JP2023549933A - 親和性が低下した改変ｅｇｆｒ抗体、薬物複合体及びその使用 - Google Patents

親和性が低下した改変ｅｇｆｒ抗体、薬物複合体及びその使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、ヒトＥＧＦＲタンパク質に結合する単離された抗体及び前記抗体のＡＤＣを提供する。本発明はまた、前記抗体及びＡＤＣを含む医薬組成物、並びにがんを治療する方法を提供する。

Description

発明の詳細な説明
＜関連出願の相互参照＞
本出願は、出願日が２０２０年１１月２０日である国際出願ＰＣＴ／ＣＮ２０２０／１３０４０９、及び出願日が２０２０年１１月２０日である国際出願ＰＣＴ／ＣＮ２０２０／１３０４１７の優先権を主張する。本出願には、引用により上記二つの特許出願に開示された全文が組み込まれる。
〔背景技術〕
抗体は、外来病原体に対する重要な免疫分子である。モノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ｍＡｂ）技術の発展により、モノクローナル抗体が疾患の研究、診断、治療に広く使用されるようになっている。第一世代ｍＡｂ（主に単一特異性的な二価ｍＡｂ）の治療的使用は、がん、自己免疫疾患、及び感染症を含む様々な疾患の治療に成功した。しかし、固形腫瘍などの多くの疾患は、抗体ベースの治療法に対して非常に強い抵抗力を示している。
抗体薬物複合体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＡＤＣ）は、活性傷害性薬物と化学的に結合したｍＡｂであるため、ｍＡｂの標的特異性と細胞傷害性薬物のがん殺傷能力を備えている。特定のｍＡｂ－傷害性薬物の組み合わせを選択する能力、及びｍＡｂと薬物の結合の進歩は、健康な組織の曝露を最小限に抑えながら、がんを標的とする新しい可能性を提供した。２０１９年の時点で、Ａｄｏ－トラスツズマブエムタンシン（ａｄｏ－ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ｅｍｔａｎｓｉｎｅ、ＫａｄｃｙｌａＴＭ）、ブレンツキシマブベドチン（ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ、ＡｄｃｅｔｒｉｓＴＭ）、イノツズマブオゾガマイシン（ｉｎｏｔｕｚｕｍａｂ ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ、ＢｅｓｐｏｎｓａＴＭ）、ゲムツズマブオゾガマイシン（ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ、ＭｙｌｏｔａｒｇＴＭ）、ポラツズマブベドチン－ｐｉｉｑ（ｐｏｌａｔｕｚｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ－ｐｉｉｑ、ＰｏｌｉｖｙＴＭ）、エンホルツマブベドチン（Ｅｎｆｏｒｔｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ、ＰａｄｃｅｖＴＭ）、及びトラスツズマブデルクステカン（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ｄｅｒｕｘｔｅｃａｎ、ＥｎｈｅｒｔｕＴＭ）という合計七つのＡＤＣがＦＤＡによって承認され、これらはすべて細胞傷害性薬物と二価ｍＡｂとのコンジュゲートを含んでいる。現在、市販が承認されたこれらの七つのＡＤＣ薬物に加えて、多数のＡＤＣが臨床開発中である。
上皮成長因子受容体（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ１又はｃ－ｅｒｂＢ－１とも呼ばれる）は、１７０ｋＤａの膜貫通型糖タンパク質であり、細胞表面受容体チロシンキナーゼファミリーのメンバーである［１，２］。ＥＧＦＲは、非小細胞肺がん、乳がん、結腸直腸がん、頭頸部がん、及び膠芽腫など、多くの上皮腫瘍で異常に活性化される［３－８］。受容体の過剰発現、遺伝子増幅、活性化突然変異、受容体リガンドの過剰発現及び／又はＥＧＦＲ活性調節因子の欠失は、ＥＧＦＲの異常な活性化を引き起こすことができる。
受容体の細胞外ドメイン上のＥＧＦＲ結合部位をブロックするか、又は細胞内チロシンキナーゼ活性を阻害することによってＥＧＦＲシグナル伝達を中断することで、ＥＧＦＲ発現腫瘍の増殖を阻害し、患者の状態を改善することができる［９－１１］。抗ＥＧＦＲ抗体は、細胞表面の受容体に結合してリガンド結合を妨害することで抗腫瘍効果を発揮し、その下流のシグナル伝達経路を阻害する［１２，１３］。
セツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、ニモツズマブ（ｎｉｍｏｔｕｚｕｍａｂ）、パニツムマブ（ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）、ネシツムマブ（ｎｅｃｉｔｕｍｕｍａｂ）など、ＥＧＦＲのいくつかのリガンドブロッキング抗体は、様々な種類のがんの治療薬として承認されている［１３］。パニツムマブは、ＥＧＦＲを強力かつ特異的に標的とする臨床的に検証された抗体である。しかし、ＥＧＦＲは正常組織でも発現するため、パニツムマブの臨床反応はしばしば著しい毒性を伴う［１４］。また、パニツムマブの非常に高い親和性（ＫＤ＝１０－１１Ｍ）はＥＧＦＲ／ＥＧＦ結合の強力な遮断薬にするものの、パニツムマブは細胞傷害性薬物との潜在的な更なる複合化の副作用のため、ＡＤＣの構築には望ましくないものとなる。
〔発明の概要〕
本開示の一態様は、（ａ１）それぞれ配列番号１４、配列番号１５、及び配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、及びＣＤＲ３領域を含む、重鎖可変ドメインと、（ｂ１）それぞれ配列番号２０、配列番号２１、及び配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、及びＣＤＲ３領域を含む、軽鎖可変ドメインと、を含む単離された抗体を提供する。本開示は、（ａ２）それぞれ配列番号１４、配列番号１６、及び配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、及びＣＤＲ３領域を含む、重鎖可変ドメインと、（ｂ２）それぞれ配列番号１９、配列番号２２、及び配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、及びＣＤＲ３領域を含む、軽鎖可変ドメインと、を含む別の単離された抗体を提供する。本開示は、（ａ３）それぞれ配列番号１４、配列番号１５、及び配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、及びＣＤＲ３領域を含む、重鎖可変ドメインと、（ｂ３）それぞれ配列番号２０、配列番号２２、及び配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、及びＣＤＲ３領域を含む、軽鎖可変ドメインと、を含む別の単離された抗体を提供する。本開示は、（ａ４）それぞれ配列番号１４、配列番号１６、及び配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、及びＣＤＲ３領域を含む、重鎖可変ドメインと、（ｂ４）それぞれ配列番号２０、配列番号２１、及び配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、及びＣＤＲ３領域を含む、軽鎖可変ドメインと、を含む別の単離された抗体を提供する。これらの抗体は、ヒトＥＧＦＲタンパク質と特異的に結合する。いくつかの実施形態において、前記抗体は、ヒトＥＧＦＲに結合するＫＤ値の範囲が約１×１０－９Ｍ～約５×１０－８Ｍである。
本開示の一態様は、（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む可変ドメインを有する重鎖、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む可変ドメインを有する軽鎖；又は（ｂ）配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む可変ドメインを有する重鎖、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む可変ドメインを有する軽鎖；又は（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む可変ドメインを有する重鎖、及び配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む可変ドメインを有する軽鎖；又は（ｄ）配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む可変ドメインを有する重鎖、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む可変ドメインを有する軽鎖；を含む単離された抗体を提供する。
本開示の別の態様は、（ａ）配列番号７に示されるアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖；又は（ｂ）配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖；又は（ｃ）配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖；又は（ｄ）配列番号７に示されるアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖；又は（ｅ）配列番号９に示されるアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖；を含む単離された抗体を提供する。
本願に記載の抗体は、モノクローナル抗体であってもよい。いくつかの実施形態において、本開示に記載の抗体は、重鎖に一つのアミノ酸突然変異及び軽鎖に一つのアミノ酸突然変異を有する抗体パニツムマブ（Ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）と見なすことができ、これはＥＧＦＲを標的とする最初の完全ヒトモノクローナル抗体である。軽鎖の突然変異がＹ３２Ａである場合、重鎖の突然変異はＴ１０３Ａであってもよく、又は軽鎖の突然変異がＤ５０Ａである場合、重鎖の突然変異はＴ５９Ａであってもよい。
さらなる態様において、さらに本発明に記載の抗体をコードする核酸分子、前記核酸分子を含む発現ベクター、及び前記発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
本開示のさらなる態様は、化学リンカーを介して細胞傷害性薬物にコンジュゲートされた本発明に記載の抗体を含む、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）又はその薬学的に許容される塩を提供する。いくつかの実施形態において、前記細胞傷害性薬物は、モノメチルアウリスタチンＥ（ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｅ、ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｆ、ＭＭＡＦ）、アウリスタチンＥ（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｅ）、アウリスタチンＦ（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｆ）、メイタンシンＤＭ１（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ ＤＭ１）とＤＭ４、メイタンシノール（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｌ）、サンドラマイシン（ｓａｎｄｒａｍｙｃｉｎ）、ピロロベンゾジアゼピン（ｐｙｒｒｏｌｏｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ）、ピロロベンゾジアゼピン二量体（ｐｙｒｒｏｌｏｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ ｄｉｍｅｒ）、アントラサイクリン系（ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅ）、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、ドラスタチン１０（ｄｏｌａｓｔａｔｉｎ １０）、デュオカルマイシン（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、タイランスタチンＡ（ｔｈａｉｌａｎｓｔａｔｉｎ Ａ）、ウンシアラマイシン（ｕｎｃｉａｌａｍｙｃｉｎ）、アマニチン（ａｍａｎｉｔｉｎ）、リシン（ｒｉｃｉｎ）、ジフテリア毒素（ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ ｔｏｘｉｎ）、エリブリン（ｅｒｉｂｕｌｉｎ）、１３１Ｉ、インターロイキン（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ）、腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ）、ケモカイン（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）、イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ、ＳＮ３８）、エキサテカン（ｅｘａｔｅｃａｎ）及びナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）からなる群より選択され得る。
前記抗体部分と前記細胞傷害性薬物とを連結する化学リンカーは、切断可能であっても切断不可能であってもよい。いくつかの実施形態において、前記リンカーは、ＰＥＧｎスペーサー領域を含み、ここで、ｎが１～２０である（即ち、１～２０の繰り返し単位（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）を有する）。いくつかの実施形態において、前記化学リンカーは、ＰＥＧｎスペーサー領域に接続されたリンカー断片をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記化学リンカーは、ＰＥＧｎスペーサー領域を含まないリンカー断片を含む。いくつかの実施形態において、前記リンカー断片は、６－マレイミドカプロイル（６－ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌ、ＭＣ）、マレイミドプロピオニル（ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎｙｌ、ＭＰ）、バリン－シトルリン（Ｖａｌ－Ｃｉｔ）、アラニン－フェニルアラニン（Ａｌａ－Ｐｈｅ）、ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル（ｐ－ａｍｉｎｏｂｅｎｚｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ、ＰＡＢ）、６－マレイミドカプロイル－バリン－シトルリン－ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル（ＭＣ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ）、Ｍａｌ－ＰＥＧｎ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ（ｎ＝１～２０）、Ｐｈｅ－Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）－ＰＡＢ、Ａｌｏｃ－Ｄ－Ａｌａ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）－ＰＡＢ－ＰＮＰ、Ｂｏｃ－Ｐｈｅ－（Ａｌｌｏｃ）Ｌｙｓ－ＰＡＢ－ＰＮＰ及びパーフルオロフェニル ３－（ピリジン－２－イルジスルファニル）プロパノエート（ｐｅｒｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ ３－（ｐｙｒｉｄｉｎｅ－２－ｙｌｄｉｓｕｌｆａｎｙｌ）ｐｒｏｐａｎｏａｔｅ）、又はそれらの組み合わせからなる群より選択され得る。
本開示のさらなる態様は、本発明の一つ又は複数の抗体、一つ又は複数のＡＤＣ又はその薬学的に許容される塩、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
本開示のさらなる態様は、治療有効量の本明細書に記載の医薬組成物を被験者に投与することを含む、ヒト被験者のがんなどの疾患を治療する方法を提供する。前記がんは、非小細胞肺がん（ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ）、表皮がん（ｅｐｉｄｅｒｍｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、乳がん（ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ）、結腸直腸がん（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ）、卵巣がん（ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ）、子宮頸がん（ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ）、膀胱がん（ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ）、食道がん（ｏｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｃａｎｃｅｒ）、頭頸部がん（ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｃａｎｃｅｒ）、膠芽腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍ）、及び鼻咽頭がん（ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｃａｎｃｅｒ）を含んでもよい。
〔図面の説明〕
〔図１〕ＥＧＦＲタンパク質の抗体結合部位表面とパニツムマブのＣＤＲとの相互作用の模式図を示す。（Ａ）パニツムマブ軽鎖ＣＤＲはＥＧＦＲドメインＩＩＩの末端β－鎖と相互作用する。上のＥＧＦＲは、下のパニツムマブのＬ１、Ｌ２及びＬ３ ＣＤＲと相互作用する。（Ｂ）パニツムマブ重鎖ＣＤＲはＥＧＦＲドメインＩＩＩのβ－シート表面と相互作用し、ＥＧＦＲに結合する。ＥＧＦＲは、Ｈ１、Ｈ２、及びＨ３ ＣＤＲ領域の上に示されている。突然変異を起こしたアミノ酸は丸で囲まれている。
〔図２〕本発明のいくつかの実施例による抗体の特徴を示す。（ａ）ＨＥＫ２９３細胞で産生された特定の抗体の純度と収量である。（ｂ）還元（Ｒ）抗体と非還元（ＮＲ）抗体のＳＤＳ－ＰＡＧＥプロットである。（ｃ）精製抗体のＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析である。
〔図３〕ＥＧＦＲに対する本発明の実施例による特定の抗体及び他の抗体の結合曲線を示す。
〔図４〕本発明の実施例による特定の抗体から製造された二つのＡＤＣのＨＩＣプロファイルを示す。
〔図５〕本発明の実施例による特定のＡＤＣ及びＥＧＦＲ発現がん細胞に対する比較ＡＤＣの細胞毒性曲線を示す：（ａ）Ａ４３１細胞、（ｂ）ＮＵＧＣ３細胞、（ｃ）Ａ４３１細胞、（ｄ）ＮＵＧＣ３細胞。
〔図６〕溶媒で治療したマウスにおける腫瘍体積と比較した、本開示の特定の例示的なＡＤＣで治療したマウスにおける腫瘍体積の経時的変化を示す。
〔具体的な実施形態〕
本開示は、パニツムマブのアミノ酸配列の修飾に基づく抗体を提供する。ＥＧＦＲに対する結合特異性を失うことなく、修飾（又は突然変異）抗体は抗原に対する親和性が低下し、正常組織に対する毒性が低下する。本発明はまた、これらの抗体に基づくＡＤＣを提供する。いくつかの実施形態によれば、親野生型パニツムマブ及び同じ毒素から製造されたＡＤＣと比較して、突然変異抗体から製造されたＡＤＣは、ＥＧＦＲ高発現腫瘍細胞を死滅させる上で同等の効力を保持すると同時に、ＥＧＦＲ低発現細胞に対して顕著に低下する効力を有する。したがって、このような突然変異抗体から製造されたＡＤＣによる治療は、より良い治療ウィンドウを有することができ、パニツムマブ治療に関連するＥＧＦＲ低発現正常皮膚組織に対するオンターゲットオフ腫瘍（ｏｎ－ｔａｒｇｅｔ－ｏｆｆ－ｔｕｍｏｒ）の毒性はより小さい。
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」は、単分子からなる抗体分子の製剤を指す。
「ヒトＥＧＦＲに特異的に結合する」抗体又は分子とは、ヒトＥＧＦＲタンパク質に結合するが、非ヒトＥＧＦＲタンパク質であるタンパク質には実質的に結合しない抗体又はポリペプチド分子を指す。
本開示の一態様は、（ａ１）それぞれ配列番号１４、配列番号１５、及び配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、及びＣＤＲ３領域を含む、重鎖可変ドメインと、（ｂ１）それぞれ配列番号２０、配列番号２１、及び配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、及びＣＤＲ３領域を含む、軽鎖可変ドメインと、を含む単離された抗体を提供する。本開示は、（ｂ１）それぞれ配列番号１４、配列番号１６、及び配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、及びＣＤＲ３領域を含む、重鎖可変ドメインと、（ｂ２）それぞれ配列番号１９、配列番号２２、及び配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、及びＣＤＲ３領域を含む、軽鎖可変ドメインと、を含む別の単離された抗体を提供する。本開示は、（ａ３）それぞれ配列番号１４、配列番号１５、及び配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、及びＣＤＲ３領域を含む、重鎖可変ドメインと、（ｂ３）それぞれ配列番号２０、配列番号２２、及び配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、及びＣＤＲ３領域を含む、軽鎖可変ドメインと、を含む別の単離された抗体を提供する。本開示は、（ａ４）それぞれ配列番号１４、配列番号１６、及び配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、及びＣＤＲ３領域を含む、重鎖可変ドメインと、（ｂ４）それぞれ配列番号２０、配列番号２１、及び配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、及びＣＤＲ３領域を含む、軽鎖可変ドメインと、を含む別の単離された抗体を提供する。これらの抗体は、ヒトＥＧＦＲタンパク質と特異的に結合する。いくつかの実施形態において、前記抗体は、ヒトＥＧＦＲに結合するＫＤ値の範囲が約１×１０－９Ｍ～約５×１０－８Ｍである。
本開示の一態様は、（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む可変ドメインを有する重鎖、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む可変ドメインを有する軽鎖；又は（ｂ）配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む可変ドメインを有する重鎖、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む可変ドメインを有する軽鎖；又は（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む可変ドメインを有する重鎖、及び配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む可変ドメインを有する軽鎖；又は（ｄ）配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む可変ドメインを有する重鎖、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む可変ドメインを有する軽鎖；を含む単離された抗体を提供する。
本開示の別の態様は、（ａ）配列番号７に示されるアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖；又は（ｂ）配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖；又は（ｃ）配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖；又は（ｄ）配列番号７に示されるアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖；又は（ｅ）配列番号９に示されるアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖、を含む単離された抗体を提供する。
出発ポリペプチドのアミノ酸配列突然変異体をコードするＤＮＡは、当該分野で知られている様々な方法によって製造することができる。これらの製造方法には、初期に製造されたポリペプチドをコードするＤＮＡの部位特異的（又はオリゴヌクレオチド媒介）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、及びカセット突然変異誘発が含まれるが、これらに限定されない。組換え抗体の突然変異体は、制限断片操作によって、又は合成オリゴヌクレオチドとのオーバーラップ伸長ＰＣＲによっても構築することができる。突然変異原性プライマーは、システインコドン置換をコードする。標準的な突然変異誘発技術を採用して、そのような突然変異操作された抗体をコードするＤＮＡを生成することができる。
本開示のなおさらなる態様は、本発明に記載の抗体又は任意の前記抗体の抗原結合部分をコードする核酸分子を提供する。前記核酸分子を含む発現ベクターを含む、宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ヒト胚性腎細胞、リンパ球細胞又は微生物（例えば大腸菌、及び酵母などの真菌）であって、本開示の抗体、好ましくはモノクローナル抗体を産生するために使用することができる。一実施形態において、本開示の部分的又は完全長抗体をコードするＤＮＡは、遺伝子が転写及び翻訳制御配列に作動可能に連結されるように一つ又は複数の発現ベクターに挿入される標準的な分子生物学的手法によって得ることができる。「作動可能に連結される（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」という用語は、ベクター内の転写及び翻訳制御配列が抗体遺伝子の転写及び翻訳を調節するという意図された機能を果たすように、抗体遺伝子がベクターに連結されることを意味することを意図する。「制御配列（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」という用語は、抗体遺伝子の転写又は翻訳を制御するプロモーター、エンハンサー及び他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図する。例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ． （１９９０））にこのような制御配列が記載されている。哺乳動物宿主細胞発現の好ましい制御配列には、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ、ＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（Ｓｉｍｉａｎ Ｖｉｒｕｓ ４０、ＳＶ４０）、アデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ、例えばアデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））及びポリオーマウイルス（ｐｏｌｙｏｍａ）に由来するプロモーター及び／又はエンハンサーなどの、哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を指示するウイルスエレメントが含まれる。或いは、ユビキチンプロモーター又はβ－グロビンプロモーターなどの非ウイルス調節配列を使用することができる。さらに、調節エレメントは、ＳＶ４０初期プロモーター及びヒトＴ細胞白血病ウイルス１型の長末端リピートからの配列を含むＳＲαプロモーターシステムなどの異なる供給源からの配列から構成されている（Ｔａｋｅｂｅ ｅｔ ａｌ．， （１９８８） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ８：４６６－４７２）。使用される発現宿主細胞と適合性がある発現ベクター及び発現制御配列を選択する。
抗体をコードするＤＮＡを前記発現ベクターに挿入することができる。組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることができる。抗体をコードするＤＮＡは、シグナルペプチドが抗体のアミノ末端をコードするＤＮＡにインフレームで連結されるようにベクターにクローニングすることができる。前記シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチド又は異種シグナルペプチド（即ち、非免疫グロブリン由来のシグナルペプチド）であってもよい。
本開示のさらなる態様は、化学リンカーを介して細胞傷害性薬物にコンジュゲートされた本発明に記載の抗体を含む、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）又はその薬学的に許容される塩を提供する。いくつかの実施形態において、前記細胞傷害性薬物は、モノメチルアウリスタチンＥ（ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｅ、ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｆ、ＭＭＡＦ）、アウリスタチンＥ（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｅ）、アウリスタチンＦ（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｆ）、メイタンシンＤＭ１（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ ＤＭ１）とＤＭ４、メイタンシノール（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｌ）、サンドラマイシン（ｓａｎｄｒａｍｙｃｉｎ）、ピロロベンゾジアゼピン（ｐｙｒｒｏｌｏｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ）、ピロロベンゾジアゼピン二量体（ｐｙｒｒｏｌｏｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ ｄｉｍｅｒ）、アントラサイクリン系（ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅ）、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、ドラスタチン１０（ｄｏｌａｓｔａｔｉｎ １０）、デュオカルマイシン（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、タイランスタチンＡ（ｔｈａｉｌａｎｓｔａｔｉｎ Ａ）、ウンシアラマイシン（ｕｎｃｉａｌａｍｙｃｉｎ）、アマニチン（ａｍａｎｉｔｉｎ）、リシン（ｒｉｃｉｎ）、ジフテリア毒素（ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ ｔｏｘｉｎ）、エリブリン（ｅｒｉｂｕｌｉｎ）、１３１Ｉ、インターロイキン（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ）、腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ）、ケモカイン（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）、イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ、ＳＮ３８）、エキサテカン（ｅｘａｔｅｃａｎ）及びナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）からなる群より選択され得る。
前記抗体部分と前記細胞傷害性薬物とを連結する化学リンカーは、切断可能であっても切断不可能であってもよい。いくつかの実施形態において、前記リンカーは、ＰＥＧｎスペーサー領域を含み、ここで、ｎが１～２０である（即ち、１～２０の繰り返し単位（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）を有する）。いくつかの実施形態において、前記化学リンカーは、前記ＰＥＧｎスペーサー領域に接続されたリンカー断片をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記化学リンカーは、ＰＥＧｎスペーサー領域を含まないリンカー断片を含む。いくつかの実施形態において、前記リンカー断片は、６－マレイミドカプロイル（６－ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌ、ＭＣ）、マレイミドプロピオニル（ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎｙｌ、ＭＰ）、バリン－シトルリン（Ｖａｌ－Ｃｉｔ）、アラニン－フェニルアラニン（Ａｌａ－Ｐｈｅ）、ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル（ｐ－ａｍｉｎｏｂｅｎｚｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ、ＰＡＢ）、６－マレイミドカプロイル－バリン－シトルリン－ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル（ＭＣ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ）、Ｍａｌ－ＰＥＧｎ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ（ｎ＝１－２０）、Ｐｈｅ－Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）－ＰＡＢ、Ａｌｏｃ－Ｄ－Ａｌａ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）－ＰＡＢ－ＰＮＰ、Ｂｏｃ－Ｐｈｅ－（Ａｌｌｏｃ）Ｌｙｓ－ＰＡＢ－ＰＮＰ及びパーフルオロフェニル ３－（ピリジン－２－イルジスルファニル）プロパノエート（ｐｅｒｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ ３－（ｐｙｒｉｄｉｎｅ－２－ｙｌｄｉｓｕｌｆａｎｙｌ） ｐｒｏｐａｎｏａｔｅ）、又はそれらの組み合わせからなる群より選択され得る。
本開示のさらなる態様において、本発明の一つ又は複数の抗体、一つ又は複数のＡＤＣ又はその薬学的に許容される塩、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。本明細書で使用されるように、「薬学的に許容される担体」は、薬学的に許容される担体、賦形剤又は安定剤を含む。これらには、生理学的に適合する溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、界面活性剤、増粘剤又は乳化剤、固体結合剤、分散剤又は懸濁補助剤、可溶化剤、着色剤、香料、崩壊剤、潤滑剤、甘味料、防腐剤及び等張剤などが含まれるが、これらに限定されない。適切な担体の選択は、当業者の知識の範囲内である。組成物は、一つ又は複数の追加の薬物活性成分、例えば別の抗体及び薬物（例えば、細胞毒性剤又は抗腫瘍剤）を含むことができる。本発明の医薬組成物はまた、例えば別の抗がん剤及び別の抗炎症剤等との併用療法で投与することができる。
前記医薬組成物は、静脈内（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ）、筋肉内（ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ）、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、非経口（ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）、表皮（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ）、及び他の投与経路に適用することができる。投与経路によっては、活性成分を材料にコーティングするか、或いは他の方法で材料又は構造に担持して、それを不活性化する可能性のある酸及び他の自然条件の作用から保護することができる。本明細書で使用される語句「非経口投与」は、経腸及び局所（ｔｏｐｉｃａｌ）投与以外の投与様式を指し、通常は注射による、且つ静脈内、筋肉内、動脈内（ｉｎｔｒａａｒｔｅｒｉａｌ）、髄腔内（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ）、嚢内（ｉｎｔｒａｃａｐｓｕｌａｒ）、眼窩内（ｉｎｔｒａｏｒｂｉｔａｌ）、心臓内（ｉｎｔｒａｃａｒｄｉａｃ）、皮内（ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ）、腹腔内（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ）、経気管（ｔｒａｎｓｔｒａｃｈｅａｌ）、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、表皮下（ｓｕｂｃｕｔｉｃｕｌａｒ）、関節内（ｉｎｔｒａａｒｔｉｃｕｌａｒ）、被膜下（ｓｕｂｃａｐｓｕｌａｒ）、くも膜下（ｓｕｂａｒａｃｈｎｏｉｄ）、脊髄内（ｉｎｔｒａｓｐｉｎａｌ）、硬膜外（ｅｐｉｄｕｒａｌ）及び胸骨内（ｉｎｔｒａｓｔｅｒｎａｌ）注射及び注入が含まれるが、これらに限定されない。或いは、本発明の組成物は、非経口以外の経路、例えば、局所、表皮又は粘膜投与経路（例えば、鼻腔内、経口、膣、直腸、舌下又は局所投与）により投与することができる。
本開示の別の態様は、治療有効量の本明細書に記載の医薬組成物を被験者に投与することを含む、ヒト被験者におけるがんなどの疾患を治療するために使用される方法を提供する。前記がんは、非小細胞肺がん（ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ）、表皮がん（ｅｐｉｄｅｒｍｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、乳がん（ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ）、結腸直腸がん（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ）、卵巣がん（ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ）、子宮頸がん（ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ）、膀胱がん（ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ）、食道がん（ｏｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｃａｎｃｅｒ）、頭頸部がん（ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｃａｎｃｅｒ）、膠芽腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍ）、及び鼻咽頭がん（ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｃａｎｃｅｒ）を含んでもよい。
前記組成物を被験者に投与する場合、投与レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療応答）を提供するように調整することができる。被験者、治療する疾患等に応じて、単回ボーラス又は分割用量を投与することができる。本明細書で使用される投与量単位形態は、治療される被験者のための単一投与量として適した物理的に別個の単位を指す。各ユニットは、必要な薬物担体とともに所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性成分を含有する。徐放性製剤を使用する場合、より少ない投与頻度が必要である。
本開示の抗体又はそのＡＤＣ薬用塩の投与について、前記投与量は、被験者の体重の約０．０００１～１００ｍｇ／ｋｇ、より通常は０．０１～１０ｍｇ／ｋｇであり得る。例えば、投与量は、０．３ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重、又は１０ｍｇ／ｋｇ体重、或いは１～１０ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。適切な治療レジメンは、週に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、及び月に１回などであり得る。本発明の抗ＥＧＦＲ抗体の例示的な投与レジメンは、１ｍｇ／ｋｇ体重又は３ｍｇ／ｋｇ体重の投与量で静脈内投与することを含むことができる。
本発明の抗体又はＡＤＣ又はその薬用塩の「治療有効量」又は「有効量」は、好ましくは、疾患症状の重症度の低減、疾患の無症状期間の頻度及び／又は期間の増加、疾患苦痛による傷害又は障害の可能性の予防又は低減、或いは疾患の進行の阻害又は遅延をもたらす。例えば、担がん被験者の治療に関して、抗体組成物の「治療有効量」は、未治療の被験者に対して少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、さらにより好ましくは少なくとも約６０％、またさらにより好ましくは少なくとも約８０％の腫瘍の増殖を阻害することができる。
実施例
１．低い抗原親和性を有するパニツムマブ突然変異抗体の設計
パニツムマブ／ＥＧＦＲ複合体の高分解能３Ｄ構造解析により、Ｌ３ ＣＤＲは一般的に抗原結合に最も大きく寄与するが、Ｌ２ ＣＤＲはＥＧＦＲドメインＩＩＩのＤ５０とＫ４６５との間の溶媒露出塩架橋のみを介して単一の相互作用を行い、Ｌ１ ＣＤＲはＥＧＦＲドメインＩＩＩのＹ３２とＩ４６６との間の溶媒露出水素結合架橋を介して別の単一の相互作用を行うことが示されている（図１のＡ部分）。これは、Ｌ１／Ｌ２ ＣＤＲは通常、小さな結合寄与しかしないという一般的な考え方と一致している。重鎖側では、Ｈ２及びＨ３ ＣＤＲがパニツムマブとＥＧＦＲドメインＩＩＩとの間の中心に埋め込まれた特定の相互作用の大部分を占めているが、ＥＧＦＲドメインＩＩＩのＴ５９～Ｋ４４３を含むカルボニルに結合するＨ２ ＣＤＲ水素結合は高度に溶媒に暴露されている。Ｈ３は、ＥＧＦＲドメインＩＩＩのＴ１０３とＫ４６５のカルボニルの間に追加の水素結合を形成し、これも高度に溶媒に暴露されている（図１のＢ部分）。上記の相互作用の溶媒暴露の性質により、本発明者らは、ＣＤＲのＬ２Ｄ５０、Ｌ１Ｙ３２、Ｈ２Ｔ５９又はＨ３Ｔ１０３のアミノ酸残基を、短い側鎖を含むアミノ酸で置換すると、わずかな親和性損失しか引き起こさず、抗体／抗原相互作用界面にわずかな混乱を引き起こす可能性があるという仮説を立てた。
アラニンスキャン技術を使用して、同定された各アミノ酸に対してアラニン置換を有する突然変異体を製造した。突然変異抗体が生成される場合、各突然変異の重鎖又は軽鎖は野生型（パニツムマブ）又は突然変異の軽鎖又は重鎖と対になる。生成された八つの単一又は二重突然変異を有する突然変異抗体（それらのＶＨ及びＶＬ領域並びに対応する配列番号は下表に示される）にＥＧＦＲ結合測定を行った。
突然変異抗体を発現するために、コドン最適化及び遺伝子合成を行った。特定の完全長重鎖及び完全長軽鎖ＤＮＡをそれぞれ別々のｐｃＤＮＡ３プラスミドにクローニングした。ペアプラスミドのＨＥＫ２９３細胞を使用して一過性にトランスフェクションし、ワンステッププロテインＡ精製を行って検出に十分なタンパク質を製造した。このような形で製造された抗体は発現が良好で、収率が高く、ワンステッププロテインＡ精製プロセスで高純度の精製を行うことができる（図２のａ、ｂ、ｃ部分）。
２．突然変異抗体のＥＧＦＲ結合親和性の測定
ＥＬＩＳＡ法を使用して、突然変異抗体と対照野生型（ｗｔ）抗体との間のＥＧＦＲ結合能力を検出・比較した。突然変異抗体サンプル又は対照抗体を、１０μｇ／ｍＬから連続的に５倍希釈し、合計８回希釈し、９６ウェルプレートにコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。４００００倍希釈のＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体（Ｓｉｇｍａ、Ａ０１７０）を検出試薬として、ＴＭＢを用いて比色反応を行い、４５０／６５０ｎｍでマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ １９０）を用いてプレート上の吸光度を読み取り、用量反応曲線形式の４つのパラメータロジスティックモデルを用いてデータ解析を行った。
図３の結果より、Ｈ２Ｔ５９（ＢＢ０５００－２ｆ１）又はＬ２Ｄ５０（ＢＢ０５００－２ｆ２）一点アラニン置換が当該突然変異抗体のＥＧＦＲ結合活性のＥＣ５０に小さな影響を与えることが示されている。一方、Ｈ３Ｔ１０３（ＢＢ０５００－２ｇ１）一点アラニン置換が当該突然変異抗体のＥＧＦＲ結合活性に大きな影響を与え（ＥＣ５０～１００倍変化）、Ｌ１Ｙ３２（ＢＢ０５００－２ｇ２）の突然変異はＥＧＦＲ結合活性を完全に失わせる。これらの結果から、Ｈ２Ｔ５９及びＬ２Ｄ５０がパニツムマブの全体的な標的結合活性にほとんど寄与していない一方で、Ｈ３Ｔ１０３及びＬ１Ｙ３２がパニツムマブ／ＥＧＦＲ複合体の高親和性会合に決定的に関与しているか、又はこれらの場所でのアラニン置換が抗原結合表面の適切な構造に不利であることが示唆されている。ＢＢ０５００－２ｆ１とＢＢ０５００－２ｆ２の結合曲線の上部プラトーはいずれもｗｔ対照レベルに達しておらず、これは両方の置換が標的結合速度論の逸脱率に影響を与えていることが示唆されている。
二重突然変異の結合プロファイルは、より複雑な状況を明らかにした。まず、Ｈ２Ｔ５９とＬ２Ｄ５０の両方にアラニン置換を有するＢＢ０５００－２ｆは、相加効果があるように考えられ、ＥＣ５０への影響が極めて小さいであるが、上部プラトーがより低い。次に、Ｈ３Ｔ１０３／Ｌ２Ｄ５０（ＢＢ０５００－２ｇｆ）又はＨ２Ｔ５９／Ｌ１Ｙ３２（ＢＢ０５００－２ｆｇ）上の二重アラニン置換は、それぞれＨ３Ｔ１０３又はＬ１Ｙ３２（ＢＢ０５００－２ｇ１又はＢＢ０５００－２ｇ２）上の一点突然変異表現に非常に似ており、Ｈ３Ｔ１０３又はＬ１Ｙ３２上のアラニン置換が突然変異抗体の全体的な結合活性に支配的な影響を及ぼすことが示唆されている。最後に、そして最も驚くべきことに、Ｈ３Ｔ１０３とＬ１Ｙ３２の二重変異（ＢＢ０５００－２ｇ）は、Ｈ２Ｔ５９とＬ２Ｄ５０の二重変異（ＢＢ０５００－２ｆ）に似た良好な結合活性を示している。この二重変異によって結合活性が大幅に救済されたことは、側鎖と標的の相互作用の喪失に加えて、各単一突然変異がＨ２又はＬ２ループの立体構造変化を誘導する可能性があることを示唆している。変異Ｈ２ループはｗｔ Ｌ２ループと衝突する可能性があり、逆もまた同様である。対照的に、変異Ｈ２ループと変異Ｌ２ループは凝集に適している可能性があるため、この特定の二重変異のペアを持つ変異抗体は、全体的なＥＧＦＲ結合活性を大部分保持している。
ヒトＥＧＦＲに対する変異抗体と対照（ｗｔ）抗体のＥＧＦＲ結合親和性は、Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ９６ｅ（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ）で測定した。親和性検出は、ＡＨＣ（ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ Ｆｃ Ｃａｐｔｕｒｅ）バイオセンサーを使用して、ＳＤバッファー（０．０２％Ｔｗｅｅｎ－２０、０．１％ ＢＳＡを含むＰＢＳバッファー、ｐＨ ７．４）で実行した。抗体サンプル又はバッファーを９６ウェルマイクロタイタープレートに配置した。タンパク質固定化の前にベースラインを確立するために、ＳＤバッファーを使用してＡＨＣバイオセンサー（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ）をプリウェットした。抗体サンプルはバイオセンサーに固定化された。ＥＧＦＲへの突然変異抗体又は対照（ｗｔ）抗体の結合会合をモニターし、またその後のＳＤバッファーでの解離をモニターした。突然変異抗体と対照抗体の結合は、各ＥＧＦＲ濃度で評価した。データはデータ収集ソフトウェアによって自動的に生成され、データ分析はＦｏｒｔｅＢｉｏデータ分析ソフトウェアを使用して実行された。
結合親和性データは表２に示される。計算されたｗｔ対照抗体（パニツムマブ）のＫＤは１０－１０Ｍであり、突然変異体（ＢＢ０５００－２ｆ１、ＢＢ０５００－２ｆ２、ＢＢ０５００－２ｎ及びＢＢ０５００－２ｇ）のＫＤは１０～１００倍低下（１×１０－９～５×１０－８Ｍの範囲）であり、これは低親和性抗体ＢＢ０５Ｄ３（ニモツズマブ）に似ている。この低下は主に、解離速度がより速く、会合速度の変化が少ないためである。これらのデータはＥＬＩＳＡデータと一致し、突然変異抗体の飽和結合能力の低下は、突然変異抗体／標的複合体のより速い解離によって実際に引き起こされたという仮説を支持している。
３．突然変異型抗ＥＧＦＲ抗体のコンジュゲートによるＡＤＣの生成
穏やかな還元条件下（ＴＣＥＰ：ｍＡｂ＝１～３、中性ｐＨ、室温下＜２４０分）で、抗体の鎖間ジスルフィド結合を部分的に還元し、薬物‐リンカーにコンジュゲートしてＡＤＣを形成することができる。中性ｐＨのリン酸緩衝液中の精製抗体にＴＣＥＰを加えて部分的に還元し、薬物複合体を生成した。薬物‐リンカー（Ｍａｌ－ＰＥＧ２－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－エリブリン（ｅｒｉｂｕｌｉｎ）又はＭＣ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ）をＤＭＡに加え、抗体と反応させて所望の薬物抗体比（ｄｒｕｇ－ｔｏ－ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒａｔｉｏ、ＤＡＲ）を得た。抗体とＡＤＣの特性評価のために、疎水性相互作用クロマトグラフィー（Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＨＩＣ）を使用してＡＤＣにおける薬物分布及び薬物と抗体のモル比を評価した。非還元型ＡＤＣにＣＥ－ＳＤＳも実施し、遊離軽鎖（Ｌ）、遊離重鎖（Ｈ）、半抗体（ＨＬ）、インタクト抗体（ＬＨＨＬ）、及び一つ又は二つの軽鎖を欠く抗体（ＨＨＬ又はＨＨ）など、ＡＤＣ製品中の非共有結合成分の割合を評価した。
部位特異的薬物コンジュゲートに適した抗体を製造するために、ｗｔパニツムマブ（及びｗｔニモツズマブ）可変配列とアラニン置換配列を含む抗体を、天然のＨ－Ｈ二重ジスルフィド結合の上流に位置して追加のＨ－Ｈ鎖間ジスルフィド結合を有する特別なヒンジ配列を含むフォーマットで製造した。当該追加のＨ－Ｈジスルフィド結合は、鎖間の他のジスルフィド結合よりも還元されやすい。したがって、ＬＣ－ＭＳにより確認されたように、このジスルフィド結合を形成するシステイン残基は、薬物コンジュゲートのための好ましい部位となった。これらの操作された抗体から製造されたＡＤＣは、主にＤＡＲ２ ＡＤＣの形で構成されている（図４のａ部分：エリブリンにコンジュゲートしたＢＢ０５００－２ｆ、図４のｂ部分：エリブリンにコンジュゲートしたＢＢ０５００－２ｇ、図４のｃ部分：エリブリンにコンジュゲートしたＢＢ０５００－２ｎ、図４のｄ部分：ＭＭＡＥにコンジュゲートしたＢＢ０５００－２ｆ、図４のｅ部分：ＭＭＡＥにコンジュゲートしたＢＢ０５００－２ｇ、図４のｆ部分：ＭＭＡＥにコンジュゲートしたＢＢ０５００－２ｎ）。
４．ＥＧＦＲ高／低発現細胞に対する突然変異抗体から製造されたＡＤＣの細胞毒性
変異型ＡＤＣ（ＢＢ０５００－２ｆ／２ｇ／２ｎ－エリブリン、ＢＢ０５００－２ｆ／２ｇ／２ｎ－ＭＭＡＥ）の細胞毒性を調べるために、比色ベースの細胞毒性アッセイにおいて、低親和性ＡＤＣ ＢＢ０５Ｄ３－エリブリン／ＭＭＡＥ（ニモツズマブＡＤＣ）及び野生型パニツムマブＡＤＣ ＢＢ０５００－２ｄ－エリブリン／ＭＭＡＥ（Ｃｔｌ ＡＤＣ）と比較することで、これらのＡＤＣはＥＧＦＲ発現レベルの異なる標的発現がん細胞に対するインビトロ細胞毒性を評価した。アッセイを行うために、標的細胞を細胞株ごとに最適化された細胞密度で９６ウェル平底組織培養プレートに接種し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩（１６～２０時間）インキュベートした。最適な殺傷効果を達成するために、連続的に希釈したＡＤＣサンプルを細胞プレートに移し、アッセイプレートを特定の期間（細胞株に依存して３～５日間）インキュベートした。データ解析は、用量反応曲線の４つのパラメータロジスティックモデルを用いて行った。
図５のａ部分／ｂ部分に示されるように、３つの突然変異型抗体（ＢＢ０５００－２ｆ、ＢＢ０５００－２ｇ、及びＢＢ０５００－２ｎ）と毒素エリブリンからなるＡＤＣは、ＥＧＦＲ高発現細胞（Ａ４３１細胞、図５のａ部分）に対して、ｗｔパニツムマブ配列を含む抗体からなるＡＤＣ（ＢＢ０５００－２ｄ－エリブリン）に似た強力な細胞傷害活性を示している。このＥＧＦＲ高発現細胞に対して、この４つのＡＤＣはすべて、低親和性抗ＥＧＦＲ抗体ニモツズマブからなるＡＤＣ（ＢＢ０５Ｄ３－エリブリン）よりも有効である。対照的に、ＥＧＦＲ低発現細胞株（ＮＵＧＣ３細胞、図５のｂ部分）については、３つの突然変異抗体（ＢＢ０５００－２ｆ／２ｇ／２ｎ）から製造されたＡＤＣの細胞傷害効力はＢＢ０５Ｄ３－エリブリンにより近く、ｗｔパニツムマブ配列を含む抗体からなるＡＤＣの細胞傷害性は著しくより強い。
図５のｃ部分／ｄ部分に示されるように、３つの突然変異抗体（ＢＢ０５００－２ｆ、ＢＢ０５００－２ｇ、ＢＢ０５００－２ｎ）と毒素ＭＭＡＥからなるＡＤＣは、ＥＧＦＲ高発現細胞株（Ａ４３１細胞、図５のｃ部分）又はＥＧＦＲ低発現細胞株（ＮＵＧＣ３細胞、図５のｄ部分）に対して、低親和性抗ＥＧＦＲ抗体ニモツズマブ（ＢＢ０５Ｄ３－エリブリン）からなるＡＤＣに似た強力な細胞傷害活性を示している。これらの４つのＡＤＣはすべて、ＥＧＦＲ高発現又は低発現細胞に対して、ｗｔパニツムマブ配列を含む抗体からなるＡＤＣ（ＢＢ０５００－２ｄ－ＭＭＡＥ）よりも有効ではない。
５．腫瘍異種移植片に対する突然変異抗体から製造されたＡＤＣのインビボ有効性
ヌードマウスで樹立した表皮がん移植片モデル及び肺がん移植片モデルで突然変異型抗体とＭＭＡＥからなるＡＤＣの抗腫瘍活性を評価した。Ａ４３１（表皮がん）及びＮＣＩ－Ｈ４４１（肺がん）細胞を無胸腺のヌードマウスの背中に移植した。担がんマウスを溶媒（対照群）又は５ｍｇ／ｋｇ ＡＤＣ（ＢＢ０５００－２ｆ１－ＭＭＡＥ、ＢＢ０５００－２ｆ２－ＭＭＡＥ、ＢＢ０５００－２ｇ－ＭＭＡＥ又はＢＢ０５００－２ｎ－ＭＭＡＥ）で１回治療した。投与後の異なる時点で腫瘍の体積を測定した。結果は図６に示されるように、Ａ４３１異種移植片モデル（図６のａ部分）及びＮＣＩ－Ｈ４４１異種移植片モデル（図６のｂ部分）において、溶媒で治療したマウスにおける腫瘍体積と比較して、突然変異型抗体から製造されたＡＤＣで治療したマウスにおける腫瘍体積は減少した。
本発明の具体的な実施形態を詳細に説明したが、当業者は、開示された全ての教示に従ってそれらの詳細に様々な修正及び置換を加えることができ、これらの変更の全てが本発明の範囲内に入ることを理解するであろう。本発明の全範囲は、添付の特許請求の範囲及びその任意の均等物によって定義される。
参考文献
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［８］． Ｋａｔｓｕｙａ Ｎａｋａｉ， Ｍｉｅｎ－Ｃｈｉｅ Ｈｕｎｇ， Ｈｉｒｏｈｉｔｏ Ｙａｍａｇｕｃｈｉ， ｅｔ ａｌ． Ａｍ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０１６； ６：１６０９－１６２３．
［９］． Ｄｉａｚ－Ｓｅｒｒａｎｏ， Ａ．， Ｇｅｌｌａ， Ｐ．， Ｊｉｍｅｎｅｚ， Ｅ．， ｅｔ ａｌ． Ｄｒｕｇｓ． ２０１８；７８： ８９３－９１１．
［１０］． Ｅｍｉｌｙ Ｐａｄｆｉｅｌｄ， Ｈａｙｌｅｙ Ｐ． Ｅｌｌｉｓ ， Ｋａｔｈｒｅｅｎａ Ｍ． Ｋｕｒｉａｎ．， ｅｔ ａｌ． Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ． ２０１５； ５：１－８．
［１１］． Ｙｕａｎｈｏｎｇ Ｘｉｅ， Ｙｉｎｇｘｕａｎ Ｃｈｅｎ， Ｊｉｎｇｙｕａｎ Ｆａｎｇ， ｅｔ ａｌ． Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｔｈｅｒａｐｙ． ２０２０； ５：２２．
［１２］． Ｅ． Ｍａｒｔｉｎｅｌｌｉ， Ｒ． Ｄｅ Ｐａｌｍａ， Ｍ． Ｏｒｄｉｔｕｒａ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ． ２００９； １５８： １－９．
［１３］． Ｗｅｎｑｉ Ｃａｉ， Ｌｉｓｉ Ｚｅｎｇ， Ｌｉｆｅｎｇ Ｗａｎｇ， ｅｔ ａｌ． Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ． ２０２０； １０：１－１６．
［１４］． Ｍｅｌａｒｋｏｄｅ Ｓ． Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ， Ａｎａｎｄ Ｅｓｗａｒａｉａｈ， Ｔａｎｉａ Ｃｒｏｍｂｅｔ， ｅｔ ａｌ． ｍＡｂｓ， ２００９；１：４１－４８．
本明細書に記載される全ての特許及び非特許文献の参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
以上、本発明を一つ又は複数の実施形態に関連して説明したが、本発明はそれらの実施形態に限定されるものではなく、その説明は、添付の特許請求の範囲の精神及び範囲内に含まれ得るすべての代替、修正、及び均等物をカバーすることを意図していることを理解されたい。
シーケンスリスト
配列番号１（ＢＢ０５００－２ｆ１、ＢＢ０５００－２ｆ、ＢＢ０５００－２ｎ及びＢＢ０５００－２ｆｇのＶＨ）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＶＳＳＧＤＹＹＷＴＷＩＲＱＳＰＧＫＧＬＥＷＩＧＨＩＹＹＳＧＮＡＮＹＮＰＳＬＫＳＲＬＴＩＳＩＤＴＳＫＴＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＩＹＹＣＶＲＤＲＶＴＧＡＦＤＩＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
配列番号２（ＢＢ０５００－２ｆ１及びＢＢ０５００－２ｇ１のＶＬ）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＦＣＱＨＦＤＨＬＰＬＡＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
配列番号３（ＢＢ０５００－２ｆ２及びＢＢ０５００－２ｇ２のＶＨ）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＶＳＳＧＤＹＹＷＴＷＩＲＱＳＰＧＫＧＬＥＷＩＧＨＩＹＹＳＧＮＴＮＹＮＰＳＬＫＳＲＬＴＩＳＩＤＴＳＫＴＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＩＹＹＣＶＲＤＲＶＴＧＡＦＤＩＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
配列番号４（ＢＢ０５００－２ｆ２、ＢＢ０５００－２ｆ、ＢＢ０５００－２ｎ及びＢＢ０５００－２ｇｆのＶＬ）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＦＣＱＨＦＤＨＬＰＬＡＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
配列番号５（ＢＢ０５００－２ｇ１、ＢＢ０５００－２ｇ及びＢＢ０５００－２ｇｆのＶＨ）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＶＳＳＧＤＹＹＷＴＷＩＲＱＳＰＧＫＧＬＥＷＩＧＨＩＹＹＳＧＮＴＮＹＮＰＳＬＫＳＲＬＴＩＳＩＤＴＳＫＴＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＩＹＹＣＶＲＤＲＶＡＧＡＦＤＩＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
配列番号６（ＢＢ０５００－２ｇ２、ＢＢ０５００－２ｇ及びＢＢ０５００－２ｆｇのＶＬ）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＳＮＡＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＦＣＱＨＦＤＨＬＰＬＡＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
配列番号７（ＢＢ０５００－２ｆ１／２ｆ／２ｆｇ重鎖）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＶＳＳＧＤＹＹＷＴＷＩＲＱＳＰＧＫＧＬＥＷＩＧＨＩＹＹＳＧＮＡＮＹＮＰＳＬＫＳＲＬＴＩＳＩＤＴＳＫＴＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＩＹＹＣＶＲＤＲＶＴＧＡＦＤＩＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＰＫＳＤＫＣＴＨＴＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＳＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号８（ＢＢ０５００－２ｆ１／２ｇ１軽鎖）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＦＣＱＨＦＤＨＬＰＬＡＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号９（ＢＢ０５００－２ｆ２／２ｇ２重鎖）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＶＳＳＧＤＹＹＷＴＷＩＲＱＳＰＧＫＧＬＥＷＩＧＨＩＹＹＳＧＮＴＮＹＮＰＳＬＫＳＲＬＴＩＳＩＤＴＳＫＴＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＩＹＹＣＶＲＤＲＶＴＧＡＦＤＩＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＰＫＳＤＣＫＴＨＴＶＥＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号１０（ＢＢ０５００－２ｆ２／２ｆ／２ｇｆ／２ｎ軽鎖）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＦＣＱＨＦＤＨＬＰＬＡＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号１１（ＢＢ０５００－２ｇ１／２ｇ／２ｇｆ重鎖）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＶＳＳＧＤＹＹＷＴＷＩＲＱＳＰＧＫＧＬＥＷＩＧＨＩＹＹＳＧＮＴＮＹＮＰＳＬＫＳＲＬＴＩＳＩＤＴＳＫＴＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＩＹＹＣＶＲＤＲＶＡＧＡＦＤＩＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＰＰＫＳＣＤＫＴＨＴＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＳＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号１２（ＢＢ０５００－２ｇ２／２ｇ／２ｆｇ軽鎖）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＳＮＡＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＦＣＱＨＦＤＨＬＰＬＡＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号１３（ＢＢ０５００－２ｎ重鎖）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＶＳＳＧＤＹＹＷＴＷＩＲＱＳＰＧＫＧＬＥＷＩＧＨＩＹＹＳＧＮＡＮＹＮＰＳＬＫＳＲＬＴＩＳＩＤＴＳＫＴＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＩＹＹＣＶＲＤＲＶＴＧＡＦＤＩＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＰＰＫＳＤＣＫＴＨＴＶＥＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号１４（ＢＢ０５００－２ｆ１／２ｆ２／２ｇ１／２ｇ２／２ｆ／２ｇ／２ｆｇ／２ｇｆ／２ｎ及びｗｔのＶＨ ＣＤＲ１）
ＧＧＳＶＳＳＧＤＹ
配列番号１５（ＢＢ０５００－２ｆ／２ｆ１／２ｆｇ／２ｎのＶＨ ＣＤＲ２、Ｔ５９Ａ突然変異を有する）
ＹＹＳＧＮＡ
配列番号１６（ＢＢ０５００－２ｆ２／２ｇ１／２ｇ２／２ｇ／２ｇｆ及びｗｔのＶＨ ＣＤＲ２）
ＹＹＳＧＮＴ
配列番号１７（ＢＢ０５００－２ｇ／２ｇ１／２ｇｆのＶＨ ＣＤＲ３、Ｔ１０３Ａ突然変異を有する）
ＤＲＶＡＧＡＦＤＩ
配列番号１８（ＢＢ０５００－２ｆ１／２ｆ２／２ｇ２／２ｆ／２ｆｇ／２ｎ及びｗｔのＶＨ ＣＤＲ３）
ＤＲＶＴＧＡＦＤＩ
配列番号１９（ＢＢ０５００－２ｇ２／２ｇ／２ｆｇのＶＬ ＣＤＲ１、Ｙ３２Ａ突然変異を有する）
ＱＡＳＱＤＩＳＮＡＬＮ
配列番号２０（ＢＢ０５００－２ｆ１／２ｆ２／２ｇ１／２ｆ／２ｇｆ／２ｎ及びｗｔのＶＬ ＣＤＲ１）
ＱＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ
配列番号２１（ＢＢ０５００－２ｆ２／２ｆ／２ｇｆ／２ｎのＶＬ ＣＤＲ２、Ｄ５０Ａ突然変異を有する）
ＡＡＳＮＬＥＴ
配列番号２２（ＢＢ０５００－２ｆ１／２ｇ１／２ｇ２／２ｇ／２ｆｇ及びｗｔのＶＬ ＣＤＲ２）
ＤＡＳＮＬＥＴ
配列番号２３（ＢＢ０５００－２ｆ１／２ｆ２／２ｇ１／２ｇ２／２ｆ／２ｇ／２ｆｇ／２ｇｆ／２ｎ及びｗｔのＶＬ ＣＤＲ３）
ＱＨＦＤＨＬＰＬＡ
ＥＧＦＲタンパク質の抗体結合部位表面とパニツムマブのＣＤＲとの相互作用の模式図を示す。（Ａ）パニツムマブ軽鎖ＣＤＲはＥＧＦＲドメインＩＩＩの末端β－鎖と相互作用する。上のＥＧＦＲは、下のパニツムマブのＬ１、Ｌ２及びＬ３ ＣＤＲと相互作用する。（Ｂ）パニツムマブ重鎖ＣＤＲはＥＧＦＲドメインＩＩＩのβ－シート表面と相互作用し、ＥＧＦＲに結合する。ＥＧＦＲは、Ｈ１、Ｈ２、及びＨ３ ＣＤＲ領域の上に示されている。突然変異を起こしたアミノ酸は丸で囲まれている。 本発明のいくつかの実施例による抗体の特徴を示す。（ａ）ＨＥＫ２９３細胞で産生された特定の抗体の純度と収量である。（ｂ）還元（Ｒ）抗体と非還元（ＮＲ）抗体のＳＤＳ－ＰＡＧＥプロットである。（ｃ）精製抗体のＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析である。 ＥＧＦＲに対する本発明の実施例による特定の抗体及び他の抗体の結合曲線を示す。 本発明の実施例による特定の抗体から製造された二つのＡＤＣのＨＩＣプロファイルを示す。 本発明の実施例による特定のＡＤＣ及びＥＧＦＲ発現がん細胞に対する比較ＡＤＣの細胞毒性曲線を示す：（ａ）Ａ４３１細胞、（ｂ）ＮＵＧＣ３細胞、（ｃ）Ａ４３１細胞、（ｄ）ＮＵＧＣ３細胞。 溶媒で治療したマウスにおける腫瘍体積と比較した、本開示の特定の例示的なＡＤＣで治療したマウスにおける腫瘍体積の経時的変化を示す。

Claims (19)

  1. （ａ１）それぞれ配列番号１４、配列番号１５、及び配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、及びＣＤＲ３領域を含む、重鎖可変ドメインと、（ｂ１）それぞれ配列番号２０、配列番号２１、及び配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、及びＣＤＲ３領域を含む、軽鎖可変ドメイン；又は
    （ａ２）それぞれ配列番号１４、配列番号１６、及び配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、及びＣＤＲ３領域を含む、重鎖可変ドメインと、（ｂ２）それぞれ配列番号１９、配列番号２２、及び配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、及びＣＤＲ３領域を含む、軽鎖可変ドメイン；又は
    （ａ３）それぞれ配列番号１４、配列番号１５、及び配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、及びＣＤＲ３領域を含む、重鎖可変ドメインと、（ｂ３）それぞれ配列番号２０、配列番号２２、及び配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、及びＣＤＲ３領域を含む、軽鎖可変ドメイン；又は
    （ａ４）それぞれ配列番号１４、配列番号１６、及び配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、及びＣＤＲ３領域を含む、重鎖可変ドメインと、（ｂ４）それぞれ配列番号２０、配列番号２１、及び配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、及びＣＤＲ３領域を含む、軽鎖可変ドメイン；
    を含む、ヒトＥＧＦＲタンパク質と特異的に結合する単離された抗体。
  2. （ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む可変ドメインを有する重鎖、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む可変ドメインを有する軽鎖；又は
    （ｂ）配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む可変ドメインを有する重鎖、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む可変ドメインを有する軽鎖；又は
    （ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む可変ドメインを有する重鎖、及び配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む可変ドメインを有する軽鎖；又は
    （ｄ）配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む可変ドメインを有する重鎖、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む可変ドメインを有する軽鎖；
    を含む、単離された抗体。
  3. 前記抗体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む可変ドメインを有する重鎖、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む可変ドメインを有する軽鎖を含む、請求項２に記載の単離された抗体。
  4. （ａ）配列番号７に示されるアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖；又は
    （ｂ）配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖；又は
    （ｃ）配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖；又は
    （ｄ）配列番号７に示されるアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖；又は
    （ｅ）配列番号９に示されるアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖；
    を含む、単離された抗体。
  5. 前記抗体は、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項３に記載の単離された抗体。
  6. 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１～５のいずれか一項に記載の単離された抗体。
  7. 請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体をコードする核酸分子。
  8. 請求項７に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
  9. 請求項８に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
  10. 化学リンカーを介して細胞傷害性薬物にコンジュゲートされた請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体を含む、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）又はその薬学的に許容される塩。
  11. 前記細胞傷害性薬物は、エリブリン、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＦ、メイタンシンＤＭ１とＤＭ４、メイタンシノール、サンドラマイシン、ピロロベンゾジアゼピン、ピロロベンゾジアゼピン二量体、アントラサイクリン系、カリケアマイシン、ドラスタチン１０、デュオカルマイシン、ドキソルビシン、タイランスタチンＡ、ウンシアラマイシン、アマニチン、リシン、ジフテリア毒素、１３１Ｉ、インターロイキン、腫瘍壊死因子、ケモカイン、イリノテカン（ＳＮ３８）、エキサテカン及びナノ粒子からなる群より選択される、請求項１０に記載のＡＤＣ又はその薬学的に許容される塩。
  12. 前記化学リンカーに含まれる部分は、６－マレイミドカプロイル（ＭＣ）、マレイミドプロピオニル（ＭＰ）、バリン－シトルリン（Ｖａｌ－Ｃｉｔ）、アラニン－フェニルアラニン（Ａｌａ－Ｐｈｅ）、ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢ）、６－マレイミドカプロイル－バリン－シトルリン－ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル（ＭＣ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ）、Ｍａｌ－ＰＥＧｎ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ（ｎ＝１～２０）、Ｐｈｅ－Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）－ＰＡＢ、Ａｌｏｃ－Ｄ－Ａｌａ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）－ＰＡＢ－ＰＮＰ、Ｂｏｃ－Ｐｈｅ－（Ａｌｌｏｃ）Ｌｙｓ－ＰＡＢ－ＰＮＰ及びパーフルオロフェニル ３－（ピリジン－２－イルジスルファニル）プロパノエートからなる群より選択される、請求項１０～１１のいずれか一項に記載のＡＤＣ又はその薬学的に許容される塩。
  13. 前記細胞傷害性薬物がエリブリンである、請求項１０～１２のいずれか一項に記載のＡＤＣ又はその薬学的に許容される塩。
  14. 前記抗体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む可変ドメインを有する重鎖、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む可変ドメインを有する軽鎖を含む、請求項１３に記載のＡＤＣ又はその薬学的に許容される塩。
  15. 前記細胞傷害性薬物がＭＭＡＥである、請求項１０～１２のいずれか一項に記載のＡＤＣ又はその薬学的に許容される塩。
  16. 前記抗体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む可変ドメインを有する重鎖、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む可変ドメインを有する軽鎖を含む、請求項１５に記載のＡＤＣ又はその薬学的に許容される塩。
  17. （ａ）請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体、或いは請求項１０～１６のいずれか一項に記載のＡＤＣ又はその薬学的に許容される塩、及び
    （ｂ）薬学的に許容される担体
    を含む、医薬組成物。
  18. 治療有効量の請求項１７に記載の医薬組成物を被験者に投与することを含む、ヒト被験者のがんを治療する方法。
  19. 前記がんが、非小細胞肺がん、表皮がん、乳がん、結腸直腸がん、卵巣がん、子宮頸がん、膀胱がん、食道がん、頭頸部がん、膠芽腫、及び鼻咽頭がんからなる群より選択される、請求項１８に記載の方法。
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