JPH08500084A

JPH08500084A - 毒素および薬剤を含む治療用複合体

Info

Publication number: JPH08500084A
Application number: JP5518731A
Authority: JP
Inventors: ハンセン，ハンス・ジェイ; グリフィス，ゲイリー・エル; レンティーン‐ジョーンズ，アナスタシア; ゴールデンバーグ，デイヴィッド・エム
Original assignee: イムノメディクス，インコーポレイテッド
Priority date: 1992-05-11
Filing date: 1993-05-07
Publication date: 1996-01-09
Anticipated expiration: 2014-08-30
Also published as: CA2118032A1; EP0651646A1; PT651646E; JP2942356B2; EP0651646B1; EP1283059A3; DE69333182T2; ATE248858T1; ES2208639T3; DE69333182D1; US5541297A; US5601825A; EP0651646A4; WO1993023062A1; EP1283059A2; DK0651646T3; CA2118032C

Abstract

(57)【要約】癌または伝染性疾患の治療に有用な複合体は、薬剤もしくは機能的なレセプター結合ドメインを欠いた天然の毒素である修飾毒素と、標的細胞もしくは病原体に付随する物質と反応するタンパク質とを含む。該標的物質は、該複合体を細胞の細胞質内に内在化させ、細胞を殺す。複合前のタンパク質は、少なくとも１個のメルカプト複合体を有し、該メルカプト複合体は毒素もしくは薬剤との複合のための部位となる。該複合体の製造方法、該複合体の医薬的組成物、および治療に有用な医薬を製造するための該複合体の使用もまた提供される。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称毒素および薬剤を含む治療用複合体発明の背景１．発明の分野本発明は、治療用複合体に関するものであり、薬剤もしくは修飾毒素と、標的細胞に付随する物質（該物質は、細胞内に該複合体を内在化させる。）と反応するタンパク質とを含む治療用複合体に関する。本発明はまた、毒素もしくは薬剤と抗体もしくは抗体フラグメントとを含む部位特異的複合体についての改良され、かつ至適化された方法にも関する。本発明はさらに、癌療法において有用な組成物および方法に関する。本発明はさらにまた、ウイルス、微生物および寄生虫による疾病の治療に有用な組成物および方法にも関する。２．先行技術細胞内に内在化される薬剤もしくは毒素は、多くのヒト疾患の原因となっている細胞に対する極めて強力な細胞毒性剤である。その強い活性のために、これらの薬剤は、標的細胞に特異的に結合する細胞毒性剤を形成するために単クローン性抗体に結合させられる。したがって、これらのイムノトキシン（immunotoxin ）は、癌、ウイルス、寄生虫および他の伝染性生物による疾病の治療に非常に有用である。毒素もしくは薬剤を単クローン性抗体に結合させるために、種々の方法が用いられてきた。しかし、タンパク質、特に抗体もしくは抗体フラグメントと、毒素もしくは毒素による治療効果と同様な治療効果を有する薬剤との安定な複合体を形成するための部位特異的方法についてのニーズはなお残っている。発明の目的本発明の目的は、安定であって、免疫反応性の強い、毒素もしくは薬剤と抗体もしくは抗体フラグメントの複合体を容易に製造することである。本発明の別の目的は、毒素もしくは薬剤を抗体もしくは抗体フラグメントの中に導入する方法を提供することである。本発明のまた別の目的は、治療方法で使用する毒素もしくは薬剤と抗体もしくは抗体フラグメントの安定な複合体を提供することである。本発明の別の目的は、ヒトの癌、リンパ腫および白血病に罹患している患者の治療方法において使用する薬剤を提供することである。本発明の別の目的は、微生物や寄生虫に感染した患者の治療方法において使用する薬剤を提供することである。本発明のまた別の目的は、ウイルスに感染している細胞を破壊することによる、ウイルス感染をもつ患者の治療方法において使用する薬剤を提供することである。この明細書および添付の請求の範囲をさらに検討することによって、本発明のまた別の目的および利点が当業者には明らかとなろう。発明の要旨一つの態様として、本発明は、複合の前に少なくとも１個のメルカプト基を有し、この基が複合のための部位となるようなタンパク質と複合した毒素もしくは薬剤を提供する。この複合体は、薬剤もしくは機能的なレセプター結合ドメインを欠いた天然の毒素である修飾毒素、および標的細胞もしくは生物体に付随する物質と反応するタンパク質を含む。該標的細胞もしくは生物体に付随する物質は、細胞の細胞質内に該複合体を内在化させ、さらに該薬剤もしくは毒素は、細胞を殺す。また別の態様として、本発明は、複合の前に少なくとも１個のメルカプト基を有し、この基か複合のための部位となるような抗体もしくは抗体フラグメントと複合した毒素もしくは薬剤を提供する。この複合体は、薬剤もしくは機能的なレセプター結合ドメインを欠いた天然の毒素である修飾毒素、および癌細胞（例えはＢ細胞リンパ腫）上に存在する腫瘍関連抗原と反応する抗体もしくは抗体フラグメントを含む。ここで抗原は、該複合体を癌細胞内に内在化させる。また別の態様として、本発明は、毒素もしくは薬剤との複合前に処理され、重鎖の間のジスルフィド結合が切断され、複合のための部位となることができる遊離スルフヒドリル（メルカプト）基を生じるような抗体もしくは抗体フラグメントと複合した毒素もしくは薬剤を提供する。この複合体は、薬剤もしくは機能的なレセプター結合ドメインを欠いた天然の毒素である修飾毒素、および標的細胞もしくは病原体に付随する物質と反応する抗体もしくは抗体フラグメントを含む。該標的細胞もしくは病原体に付随する物質は、細胞もしくは病原体の細胞質内に該複合体を内在化させる。また別の態様として、本発明は、ヒトのリンパ腫もしくは白血病をもつ患者の治療方法で使用する薬剤を提供する。患者は、医薬的に許容できる担体中の抗体もしくは抗体フラグメント複合体を含む細胞毒性量の組成物を投与される。この複合体は、機能的なレセプター結合ドメインを欠いた天然の毒素である修飾毒素、およびリンパ腫上に存在する腫瘍関連抗原と反応する抗体もしくは抗体フラグメントを含む。この抗原は、悪性細胞内に複合体を内在化させる。また別の態様として、本発明は、癌の治療法で使用する薬剤を提供する。この方法は、抗原を産生するか、または抗原と結合する癌をもつ患者に、該抗原に特異的で、機能的なレセプタ結合領域を欠いた天然の毒素である修飾毒素と複合されているＦａｂ’抗体フラグメントの細胞毒性量を非経口的に注射することを含む。該抗原は、該癌細胞内に該複合体を内在化させる。また別の態様として、本発明は無菌的注射可能組成物を提供する。この組成物は、毒素もしくは薬剤と、抗体もしくは抗体フラグメントと、医薬的に許容できる注射賦形剤を含む。この複合体は、薬剤もしくは機能的なレセプター結合ドメインを欠いた天然の毒素である修飾毒素、および癌細胞もしくは病原体に存在する抗原と反応する抗体もしくは抗体フラグメントを含む。この抗原は、その細胞もしくは病原体中に該複合体を内在化させる。また別の態様として、本発明は注射可能な無菌的組成物を提供する。この組成物は、医薬的に許容できる注射用賦形剤中に毒素とタンパク質の複合体を含む。この複合体は、薬剤もしくは機能的なレセプター結合ドメインを欠いた天然の毒素である修飾毒素と、標的細胞もしくは病原体に付随する物質と反応し、さらに複合のための部位となる少なくとも１個のメルカプト基を複合前にもっているタンパク質とを含む。該標的細胞もしくは病原体に付随する物質は、複合体を細胞の細胞質内に内在化させる。また別の態様として、本発明は、薬剤もしくは機能的なレセプター結合ドメインを欠いた毒素と、少なくとも１個のジスルフィド結合を有するタンパク質前駆体由来のタンパク質とを含む複合体の製造方法を提供する。この方法は、（ａ）タンパク質前駆体をジスルフィド還元剤と反応させ、ジメルカプトタンパク質を形成させ、さらに（ｂ）毒素もしくは薬剤をジメルカプトタンパク質に接触させ、複合体を形成する工程を含む。別の態様として、本発明は、Ｆａｂ’抗体フラグメントと、薬剤もしくは機能的なレセプター結合ドメインを欠いた毒素とを含む複合体の製造方法を提供する。この方法は以下の工程を含む。（ａ）ジスルフィド基を切断するために無傷の抗体を、多数の基部遊離スルフヒドリル基を生じるためには十分であるが、該抗体を免疫学的に不活性にするには不十分な量の還元剤で部分的に還元し、さらに、この部分的還元抗体を回収し、（ｂ）部分的還元抗体を切断して、還元Ｆ（ａｂ’）₂フラグメントを生じさせ、さらに、（ｃ）部分的還元Ｆ（ａｂ’）₂フラグメントを薬剤溶液もしくは機能的結合ドメインを欠いた毒素溶液と接触させる。また別の態様として、本発明は、タンパク質と毒素もしくは薬剤の複合体を製造する方法を提供する。この方法は、溶液中で（ａ）少なくとも１個の付属スルフヒドリル基を有するタンパク質と、（ｂ）薬剤もしくは機能的なレセプター結合ドメインを欠いた毒素の混合物を接触させ、さらに、生じた複合体溶液を回収する工程を含む。詳細な説明タンパク質物質と複合した毒素もしくは薬剤に関する組成物および方法が、癌および感染性疾患の治療における複合体の使用と同様に提供される。この癌の状態には、癌種、肉腫、白血病、リンパ腫およびミエローマが含まれる。伝染性疾患は、侵入微生物または寄生虫によって引き起こされるものを含む。本明細書で用いられるように、「微生物」とは、ウイルス、細菌、リケッチア、マイコプラズマ、原虫、カビなどのような微生物を指し、「寄生虫」とは、伝染性で一般に顕微鏡的な非常に小さな多細胞性無脊椎動物、またはその卵もしくは幼生形を指し、これらは抗体誘発排除または溶解性もしくは食細胞性破壊に感受性であり、例えば嬬虫を含むマラリアの寄生虫、スピロヘータなどを指す。一方、「伝染性因子」または「病原体」とは、微生物および寄生虫の両方を指す。したがって、本発明の方法は、間隙を置いて隣合う多数の遊離スルフヒドリル（メルカプト）基を有するタンパク質の溶液を毒素もしくは薬剤の溶液と接触させ、それによってタンパク質と複合した毒素もしくは薬剤の溶液を得る工程を広く含む。この方法の好ましい態様は、本発明の方法を応用し、治療に有用な毒素複合抗体もしくは薬剤複合抗体もしくは抗体フラグメントを製造することを含む。本発明の方法は、毒素または薬剤を、不可欠の遊離スルフヒドリル（メルカプト）基をもつ他のタンパク質に結合させるために用いられる。１つまたはそれ以上の基部遊離スルフヒドリル基を有するタンパク質は直接標識できる。ジスルフィド基を有するもの（通常システイン残基によって連結されている）は、還元剤で処理し、遊離のスルフヒドリル基を生成させることができる。これによって、ジスルフィド基が連続していないポリペプチド鎖を連結させている場合、タンパク質のフラグメント化が生じるか、または単に鎖の分離を生じる。ジスルフィド結合が単一のポリペプチド鎖の離れたセグメントをつなぐ場合には、おそらくタンパク質の構造変化を含む。遊離スルフヒドリル（メルカプト）基を有するタンパク質を製造するために、遺伝子工学を用いることができる。このタンパク質物質は、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、糖蛋白、脂質蛋白など（例えばホルモン、リンホカイン、成長因子、アルブミン、サイトカイン、酵素、免疫調節剤、レセプタータンパク質、抗体および抗体フラグメント）でもよい。タンパク質物質は、少なくとも１個の遊離メルカプト基、または複合のための部位として利用できるメルカプト基を提供する少なくとも１個の利用可能なジスルフィド基の何れかを有することを特徴とする。好ましいタンパク質物質は、標的細胞の表面物質、特に表面抗原と反応するものであり、この場合、複合体は当該表面と結合し、続いて細胞内に摂取される。表面抗原の中では、とりわけ表面膜レセプター、免疫グロブリン、抗体、酵素、天然に生じるレセプター、レクチンなどである。膜レセプターおよび細胞内抗原もしくはレセプターか好ましい。本発明で特に興味のあるタンパク質物質は、抗体および抗体フラグメントである。「抗体および抗体フラグメント」とは、一般に、特異的に抗原と結合して免疫複合体を形成する免疫グロブリンまたはそのフラグメントを意味する。この抗体は、いずれかの種類の完全な免疫グロブリン、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、２種もしくは多数の抗原特異性またはエピトープ特異性をもつキメラもしくはハイブリッド抗体でもよい。それは、多クローン性抗体、好ましくは、ヒトまたは適切な動物（例えば霊長類、ヤギ、ウサギ、マウスなど）のアフィニティー精製抗体でもよい。単クローン性抗体は、また本発明での使用に適しており、その高い特異性のゆえに好ましい。それらは、現在通常の哺乳類の免疫原性抗原調製物による免疫方法と考えられているもの、不朽化ミエローマ細胞株と免疫リンパ細胞もしくは牌細胞との融合、および特異的ハイブリドーマクローンの分離によって、容易に調製できる。単クローン性抗体を調製する、より非慣用的方法、例えば種間融合および高可変領域の遺伝子工学操作も除外されない。なぜならば、本発明におけるそれらの利用を左右するものは、主に抗体の抗原特異性だからである。単クローン性抗体の製造のためのより新しい技術もまた用いることができることは理解しえよう。これらは、例えば、ヒト単クローン性抗体、種間単クローン性抗体、キメラ（例えはヒト／マウス）単クローン性抗体、遺伝子工学操作抗体などである。本発明で有用な抗体フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）₂、Ｆ（ａｂ）₂、Ｆａｂ’ 、Ｆａｂ、Ｆｖなどであるが、ハイブリッドフラグメントも含む。好ましいフラグメントは、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）₂である。免疫グロブリンの高可変抗原結合領域を保持し、Ｆａｂ’ フラグメントと同じかまたはそれより小さいサイズをもつサブフラグメントもまた有用である。これは、単鎖であれ複数鎖であれ、遺伝子操作および／または組換え体タンパク質を含み、該タンパク質は、抗原結合部位を含むか、もしくは天然の免疫グロブリンフラグメントと実質的に同じ態様での標的照準用担体としてインビボで機能する。そのような単鎖結合分子は米国特許第4,946,778号に開示されており、この文献は引用することによって本明細書に含まれる。Ｆａｂ’抗体フラグメントは、便宜的には、Ｆ（ａｂ’）₂フラグメントの還元切断によって作製でき、Ｆ（ａｂ’）₂フラグメントは、無傷の免疫グロブリンのペプシン消化によって作製できる。Ｆａｂ抗体フラグメントは、還元条件下での無傷の免疫グロブリンのパパイン消化、または完全な免疫グロブリンの注意深いパパイン消化によって生じるＦ（ａｂ）₂フラグメントの切断によって作製できる。このフラグメントは、遺伝子工学によってもまた製造できる。ハイブリッド抗体のように、抗体と免疫グロブリンクラスの混合物も用いることができるということは特筆すべきであろう。ハイブリッドは２つの異なる抗原特異性をもつことができる。２つの特異性をもつハイブリッド抗体フラグメントは、米国特許第4,361,544号に開示された抗腫瘍マーカーハイブリッドと同様に調製することができる。ハイブリッド抗体を調製する他の技術は、例えば米国特許第4,474,893号および第4,479,895号、並びにミルシュタインらの文献（Milste inら、Immunol.Today,5299(1984)）に開示されている。腫瘍抗原および病原体に対する抗体は既知である。例えば、腫瘍もしくは感染病巣（ウイルス、細菌、カビまたは寄生虫の感染を含む）によって産生され、またはそれらに付随するマーカーと特異的に結合する抗体および抗体フラグメント、並びにそのような微生物に付随する抗原および生成物は、とりわけハンセンらの米国特許第3,927,193号、およびゴールデンバーグの米国特許第4,331,647号、第4,348,376号、第4,361,544号、第4,468,457号、第4,444,744号、第4,818,709 号および第4,624,846号に開示されている。特に、抗原、例えば胃腸、肺、乳房、前立腺、卵巣、精巣、脳またはリンパ性の腫瘍、肉腫またはメラノーマに対する抗体が有利に用いられる。伝染性疾患因子に対する広範囲の単クローン性抗体が開発されており、それらは、ポリンの論評（Polin,Eur.J.Clin.Microbiol.,3(5):387-398,1984）に要約され、容易に利用できることが示されている。これらは、例えば以下のような病原体およびそれらの抗原に対する単クローン性抗体（ＭＡｂ）を含む。抗細菌ＭＡｂストレプトコッカス・アガラクティエ（Streptococcus agalactiae）レジオネラ・ニューモフィリア（Legionella pneumophilia）化膿連鎖球菌大腸菌淋菌髄膜炎菌肺炎球菌Ｂ型インフルエンザ菌梅毒トレポネーマライム病スピロヘータ緑膿菌癩菌ウシ流産菌結核菌破傷風毒素抗ウイルスＭＡｂＨＩＶ−１、−２、−３Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型肝炎狂犬病ウイルスインフルエンザウイルスサイトメガロウイルス単純庖疹ウイルスＩ型、ＩＩ型ヒト血清パルボ様ウイルス合胞体形成呼吸器ウイルス帯状庖疹ウイルスＢ型肝炎ウイルス麻疹ウイルスアデノウイルスヒトＴ細胞白血病ウイルスエプスタインーバーウイルスネズミ白血病ウイルス＊流行性耳下腺炎ウイルス小水庖性口内炎ウイルスシンドビスウイルスリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス疣贅ウイルスブルータングウイルスセンダイウイルスネコ白血病ウイルス＊レオウイルスポリオウイルスシミアンウイルス４０＊マウス乳癌ウイルスデングウイルス狂犬病ウイルス＊＝動物ウイルス抗−原虫ＭＡｂ熱帯熱マラリア原虫三日熱マラリア原虫卜キソプラズマ・ゴンディー（Toxoplasma gondii）アルゼンチントリパノソーマクルーズトリパノソーマローデシアトリパノソーマブルーストリパノソーママンソン住血吸虫日本住血吸虫バベシア・ボービス（Babesia bovis）エルメリア・テネラ（Elmeria tenella）オルコセルカ・ボルブラス（Onchocerca volvulus）熱帯リーシュマニア（Leishmania tropica）トリキネラ・スピラーリス（Trichinella spiralis）タイレリア・パーバ（Theileria parva）羊条虫無鉤条虫棘球条虫エキノコックス・グラヌロスス（Echinococcus granulosus）メソセストイデス・コルチー（Mesocestoides corti）抗マイコプラズマＭＡｂマイコプラズマ・アースリティディス（Mycoplasma arthritidis）マイコプラズマ・ヒオリーニス（M.hyorhinis）マイコプラズマ・オラーレ（M.orale）マイコウラズマ・アルギニニー（M.arginini）アコレプラズマ・ライドロウイー（Acholeplasma laidlawii）マイコプラズマ・サリバリウム（M.salivarium）肺炎マイコプラズマ（M.pneumoniae）文献に記載されている、伝染性生物に対して作られたさらに別のＭＡｂの例を下記に記す。ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）のｇｐ１２０糖蛋白抗原に対するＭＡｂは既知であり、そのような抗体のいくつかは、ヒトにおいて免疫的保護の役割をもつことができる（例えばロッシーら参照(Rossiら、Proc. Natl. Acad. Sc i. USA, 86:8055-8058, 1990)）。ウイルス抗原およびウイルス誘発抗原に対する他のＭＡｂもまた知られている。これは、エピトープの適切な選択が、治療的標的と非治療的標的の間の識別を可能にすることができることを示している。マラリア寄生虫に対するＭＡｂは、スポロゾイト、メロゾイト、シゾントおよび生殖母細胞期に対して作製することができる。単クローン性抗体はスポロゾイト（限局スポロゾイト(Circumsporozoite)抗原）に対して作製され、さらに、インビトロおよびゲッ歯類においてスポロゾイトを中和することが示された（N. Y oshidaら、Science 207:71-73, 1980）。幾つかのグループは、トキソプラズマ・ゴンディー（トキソプラズマ症に関わる原虫性寄生虫(Kasperら、J. Immunol. 129:1694-1699, 1982; 同書、130:2407 -2412, 1983)）に対するＭＡｂを作製した。幼住血吸虫の表面抗原に対するＭＡｂが作製され、これがインビボおよびインビトロで幼住血吸虫に対して作用することが見出された（Simpsonら、Parasitol ogy, 83:163-177, 1981; Smithら、Parasitology,84:83-91, 1982; Gryzchら、J . Immunol., 129:2739-2743, 1982; Zoddaら、J. Immunol. 129:2326-2328, 198 2; Dissousら、J. Immunol., 129:2232-2234, 1982）。トリパノソーマ・クルーズは、シャガス病の原因因子であり、吸血昆虫のサシガメによって伝播される。この寄生虫の一形態から別の形態（エピマスチゴートからトリポマスチゴート期）への分化をインビトロで特異的に抑制し、さらに細胞表面の糖蛋白（しかしこの抗原はこの寄生虫の哺乳類（血流）形には存在しない）と反応するＭＡｂが作製された（Sherら、Nature,300:639-640,1982）。ヒトの感染症の大半の原因である殆どの微生物（細菌、ウイルス、原虫類、寄生虫）に対して適切なＭＡｂが作製され、多くはインビトロでの診断の目的で以前に使用された。これらの抗体および通常の方法で作製できる最近のＭＡｂは、本発明での使用に適当である。好ましいタンパク質は、癌、肉腫またはリンパ腫上に存在する腫瘍関連抗原と反応する抗体または抗体フラグメントである。そのような抗体の１つは、ゴールデンバーグら（Goldenbergら、J.Clin.Oncolgy 9(4):548-564,1991）およびポーラックら（Pawlakら、Cancer Res.49:4568-4577,1989）の文献にＬＬ−２およびＥＰＢ−２としてそれぞれ開示されているか、それらは同じ抗体である。この文献は引用することによって本明細書に含まれる。別のおそらく有用な抗体は、ＬＹＭ−１であり、これは現在Ｂ細胞リンパ腫の治療のために、テクニクローンインターナショナル社（Techniclone International Corp.）によって製造されている。タンパク質、特に少なくとも１個の遊離スルフヒドリル（メルカプト）基をもつ抗体もしくは抗体フラグメントは、穏やかな条件下で選択的に毒素もしくは薬剤と複合し、血中または他の体液および組織中で極めて安定なスルフヒドリル基と強固な結合を形成することができることが分かった。抗体およびいくつかの抗体フラグメントは、軽鎖および重鎖を一緒に結合するジスルフィド結合同様、重鎖を連結する１つまたはそれ以上のジスルフィド結合を含んでいる。軽鎖と重鎖を結合させるジスルフィド結合は、ジスルフィド還元剤にとって通常接近しにくいので、重鎖を連結するジスルフィド結合が通常選択的に切断され得る。生じたフラグメントは、その免疫特異性および抗原結合能を保持している。免疫グロブリンの重鎖を連結しているジスルフィド結合の還元は、注意深く実施されなければならないことは理解されよう。なぜならば、還元条件があまりに厳しいか、または還元剤がフラグメントとあまりに長時間接触する状態に置かれた場合には、軽鎖と重鎖を連結する、通常、反応性がより低いジスルフィド結合も最終的には還元されるからである。ジスルフィド結合の還元は、有利にはチオール還元剤、例えばシステイン、メルカプトエタノール、ジチオエリトリトール（ＤＴＥ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、グルタチオンなどで実施される。ジスルフィドタンパク質のジスルフィド結合の還元は、その反応条件によるが、（ａ）存在するジスルフィド結合のいくつかのみを還元し、したがってジスルフィドタンパク質からメルカプトタンパク質を生じるか、または（ｂ）重鎖を連結するすべてのジスルフィド結合を完全に還元し、それによってジスルフィドタンパク質を切断して遊離のメルカプト部位を含むフラグメントを生じるかのいずれかであろう。少なくとも１個のジスルフィド結合を含むタンパク質（例えば抗体またはＦ（ａｂ’）₂フラグメント）の既知のジスルフィド結合還元剤（例えばジチオスレイトール、システイン、メルカプトエタノールなど）による還元では、短時間後（典型的には、精製も含めて１時間未満）に、分析によれば１〜１０個の遊離スルフヒドリル（メルカプト）基を有する抗体を生じる。Ｆ（ａｂ’）₂フラグメントの還元は、ｐＨ５．５〜７．５、好ましくは６．０〜７．０、より好ましくは６．４〜６．８、最も好ましくは約ｐＨ６．６で、例えばクエン酸、酢酸または燐酸緩衝液、好ましくは燐酸緩衝食塩水中で、有利には不活性ガス雰囲気下で好ましくは実施される。チオール還元は、注意深く行われない場合には、フラグメントの軽鎖および重鎖の鎖分離を生じることは周知であるので、フラグメントの統合性が失われないように反応は注意深く制御されなければならない。そのようなジスルフィド還元にはシステインが好ましく、また、システインと同様な酸化能をもつ他のチオールも有利に用いられるであろう。ジスルフィド還元剤とタンパク質の比は、鎖内ジスルフィド結合の安定性の関数であり、それぞれの事例について最適なものを決定しなければならない。（Ｆａｂ’）₂抗体フラグメントの切断は、１０〜３０ｍＭ、好ましくは約２０ｍＭのシステインと、約１０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で有利に実施される。既知のジスルフィド結合還元剤によるＦ（ａｂ’）₂フラグメントの還元では、短時間後（典型的には精製も含めて１時間未満）に、分析によれば典型的には１〜３個の遊離スルフヒドリル基を有するＦａｂ’を生じる。続いて有利には、Ｆａｂ−ＳＨまたはＦａｂ’−ＳＨフラグメントを、過剰な還元剤を含む低分子量分子種を捕捉する小形サイズ分離用ゲルカラムに通す。適切なそのようなサイズ分離用ゲルカラムは、例えばデキストラン（セファデックスＧ−２５、Ｇ−５０（ファルマシア））、フラクトゲルTSK HW55（EM Science ）、ポリアクリルアミド（例えばＰ−４、Ｐ−６(BioRad)）などを含む。切断は、例えばサイズ排除ＨＰＬＣによってモニターし、ＦａｂまたはＦａｂ’フラグメントが最適範囲で産生され、一方軽鎖一重鎖切断（これは一般にジスルフィド切断に対して、より抵抗性をもつ）を最小にできるように条件を調製できる。続いてサイズ分離用ゲルカラムからの溶出液は、約０．０３〜０．０７Ｍ、好ましくは約０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ約４．５）中で安定化される。該緩衝液は、約０．１〜０．３Ｍ、好ましくは約０．１５Ｍ食塩水中で作製し、好ましくは不活性ガス（例えばアルゴン）で浄化する。一般には、約０．５〜５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約１〜３ｍｇ／ｍｌの抗体フラグメント濃度の溶液を用いて作業するのが有利である。一般には、約０．０１〜１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．１〜５ｍｇ／ｍｌの抗体もしくは抗体フラグメント濃度をもち、一般には食塩水、好ましくは約４．０〜４．５の弱い酸性ｐＨで緩衝された食塩水溶液で作業することが有利である。ジスルフィド基を還元する、当業者に既知の他の方法があり、これらは同位元素（例えばテクネチウムおよびレニウム）で放射能標識が可能であるといわれている。そのような方法は、ＷＯ８８／０７８３２号（1988年10月6日公開）、レノ（Reno）らの米国特許第4,877,868号およびローデス（Rhodes）の米国特許第5 ,078,985号（すべて文献は引用することによって本明細書に含まれる）に開示されている。これらの開示は放射能標識に限定されているが、一方開示方法の修飾は、本発明において少なくとも１個のメルカプト基をもつタンパク質を製造するために有用であろう。一旦還元されると、メルカプト基を有するタンパク質は、厳密に酸素を含まない条件下で保存される場合、極めて安定である。低ｐＨ、特にｐＨ６未満での保存によって、安定性はまた増強される。安定化のより好ましい方法は、メルカプト基を有するタンパク質溶液を凍結乾燥することである。細胞内タンパク質合成に干渉する薬剤は、当業者に既知であり、ピューロマイシン、シクロヘキシミドおよびリボヌクレアーゼが含まれる。毒素は、本発明の方法および組成物での使用に好ましい。治療剤として有用な毒素は、当業者に既知であり、植物毒素および細菌毒素、例えばアブリン、アルファ毒素、ジフテリア毒素、外毒素、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、リシンおよびサポリンが含まれる。天然型の毒素は、細胞を殺すために最小限３つの異なる生化学的機能を要求する。すなわち、細胞結合機能、細胞毒性機能、および毒素活性を細胞内に移入させる機能である。本発明で用いられる修飾毒素は、天然毒素の細胞結合機能を提供するドメインが、該ドメインが部分的または全面的に失われているので当該機能を提供できないという点で、天然毒素とは異なっている。続いて薬剤もしくは修飾毒素を当業者に既知の方法で処理し、少なくとも１個のメルカプト基を含むタンパク質にそれらの薬剤もしくは修飾毒素を複合させることを可能にする。毒素の処理方法および特に修飾シュードモナス外毒素が文献に開示されている（Batkraら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:8545-8549,1989; Seetharamら、J.Bio l.Chem.266(26):17376-17381,1991; Pastanら、米国特許第4,892,827号（すべての文献は引用することにより本明細書に含まれる））。好ましい修飾シュードモナス外毒素は、ＡＤＰリボシル化アクチベート（細胞膜を通り抜け移入させる機能）を含み、天然毒素の機能的レセプターバインダー領域Ｉａを欠いている。そのような修飾シュードモナス外毒素の１つは、天然のシュードモナス外毒素のアミノ酸１−２５２および３６５−３８０を欠いており、カルボキシル末端に−ＲＥＤＬＫの代わりに−ＫＤＥＬ変異を含んでいる。前述の量の抗体または抗体フラグメントを複合させる場合、薬剤または毒素の量は、一般に抗体または抗体フラグメントの量の約０．２５〜５倍、好ましくは１〜３倍であり、反応時間は約１０〜１２０分、好ましくは３０〜９０分である。通常は、これらの条件によって、実質的に定量的なタンパク質への毒素の複合が高度に安定な形で生じる。このタンパク質複合体の生理学的溶液は有利には無菌バイアルに、例えば約１０．０〜５００ｍｇタンパク質複合体／バイアルの単位用量で計り入れ、さらにこのバイアルは栓で蓋をするかまたは封入して、低温で保存し、ないしは凍結乾燥して栓をするかまたは封入して、保存する。これらのキットの変更形または修飾は、患者または治療方針の個々の必要性にしたがって当業者には明白であろう。これは、放射性同位元素が提供され、または利用される形態における変更形でも同様である。さらに、腫瘍または感染病巣をもつ患者の治療方法において、腫瘍または感染病巣によって産生されるか、またはそれらに付随する抗原と特異的に結合し、さらに治療的に有効な量の毒素または薬剤と複合されている抗体または抗体フラグメントを非経口的にそのような腫瘍または感染病巣をもつヒト患者に注射する場合には、本発明にしたがって作成された毒素もしくは薬剤の複合抗体もしくは抗体フラグメントを使用することは明らかな改善をもたらすであろう。本発明の重要な態様は、炭水化物ポリマーまたはポリオール基をもつ複合体の毒素部分の免疫原性の減少を伴う。実施例は、デキストラン、多糖類、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などを含む。当業者は、さらに熟考を加えることなく前述の記載を用いて、本発明をその最大の範囲まで利用することが可能であると考えられる。以下の好ましい特定の実施例は、したがって、単に説明として意図されたものであり、どの様な場合にあっても本開示の残余のものを限定するものではない。以下の実施例では、すべての温度はそのまま℃で示され、特に明示しない限り、部および百分率は全て重量による。実施例実施例１−隠蔽Ｆａｂ’／毒素複合体Ａ．ＬＬ−２−ＩｇＧ（上記に開示）を低分子量メルカプタンで還元し、ペプシンを用いた処理によってＦ（ａｂ’）₂ＳＨに変換し、タンパク質Ａによる減算クロマトグラフィーおよび透析ろ過によって精製する。全工程は、アルゴン下で、アルゴン浄化溶液を用いて実施する。Ｂ．リジン基を有するペプチドリンカーを合成する。このペプチドリンカーを高度に精製した１’−カルボニルジイミダゾル活性化一官能基ポリエチレン（ＰＥＧ）と反応させる。ペプチドリンカー−ＰＥＧ−誘導体をゲルろ過（ＰＥＧ− ペプチド）およびイオン交換クロマトグラフィーによって精製する。Ｃ．ＰＥＧ−ペプチドをスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル−１− カルボキシレート（ＳＭＣＣ）で活性化し、ＬＬ−２−Ｆ（ａｂ’）₂ＳＨと混合する。生じたＬＬ−２−Ｆ（ａｂ’）²−ペプチド−ＰＥＧをジチオエリトリトールで還元し、生じたＰＥＧ−ペプチド−ＬＬ−２−Ｆａｂ’ＳＨを精製する。Ｄ．Ｉａ結合ドメインを欠く修飾シュードモナス外毒素（ｍＰＥ）を大腸菌で発現させ、ペリプラズムから抽出し、イオン交換クロマトグラフィーで精製する。ｍＰＥをＳＭＣＣ（ＡｍＰＥ）で処理して活性化する。Ｅ．ＰＥＧ−ペプチド−ＬＬ−２−Ｆａｂ’ＳＨをＡｍＰＥとともに保温し、治療剤であるＬＬ−２−ＰＥＧ−Ｆａｂ’−ＳｄＰＥを得る。これをゲルろ過クロマトグラフィーで精製する。実施例２− 隠蔽抗体フラグメントと毒素の複合体による治療化学療法に耐性のＢ細胞リンパ腫をもつ患者は、癌による広範囲の骨髄浸潤のために、放射性免疫療法による治療にはふさわしくないように思われる。患者を静脈輸液によって実施例１の複合体で処置し、リンパ腫の完全な寛解が認められる。実施例３−抗ＨＩＶピューロマイシン複合体Ｂａｌｂ／ｃマウスをＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）エンベロープタンパク質、ｇｐ１２０のアミノ末端に存在するアミノ酸構造を有する合成ペプチドで免疫する。ｇｐ１２０と反応する単クローン性抗体を産生するハイブリドーマは、通常の方法を用いる免疫マウスの牌臓リンパ球由来である。この単クローン性抗体を異なるＨＩＶ分離物に対する反応性について調べる。全分離物に対する高い親和性を示すＭＡｂ（ｍＢ１）を抗ＨＩＶピューロマイシン複合体の作製に使用するために選択する。ｍＢ１を産生するハイブリドーマクローンのｍＲＮＡを分離し、重鎖および軽鎖可変領域のＣＤＲの配列を決定する。その後組換え体ＤＮＡ技術を用いて、この重鎖および軽鎖の高可変領域をＭ１３ベクターでクローニングしたヒトＩｇＧ重鎖および軽鎖のｃＤＮＡにＣＤＲ移植する。可変領域をコードする遺伝子をＭ１３ベクターから切り出し、ｐＳＶ２ｇｐｔ（重鎖プラスミド）およびｐＳＶ２ｎｅｏ（プロモーターとエンハンサーエレメントを含む軽鎖プラスミド）において再クロ−ニングする。ＳＰ２／０ネズミミエローマをこのプラスミドを用いてＤＮＡ感染（トランスフェクト）させ、ヒト化抗体（ｈＢ１）を産生するハイブリドーマをクローニングによって選別する。ｈＢ１産生ハイブリドーマをバイオリアクターで増殖させ、ｈＢ１をイオン交換クロマトグラフィーによって培養液から分離する。ｈＢ１−ＩｇＧをペプシンで切断し、Ｆ（ａｂ’）₂をタンパク質Ａにおけるサブトラクションクロマトグラフィーおよび透析ろ過によって精製する。ｈＢ１ −ＩｇＧをシステインを用いて還元によってＦａｂ’に変換し、Ｆａｂ’はゲルろ過クロマトグラフィーによって精製する。全工程は、アルゴン下で実施し、緩衝液はアルゴンで浄化し、さらに、Ｆａｂ’−ＳＨは、治療用複合体を調製するために使用するまでアルゴン雰囲気下で維持する。ピューロマイシンは、一方の末端にリジンを有し、他方の末端に転座ペプチド（ＧＧＧＫＤＥＬ−ＣＯＯＨ）を有する直線状ポリマーに誘導する。このポリマーをＳＭＣＣ（ＡＰＰ）による処理で活性化する。ｈＢ１−Ｆａｂ’ＳＨをＡＰＰで保温し、治療用複合体ｈＢ１−Ｆａｂ’−Ｓ −ＡＰＰを得る。ＨＩＶに感染し、高力価のｐ２４ＨＩＶ抗原をその血中にもつ衰弱した発熱男性患者を、静注により週２回ｈＢ１−Ｆａｂ’−Ｓ−ＡＰで処置する。治療後２か月で患者の血液は、ｐ２４ＨＩＶ抗原について調べたとき陰性で、健康状態は著名に改善される。前述の実施例は単に説明のためであり、本発明の方法、キットおよび用途を種々の利用および条件に、本発明の範囲を外れること無く利用するために多くの変更および修飾が当業者には実施可能である。本発明の広い範囲は、添付の請求の範囲により、さらに無数のその均等物によってその範囲が限定される。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９４年３月２８日【補正内容】７４．第一チオール結合リンカーを通して、薬剤もしくは機能的なレセプタ一結合ドメインに欠ける修飾された毒素に複合し、さらに、少なくとも第二チオール結合リンカーを通して、少なくとも１つの多糖類またはポリオールに複合した、標的細胞もしくは病原性微生物の抗原に特異的に結合する抗体ＦａｂもしくはＦａｂ’フラグメントを含む低免疫原性免疫複合体であって、該抗原が、該複合体を該標的細胞もしくは微生物の細胞質中に内在化させる、低免疫原性免疫複合体。７５．上記抗原が腫瘍関連抗原である、請求の範囲第７４項に記載の免疫複合体。７６．上記腫瘍関連抗原が、リンパ腫、癌腫、肉腫、白血病、またはミエローマ細胞上に存在する、請求の範囲第７５項に記載の免疫複合体。７７．上記腫瘍関連抗原が、リンパ腫または白血病細胞上に存在する、請求の範囲第７６項に記載の免疫複合体。７８．上記抗原が病原性微生物の抗原である、請求の範囲第７４項に記載の免疫複合体。７９．上記微生物がウイルス、原虫または細菌である、請求の範囲第７８項に記載の免疫複合体。８０．上記毒素がアブリン、アルファ毒素、ジフテリア毒素、外毒素、ゲロニン、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、リシンまたはサポニンである、請求の範囲第７４項に記載の免疫複合体。８１．上記毒素が修飾シュードモナス外毒素である、請求の範囲第８０項に記載の免疫複合体。８２．上記薬剤がプロマイシン、シクロヘキシミドまたはリボヌクレアーゼである、請求の範囲第７４項に記載の免疫複合体。８３．上記多糖類がデキストランである、請求の範囲第７４項に記載の免疫複合体。８４．上記ポリオールがポリエチレングリコールである、請求の範囲第７４項に記載の免疫複合体。８５．（ａ）複数の基部遊離スルフヒドリル基を生じさせるには十分な量であるが、抗原を免疫学的に不活性にさせるかまたは抗体重鎖を完全に切断するには不十分な量の、ジスルフィド基を切断する還元剤で、標的細胞もしくは病原性微生物の抗原に特異的に結合する無傷の抗体を部分的に還元し、（ｂ）ペプシンまたはパパインを用いて、該部分的に還元された抗体を酵素切断して、Ｆ（ａｂ’）₂もしくはＦ（ａｂ）₂フラグメントを生じさせ、該フラグメントを回収する工程、および（ｃ）該Ｆ（ａｂ’）₂もしくはＦ（ａｂ）₂フラグメントを、チオール反応性リンカーと結合した少なくとも１つの多糖類もしくはポリオール基と反応させて、該多糖類もしくはポリオール基を該フラグメントに複合させ、生じた複合体を回収し、さらに、（ｄ）ジスルフィド基を切断する還元剤を用いて、該（ｃ）工程の生成物の重鎖と結合した残余ジスルフィド基を切断し、少なくとも１つの遊離スルフヒドリル基をもつ、生じた多糖類−もしくはポリオール一複合Ｆａｂ’もしくはＦａｂフラグメントを回収し、（ｅ）該（ｄ）工程の生成物を、薬剤、もしくは機能的なレセプター結合ドメインが欠けており、チオール反応性リンカーに結合した修飾毒素と反応させて、生じた低免疫原性免疫複合体を回収する工程、または、（ｃ′）該（ａｂ’）₂もしくはＦ（ａｂ）₂フラグメントを、薬剤、もしくは機能的なレセプター結合ドメインが欠けており、チオール反応性リンカーに結合した修飾毒素と反応させて、生じた複合体を回収し、（ｄ′）ジスルフィド基を切断する還元剤で、該（ｃ′）工程の生成物の重鎖と結合した残余ジスルフィド基を切断し、少なくとも１つの遊離スルフヒドリル基をもつ、生じた薬剤−もしくは修飾毒素−複合Ｆａｂ’もしくはＦａｂフラグメントを回収し、（ｅ′）該（ｄ′）工程の生成物を、チオール反応性リンカーに結合した少なくとも１つの多糖類もしくはポリオール基と反応させて、該フラグメントに該多糖類もしくはポリオール基を複合させ、生じた低免疫原性免疫複合体を回収する工程、を含む低免疫原性免疫複合体の製造方法。８６．上記（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）の工程が使用される、請求の範囲第８５項に記載の製造方法。８７．上記（ｃ′）、（ｄ′）および（ｅ′）の工程が使用される、請求の範囲第８５項に記載の製造方法。８８．上記チオール反応性リンカーがマレイミド基を含む、請求の範囲第８５項に記載の製造方法。８９．請求の範囲第８６項または第８７項に記載の製造方法によって製造される低免疫原性免疫複合体。９０．（ａ）請求の範囲第７４項または第８９項に記載の免疫複合体、および（ｂ）医薬的に許容できる注射賦形剤を含む、殺菌済み注射可能組成物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 38/43 Ｃ０７Ｋ 14/435 8318−4Ｈ 16/10 8318−4Ｈ 16/18 8318−4Ｈ 16/30 8318−4Ｈ 9455−4ＣＡ６１Ｋ 37/48 (72)発明者レンティーン‐ジョーンズ，アナスタシアアメリカ合衆国、08867 ニュー・ジャージー、ピッツタウン、アール・アール＃３、ボックス 354 (72)発明者ゴールデンバーグ，デイヴィッド・エムアメリカ合衆国、07945 ニュー・ジャージー、メンダム、プレザント・ヴァリー・ロード 30

Claims

【特許請求の範囲】１．毒素もしくは薬剤と複合したタンパク質であって、該複合体が、薬剤もしくは機能的レセプター結合ドメインを欠いた天然毒素である修飾毒素と、標的細胞もしくは病原微生物の物質と反応するタンパク質とを含み、該標的物質が該複合体を細胞もしくは微生物の細胞質内に内在化させ、複合前に該タンパク質が、複合部位になる少なくとも１個のメルカプト基を有するものである複合タンパク質。２．上記タンパク質がペプチド、ポリペプチド、ホルモン、リンホカイン、成長因子、アルブミン、サイトカイン、酵素、免疫調節物質、レセプタータンパク質、抗体または抗体フラグメントである請求の範囲第１項に記載の複合タンパク質。３．上記タンパク質が、複合前にジメルカプトタンパク質を形成するために還元される少なくとも１個のジスルフィド結合を有する、請求の範囲第１項に記載の複合タンパク質。４．上記ジメルカプトタンパク質が免疫グロブリン、単クローン性抗体またはその特異的結合フラグメントである、請求の範囲第３項に記載の複合タンパク質。５．上記フラグメントがＦ（ａｂ）₂またはＦ（ａｂ’）₂である、請求の範囲第４項に記載の複合タンパク質。６．上記タンパク質がＦｖ、単鎖抗体、ＦａｂまたはＦａｂ’である、請求の範囲第１項に記載の複合タンパク質。７．上記タンパク質が、リンパ腫、癌腫、肉腫、白血病またはミエローマ上に存在する腫瘍関連抗原と反応する抗体もしくは抗体フラグメントである、請求の範囲第１項に記載の複合タンパク質。８．上記フラグメントがＦ（ａｂ）₂、Ｆ（ａｂ’）₂、ＦａｂまたはＦａｂ ’である、請求の範囲第７項に記載の複合タンパク質。９．上記毒素がアブリン、アルファ毒素、ジフテリア毒素、外毒素、ゲロニン、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、リシンまたはサポリンであり、上記薬剤がピューロマイシン、シクロヘキシミドまたはリボヌクレアーゼである、請求の範囲第１項に記載の複合タンパク質。１０．上記外毒素が修飾シュードモナス外毒素である、請求の範囲第９項に記載の複合タンパク質。１１．免疫原性の少ない複合体を作製するために炭水化物ポリマーまたはポリオール基と結合させた、請求の範囲第１項に記載の複合タンパク質。１２．上記炭水化物ポリマーまたはポリオール基が、デキストラン、多糖類またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求の範囲第１１項に記載の複合タンパク質。１３．上記細胞もしくは病原体の標的物質が膜レセプターである、請求の範囲第１項に記載の複合タンパク質。１４．上記標的物質が細胞内抗原またはレセプターである、請求の範囲第１項に記載の複合タンパク質。１５．上記標的物質がウイルス抗原またはウイルス誘発抗原である、請求の範囲第１項に記載の複合タンパク質。１６．毒素もしくは薬剤と複合した抗体もしくは抗体フラグメントであって、該複合体が、薬剤もしくは機能的レセプター結合ドメインを欠いた天然毒素である修飾毒素と、癌細胞上に存在する腫瘍関連抗原と反応する抗体もしくは抗体フラグメントとを含み、該抗原が該複合体を癌細胞内に内在化させ、複合前に該抗体もしくは抗体フラグメントが、複合部位になる少なくとも１個のメルカプト基を有するものである複合抗体もしくは複合抗体フラグメント。１７．上記フラグメントがＦｖ、単鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）₂ またはＦ（ａｂ’）₂である、請求の範囲第１６項に記載の複合体。１８．上記フラグメントがＦ（ａｂ）₂、Ｆ（ａｂ’）₂、ＦａｂまたはＦａｂ’である、請求の範囲第１６項に記載の複合体。１９．上記毒素がアブリン、アルファ毒素、ジフテリア毒素、外毒素、ゲロニン、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、リシンまたはサポリンであり、上記薬剤がピューロマイシン、シクロヘキシミドまたはリボヌクレアーゼである、請求の範囲第１６項に記載の複合体。２０．上記外毒素が修飾シュードモナス外毒素である、請求の範囲第１９項に記載の複合体。２１．免疫原性の少ない複合体を作製するために炭水化物ポリマーまたはポリオール基と結合させた、請求の範囲第１６項に記載の複合体。２２．上記炭水化物ポリマーまたはポリオール基が、デキストラン、多糖類またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求の範囲第２１項に記載の複合体。２３．毒素もしくは薬剤と複合した抗体もしくは抗体フラグメントであって、該複合体が、薬剤もしくは機能的レセプター結合ドメインを欠いた天然毒素である修飾毒素と、標的細胞もしくは病原体に付随する物質と反応する抗体もしくは抗体フラグメントとを含み、該標的細胞もしくは病原体に付随する物質が、該複合体を該細胞もしくは病原体の細胞質内に内在化させるものであり、該抗体もしくは抗体フラグメントが、毒素もしくは薬剤との複合前に処理されて、重鎖間のジスルフィド結合が切断され、複合部位になることができる遊離スルフヒドリル基を生成するものである、複合抗体または複合抗体フラグメント。２４．上記フラグメントがＦｖ、単鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）₂ またはＦ（ａｂ’）₂である、請求の範囲第２３項に記載の複合体。２５．上記フラグメントがＦ（ａｂ）₂、Ｆ（ａｂ’）₂、ＦａｂまたはＦａｂ’である、請求の範囲第２３項に記載の複合体。２６．上記毒素がアブリン、アルファ毒素、ジフテリア毒素、外毒素、ゲロニン、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、リシンまたはサポリンであり、上記薬剤がピューロマイシン、シクロヘキシミドまたはリボヌクレアーゼである、請求の範囲第２３項に記載の複合体。２７．上記外毒素が修飾シュードモナス外毒素である、請求の範囲第２６項に記載の複合体。２８．免疫原性の少ない複合体を作製するために炭水化物ポリマーまたはポリオール基と結合させた、請求の範囲第２３項に記載の複合体。２９．上記炭水化物ポリマーまたはポリオール基が、デキストラン、多糖類またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求の範囲第２８項に記載の複合体。３０．医薬的に許容できる担体中に抗体もしくは抗体フラグメント複合体を含む組成物の、リンパ腫もしくは白血病をもつ患者の治療方法で使用する医薬の調製における使用であって、該複合体が、機能的なレセプター結合ドメインを欠いた天然の毒素である修飾毒素と、リンパ腫もしくは白血病に付随する腫瘍関連抗原と反応する抗体もしくは抗体フラグメントとを含み、該患者に細胞毒性量の該医薬を投与し、さらに、該抗原が悪性リンパ腫もしくは白血病細胞内に該複合体を内在化させるものである該組成物の使用。３１．上記リンパ腫がＢ細胞リンパ腫もしくは白血病である、請求の範囲第３０項に記載の使用。３２．上記抗体フラグメントがＦｖＮ単鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）₂またはＦ（ａｂ’）₂である、請求の範囲第３０項に記載の使用。３３．上記毒素がアブリン、アルファ毒素、ジフテリア毒素、外毒素、ゲロニン、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、リシンまたはサポリンである、請求の範囲第３０項に記載の使用。３４．上記外毒素が修飾シュードモナス外毒素である、請求の範囲第３３項に記載の使用。３５．免疫原性の少ない複合体を作製するために炭水化物ポリマーまたはポリオール基と結合させた、請求の範囲第３０項に記載の使用。３６．上記炭水化物ポリマーまたはポリオール基が、デキストラン、多糖類またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求の範囲第３５項に記載の使用。３７．上記抗原が膜レセプターである、請求の範囲第３０項に記載の使用。３８．上記抗原が細胞内抗原またはレセプターである、請求の範囲第３０項に記載の使用。３９．腫瘍によって産生される抗原または腫瘍関連抗原に特異的であるＦａｂ’抗体フラグメントを含む複合体の、癌の治療方法で使用する医薬の製造における使用であって、該フラグメントが機能的なレセプター結合ドメインを欠いた天然の毒素である修飾毒素と複合されており、該癌の治療が、該抗原を産生するかまたは該抗原と関連する癌をもつヒト患者に非経口的に細胞毒性量の当該医薬を投与することを含み、該抗原が該癌細胞内に該複合体を内在化させるものである該複合体の使用。４０．上記毒素がアブリン、アルファ毒素、ジフテリア毒素、外毒素、ゲロニン、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、リシンまたはサポリンである、請求の範囲第３９項に記載の使用。４１．上記外毒素が修飾シュードモナス外毒素である、請求の範囲第４０項に記載の使用。４２．免疫原性の少ない複合体を作製するために炭水化物ポリマーまたはポリオール基と結合させた、請求の範囲第３９項に記載の使用。４３．上記炭水化物ポリマーまたはポリオール基が、デキストラン、多糖類またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求の範囲第４２項に記載の使用。４４．上記抗原が膜レセプターである、請求の範囲第３９項に記載の使用。４５．上記抗原が細胞内抗原またはレセプターである、請求の範囲第３９項に記載の使用。４６．（ａ）抗体複合体もしくは抗体フラグメント複合体であって、該複合体が、薬剤もしくは機能的レセプター結合ドメインを欠く天然毒素である修飾毒素と、癌細胞もしくは病原体上に存在する抗原と反応する抗体もしくは抗体フラグメントとを含み、該抗原が該複合体を該細胞もしくは病原体内に内在化させるものである複合抗体もしくは複合抗体フラグメント、および（ｂ）医薬的に許容できる注射用賦形剤を含む、殺菌済み注射可能組成物。４７．上記毒素がアブリン、アルファ毒素、ジフテリア毒素、外毒素、ゲロニン、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、リシンまたはサポリンである、請求の範囲第４６項に記載の組成物。４８．（ａ）機能的なレセプター結合ドメインを欠く天然毒素である修飾毒素と、標的細胞もしくは病原体の物質と反応するタンパク質とを含む、毒素と複合したタンパク質、および（ｂ）医薬的に許容できる注射用賦形剤を含む殺菌済み注射可能組成物であって、該標的細胞もしくは病原体の物質が該複合体を細胞の細胞質内に内在化させるものであり、複合前に該タンパク質が、複合のための部位となる少なくとも１個のメルカプト基を有するものである無菌的注射可能組成物。４９．上記タンパク質がペプチド、ポリペプチド、ホルモン、リンホカイン、成長因子、アルブミン、サイトカイン、酵素、免疫調節物質、レセプタータンパク質、抗体または抗体フラグメントである、請求の範囲第４８項に記載の組成物。５０．上記タンパク質が免疫グロブリン、単クローン性抗体またはその特異的結合フラグメントである、請求の範囲第４８項に記載の組成物。５１．上記タンパク質が抗体フラグメントである請求の範囲第５０項に記載の組成物。５２．上記フラグメントがＦ（ａｂ）²またはＦ（ａｂ’）₂である、請求の範囲第５１項に記載の組成物。５３．上記フラグメントがＦｖ、単鎖抗体、ＦａｂまたはＦａｂ’である、請求の範囲第５１項に記載の組成物。５４．上記タンパク質か、リンパ腫もしくは白血病細胞上に存在する腫瘍関連抗原と反応する抗体もしくは抗体フラグメントである、請求の範囲第４８項に記載の組成物。５５．上記タンパク質が、癌細胞上に存在する腫瘍関連抗原と反応する抗体もしくは抗体フラグメントである、請求の範囲第４８項に記載の組成物。５６．上記タンパク質か、病原体に付随する抗原と反応する抗体もしくは抗体フラグメントである、請求の範囲第４８項に記載の組成物。５７．上記病原体がウイルス、原虫または細菌である、請求の範囲第５６項に記載の組成物。５８．上記フラグメントがＦ（ａｂ）₂、Ｆ（ａｂ’）²、ＦａｂまたはＦａｂ’である、請求の範囲第５４項に記載の組成物。５９．上記毒素がアブリン、アルファ毒素、ジフテリア毒素、外毒素、ゲロニン、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、リシンまたはサポリンであり、上記薬剤がピューロマイシン、シクロヘキシミドまたはリボヌクレアーゼである、請求の範囲第４８項に記載の組成物。６０．上記外毒素が修飾シュードモナス外毒素である、請求の範囲第５９項に記載の組成物。６１．免疫原性の少ない複合体を作製するために炭水化物ポリマーまたはポリオール基と結合させた、請求の範囲第４８項に記載の組成物。６２．上記炭水化物ポリマーまたはポリオール基が、デキストラン、多糖類またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求の範囲第６１項に記載の組成物。６３．上記抗原が膜レセプターである、請求の範囲第４８項に記載の組成物。６４．上記抗原が細胞内抗原またはレセプターである、請求の範囲第４８項に記載の組成物。６５．上記抗原がウイルス抗原またはウイルス誘発抗原である、請求の範囲第４８項に記載の組成物。６６．薬剤もしくは機能的なレセプター結合ドメインを欠いた毒素と、少なくとも１個のジスルフィド結合を有するタンパク質前駆体由来のタンパク質とを含む複合体の調製方法であって、（ａ）該タンパク質前駆体をジスルフィド還元剤と反応させ、ジメルカプトタンパク質を生成し、（ｂ）該毒素もしくは薬剤と該ジメルカプトタンパク質とを接触させて該複合体を生成する工程を含む該複合体の調製方法。６７．上記タンパク質前駆体がペプチド、ポリペプチド、ホルモン、リンホカイン、成長因子、アルブミン、サイトカイン、酵素、免疫調節剤、レセプタータンパク質、抗体または抗体フラグメントである、請求の範囲第６６項に記載の方法。６８．上記タンパク質前駆体が免疫グロブリン、単クローン性抗体、多クローン性抗体、またはその特異的結合フラグメントである、請求の範囲第６６項に記載の方法。６９．抗体フラグメントかＦ（ａｂ）₂、Ｆ（ａｂ’）²、ＦａｂまたはＦａｂ’である請求の範囲第６６項に記載の方法。７０．上記ジメルカプトタンパク質が上記毒素との接触前に安定化されている請求の範囲第６６項に記載の方法。７１．上記ジメルカプトタンパク質が凍結乾燥によって安定化されている請求の範囲第６９項に記載の方法。７２．Ｆａｂ’抗体フラグメントと、機能的なレセプター結合ドメインを欠いた薬剤もしくは毒素とを含む複合体の製造方法であって、（ａ）複数の基部遊離スルフヒドリル基を生じるために十分な量であるが、該抗体を免疫学的に不活性にするには不十分な量の、ジスルフィド複合体を切断するための還元剤で、無傷の抗体を部分的に還元し、さらに該部分的に還元された抗体を回収し、（ｂ）該部分的に還元された抗体を切断して、還元されたＦ（ａｂ’）₂フラグメントを生じさせ、（ｃ）該部分的に還元されたＦ（ａｂ’）₂フラグメントの溶液を機能的な結合ドメインを欠く毒素もしくは薬剤と接触させる工程を含む該複合体の製造方法。７３．（ａ）少なくとも１個の付属スルフヒドリル基を有するタンパク質と、（ｂ）機能的なレセプター結合ドメインを欠く毒素もしくは薬剤との混合物を、溶液中で接触させ、生じた複合体の溶液を回収する工程を含む、タンパク質と毒素もしくは薬剤の複合体の製造方法。