を有する偏性細胞内寄生体である
。生活環の複製段階は感染した宿主細胞の細胞質からこの細菌を隔離する膜に結
合した封入体内で起こる。
ミジア(Chlamydia psittaci)のTWAR株として記載されていたが、その後は新種で
あると認識されている。肺炎クラミジアは他のクラミジア種(トラコーマクラミ
ジア(C. trachomatis)、C.ペコラム(C. pecorum)およびオウム病クラミジアと
は抗原的、遺伝的および形態的に異なっている。それはトラコーマクラミジアま
たはオウム病クラミジアといずれかとDNA配列において10%以下の相同性し
か示さない。
り、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)および肺炎マイコプラズマ(Mycoplasm a pneumoniae)よりもわずかに低い頻度である(Grayston et al. (1995) Journal
of nfectious Diseases 168:1231; Campos et al. (1995) Investigation of O
phthalmology and Visual Science 36:1477)。それはまた気管支炎および副鼻腔
炎をはじめとする上気道症状および疾患を引き起こす(Grayston et al. (1990)
Journal of Infectious Diseases 168:1231; Grayston et al (1990) Journal o
f Infectious Diseases 161:618-625; Marrie (1993) Clinical Infectious Dis
eases, 18:501-513; Wang et al (1986) Chlamydial infectious, Cambridge Un
iversity Press, Cambridge, p.329)。大部分の成人集団(60%を超える)は
肺炎クラミジアに対する抗体を持っており(Wang et al (1986) Chlamydial infe
ction, Cambridge University Press, Cambridge, p.329)、これはまだ認識され
ていないか、または無症候性である過去の感染を示している。
声、および発熱;聴診での異常な胸部音)として示される。ほとんどの患者では
咳が2〜6週間持続し、回復が遅い。このようなケースの約10%で、上気道感
染の後に気管支炎または肺炎が起こる。さらに肺炎クラミジア流行の際には、次
ぎにこれらの肺炎患者の約半数、特に虚弱者や高齢者で肺炎球菌の同時感染が認
めれた。上記で示されたように、肺炎クラミジア感染が呼吸器系感染以外の疾患
にも関連するさらに多くの証拠がある。
鳥類または動物の貯蔵庫は知られていない。伝染については明らかには定義され
ていない。それは分泌物との直接的な接触、媒介物、または風媒拡散によると考
えられる。長い潜伏期間があり、それは何ヶ月も持続する。流行の分析に基づけ
ば、感染者はその生物の効率の悪い媒介者であるので、肺炎クラミジアはある集
団にゆっくり拡散すると考えられる(患者から患者の間隔は平均30日)。肺炎
クラミジア罹病率は普遍的である。小児期に最初に感染した後、成人期に再感染
が起こる。肺炎クラミジアは、2〜3年持続する高い発病率(流行病)間隔を重
ね合わせると著しくは世界中の伝染病であると考えられる。トラコーマクラミジ
ア感染は肺炎クラミジアに対する交差免疫を付与しない。感染症は経口抗せ物質
テトラサイクリンまたはエリスロマイシン(2g/d、少なくとも10〜14日
間)で容易に治療される。最近開発された薬剤アジスロマイジンはクラミジア感
染症に対して単回投与として極めて有効である。
症の90%までは亜急性であるか、認識されない。工業国の小児の間では感染は
5才まではまれであると考えられていたが、最近の研究(E Normann et al, Chla
mydia pneumoniae in children with acute respiratory tract infections, Ac
ta Paediatrica, 1998, Vol 87, Iss 1, pp 23-27)では、この世代の子供の多く
は血清反応陰性であるにもかかわらず感染のPCR証拠を示し、2〜4才の17
〜19%有病率と見積もられることが報告されている。発展途上国では、幼児の
間の肺炎クラミジア抗体の血清有病率は上昇し、肺炎クラミジアは急性下気道疾
患、ならびに世界の熱帯地方の幼児よび小児の死亡率の重要な原因であり得ると
疑われる。
感染は通常、5才から20才の間で起こる。米国では例えば、肺炎クラミジアに
よって引き起こされる毎年の小児肺炎の30,000症例であると見積もられる
。感染は小児または若年(例えば、学生や徴兵)群の中で集団発生する。
(スェーデン、イタリア、フィンランドおよび米国から報告)。流行中、肺炎ク
ラミジアは感染は肺炎の症例の50〜60%にのぼると考えられる。このような
期間にはまた、さらに肺炎球菌による混合感染があることが報告されている。
の研究に基づけば、年齢とともに曝露が増す傾向にあり、これは特にヒトにおい
て明らかである。何人かの研究者が、持続性、無症候性の肺炎クラミジア感染状
態がよくあることであると推測している。
と進行する可能性がある。米国での研究は、60才より若い人において肺炎クラ
ミジアによって引き起こされた発病率は年間1,000人につき1症例であるが
、若年層では発病率は3倍に上昇していたことを明らかにした。肺炎クラミジア
感染は病床中にある患者を除いては入院につながることはまれである。
ある。従来の肺炎クラミジア感染と心臓発作、冠動脈疾患および頸動脈疾患との
関係を示すいくつかの疫学研究がある(Saikku et al. (1988) Lanet; ii:983-98
6; Thom et al. (1992) JAMA 268:68-72; Linnanmaki et al. (1993), Circulat
ion 87:1030; Saikku et al. (1992) Annals Internal Medicine 116:273-287;
Melnick et al (1993) American Journal of Medicine 95:499)。さらに、この
微生物は冠動脈、頸動脈、末梢動脈および大動脈のアテロームおよび脂肪索で検
出されている(Shor et al. (1992) South African. Medical Journal 82:158-16
1; Kuo et al. (1993) Journal of Infectious Diseases 167:841-849; Kuo et
al. (1993) Arteriosclerosis and Thrombosis 13:1501-1504; Campbell et al
(1995) Journal of Infectious Diseases 172:585; Chiu et al. Circulation,
1997. Circulation. 96:2144-2148)。種々の肺炎クラミジアは冠動脈および頸動
脈から回収されている(Ramirez et al (1996) Annals of Internal Medicine 12
5:979-982; Jackson et al. 1997. J. Infect. Dis.176:292-295)。さらに肺炎
クラミジアはウサギモデルにおけるアテローム性動脈硬化症の変化を誘導するこ
とが示されている(Fong et al (1997) Journal of Clinical Microbiology 35:4
8 および Laitinen et al. 1997. Infect. Immun. 65:4832-4835)。考え併せる
とこれらの結果は、、クラミジア性のアテローム性動脈硬化症の疫学的重要性は
依然証明されてはいないが、肺炎クラミジアがヒトにおいてアテローム性動脈硬
化症を引き起こし得るという高い可能性があることを示している。
ている。感染は喘鳴性の喘息性気管支炎、成人発症喘息および成人における喘息
の急性再燃に結びつけられており、小規模研究では何人かで長期抗生物質治療が
効果的にゆっくりと疾病の重篤度を軽減することが示されている(Hahn DL, et a
l. Evidence for Chlamydia pneumoniae infection in steroid-dependent asth
ma. Ann Allergy Asthma Immunol. 1998 Jan; 80(1): 45-49; Hahn DL, et al.
Association of Chlamydia pneumoniae IgA antibodies with recently symptom
itic asthma. Epidemiol Infect. 1996 Dec; 117(3): 513-517; Bjornsson E, e
t al. Serology of chlamydia in relation to asthma and bronchial hyperres
ponsiveness. Scand J Infect Dis. 1996; 28(1): 63-69; Hahn DL. Treatment
of Chlamydia pneumoniae infection in adult asthma: a befor-after trial.
J Fam Pract. 1995 Oct; 41(4): 345-351; Allegra L, et al. Acute exacerbat
ions of asthma in adults: role of Chlamydia pneumoniae infection. Eur Re
spir J. 1994 Dec; 7(12): 2165-2168; Hahn DL, et al. Association of Chlam
ydia pneumoniae (strain TWAR) infection with wheezng, asthmatic bronchit
is, and adult-onset asthma. JAMA. 1991 Jul 10; 266(2): 225-230)。
重要であると考えられる。いずれのヒトクラミジア感染にも有用なワクチンはま
だない。有効なワクチンは物理的または化学的に不活化したクラミジアを用いて
開発できると考えられる。しかしながらかかるワクチンは高い安全域がない。一
般に、安全なワクチンはその微生物の遺伝子操作のよって弱毒化するか、または
組換えによって作出される。従って、ヒトクラミジア感染に対する有効かつ安全
なワクチンを作出する主な障壁は、クラミジア、特に肺炎クラミジアに関する遺
伝情報が不十分であることであった。
する安全かつ有効なワクチンが達成可能な目標であることを示している。例えば
、トラコーマクラミジアの肺感染から回復したマウスはその後の膣攻撃によって
誘導される不妊症から保護される(Pal et al. (1996) Infection and Immunity.
64:5341)。同様に、不活化したオウム病クラミジアで免疫化したヒツジはその
後のクラミジア誘発性の流産および死産から保護された(Jones et al. (1995) V
accine 13:715)。マウスモデルにおいて、クラミジア感染症からの保護は、Th
1免疫応答、特にCD8+CTL応答と関連づけられている(Rottenbery et al.
1999. J. Immunol. 162:2829-2836 および Penttila et al.1999. Immunology 9
7:490-496)。そして、同様の応答が保護を付与するためにヒトにおいて誘導され
ることが必要となることは起こりそうもない。しかしながら、肺炎クラミジアに
対する保護免疫応答を引き起こすことができる抗原はあまり知られていない。粘
膜表面の十分高力価の中和抗体の存在も保護作用を発揮し得る(Cotter et al. (
1995) Infection and Immunity 63:4704)。
十分記載されていないが、バリエーションはトラコーマクラミジアに基づいて存
在しているものと予測される。トラコーマクラミジアの血清学的亜型は主要外膜
タンパク質(MOMP)における抗原バリエーションに基づいて定義されている
が、公表されている肺炎クラミジアMOMP遺伝子配列はこの微生物のいくつか
の異なる単離物の間ではダリエーションを示していない(Campbell et al Infect
ion and Immunity (1990)58:93; McCafferty et al Infection and Immunity (1
995) 63:2387-9; Gaydos et al. Infection and Immunity (1992)60(12) :5319-
5323。76kDaの抗原をコードする遺伝子は肺炎クラミジアのただ単一株から
クローニングされたものであり、その配列は公開されている(Perez Melgosa et
al., Infection and Immunity. 1994. 62:880)。9kDaおよび60kDaのシ
ステイン豊富な外膜タンパク質遺伝子を含むオペロンが記載されている(Watson
et al., Nucleic Acids Res (1990) 18:5299; Watson et al., Microbiology (1
995) 141:2489)。肺炎クラミジアに対する免疫血清によって認識される多くの抗
原は総てのクラミジア間で保存されているが、98kDA、76kDaおよび他
のいくつかのタンパク質は肺炎クラミジア特異的である可能性がある(Knudsen e
t al. Infect. Immun. 1999. 67: 375-383; Perez Melgosa et al., Infection
and Immunity. 1994. 62:880; Melgosa et al., FEMS Microbiol Lett (1993) 1
12:119; Campbell et al., J Clin Microbiol (1994) 32:583)。76kDaおよ
び54kDaの抗原に対する抗血清が報告されており、インビトロにおいて肺炎
クラミジアを無効にする(Perez Melgosa et al. 1994. Infect. Immun. 62:8
80-886 および Wiedman-Al-Ahmad et al. 1997. Clin Diagn.Lab. Immnol. 4:70
0-704)。肺炎クラミジア血清型の数および相対頻度の評価、ならびに抗原の定
義はまだ可能ではない。肺炎クラミジアCWL−029株の全ゲノム配列はすで
に知られており(http://chlamydia-www.berkeley.edu:4231/)、さらなる配列が
入手できるので、抗原バリエーションのよりよい理解が得られる。
は総てのクラミジアにわたって保存されているが、98kDa、76kDaおよ
び54kDaタンパク質は肺炎クラミジア特異的であると思われる(Campos et a
l. (1995) Investigation of Ophthalmology and Visual Science 36: 1477; Ma
rrie (1993) Clinical Infectious Diseases, 18:501-513; Wiedmann-Al-Ahmad
M, et al. Reactions of polyclonal and neutralizing anti-p54 monoclonal a
ntibodies with an isolated, species-specific 54-kilodalton protein od Ch
lamydia pneumoniae, Clin Diagn Lab Immunil. 1997 Nov; 4(6): 700-704)。患
者由来の血清による単離物の免疫ブロッティングは、単離物間でブロッティング
パターンにバリエーションがあることを示し、血清型肺炎クラミジアが存在し得
ること示している(Grayston et al. (1995) Journal of Infectious Diseases 1
68:1231; Ramirez et al. (1996) Annals of Internal Medecine 125:979-982)
。しかしながらこの結果は、患者の血清の免疫ブロットプロフィールが感染後経
時的に変化するので、患者の感染状態によって混乱しているかもしれない。血清
型の数および相対頻度の評価、ならびに抗原の定義は依然として可能ではない。
肺感染に対する保護免疫応答を誘導するための、DNA免疫措置の使用が報告さ
れている (Zhang et al. 1997. J.Infect.Dis. 76:1035-1040、およびZhang et
al. 1999. Immunology. 96:314-321)。
ラミジアのポリヌクレオチド配列を同定および単離する必要性がある。
ラミジアポリペプチド指定omp P6前駆体遺伝子産物(配列番号1)をコー
ドする精製および単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。本発明の一つの
形態では、ポリヌクレオチド分子は配列番号2のポリペプチドをコードするDN
Aである。
供する。対応するコードペプチドのアミノ酸配列は配列番号2で示されている。
配列を提供する限り、本発明はまたかかるポリペプチドに由来する断片をコード
するポリヌクレオチドを提供することが分かるであろう。さらに、本発明は、本
明細書に記載の非必須アミノ酸の付加、欠失または置換によって生じるかかるペ
プチドおよびそれらに由来する断片の変異体および誘導体、ならびにを提供する
ものと理解される。当業者ならば、本発明はクラミジアポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチド配列が提供される限り、さらにかかるポリペプチドと特異的
に結合する単一特異性抗体を提供することが容易に分かるであろう。
オチドで形質転換またはトランスフェクトされた細胞を含む。従って、本発明は
さらに(i)組換え宿主系において本発明のポリペプチドを製造する方法、なら
びに関連の発現カセット、ベクター、および形質転換またはトランスフェクト細
胞;(ii)希釈剤または担体と組み合わせた、本発明のポリヌクレオチドを含有
するワクチン、またはポックスウイルス、ネズミチフス菌(Salmonella typhimur ium )またはコレラ菌(Viblerae cholerae)ベクターなどの生ワクチン(かかるワ
クチンおよびワクチンベクターは、例えばクラミジア感染を予防および治療する
のに有用である)、ならびに関連の医薬組成物および関連の治療および/または
予防方法;(iii)裸の形態もしくは送達ビヒクルと配合した本発明のRNAま
たはDNA分子、本発明のポリペプチドもしくはポリペプチドの組合せ、または
単一特異性抗体、ならびに関連の医薬組成物の治療的および/または予防的使用
;(iv)DNAまたはRNA分子、単一特異性抗体、または本発明のポリペプチ
ドの使用を含み得る、生物学的サンプルにおけるクラミジアの存在の診断方法;
および(v)抗体に基づくアフィニティークロマトグラフィーによる本発明のポ
リペプチドの精製方法を提供する。
ンリーディングフレーム(ORF)が同定されている。このタンパク質をコード
する遺伝子を発現プラスミドに挿入されているが、これはクラミジア感染に対す
る免疫防御を与えることが分かっている。従ってこのomp P6前駆体および
関連のポリペプチドを用いてクラミジア感染を予防および治療することができる
。
ヌクレオチドが提供され、そのアミノ酸配列は配列番号2に示されている。
ポリヌクレオチドと定義される。例えば生細菌のゲノム中、または遺伝子バンク
の一部として存在する天然DNA分子は単離されないが、細菌ゲノムの残存部分
から同分子は分離される、例えばクローニング(増幅)の結果として単離される
。典型的には単離されたDNA分子は天然に存在するゲノムの5’または3’末
端にすぐ隣接するDNA領域(例えばコドン領域)から遊離している。かかる単
離ポリヌクレオチドはベクターまたは組成物の一部であってよいが、かかるベク
ターまたは組成物がかかるポリヌクレオチドの自然環境の一部ではないというこ
とから「単離された」と定義される。
たは合成DNA)のいずれか、またはその改変体、変異体、相同体もしくは断片
である。DNAは二本鎖または一本鎖のいずれかであり、一本鎖であれば、コー
ド鎖または非コード(アンチセンス)鎖のいずれかである。配列番号1で示され
る本発明のポリペプチドをコードする配列のいずれか1つが、(a)コード配列
、(b)(a)の転写により誘導されるリボヌクレオチド配列、または(c)遺
伝子コードの重複または縮重により同じポリペプチドをコードするコード配列で
ある。「ポリペプチド」または「タンパク質」とは、長さまたは翻訳後修飾(例
えばグリコシル化またはリン酸化)にかかわらず、いずれのアミノ酸鎖をも意味
する。本願では両用語を相互に使用してもよい。
。本明細書において使用される「相同アミノ酸配列」とは、臨界融解温度(Tm
)を超えない25〜35℃において、配列番号1の核酸配列のいずれの部分とも
ハイブリダイズする核酸配列によって総てまたは一部がコードされるいずれかの
ポリペプチドである。相同アミノ酸配列は配列番号2で示されるアミノ酸配列と
1つ以上の保存的アミノ酸置換に関して異なるものである。またかかる配列は血
清型変異体(下記)ならびに免疫原性などのポリペプチド本来の特徴を維持する
、欠失または挿入を含む配列も包含する。かかる配列は配列番号2と好ましくは
少なくとも75%、さらに好ましくは80%、および最も好ましくは90%同一
である。 相同アミノ酸配列には配列番号2と同一または実質的に同一の配列が挙げられ
る。「実質的に同一のアミノ酸配列」とは、参照アミノ酸配列と少なくとも90
%、好ましくは95%、さらに好ましくは97%、および最も好ましくは99%
同一であり、かつ好ましくは参照配列と大部分の保存的アミノ酸置換に関して異
なる配列を意味する。
例えばアスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、およびチロシンのよう
な非荷電極性側鎖を有するアミノ酸;リジン、アルギニン、およびヒスチジンの
ような塩基性側鎖を有するアミノ酸;アスパラギン酸、およびグルタミン酸のよ
うな酸性側鎖を有するアミノ酸;およびグリシン、アラニン、バリン、ロイシン
、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、
およびシステインのような非極性側鎖を有するアミノ酸が挙げられる。
gy Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705のSequence Analysis
Software Packageのような配列解析ソフトウェアを用いて求められる。アミノ酸
配列を同一性が最大となるように配列する。配列に人為的にギャップを挿入し適
当な配列を得てもよい。ひと度最適なアライメントが設定されれば、全位置数に
対し、両配列のアミノ酸が一致する位置を総て記録することにより相同性の程度
が確認される。
ド配列と好ましくは少なくとも45%、より好ましくは60%、さらに好ましく
は75%、さらにより好ましくは85%、および最も好ましくは90%同一のも
のである。
には、天然に存在する対立遺伝子変異体、ならびに配列番号2のポリペプチド本
来の特徴を維持する変異体または天然には存在しないいずれの他の変異体も包含
される。
的機能を変更しない、1つ以上のアミノ酸の置換、欠失または付加を有すること
を特徴とするポリペプチドのもう一つの形態である。「生物学的機能」とは、た
とえその機能が細胞の増殖または生存に必要でなくとも、それが天然に存在する
細胞におけるポリペプチドの機能を意味する。例えばポーリンの生物学的機能は
細胞外媒質に存在する化合物を細胞へ侵入させることである。生物学的機能は抗
原性特性とは性質が異なる。ポリペプチドは1以上の生物学的機能を有し得る。
どの細菌種は通常対立遺伝子の小さな変化に関し互いに異なる種々の株で表され
る。実際、異なる株において同じ生物学的機能を果たすポリペプチドはそれぞれ
の株で同一でないアミノ酸配列(およびポリヌクレオチド配列)を有していても
よい。この変動にかかわらず、一般に多くの対立遺伝子変異体に対して向けられ
た免疫応答が実証されている。クラミジアMOMP抗原の研究では、株間のMO
MPのアミノ酸配列の変化にかかわらず、雑種株抗体結合が起こるとともに感染
力の中和がなされ、免疫原として用いた際に、MOMPがアミノ酸変化を許容す
ることが示される。
常法により抽出されたゲノム細菌DNAのポリメラーゼ鎖反応(PCR)増幅法
によって回収される。これにはコードドメインの5’および3’末端の上流およ
び下流に適合する合成オリゴヌクレオチドプライマーの使用が含まれる。好適な
プライマーは配列番号1で提供されるヌクレオチド配列情報により設計される。
その工程は次の通りである:10〜40個、好ましくは15〜25個のヌクレオ
チドからなるプライマーを選択する。効率的なハイブリダイゼーションを確実に
するのに十分な比率でCおよびGを含有する、すなわちCおよびGヌクレオチド
量が全ヌクレオチド含量の少なくとも40%、好ましくは50%である、プライ
マーを選択することが有利である。標準的なPCR反応は典型的には100μL
につき0.5〜5単位のTaqDNAポリメラーゼ、各20〜200μMのデオ
キシヌクレオチド(好ましくは同濃度)、全デオキシヌクレオチド濃度にわたっ
て0.5〜2.5mM、105〜106の標的分子、および約20Pmolの各
プライマーを含む。PCRサイクル約25〜50回を行い、アニーリング温度を
プライマーの真のTmより15〜5℃低い温度とする。よりストリンジェントな
アニーリング温度にすると誤ってアニーリングしたプライマーの識別が向上し、
プライマーの3’末端への誤ったヌクレオチドの組み込みが少なくなる。変性温
度は95℃〜97℃が典型であるが、G+C豊富な標的の変性についてはより高
い温度が適当であろう。実施するサイクル数は最初の標的分子の濃度にもよるが
、典型的には特異的でないバックグラウンド産物が集積する傾向にあるので、4
0サイクルを超えない方がよい。
収する別法としては、DNAまたはRNAライブラリーのハイブリダイゼーショ
ンスクリーニングによるものがある。ハイブリダイゼーション手順は当技術分野
では十分に知られており、Ausubel et al., (Ausubel et al., Current Protoco
ls in Molecular Biology, John Wiley & Sons INc., 1994), Silhavy et al. (
Silhavy et al. Experiments with Gene Fusions, Cold Spring harbor Laborat
ory Press, 1994)、およびDavis et al. (Davis et al. A Manual for Genetic
Engineering: Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring harbor Laboratory
Press, 1980)に記載されている。ハイブリダイゼーション条件を至適化する重要
なパラメーターは、その温度を超えると2本の相補DNA鎖が互いに分離する臨
界融解温度を得るのに用いる式で表される(Casey & Davidson, Nucl. Acid Res.
(1977) 4:1539)。約600個以上のヌクレオチドでなるポリヌクレオチドの場
合、この式は次の通りである: Tm=81.5+0.41x(%G+C)+16.6log(陽イオン濃度)−0.63x(%ホルムアミト゛)−600/塩 基数。
約20〜40℃、20〜25℃、または好ましくは計算値Tmを超えない30〜
40℃である。最適温度および塩条件が容易に求め得ることは当業者には明らか
であろう。
50%ホルムアミド含有SSCにおける、または(ii)65℃で4〜16時間以
内、6×SSC水溶液(1M NaCl、0.1Mクエン酸ナトリウム(pH7
.0))における、プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイズインキュ
ベーション双方の間にストリンジェント条件に達する。
われる。このような温度では、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件
は6×SSC、好ましくは2×SSCまたは1×SSC、より好ましくは0.5
×SSC、0.3×SSCまたは0.1×SSC(ホルムアミドの不在下)行う
ことができる。1×SSCは0.15M NaClおよび0.015Mクエン酸
ナトリウムを含む。
/または欠失を許容すると思われる抗原の領域を同定する公知の方法を用いて設
計される。例として、異なる種由来の相同ポリペプチドを比較し、保存された配
列を同定することを挙げる。さらに分岐した配列が最も配列変化を許容すると考
えられる。配列間の相同性は例えばAltschul et al., Nucleic Acids Res,;25:3
389-3402 (1997)のBLAST相同性検索アルゴリズムを用いて解析すればよい
。あるいは、コンピューターによって支援される可能性のあるTまたはB細胞エ
ピトープの解析に基づいて配列がTおよび/またはB細胞とより高い反応性を有
するように改変する。さらにもう1つの別法では、in vitroにおいてポリペプチ
ド内のある特定のアミノ酸残基または配列を変異させ、次いでのその変異ポリペ
プチドを、以下に概略を記した方法によりクラミジア感染症を予防または治療す
る能力についてスクリーニングする。
2のある特定の相同体がクラミジア感染症の予防または治療に有用であるかを過
度な実験を行うことなく求められることが容易に理解されるであろう。
選択する 工程を含んでなる。
動物と比べた場合のクラミジア感染症のいずれかの影響の重篤度の軽減を意味す
る。
リペプチド配列の部分配列、内部欠失により全長ポリペプチドから誘導されたポ
リペプチド、および融合タンパク質であるポリペプチド誘導体が提供される。
質の小さな(例えば8〜10個のアミノ酸)免疫原性領域であるため、ワクチン
としてタンパク質免疫原の断片および変異体を使用することは免疫学の分野では
一般に認られた慣例である。クラミジア以外の病原体の表面に曝された抗原に対
応する種々の短い合成ペプチドがそれぞれの病原体、例えばネズミ乳癌ウイルス
の11残基ペプチド(Casey & Davidson, Nucl. Acid Res. (1977) 4:1539)、セ
ムリキ森林ウイルスの16残基ペプチド(Snijders et al., 1991. J.Gen.Virol.
72:557-565)、およびイヌパルボウイルス由来の15残基各々の2つの重複ペプ
チド(Langeveld et al., Vaccine 12(15):1473-1480,1994)に対する有効なワク
チン抗原であることが分かっている。
長配列固有のものであり、本発明により教示されることは当業者には容易に理解
されるであろう。かかるポリペプチド断片の長さは少なくとも12個のアミノ酸
であることが好ましい。それらの長さが少なくとも20個のアミノ酸、好ましく
は少なくとも50個のアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも75個のアミノ酸
、およびさらに好ましくは少なくとも100個のアミノ酸であることが有利であ
る。
ドからなるポリヌクレオチドは、以下に概略を記したパラメーターを用い、かつ
増幅される断片の5’および3’末端の上流および下流の配列に適合するプライ
マーを使用するPCR増幅法により回収される。かかる増幅物の鋳型ポリヌクレ
オチドは配列番号1と相同な全長ポリヌクレオチド、またはDNAまたはRNA
ライブラリーなどのポリヌクレオチド混合物に含まれるポリヌクレオチドのいず
れかである。部分配列を回収する別法としては、上記の条件下においてTmの計
算式を用いてスクリーニングハイブリダイゼーションを行う。30〜600個の
ヌクレオチドからなる断片を回収する場合、計算値Tmを減法(600/塩基対
のポリヌクレオチドサイズ)により補正し、ストリンジェント条件をTmを超え
ない5〜10℃であるハイブリダイゼーション温度で定義する。20〜30塩基
より短いオリゴヌクレオチドを得る場合、Tmの計算式は次の通りである:Tm
=4x(G+C)+2(A+T)。例えば、50%C+Gの18個のヌクレオチ
ド断片は約54℃のTmを有するであろう。配列番号2の断片またはその相同配
列である短いペプチドは化学合成(E. Gross and H. J. Meinhofer, 4 The Pepti
des: Analysis, Synthesis, Biology; Modern Techniques of Peptide Synthesi
s, John Wiley & Sons (1981)、およびM. Bodanzki, Principles of Peptide Sy
nthesis, Springer-Verlag (1984))により直接得られる。
ューター支援解析を用いて設計する。これにより表面に曝された有望な抗原性領
域が同定されよう(Hughs et al., 1992. Infect. Immun. 60(9):3497)。プログ
ラムSEQSEE(Wishart DS, et al., “SEQSEE:タンパク質配列解析
に適した総合プログラム” Comput Appl Biosci. 1994 Apr; 10 (2): 121-32)を
使用する、産物の順応性および疎水性に基づく配列番号2にある6個のアミノ酸
配列の解析では、有用な免疫原性断片および変異体を選択する基準として使用し
てもよい、可能性あるBおよびT細胞エピトープが明らかとなり得る。この解析
では抗体により認識されると考えられる外面特徴の適当な組合せを使用する。H
LA−A0201 MHCサブクラスの有望なT細胞エピトープがNIHで開発
されたアプローチとエミュレートする、アルゴリズムにより明らかにすることが
できる(Parker KC, et al. "Peptide binding to MHC class I molecules: impl
ications for antigenic peptide prediction." Immunol Res 1995; 14 (1) 34-
57)。
範囲全体に存在する。しかしながら、いくつかのエピトープはポリペプチドの2
次および3次構造によりマスクされる。かかるマスクされたエピトープを明らか
にするため、大きな内部欠失を引き起こし、それによってもとのタンパク質構造
の大部分を取り除いてマスクされたエピトープを露出させる。かかる内部欠失は
時に株間の高変異性の免疫優性領域を取り去るという付加的な利点をもたらす。
ポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドおよび大きな内部欠失を有する
およびポリペプチドを常法により構築する(Ausubel et al., Current Protocols
in Molecular Biology, John Wily & Sons Inc., 1994)。かかる方法には標準
PCR、逆PCR、クローニングしたDNA分子の制限酵素処理、またはKunkel
et al.(Kunkel et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82:448)の方法が
挙げられる。これらの方法の成分およびその使用説明書はStratageneなどの様々
な販売元から容易に入手可能である。ひと度欠失変異体を構築すれば、それらを
上記のようにクラミジア感染症を予防または治療する能力について調べる。
プチドとNまたはC末端で融合した本発明のポリペプチドまたはポリペプチド誘
導体を含有するものである(以後ペプチドテールと記す)。かかる融合ペプチド
を得る簡便な方法はポリヌクレオチド配列のインフレーム融合物、すなわちハイ
ブリッド遺伝子の翻訳による。融合ポリペプチドをコードするハイブリッド遺伝
子を発現ベクターに挿入し、それを用いて宿主細胞を形質転換またはでトランス
フェクトする。そうでなければ、ポリペプチドまたはポリペプチド誘導体をコー
ドするポリヌクレオチド配列を、ペプチドテールをコードするポリヌクレオチド
が既に存在する発現ベクターに挿入する。かかるベクターおよびその使用説明書
は商業的に入手可能である、例えばペプチドテールがマルトース結合タンパク質
である、New England BiolabsのpMal−c2またはpMal−p2系、Pharm
aciaのグルタチオン−S−トランスフェラーゼ系、またはNovagenから入手可能
なHis−Tag系。これらおよび他の発現系により本発明のポリペプチドおよ
び誘導体のさらなる単離のための便宜な手段が提供される。
しくは断片と、コレラ毒素または大腸菌(E. coli)易熱性毒素のいずれかのサブ
ユニットBのようなアジュバント活性を有するポリペプチドとを融合したもので
ある。もう一つの有利な融合物はポリペプチド、相同体または断片と、強力なT
細胞エピトープまたはB細胞エピトープとを融合したものである。かかるエピト
ープは当技術分野で公知のもの(例えば、B型肝炎コア抗原、D. R. Millich et
al., "Antibody production to the nucleocapsid and envelope of the Hepat
itis B virus primed by a single synthetic T cell site", Nature. 1987. 32
9: 547-549)、または、可能性のあるTまたはB細胞のコンピュータ補助分析に
基づく本発明のもう一つのポリペプチドにおいて同定されたものであってよい。
本発明のこの態様に従い、融合ポリペプチドは配列番号2、またはその相同体も
しくは断片由来のTまたはB細胞エピトープを含んでなる(ここで、エピトープ
はそのポリペプチドまたは相同体もしくは断片の多様な変異体から誘導され、各
々のエピトープはそのエピトープのポリペプチド内の位置および配列において他
とは異なっている)。かかる融合物は全ポリペプチド、相同体または断片に対す
るTまたはB細胞応答を最適にするため、それはクラミジア感染症の予防および
治療に有効である。
ポリペプチドのN、または好ましくはC末端、またはTもしくはB細胞エピトー
プとを融合する。そうでなければ、本発明のポリペプチド断片をアジュバント活
性を有するポリペプチドのアミノ酸配列内に挿入する。またTまたはB細胞エピ
トープを本発明のポリペプチドのアミノ酸配列内に挿入してもよい。
有する、本発明のポリペプチドへと成熟するハイブリッド前駆体ポリペプチドも
コードする。「異種シグナルペプチド」とは、本発明のポリペプチドの天然に存
在する前駆体には見られないシグナルペプチドを意味する。
クレオチド分子は多方面に適用される。DNA分子は例えば(i)組換え宿主系
においてコードされたポリペプチドを生産するプロセスにおいて、(ii)クラミ
ジア感染症を予防および/または治療する方法および組成物においてさらに用い
られる、ポックスウイルスなどのワクチンベクターの構築において、(iii)裸
の形態で、または送達ビヒクルと配合したワクチン薬剤として(RNA分子と同
様)、および(iv)本発明のポリヌクレオチドを過剰発現できる、またはそれを
無毒性、変異型で発現する弱毒クラミジア株の構築において用いられる。
に適当なプロモーターの制御下に置かれた本発明のDNA分子を含有する発現カ
セット;(ii)本発明の発現カセットを含有する発現ベクター;(iii)本発明
の発現カセットおよび/またはベクターで形質転換またはトランスフェクトした
原核生物または真核生物細胞、ならびに(iv)本発明のDNA分子の発現を可能
にする条件下において、本発明の発現カセットおよび/またはベクターで形質転
換またはトランスフェクトした原核生物または真核生物細胞を培養し、細胞培養
物からコードされたポリペプチドまたはポリペプチド誘導体を回収することを含
む、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドまたはポリペプ
チド誘導体を生産する方法を含む。
は、酵母細胞(例えばサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)
またはピキア・パストリス(Pichia pastoris))、哺乳類細胞(例えばCOSI
、NIH3T3、またはJEG3細胞)、節足動物細胞(例えばスポドプテラ・
フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)(SF9)細胞)、および植物細胞が挙
げられる。好ましい発現系としては大腸菌のような原核生物宿主がある。当業者
には細菌および真核生物細胞は商業的供給者をはじめいくつかの異なる供給者、
例えばAmerican Type Culture Collection (ATCC; Rockville, Maryland)から入
手可能である。組換えタンパク質発現に用いる細胞の商業的供給者は細胞の使用
説明書も提供する。
ば、特定の脂質化形態(lipidated form)または他のいずれかの形で本発明のポリ
ヌクレオチドを生産するのが有用であると考えられる。
を等しく十分に発現するとは考えられないことは当業者には容易に理解されるで
あろう。しかしながら、下記の指針により、過度な実験を行うことなく、かつ本
発明の範囲を逸脱することなく、ベクター、発現制御配列および宿主が選択でき
よう。
と適合する宿主を選択する必要がある。ベクターコピー数、コピー数を調節する
能力、抗生物質耐性などの他のタンパク質の発現が考慮される。発現制御配列を
選択する場合、いくつかの変数が考慮される。重要な変数には配列の相対強度(
例えば、種々の条件下において発現を駆動する能力)、配列の機能を調節する能
力、発現されるポリヌクレオチドと制御配列間の適合性(例えば二次構造は効率
的な転写を妨げるヘアピン構造を回避すると考えられる)がある。宿主を選択す
る場合、所望のコンホメーションで産物を発現でき、スケールアップが容易で、
さらにそれが最終産物の精製を容易にすることが望むならば、選択されたベクタ
ーと適合し、発現産物のいずれかの起こりうる有毒作用に耐性であり、発現産物
を効率的に分泌できる単細胞宿主を選択する。
される宿主系にもよっても異なる。典型的には発現カセットは選択された宿主系
において機能し得るものであり、かつ構成的または誘導性であり得るプロモータ
ー;リボソーム結合部位;要すれば開始コドン(ATG);シグナルペプチド、
例えば脂質化(lipidation)シグナルペプチドをコードする領域;本発明のDNA
分子;停止コドン;および所望により3’末端領域(翻訳および/または転写タ
ーミネーター)を含む。シグナルペプチドコード領域は本発明のポリヌクレオチ
ドに隣接し、適当なリーディングフレームに存在する。シグナルペプチドコード
領域は成熟ポリペプチドをコードするDNA分子と相同または異種であり、発現
に用いられる宿主の分泌機構と適合する。本発明のDNA分子により単独または
シグナルペプチドとともに構成されるリーディングフレームは転写および翻訳が
宿主系において起こるようにプロモーターの制御下に置かれる。プロモーターお
よびシグナルペプチドコード領域は広く知られており、当業者ならば入手可能で
ある。例えばアラビノースにより誘導可能であり(プロモーターaraB)かつ
大腸菌などのグラム陰性菌において機能し得る、ネズミチフス菌(Salmonella ty phimurium )(および誘導体)のプロモーター(米国特許第5,028,530号お
よびCagnon et al., (Cagnon et al., Protein Engineering (1991) 4(7):843)
に記載);T7ポリメラーゼを発現する数多くの大腸菌株において機能し得る、
RNAポリメラーゼをコードするバクテリオファージT7遺伝子のプロモーター
(米国特許第4,952,496号に記載);OspA脂質化シグナルペプチド;
およびRlpB脂質化シグナルペプチド(Takase et al., J. Bact. (1987) 169:
5692)が挙げられる。
ベクターの一部である。発現ベクター(例えばプラスミドまたはウイルスベクタ
ー)は、例えばPouwels et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual 1985,
Supp. 1987)に記載されるものから選択することができる。好適な発現ベクター
は商業的供給者から購入することができる。
では十分に公知であり、Ausubel et al., (Ausubel et al., Current Protocols
in Molecular Biology, John Wily & Sons Inc., 1994)に記載されるように選
択した宿主系によって異なる。
され細胞内コンパートメントに留まり、細胞外媒質または原形質膜空間に分泌/
放出されるか、または細胞膜に埋め込まれる。ポリペプチドは組換え細胞培養物
の遠心分離後の細胞抽出物からまたは上清から実質的に精製された形で回収され
る。典型的には組換えポリペプチドは抗体に基づくアフィニティー精製により、
またはポリペプチドまたはその誘導体をコードするポリヌクレオチドとアフィニ
ティー結合小ドメインとの融合などの当業者によって容易に適合できる十分に公
知な他の方法により精製する。本発明のポリペプチドを免疫アフィニティーによ
り精製するのに有用な抗体は下記のようにして得られる。
ヒクル(生ワクチンベクター)としてウイルスまたは細菌宿主を用いるか、また
は遺伝子を遊離型で、例えばプラスミドに挿入して投与するかの2つの主要な経
路がある。本発明のポリヌクレオチドの治療または予防効力は下記のようにして
評価される。
下に置かれた本発明のDNA分子を含有するポックスウイルスなどのワクチンベ
クター;(ii)本発明のワクチンベクターとともに希釈剤または担体を含んでな
る材料の組成物;とりわけ(iii)治療または予防上有効な量の本発明のワクチ
ンベクターを含有する医薬組成物;(iv)哺乳類に免疫原性上有効な量の本発明
のワクチンベクターを投与してクラミジアに対する感染防御または治療免疫応答
を誘導することを含む、哺乳類(例えばヒト)のクラミジアに対する免疫応答を
誘導する方法;またこの方法は動物(例えばネコまたは鳥)のクラミジア感染症
を治療または予防する獣医学的適用に用いることができる;さらに詳しくは(v
)感染した個体に予防または治療量の本発明のワクチンベクターを投与すること
を含む、クラミジア(例えばC.トラチョマチス(C. trachomatis)、C.プシタ
チ(C. psittaci)、肺炎クラミジア、C.ペコラム(C. pecorum))感染症を予防
および/または治療する方法が提供される。さらに本発明の第三の態様によれば
、クラミジア感染症を予防および/または治療する医薬の製造における本発明の
ワクチンベクターの使用が含まれる。
プチドまたは誘導体を発現する。ワクチンベクターはさらに免疫応答を増大する
(アジュバント効果)インターロイキン−2(IL−2)またはインターロイキ
ン−12(IL−12)などのサイトカインを発現すると考えられる。発現され
る各成分が哺乳類細胞における発現に必要なエレメントの制御下に置かれている
ことは明らかである。
は誘導体を発現し得るいくつかのワクチンベクターを含んでなる。組成物はまた
付加的なクラミジア抗原、またはそのサブユニット、断片、相同体、変異体もし
くは誘導体;または必要に応じてIL−2もしくはIL−12などのサイトカイ
ンと共に、または該サイトカインをを発現し得るワクチンベクターを含んでなっ
てもよい。
的な経路により、特に粘膜(例えば目、鼻腔内、口腔、胃、肺、腸、直腸、膣、
または尿管)表面にまたは非経口(例えば皮下、皮内、筋肉内、静脈内、または
腹膜内)経路により投与される本発明のワクチンベクターの使用を含んでなる。
好ましい経路はワクチンベクターの選択による。1回の投与で治療を果たしても
よいし、または間隔をおいて反復してもよい。好適な用量は当業者に理解されて
いる、ワクチンベクター自体、投与経路または予防接種する哺乳類の条件(重量
、年齢など)といった種々のパラメーターによって異なる。
クスウイルスなどのウイルスベクター、ならびに細菌ベクター(例えば赤痢菌属
(Shigella)、サルモネラ菌(Salmonella)、コレラ菌(Vibrio cholerae)、乳酸桿
菌(Lactobacillus)、カルメットーゲラン菌(Bacille bilie de Calmette-Guerin
)(BCG)、および連鎖球菌(Streptococcus))が挙げられる。
ウイルスベクターの構築方法が米国特許第4,920,209号に記載されてい
る。ポックスウイルスベクターにはワクシニアおよびカナリヤポックスウイルス
があり、それぞれ米国特許第4,722,848号および米国特許第5,364,7
73号に記載されている。例えばワクシニアウイルスベクターの記載はTartagli
a et al., Virology (1992) 188:217、カナリヤポックスの参照文献はTaylor et
al. Vaccine (1995) 13:539も参照。哺乳類細胞における発現に好適な条件下で
本発明のポリヌクレオチドをウイルスゲノムに挿入するために、本発明のポリヌ
クレオチドを発現し得るポックスウイルスベクターをKieny et al., Nature (19
84) 312:163に記載される相同組換えにより得る。一般に治療または予防に使用
するワクチンウイルスベクターの用量はキログラム当たりのプラーク形成単位が
、約1×104〜約1×1011、有利には約1×107〜約1×1010、好
ましくは約1×107〜約1×109であってよい。好ましくは、ウイルスベク
ターを、例えば4週間おきに3回で、非経口投与する。本発明のウイルスベクタ
ーを含有する組成物に化学アジュバントを加えることを避け、それによってウイ
ルスベクター自身に対する免疫応答を最小にすることが好ましい。
s et al., Nature (1983) 306:551および米国特許第4,882,278号では
、機能し得るコレラ毒素が生産されないように欠失させた、2つのctxA対立
遺伝子それぞれの実在する量のコード配列を有する株が記載されている。WO9
2/11354では、変異(この変異を単一株においてctxA変異と組み合わ
せてもよい)によりirgA遺伝子座を不活性化した株が記載されている。WO
94/01533では、機能し得るctxAおよびattRS1 DNA配列を
欠いた欠失変異体が記載されている。WO94/19482に記載されるように
、これらの変異株を遺伝子操作して非対応抗原を発現させる。本発明のDNA分
子によりコードされるポリペプチドまたはポリペプチド誘導体を発現し得るコレ
ラ菌株の有効なワクチン用量は、選択された投与経路に適した用量中の生存細菌
数、約1×105〜約1×109、好ましくは約1×106〜約1×108を含
有する。好ましい投与経路としてはあらゆる粘膜経路が挙げられ、最も好ましく
はこれらのベクターは鼻腔内または経口投与される。
菌株、および経口ワクチンとしてのそれらの使用は、Nakayama et al. (Bio/Tec
hnology (1988) 6:693)およびWO92/11361に記載されている。 好ましい投与経路としてはあらゆる粘膜経路が挙げられ、最も好ましくはこれ
らのベクターは鼻腔内または経口投与される。
., EMBO (1992) 11:1991およびSizemore et al., Science (1995) 270:299(フ
レクスナー赤痢菌(Shigella flexneri)); Medaglini et al., Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA (1995) 92:6868(ストレプトコッカス・ゴルドニー(Streptococcus gordonii))、Flynn J. L., Cell. Mol. Biol. (1994) 40 (suppl. I): 31(Ba
cille Calmette Guerin)、WO88/06626、WO90/00594、W
O91/13157、WO92/01796、およびWO92/21376(カ
ルメットーゲラン菌)に記載されている。
は遊離状態でプラスミドの一部として残す。
有してもよい。いくつかのアジュバントが当業者に公知である。好ましいアジュ
バントは以下に挙げるように選択される。
もに希釈剤または担体を含んでなる材料の組成物;(ii)治療または予防上有効
な量の本発明のポリヌクレオチドを含有する医薬組成物;(iii)免疫原性上有
効な量の本発明のポリヌクレオチドを投与してクラミジアに対する感染防御免疫
応答を誘導することにより哺乳類のクラミジアに対する免疫応答を誘導する方法
;さらに詳しくは(iv)感染した個体に予防または治療量の本発明のポリヌクレ
オチドを投与することにより、クラミジア(例えばC.トラチョマチス、C.プ
シタチ、肺炎クラミジア、またはC.ペコラム)感染症を予防および/または治
療する方法が提供される。さらに本発明の第四の態様によれば、クラミジア感染
症を予防および/または治療する医薬の製造における本発明のポリヌクレオチド
の使用が含まれる。好ましい使用には哺乳類細胞における、特に哺乳類細胞にお
いて複製できず、かつ哺乳類ゲノムに実質的に組み込むことのできないプラスミ
ドにおける発現の条件下に置かれたDNA分子の使用が挙げられる。
クチンとしての投与が挙げられる。かかるポリヌクレオチドは哺乳類細胞におい
て複製できず、かつ哺乳類ゲノムに組み込むことのできないプラスミドの一部と
してDNAの形で用いられる。典型的には、かかるDNA分子は哺乳類細胞の発
現に好適なプロモーターの制御下に置かれる。プロモーターは遍在して、または
組織特異的のいずれかで機能する。非組織特異的プロモーターの例としては、初
期サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター(米国特許第4,168,062
号に記載される)およびラウス肉腫ウイルスプロモーター(Norton & Coffin, M
olec. Cell Biol. (1985) 5:281に記載される)が挙げられる。組織特異的プロ
モーターの例としては、筋肉細胞における発現を駆動するデスミンプロモーター
(Li et al., Gene (1989) 78:243、Li & Paulin, J. Biol. Chem. (1991) 266:
6562およびLi & Paulin, J. Biol. Chem. (1993) 268:10403に記載される)であ
る。プロモーターの使用については当業者は十分に公知である。有用なベクター
は多くの公報、特にWO94/21797およびMartikka et al., Human Gene
Therapy (1996) 7: 1205で記載されている。
の前駆体または成熟型のいずれかをコードする。前駆体型ではシグナルペプチド
は相同または異種のいずれかである。後者の場合、組織型プラスミノゲン因子(
tPA)のリーダー配列などの真核生物リーダー配列が好ましい。
とともに所望によりウレアーゼサブユニットA、Bもしくはその両方などの別の
クラミジア抗原、またはその断片、誘導体、変異体もしくは類似体をコードする
少なくとも一つの付加的なポリヌクレオチドを含有する。また組成物は免疫応答
を増強するためにインターロイキン−2(IL−2)またはインターロイキン−
12(IL−12)などのサイトカインをコードする付加的なポリヌクレオチド
を含有してもよい。これらの付加的なポリヌクレオチドは発現に好適な制御下に
置かれている。
は同じプラスミドに存在することが有利である。
ドの調製および精製標準手法を用いる。ワクチンとして用いるための本発明のポ
リヌクレオチドは以下に概略を記した種々の方法により処方される。
で使用される。かかるポリヌクレオチドは単に滅菌生理食塩水または滅菌緩衝溶
液などの生理学上許容される溶液に、担体を用いてまたは用いずに希釈する。担
体が存在する場合には、担体が等張性、低張性、または弱高張性であることが好
ましく、スクロース溶液、例えば20%スクロース含有溶液により得られるよう
な比較的低いイオン強度を有する。
。かかる薬剤の例は(i)ブピバカインなどの細胞透過性を改変する化学物質(
例えばWO94/16737参照)、(ii)ポリヌクレオチドをカプセル封入す
るリポソーム、または(iii)それ自身がポリヌクレオチドと結合する陽イオン
脂質またはシリカ、金、もしくはタングステン微粒子である。
ポソーム作製方法の詳細な説明に関する、Liposomes: A Practical Approach, R
pc New Ed, IRL press (1990)参照)、ポリヌクレオチドをはじめとする広範囲
の産物を送達するのに有用である。陽イオン脂質もまた当技術分野では公知であ
り、遺伝子送達には常用されている。かかる脂質には、DOTMA(N−[1−
(2,3−ジオレイルオキシ)プロピル]−N,N,N−トリメチルアンモニウ
ムクロリド)としても知られるリポフェクチン(商標)、DOTAP(1,2−
ビス(オレイルオキシ)−3−(トリメチルアンモニオ)プロパン)、DDAB
(ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド)、DOGS(ジオクタデシル
アミドログリシルスペルミン)およびDC−Chol(3β−(N−(N’、N
’−ジメチルアミノメタン)−カルバモイル)コレステロール)などのコレステ
ロール誘導体が挙げられる。これらの陽イオン脂質の記載はEP187,702
、WO90/11092、米国特許第5,283,185号、WO91/1550
1、WO95/26356、および米国特許第5,527,928号に見出すこと
ができる。遺伝子送達用の陽イオン脂質は、例えばWO90/11092に記載
されるようにDOPE(ジオレイルホスファチジルエタノールアミン)のような
中性脂質と結合させて用いることが好ましい。
進化合物を含有してもよい。それらの多くはWO93/18759、WO93/
19768、WO94/25608、およびWO95/2397に記載されてい
る。それらには核膜を通るDNAの輸送を促進するのに有用なスペルミン誘導体
(例えばWO93/18759参照)およびGALA、グラミシジンS、ならび
に陽イオン胆汁酸塩などの膜透過性化合物(例えばWO93/19768参照)
が挙げられる。
、およびTang et al. (Nature (1992) 356:152)に記載されるように遺伝子送達
に用いられる。米国特許第4,945,050号、米国特許第5,015,580号
、およびWO94/24263に記載されるもののように、微粒子で被覆したポ
リヌクレオチドを無針注入装置(「遺伝子銃」)を用いて皮内または表皮内経路
で注入する。
の強さ、発現遺伝子産物の免疫原性、投与をしようとする哺乳類の条件(例えば
哺乳類の体重、齢、および全身の健康状態)、投与様式、および剤型による。一
般に、治療または予防上有効な量、約1μg〜約1mg、好ましくは約10μg
〜約800μg、およびさらに好ましくは約25μg〜約250μgをヒト成人
に投与してもよい。1回の投与で投与を果たしてもよいし、または間隔をおいて
反復してもよい。
な指針として、本発明のポリヌクレオチドは粘膜表面、例えば目、鼻腔内、肺、
口腔、腸、直腸、膣、および尿管表面により;または非経口経路、例えば静脈内
、皮下、腹膜内、皮内、表皮内、または筋肉内経路により投与する。投与経路の
選択は選択される製剤による。ブピバカインと結合させて処方したポリヌクレオ
チドは筋肉投与が有利である。中性もしくは陰イオンリポソームまたはDOTM
AまたはDC−Cholなどの陽イオン脂質を用いる場合、製剤は静脈内、鼻腔
内(エアゾル化)、筋肉内、皮内、および皮下経路により注入することが有利で
あろう。裸の形態のポリヌクレオチドは筋肉内、皮内、または皮下経路により投
与することが有利であろう。
。もしそうであれば、アジュバント作用を示すために同時投与する必要のない浸
透性アジュバント、例えば米国特許第5,057,546号に記載されるQS21
などが好ましい。
ーブおよびプライマーの設計が可能になる。従って、本発明の第五の態様によれ
ば、配列番号1に示される配列の遺伝子コードの縮重で見られる、または縮重に
より誘導された配列を有するヌクレオチドプローブまたはプライマーが提供され
る。
条件下で、配列番号1を有する核酸分子と、または配列番号1と相同な配列と、
またはその相補もしくはアンチセンス配列とハイブリダイズするDNA(好まし
くは一本鎖)またはRNA分子(または改変体もしくはその組合せ)をいう。一
般に、プローブは全長配列よりかなり短い。かかるプローブは約5〜約100個
、好ましくは約10〜約80個のヌクレオチドを含有する。特にプローブは配列
番号1の一部と少なくとも75%、好ましくは少なくとも85%、さらに好まし
くは95%相同である、またはかかる配列と相補的である配列を有する。プロー
ブはイノシン、メチル−5−デオキシシチジン、デオキシウリジン、ジメチルア
ミノ−5−デオキシウリジン、またはジアミノ−2,6−プリンなどの改変塩基
を含有してもよい。糖またはリン酸残基も改変または置換してもよい。例えばデ
オキシリボース残基をポリアミドで置き換えてもよく(Nielsen et al., Science
(1991) 254:1497)、リン酸残基をジホスフェート、アルキル、アリールホスホ
ネートおよびホスホロチオエートエステルなどのエステル基で置き換えてもよい
。さらにリボヌクレオチドの2’−ヒドロキシ基をアルキル基のような官能基な
どで改変してもよい。
宜にはかかる捕捉プローブは共有結合手段によりまたは受動的吸着により固相支
持体に直接的または間接的に固定する。検出プローブは放射性同位元素、ペルオ
キシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、ならびに発色性、蛍光性、または発光
性基質を加水分解し得る酵素、発色性、蛍光性、または発光性化合物、ヌクレオ
チド塩基類似体、およびビオチンから選択される検出マーカーで標識する。
A Laboratory Manual (1982) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Sp
ring Habor, New York)、サザンブロット法(Southern, J. Mol. Biol. (1975) 9
8:503)、ノーザンブロット法(RNAを標的として用いることを除いて、サザン
ブロットと同じ)、またはサンドイッチ手法(Dunn et al., Cell (1977) 12:23)
などのいずれの通常のハイブリダイゼーション手法にも用いてよい。後の手法で
は互いに少なくとも部分的に異なるヌクレオチド配列を有する特異的な捕捉プロ
ーブおよび/または特異的な検出プローブの使用が含まれる。
における酵素的DNA重合を開始するのに用いる、通常約10〜約40個のヌク
レオチドのプローブである。PCRをはじめとする診断法に用いるプライマーを
当技術分野で公知な方法で標識する。
てクラミジアの存在を検出および/または同定する本発明のプローブを含んでな
る試薬;(ii)(a)該生物学的材料からサンプルを採取または誘導し、(b)
該材料からDNAまたはRNAを抽出して変性させ、さらに(c)ストリンジェ
ントハイブリダイゼーション条件下で、ハイブリダイゼーションが検出されるよ
うに本発明のプローブ、例えば捕捉、検出プローブもしくはその両方に曝す、生
物学的材料においてクラミジアの存在を検出および/または同定する方法;およ
び(iii)(a)該生物学的材料からサンプルを採取または誘導し、(b)そこ
からDNAを抽出し、(c)抽出したDNAに少なくとも1つ、および好ましく
は2つの本発明のプライマーを提供してポリメラーゼ鎖反応により増幅し、さら
に(d)増幅したDNA断片を生産する、生物学的材料においてクラミジアの存
在を検出および/または同定する方法も包含する。
によりそれらの対応するアミノ酸配列が使用可能になることは明らかである。従
って本発明の第六の態様によれば、本発明のポリヌクレオチドによりコードされ
るアミノ酸配列を有する、実質的に精製されたポリペプチドまたはポリペプチド
誘導体が提供される。
然に存在する環境から選別されたポリヌクレオチド、および/またはそれが合成
される環境に存在する多数のポリヌクレオチドから遊離したポリペプチドと定義
される。例えば、実質的に精製されたポリペプチドは細胞質ポリペプチドから遊
離したものである。本発明のポリペプチドが天然源、すなわちクラミジア株から
精製され得る、または組換え手段により生産され得ることは当業者には容易に理
解されよう。
に対する感染防御をすると考えられる標的動物において、その免疫原性を向上さ
せるために改変されたまたは処理されたポリペプチド、相同体または断片が提供
される。かかる改変または処理には:3−メチルヒスチジン、4−ヒドロキシプ
ロリン、5−ヒドロキシリジンなどのアミノ酸誘導体によるアミノ酸置換、アミ
ノ酸の遊離アミノ、カルボキシルまたはヒドロキシル側基の改変などのポリペプ
チド、相同体または断片の調整後に行われる改変または欠失が挙げられる。
ペプチドまたはポリペプチド誘導体の同定は、配列番号1のアミノ酸配列を有す
る参照ポリペプチドに対して作製した抗血清との交差反応性によるスクリーニン
グにより達成される。の手順は次の通りである:単一特異性高度免疫抗血清を、
精製参照ポリペプチド、融合ポリペプチド(例えばMBP、GST、またはHi
s−tag系の発現産物、その使用に関する記載および説明についてはpcDN
A3.1/Myc−His(+)A、BおよびCに関する、またXpress(
商標)系タンパク質精製に関するInvitrogen製品マニュアルに含まれている)、
または抗原性であると推測される合成ペプチドに対して作製する。抗血清を融合
ポリペプチドに対して作製する場合、2つの異なる融合系を使用する。特異性抗
原性は以下のようにウエスタンブロット法(Towbin et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA (1979) 76:4350)、ドットブロット法、およびELISA法などのいく
つかの方法により求めることができる。
は大腸菌全抽出物のいずれかとして、Laemmli(Nature (1970) 227:680)により記
載されたSDS−PAGE電気泳動法に付す。ニトロセルロース膜に移した後、
この材料を約1:5〜約1:5000、好ましくは約1:100〜約1:500
の希釈範囲で、希釈した単一特異性高度免疫抗血清とともにさらにインキュベー
トする。その産物に対応する一つのバンドが上記の希釈範囲のいずれかで反応性
を呈すれば、特異的抗原性が示される。
ましい。全細胞抽出物を用いてもよいが、精製調製物が好ましい。要するに、約
10μgタンパク質/mlの調製物約100μlを96−ウェルポリカーボネー
トELISAプレートに分注する。このプレートを37℃で2時間、次いで4℃
で一晩インキュベートする。プレートを0.05%Tween20含有リン酸緩
衝生理食塩水(PBS)(PBS/Tweenバッファー)で洗浄する。ウェル
を1%ウシ血清アルブミン(BSA)含有PBS250μlで飽和させ、非特異
的抗体結合を妨げる。37℃で1時間インキュベーションした後、プレートをP
BS/Tweenバッファーで洗浄する。抗血清は0.5%BSA含有PBS/
Tweenバッファーで連続的に希釈する。各ウェルに希釈物100μlを加え
る。プレートを37℃で90分間インキュベートし、洗浄して標準法により評価
する。例えば、特異的抗体をウサギで生産した場合、ヤギ抗ウサギペルオキシダ
ーゼ複合体をウェルに加える。インキュベーションを37℃で90分間で行い、
プレートを洗浄する。適当な基質により反応物を顕出させ、この反応物を比色定
量(分光光度計により測定された吸光度)により測定する。上記の試験条件下で
、O.D.値が非免疫対照血清より大きい場合に陽性反応を示す。
。要するに、約100μg/mlの産物の溶液を50mM Tris−HCl(
pH7.5)で連続的に2倍希釈する。各希釈物100μlを96−ウェルドッ
トブロット装置(Biorad)にセットしたニトロセルロース膜0.45μmに塗布す
る。系を減圧してバッファーを除去する。50mM Tris−HCl(pH7
.5)を加えてウェルを洗浄し、膜を風乾する。膜をブロッキングバッファー(
50mM Tris−HCl(pH7.5)、0.15M NaCl、10g/
L脱脂乳)で飽和させ、約1:50〜約1:5000、好ましくは約1:500
の抗血清希釈物とともにインキュベートする。反応物を標準手順により調べる。
例えば、ウサギ抗体を用いる場合、ヤギ抗ウサギペルオキシダーゼ複合体をウェ
ルに加える。インキュベーションを37℃で90分間で行い、ブロットを洗浄す
る。適当な基質により反応物を顕出させて停止させる。この反応物を発色スポッ
トの様子から、例えば比色定量により視覚的に測定する。上記の試験条件下で、
発色スポットが少なくとも約1:5、好ましくは少なくとも約1:500の希釈
物と結合する場合に陽性反応を示す。
できる。本発明の第七の態様によれば、(i)本発明のポリペプチドとともに希
釈剤または担体を含んでなる材料の組成物;とりわけ(ii)治療または予防上有
効な量の本発明のポリペプチドを含有する医薬組成物;(iii)免疫上有効な量
の本発明のポリペプチドを哺乳類に投与してクラミジアに対する感染防御免疫応
答を誘導することにより哺乳類のクラミジアに対する免疫応答を誘導する方法;
さらに詳しくは(iv)感染した個体に予防または治療量の本発明のポリペプチド
を投与することにより、クラミジア(例えばC.トラチョマチス、C.プシタチ
、肺炎クラミジア、またはC.ペコラム)感染症を予防および/または治療する
方法が提供される。さらに本発明の第七の態様によれば、クラミジア感染症を予
防および/または治療する医薬の製造における本発明のポリペプチドの使用が含
まれる。
経路、特に粘膜(例えば目、鼻腔内、肺、口腔、胃、腸、直腸、膣、または尿管
)表面にまたは非経口(例えば皮下、皮内、筋肉内、静脈内、または腹膜内)経
路により投与する。投与経路の選択はポリペプチドと結合したアジュバントなど
のいくつかのパラメーターによる。粘膜アジュバントを用いる場合には鼻腔内ま
たは口腔経路が好ましい。脂質処方またはアルミニウム化合物を用いる場合には
非経口経路が好ましく、皮下または筋肉内経路が最も好ましい。この選択もまた
ワクチン薬剤の性質による。例えば、CTBまたはLTBと融合した本発明のポ
リペプチドは粘膜表面に投与することが最もよい。
チドまたは誘導体を含有する。所望により組成物は少なくとも一つの付加的なク
ラミジア抗原、またはそのサブユニット、断片、相同体、変異体もしくは誘導体
を含有してもよい。
ム、好ましくは中性または陰イオンリポソーム、ミクロスフェア、ISCOMS
、またはウイルス様粒子(VLP)中にまたはそれとともに処方して、送達を促
進および/または免疫応答を増強する。当業者はこれらの化合物を容易に入手で
きる;例えばLiposomes: A Practical Approach,RCP New Ed, IRL press(1990)
参照。
アジュバントは抗原を局所デポジットに封鎖することにより、それを急速な分散
から守る、またはそれらは宿主を刺激して免疫系のマクロファージまたは他の成
分に対し化学走性である因子を分泌する物質を含有すると考えられる。一般的に
は当業者によって、例えば以下に記載されるもの(本発明の第11の態様に基づ
くもの)から適当な選択がなされるであろう。
たは必要に応じて間隔をおいて反復してもよい。例えば、開始用量の後、週単位
または1ヶ月単位の間隔をおいて3回の追加免疫抗原投与を続ける。好適な用量
は当業者には容易に決定できるが、受容者(例えば成人または小児)、個々のワ
クチン抗原、投与経路または頻度、アジュバントの有無またはタイプ、および所
望の効果(例えば感染防御および/または治療)を含む種々のパラメーターによ
って異なる。一般に、本発明のワクチン抗原を粘膜経路によって約10μg〜約
500mg、好ましくは約1mg〜約200mgの量を投与する。投与が非経口
経路の場合、通常用量は約1mg、好ましくは約100μgの限度を超えない。
ドを多段階免疫化プロセスの要素として連続的に用いてもよい。例えば、まず哺
乳類にポックスウイルスなどの本発明のワクチンベクターを、例えば非経口経路
によりに注入し、次いでワクチンベクターによりコードされるポリペプチドで2
回、例えば粘膜経路により追加免疫抗原を加える。また別の例では本発明のポリ
ペプチドまたは誘導体と結合したリポソームを開始に用い、粘膜アジュバント(
例えばLT)と組み合わせた本発明の可溶性ポリペプチドまたは誘導体を用いて
粘膜により追加免疫抗原刺激を行う。
液サンプルにおいて抗クラミジア抗体の存在を検出する診断試薬として用いられ
る。かかるポリペプチドの長さは約5〜約80個、好ましくは約10〜約50個
のアミノ酸である。診断方法により、それらを標識するまたは標識しないのいず
れかである。かかる試薬を含む診断方法を以下に記載する。
たはポリペプチド誘導体を生産し精製する。以下に記載されるように、ポリペプ
チドまたはポリペプチド誘導体は精製を促進する融合テールを有した融合タンパ
ク質として生産される。融合産物を用いて小型哺乳類、例えばマウスまたはウサ
ギを免疫化し、ポリペプチドまたはポリペプチド誘導体に対する抗体(単一特異
性抗体)を作製する。よって本発明の第八の態様によれば、本発明のポリペプチ
ドまたはポリペプチド誘導体と結合する単一特異性抗体が提供される。
し得る抗体を意味する。本発明の抗体はポリクローナルまたはモノクローナル抗
体のいずれかである。単一特異性抗体は組換え体、例えばキメラ(例えば、ヒト
不変部と結合したネズミ由来の可変部により構成された)、ヒト化型(動物、例
えばネズミ由来の超可変部とともにあるヒト免疫グロブリン不変主鎖)および/
または一本鎖であってよい。ポリクローナルおよび単一特異性抗体は双方とも免
疫グロブリン断片、例えばF(ab)’2またはFabフラグメントの形であっ
てもよい。本発明の抗体はいずれのイソ型のもの、例えばIgGまたはIgAで
あってよいが、ポリクローナル抗体は単一イソ型またはイソ型の混合物ある。
相同体または断片を含んでなる組成物による哺乳類の免疫化により産生される。
かかる抗体はポリクローナルまたはモノクローナル抗体であってよい。ポリクロ
ーナルまたはモノクローナル抗体の産生方法は当技術分野では十分に公知である
。例えば、"Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laborator
y, Eds. E. Harlow and D. Lane (1988)、およびD. E. Yelton et al., 1981. A
nn. Rev. Biochem. 50: 657-680参照。モノクローナル抗体についてはKohl and
Milstein (1975) Nature 256:495-497参照。
抗体を標準免疫学的アッセイ法、例えばウエスタンブロット解析法、ドットブロ
ットアッセイ法、またはELISA法(例えばColigan et al., Current Protoco
ls in Immunology (1994) John Wiley & Sons, Inc., New York, NY参照)を用い
て作製して同定する。抗体は生物学的サンプルなどのサンプルにおいてクラミジ
ア抗原の存在を検出する診断法に用いられる。また抗体は本発明のポリペプチド
またはポリペプチド誘導体を精製するアフィニティークロマトグラフィーにも用
いられる。以下でさらに考察するように、かかる抗体を予防および治療的受動的
免疫化方法に用いてもよい。
たはポリペプチド誘導体を含有する生物学的サンプルにおいてクラミジアの存在
を検出する試薬;および(ii)免疫複合体が形成されるように生物学的サンプル
と本発明の抗体、ポリペプチド、またはポリペプチド誘導体とを接触させて、か
かる複合体を検出してサンプルまたはサンプルが誘導される生物体においてクラ
ミジアの存在を示すことにより、生物学的サンプルにおいてクラミジアの存在を
検出する方法が提供される。
またはポリペプチド誘導体とで形成されること、および結合していない材料がい
ずれも複合体の検出前に除去されることは当業者には容易に理解されるであろう
。ポリペプチド試薬がサンプル、例えば血液サンプルにおいて抗クラミジア抗体
の存在を検出するのに有用であり、本発明の抗体が胃抽出物または生検などのサ
ンプルをクラミジアポリペプチドの存在についてスクリーニングするのに有用で
あることは明らかである。
チド誘導体)は遊離状態にあるか、またはチューブ、ビーズ、または当分野にお
いて用いられるいずれかの他の通常の支持体などの固相支持体に固定されている
かである。固定は直接的または間接的手段によりなし遂げられる。直接的手段と
しては受動的吸着(非共有結合)または支持体と試薬との共有結合が挙げられる
。「間接的手段」とは試薬と相互作用する抗試薬化合物が固相支持体に最初に付
着することを意味する。例えば、ポリペプチド試薬を用いる場合に、それが生物
学的サンプルにおいて抗体の認識に関係していないエピトープと結合するのであ
れば、それに結合する抗体が抗試薬として作用し得る。間接的手段にはまた、例
えばビタミンなどの分子がポリペプチド試薬に接合され、その対応する受容体が
固相に固定されるリガンド−受容体系も用いられる。これはビオチン−ストレプ
トアビジン系によって例示される。あるいは、ペプチドテールを化学的にまたは
遺伝子操作により試薬に加え、接合または融合された産物をペプチドテールの受
動的吸着または共有結合により固定する。
薬はそれがその標的と結合した場合に試薬の検出がなされる検出手段によって標
識される。検出手段はフルオレセインイソシアネートまたはフルオレセインイソ
チオシアネートなどの蛍光剤、またはセイヨウワサビペルオキシダーゼもしくは
ルシフェラーゼ、またはアルカリ性ホスファターゼなどの酵素、または125I
または51Crなどの放射性元素であってよい。
一特異性抗体に基づくアフィニティークロマトグラフィーを行うことを含む、生
物学的サンプルから、本発明のポリペプチドまたはポリペプチド誘導体を精製す
る方法が提供される。
抗体のいずれか、および好ましくはIgG型である。精製IgGは常法により抗
血清から調製する(Coligan et al., Current Protocols in Immunology (1994)
John Wiley & Sons, Inc., New York, NY.)。一般的なクロマトグラフィー支持
体、ならびに抗体を接合する標準方法については、例えばAntibodies: A Labora
tory Manual, D. Lane, E. Harlow, Eds. (1988)に記載されている。以下に概略
を記す。
的サンプルを、本発明のポリペプチドまたはポリペプチド誘導体(すなわち抗原
)をクロマトグラフィー材に吸着させるように、好ましくは生物学的サンプルの
希釈に用いるバッファーで平衡化した材料に適用する。本発明の抗体と結合した
ゲルまたは樹脂などのクロマトグラフィー材はバッチ型またはカラムのいずれか
である。結合しない成分を洗い流し、次いで抗原をグリシンバッファー、または
カオトロピック剤、例えばグアニジンHCl、もしくは高塩濃度(例えば、3M
MgCl2)を含有するバッファーなどの好適な溶出バッファーで溶出する。
溶出画分を回収し、例えば280nmにおける吸光度を測定することにより抗原
の存在を検出する。
剤または担体を含んでなる材料の組成物;(ii)治療または予防上有効な量の本
発明の単一特異性抗体を含んでなる医薬組成物;および(iii)感染した個体に
治療または予防量の本発明の単一特異性抗体を投与することにより、クラミジア
(例えばC.トラチョマチス、C.プシタチ、肺炎クラミジア、またはC.ペコ
ラム)感染症を治療または予防する方法が提供される。さらに本発明の第11の
態様によれば、クラミジア感染症を治療または予防する医薬の製造における本発
明の単一特異性抗体の使用が含まれる。
はIgAイソ型のもの(優勢)である。受動的免疫化では抗体を重炭酸バッファ
ーの存在下で哺乳類の粘膜表面、例えば胃粘膜に、例えば経口または胃内投与す
ることが有利である。また全身投与は重炭酸バッファーを用いずに行われる。本
発明の単一特異性抗体を単一有効成分として、または異なるクラミジアポリペプ
チドに対して特異的な少なくとも一つの単一特異性抗体との混合物として投与す
る。用いる抗体量および特定の管理方法は当業者により容易に決定される。大部
分の目的には、例えば抗体約100〜1,000mgを1週間毎日投与、または
抗体約100〜1,000mgを2または3日間1日当たり3回投与が有効な管
理法である。
または感染防御および/または治療的免疫の誘導を、例えば肺炎クラミジアマウ
スモデルを用いて測定することにより評価する。モデルの肺炎クラミジア株を別
のクラミジア株と置き換えてもよいことは当業者に容易に理解されるであろう。
例えば、肺炎クラミジア由来のDNA分子およびポリペプチドの効果は、好まし
くはマウスモデルにおいて肺炎クラミジア株を用いて評価する。感染防御はクラ
ミジア感染症の程度を対照群のものと比較して求める。感染症が対照群に比べて
軽減されている場合に感染防御を示す。本発明のポリヌクレオチド、ワクチンベ
クター、ポリペプチドおよびその誘導体、ならびに抗体に対してかかる評価がな
される。上記のいずれのワクチン組成物においても有用なアジュバントは以下の
通りである。
およびヒドロキシリン酸アルミニウムなどのアルミニウム化合物が挙げられる。
標準プロトコールに従い、抗原をアルミニウム化合物で沈降させる、またはそれ
に吸着させる。RIBI(ImmunoChem, Hamilton, MT)などの他のアジュバントも
非経口投与に用いられる。
毒(LT)、クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)毒Aお
よび百日咳毒(PT)、もしくはその組合せ、サブユニット、変性毒素、または
天然コレラ毒サブユニットB(CTB)の精製製剤などのその変異体が挙げられ
る。これらの毒素のいずれに対する断片、相同体、誘導体、および融合物もアジ
ュバント活性を保有している場合にはそれらもまた適当である。好ましくは弱毒
化した変異体を用いる。好適な変異体は、例えばWO95/17211(Arg
−7−Lys CT変異体)、WO96/06627(Arg−192−Gly
LT変異体)、およびWO95/34323(Arg−9−LysおよびGl
u−129−Gly PT変異体)に記載される。本発明の方法および組成物に
おいて用いられるさらなるLT変異体には、例えばSer−63−Lys、Al
a−69−Gly、Glu−110−Asp、およびGlu−112−Asp変
異体が挙げられる。例えば大腸菌、サルモネラ・ミネソタ(Salmonella minnesot a )、ネズミチフス菌、またはシゲラ・フレクスネリ(Shigella Flexneri)の細菌
モノホスホリル脂質A(MPLA);サポニン、またはポリアクチドグリコリド
(PLGA)ミクロスフェアなどの他のアジュバントも粘膜投与に用いられる。
WO95/02415)、DC−chol(3b−(N−(N’,N’−ジメチ
ルアミノメタン)−カルバモイル)コレステロール;米国特許第5,283,18
5号およびWO96/14831)およびQS−21(WO88/09336)
が挙げられる。
を含有する本発明の医薬組成物は常法で製造される。特に医薬上許容される希釈
剤または担体、例えば水またはリン酸緩衝生理食塩水などの生理食塩水とともに
処方される。一般に希釈剤または担体は投与形ならびに経路、および医薬上の標
準法に基づき選択される。好適な医薬上の担体または希釈剤、ならびに医薬製剤
における使用に医薬上必要不可欠なものは、Remington's Pharmaceutical Scien
ces、当分野における標準的な参照文献およびUSP/NFに記載されている。
生物質、制酸剤、スクラルファート、またはその組合せとを併用した経口投与に
よりクラミジア感染症を治療する方法も含む。ワクチン抗原およびアジュバント
とともに投与し得るかかる化合物の例としては、例えばマクロライド、テトラサ
イクリン、およびその誘導体(用い得る抗生物質の特異例として、アジトロマイ
シンもしくはドキシサイクリンまたはサイトカインもしくはステロイド類などの
免疫調節剤が挙げられる)などの抗生物質がある。さらにともに結合した1種を
超える上記成分を含有する化合物を用いる。本発明はまたこれらの方法を行うた
めの組成物、すなわち医薬上許容される担体または希釈剤中に本発明のクラミジ
ア抗原(または抗体)、アジュバント、および1種以上の上記の化合物を含有す
る組成物も含む。
れているエピトープ、ネズミαミオシン重鎖エピトープM7A−αと交差反応す
る配列を含んでいることが示されている(Bachmaier et al., Science (1999) 28
3:1335)。この交差反応性は心血管疾患の発症の一因であることを示しているの
で、ワクチンとして使用される場合はそのタンパク質からこのエピトープおよび
ヒト抗原と交差反応するその他のエピトープのいずれもを除去するのが有効であ
り得る。従って、本発明のさらなる具体例は、例えばタンパク質をコードするポ
リヌクレオチドからエピトープをコードするヌクレオチドを欠失させるまたは置
換して、ワクチンとしてのタンパク質の有効性と安全性を向上させることでコー
ド配列を改変することを含む。ヒト抗原との望ましくない相同性または交差反応
性を持つことがわかっているいずれの防御抗原に対しても同様のアプローチが適
当であり得る。
者ならば容易に求められる。治療/免疫化計画についても公知であり、当業者に
よって容易に計画される。例えば、非ワクチン成分を1〜14日目に投与して、
ワクチン抗原+アジュバントを7、14、21、および28日目に投与すること
が可能である。
具体的な例により得られる。これらの例は単に例示のために記載されるものであ
って、本発明の範囲を限定しようとするものではない。状況が提案されまたは便
宜となる限り、形態の変更および同等物との置換も考えられる。ここでは特定の
用語が用いられているが、かかる用語は説明を意図したものであって、限定しよ
うとするものではない。
ラスミドベクターpCABk831の調製を示すものである。 omp P6前駆体遺伝子を5’プライマー(5'ATAAGAATGCGGCCGCCACCATGAATAT ACATTCCCTATGGAAAC 3')(配列番号3)および3’プライマー (5'GCGCCGGATCCCGCGTGCATGAATCTTAAACTCTGTACGGC 3')(配列番号4)を用いるポ
リメラーゼ連鎖反応(PCR)によって、肺炎クラミジア・ゲノムDNAから増
幅した。5’プライマーはNotI制限部位、リボゾーム結合部位、開始コドン
、およびomp P6前駆体コード配列の5’末端配列を含む。3’プライマー
はomp P6前駆体のC末端配列をコードする配列およびBamHI制限部位
を含む。停止コドンを除き、さらなるヌクレオチドを挿入してヒスチジンタグと
のフレーム内融合物を得た。 増幅後、QIAquick(商標)PCR精製キット(Qiagen) を用いてPC
R断片を精製し、その後NotIおよびBamHIで消化し、ヒトCMVプロモ
ーターの制御下で転写する例2に記載のpCA−Myc−His真核生物発現ベ
クター(図3)へ挿入した。
IおよびBamHIで制限処理してCMVプロモーターを除去し、残りのベクタ
ー断片を単離した。プラスミドVR−1012(Vical)由来のCMVプロモータ
ーおよびイントロンAをSpeI/BamHI断片上に単離した。これらの断片
を連結してプラスミドpCA/Myc−Hisを作出した。omp P6前駆体
遺伝子を含んだPCR断片をNotI/BamHIで制限処理したものをNot
IおよびBamHIで制限処理したプラスミドpCA/Myc−Hisと連結し
てプラスミドpCABk831を作出した(図3)。
菌XL−1ブルー(Stratagene)へトランスフェクトし、これを50μg/mlの
カルベニシリンを含むLB培地で増殖させた。プラスミドはエンド・フリー・プ
ラスミド・ギガ・キット(商標)(Qiagen)大スケールDNA精製系によって単離
した。DNA濃度は260nmの吸光度で求め、ゲル電気泳動に付して臭化エチ
ジウム染色し、分子量標準と比較してプラスミドを確認した。遺伝子の5’およ
び3’末端はLiCorモデル4000LDNAシーケンサーおよびIRD−8
00標識プライマーを用いた配列決定によって確認した。
疫化を示す。 これまでに、マウスが肺炎クラミジアの種々の単離物による鼻腔内感染に感受
性があることが示されている(Yang et al., Infect. Immun. May 1993.61(5):20
37-40。AR−39株(Grayston et al., (1990) Journal of Infections Disea
ses 161:618-625)は、裸のDNAとして送達されたクラミジア遺伝子産物の致死
下の肺炎クラミジアの肺感染に対する防御応答を誘起する能力を調べるための抗
原投与感染モデルとしてBal/cマウスにおいて用いた。防御免疫は肺感染の
加速化されたクリアランスと定義される。
の肺炎クラミジアomp P6前駆体のコード配列を含むプラスミドDNAで筋
肉内(i.m.)および鼻腔内(i.n.)感作させた。対照個体群には生理食
塩水またはクラミジア遺伝子の挿入物を欠いたプラスミドベクターを与えた。
μgを左、右の四頭筋に交互に注射した。i.n.感作では、0、3および6週
の3回、DNA50μgを含むPBS50μlを麻酔したマウスに吸入させた。
8週目に、致死下の肺炎クラミジア抗原投与の増殖を制限する能力を試験するた
めに、免疫化しマウスにSPGバッファー100μl中の肺炎クラミジアAR3
9株5×105IFUを鼻腔内接種した。
%スクロース、5mMグルタミン酸塩、12.5mMリン酸塩 pH7.5)中
で本発明ホモジネートした。このホモジネートはアッセイまで−70℃で凍結保
存した。ホモジネート希釈物を感受性細胞の単層に接種することで感染性クラミ
ジアの存在に関してアッセイした。この接種物を3000rpmで1時間細胞上
へ遠心分離した後、シクロヘキシミド1μg/mlの存在下で35℃にて3日間
インキュベートした。単層のインキュベーション後、ホルマリンおよびメタノー
ルで固定し、次ぎに肺炎クラミジアおよびペルオキシダーゼ基質として金属で増
強したDABを感染させたウサギからの回復期血清を用いてクラミジア封入体の
存在に対して免疫ペルオキシダーゼ染色した。
ウスの肺のクラミジア力価が、9日目で6例中5例で39,500未満(平均2
4,933)であり、一方、生理食塩水を感作させた偽性の対照マウスの値の範
囲は、9日目で13,500〜178,700IFU/肺(平均69,782)
であった。別のプラスミドDNA構築物のpCABk1106では防御できず、
感作マウスの肺の力価は生理食塩水を感作させた対照マウスで得られたもの(平
均62,516)と同等であったので、DNAの感作自体は認められた防御効果
の一因ではなかった。構築物pCABk1106は推定omp P6前駆体をコ
ードするヌクレオチド配列が非関連推定タンパク質をコードする肺炎クラミジア
ヌクレオチド配列に置換されていること以外はpCABk831と同一である。
号1)およびomp P6前駆体の推定アミノ酸配列(配列番号2)を示す。
す。
肺感染に対する保護免疫応答を誘導するための、DNA免疫措置の使用が報告さ
れている (Zhang et al. 1997. J.Infect.Dis. 76:1035-1040、およびZhang et
al. 1999. Immunology. 96:314-321)。 以下の文献も関連性のあり得るものである:WO99/27105A (GENSET SA; GRIFFA
IS REMY(FR)) 3 June 1999 (1999-06-03) および "Nucreotide sequence of the
complete genome of Chlamiydia pneumoniae" GENESEQ NUCLEIC ACID SEQUENCE
DATABASE, 13 September 1999 (1999-09-03), XP002168446 および "Chlamydia
pneumoniae transmembrane protein sequence" GENESEQ AMINO ACID SEQUENCE
DATABASE, 13 September 1999 (1999-09-13), XP002168447; KALMAN et al.: "P
eptideglycan-associated lipoprotein" SWISSPROT SEQUENCE DATABASE, 1 May
1999 (1999-05-01), XP002168449 および KALMAN et al.: "Comparative genome
s of Chlamydia pneumoniae and C. trachomatis" NATURE GENETICS, vol.21, A
pril 1999 (1999-04), 385-389頁, XP000853883; WO95/12411A; およびWO97/467
09A。
Claims (34)
- 【請求項1】 (a)配列番号2; (b)(a)のポリペプチド由来の少なくとも12個の連続するアミノ酸を含
んでなる免疫原性断片;および (c)その免疫原性を向上させるために改変された(a)または(b)のポリ
ペプチド(この改変ポリペプチドは対応する(a)または(b)のポリペプチド
とアミノ酸配列において少なくとも75%の同一性を有する) のいずれか1つから選択されるポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなる
、核酸分子。 - 【請求項2】 (a)配列番号1; (b)配列番号1によってコードされるポリペプチドをコードする配列; (c)(a)および(b)の核酸配列のいずれか1つに由来する少なくとも3
8個の連続するヌクレオチドを含んでなる配列; (d)配列番号1によってコードされるポリペプチドとアミノ酸配列において
少なくとも75%の同一性を有するポリペプチドをコードする配列 のいずれか1つから選択される核酸配列を含んでなる、核酸分子。 - 【請求項3】 請求項1の核酸分子に対してアンチセンスである核酸配列を含んでなる、核酸
分子。 - 【請求項4】 請求項1に記載の核酸分子によってコードされるポリペプチドと付加的なポリ
ペプチドとを含んでなる融合タンパク質をコードする核酸配列を含んでなる、核
酸分子。 - 【請求項5】 付加的なポリペプチドが異種シグナルペプチドである、請求項4に記載の核酸
分子。 - 【請求項6】 付加的なポリペプチドがアジュバント活性を有する、請求項4に記載の核酸分
子。 - 【請求項7】 1以上の発現制御配列に作動可能に連結された、請求項1〜6のいずれか一項
に記載の核酸分子。 - 【請求項8】 請求項1、2、および4〜7のいずれか一項に記載の少なくとも一つの第一の
核酸とワクチンベクターとを含んでなり(ここで、各々の第一の核酸はポリペプ
チドとして発現する)、所望によりこの第一の核酸によって発現されるポリペプ
チドに対する免疫応答を増強する付加的なポリペプチドをコードする第二の核酸
を含んでなる、ワクチン。 - 【請求項9】 第二の核酸が付加的なクラミジアポリペプチドをコードしている、請求項8に
記載のワクチン。 - 【請求項10】 請求項1〜7のいずれか一項に記載の核酸と医薬上許容される担体とを含んで
なる、医薬組成物。 - 【請求項11】 請求項8または9に記載のワクチンと医薬上許容される担体とを含んでなる、
医薬組成物。 - 【請求項12】 請求項7に記載の核酸分子で形質転換された、単細胞宿主。
- 【請求項13】 ストリンジェント条件下で、配列番号1の核酸分子、またはその核酸分子の相
同体または相補もしくはアンチセンス配列とハイブリダイズする5〜100個の
ヌクレオチドからなる、核酸プローブ。 - 【請求項14】 ストリンジェント条件下で、配列番号1の核酸分子、またはその核酸分子の相
同体または相補もしくはアンチセンス配列とハイブリダイズする10〜40個の
ヌクレオチドからなる、プライマー。 - 【請求項15】 請求項1、2、および4〜7のいずれか一項に記載の核酸配列によってコード
されている、ポリペプチド。 - 【請求項16】 (a)配列番号2; (b)(a)のポリペプチド由来の少なくとも12個の連続するアミノ酸を含
んでなる免疫原性断片;および (c)その免疫原性を向上させるために改変された(a)または(b)のポリ
ペプチド(この改変ポリペプチドは対応する(a)または(b)のポリペプチド
とアミノ酸配列において少なくとも75%の同一性を有する) のいずれか1つから選択されるアミノ酸配列を含んでなる、ポリペプチド。 - 【請求項17】 請求項15または16のポリペプチドと付加的なポリペプチドとを含んでなる
、融合ポリペプチド。 - 【請求項18】 付加的なポリペプチドが異種シグナルペプチドである、請求項17に記載の融
合ポリペプチド。 - 【請求項19】 付加的なポリペプチドがアジュバント活性を有する、請求項17に記載の融合
タンパク質。 - 【請求項20】 請求項15または16のポリペプチドを生産する方法であって、請求項12に
記載の単細胞宿主を培養する工程を含んでなる、方法。 - 【請求項21】 請求項15〜19のいずれか一項に記載のポリペプチドに対する抗体。
- 【請求項22】 請求項15〜19のいずれか一項に記載の少なくとも一つの第一のポリペプチ
ドと医薬上許容される担体とを含んでなり、所望によりこの第一のポリペプチド
に対する免疫応答を増強する第二のポリペプチドを含んでなる、ワクチン。 - 【請求項23】 第二のポリペプチドが付加的なクラミジアポリペプチドを含んでなる、請求項
22に記載のワクチン。 - 【請求項24】 請求項15〜19のいずれか一項に記載のポリペプチドと医薬上許容される担
体とを含んでなる、医薬組成物。 - 【請求項25】 請求項22または23に記載のワクチンと医薬上許容される担体とを含んでな
る、医薬組成物。 - 【請求項26】 請求項21に記載の抗体と医薬上許容される担体とを含んでなる、医薬組成物
。 - 【請求項27】 (a)請求項1〜7のいずれか一項に記載の核酸; (b)請求項8、9、22および23のいずれか一項に記載のワクチン; (c)請求項10、11、24〜26のいずれか一項に記載の医薬組成物; (d)請求項15〜19のいずれか一項に記載のポリペプチド;または (e)請求項21に記載の抗体 を用いて、クラミジア感染症を予防または治療する方法。
- 【請求項28】 (a)請求項1〜7のいずれか一項に記載の核酸; (b)請求項15〜19のいずれか一項に記載のポリペプチド;および (c)請求項21に記載の抗体 のいずれか1つから選択される成分を用いて、試験される哺乳類の体液をアッセ
イする工程を含んでなる、クラミジア感染症の検出方法。 - 【請求項29】 使用説明書と、 (a)請求項1〜7のいずれか一項に記載の核酸; (b)請求項15〜19のいずれか一項に記載のポリペプチド;および (c)請求項21に記載の抗体 のいずれか1つから選択される成分とを含んでなる、診断キット。
- 【請求項30】 予めポリペプチドで免疫化した哺乳類におけるクラミジア感染を予防または軽
減するのに有効な免疫応答を誘導する、請求項15〜19に記載のポリペプチド
を同定する方法であって、 (a)マウスをポリペプチドで免疫化し;さらに (b)免疫化したマウスにクラミジアを接種し、 ここで、免疫化されていない対照マウスに比べて免疫化したマウスでクラミジ
ア感染が予防されたまたはその重篤度が軽減したポリペプチドを同定する 工程を含んでなる、方法。 - 【請求項31】 発現プラスミドpCABk831。
- 【請求項32】 配列番号3または4の核酸分子。
- 【請求項33】 クラミジア由来のomp P6前駆体。
- 【請求項34】 肺炎クラミジア由来のomp P6前駆体。
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PCT/CA2000/001534 WO2001046224A2 (en) | 1999-12-22 | 2000-12-20 | Chlamydia antigens and corresponding dna fragments and uses thereof |
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