KR102001686B1 - 신규한 egfr 결합 단백질 - Google Patents

Abstract

상피 성장 인자 수용체 (EGFR)와 상호작용하는 항원 결합 단백질들, 가령 항체들이 설명된다. EGFR에 대한 항원 결합 단백질의 약제학적으로 유효량을 투여함으로써 암 및 기타 질환들을 치료하는 방법 또한 설명된다.

Description

신규한 EGFR 결합 단백질 {NOVEL EGFR BINDING PROTEINS}

본 출원은 2011년 4월 7일자로 제출된 미국 가출원 번호 61/473,014에 근거하며, 이의 이익을 청구하며, 전문이 여기에 참고자료로 편입된다.

서열 목록에 대한 언급

본 출원은 전자형태의 서열 목록과 함께 제출된다. 서열 목록은 2012년 4월 6일에 만든, 14KB 크기의 A-1628-WO-PCT_SeqList.txt으로 명명된 파일로 제공된다. 전자 형태의 서열 목록안의 정보는 이의 전체가 여기에 참고자료로 편입된다.

상피 성장 인자 수용체 ("EGFR", "ErbB 수용체", 또는 "ErbB1 수용체"으 또한 명명됨)는 ErbB 수용체 과(family)에 속하는 수용체 단백질 티로신 키나제다. ErbB 수용체 과는 ErbB (ErbB1, 또는 Her-1 수용체로도 또한 알려짐), ErbB2 (Her-2 수용체), ErbB3 (Her-3 수용체) 및 ErbB4 (Her-4 수용체), 그리고 이 과의 다른 구성원들을 포함한다. 따라서, 용어 "ErbB1", "ErbB1 수용체", "ErbB 수용체", "상피 성장 인자 수용체", 및 "EGFR"은 여기에서 호환되며, 그리고 예를 들면, Carpenter et al. Ann. Rev. Biochem. 56:881-914 (1987)에서 공개된 것과 같이 이의 자연 발생적 돌연변이 형태(예컨데, Humphrey et al . PNAS ( USA ) 87:4207-4211 (1990)에서와 같이 결실 EGFR)를 포함하는, EGFR을 지칭한다. 본 명세서에서 이용된 것과 같이, "EGFR"은 고유 서열 EGFR 또는 이의 아미노산 서열 변이체일 수 있다는 것을 인지할 것이다.

EGFR은 일반적으로 세포외 도메인을 포함하고, 이는 ErbB 리간드 (가령 EGF, TGF-α, 등.); 친지성 막통과 도메인; 보존된 세포내 티로신 키나제 도메인; 그리고 포스포릴화될 수 있는 몇 가지 티로신 잔기들을 숨겨둔 카르복시-말단 신호생성 도메인에 결합될 수 있다.

EGFR 및 이의 리간드, 상피 성장 인자 ("EGF")은 세포성 증식과 인간 고형 종양을 포함하는 많은 유형의 암에 연루되어 있다. 예컨데, Mendelsohn, Cancer Cell, 7:359 (1989); Mendelsohn, Cancer Biology 1:339-344 (1990), Modjtahedi and Dean Int'l, J. Oncology 4:277-296 (1994) 참고. 이것은 폐암, 유방암, 결장직장암, 위암, 뇌암, 방광암, 두경부암, 난소암, 그리고 전립선 암종을 포함한다. Modjtahedi and Dean, Int'l J. Oncology 4:277-296 (1994).

다수의 항-EGFR 항체들은 상업적으로 이용가능하거나, 또는 현재 임상 개발에 있다. 이러한 항체들은 Vectibix® (파니투무마브(panitumumab)), Erbitux® (세투시마브(cetuximab)); 자라투무마브(zalatumumab), 니모투주마브(nimotuzumab), 그리고 마투주마브(matuzumab)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

파니투무마브 (상표 Vectibix®으로 시판됨)는 U.S., 유럽, 일본 및 전세계 많은 다른 국가들에서 전이성 결장직장 암 (mCRC)의 특정 치료에 승인된 인간, 항-EGFR 단클론성 항체이다. 파니투무마브의 핵산 및 아미노산 서열은 공지되어 있고, 그중에서도 특히, 미국 특허 제6,235,883호 및 제7,807,798호 (Jakobovits et al.)에서 찾아볼 수 있다. 이들 특허의 내용은 전문이 여기에 참고자료로 편입된다. 파니투무마브의 중쇄(감마) 서열은 본 명세서에서 서열번호 1로 제시된다. 파니투무마브의 경쇄 (카파) 서열은 본 명세서에서 서열번호 2로 제시된다. 본 명세서에서 이용된 것과 같이, 용어 "AMG 954"는 Vectibix® (파니투무마브)를 지칭한다.

특정 아미노산 잔기들의 이성질체화(Isomerization)는 항체들에서 관찰된 현상이다. 예를 들면, Wakankar et al.은 2개의 재조합 단일클론성 항체들의 경쇄 상보성 결정 영역들 (CDR)에서 특정 아스파르트산 (Asp) 잔기들이 이러한 이성질체화에 영향을 받기쉽다는 것을 관찰하였다. 특히, 이들 항체에서 아스파르트산 (Asp) 이성질체화는 이소아스파르테이트 (IsoAsp), 및 이들 항체의 환(cyclic) 이미드 (Asu) 변이체들의 형성을 유도하였다. Wakankar et al., Biochemistry , 2007 Feb 13;46(6):1534-44 (Jan. 2007). 이들 변이체의 형성은 이들 항체의 결합 친화력을 감소시키고, 이에 의해 이들의 효능이 감소된다는 것이 밝혀졌다. Id.

Vectibix® (파니투무마브)의 특정 아미노산들의 이성질체화가 관찰되었다. 이 이성질체화는 효능의 특정 상실, 뿐만 아니나 화학적 분해 가능성과 관련있는 것으로 보이며, 따라서 바람직하지 않다. 따라서, 이 이성질체화를 없애거나 또는 감소시키기 위한 강력한 요구가 있다.

볼 수 있는 것과 같이, 본 명세서에서 설명된 돌연변이체들은 (i) 유지된 효능, 또는 (ii) 개선된 안정성, 또는 (iii) 이 둘 모두를 가진다.

발명의 요약

파니투무마브에서 특정 점 돌연변이는 바람직하지 않은 이성질체화와 파니투무마브의 결과적인 분해를 경감시킬 수 있다는 것을 예상치않게 발견하였다. 예를 들면 파니투무마브 돌연변이체들은 D92가 N92로, 그리고 D92에서 E92로 변경된 경쇄 아미노산들을 보유하고, 파니투무마브보다 유지된 효능 및/또는 개선된 안정성을 나타내었다.

pH 5.8 및 5.0, 37℃에서 가속화된 안정성 연구들은 파니투무마브의 경쇄 (LC) CDR3 아스파르트산 잔기 D92가 이성질체화되기 쉽고, 따라서 활성을 상실하게 된다는 것을 보여주었다. 근본적(primary) 서열을 변형시킴으로써 이러한 문제를 제거할 가능성이 있는 지를 평가하기 위하여, 각 돌연변이체에 단일 점 돌연변이(point mutation)를 가진 2개의 돌연변이체들을 만들었다: 경쇄 (LC)의 CDR3 안에서 D92가 N92로 ("N" 돌연변이체); 그리고 D92가 E92로("E" 돌연변이체) 돌연변이. 양쪽 돌연변이체들은 세포 기반 효능 분석으로 측정하였을 때 생물학적 활성을 유지하였다. 또한, 안정성 연구는 D92 에서 E92로의 돌연변이체는 가속화된 조건하에서 효능은 유지하면서 Vectibix® (파니투무마브)보다 상당히 더 안정적이다고 나타내었다. D92에서 N92로의 돌연변이체는 유사하게 효능을 유지하였지만, 안정성에서 관찰된 개선점은 없었다.

따라서 본 발명은 항원 결합 단백질들, 또는 이의 단편들, 가령 서열번호 3, 및/또는 서열번호 4, 서열번호 5, 및/또는 서열번호 6에서 볼 수 있는 것들에 관련된다. 본 발명의 항원 결합 단백질들은 단일클론성 항체들, 또는 이의 단편일 수 있고, 그리고 인간 항체들, 인간화된 항체들, 키메라 항체들, 다중특이적 항체들, 그리고 이의 단편들을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

다른 측면들에서, 본 발명은 서열번호 3의 CDR 1-3에 걸친 영역을 포함하는 항원 결합 단백질에 관계한다. 본 발명은 서열번호 4의 CDR 1-3에 걸친 영역을 포함하는 항원 결합 단백질에 더 관계한다.

본 발명은 위치 92에서 점 돌연변이를 보유하는 항-EGFR 항체에 또한 관계하며, 여기에서 전술한 점 돌연변이는 글루타민산 잔기 또는 아스파라긴이다.

본 발명은 EGFR 항체, 가령 파니투무마브의 안정성을 개선시키는 방법에 더 관계하는데, 이 방법은 위치 92의 아스파르트산 잔기를 글루타민산 잔기 또는 아스파라긴 잔기로 변화시키는 것을 포함한다.

더욱이, 본 발명은 EGF 및/또는 TGF-α에 EGFR의 결합(또는 다른 상호작용)을 감소시킬 수 있는 본 명세서에서 설명된 단리된 단리된 항원 결합 단백질들에 관계한다. 본 발명은 또한 EGFR과의 결합에 대해 본 명세서에서 설명된 항원 결합 단백질과 경쟁하는 단리된 항원 결합 단백질에 관계한다.

본 발명은 서열번호 3, 4, 5, 또는 6 중 임의에서 제시된 것과 같은 항원 결합 단백질, 또는 이의 일부를 인코드하는 핵산 분자에 또한 관계한다. 이 핵산 분자는 조절(control) 서열에 작용가능하도록(operably) 연결될 수 있다. 다른 측면들에서, 본 발명은 이러한/이들 핵산 분자들을 포함하는 벡터, 그리고 이들 벡터를 포함하는 숙주 세포에 더 관계한다.

본 발명은 전술한 항원 결합 단백질을 분비하는 숙주 세포로부터 전술한 항원 결합 단백질을 준비하는 단계를 포함하는 본 명세서에서 설명된 항원 결합 단백질을 제조하는 방법에 더 관계한다.

다른 측면들에서, 본 발명은 본 명세서에서 설명된 최소한 하나의 항원 결합 단백질 (가령 항체)과 약제학적으로 수용가능한 부형제를 포함하는 제약학적 조성물에 관계한다.

본 발명은 본 명세서에서 설명된 하나 또는 그 이상의 항원 결합 단백질을 포함하는 제약학적 조성물, 방사능동위원소, 방사성핵종, 독소, 치료제, 또는 화학치료제를 더 포함하는 제약학적 조성물에 또한 관계한다.

여전히 다른 측면들에서, 본 발명은 본 명세서에서 설명된 최소한 하나의 단리된 항원 결합 단백질의 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 암의 치료 또는 예방용 방법들에 관계한다. 본 발명은 본 명세서에서 설명된 최소한 하나의 단리된 항원 결합 단백질의 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 최소한 하나의 상승된 EGF 및 EGFR 수준과 연관된 병을 치료 또는 예방하는 방법들에 더 관계한다. 본 발명은 본 명세서에서 설명된 최소한 하나의 항원 결합 단백질의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 환자에게서 EGFR가 EGF에 결합을 저해시키는 방법들에 또한 관계한다.

일부 측면들에서, 본 발명은 서열번호 3 및/또는 서열번호 4에서 제시된 하나 또는 그 이상의 경쇄 상보성 결정 영역들 (CDR)을 포함하는 EGFR에 결합하는 단리된 항원 결합 단백질을 포함한다.

분명하게 하기 위하여, 항원 결합 단백질들에서 CDR은 밑줄을 치고, 이어지는 순서, 가령, CDR1, CDR2, CDR3으로 제시되는 것으로 이해해야 할 것이다.

일부 측면들에서, 본 발명은 본 명세서에서 설명된 임의의 항원 결합 단백질들이 결합하는 에피토프에 특히 결합하는 단리된 항원 결합 단백질을 포함한다.

본 발명의 다른 측면들은 당업계 숙련자들에 의해 인지될 것이며, 본 명세서에서 설명된다.

도 1은 pH 5.8, 37℃에서 6개월 동안 Lys-C 펩티드 지도(map)에 의해 탐지된 Vectibix® (파니투무마브) D92 이성질체화를 보여준다. Vectibix® (파니투무마브)는 37℃에서 제제화 완충액(formulation buffer), pH5.8에서 6개월 동안 항온처리되었다. 시료들은 Lys-C 펩티드 매핑(maping)을 이용하여 참조 표준과 비교되었다. 이성질체화의 수준은 변형된 그리고 고유 펩티드 Lys-L3 (잔기들 46-103)의 비율에 의해 정량화되었다. "A"은 하이브리도마-유도된 분자를 나타내고, 그리고 "B"는 CHO-유도된 분자를 보여준다.
도 2는 경쇄 (LC) D92, isoD92, E92 및 N92의 구조적 모델을 보여준다.
도 3은 pH 5.0, 50℃에서 4주 동안 Vectibix® (파니투무마브) 돌연변이체들의 가속화된 안정성 데이터를 보여준다. 야생형 Vectibix® (D92) 및 두 가지 돌연변이체들 (E92, N92)은 pH 5.0, 50℃에서 4주 동안 항온처리되었다. 트립신에 의한 매핑(tryptic maping)으로 처리 안 된 재료에 대해 스트레스를 가한 시료들과 비교하면, 펩티드 Trp-L5는 다음과 같이 분포되었다는 것을 보여 준다: 야생형 분자 2개의 Trp-L5 피크 (D92 및 isoD92), 돌연변이체 N92 3개의 Trp-L5 피크 (N92, D92 및 isoD92), 그리고 돌연변이체 E92 한 개의 Trp-L5 피크 (E92). 그중에서도 특히, 돌연변이체 E92가 이들 가속화된 스트레스 조건하에서 안정적임을 이 결과는 보여준다.
도 4는 세포-기반 분석(cell-based assays)에서 Vectibix® (파니투무마브) 돌연변이체들의 효능을 보여준다.

EGFR에 결합하는 항원 결합 단백질들 (가령 항체들 및 이의 기능적 결합 단편들)이 본 명세서에서 설명된다. 일부 구체예들에서, 이 항원 결합 단백질들은 EGFR에 결합하여 다양한 방식으로 EGFR의 기능을 차단한다. 일부 구체예들에서, 이 항원 결합 단백질들은 EGFR가 다른 물질들과 상호작용하는 능력을 차단 또는 감소시킨다. 예를 들면, 일부 구체예들에서, 이 항원 결합 단백질은 EGFR이 EGF에 결합할 환경을 저지 또는 감소시키는 방식으로 EGFR에 결합한다. 다른 구체예들에서, 항원 결합 단백질들은 EGFR에 결합하지만, EGFR이 EGF와 상호작용하는 능력을 차단시키지 못할 수 있다. 일부 구체예들에서, 이 항원 결합 단백질들은 인간 단일클론성 항체들이다.

EGFR에 대한 항원 결합 단백질들은 결장직장, 유방, 폐, 두경부, 난소, 경부, 전립선, 췌장 및 이와 유사한 것을 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 암들의 치료 및/또는 예방에 이용될 수 있다. 따라서, 암을 가진 개체들을 치료하는 방법들 및 조성물들은 본 명세서에서 설명된 것과 같이 본 발명의 범위 내에 있다.

편의상, 다음 단락들에서는 본 명세서에서 이용된 용어들의 다양한 의미들의 개요를 일반적으로 나타낸다. 이 논의에 이어서, 항원 결합 단백질들에 대한 일반적인 측면들이 논의되며, 이어서 이 항원 결합 단백질들의 다양한 구체예들의 성질과 이들이 어떻게 이용될 수 있는지에 대해 설명하는 특정 실시예들이 이어진다.

정의 및 구체예들

본 명세서의 설명은 오로지 예시 및 설명을 위한 것이며, 청구되는 본 발명을 제한하는 것이 아님을 이해해야 한다. 본 출원에서, 단수의 용도는 다른 언급이 없는 한, 복수를 포함한다. 본 출원에서 "또는"의 용도는 다른 언급이 없는 한, "및/또는"을 의미한다. 더욱이, "포함하는(including)" 뿐만 아니라 다른 형태들, 가령 "포함하다(includes)" 및 "포함된(included)"의 용도는 제한적이지 않다. 또한, 용어 가령 "요소(element)" 또는 "성분(component)"은 다른 언급이 없는 한, 하나의 단위를 포함하는 요소 및 성분, 그리고 하나 이상의 소단위(subunit)를 포함하는 요소 및 성분들을 모두 포괄한다. 또한, "일부(portion)"의 용도는 모이어티의 부분 또는 전체 모이어티를 포함할 수 있다.

본 명세서에서 이용된 단락 머리말은 단지 체계적인 목적을 위한 것이며, 설명된 주제를 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다. 본 출원에서 언급된 특허, 특허 출원, 문헌, 책 및 조약등을 포함하나 이에 한정되지 않는 모든 서류들, 또는 서류들의 일부들은 임의의 목적을 위하여 이들 각각의 전문이 여기에 참고자료로 편입된다. 본 명세서에서 이용된 것과 같이, 다른 언급이 없는 한, 다음의 용어들은 다음의 의미를 가지는 것으로 이해된다:

용어 "EGFR" 은 상피 성장 인자 수용체, 이의 단편들, 뿐만 아니라 관련된 폴리펩티드들을 지칭하는데, 이는 대립형질 변이체들, 접합(splice) 변이체들, 파생적(derivative) 변이체들, 치환(substitution) 변이체들, 결실 변이체들, 및/또는 N-말단 메티오닌의 추가를 포함하는 삽입 변이체들, 융합 폴리펩티드들, 그리고 종간 동족체(interspecies homologs)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 특정 구체예들에서, EGFR 폴리펩티드는 말단 잔기들, 가령, 신호 펩티드 서열 잔기들, 표적화 잔기들, 아미노 말단 메티오닌 잔기들, 리신 잔기들, tag 잔기들 및/또는 융합 단백질 잔기들을 포함하나 이에 한정되지 않는다. EGFR의 언급은 변이체들, 이소폼(isoforms) 및 인간 EGFR의 종(species) 동족체를 포함한다. 바람직한 구체예에서, EGFR-항원에 본 발명의 항체의 결합으로 하나 또는 그 이상의 EGFR 리간드(들)이 EGFR에 결합하는 것을 저해 또는 차단시킴으로써 EGFR을 발현시키는 세포(예컨대, 종양 세포)의 성장이 저해된다. 용어 "EGFR 리간드"는 EGF, TGF-알파, 헤파린 결합 EGF (HB-EGF), 암피레굴린 (AR), 헤레굴린(heregulin), 베타-셀룰린(cellulin), 및 에피레굴린 (EPI)을 포함하나 이에 한정되지 않는, EGFR의 모든 리간드들(예컨대 생리학적)을 포괄한다. 또다른 바람직한 구체예에서, EGFR-항원에 본 발명의 항체의 결합은 작동체(effector) 세포 식세포작용(phagocytosis) 및/또는 EGFR을 발현시키는 세포의 사멸을 조정한다.

성숙 EGFR의 세포외 부분(SwissProt acc.#P00533)은 621개의 아미노산들과 4개의 수용체 도메인들로 구성된다: 도메인 I은 잔기들 1-165를 포괄하고, 도메인 II는 잔기들 166-312를 포괄하고, 도메인 III은 잔기들 313-481을 포괄하고, 그리고 도메인 IV는 482-621을 포괄한다(Cochran et al. (2004) J. Immunol. Methods, 287, 147-158). 도메인 I 및 III은 리간드들에 대한 고 친화력 결합 부위들의 형성에 기여하는 것으로 제기되었다. 도메인 II 및 IV는 단백질 폴딩(folding)을 안정화시키고, 그리고 있을 수 있는 EGFR 이합체화 인터페이스를 담고 있는 시스테인이 풍부한, 라미닌-유사 영역들이다.

생체표식들(Biomarkers)

KRAS 유전자에서 특정 돌연변이들은 EGFR 억제제, 가령 항체에 무-반응으로 예측되는 것으로 밝혀졌다. 예컨데, US 2008/0293055, "KRAS mutations and Anti-EGFR Antibody Therapy", Freeman et al., 이 내용은 전문이 여기에 참고자료로 편입된다. 다수의 이러한 KRAS 돌연변이들이 확인되었는데, G12S, G12V, G12D, G12A, G12C, G13A, G13D, 및 T20M을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

NRAS, PTEN, 및 PIP3을 포함하는 추가 생체표식들은 Asghar et al., Clin. Colorectal Cancer . , Dec., 9(5):274-81 (2010)에 설명된다. 또다른 잠재적 생체표식, EGFR 유전자 복사 숫자(gene copy number)는 US 2007/0087394 및 US 2009/0269344에서 설명되며, 이들의 내용은 전문이 여기에 참고자료로 편입된다.

용어 "돌연변이체 EGFR 폴리뉴클레오티드", "돌연변이체 EGFR 올리고뉴클레오티드" 그리고 "돌연변이체 EGFR 핵산"은 호환되며, 그리고 L688P, Q701H, K745N, C781R, 아미노산 771과 772 사이에 히스티딘 삽입, T790M, L828stop, Q849R, F910L, 및 V948A로부터 선택된 최소한 하나의 EGFR 돌연변이를 포함하는 EGFR 폴리펩티드를 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 말한다. 예컨데, 참고자료에 편입된 US 2007/0048754, Freeman et al. 참고.

용어들 "돌연변이체 Pl3K 폴리뉴클레오티드", "돌연변이체 Pl3K 올리고뉴클레오티드", 그리고 "돌연변이체 Pl3K 핵산"은 호환되며, 그리고 E542K, E545A, 및 H1047L로부터 선택된 최소한 하나의 Pl3K 돌연변이를 포함하는 Pl3K 폴리펩티드를 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.

용어 "돌연변이체 B-Raf 폴리뉴클레오티드", "돌연변이체 B-Raf 올리고뉴클레오티드", 및 "돌연변이체 B-Raf 핵산"은 호환되며, 그리고 최소한 하나의 B-Raf 돌연변이를 가진 B-Raf 폴리펩티드를 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 이들 돌연변이는 US 2009/0075267에서 설명되며, 전문이 여기에 참고자료로 편입된다.

본 명세서에서 이용된 것과 같이, 용어 "암"은 신장, 유방, 폐, 신장, 방광, 결장, 난소, 전립선, 위, 뇌, 두경부, 피부, 자궁, 고환, 식도 및 간암, 비-호지킨(Hodgkin) 및 호지킨(Hodgkin) 임파종을 포함하는 임파종, 백혈병 및 다발성 골수종을 포함하는, 고형 종양 및 림프 암을 포함하는 인간 암 및 암종, 육종, 선암, 임파종, 백혈병, 등을 지칭한다. "비뇨생식기 암"은 신장, 방광, 요로, 요도, 전립선, 음경, 고환, 음문, 질, 경부 및 난소 조직을 포함하나 이에 한정되지 않는, 요로 및 생식기 조직의 인간 암을 지칭한다.

용어 "과다발현되다(overexpress)", "과다발현(overexpression)", 또는 "과다발현된(overexpressed)"은 호환적으로 이용되며, 정상 세포와 비교하여, 암 세포에서 탐지가능한 보통 수준보다 더 큰 수준으로 전사 또는 해독되는 유전자를 지칭한다. 따라서 과다발현은 단백질 및 RNA의 과다발현 (증가된 전사, 전사후 프로세싱, 해독, 해독후 프로세싱, 변경된 안정성 그리고 변경된 단백질 분해로 인하여), 뿐만 아니라, 변경된 단백질 경로 패턴(traffic patterns) (증가된 핵 국소화), 그리고 예컨데, 기질의 증가된 효소 가수분해에서와 같이 증가된 기능적 활성으로 인한 국소 과다발현을 모두 지칭한다. 과다발현은 또한 정상 세포 또는 비교 세포 (예컨데, BPH 세포)와 비교하여 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상일 수 있다.

용어 "암-연관된 항원" 또는 "종양-특이적 표식" 또는 "종양 표식"은 호환되며, 그리고 정상 세포와 비교하여 암 세포에서 선호적으로 발현되는 분자(전형적으로 단백질, 탄수화물 또는 지질)를 지칭하며, 그리고 약리학적 물질을 암 세포에게 선호적으로 표적화시키는데 유용하다. 표식 또는 항원은 세포 표면 또는 세포내에서 발현될 수 있다. 흔히, 암-연관된 항원은 정상 세포와 비교하여 암 세포 안에서 최소한 분해되도록 발현되거나 또는 안정화된 분자로, 가령, 정상 세포와 비교하여, 2-배 발현, 3-배 발현 또는 그 이상이 된다. 흔히, 암-연관된 항원은 암 세포에서 부적절하게 합성된 분자, 실례로, 정상 세포상에서 발현되는 분자와 비교하여 결실, 추가 또는 돌연변이들을 함유하는 분자다. 또한, 암-연관된 항원은 암 세포 안에서만 독점적으로 발현될 수 있고, 그리고 정상 세포에서는 합성되거나 또는 발현되지 않을 수 있다. 구체화된 세포 표면 종양 표식들은 유방암의 경우 c-erbB-2 및 인간 상피 성장 인자 수용체 (EGFR) 단백질들, 전립선 암의 경우 PSMA, 그리고 유방, 난소 및 결장직장을 포함하는 다수의 암에서 탄수화물 뮤신을 포함한다.

"항진제(agonist)"는 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 (가령 수용체)에 결합하여, 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 활성 또는 발현을 자극, 증가, 활성화, 실행, 활성의 강화, 감작화 또는 활성의 상향 조절하는 물질을 지칭한다.

"길항제(antagonist)"는 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 발현을 저해시키는 물질 또는 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드에 결합하여, 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 활성을 부분적으로 또는 완전하게 차단, 감소, 저지, 활성의 지연, 비활성화, 비감작화 또는 하향 조절하는 물질을 지칭한다.

"작은 유기 분자(small organic molecule)"는 약 50 Daltons 이상 그리고 약 2500 Daltons 미만, 선호적으로 약 2000 Daltons 미만의, 선호적으로 약 100 내지 약 1000 Daltons, 더욱 선호적으로 약 200 내지 약 500 Daltons 범위의 분자량을 보유하는 자연적으로 생성된 또는 합성된 유기 분자를 지칭한다.

세포독성 물질들은 "세포-주기(cycle) 특이적" 또는 "세포분열저지성(antimitotic)" 또는 "세포골격(cytoskeletal)-상호작용" 약물들이다. 이들 용어는 호환되며, 그리고 유사분열에서 세포들을 차단시키는 임의의 약리학적 물질을 지칭한다. 이러한 물질들은 화학요법에 유용하다. 일반적으로, 세포-주기-특이적-약물들은 세포골격 단백질 투블린(tubulin)에 결합하여, 투블린이 미소관(microtubules)으로 중합되는 능력을 저지시켜, 중기(metaphase)에서 세포 분열을 정지시키는 결과를 초래한다. 구체화된 세포-주기-특이적 약물들은 빈카 알칼로이드, 탁산, 콜히친, 그리고 포도필로톡신을 포함한다. 구체화된 빈카 알칼로이드는 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 빈데신(vindesine) 그리고 비노렐빈(vinorelbine)을 포함한다. 구체화된 탁산은 파클리탁셀(paclitaxel)과 도세탁셀(docetaxel)을 포함한다. 세포골격-상호작용 약물의 또다른 예로는 2-메톡시에스트라디올을 포함한다.

"siRNA" 또는 "RNAi"는 이중 가닥으로된(double stranded) RNA를 형성하는 핵산을 지칭하는데, 이때 이중 가닥으로된 RNA는 유전자 또는 표적 유전자와 동일한 세포에서 siRNA가 발현될 때 유전자 또는 표적 유전자의 발현을 감소 또는 저지시키는 능력을 보유한다. 따라서 "siRNA" 또는 "RNAi"는 상보 가닥들에 의해 형성된 이중 가닥으로된 RNA를 지칭한다. 이중 가닥으로된 분자를 형성하기 위하여 혼성화되는 siRNA의 상보적 부분은 전형적으로 실질적 또는 완전한 동일성을 보유한다. 한 구체예에서, siRNA는 표적 유전자에 실질적 또는 완전한 동일성을 보유하고, 그리고 이중 가닥으로된 siRNA를 형성하는 핵산을 지칭한다. 전형적으로, siRNA는 길이가 최소한 약 15-50개의 뉴클레오티드, 예컨데, 이중 가닥으로된 siRNA의 각 상보적 서열은 길이가 15-50개의 뉴클레오티드이고, 그리고 이중 가닥으로된 siRNA는 길이가 약 15-50개의 염기쌍, 선호적으로 약 20-30개의 염기 뉴클레오티드, 선호적으로 길이가 약 20-25 또는 약 24-29개의 뉴클레오티드, 예컨데, 길이가 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개의 뉴클레오티드이다.

바람직한 치료 유전자 코딩 및 조절 서열들을 포함하는 적합한 벡터의 작제는 표준 결찰 및 제한 기술을 이용하는데, 이들은 당업계에 잘 공지되어 있다( Maniatis et al ., in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982) 참고). 단리된 플라스미드, DNA 서열들, 또는 합성된 올리고뉴클레오티드들은 원하는 형태로 절단되고, 맞춤화되고(tailored), 그리고 재-결찰된다.

핵산은 또다른 핵산 서열과 기능적 상호관계의 위치에 있을 때 "작용가능하도록 연계(operably linked)"되어 있다. 예를 들면, 프레-서열(presequence) 또는 분비 리더(secretory leader)용 DNA는 이 폴리펩티드의 분비에 참여하는 프레-단백질(preprotein)로 발현된다면, 폴리펩티드용 DNA에 작용가능하도록 연계되며; 프로모터(promoter) 또는 인헨서(enhancer)는 이것들이 서열의 전사에 영향을 준다면 코딩 서열에 작용가능하도록 연계되고; 또는 리보좀 결합 부위는 해독을 실시하도록 위치되어 있다면 코딩 서열에 작용가능하도록 연계된다. 일반적으로, "작용가능하도록 연계된(operably linked)"이란 연계되는 DNA 서열들이 서로 인접해있다는 것을 의미하고, 그리고 분비 리더의 경우, 인접하고, 리딩 단계(reading phase)에 있다. 그러나, 인헨서들은 인접해 있을 필요는 없다. 연계(Linking)는 편리한 제한 부위에서 결찰(ligation)에 의해 시행된다. 이러한 부위들이 없다면, 합성 올리고뉴클레오티드 어뎁터(adaptors) 또는 링커(linkers)들이 통상적인 과정에 따라 이용된다.

두 가지 또는 그 이상 핵산들 또는 폴리펩티드 서열들의 내용에서 "동일한(identical)" 또는 "동일성(identity)" 비율은 하기에서 설명된 디폴트 매개변수를 가진 BLAST 또는 BLAST 2.0 서열 비교 알고리즘을 이용하여 또는 수작업 배열 및 또한 시각적 관찰을 통하여(예컨데, NCBI website http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ 또는 이와 유사한 것을 참고), 동일한, 또는 아미노산 잔기들 또는 뉴클레오티드의 명시된 동일 비율(가령, 비교창 또는 지정된 영역에 걸쳐 최대한 일치되도록 배열하고 비교하였을 때, 명시된 영역에 걸쳐 약 60% 동일성, 선호적으로 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 더 높은 동일성)을 가지는 두 개 또는 그 이상의 서열 또는 준서열을 지칭한다. 이러한 서열들은 "실질적으로 동일하다"라고 말한다. 이 정의는 또한 테스트 서열의 보체를 지칭하거나 또는 이에 적용될 수 있다. 이 정의는 결실 및/또는 추가를 보유하고, 뿐만 아니라 치환을 보유한 서열들을 또한 포함한다. 본 명세서에서 설명된 것과 같이, 바람직한 알고리즘은 갭 및 이와 유사한 것을 설명할 수 있다. 바람직하게는, 동일성은 길이가 최소한 약 25개의 아미노산 또는 뉴클레오티드인 영역에 걸쳐 존재하고, 또는 더 선호적으로 길이가 50-100개의 아미노산 또는 뉴클레오티드인 영역에 걸쳐 존재한다.

서열 비교를 위하여, 전형적으로 한 가지 서열은 테스트 서열과 비교되는 참조 서열로 삼는다. 서열 비교 알고리즘을 이용하여, 테스트 및 참조 서열들을 컴퓨터에 입력할 때, 필요에 따라 준서열 좌표가 지정되고, 그리고 서열 알고리즘 프로그램 매개변수들이 지정된다. 바람직하게는, 디폴트 프로그램 매개변수들을 이용할 수 있고, 또는 대체 매개변수들이 지정될 수 있다. 그 다음 서열 비교 알고리즘은 프로그램 매개변수들에 근거하여 참조 서열에 대해 테스트 서열들의 서열 동일성 비율을 계산한다.

"비교 창(window)"은 20 내지 600, 보통 약 50 내지 약 200, 더 일반적으로 약 100 내지 약 150개로 구성된 군에서 선택된 인접 위치들 수중 임의의 하나의 분절의 참조를 포함하는데, 이때 서열은 두 서열이 최적으로 배열된 후, 동일한 수의 인접 위치들의 참조 서열과 비교된다. 비교를 위한 서열 배열 방법들은 당업계에 잘 공지되어 있다. 비교용 서열들의 최적 배열은 Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)의 국소 상동 알고리즘에 의해, Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)의 상동 배열 알고리즘에 의해, Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)의 유사성 방법에 대한 조사에 의해, 이들 알고리즘의 컴퓨터화된 이행(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA)에 의해, 또는 수작업 배열 및 시각적 조사(예컨데, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995 부록))에 의해 실행될 수 있다.

서열 동일성 및 서열 유사성 백분율을 결정하는데 적합한 바람직한 알고리즘의 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이며, 각각 Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977) 및 Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)에서 설명되고 있다. BLAST 및 BLAST 2.0은 본 명세서에서 설명된 매개변수들과 함께 본 발명의 핵산 및 단백질들의 서열 동일성 백분율을 결정하는데 이용된다. BLAST 분석을 실행하기 위한 소프트웨어는 the National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)를 통하여 공개적으로 이용가능하다. 이 알고리즘은 우선 문제의 서열에서 길이 W의 짧은 단어를 확인함으로써 고득점 서열 쌍(HSPs)을 확인하는 것을 포함하는데, 이는 데이터베이스 서열에서 동일한 길이의 단어와 함께 배열될 때 약간의 양성-값의 임계 득점 T에 필적되거나 또는 충족된다. T는 이웃 단어 득점 임계치(neighborhood word score threshold)로 지칭된다(Altschul et al., 상기와 동일). 이들 초기 이웃 단어 히트(hits)는 이들이 포함된 더 긴 HSPs를 찾기 위한 조사를 실행하는 씨드(seed)로 작용한다. 단어 히트는 누적 배열 득점이 증가되는 한 각 서열을 따라 양 방향으로 확장된다. 누적 득점(Cumulative scores)은 뉴클레오티드 서열들의 경우, 매개변수 M (정합(matching) 잔기 쌍의 경우 보상 득점; 항상 >0) 및 N (부정합(mismatching) 잔기들에 대한 벌칙 득점; 항상<0)을 이용하여 계산된다. 아미노산 서열들의 경우, 득점 매트릭스(scoring matrix)를 이용하여 누적 득점을 계산한다. 각 방향에서 단어 히트의 연장은 다음의 경우 중단된다: 최대 획득된 값으로부터 분량 X만큼 누적 배열 득점이 떨어질 때; 하나 또는 그 이상의 음성-득점 잔기 배열의 축적으로 인하여, 누적 득점이 0 또는 그 이하로 내려갈 때; 또는 어느 서열이건 서열의 단부에 이를 때. BLAST 알고리즘 매개변수 W, T, 및 X는 배열의 감도(sensitivity) 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램 (뉴클레오티드 서열들의 경우)은 단어 길이(W) 11, 예측(E) 10, M=5, N=4 그리고 양 가닥의 비교를 디폴트로 이용한다. 아미노산 서열들의 경우, BLASTP 프로그램은 단어길이 3, 그리고 예측(E) 10, 그리고 BLOSUM62 득점 매트릭스(Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989) 참고) 배열 (B) 50, 예측(E) 10, M=5, N=4, 그리고 양 가닥의 비교를 디폴트로 이용한다.

용어 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 단일-가닥으로된 그리고 이중-가닥으로된 뉴클레오티드 폴리머들을 모두 포함한다. 폴리뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 이들중 임의의 뉴클레오티드의 변형된 형태일 수 있다. 전술한 변형들(modifications)은 염기 변형들 가령, 브로모우리딘 및 이노신 유도체들, 리보오스 변형들 가령, 2',3'-디데옥시리보오스, 그리고 뉴클레오티드간 링키지 변형들 가령, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포로아닐라데이트 그리고 포스포로아미데이트를 포함한다.

용어 "올리고뉴클레오티드"는 200개 또는 이 보다 적은 수의 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 말한다. 일부 구체예들에서, 올리고뉴클레오티드는 길이가 10 내지 60개 염기들이다. 다른 구체예들에서, 올리고뉴클레오티드는 길이가 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 내지 40개의 뉴클레오티드다. 올리고뉴클레오티드는 예컨데, 돌연변이체 유전자의 작제에 이용되는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 탐지 분석용으로 방사능동위원소라벨, 형광 라벨, 합텐 또는 항원성 라벨을 포함하는 라벨을 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 예를 들면, PCR 프라이머, 클로닝 프라이머 또는 혼성화(hybridization) 프로브로 이용될 수 있다.

"단리된 핵산 분자"는 게놈의 DNA 또는 RNA, mRNA, cDNA, 또는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부와 연관되지 않는 이의 합성 기원 또는 이의 일부 조합을 의미하며, 여기에서 단리된 폴리뉴클레오티드는 자연상태에서 볼 수 있거나, 또는 자연적으로 연계되지 않은 폴리뉴클레오티드에 연계된다. 본 설명을 목적으로, 특정 뉴클레오티드 서열을 포함하는 "핵산 분자"는 고유한 염색체를 포괄하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 명시된 핵산 서열들을 "포함하는" 단리된 핵산 분자들은 명시된 서열들에 추가하여, 최대 10 또는 심지어 최대 20개의 다른 단백질들 또는 이의 일부의 코딩 서열들을 포함할 수 있거나, 또는 명시된 핵산 서열들의 코딩 부분의 발현을 조절하는 작용가능하도록 연계된 조절 서열을 포함할 수 있고, 및/또는 벡터 서열들을 포함할 수 있다.

다른 언급이 없는 한, 본 명세서에서 논의되는 임의의 단일-가닥으로된 폴리뉴클레오티드 서열의 좌측 말단은 5'말단이며; 이중-가닥으로된 폴리뉴클레오티드 서열들의 좌측 방향은 5'방향을 지칭한다. 5'에서 3'방향으로 초기 RNA 전사체들의 추가는 전사 방향을 지칭하고; RNA 전사체의 5'에서 5'단부인 RNA 전사체와 동일한 서열을 보유하는 DNA 가닥상에 서열 영역들은 "상류(upstream) 서열들"이라고 하며; RNA 전사체의 3'에서 3'단부인 RNA 전사체와 동일한 서열을 보유하는 DNA 가닥상에 서열 영역들은 "하류(downstream) 서열들"이라고 한다.

용어 "조절 서열"은 결찰되는 코딩 서열의 발현 및 프로세싱에 영향을 줄 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 이러한 조절 서열들의 성질은 숙주 유기체에 따라 달라질 수 있다. 특정 구체예들에서, 원핵생물용 조절 서열들은 프로모터, 리보좀 결합 부위, 그리고 전사 종료 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 진핵생물용 조절 서열들은 전사 인자들, 전사 인헨서 서열들, 그리고 전사 종료 서열을 위한 하나 또는 다수의 인지 부위들을 포함하는 프로모터들을 포함할 수 있다. "조절 서열들"은 리더 서열들 및/또는 융합 파트너 서열들을 포함할 수 있다.

용어 "벡터"는 단백질 코딩 정보를 숙주 세포로 전달하는데 이용되는 임의의 분자 또는 엔터티(예컨데, 핵산, 플라스미드, 박테리오파아지 또는 바이러스)를 의미한다.

용어 "발현 벡터" 또는 "발현 구조체"는 숙주 세포의 형질변환에 적합하고, 그리고 핵산 서열에 작용가능하도록 연계된 하나 또는 그 이상의 이종기원(heterologous) 코딩 영역들의 지향 및/또는 조절(숙주 세포와 결합)하는 핵산 서열들을 포함하는 벡터를 말한다. 발현 구조체는 전사, 해독에 영향을 주는 또는 조절하는, 그리고 인트론이 존재한다면, 이에 작용가능하도록 연계된 코딩 영역을 접합시키는 RNA에 영향을 주는 서열들을 포함하나 이에 한정되지 않는 서열들을 포함할 수 있다. 본 발명에 유용한 발현 벡터들은 발현되는 DNA 서열 또는 단편에 작용가능하도록 연계된 최소한 하나의 발현 조절 서열을 포함한다. 이 조절 서열은 클론된 DNA 서열의 발현을 조절 및 제어하기 위하여 벡터 안에 삽입된다. 유용한발현 조절 서열들의 예로는 lac 시스템, trp 시스템, tac 시스템, trc 시스템, 람다 파아지의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역들, fd 피복 단백질의 조절 영역, 효모의 해당(glycolytic) 프로모터들, 예컨데, 3-포스포글리세레이트 키나제용 프로모터, 효소 산 포스파타제용 프로모터, 예컨데, Pho5, 효모 알파-메이팅 인자들의 프로모터들, 그리고 폴리오마, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 그리고 원숭이 바이러스로부터 유도된 프로모터들, 예컨데, 초기(early) 및 후기(late) 프로모터들 또는 SV40, 그리고 원핵 또는 진핵 세포 및 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 공지된 기타 서열들 또는 이의 조합들이 있다.

본 명세서에서 이용된 것과 같이, "작용가능하도록 연계된(operably linked)"이란 이 용어가 적용되는 성분들이 적합한 조건하에 이들의 고유 기능을 실행하도록 허용하는 관계에 있다는 것을 의미한다. 예를 들면, 백터안에서 단백질 코딩 서열에 "작용가능하도록 연계된" 조절 서열은 조절 서열들의 전사 활성에 필적되는 조건하에 단백질 코딩 서열의 발현이 이루어지도록 결찰된다.

용어 "숙주 세포"는 핵산 서열에 의해 형질변환된 또는 형질변환될 수 있고, 이에 의해 관심대상의 유전자를 발현시키는 세포를 의미한다. 이 용어는 관심 대상의 유전자가 존재하는 한, 부모 세포의 후손이 형태학적으로 동일하거나 또는 당일하지 않거나 또는 고유 부모 세포로 유전적으로 구성되던 간에 부모 세포의 후손을 포함한다.

용어 "형질감염(transfection)"은 세포에 의해 외부 또는 외생성 DNA가 취입되는 것을 말하며, 그리고 이 외생성 DNA가 세포 막 안으로 도입되었을 때 이 세포는 "형질감염되었다"라고 한다. 다수의 형질감염 기술들이 당업계에 잘 공지되어 있고, 본 명세서에서 설명된다. 예컨데, Graham et al ., 1973, Virology 52:456; Sambrook et al ., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 상기와 동일; Davis et al., 1986, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier; Chu et al ., 1981, Gene 13:197 참고. 이러한 기술들을 이용하여 하나 또는 그 이상의 외생성 DNA 모이어티들을 적합한 숙주 세포들 안으로 도입시킬 수 있다.

용어 "형질변환(transformation)"은 세포의 유전적 특징에 변화를 지칭하며, 새로운 DNA 또는 RNA를 포함하도록 세포가 변형되었을 때, 이 세포는 형질변환되었다고 한다. 예를 들면, 형질감염, 형질유도(transduction), 또는 다른 기술들을 통하여 새로운 유전적 물질을 도입시킴으로써 세포의 고유 상태로부터 유전적으로 변형될 때 세포는 형질변환된다. 형질감염 또는 형질유도 후, 형질변환 DNA는 세포의 염색체 안으로 물리적으로 통합됨으로써 세포의 DNA와 재조합될 수 있거나, 또는 복제없이 에피좀 요소로 일시적으로 유지될 수 있거나, 또는 플라스미드와 같이 독립적으로 복제될 수 있다. 이 형질변환 DNA가 세포의 분할과 함께 복제될 때, 이 세포는 "안정적으로 형질변환되었다"로 간주된다.

용어 "폴리펩티드" 또는 "단백질"은 고유 단백질의 아미노산 서열을 보유하는 거대분자를 의미하는데, 즉, 자연적으로-발생되는 그리고 비-재조합 세포에 의해 생산되는 단백질이거나; 또는 유전적으로-조작된 또는 재조합 세포에 의해 생산되며, 그리고 이 고유 단백질의 아미노산 서열을 보유한 분자들, 또는 고유 서열로부터 결실, 추가 및/또는 치환을 가진 분자들을 포함한다. 이 용어는 하나 또는 그 이상의 아미노산들이 대응하는 자연적으로-발생되는 아미노산 및 폴리머들의 화학적 유사체인, 아미노산 폴리머들을 또한 포함한다. 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 특히 EGFR 항원 결합 단백질들, 항체들, 또는 항원-결합 단백질의 하나 이상의 아미노산의 결실, 추가 및/또는 치환을 가진 서열들을 포괄한다. 이 용어 "폴리펩티드 단편"은 전장(full-length)의 고유 단백질과 비교하였을 때, 아미노-말단 결실, 카르복시-말단 결실, 및/또는 내부 결실을 보유한 폴리펩티드를 지칭한다. 이러한 단편들은 고유 단백질과 비교하였을 때 변형된 아미노산들을 또한 포함할 수 있다. 특정 구체예들에서, 단편들은 길이가 약 5 내지 500개의 아미노산들이다. 예를 들면, 단편들은 길이가 최소한 5, 6, 8, 10, 14, 20, 50, 70, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 또는 450개의 아미노산들이다. 유용한 폴리펩티드 단편들은 결합 도메인들을 포함하는, 항체들의 면역학적 기능적 단편들을 포함한다. EGFR-결합 항체의 경우, 유용한 단편들은 CDR 영역, 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 도메인, 항체 쇄의 일부 또는 2개의 CDR을 포함하는 이의 가변 영역들, 그리고 이와 유사한 것들을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

용어 "단리된 단백질"은 주체(개체) 단백질은 (1) 이 주체 단백질과 보통 함께 볼 수 있는 일부 다른 단백질이 최소한 없으며, (2) 동일한 원천, 예컨데, 동일한 종으로부터 다른 단백질이 기본적으로 없으며, (3) 상이한 종의 세포에 의해 발현되며, (4) 최소한 약 50%의 폴리뉴클레오티드, 지질, 탄수화물 또는 자연 상태에서 연합된 기타 물질들로부터 분리되었으며, (5) 자연상태에서 연합되지 않은 폴리펩티드와 작용가능하도록 연합되며 (공유 또는 비-공유 상호작용에 의해), 또는 (6) 자연상태에서 발생되지 않음을 의미한다. 전형적으로, "단리된 단백질"은 주어진 시료의 최소한 약 5%, 최소한 약 10%, 최소한 약 25%, 또는 최소한 약 50%로 구성된다. 합성 기원의 게놈 DNA, cDNA, mRNA 또는 기타 RNA, 또는 이의 조합도 이러한 단리된 단백질을 인코드할 수 있다. 바람직하게는, 단리된 단백질은 이의 자연 환경에서 발견되는, 치료, 진단, 예방, 연구 및 기타 용도를 간섭할 수 있는 단백질들 또는 폴리펩티드들 또는 기타 오염물질들이 실질적으로 없다.

용어 "아미노산"은 자연적으로 그리고 비-자연적으로 발생되는 아미노산들을 지칭하는데, 당업계에서 이의 통상적 의미를 포함한다.

폴리펩티드 (예컨데, 항원 결합 단백질, 또는 항체)의 "변이체(variant)"는 또다른 폴리펩티드 서열과 비교하여 아미노산 서열에 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기들이 삽입되거나, 이로부터 결실되거나 및/또는 치환된 아미노산 서열을 포함한다. 변이체들은 융합 단백질들을 포함한다.

용어 "동일성(identity)"은 서열의 배열 및 비교에 의해 측정될 때, 2개 또는 그 이상 폴리펩티드 분자의 서열들 또는 2개 또는 그 이상 핵산 분자 사이에 상관관계를 지칭한다. "동일성 백분율"은 비교된 분자들안에서 아미노산 또는 뉴클레오티드 간에 동일한 잔기들의 백분율을 의미하고, 비교되는 분자들의 최소 크기에 근거하여 계산된다. 이들 계산을 위하녀 배열에서 갭(존재한다면)은 특정 수학적 모델 또는 컴퓨터 프로그램 (가령,"알고리즘")에 의해 선호적으로 어드레스된다. 배열된 핵산 또는 폴리펩티드들의 동일성을 계산하는데 이용될 수 있는 방법들은 Computational Molecular Biology, (Lesk, A. M., ed.), 1988, New York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, D. W., ed.), 1993, New York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.), 1994, New Jersey: Humana Press; von Heinje, G., 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: Academic Press; Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.), 1991, New York: M. Stockton Press; 그리고 Carillo et al., 1988, SIAM J. Applied Math. 48:1073에서 설명된 것들을 포함한다.

동일성 백분율을 계산함에 있어서, 비교되는 서열들은 서열 간에 최대 정합을 제공하는 방식으로 전형적으로 배열된다. 동일성 백분율을 결정하는데 이용될 수 있는 한 가지 예시적인 컴퓨터 프로그램은 GCG 프로그램 패키지이고, 이 패키지는 GAP을 포함한다 (Devereux et al., 1984, Nucl. Acid Res. 12:387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI). 컴퓨터 알고리즘 GAP를 이용하여 서열 동일성 백분율이 결정되는 두 가지 폴리펩티드들 또는 폴리뉴클레오티드들을 배열한다. 이 서열들은 이들의 해당 아미노산 또는 뉴클레오티드의 최적 정합을 위하여 배열된다(알고리즘에 의해 결정될 때 "정합된 구간(matched span)". 이 알고리즘과 함께, 갭 오프닝 페널티(gap opening penalty) (이는 3x 평균 항으로 계산되며, 여기에서 "평균 항(average diagonal)"은 이용되는 비교 매트릭스의 항의 평균을 말하며; "항(diagonal)"은 특정 비교 매트릭스에 의해 각 완벽한 아미노산 정합에 할당되는 득점 또는 숫자를 말한다) 그리고 갭 연장 페널티(gap extension penalty) (통상 갭 오픈 패널티의 1/10 배이다), 뿐만 아니라 비교 매트릭스 가령 PAM 250 또는 BLOSUM 62이 이용된다. 특정 구체예들에서, 표준 비교 매트릭스(PAM 250 비교 매트릭스용으로 Dayhoff et al ., 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352; BLOSUM 62 비교 매트릭스용으로 Henikoff et al ., 1992, Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 89:10915-10919)는 이 알고리즘에 의해 또한 이용된다.

GAP 프로그램을 이용하여 폴리펩티드들 또는 뉴클레오티드 서열들에 대한 동일성 백분율을 결정하는데 이용될 수 있는 매개변수의 예들은 다음과 같다:

● 알고리즘: Needleman et al., 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453

● 비교 매트릭스: BLOSUM 62, Henikoff et al., 1992, 상기

● 갭 패널티: 12 (그러나, 단부 갭에 대한 패널티는 없음)

● 갭 길이 패널티: 4

● 유사성 임계치: 0

두 아미노산 서열들의 배열을 위한 특정 배열 계획은 이들 두 서열의 단지 짧은 영역들의 정합만을 초래할 수 있고, 이러한 배열된 작은 영역은 이 두 전장 서열들 사이에 유의적인 상호관계가 없다하더라도 매우 높은 서열 동일성을 보유할 수 있다. 따라서, 표적 폴리펩티드의 인접 아미노산들의 최소한 50개 또는 다른 수까지 걸치는 배열을 초래하도록 원한다면 선택된 배열 방법(GAP 프로그램)은 조정될 수 있다.

본 명세서에서 이용된 것과 같이, 20개의 통상적인 (예컨데, 자연적으로 발생되는) 아미노산과 이들의 약어는 통상적인 사용에 따른다. Immunology - A Synthesis (2nd Ed., E. S. Golub & D. R. Gren, Eds., Sinauer Assoc., Sunderland, Mass. (1991)), 이는 임의의 목적을 위하여 전문이 여기에 참고자료로 편입된다. 20개의 통상적인 아미노산의 입체이성질체들(예컨데, D-아미노산들), 비천연 아미노산들 가령 α-, α-이중치환된 아미노산들, N-알킬 아미노산들, 젖산, 그리고 기타 비통상적인 아미노산들은 본 발명의 폴리펩티드들의 적합한 성분이 또한 될 수 있다. 비통상적인 아미노산들의 예로는 다음을 포함한다: 4-하이드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트, ε-N,N,N-트리메틸리신, ε-N-아세틸리신, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-포르밀메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5-히드록시리신, σ-N-메틸아르기닌, 그리고 기타 유사한 아미노산들 및 이미노산(예컨데, 4-히드록시프롤린)을 포함한다. 본 명세서에서 이용된 폴리펩티드 표시법에서, 표준 사용 및 협정에 따라 왼쪽 방향은 아미노 말단 방향이며, 오른쪽 방향은 카르복시-말단 방향이다.

유사하게, 다른 언급이 없는 한, 단일-가닥으로된 폴리뉴클레오티드 서열들의 좌측 단부는 5'단부이며; 이중-가닥으로된 폴리뉴클레오티드 서열들의 좌측 방향은 5'방향이라고 한다. 초기 RNA 전사체들의 5'에서 3'방향으로 추가는 전사 방향으로 지칭되며; RNA와 동일한 서열을 보유하고, RNA 전사체의 5'에서 5'방향이 되는 DNA 가닥상에서 서열 영역은 "상류 서열들"이라고 하며; RNA 전사체의 3'에서 3'방향이 되는 DNA 가닥상에서 서열 영역은 "하류 서열들"이라고 한다.

보존적(Conservative) 아미노산 치환들은 자연적으로 발생되지 않는 아미노산 잔기들을 포괄할 수 있는데, 이들은 생물학적 시스템에서 합성보다는 화학적 펩티드 합성에 의해 일반적으로 편입된다. 여기에는 펩티드모방체들(peptidomimetics) 및 뒤집힌(reversed) 또는 역전된(inverted) 형태의 다른 아미노산 모이어티를 포함한다.

자연적으로 발생되는 잔기들은 보통의 측쇄 성질에 근거하여 분류될 수 있다:

소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

산성: Asp, Glu;

염기성: His, Lys, Arg;

쇄의 지향(chain orientation)을 간섭하는 잔기들: Gly, Pro; 그리고

방향족: Trp, Tyr, Phe.

예를 들면, 비-보존적 치환들은 이들 부류중 하나의 구성원이 또다른 부류의 구성원과의 교환과 관련될 수 있다. 이러한 치환된 잔기들은 예를 들면, 비-인간 항체들과 상동성인 인간 항체의 영역 안으로, 또는 이 분자의 비-상동성 영역 안으로 도입될 수 있다.

특정 구체예들에 따라 이 항원 결합 단백질 (가령 항체)에 변화를 만들 때, 아미노산들의 수치료 색인(hydropathic index)이 고려될 수 있다. 각 아미노산에는 이 아미노산의 소수성 및 하전 특징에 근거하여 수치료 색인이 할당되었다. 이것들은 다음과 같다: 이소류신 (+4.5); 발린 (+4.2); 류신 (+3.8); 페닐알라닌 (+2.8); 시스테인/시스틴 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글리신(-0.4); 트레오닌 (-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 티로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파라테이트 (-3.5); 아스파라진 (-3.5); 리신 (-3.9); 그리고 아르기닌 (-4.5).

단백질에게 상호활성 생물학적 기능을 부여함에 있어서 아미노산의 수치료 색인의 중요성은 당업계에 이해되고 있다. Kyte et al ., J. Mol. Biol., 157:105-131 (1982). 특정 아미노산들은 유사한 수치료 색인 또는 득점을 보유하지만, 유사한 생물학적 활성을 유지하는 다른 아미노산들로 치환될 수 있음이 알려져있다. 수치료 색인에 근거하여 변화를 만들 때, 특정 구체예들에서, 수치료 색인이 ±2 이내인 아미노산들의 치환이 포함된다. 특정 구체예들에서, ±1이내인 것들이 포함되며, 그리고 특정 구체예들에서, ±0.5 이내인 것들이 포함된다.

유사한(like) 아미노산들의 치환은 창조된 생물학적으로 기능적 단백질 또는 단백질이 본 발명의 경우에서와 같이 면역학적 구체예들에서 사용하도록 의도될 때 특히, 친수성에 근거하여 효과적으로 만들어질 수 있다는 것이 당업계에서 또한 인지된다. 특정 구체예들에서, 단백질의 인접 아미노산들의 소수성에 의해 지배될 때, 단백질의 최대 국소 평균 친수성은 가령, 단백질의 생물학적 성질과 함께, 이의 면역원성 및 항원성과 관련된다.

이들 아미노산 잔기들에게 다음의 친수성 값들이 할당되었다: 아르기닌 (+3.0); 리신 (+3.0); 아스파라테이트 (+3.0 ± 1); 글루타메이트 (+3.0 ± 1); 세린 (+0.3); 아스파라진 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글리신(0); 트레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5 ± 1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 류신 (-1.8); 이소류신 (-1.8); 티로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5) 그리고 트립토판 (-3.4). 유사한 친수성 값들에 근거하여 변화를 만들 때, 특정 구체예들에서, 친수성 값이 ±2 이내인 아미노산들의 치환이 포함된다. 특정 구체예들에서, ±1이내인 것들이 포함되며, 그리고 특정 구체예들에서, ±0.5 이내인 것들이 포함된다. 친수성에 근거하여 근본적 아미노산 서열들로부터 에피토프를 또한 확인할 수 있다. 이들 영역은 또한 "에피토프 코어 영역들"이라고 지칭된다.

예시적인 아미노산 치환들을 표 1에 제시한다.

용어 "유도체(derivative)"는 아미노산(또는 핵산)의 삽입, 결실, 또는 치환을 제외한 화학적 변형을 포함하는 분자를 지칭한다. 특정 구체예들에서, 유도체들은 공유적 변형들, 가령, 폴리머들, 지질, 기타 유기 또는 무기 모이어티들과의 화학적 결합을 포함하나 이에 한정되지 않는, 변형들을 포함한다. 특정 구체예들에서, 화학적으로 변형된 항원 결합 단백질은 화학적으로 변형안된 항원 결합 단백질보다 더 큰 순환 반감기를 보유할 수 있다. 특정 구체예들에서, 화학적으로 변형된 항원 결합 단백질은 의도된 세포들, 조직, 및/또는 장기들에 대한 개선된 표적화 능력을 보유할 수 있다. 일부 구체예들에서, 항원 결합 단백질 유도체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌 글리콜, 또는 폴리프로필렌 글리콜을 포함하나 이에 한정되지 않는, 하나 또는 그 이상의 수용성 폴리머 부착물들을 포함하도록 공유적으로 변형된다. 예컨데, 미국 특허 제4,640,835호, 제4,496,689호, 제4,301,144호, 제4,670,417호, 제4,791,192호 그리고 제4,179,337호 참고. 특정 구체예들에서, 항원 결합 단백질 유도체는 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜, 덱스트란, 셀룰로오즈, 또는 기타 탄수화물 기반된 폴리머들, 폴리-(N-비닐 피롤리돈)-폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 동종폴리머들, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 코폴리머, 폴리옥시에틸화된 폴리올 (예컨데, 글리세롤) 그리고 폴리비닐 알코올, 뿐만 아니라 이러한 폴리머들의 혼합물을 포함하나 이에 한정되지 않는, 하나 또는 그 이상의 폴리머를 포함한다.

특정 구체예들에서, 유도체는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 소단위들과 함께 공유적으로 변형된다. 특정 구체예들에서, 하나 또는 그 이상의 수용성 폴리머는 하나 또는 그 이상의 특이적 위치, 예를 들면 유도체의 아미노 말단에 결합된다. 특정 구체예들에서, 하나 또는 그 이상의 수용성 폴리머는 유도체의 하나 또는 그 이상의 측쇄에 무작위로 부착된다. 특정 구체예들에서, PEG를 이용하여 항원 결합 단백질에 대한 치료 효능을 개선시킨다. 특정 구체예들에서, PEG를 이용하여 인간화된 항체에 대한 치료 효능을 개선시킨다. 이러한 특정 방법들은 예를 들면, U.S. 특허 제6,133,426호에서 논의되며, 이는 임의의 목적을 위하여 전문이 여기에 참고자료로 편입된다.

제약 산업에서 펩티드 유사체들(analogs)은 주형(template) 펩티드와 유사한 성질을 가진 비-펩티드 약물로 통상적으로 이용된다. 이러한 유형의 비-펩티드 화합물을 "펩티드 모방체(peptide mimetics 또는 peptidomimetics)"라고 한다. Fauchere, J., Adv. Drug Res., 15:29 (1986); Veber & Freidinger, TINS, p.392 (1985); 그리고 Evans et al., J. Med. Chem., 30:1229 (1987), 임의의 목적을 위하여 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 편입된다. 이러한 화합물들은 자동화된 분자 모델링의 도움으로 흔히 발달된다. 치료요법적으로 유용한 펩티드들과 구조적으로 유사한 펩티드 모방체들을 이용하여 유사한 치료 또는 예방 효과를 만들 수 있다. 일반적으로, 펩티드모방체들은 전형적인(paradigm) 폴리펩티드 (가령, 생화학적 성질 또는 약리학적 활성을 보유한 폴리펩티드), 가령 인간 항체와 구조적으로 유사하지만, 당업계에 잘 공지되어 있는 방법들에 의해 다음으로부터 선택된 최소한 하나의 링키지에 의해 임의선택적으로 대체된 하나 또는 그 이상의 펩티드 링키지(linkage)를 보유한다: --CH₂NH--, --CH₂S--, --CH₂-CH₂--, --CH=CH-(시스 및 트란스), --COCH₂--, --CH(OH)CH₂--, 그리고 CH₂SO--. 특정 구체예들에서, 콘센선스(consensus) 서열의 하나 또는 그 이상의 아미노산들이 동일한 유형의 D-아미노산(예컨데, L-리신을 대신하여 D-리신)으로의 시스템적 치환을 이용하여 좀더 안정적인 펩티드들을 만들 수 있다. 또한, 콘센선스 서열 또는 실질적으로 동일한 콘센선스 서열 변이를 포함하는 강요된(constrained) 펩티드들이 당업계에 잘 공지되어 있는 방법들에 의해 만들어질 수 있다(Rizo & Gierasch, Ann. Rev. Biochem., 61:387 (1992), 임의의 목적을 위하여 여기에 참고자료로 편입된다); 예를 들면, 펩티드를 고리화시키는 분자내 이황화 다리를 형성할 수 있는 내부 시스테인 잔기들을 첨가함으로써 만들 수 있다.

생물학적 재료들, 가령 폴리펩티드들, 핵산, 숙주 세포, 그리고 이와 유사한 것과 연관되어 명세서를 통하여 이용된 용어 "자연적으로 발생되는"이란 자연계에서 발견되는 재료 또는 재료의 형태를 지칭한다.

본 명세서에서 이용된 것과 같이 "항원 결합 단백질"("ABP")은 특정 표적 항원에 결합하는 임의의 단백질을 의미한다. 본 출원에서, 특정 표적 항원은 EGFR 단백질 또는 이의 단편 또는 영역이다. "항원 결합 단백질"은 항체들 및 이의 결합 부분들, 가령 면역학적으로 기능을 하는 단편들을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 펩티바디(Peptibodies)는 항원 결합 단백질들의 또다른 예시다. 항체 또는 면역글로블린 쇄(중쇄 또는 경쇄) 항원 결합 단백질의 "면역학적으로 기능적 단편" (또는 단순히 "단편")은 본 명세서에서 이용된 것과 같이, 전장 쇄에 존재하는 아미노산의 최소한 일부가 부족하지만, 항원에 특이적 결합을 여전히 할 수 있는 항체의 일부(일부가 어떻게 획득되거나 합성되었는지와는 무관하게)를 포함하는 항원 결합 단백질의 종이다. 이러한 단편들은 생물학적으로 활성이 있으며, 이들은 표적 항원에 결합하고, 주어진 에피토프에 결합함에 있어서 고유 항체들을 포함하는 기타 항원 결합 단백질들과 경쟁할 수 있다. 일부 구체예들에서, 이 단편들은 중화 단편들이다. 일부 구체예들에서, 이 단편들은 EGF와 EGFR 사이에 상호작용 가능성을 차단 또는 감소시킬 수 있다. 한 측면에서, 이러한 단편은 전장의 경쇄 또는 중쇄에 존재하는 최소한 하나의 CDR을 보유할 것이며, 그리고 일부 구체예들은 단일 중쇄 및/또는 경쇄 또는 이의 일부를 포함할 것이다. 이들 생물학적으로 활성 단편들은 재조합 DNA 기술에 의해 만들어질 수 있거나, 또는 고유 항체들을 포함하는, 항원 결합 단백질들의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 만들어질 수 있다. 면역학적으로 기능적 면역글로블린 단편들은 Fab, 디아바디(diabody) (경쇄 가변 도메인과 동일한 폴리펩티드 상에 중쇄 가변 도메인, 이들은 동일한 쇄 상에서 두 도메인 사이에 쌍형성을 허용하기에는 너무 짧은 펩티드 링커에 의해 연결되어 있다), Fab', F(ab')₂, Fv, 도메인 항체들 그리고 단일-쇄 항체들을 포함하나 이에 한정되지 않고, 인간, 마우스, 쥐, 카멜리드(camelid) 또는 토끼를 포함하나 이에 한정되지 않는 임의의 포유류로부터 유도될 수 있다. 본 명세서에서 설명된 항원 결합 단백질들의 기능적 일부, 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 CDR은 제 2 단백질 또는 소분자에 공유적으로 결합되어, 이중기능 치료 성질을 보유한, 또는 연장된 혈청 반감기를 보유하는 신체내 특정 표적을 지향하는 치료제를 만들 수 있다는 것도 더 고려될 수 있다. 당업계에 숙련자들에 의해 인지될 수 있는 것과 같이, 항원 결합 단백질은 비-단백질 성분들을 포함할 수 있다.

본 명세서에서 설명된 특정 항원 결합 단백질들은 항체들 또는 항체들로부터 유도된다. 특정 구체예들에서, 이 항원 결합 단백질들의 폴리펩티드 구조는 단일클론성 항체들, 이중특이적 항체들, 미니바디(minibodies), 도메인 항체들, 합성 항체들 (때로, 본 명세서에서 "항체 모방체(mimetics)"이라고 함), 키메라 항체들, 인간화된 항체들, 인간 항체들, 항체 융합 (때로, 본 명세서에서 "항체 접합체(conjugates)"라고 함), 그리고 이의 단편들을 포함하나 이에 한정되지 않는, 항체들에 기반을 둔다. 일부 구체예들에서, 이 항원 결합 단백질은 아비머(avimers)(단단한 결합 펩티드)를 포함 또는 구성된다. 이러한 다양한 항원 결합 단백질들은 본 명세서에서 더 설명된다.

"Fc" 영역은 항체의 C_H1 및 C_H2 도메인들을 포함하는 2개의 중쇄 단편들을 포함한다. 2개의 중쇄 단편들은 2개 또는 그 이상 이황화 결합과 C_H3 도메인들의 소수성 상호작용에 의해 잡혀있다.

"Fab 단편"은 하나의 경쇄와 하나의 중쇄의 C_H1 및 가변 영역들을 포함한다. Fab 분자의 중쇄는 또다른 중쇄 분자와 함께 이황화 결합을 형성할 수 없다.

"Fab' 단편"은 하나의 경쇄와 V_H 도메인 및 C_H1 도메인을 포함하는 하나의 중쇄 일부, 그리고 C_H1과 C_H2 도메인 사이의 영역들을 포함하고, 쇄간 이황화결합(interchain disulfide bond)은 2개의 Fab' 단편들의 2개 중쇄 사이에 형성되어 F(ab')₂ 분자를 만들 수 있다.

"F(ab')₂ 단편"은 C_H1과 C_H2 도메인들 사이에 불변 영역의 일부를 포함하는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함하고, 쇄간 이황화결합은 2개의 중쇄 사이에서 형성된다. 따라서, F(ab')₂ 단편은 2개의 중쇄 사이에 이황화 결합에 의해 서로 잡혀있는 2개의 Fab' 단편들로 구성된다. 을 포함한다.

"Fv 영역"은 불변 영역들이 부족하지만, 중쇄와 경쇄 모두로부터 가변 영역을 포함한다.

"단일-쇄 항체들"은 단일 폴리펩티드 쇄를 형성하기 위하여 유연성 링커에 의해 서로 연결된 중쇄 및 경쇄 가변 영역들이 있는 Fv 분자이며, 항원 결합 영역을 형성하게 된다. 단일 쇄 항체들은 국제 특허 출원 공개 번호 WO 88/01649 및 미국 특허 제4,946,778호 및 제5,260,203호에서 논의되며, 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 편입된다.

"도메인 항체"는 중쇄의 가변 영역 또는 경쇄의 가변 영역만을 포함하는 면역학적으로 기능적 면역글로블린 단편이다. 일부 경우들에서, 2개 또는 그 이상 V_H 영역들은 펩티드 링커에 의해 공유적으로 결합되어 이가(bivalent) 도메인 항체가 만들어진다. 이가 도메인 항체의 2개 V_H 영역들은 동일한 또는 상이한 항원들을 표적할 수 있다

"이가(bivalent) 항원 결합 단백질" 또는 "이가(bivalent) 항체"는 2개의 항원 결합 부위를 포함한다. 일부 경우들에서, 2개의 결합 부위들은 동일한 항원 특이성을 보유한다. 이가 항원 결합 단백질들과 이가 항체들은 본 명세서에서 정의된 것과 같이 이중특이적일 수 있다. "다중특이적" 또는 "다중기능적" 항체를 제외한 이가 항체는 특정 구체예들에서, 각각 동일한 결합 부위를 가지는 것으로 일반적으로 이해된다.

"다중특이적 항원 결합 단백질" 또는 "다중특이적 항체"는 하나 이상의 항원 또는 에피토프를 표적으로 하는 것이다.

"이중특이적", "이원(dual)-특이적", 또는 "이중기능적" 항원 결합 단백질 또는 항체는 각각 두 개의 상이한 항원 결합 부위들을 보유한 하이브리드 항원 결합 단백질 또는 항체다. 이중특이적 항원 결합 단백질들과 항체들은 다중특이적 항원 결합 단백질 항체의 종이며, 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편들의 연계를 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 방법들에 의해 만들어질 수 있다. 예컨데, Songsivilai and Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321; Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:1547-1553. 이중특이적 항원 결합 단백질 또는 항체의 2개의 결합 부위는 2개의 상이한 에피토프에 결합할 것이며, 동일한 또는 상이한 단백질 표적이 존재할 수 있다.

각 개별 면역글로블린 쇄는 전형적으로 몇 가지 "면역글로블린 도메인들"로 구성되는데, 각각은 대충 90 내지 110개의 아미노산들로 구성되며, 특징적인 폴딩 패턴을 보유한다. 이들 도메인은 항체 폴리펩티드들로 구성된 기본 단위들이다. 인간에서, IgA 및 IgD 이소타입은 4개의 중쇄와 4개의 경쇄를 포함하고; IgG 및 IgE 이소타입은 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하고; 그리고 IgM 이소타입은 5개의 중쇄와 5개의 경쇄를 포함한다. 중쇄 C 영역은 전형적으로 작동체 기능을 담당할 수 있는 하나 또는 그 이상의 도메인들을 포함한다. 중쇄 불변 영역 도메인들의 수는 이소타입에 따라 달라질 것이다. IgG 중쇄는 예를 들면, C_H1, C_H2 및 C_H3로 알려진 3개의 C 영역 도메인을 포함한다. 제시된 항체들은 이들 이소타입(이소타입s) 및 서브타입(subtypes)중 임의의 것을 가질 수 있다. 본 발명의 특정 구체예들에서, 항-EGFR 항체는 IgG2 또는 IgG4 서브타입니다.

항원 결합 단백질은 해리 상수 (K_d)가 ≤10^-7 M인 경우 이의 표적 항원에 "특이적으로 결합한다"라고 말한다. 이 항원 결합 단백질은 K_d가 ≤ 5x10^-9M 인 경우 "높은 친화력"으로 항원에 특이적으로 결합하고, 그리고 K_d가 ≤ 5x10^-10M 인 경우 "매우 높은 친화력"으로 항원에 특이적으로 결합한다. 한 구체예에서, 이 항원 결합 단백질의 K_d 값은 ≤10^-9 M이다. 한 구체예에서, 분리 속도(off-rate)는 <1 x 10^-5이다. 다른 구체예들에서, 이 항원 결합 단백질들은 약 10^-9 M 내지 10^-13 M의 K_d로 인간 EGFR에 결합할 것이며, 여전히 또다른 구체예에서, 이 항원 결합 단백질들은 ≤5 x 10^-10의 K_d로 결합할 것이다. 당분야 숙련자들이 인지하겠지만, 일부 구체예들에서, 임의의 또는 모든 항원 결합 단편들은 EGFR에 특이적으로 결합할 것이다.

항원 결합 단백질이 제 2 표적에 결합하는 것보다 더 단단하게 하나의 표적에 결합할 때 "선택적(selective)"이라고 한다.

"항원 결합 영역"이란 지정된 항원 (예컨데, 파라토프(paratope))에 특이적으로 결합하는 단백질 또는 단백질의 일부를 의미한다. 예를 들면, 항원과 상호작용하고, 항원 결합 단백질에게 이 항원에 대한 특이성 및 친화력을 부여하는 아미노산 잔기들을 포함하는 항원 결합 단백질의 일부분을 "항원 결합 영역"이라고 한다. 항원 결합 영역은 하나 또는 그 이상의 상보성 결합 영역(CDR)을 일반적으로 포함한다. 특정 항원 결합 영역들은 a하나 또는 그 이상의 "골격(framework)" 영역들을 또한 포함한다. "CDR"은 항원 결합 특이성 및 친화력에 기여하는 아미노산 서열이다. "골격(Framework)" 영역들은 이 항원 결합 영역과 항원 사이에 결합을 촉진시키기 위하여 CDR의 적절한 배열을 유지하는데 도움을 줄 수 있다. 구조적으로, 골격 영역들은 항체들내에서 CDR 사이에 위치할 수 있다.

특정 측면들에서, EGFR, 예를 들면 인간 EGFR에 결합하는 재조합 항원 결합 단백질들이 제시된다. 이러한 내용에서,"재조합 항원 결합 단백질"은 재조합 기술, 가령, 본 명세서에서 설명된 재조합 핵산의 발현을 통하여 만들어진 단백질이다. 재조합 단백질들의 생산 방법들과 기술들은 당업계에 잘 공지되어 있다.

용어 "항체"는 임의의 이소타입의 고유 면역글로블린, 또는 이 표적 항원에 특이적 결합에 대해 고유 항체와 경쟁할 수 있는 이의 단편을 지칭하고, 그리고 실례로, 키메라, 인간화된, 완전한 인간, 및 이중특이적 항체들을 포함한다. "항체"은 항원 결합 단백질의 종이다. 고유 항체는 일반적으로 최소한 2가지 전장(full-length)의 중쇄와 2가지 전장의 경쇄를 포함할 것이지만, 그러나 일부 경우는 오로지 중쇄만을 포함할 수 있는 카멜리드(camelids)에서 자연적으로 발생되는 항체와 같이 더 적은 수의 쇄를 포함할 수 있다. 항체들은 단일 원천으로부터 오로지 유도될 수 있거나, 또는 "키메라(chimeric)", 즉, 하기에서 더 설명되겠지만 두 개의 상이한 항체들로부터 유도될 수 있는 상이한 부분을 가진 항체일 수도 있다. 이 항원 결합 단백질들, 항체들, 또는 결합 단편들은 재조합 DNA 기술, 또는 고유 항체들의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 하이브리도마로 생산될 수 있다, 다른 언급이 없는 한, 용어 "항체"는 2개의 전장 중쇄와 2개의 전장 경쇄를 포함하는 항체에 추가적으로, 유도체, 변이체들, 단편들, 그리고 이의 뮤테인(muteins)을 포함하며, 이들의 예들은 하기에서 설명된다. 더욱이, 명시적으로 배제되지 않는 한, 항체들은 단일클론성 항체들, 이중특이적 항체들, 미니바디(minibodies), 도메인 항체들, 합성 항체들 (일부 경우 "항체 모방체(mimetics)"라고 부름), 키메라 항체들, 인간화된 항체들, 인간 항체들, 항체 융합 (일부 경우 "항체 접합체"라고 부름), 그리고 이의 단편들을 각각 포함한다. 일부 구체예들에서, 이 용어는 펩티바디(peptibodies)를 또한 포괄한다.

자연적으로 발생되는 항체 구조적 단위는 일반적으로 사합체(tetramer)를 포함한다. 이러한 각 사합체는 일반적으로 두 개의 동일한 폴리펩티드 쇄 쌍으로 구성되며, 각 쌍은 하나의 전장 "경쇄"(특정 구체예들에서, 약 25 kDa)와 하나의 전장 "중쇄"(특정 구체예들에서, 약 50-70 kDa)를 보유한다. 각 쇄의 아미노-말단 일부는 일반적으로 항원 인지를 담당하는 약 100 내지 110개 또는 그 이상의 아미노산들로 된 가변 영역을 전형적으로 포함한다. 각 쇄의 카르복시-말단 일부는 작동체 기능을 담당하게될 불변 영역을 전형적으로 특정한다. 인간 경쇄들은 카파 및 람다 경쇄로 전형적으로 분류된다. 중쇄는 뮤(mu), 델타, 감마, 알파 또는 입실론으로 전형적으로 분류되며, 그리고 IgM, IgD, IgG, IgA, 및 IgE의 항체의 이소타입으로 특징화된다. IgG는 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4를 포함하나 이에 한정되지 않는, 몇 가지 하위분류를 보유한다. IgM은 IgM1 및 IgM2를 포함하나 이에 한정되지 않는, 하위분류를 보유한다. IgA는 IgA1 및 IgA2를 포함하나 이에 한정되지 않는 하위분류로 유사하게 세분된다. 전장의 경쇄 및 중쇄 안에서, 일반적으로 가변 영역과 불변 영역들은 약 12개 또는 그 이상의 아미노산들로 된 "J"영역에 의해 결합되고, 중쇄는 약 10개 이상의 아미노산들로 된 "D"영역을 또한 포함한다. 예컨데, Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)) (모든 목적을 위하여 이의 전문이 여기에 참고자료로 편입된다). 각 중쇄/경쇄 쌍의 가변 영역들은 전형적으로 항원 결합 부위를 형성한다.

가변 영역들은 상보성 결정 영역들 또는 CDR이라고도 불리는 3가지 초가변 영역들에 의해 결합된 상대적으로 보존된 골격 영역들(FR)의 동일한 일반적인 구조를 전형적으로나타낸다. 각 쌍의 두 개 쇄로부터 CDR은 골격 영역들에 의해 일반적으로 정렬되는데, 이러한 정렬은 특이적 에피토프에 결합을 가능하게 한다. 경쇄와 중쇄 가변 영역들은 N-말단으로부터 C-말단으로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4 도메인들을 포함한다. 각 도메인에 아미노산의 할당은 Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991)), 또는 Chothia & Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987); Chothia et al., Nature, 342:878-883 (1989)의 정의에 따라 이루어진다.

본 명세서에서 이용된 "92" 번호는 아미노산 번호 92를 지칭하는 것으로 이해해야 할 것이다. 이 경우 아미노산 번호 92는 Kabat 번호매김(numbering)을 이용하여, 또는 파니투무마브 항체 돌연변이체들의 경우 신호 펩티드 서열 다음을 직접 헤아림으로써 동일한 위치에 있다는 것을 인지할 것이다.

특정 구체예들에서, 항체 중쇄는 항체 경쇄 없이 항원에 결합한다. 특정 구체예들에서, 항체 경쇄는 항체 중쇄 없이 항원에 결합한다. 특정 구체예들에서, 항체 결합 영역은 항체 경쇄 없이 항원에 결합한다. 특정 구체예들에서, 항체 결합 영역은 항체 중쇄 없이 항원에 결합한다. 특정 구체예들에서, 개별 가변 영역은 다른 가변 영역없이 항원에 특이적으로 결합한다.

특정 구체예들에서, 항체의 구조를 해부하거나 및/또는 항체-리간드 복합체의 구조를 해부함으로써 CDR의 확실한 설명과 항체의 결합 부위를 포함하는 잔기들의 확인이 이루어진다. 특정 구체예들에서, 가령 X-선 결정학과 같은 당업계 숙련자들에게 공지된 다양한 임의의 기술에 의해 이루어질 수 있다. 특정 구체예들에서, CDR 영역들을 확인 또는 흉내내는데 다양한 분석 방법이 이용될 수 있다. 이러한 방법들의 예로는 Kabat 개념, Chothia 개념, "AbM" 개념 및 접촉 개념(contact definition)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

Kabat 개념은 항체에서 잔기들의 번호 매김의 기준이며, CDR 영역들을 확인하는데 일반적으로 이용된다. 예컨데, Johnson & Wu, Nucleic Acids Res., 28:214-8 (2000). Chothia 개념은 Kabat 개념과 유사하지만, Chothia 개념은 특정 구조적 루프 영역들의 위치를 고려한다. 예컨데, Chothia et al., J. Mol. Biol., 196: 901-17 (1986); Chothia et al., Nature, 342: 877-83 (1989). "AbM" 개념은 항체 구조를 모형화하는 Oxford Molecular Group에 의해 만들어진 컴퓨터 프로그램의 집적된 슈트를 이용한다. 예컨데, Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86:9268-9272 (1989); "AbM^TM, A Computer Program for Modeling Variable Regions of Antibodies", Oxford, UK; Oxford Molecular, Ltd 참고. AbM 개념은 Samudrala et al., "Ab Initio Protein Structure Prediction Using a Combined Hierarchical Approach", in PROTEINS, Structure, Function and Genetics Suppl., 3:194-198 (1999)에서 설명된 것들과 같이 지식 데이터베이스와 ab initio 방법들을 조합하여 이용함으로써 근본적 서열로부터 항체의 3차 구조를 모형화한다. 접촉 개념은 이용가능한 복합 결정 구조의 분석에 근거한다. 예컨데, MacCallum et al., J. Mol. Biol., 5:732-45 (1996).

조약에 의해, 중쇄에서 CDR 영역들은 전형적으로 H1, H2, 및 H3으로 지칭하며, 아미노 말단으로부터 카르복시 말단 방향으로 연속하여 번호를 매긴다. 경쇄에서 CDR 영역들은 L1, L2, 및 L3으로 지칭하며, 아미노 말단으로부터 카르복시 말단 방향으로 연속으로 번호를 매긴다.

"경쇄"는 전장 경쇄와 결합 특이성을 부여하는 충분한 가변 영역 서열을 보유하는 이의 단편들을 포함한다. 전장 경쇄는 가변 영역 도메인, V_L, 및 불변 영역 도메인, C_L을 포함한다. 경쇄의 가변 영역 도메인은 폴리펩티드의 아미노-말단에 있다. 경쇄들은 카파 쇄와 람다 쇄를 포함한다.

EGFR에 대한 본 항체들, 또는 이의 단편들의 특이성은 친화력(affinity) 및/또는 결합력(avidity)에 근거하여 결정될 수 있다. 항원과 항체의 해리에 대한 평형 상수(Kd)로 나타내는 친화력은 항원 결정부위와 항체-결합 부위 사이의 결합 강도를 측정한다. 결합력은 항체와 이의 항원 사이의 결합 강도의 척도다. 결합력은 항체에서 이의 항원 결합 부위를 가진 에피토프 사이의 친화력과 항체의 원자가(valence) 모두에 관계되는데, 이 원자가는 특정 에피토프에 특이적인 항원 결합 부위들의 수를 말한다. 항체들은 10^-5 내지 10^-11 l/mol의 해리 상수(Kd)를 가지며 일반적으로 결합한다. 10^-4 l/mol이상의 임의의 K_d는 비-특이적 결합을 나타내는 것으로 일반적으로 간주된다. Kd 값이 적을수록, 항원 결정부위와 항체 결합 부위 사이에 더 강력한 결합이 있다.

용어 "중쇄(heavy chain)" 는 전장의 중쇄와 결합 특이성을 부여하는 충분한 가변 영역 서열을 보유하는 이의 단편들을 포함한다. 전장의 중쇄는 가변 영역 도메인, V_H와 3개의 불변 영역 도메인들, C_H1, C_H2, 및 C_H3을 포함한다. V_H 도메인은 폴리펩티드의 아미노-말단에 있고, C_H 도메인들은 카르복시-말단에 있으며, C_H3가 폴리펩티드의 카르복시-말단에 가장 가까이 있다. 중쇄는 IgG (IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 서브타입을 포함), IgA (IgA1 및 IgA2 서브타입을 포함), IgM 그리고 IgE를 포함하는, 임의의 이소타입일 수 있다.

이중특이적 또는 이중기능적 항체는 2개의 상이한 중쇄/경쇄 쌍들과 2개의 상이한 결합 부위를 보유하는 인위적인 하이브리드 항체다. 이중특이적 항체들은 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편들의 연계를 포함하나 이에 한정되지 않는, 다양한 방법들에 의해 만들어질 수 있다. 예컨데, Songsivilai et al., Clin. Exp. Immunol., 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol., 148:1547-1553 (1992) 참고.

일부 포유류종들은 단지 단일 중쇄만을 가지는 항체들을 또한 만든다.

각 개별 면역글로블린 쇄는 몇 가지 "면역글로블린 도메인들"로 전형적으로 구성되는데, 각각은 대개 90 내지 110개의 아미노산들로 구성되며, 특징적인 폴딩 패턴을 가진다. 이들 도메인은 항체 폴리펩티드들로 구성된 기본 단위들이다. 인간에서, IgA 및 IgD 이소타입은 4개의 중쇄와 4개의 경쇄를 포함하고; IgG 및 IgE 이소타입은 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하고; 그리고 IgM 이소타입은 5개의 중쇄와 5개의 경쇄를 포함한다. 중쇄 C 영역은 전형적으로 작동체 기능을 담당할 수 있는 하나 또는 그 이상의 도메인들을 포함한다. 중쇄 불변 영역 도메인들의 수는 이소타입에 따라 달라질 것이다. IgG 중쇄는 예를 들면, C_H1, C_H2 및 C_H3으로 알려진 3개의 C 영역 도메인을 포함한다. 제시된 항체들은 이들 이소타입(isotypes) 및 서브타입(subtypes)중 임의의 것을 가질 수 있다. 본 발명의 특정 구체예들에서, 항-EGFR 항체는 IgG2 또는 IgG4 서브타입니다.

"가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 중쇄에서 대략적으로 아미노-말단 120 내지 130개의 아미노산들을 전형적으로 포함하고, 그리고 경쇄에서 약 100 내지 110개의 아미노 말단 아미노산들을 포함하는 항체의 경쇄 및/또는 중쇄의 일부를 지칭한다. 특정 구체예들에서, 동일한 종의 항체들에서도 상이한 항체들의 가변 영역들은 아미노산 서열이 상당히 다르다. 특정 항체가 이의 표적에 대한 특이성은 항체의 가변 영역에 의해 일반적으로 결정된다.

용어 "중화(neutralizing) 항원 결합 단백질" 또는 "중화 항체"는 리간드에 결합하고, 리간드가 결합 짝에 결합되는 것을 막거나 또는 감소시키는 항원 결합 단백질 또는 항체를 말한다. 이는 리간드상의 결합 부위를 직접적으로 차단시키거나 또는 리간드에 결합하여, 그리고 리간드의 결합 능력을 간접적 수단(가령 리간드에서 구조적 또는 에너지적으로 변경)을 통하여 변경시킴으로써 이루어질 수 있다. 일부 구체예들에서, 이 용어는 이것들이 결합된 단백질이 생물학적 기능을 실행하는 것을 방해하는 항원 결합 단백질을 또한 표현할 수 있다. 항원 결합 단백질, 예컨데, 항체 또는 이의 면역학적으로 기능적 단편의 결합 및/또는 특이성을 평가함에 있어서, 항체 또는 단편은 항체 과량이 리간드에 결합된 결합 짝의 양을 최소한 약 1-20, 20-30%, 30-40%, 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-85%, 85-90%, 90-95%, 95-97%, 97-98%, 98-99% 또는 그 이상 (시험관내 경쟁 결합 분석에서 측정되었을 때)으로 감소시킬 때, 리간드가 이의 결합짝에 결합하는 것을 실질적으로 저해시킬 수 있다. 일부 구체예들에서, EGFR 항원 결합 단백질들의 경우, 이러한 중화 분자는 EGFR가 EGF에 결합하는 능력을 감소시킬 수 있다. 일부 구체예들에서, 중화 능력은 경쟁 분석을 통하여 특징화되거나 및/또는 설명된다. 일부 구체예들에서, 중화 능력은 IC₅₀ 또는 EC₅₀ 값으로 설명된다. 일부 구체예들에서, 이 항원 결합 단백질들은 비-중화 항원 결합 단백질들일 수 있다.

용어 "표적"은 항원 결합 단백질이 결합될 수 있는 분자 또는 분자의 일부를 지칭한다. 특정 구체예들에서, 표적은 하나 또는 그 이상의 에피토프를 보유할 수 있다. 특정 구체예들에서, 표적은 항원이다. "항원 결합 단백질"에서 "항원"의 용도는 이 항원을 포함하는 단백질 서열이 항체에 결합될 수 있다는 것을 단순히 나타낸다. 이 내용에서, 단백질은 외부물질이거나 또는 면역 반응을 유도할 수 있어야 할 필요는 없다.

동일한 에피토프에 대해 경쟁하는 항원 결합 단백질들 (예컨데, 중화 항원 결합 단백질들 또는 중화 항체들)의 내용에서 이용될 경우 "경쟁하다"란 의미는 분석에 의해 측정될 때 항원 결합 단백질들 간에 경쟁을 말하는데, 이때 테스트되는 항원 결합 단백질 (예컨데, 항체 또는 이의 면역학적으로 기능적 단편)은 공통적인 항원 (예컨데, EGFR 또는 이의 단편)이 참조 항원 결합 단백질 (예컨데, 리간드, 또는 참조 항체)에 특이적 결합을 방해 또는 저지(예컨대 감소)시킨다. 하나의 항원 결합 단백질이 또다른 것과 경쟁을 하는지를 판단할 때 다수의 경쟁적 결합 분석이 이용될 수 있다; 예를 들면: 고형 상 직접 또는 간접 방사능면역분석(RIA), 고형상 직접 또는 간접 효소 면역분석(EIA), 샌드위치 경쟁 분석(예컨데, Stahli et al., 1983, Methods in Enzymology 9:242-253); 고형 상 직접 바이오틴-아비딘EIA (예컨데, Kirkland et al., 1986, J. Immunol. 137:3614-3619) 고형 상 직접 라벨된 분석, 고형 상 직접 라벨된 샌드위치 분석(예컨데, Harlow and Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); I-125 라벨을 이용한 고형 상 직접 라벨 RIA (예컨데, Morel et al., 1988, Molec. Immunol. 25:7-15); 고형 상 직접 바이오틴-아비딘 EIA (예컨데, Cheung, et al., 1990, Virology 176:546-552 참고); 그리고 직접 라벨된 RIA (Moldenhauer et al., 1990, Scand. J. Immunol. 32:77-82). 전형적으로, 이러한 분석은 라벨안된 테스트 항원 결합 단백질과 라벨된 참조 항원 결합 단백질 중 임의의 것을 가진 고형 표면 또는 세포상에 결합된 정제된 항원의 사용과 관련된다. 경쟁적 저해는 테스트 항원 결합 단백질 존재하에서 고형 표면 또는 세포에 결합된 라벨의 양을 결정함으로써 측정된다. 보통 테스트 항원 결합 단백질은 과량으로 존재한다. 경쟁 분석에 의해 확인된 항원 결합 단백질들(항원 결합 단백질들과 경쟁하는)은 참조 항원 결합 단백질들과 동일한 에피토프에 결합하는 항원 결합 단백질과 공간적 방해가 일어나도록 하기 위하여 참조 항원 결합 단백질이 결합하는 에피토프에 충분히 근접해있는 인접 에피토프에 결합하는 항원 결합 단백질들을 포함한다. 경쟁적 결합을 결정하는 방법들에 대한 추가 상세한 내용은 본 명세서의 실시예에서 제공된다. 보통, 경쟁 항원 결합 단백질이 과량으로 존재할 때, 이 단백질은 참조 항원 결합 단백질이 공통적인 항원에 특이적으로 결합되는 것을 최소한 40-45%, 45-50%, 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75% 또는 75% 또는 그 이상으로 저해(예컨대 감소)시킬 것이다. 일부 경우에서, 결합은 최소한 80-85%, 85-90%, 90-95%, 95-97%, 또는 97% 또는 그 이상으로 저해된다.

용어 "항원"은 선택적 결합제, 가령 항원 결합 단백질 (예컨데, 항체 또는 이의 면역학적 기능적 단편을 포함)이 결합할 수 있는 분자 또는 분자의 일부를 지칭한다. 일부 구체예들에서, 이 항원은 이 항원에 결합될 수 있는 항체를 동물에서 생산하기 위하여 이용될 수 있다. 항원은 상이한 항원 결합 단백질들, 예컨데, 항체들과 상호작용할 수 있는 하나 또는 그 이상의 에피토프를 보유할 수 있다.

용어 "에피토프(epitope)"는 항원 결합 단백질, 가령 항체 또는 T-세포 수용체가 결합할 수 있는 임의의 결정부위(determinant)를 포함한다. 에피토프는 이 항원을 표적으로 하는 항원 결합 단백질이 결합되는 항원의 영역이며, 항원이 단백질일 때, 이 항원 결합 단백질에 바로 접촉되는 특이적 아미노산들을 포함한다. 거의 대부분의 경우, 에피토프는 단백질들 상에 있지만, 일부 경우들에서는 다른 종류의 분자들, 가령 핵산 상에 존재할 수 있다. 에피토프 결정부위들은 분자의 화학적으로 활성 표면 기들(grouping), 가령 아미노산들, 슈가 측쇄, 포스포릴 또는 설포닐 기들을 포함할 수 있고, 그리고 특이적 3차원 구조적 특징들, 및/또는 특이적 하전 특징들을 보유할 수 있다. 일반적으로, 특정 표적 항원에 특이적인 항체들은 단백질 및/또는 거대분자의 복합 혼합물에서 표적 항원상에 에피토프를 선호적으로 인지할 것이다.

본 명세서에서 이용된 것과 같이, "실질적으로 순수한"이란 설명된 분자의 종이 존재하는 우세한 종이라는 것을 의미하는데, 즉, 몰 근거로, 이 분자는 동일한 혼합물내에 임의의 다른 개별 종보다 더 풍부하다는 것을 말한다. 특정 구체예들에서, 실질적으로 순수한 분자는 목적하는 종이 존재하는 거대분자 종의 최소한 50% (몰 기준)를 포함하는 조성물이다. 다른 구체예들에서, 실질적으로 순수한 조성물은 조성물내에 존재하는 모든 거대분자 종의 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 또는99%를 포함할 것이다. 다른 구체예들에서, 목적 종은 기본적으로 동질이 되도록 정제되며, 오염 종은 통상적인 탐지 방법들에 의해 조성물 안에서 탐지되지 않을 것이며, 따라서, 이 조성물은 단일의 탐지가능한 거대분자 종으로 구성된다.

용어 "물질(agent)"은 화학적 화합물, 화학적 화합물들의 혼합물, 생물학적 거대분자, 또는 생물학적 재료로부터 만든 추출물을 나타낼 때 이용된다.

본 명세서에서 이용된 것과 같이, 용어 "라벨(label)" 또는 "라벨된(labeled)"은 예컨데, 방사능동위원소라벨된 아미노산의 편입 또는 표시된 아비딘에 의해 탐지될 수 있는 바이오틴 모이어티의 폴리펩티드(예컨데, 시각적 또는 발색 방법들에 의해 탐지될 수 있는 형광 표식 또는 효소 활성을 포함하는 스트렙타아비딘)에 부착함으로써 탐지가능한 표식의 통합을 말한다. 특정 구체예들에서, 라벨 또는 표식은 치료제일 수도 있다. 폴리펩티드들 및 당단백질들을 라벨링시키는 다양한 방법들이 당업계에 잘 공지되어 있고, 이용할 수 있다. 폴리펩티드용 라벨의 예로는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다: 방사능동위원소 또는 방사성핵종 (예컨데, ³H, ¹⁴C, ¹⁵N, ³⁵S, ⁹⁰Y, ⁹⁹Tc, ¹¹¹In, ¹²⁵I, ¹³¹I), 형광 라벨(예컨데, FITC, 로다민, 란탄족 인), 효소 라벨(예컨데, 양고추냉이 과산화효소, β-갈락토시다제, 루시퍼라제, 알칼리 포스파타제), 화학발광제, 바이오티닐 군, 제2 리포터에 의해 인지되는 예정된 폴리펩티드 에피토프(예컨데, 류신 지퍼 쌍 서열들, 2차 항체들을 위한 결합 부위들, 금속 결합 도메인들, 에피토프 테그). 특정 구체예들에서, 라벨들은 잠재적인 공간적 방해를 줄이기 위하여 다양한 길이의 스페이스 암에 부착된다.

본 명세서에서 이용된 것과 같이, 용어 "생물학적 시료"는 살아있는 또는 원래 살아있는 것으로부터 얻은 임의의 양의 물질을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이러한 살아있는 것들은 인간, 마우스, 원숭이, 쥐, 토끼 및 기타 동물들을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이러한 물질들은 혈액, 혈청, 소변, 세포, 장기들, 조직, 뼈, 골수, 림프절 및 피부를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

용어 "약학적 물질 조성물" (또는 물질 또는 약물)은 본 명세서에서 이용된 것과 같이 환자에게 적절하게 투여될 경우 바람직한 치료 효과를 유도할 수 있는 화학적 화합물, 조성물, 물질 또는 약물을 지칭한다. 이는 반드시 한 종류 이상의 성분을 요구하지는 않는다.

용어 "치료요법적으로 유효량" 및 "치료요법적으로 유효약량(effective dose)" 은 포유류에서 치료 반응을 발생시키는 것을 결정된 EGFR 항원 결합 단백질의 양을 말한다. 이러한 치료요법적으로 유효량은 당업계 숙련자들에 의해 용이하게 확인된다. 정확한 약량 및 제제는 치료 목적에 따라 달라질 것이며, 공지의 기술들을 이용하여 당업계 숙련자들이 확인할 수 있을 것이다(예컨데, Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, Gennaro, Editor (2003), and Pickar, Dosage Calculations (1999) 참고).

용어 "약제학적으로 수용가능한 염" 또는 "약제학적으로 수용가능한 운반체(carrier)"는 본 명세서에서 설명된 화합물에서 발견되는 특정 치환체들에 따라, 상대적으로 비독성 산 또는 염기로 준비된 활성 화합물들의 염을 포함한다는 의미다.

용어 "조절물질(modulator)"은 본 명세서에서 이용된 것과 같이, 분자의 활성 또는 기능을 변화 또는 변경시키는 화합물이다. 예를 들면, 조절물질은 이 조절물질이 없을 때 관찰되는 분자의 특정 활성 또는 기능의 정도와 비교하였을 때, 분자의 활성 또는 기능의 증가 또는 감소를 야기시킬 수 있다. 특정 구체예들에서, 조절물질은 억제제이며, 이는 분자의 최소한 하나의 활성 또는 기능의 정도를 감소시킨다. 분자의 특정 활성 및 기능의 예로는 결합 친화력, 효소 활성 및 신호 형질유도를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 특정 억제제들의 예로는 단백질들, 펩티드, 항체들, 펩티바디(peptibodies), 탄수화물, 또는 작은 유기 분자들을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 펩티바디는 예컨데, U.S. 특허 제6,660,843호 (PCT 출원 번호 WO 01/83525에 대응됨)에서 설명된다.

용어 "환자" 및 "개체"는 호환되며, 인간 및 인간이 아닌 동물 개체 뿐만 아니라, 정식으로 진단받은 질환을 가진 것들, 공식적으로 인지된 장애가 없는 것들, 의학적 관심을 받는 것들, 장애의 발달 위험에 처한 것들을 포함한다.

용어 "치료하다(treat)"와 "치료(treatment)"는 개체에서 장애 또는 다른 위험 인자들이 발생할 위험을 줄이는 치료요법적 처리, 예방적 처리 및 적용을 포함한다. 치료는 장애의 완벽한 치유를 요구하지 않으며, 징후 또는 숨어있는 위험 인자들을 줄이는 구체예들을 포괄한다.

용어 "예방하다(prevent)"는 사건의 가능성을 100% 제거하는 것을 요하지 않는다. 그보다는, 사건의 발생 가능성이 이 화합물의 존재 또는 방법에 의해 감소되었다는 것을 나타낸다.

재조합 DNA, 올리고뉴클레오티드 합성, 및 조직 배양과 형질변환을 위하여 표준 기술이 이용될 수 있다(예컨데, 전기천공(electroporation), 리포펙션(lipofection)). 효소적 반응 및 정제 기술들은 제조업자들의 설명에 따라 실행될 수 있거나, 또는 본 명세서에서 설명된 것과 같이 또는 당업계에서 통상적으로 실시되는 것과 같이 실행될 수 있다. 전술한 기술 및 절차들은 당업계에 잘 공지되어 있는 통상적인 방법들에 따라 그리고 본 명세서를 통하여 언급되고, 논의된 다양한 전반적 그리고 특이적 문헌에서 설명되는 것과 같이 일반적으로 실행될 수 있다. 예컨데, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)), 이는 임의의 목적을 위하여 전문이 여기에 참고자료로 편입된다. 특정한 정의가 제공되지 않는한, 본 명세서에서 설명된 분석 화학, 합성 유기 화학, 그리고 의학 및 약학 화학과 관련되어 이용된 명명법, 실험 과정 및 기술들은 당업계에서 잘 공지되어 있는 그리고 통상적으로 이용되는 것들이다. 화학적 합성, 화학적 분석, 약학적 조제, 제제, 운반 및 환자들의 치료용으로 표준 기술들이 이용될 수 있다.

인간 EGFR을 포함하는 EGFR에 결합되는 항원 결합 단백질들 (ABPs)이 본 명세서에서 제공된다. 일부 구체예들에서, 제공되는 항원 결합 단백질들은 본 명세서에서 설명된 것과 같이, 하나 또는 그 이상의 상보성 결정 영역들 (CDR)을 포함하는 폴리펩티드들이다. 일부 항원 결합 단백질들에서, CDR은 "골격" 영역 안에 내장되어 있으며, CDR(들)의 적절한 항원 결합 성질들이 획득되도록 CDR(들)을 향하게 한다. 일부 구체예들에서, 본 명세서에서 제공되는 항원 결합 단백질들은 EGFR과 EGF 사이에서 상호작용을 간섭, 차단, 감소 또는 조절할 수 있다. 이러한 항원 결합 단백질들은 "중화"로 표현된다. 일부 구체예들에서, 중화 항원 결합 단백질은 EGFR이 EGF에 결합하는 것을 막는 위치 및/또는 방식으로 EGFR에 결합한다.

일부 구체예들에서, 본 명세서에서 제공되는 항원 결합 단백질들은 EGFR-중개된 활성 (결합을 포함)을 억제시킬 수 있다. 일부 구체예들에서, 이들 에피토프에 항원 결합 단백질들의 결합은 그중에서도 특히 EGFR와 EGF 사이의 상호작용을 저해시키고, EGFR에 의해 중개되는 기타 생리학적 효과들을 저해시킨다. 일부 구체예들에서, 이 항원 결합 단백질들은 인간, 가령 EGFR에 대한 완전한 인간 항체들이다.

일부 구체예들에서, 이 항원 결합 단백질은 EGFR의 촉매 도메인에 결합한다. 일부 구체예들에서, 이 항원 결합 단백질은 성숙 형태의 EGFR에 결합한다. 일부 구체예들에서 이 항원 결합 단백질은 EGFR의 프로(pro)도메인에 결합한다. 일부 구체예들에서, 이 항원 결합 단백질은 성숙 형태의 EGFR에 선택적으로 결합한다. 일부 구체예들에서, 이 항원 결합 단백질은 EGFR이 EGF에 결합 또는 효과적으로 결합하지 못하는 방식으로 촉매 도메인에 결합한다. 일부 구체예들에서, 이 항원 결합 단백질은 촉매 도메인의 c-말단에 결합하지 않는다. 일부 구체예들에서, 이 항원 결합 단백질은 촉매 도메인의 n-말단에 결합하지 않는다. 일부 구체예들에서, 이 항원 결합 단백질은 EGFR 단백질의 N- 또는 C-말단에 결합하지 않는다. 일부 구체예들에서, 이 항원 결합 단백질은 본 명세서에서 논의된 항체들이 결합되는 임의의 하나의 에피토프에 결합한다. 일부 구체예들에서, 이는 본 명세서에서 논의된 항체들과 다른 항체들 사이에 경쟁 분석에 의해 결정될 수 있다. 일부 구체예들에서, 이 항원 결합 단백질은 본 명세서에서 설명된 하나의 항체가 결합하는 에피토프에 결합한다. 일부 구체예들에서, 이 항원 결합 단백질들은 EGFR이 EGF와 상호작용하는 것을 막기 위하여 EGFR의 특이적 형태학적 상태에 결합한다.

본 명세서에서 설명된 항원 결합 단백질들은 다양한 용도를 가진다. 이 항원 결합 단백질들의 일부는 실례로, 특이적 결합 분석, EGFR, 특히 인간 EGFR 또는 이의 리간드들의 친화력 정제 그리고 EGFR 활성의 다른 길항제들을 확인하기 위한 선별 분석에 유용하다. 이 항원 결합 단백질들의 일부는 EGFR가 EGF에 결합하는 것을 저해시키는데, 또는 EGFR-중개된 활성을 저해시키는데 유용하다.

이 항원 결합 단백질들은 본 명세서에서 설명된 것과 같이 다양한 치료 용도에 이용될 수 있다. 예를 들면, 일부 구체예들에서 EGFR 항원 결합 단백질들은 본 명세서에서 설명된 것과 같이 EGF 및/또는 EGFR와 관련된 질환 및 이상, 가령 암을 치료하는데 유용하다.

일부 구체예들에서, 제공되는 항원 결합 단백질들은 하나 또는 그 이상의 CDR (예컨데, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR)을 포함한다. 일부 구체예들에서, 이 항원 결합 단백질은 (a) 폴리펩티드 구조 그리고 (b) 이 폴리펩티드 구조에 삽입되거나 및/또는 결합되는 하나 또는 그 이상의 CDR을 포함한다. 이 폴리펩티드 구조는 다양한 상이한 형태를 취할 수 있다. 예를 들면, 이 펩티드는 자연적으로 발생되는 항체, 또는 이의 단편 또는 변이체의 골격이거나, 또는 이를 포함하거나, 또는 자연계에서 완벽하게 합성된 것일 수 있다. 다양한 폴리펩티드 구조의 예는 하기에서 더 설명된다.

특정 구체예들에서, 이 항원 결합 단백질들의 폴리펩티드 구조는 항체 또는 항체로부터 유도될 수 있는데, 여기에는 단일클론성 항체들, 이중특이적 항체들, 미니바디(minibodies), 도메인 항체들, 합성 항체들 (때로 본 명세서에서 "항체 모방체"이라고 함), 키메라 항체들, 인간화된 항체들, 항체 융합(때로 본 명세서에서"항체 접합체"이라고 함), 그리고 이들의 일부 또는 단편들을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일부 경우에서, 이 항원 결합 단백질은 항체의 면역학적 단편이다(예컨데, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')₂ 단편, Fv 단편, 디아바디(diabody), 또는 단일 쇄 항체 분자, 가령 scFv)

이 항원 결합 단백질이 치료 용도에 이용되는 구체예들에 있어서, 항원 결합 단백질은 EGFR의 하나 또는 그 이상의 생물학적 활성을 저해, 간섭 또는 조절할 수 있다. 한 구체예에서, 항원 결합 단백질은 인간 EGFR에 특이적으로 결합하고 및/또는 인간 EGFR이 EGF에 결합하는 것을 실질적으로 최소한 약 20%-40%, 40-60%, 60-80%, 80-85%, 또는 그 이상으로 저해한다(예를 들면, 시험관 경쟁적 결합 분석에서 결합을 측정함으로써). 제공된 이 항원 결합 단백질들의 일부는 항체들이다. 일부 구체예들에서, 이 항원 결합 단백질은 10^-7, 10^-8, 10^-9, 10^-10, 10^-11, 10^-12, 10^-13 M 미만의 K_d 미만을 가진다(더 단단하게 결합). 일부 구체예들에서, 이 항원 결합 단백질은 EGF가 EGFR에 결합하는 것을 차단하기 위한 1 μM 미만, 1000 nM 내지 100 nM, 100nM 내지 10 nM, 10nM 내지 1 nM, 1000pM 내지 500pM, 500 pM 내지 200 pM, 200 pM 미만, 200 pM 내지 150 pM, 200 pM 내지 100 pM, 100 pM 내지 10 pM, 10 pM 내지 1 pM의 IC₅₀을 가진다.

일부 구체예들에서, 이 항원 결합 단백질들은 EGFR가 EGF와의 상호작용을 하지 못하게 하도록 EGFR의 특정 형태학적 상태에 결합한다.

인간화된 항원 결합 단백질들 (예컨데, 항체들)

본 명세서에서 설명된 것과 같이, EGFR에 대한 항원 결합 단백질은 인간화된 항체 및/또는 이의 일부를 포함할 수 있다. 이러한 전략의 중요한 실질적인 적용은 마우스 체액 면역 시스템의 "인간화(humanization)"이다.

특정 구체예들에서, 인간화된 항체는 인간들에서 실질적으로 비-면역원성이다. 특정 구체예들에서, 인간화된 항체는 인간화된 항체가 유도된 종과는 또다른 항체와 표적에 대해 실질적으로 동일한 친화력을 보유한다. 예컨데, U.S. 특허 제 5,530,101호, U.S. 특허 제5,693,761호; U.S. 특허 제5,693,762호; 그리고 U.S. 특허 제5,585,089호 참고.

특정 구체예들에서, 면역원성은 감소되면서 이 항원 결합 도메인의 고유 친화력은 감소없이 변형될 수 있는 항체 가변 도메인들의 아미노산들이 확인된다. 예컨데, 미국 특허 제5,766,886호 및 제5,869,619호.

특정 구체예들에서, 당업계에 잘 공지되어 있는 항체의 변형(modification)은 표적에 대한 결합 친화력의 증가 및/또는 수용체내에서 항체의 면역원성의 감소를 획득하도록 기획된다. 특정 구체예들에서, 인간화된 항체들은 이의 고유 항원에 대한 친화력을 증가시키기 위하여 글리코실화 부위들이 제거되도록 변형된다. 예컨데, Co et al., Mol. Immunol., 30:1361-1367 (1993). 특정 구체예들에서, 가령 "재성형(reshaping)", "과다키메라화(hyperchimerization)", 또는 "곁켜대기/다시꾸미기(veneering/resurfacing)"과 같은 기술을 이용하여 인간화된 항체들을 만든다. 예컨데, Vaswami et al ., Annals of Allergy , Asthma , & Immunol . 81:105 (1998); Roguska et al ., Prot . Engin ., 9:895-904 (1996); 그리고 U.S. 특허 제6,072,035호 참고. 이러한 특정 구체예들에서, 이러한 기술들은 이질적(foreign) 잔기들의 수를 감소시킴으로써 항체 면역원성을 일반적으로 감소시키지만, 이 항체들의 반복된 투여후 항-이디오타입 및 항-이인자형(anti-idiotypic 및 anti-allotypic) 반응을 막지 못한다. 면역원성을 감소시키기 위한 특정 기타 방법들은 예컨데, Gilliland et al., J. Immunol., 62(6):3663-71 (1999)에서 설명된다.

특정 예들에서, 항체들의 인간화로 항원 결합 능력의 상실이 초래된다. 특정 구체예들에서, 인간화된 항체들은 "복귀 돌연변이된다(back mutated)". 이러한 특정 구체예들에서, 인간화된 항체는 기증 항체에서 발견되는 아미노산 잔기들중 하나 또는 그 이상을 포함하도록 돌연변이된다. 예컨데, Saldanha et al., Mol. Immunol. 36:709-19 (1999).

특정 구체예들에서, EGFR에 대한 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역들의 상보성 결정 영역들 (CDR)은 동일한 또는 또다른 종으로부터 유래된 골격 영역들 (FR)에 접합(graft)될 수 있다. 특정 구체예들에서, EGFR에 대한 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역들의 CDR은 콘센선스(consensus) 인간 FR에 접합될 수 있다. 콘센선스 인간 FR을 만들기 위하여, 특정 구체예들에서, 몇 가지 인간 중쇄 또는 경쇄 아미노산 서열들로부터 FR을 배열하여 콘센선스 아미노산 서열을 확인한다. 특정 구체예들에서, EGFR 중쇄 또는 경쇄에 대한 항체의 FR들은 상이한 중쇄 또는 경쇄의 FR로 대체된다. 특정 구체예들에서, EGFR에 대한 항체의 중쇄 및 경쇄들의 FR에서 희귀한 아미노산들은 대체되지 않지만, FR 아미노산들의 나머지는 대체된다. 희귀한 아미노산들은 FR에서 항상 발견되지 않는 위치들에 있는 특이적 아미노산들이다. 특정 구체예들에서, EGFR에 대한 항체로부터 접합된 가변 영역들은 EGFR에 대한 항체의 불변 영역과는 상이한 불변 영역과 함께 이용될 수 있다. 특정 구체예들에서, 접합된 가변 영역들은 단일 쇄 Fv 항체의 일부분들이다. CDR 접합(grafting)은 예컨데, 미국 특허 제6,180,370호, 제6,054,297호, 제5,693,762호, 제5,859,205호, 제5,693,761호, 제5,565,332호, 제5,585,089호, 그리고 제5,530,101호, 및 Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988), Winter, FEBS Letts., 430:92-94 (1998)에서 설명되며, 이들은 임의의 목적으로 여기에 참고자료로 편입된다.

인간 항원 결합 단백질들 (예컨데, 항체들)

본 명세서에서 설명된 것과 같이, EGFR에 결합되는 항원 결합 단백질은 인간 (가령, 온전한 인간) 항체 및/또는 이의 일부를 포함할 수 있다. 특정 구체예들에서, 중쇄 및 경쇄 면역글로블린 분자들을 포함하는 아미노산 서열들, 특히 이 가변 영역들에 대응하는 서열들, 그리고 이를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열들이 제공된다. 특정 구체예들에서, 상보성 결정 영역들 (CDR's), 특히 CDR1 내지 CDR3에 대응되는 서열들이 제공된다. 특정 구체예들에 따르면, 이러한 면역글로블린 분자를 발현시키는 하이브리도마 세포계가 제공된다. 특정 구체예들에 따르면, 이러한 단클론성 항체를 발현시키는 하이브리도마 세포계가 제공된다. 특정 구체예들에서, 인간 EGFR에 대한 정제된 인간 단클론성 항체가 제공된다.

인간 Ig 좌(loci)의 큰 단편들을 가진 마우스 항체 생산이 부족한 마우스 변종을 기획할 수 있는데, 이러한 마우스는 마우스 항체들 없이 인간 항체들을 만들 수 있을 것으로 기대한다. 큰 인간 Ig 단편들은 큰 가변 유전자 다양성 뿐만 아니라 항체 생산 및 발현의 적절한 조절을 유지할 수 있다. 항체 다양화(diversification) 및 선택 및 인간 단백질들에 대한 면역학적 내성의 부족에 대한 마우스 기전을 개발함으로써, 이들 마우스 변종에서 재생산된 인간 항체 레퍼토리는 인간 항원들을 포함하는 임의의 관심 항원들에 대항한 높은 친화력의 온전한 인간 항체들을 만들 수 있다. 하이브리도마 기술을 이용하여, 바람직한 특이성을 가진 항원-특이적 인간 MAb들이 생산되고 그리고 선별될 수 있다. 특정 예시적인 방법들은 WO 98/24893, U.S. 특허 제5,545,807, EP 546073, 그리고 EP 546073에서 설명된다.

특정 구체예들에서, 인간 가변 영역(들)과 함께 인간이외의 종으로부터 불변 영역을 이용할 수 있다.

효모 인공 염색체(YACs)에서 메가베이스 크기의 인간 좌(loci)를 클론하고, 재작제하는 능력 그리고 이들을 마우스 생식계열 안으로 도입시키는 능력은 매우 큰 또는 조잡하게 지도로 표시된 좌의 기능성 성분들을 밝히고, 뿐만 아니라 인간 질환의 유용한 모델을 만들기 위한 방법을 제공한다. 더욱이, 마우스 좌를 이들의 인간 대등물과 치환시키는 이러한 기술을 이용하면 개발 동안 인간 유전자 산물들의 발현 및 조절, 다른 시스템과의 소통, 질병 유도 및 진행에서 이들의 관련성에 대한 식견을 제공할 수 있다.

인간 항체들은 뮤린 또는 쥐 가변 및/또는 불변 영역들을 보유하는 항체들과 연관된 일부 문제점들을 회피한다. 이러한 뮤린 또는 쥐 유도된 단백질들의 존재는 이 항체들의 신속한 제거를 유도할 수 있거나 또는 환자에 의해 항체에 대항하는 면역 반응의 생성을 유도할 수 있다. 뮤린 또는 쥐 유도된 항체들의 이용을 회피하기 위하여, 온전한 인간 항체들은 설치류, 기타 포유류 또는 동물이 온전한 인간 항체들을 생성하도록, 이들에게 기능적 인간 항체 좌의 도입을 통하여 생성될 수 있다.

인간화된 항체들은 처음에 인간의 것이 아닌 항체 아미노산 서열들을 함유하도록 출발하지만, 이들 비-인간 항체 아미노산 서열들이 인간 항체 서열들로 최소한 일부 대체된 항체들이다. 이것은 인간 항체들과 대조적으로 이 항체는 인간들이 보유하는 유전자들에 의해 인코드된다(또는 인코드될 수 있다).

항원 결합 단백질 변이체들

제공되는 기타 항체들은 본 명세서에서 설명된 가변 중쇄 및 가변 경쇄의 조합 또는 하위부분들에 의해 형성된 상기 열거된 항원 결합 단백질들의 변이체들이며, 가변 경쇄 및/또는 가변 중쇄를 포함하는데, 각각은 이들 서열들(전체 서열 또는 서열의 하위 부분들, 예컨데, 하나 또는 그 이상의 CDR)의 아미노산 서열에 최소한 50%, 50-60, 60-70, 70-80%, 80-85%, 85-90%, 90-95%, 95-97%, 97-99%, 또는 99% 이상의 동일성을 보유한다. 일부 경우들에서, 이러한 항체들은 최소한 하나의 중쇄와 하나의 경쇄를 포함하고, 반면 다른 경우들에서, 변이체 형태들은 두 개의 동일한 경쇄들과 두 개의 동일한 중쇄(또는 이의 하위부분들)을 포함한다.

특정 구체예들에서, 이 항원 결합 단백질은 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 또는 서열번호 6에서 제시된 아미노산 서열에 최소한 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구체예들에서, 이 항원 결합 단백질은 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 또는 서열번호 6에서 제시된 아미노산 서열에 최소한 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구체예들에서, 이 항원 결합 단백질은 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 또는 서열번호 6에서 제시된 아미노산 서열에 최소한 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

일부 구체예들에서, 이 항원 결합 단백질은 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 또는 서열번호 6에서 언급된 하나 또는 그 이상의 CDR에 최소한 90%, 90-95%, 및/또는 95-99% 동일한 서열을 포함한다.

본 설명에 의해, 숙련자는 잘 알려진 기술들을 이용하여 여기에서 제시되는 이 항원 결합 단백질들의 적합한 변이체들을 결정할 수 있을 것이다. 특정 구체예들에서, 당업계 숙련자는 표적화 영역들에 의해 활성의 파괴없이, 활성에 중요한 것으로 보이지 않은, 변경될 수 있는 분자의 적합한 영역들을 확인할 수 있다. 특정 구체예들에서, 숙련자들은 유사한 폴리펩티드들 가운데 보존된 분자의 잔기들 및 일부들을 확인할 수 있다. 특정 구체예들에서, 생물학적 활성 또는 구조에 중요할 수 있는 지역들 조차도 생물학적 활성의 파괴 없이 또는 폴리펩티드 구조에 불리한 영향을 주지 않으면서 보존적 아미노산 치환의 대상이 될 수 있다.

추가적으로, 당업계 숙련자는 유사한 폴리펩티드들 안에서 활성 또는 구조에 중요한 잔기들을 확인하는 구조-기능 연구를 검토할 수 있다. 이러한 비교에 의해, 숙련자들은 유사한 단백질들에서 활성 또는 구조에 중요한 아미노산 잔기들에 대응하는 아미노산 잔기들의 중요성을 단백질에서 예측할 수 있다. 당업계 숙련자는 이러한 예측된 중요한 아미노산 잔기들에 대해 화학적으로 유사한 아미노산 치환들을 선택할 수 있다.

당업계 숙련자는 유사한 항원 결합 단백질들에서 이 구조와 관련하여 3차원 구조 및 아미노산 서열을 또한 분석할 수 있다. 이러한 정보에 근거하여, 당업계 숙련자는 이의 3차 구조에 대해 항체의 아미노산 잔기들의 배열을 예측할 수 있다. 특정 구체예들에서, 당업계 숙련자는 단백질의 표면 상에 있을 것으로 예측되는 아미노산 잔기들에 대해 과도한 변화를 만들지 않도록 선택할 수 있는데, 그 이유는 이러한 잔기들은 다른 분자들과 중요한 상호작용에 연루될 수 있기 때문이다. 더욱이, 당업계 숙련자는 각 바람직한 아미노산 잔기에서 단일 아미노산 치환을 함유하는 테스트 변이체들을 생성시킬 수 있다. 그 다음 이 변이체들은 당업계 숙련자들에게 공지된 활성 분석을 통하여 스크린될 수 있다. 이러한 변이체들은 적합한 변이체들에 대한 정보를 수집하는데 이용될 수 있다. 예를 들면, 특정 아미노산 잔기에 변화가 활성이 파괴된, 바람직하지 못하게 활성이 감소된, 또는 부적합한 활성을 초래한다는 것이 발견된다면, 이러한 변화를 가진 변이체들을 회피할 수 있다. 환언하면, 이러한 일상적인 실험들로부터 모아진 정보들에 근거하여, 당업계 숙련자는 단독으로 추가적인 치환들을 회피해야 하거나 또는 다른 돌연변이들과 조합하여 회피되어야 하는 아미노산들을 용이하게 결정할 수 있다.

2차 구조의 예측에 기여한 다수의 과학 공개문헌들이 있다. Moult J., Curr. Op . in Biotech ., 7(4):422-427 (1996), Chou et al ., Biochemistry , 13(2):222-245 (1974); Chou et al., Biochemistry, 113(2):211-222 (1974); Chou et al., Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47:45-148 (1978); Chou et al., Ann. Rev. Biochem., 47:251-276 그리고 Chou et al., Biophys. J., 26:367-384 (1979). 더욱이, 2차 구조의 예측을 지원하는 컴퓨터 프로그램들이 현재 이용가능하다. 2차 구조를 예측하는 한 방법은 상동성 모델링(homology modeling)에 근거한다. 예를 들면, 30% 이상의 서열 동일성 또는, 40% 이상의 유사성을 보유하는 2 가지 폴리펩티드들 또는 단백질들은 유사한 구조적 위상을 보유한다. 단백질 구조적 데이터베이스(PDB)의 최근 성장은 폴리펩티드 또는 단백질 구조내에서 폴드의 잠재적 숫자를 포함하여 2차 구조의 강화된 예측가능성을 제공하였다. Holm et al., Nucl. Acid. Res., 27(1):244-247 (1999). Brenner et al., Curr. Op. Struct. Biol., 7(3):369-376 (1997)에서 주어진 폴리펩티드 또는 단백질 내에서 제한된 수의 폴드가 있으며, 그리고 구조의 임계 숫자가 해결되면, 구조적 예측은 극적으로 좀더 정확하게 될 것이다.

2차 구조를 예측하는 추가 방법들은 "트레드닝(threading)" (Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol., 7(3):377-87 (1997); Sippl et al., 구조, 4(1):15-19 (1996)), "프로파일 분석(profile analysis)" (Bowie et al., Science, 253:164-170 (1991); Gribskov et al., Meth. Enzym., 183:146-159 (1990); Gribskov et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 84(13):4355-4358 (1987)), 그리고 "진화론적인 연계(evolutionary linkage)" (Holm, 상기와 동일 (1999), 및 Brenner, 상기와 동일 (1997) 참고)를 포함한다.

특정 구체예들에서, 항원 결합 단백질 변이체들은 글리코실화(glycosylation) 변이체들을 포함하는데, 이때 글리코실화 부위의 숫자 및/또는 유형은 부모 폴리펩티드의 아미노산 서열들과 비교하여 변경되었다. 특정 구체예들에서, 단백질 변이체들은 고유 단백질보다는 더 많은 또는 더 적은 수의 N-연계된 글리코실화 부위들을 포함한다. N-연계된 글리코실화 부위는 서열: Asn-X-Ser 또는 Asn-X-Thr로 특징화되며, 이때 X로 표시된 아미노산 잔기는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산 잔기일 수 있다. 이 서열을 창조하기 위한 아미노산 잔기들의 치환은 N-연계된 탄수화물 쇄의 추가용 잠재적 새로운 부위를 제공한다. 대안으로, 이 서열을 제거하는 치환들은 기존의 N-연계된 탄수화물 쇄를 제거할 것이다. N-연계된 탄수화물 쇄들의 재배열이 또한 제공되는데, 이때 하나 또는 그 이상의 N-연계된 글리코실화 부위들 (전형적으로 자연적으로 발생되는 것들)은 제거되고, 그리고 하나 또는 그 이상의 새로운 N-연계된 부위들이 생성된다. 추가적인 바람직한 항체 변이체들은 시스테인 변이체들을 포함하는데, 이때 하나 또는 그 이상의 시스테인 잔기들은 부모 아미노산 서열과 비교하였을 때 삭제되거나, 또는 또다른 아미노산(예컨대, 세린)으로 치환된다. 불용성 봉입체들(inclusion bodies)의 분리 후 생물학적으로 활성 형태로 재폴드될 때 시스테인 변이체들이 유용할 것이다. 시스테인 변이체들은 일반적으로 고유 단백질 보다 더 적은 시스테인 잔기들을 보유하고, 쌍을 이루지 않는 시스테인들로 인한 상호작용을 최소화시키기 위하여 전형적으로 짝수를 보유한다.

특정 구체예들에 따르면, 아미노산 치환들은 (1) 단백질분해에 대한 민감성을 감소시키고, (2) 산화에 대한 민감성을 감소시키고, (3) 단백질 복합체에 대한 결합 친화력을 변경시키고, (4) 결합 친화력을 변경시키고, 및/또는 (4) 이러한 폴리펩티드들에서 다른 물리화학적 또는 기능적 성질들을 부여 또는 변형시키는 것들이다. 특정 구체예들에 따르면, 단일 또는 다중 아미노산 치환들 (특정 구체예들에서, 보존적 아미노산 치환들)이 자연적으로-발생되는 서열내(특정 구체예들에서, 분자간 접촉을 형성하는 도메인(들)의 외부 폴리펩티드의 일부에서)에서 만들어질 수 있다. 특정 구체예들에서, 보존적 아미노산 치환은 전형적으로 부모 서열의 구조적 특징들을 실질적으로 변경시키지 않을 수 있다(예컨데, 대체 아미노산은 부모 서열내에서 발생되는 나선을 파괴시키는 경향이 없거나, 또는 부모 서열을 특징짓는 2차 구조의 다른 유형들을 파괴시키지 않아야 한다). 당업계-인지된 폴리펩티드 2차 및 3차 구조의 예들은 Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden & J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); 그리고 Thornton et al., Nature, 354:105 (1991)에서 설명되어 있으며, 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 편입된다.

일부 구체예들에서, 이 변이체들은 본 명세서에서 공개된 이 항원 결합 단백질들의 핵산 서열들의 변이체들이다. 당업계 숙련자는 상기 논의가 항원 결합 단백질 변이체들의 확인, 평가 그리고/창조에 유용하며, 또한 이들 단백질 변이체들을 인코드하는 핵산 서열들의 확인, 평가 및/창조에도 유용할 것이라는 것을 인지할 것이다.

구절 "엄격한 혼성화 조건들(stringent hybridization conditions)"은 핵산들의 복합 혼합물에서 전형적으로 이의 표적 하위서열에 혼성화되나 다른 서열들에게는 혼성화되지 않는 조건들을 말한다. 엄격한 조건들은 서열-의존적이며, 상이한 환경에서는 달라질 것이다. 더 긴 서열들은 더 높은 온도에서 특히 혼성화된다. 핵산들의 혼성화에 대한 광범위한 안내는 Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic assays" (1993)에서 볼 수 있다. 일반적으로, 엄격한 조건은 명시된 이온 강도 pH에서 특이적 서열에 대한 열 용융점(T_m)보다 약 5-10℃ 낮은 것으로 선택된다. T_m은 표적에 상보적인 프로브의 50%가 평형상태에서 표적 서열에 혼성화되는 온도(명시된 이온강도, pH 및 핵 농도)이다(이 표적 서열들은 T_m에서 과량으로 존재하기 때문에, 프로브의 50%는 평형상태에서 점유된다). 엄격한 조건은 탈안정화 물질들, 가령 포름아미드의 추가에 의해 또한 획득될 수 있다. 선택적 또는 특이적 혼성화의 경우, 양성 신호는 배경보다 최소한 2배, 선호적으로 배경 혼성화보다 10 배가 된다. 예시적인 엄격한 혼성화 조건은 다음과 같을 수 있다: 50% 포름아미드, 5× SSC, 그리고 1% SDS, 42℃에서 항온처리, 또는 5× SSC, 1% SDS, 65℃에서 항온처리, 그리고 0.2× SSC, 및 0.1% SDS, 65℃에서 세척.

엄격한 조건하에서 서로 혼성화되지 않는 핵산들은 이들이 인코드하는 폴리펩티드들이 실질적으로 동일하다면, 실질적으로 동일하다. 이는 예를 들면, 핵산의 복사체(copy)가 유전자 코드에 의해 허용되는 최대 코돈 축퇴(degeneracy)를 이용하여 생성될 때 이러한 것이 발생된다. 이러한 경우에서, 핵산들은 전형적으로 중간정도의 엄격한 혼성화 조건에서 혼성화된다. 예시적인 "중간정도의 엄격한 혼성화 조건(moderately stringent hybridization conditions)"은 40% 포름아미드, 1 M NaC1, 1% SDS, 37℃의 완충액에서 혼성화, 그리고 1× SSC, 45℃에서 세척을 포함한다. 양성 혼성화는 최소한 2배의 배경이다. 당업계 숙련자는 대체 혼성화 및 세척 조건들을 이용하여 유사한 엄격성 조건을 제공할 수 있다는 것을 바로 인지할 것이다. 혼성화 매개변수를 결정하기 위한 추가 지침들은 다수의 참조자료에서 제공되며, 예컨데, Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel, et al., John Wiley & Sons에서 제공된다. PCR의 경우, 어닐링 온도는 프라이머 길이에 따라 약 32℃ 내지 48℃에서 다변할 수 있지만, 약 36℃ 온도가 낮은 엄격성 증폭에 일반적이다. 높은 엄격성 PCR 증폭의 경우, 높은 엄격성 어닐링 온도는 프라이머 길이 및 특이성에 따라 약 50℃ 내지 65℃에서 다변할 수 있지만, 약 62℃ 온도가 낮은 엄격성 증폭에 일반적이다. 높은 엄격성 및 낮은 엄격성 증폭 모두의 경우에 대한 전형적인 주기 조건은 30초-2분간 90℃ 내지 95℃의 변성 단계, 30초-2분간 지속되는 어닐링 단계, 그리고 1-2분동안 약 72℃의 연장 단계를 포함한다. 낮은 그리고 높은 엄격성 증폭 반응에 대한 프로토콜과 지침은 예컨데, Innis et al. (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. N.Y.)에서 제공된다.

항원 결합 단백질들 (예컨데, 항체들)의 준비

특정 구체예들에서, 항원 결합 단백질들 (가령 항체들)은 항원 (예컨데, EGFR)으로의 면역화에 의해 만들어진다. 특정 구체예들에서, 항체들은 전장의 EGFR, EGFR의 가용성 형태, 촉매 도메인 단독, EGFR의 성숙 형태, EGFR의 접합 변이체 형태, 또는 이의 단편으로의 면역화에 의해 만들어질 수 있다. 특정 구체예들에서, 본 발명의 항체들은 다중클론성 또는 단일클론성일 수 있거나, 및/또는 재조합 항체들일 수 있다. 특정 구체예들에서, 본 발명의 항체들은 예를 들면, 인간 항체들을 만들 수 있는 이식 유전자 동물의 면역화에 의해 준비된 인간 항체들이다(예컨데, PCT 공개된 출원 번호 W0 93/12227 참고).

특정 구체예들에서, 특정 전략을 이용하여 항체의 고유 성질들, 가령 이의 표적에 대한 항체의 친화력을 조정할 수 있다. 이러한 전략들은 항체 변이체를 생성하기 위하여 항체를 인코드하는 폴리뉴클레오티드 분자의 부위-특이적 또는 무작위 돌연변이생성의 이용을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 특정 구체예들에서, 바람직한 변화, 예컨데 증가된 또는 감소된 친화력을 나타내는 항체 변이체들을 스크리닝한 후에 이러한 생성이 이어진다.

특정 구체예들에서, 돌연변이성 전략에서 표적화되는 아미노산 잔기들은 CDR에 있는 것들이다. 특정 구체예들에서, 가변 도메인들의 골격 영역들내 아미노산들이 표적화된다. 특정 구체예들에서, 이러한 골격 영역들은 특정 항체들의 표적 결합 성질에 기여하는 것으로 나타났다. 예컨데, Hudson, Curr. Opin. Biotech., 9:395-402 (1999) 및 여기에서 언급된 참조자료들 참고.

특정 구체예들에서, 항체 변이체들의 더 작고 좀더 효과적으로 스크린된 라이브러리는 CDR에서 과다-돌연변이 부위에 무작위 또는 부위-지향적 돌연변이생성을 한정시킴으로써 만들어지고, 이는 체세포 친화력 돌연변이 과정 동안에 돌연변이되기 쉬운 영역들에 대응되는 부위들이다. 예컨데, Chowdhury & Pastan, Nature Biotech., 17: 568-572 (1999) 및 여기에서 언급된 참조 자료들 참고. 특정 구체예들에서, DNA 요소들의 특정 유형들을 이용하여 예로써 특정 지향 및 역전된 반복체, 특정 콘센선스 서열들, 특정 2차 구조들 그리고 특정 팔린드롬(palindromes)을 포함하나 이에 한정되지 않는, 과다-돌연변이 부위들을 확인할 수 있다. 예를 들면, 과다-돌연변이 부위들을 확인하는데 이용될 수 있는 이러한 DNA 요소들은 퓨린 (A 또는 G), 이러서 구아닌(G), 이어서 피리미딘(C 또는 T), 이어서 아데노신 또는 티미딘(A 또는 T) (가령, A/G-G-C/T-A/T)을 포함하는 4염기 서열을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 과다-돌연변이 부위들을 확인하는데 이용될 수 있는 또다른 DNA 요소의 예는 세린 코돈, A-G-C/T이다.

온전한 인간 항원 결합 단백질들 (예컨데, 항체들)의 준비

특정 구체예들에서, 파아지 디스플레이 기술(phage display technique)을 이용하여 단일클론성 항체들을 만든다. 특정 구체예들에서, 이러한 기술들은 온전한인간 단일클론성 항체들을 만든다. 특정 구체예들에서, 단일 Fab 또는 Fv 항체 단편을 인코드하는 폴리뉴클레오티드는 파아지 입자의 표면 상에 발현된다. 예컨데, Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J Mol Biol. 222: 581 (1991); U.S. 특허 제5,885,793호 참고. 특정 구체예들에서, 파아지는 표적에 대한 친화력을 보유하는 이들 항체 단편들을 확인하기 위하여 "스크리닝된다". 따라서, 이러한 특정 프로세스들은 섬유성 박테리오파아지의 표면 상에 항체 단편 레퍼토리의 디스플레이를 통한 면역 선별과 표적에 이들의 결합에 의한 파아지의 후속적 선별들 통한 면역 선별을 닮았다. 이러한 특정 절차들에서, 높은 친화력 기능적 중화 항체 단편들이 단리된다. 이러한 특정 구체예들에서 (하기에서 더 상세하게 논의되지만), 인간 항체 유전자의 완벽한 레퍼토리는 말초 혈액 임파세포로부터 자연적으로 재배열된 인간 V 유전자들의 클로닝에 의해 만들어진다. 예컨데, Mullinax et al., Proc Natl Acad Sci (USA), 87: 8095-8099 (1990) 참고.

특정 구체예들에 따르면, 본 발명의 항체는 삽입된 인간 항체 생산 게놈의 실질적인 일부를 보유하지만, 내생성 뮤린 항체들의 생산에 결함을 부여받은 이식유전자 마우스의 이용을 통하여 준비된다. 그 다음 이러한 마우스는 인간 면역글로블린 분자 및 항체들을 생산할 수 있고, 그리고 뮤린 면역글로블린 분자들과 항체들의 생산에는 결함을 가진다. 이러한 결과를 획득하기 위하여 이용된 기술들은 본 명세서에서 공개된 특허들, 출원들 그리고 참조자료들에서 공개된다. 특정 구체예들에서, 가령 PCT 공개된 출원 번호 WO 98/24893 또는 Mendez et al., Nature Genetics, 15:146-156 (1997)에서 공개된 방법들을 이용할 수 있으며, 이들 자료는 임의의 목적으로 여기에 참고자료로 편입된다.

일반적으로, EGFR에 특이적인 온전한 인간 단일클론성 항원 결합 단백질들 (예컨데, 항체들)은 다음과 같이 생산될 수 있다. 인간 면역글로블린 유전자들을 함유하는 이식유전자 마우스는 관심 항원, 예컨데 EGFR으로 면역화되고, 항체들을 발현시키는 마우스의 임파성 세포들 (가령 B-세포들)을 획득한다. 이러한 회수된 세포들은 불멸의 하이브리도마 세포계를 준비하기 위하여 골수-유형 세포계와 융합되며, 그리고 이러한 하이브리도마 세포계들은 관심 항원에 특이적인 항체들을 생산하는 하이브리도마 세포계를 확인하기 위하여 스크리닝 및 선택된다. 특정 구체예들에서, EGFR에 특이적인 항체들을 생산하는 하이브리도마 세포계의 생산이 제공된다.

특정 구체예들에서, 온전한 인간 항체들은 시험관에서 인간 비장세포들(B 또는 T 세포들)을 노출시키고, 그 다음 면역절충된 마우스, 예컨데 SCID 또는 nod/SCID에서 노출된 세포들을 재구성함으로써 만들어진다. 예컨데, Brams et al., J. Immunol. 160: 2051-2058 (1998); Carballido et al., Nat. Med., 6: 103-106 (2000) 참고. 이러한 특정 과정들에서, 인간 태아 조직을 SCID 마우스로 접목시키면(SCID-hu) 장기적 조혈생성(hematopoiesis) 및 인간 T-세포 발달을 초래한다. 예컨데, McCune et al., Science, 241:1532-1639 (1988); Ifversen et al., Sem. Immunol., 8:243-248 (1996) 참고. 특정 경우들에서, 이러한 키메라 마우스 내에서 체액 면역 반응은 동물들에서 인간 T-세포들의 공동-발달에 따라 달라진다. 예컨데, Martensson et al., Immunol., 83:1271-179 (1994) 참고. 특정 방식에서, 인간 말초 혈액 임파세포들은 SCID 마우스로 이식된다. 예컨데, Mosier et al., Nature, 335:256-259 (1988) 참고. 이러한 특정 구체예들에서, 이러한 이식된 세포들은 기폭 물질(priming agent), 가령 스타필로코커스성 엔테로톡신(Staphylococcal Enterotoxin) A (SEA)로 처리되거나, 또는 항-인간 CD40 단일클론성 항체들로 처리될 때, 더 높은 수준의 B 세포 생산이 탐지된다. 예컨데, Martensson et al ., Immunol ., 84: 224-230 (1995); Murphy et al., Blood, 86:1946-1953 (1995).

따라서, 특정 구체예들에서, 숙주 세포들 안에서 재조합 DNA의 발현에 의해 또는 하이브리도마 세포들 안에서 발현에 의해 온전한 인간 항체들이 생산될 수 있다. 다른 구체예들에서, 본 명세서에서 설명된 파아지 디스플레이 기술들을 이용하여 항체들이 생산될 수 있다.

본 명세서에서 설명된 이 항체들은 본 명세서에서 설명된 것과 같이XenoMouse® 기술의 이용을 통하여 일부 준비되었다. 그 다음 이러한 마우스는 인간 면역글로블린 분자들과 항체들을 생산할 수 있고, 그리고 뮤린 면역글로블린 분자들과 항체들의 생산은 결함을 가진다. 이를 획득하기 위하여 이용된 기술들은 본 명세서의 배경 부분에서 공개된 특허들, 출원들 그리고 참조자료에서 공개된다. 그러나, 특히, 마우스의 유전자전이 생산 및 이로부터의 항체들의 바람직한 구체예들은 1996년 12월 3일자로 제출된 U.S. 특허 출원 번호 08/759,620과 1998년 6월 11일날 공개된 국제 특허 출원 번호 WO 98/24893, 그리고 2000년 12월 21일자로 공개된 WO 00/76310에서 설명되며, 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 편입된다. Mendez et al., Nature Genetics, 15:146-156 (1997) 참고, 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 편입된다.

이러한 기술의 사용을 통하여, 다양한 항원들에 대한 온전한 인간 단일클론성 항체들이 만들어졌다. 기본적으로, 마우스의 XenoMouse® 계통은 관심 항원(예컨데 EGFR)으로 면역화되고, 임파 세포들 (가령 B-세포들)은 과다-면역화된 마우스로부터 회수되고, 회수된 임파세포들은 불멸 하이브리도마 세포계를 준비하기 위하여 골수-유형 세포계와 융합된다. 이들 하이브리도마 세포계들은 관심 항원에 특이적인 항체들을 생산하였던 하이브리도마 세포계통을 확인하기 위하여 스크리닝되고, 선별된다. EGFR에 특이적인 항체들을 생산하는 다중 하이브리도마 세포계를 생산하는 방법들이 본 명세서에서 제공된다. 더욱이, 이러한 항체들의 중쇄 및 경쇄의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 분석을 포함하는, 이러한 세포계들에의해 생산된 항체들의 특징이 본 명세서에서 제공된다.

마우스의 XenoMouse® 계통의 생산은 1990년 1월 12일자로 제출된 U.S. 특허 출원 번호 07/466,008, 1990년 11월 8일자로 제출된 U.S. 특허 출원 번호07/610,515, 1992년 7월 24일자로 제출된 U.S. 특허 출원 번호 07/919,297, 1992년 7월 30일자로 제출된 U.S. 특허 출원 번호 07/922,649, 1993년 3월 15일자로 제출된 U.S. 특허 출원 번호 08/031,801, 1993년 8월 27일자로 제출된 U.S. 특허 출원 번호 08/112,848, 1994년 4월 28일자로 제출된 U.S. 특허 출원 번호 08/234,145, 1995년 1월 20일자로 제출된 U.S. 특허 출원 번호 08/376,279, 1995년 4월 27일자로 제출된 08/430,938, 1995년 6월 5일자로 제출된 U.S. 특허 출원 번호08/464,584, 1995년 6월 5일자로 제출된 U.S. 특허 출원 번호 08/464,582, 1995년 6월 5일자로 제출된 U.S. 특허 출원 번호 08/463,191, 1995년 6월 5일자로 제출된 U.S. 특허 출원 번호 08/462,837, 1995년 6월 5일자로 제출된 U.S. 특허 출원 번호 08/486,853, 1995년 6월 5일자로 제출된 U.S. 특허 출원 번호 08/486,857, 1995년 6월 5일자로 제출된 U.S. 특허 출원 번호 08/486,859, 1995년 6월 5일자로 제출된 U.S. 특허 출원 번호 08/462,513, 1996년 10월 2일자로 제출된 U.S. 특허 출원 번호 08/724,752, 1996년 12월 3일자로 제출된 U.S. 특허 출원 번호 08/759,620, 2001년 11월 30일자로 제출된 U.S. 공개 2003/0093820, 그리고 미국 특허 제6,162,963호, 제6,150,584호, 제6,114,598호 제6,075,181호, 및 제5,939,598호 그리고 일본 특허 번호 3 068 180 B2, 3 068 506 B2, 및 3 068 507 B2. 또한 1996년 6월 12일자로 등록 공개된 유럽 특허 EP 0 463 151 B1, 1994년 2월 3일자로 공개된 국제 특허 출원 번호 WO 94/02602, 1996년 10월 31일자로 공개된 국제 특허 출원 번호 WO 96/34096, 1998년 6월 11일자로 공개된 WO 98/24893, 2000년 12월 21일자로 공개된 WO 00/76310에서 더 논의되고, 나타낸다.

온전한 인간 단클론성 항체 (Mab) 기술의 개발은 인간 질환에서 항체 요법의 전망을 충실히 실행하는데 있어서 중요한 사건이 되었다. 인간 단일클론성 항체들은 뮤린 또는 인간화된 항체들에 고유한 면역원성 및 알레르기성 반응을 최소화시키고, 그리고 증가된 효과 및/또는 안전성을 나타낸다. Abgenix (Amgen Inc의 현재)에 의해 개척된 XenoMouse® 방식을 포함하나 이에 한정되지 않는, 인간 단일클론성 항체들을 생산하는 다수의 기술들이 존재한다. Green et al., Nature Genetics 7:13-21 (1994). Xenomouse® 기술의 추가 변화는 Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997) 및 U.S. 특허 출원 번호 08/759,620에서 찾아볼 수 있을 것이며, 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 편입된다.

대안 방법으로, GenPharm International Inc.,을 포함하는 다른 곳들은 인간 항체들을 생산하는 "미니로코스(minilocus)" 방식을 이용하였다. 이 방식은 Surani et al의 미국 특허 제5,545,807호 및 미국 특허 제5,545,806호와 제5,625,825호(둘 모두다 Lonberg 및 Kay의 특허), 그리고 U.S. 특허 출원 일련 번호들 07/574,748(1990년 8월 29일자 제출), 07/575,962(1990년 8월 31일자 제출), 07/810,279(1991년 12월 17일자 제출), 07/853,408(1992년 3월 18일자 제출), 07/904,068(1992년 6월 23일자 제출), 07/990,860(1992년 12월 16일자 제출), 08/053,131(1993년 4월 26일자 제출), 08/096,762(1993년 7월 22일자 제출), 08/155,301(1993년 11월 18일자 제출), 08/161,739(1993년 12월 3일자 제출), 08/165,699(1993년 12월 10일자 제출), 08/209,741(1994년 3월 9일자 제출)에서 설명되고 있으며, 이들 각각은 여기에 참고자료로 편입된다. WO 94/25585, WO 93/12227, WO 92/22645, 및 WO 92/03918 또한 참고하며, 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 편입된다. 인간 항체들을 생산하는 추가 기술들은 예컨데, Medarex® (Bristol Myers Squibb®의 현신), 그리고 Cambridge Antibody Technologies® (CAT, AstraZeneca®의 현신)에 의해 개발되었다.

상기 언급된 특허들, 출원들 그리고 참조자료들의 내용은 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 편입된다.

본 발명의 적합한 항체들, 예컨데, 재조합, 단일클론성, 또는 다중클론성 항체들의 준비 및 본 발명에 따른 용도를 위하여, 당업계에 잘 공지되어 있는 많은 기술들이 이용될 수 있다(예컨데, Kohler & Milstein, Nature 256:495-497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4: 72 (1983); Cole et al., pp. 77-96 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985); Coligan, Current Protocols in Immunology (1991); Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988); 그리고 Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2d ed. 1986) 참고). 관심 항체의 중쇄 및 경쇄들을 인코드하는 유전자들은 세포로부터 클론될 수 있는데, 예컨데, 단클론성 항체를 인코드하는 유전자들은 하이브리도마로부터 클론될 수 있고, 그리고 재조합 단클론성 항체를 생산하는데 이용될 수 있다. 단일클론성 항체들의 중쇄 및 경쇄를 인코드하는 유전자 라이브러리 또한 하이브리도마 또는 혈장 세포들로부터 만들어질 수 있다. 중쇄 및 경쇄 유전자 산물들의 무작위 조합은 상이한 항원성 특이성을 가진 큰 항체 모둠(pool)을 생성한다(예컨데, Kuby, Immunol. (3^rd ed. 1997) 참고). 단일 쇄 항체들 또는 재조합 항체들의 생산을 위한 기술들 (U.S. 특허 제4,946,778호, U.S. 특허 제4,816,567호)을 채택하여 본 발명의 폴리펩티드들에 대한 항체들을 생산할 수 있다. 또한, 이식유전자 마우스, 또는 다른 유기체들, 가령, 다른 포유류를 이용하여 인간화된 또는 인간 항체들을 발현시킬 수 있다(예컨데, 미국 특허 제5,545,807호; 5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 제5,661,016호; Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992); Lonberg et al., Nature, 368:856-859 (1994); Morrison, Nature, 368:812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14:826 (1996); 그리고 Lonberg & Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995) 참고). 대안으로, 파아지 디스플레이 기술을 이용하여 선택된 항원들에 특별히 결합하는 항체들 및 이량체성 Fab 단편들을 확인할 수 있다 (예컨데, McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990); Marks et al., Biotechnology 10:779-783 (1992) 참고). 항체들은 이중특이적, 가령, 두 가지 상이한 항원을 인지할 수 있도록 또한 만들어질 수 있다(예컨데, WO 93/08829, Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659 (1991); 그리고 Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986)). 항체들은 또한 이종접합체(heteroconjugates), 예컨데, 두 개의 공유적으로 결합된 항체들, 또는 면역독소들 일 수 있다(예컨데, U.S. 특허 제4,676,980호, WO 91/00360; WO 92/200373; 및 EP 03089 참고).

비-인간 항체들의 인간화 또는 영장류화(primatizing)를 위한 방법들은 당업계에 잘 공지되어 있다. 일반적으로, 인간화된 항체는 인간의 것이 아닌 원천으로부터 이로 도입된 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기들을 보유한다. 이들 비-인간 아미노산 잔기들은 흔히 수입(import) 잔기들로 불리는데, 수입 가변 도메인으로부터 전형적으로 취해진다. 인간화는 Winter 및 공동작업자들(예컨데, Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988) 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992) 참고)의 방법에 따라, 인간 항체의 대응하는 서열들을 설치류 CDR 또는 CDR 서열들로 대체시킴으로써 필수적으로 실행될 수 있다. 따라서, 이러한 인간화된 항체들은 키메라 항체들이며 (U.S. 특허 제4,816,567호), 이때 실질적으로 온전한 인간 가변 도메인에 미치지 못하는 것들이 비-인간 종들로부터 취한 대응하는 서열들로 치환되었다. 실제, 인간화된 항체들은 전형적으로 인간 항체들이며, 이때 일부 CDR 잔기들과 가능한 한 일부 FR 잔기들은 설치류 항체들에서 유사 부위들로부터 취한 잔기들에 의해 치환된다.

대안 방식에서, GenPharm International, Inc.을 포함하는 다른 곳들은 "미니로코스(minilocus)" 방식을 이용하였다. 미니로코스 방식에서, 외생성 Ig 좌(locus)는 Ig 좌(locus)로부터 조각 함유물(개별 유전자들)을 통하여 모방된다. 따라서, 하나 또는 그 이상의 V_H 유전자들, 하나 또는 그 이상의 D_H 유전자들, 하나 또는 그 이상의 J_H 유전자들, mu 불변 영역, 그리고 제 2 불변 영역 (선호적으로 감마 불변 영역)은 동물 안으로 삽입시키기 위한 구조체로 형성된다. 이 방식은 Surani et al의 U.S. 특허 제5,545,807호와 Lonberg & Kay의 미국 특허 제5,545,806호, 제5,625,825호, 제5,625,126호, 제5,633,425호, 제5,661,016호, 제5,770,429호, 제5,789,650호, 제5,814,318호, 제5,877,397호, 제5,874,299호, 그리고 제6,255,458호, Krimpenfort & Berns의 U.S. 특허 제5,591,669호 및 제6,023.010호, Berns et al.의 미국 특허 제5,612,205호, 제5,721,367호, 및 제5,789,215호, 그리고 Choi & Dunn의 U.S. 특허 제5,643,763호, 그리고 GenPharm 국제 U.S. 특허 출원 일련 번호 07/574,748, 07/575,962, 07/810,279, 07/853,408, 07/904,068, 07/990,860, 08/053,131, 08/096,762, 08/155,301, 08/161,739, 08/165,699, 08/209,741에서 설명되며, 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 편입된다. 유럽 특허 0 546 073 B1, 국제 특허 출원 번호 WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852, 및 WO 98/24884 그리고 U.S. 특허 제5,981,175호 또한 참고하며, 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 편입된다. 더욱이 Taylor et al., 1992, Chen et al., 1993, Tuaillon et al., 1993, Choi et al., 1993, Lonberg et al., (1994), Taylor et al., (1994), 그리고 Tuaillon et al., (1995), Fishwild et al., (1996) 추가 참고하며, 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 편입된다.

Kirin은 마우스로부터 인간 항체들의 생성을 또한 설명하였는데, 이때 마이크로세포 융합, 염색체들의 큰 조각들, 또는 전체 염색체들이 도입되었다. 유럽 특허 출원 번호 773288 및 843961 참고하며, 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 편입된다. 추가적으로, Kirin의 Tc 마우스와 Medarex의 미니로코스(Humab)의 교잡 결과물인 KM™ 마우스가 생성되었다. 이들 마우스는 Kirin 마우스의 인간 IgH 트란스염색체 (transchromosome)와 Genpharm 마우스의 카파 쇄 트란스유전자를 보유한다(Ishida et al., Cloning Stem Cells, (2002) 4:91-102).

인간 항체들은 시험관 방법들에 의해 또한 유도될 수 있다. 적합한 예들은 파아지 디스플레이(CAT, Morphosys, Dyax, Biosite/Medarex, Xoma, Symphogen, Alexion (원래 Proliferon), Affimed) 리보좀 디스플레이(CAT), 효모 디스플레이 및 이와 유사한 것들을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

일부 구체예들에서, 본 명세서에서 설명된 항체들은 인간 IgG4 중쇄 뿐만 아니라 IgG2 중쇄들을 보유한다. 항체들은 IgG1을 포함하는 인간의 다른 이소타입들이 또한 될 수 있다. 다양한 기술들에 의해 측정되었을 때, 이 항체들은 높은 친화력, 전형적으로 약 10^-6 내지 약 10^-13 M 또는 그 이하의 Kd를 보유한다.

한 구체예에서, 이 항체는 "작동체" 모이어티에 접합된다. 이 작동체 모이어티는 라벨링 모이어티, 가령 방사능활성 라벨 또는 형광 라벨, 또는 치료 모이어티를 포함하는 임의의 숫자의 분자들이 될 수 있다.

본 발명의 항체들은 추가 아미노산 잔기들에 융합될 수 있다. 이러한 아미노산 잔기들은 단리를 용이하게 하기 위하여 아마도 펩티드 테그(tag)가 될 수도 있다. 특정 장기들 또는 조직으로 이 항체들을 유도하기 위한 기타 아미노산 잔기들 또한 고려된다.

본 발명의 또다른 측면에서, 항-EGFR 항체들 또는 항체 단편들은 항-종양 물질들 또는 탐지가능한 신호-생성 물질들에게 화학적으로 또는 생합성적으로 연계될 수 있다. 하기에서 예시하는 바와 같이, 본 발명의 항체들은 EGFR를 보유하는 세포들에게 결합시 효과적으로 내화된다. 항체에 연계된 항-종양 물질들은 항체가 결합된 종양 또는 항체가 결합된 세포의 환경에서 종양을 파괴 또는 손상시키는 임의의 물질들을 포함한다. 예를 들면, 항-종양 물질은 독성 물질, 가령 화학치료제 또는 방사능동위원소다. 적합한 화학치료제들은 당업계에 잘 공지되어 있는 것들이며, 안트라사이클린들(예컨데 다우노마이신 및 독소루비신), 메토트렉세이트, 빈데신, 네오카르지오스타틴, 시스-플라티늄, 클로람부칠, 시토신 아라비노시드, 5-플루오루우리딘, 멜파란, 리친 및 칼리케아미신을 포함한다. 화학치료제들은 통상적인 방법들을 이용하여 항체에 접합된다(예컨데, Hermentin and Seiler, Behring Inst. Mitt. 82:197-215 (1988) 참고).

탐지가능한 신호-생성 물질은 진단 목적으로 생체 및 시험관에서 유용하다. 신호 생성 물질은 외부 수단, 통상적으로 전자기 복사 측정을 통하여 탐지가능한 측정가능한 신호를 만든다. 대부분의 경우, 신호 생성 물질은 효소 또는 발색단(chromophore), 또는 형광, 인광이거나 또는 화학루미네선스에 의해 빛을 방출한다. 발색단들은 자외선 또는 가시광선 영역에서 빛을 흡수하는 염료를 포함하고, 효소 촉매된 반응의 기질 또는 분해 산물일 수 있다.

한 측면에서, 이 항체는 이 단백질의 활성을 조절한다. 이러한 작동체 모이어티는 항-종양 약물, 독소, 방사능활성 물질, 사이토킨, 제2 항체 또는 효소를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 더욱이, 본 발명은 본 발명의 항체가 프로드럭(prodrug)을 세포독성 물질로 전환시키는 효소에 연계된 구체예를 제공한다.

면역접합체를 이용하여 N-캐드헤린 양성 세포, 특히 N-캐드헤린 또는 Ly6 단백질을 발현시키는 세포들에게 작동체 모이어티를 표적화시킬 수 있다. 테스트 시료 및 대조군 시료가 대략적으로 유사하게 적하된 겔의 밴드를 확인할 때, 이러한 차이들이 분명히 명백하게 나타날 수 있다. 세포독성 물질들의 예는 리신, 독소루비신, 다우노루비신, 탁솔, 에티디움 브롬화물, 미토마이신, 에토폭시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 디히드록시 안트라신 디온, 악티노마이신 D, 디프테리아 독소, 슈도모나소 외독소(PE) A, PE40, 아브린 그리고 글루코코르티코이드 및 기타 화학치료제들, 뿐만 아니라 방사능동위원소들을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 적합한 탐지가능한 표식들은 방사능동위원소, 형광 화합물, 생물 발광 화합물, 화학발광 화합물, 금속 킬레이트 또는 효소를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

상기 임의의 구체예들에서, 화학치료 약물 및/또는 방사능 요법이 더 투여될 수 있다. 일부 구체예들에서, 환자는 호르몬 길항제 요법을 또한 받는다. 환자에게 항체 또는 항체 단편을 접촉시키는 것은 항체를 정맥, 복목, 근육, 종양내 또는 경피를 통하여 환자에게 투여함으로써 이루어진다. 일부 구체예들에서, 환자는 비뇨생식기 암 (예컨데, 방광 암, 전립선 암)을 가지고 있다. 상기 일부 구체예들에서 환자는 전립선 암을 앓고, 임의 선택적으로 더욱이 환자호르몬 제거 요법을 더 받는다. 일부 구체예들에서, 접촉은 항체를 암 또는 암 전이에 직접 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 화학치료제는 리신, 리신 A-쇄, 독소루비신, 다우노루비신, 탁솔, 에티디움 브롬화물, 미토마이신, 에토폭시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 디히드록시 안트라신 디온, 악티노마이신 D, 디프테리아 독소, 슈도모나소 외독소(PE) A, PE40, 아브린, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 겔로닌, 미토겔린, 레트스트릭토신(retstrictocin), 페노마이신, 에노마이신, 큐리신, 크로틴, 칼리케아미신(calicheamicin), 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 저해제, 메이탄시노이드 그리고 글루코코르티코이드리신으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

추가적으로, 본 발명의 임의의 단일클론성 항체들의 항원-결합 영역을 포함하는 본 발명의 재조합 단백질을 이용하여 암을 치료할 수 있다. 이러한 상황에서, 재조합 단백질의 항원-결합 영역은 치료 활성을 보유하는 제 2 단백질의 최소한 기능적으로 활성인 부분에 결합된다. 제 2 단백질은 효소, 림포카인, 온코스타틴 또는 독소를 포함할 수 있지만 이에 국한되지는 않는다. 적합한 독소들은 독소루비신, 다우노루비신, 탁솔, 에티디움 브롬화물, 미토마이신, 에토폭시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 디히드록시 안트라신 디온, 악티노마이신 D, 디프테리아 독소, 슈도모나소 외독소(PE) A, PE40, 리신, 아브린 그리고 글루코코르티코이드 및 방사능동위원소들을 포함한다.

치료제들을 항체들에 접합시키는 기술들은 공지되어 있다(예컨데, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies & Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For DrugDelivery" in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review" in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); 그리고 Thorpe et al ., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol . Rev ., 62:119-58 (1982)).

인지할 수 있는 것과 같이, 하이브리도마 세포계통을 제외한 세포계에서 항체들이 발현될 수 있다. 특정 항체들을 인코드하는 서열들을 이용하여 적합한 포유류 숙주 세포를 형질변환시킬 수 있다. 형질변환은 폴리뉴클레오티드들을 숙주 세포 안으로 도입시키는 임의의 공지된 방법에 의해 일어나는데, 예를 들면 폴리뉴클레오티드를 바이러스(또는 바이러스성 벡터) 안에 포장해 넣고, 그리고 숙주 세포를 바이러스(또는 벡터)로 당분야에 공지된 형질도입 또는 형질감염 시키는데, 미국 특허. 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461, 및 4,959,455에서 설명되고 있다 (이들 특허는 여기에 참고자료로 편입된다). 이용되는 형질변환 과정은 형질변환되는 숙주에 의존적이다. 이종(heterologous) 폴리뉴클레오티드들을 포유류 세포 안으로 도입시키는 방법들은 당업계에 잘 공지되어 있고, 그리고 덱스트란-중개된 형질감염, 인산칼슘 침전, 폴리브렌 중개된 형질감염, 원형질 융합, 전기천공리포좀내 폴리뉴클레오티드(들)의 포집, 그리고 핵으로 DNA를 직접 현미주사(microinjection)하는 것을 포함한다.

발현에 이용가능한 포유류 세포계는 당업계에 잘 공지되어 있고, 그리고 ㅈ중국(Chinese) 헴스터 난소(CHO) 세포들, HeLa 세포들, 아기 헴스터 신장(BHK) 세포들, 원숭이 신장 세포들 (COS), 인간 간세포성 암종 세포들 (예컨데, Hep G2), 인간 상피 신장 293 세포들, 그리고 다수의 다른 계통 세포들을 포함하나 이에 한정되지 않는 American Type Culture Collection (ATCC)에서 이용가능한 많은 불사화된 세포계를 포함한다. 특별히 선호되는 세포계통은 구성적 EGFR 결합 성질들을 가진 항체를 생산하고 높은 발현 수준을 보유하는 세포계통을 결정함으로써 선별된다.

특정 구체예들에서, 이 항원 결합 단백질들 (가령 항체들)은 대략적으로 1 nM 미만, 예컨데, 1000pM 내지 100 pM, 100 pM 내지 10 pM, 10 pM 내지 1 pM, 및/또는 1 pM 내지 0.1 pM 또는 이보다 적은 해리 상수(K_D)로 EGFR에 결합한다.

특정 구체예들에서, 항원 결합 단백질들은 최소한 하나의 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, Ig E, IgA, IgD, 및 IgM 이소타입의 면역글로블린 분자를 포함한다. 특정 구체예들에서, 항원 결합 단백질들 인간 카파 경쇄 및/또는 인간 중쇄를 포함한다. 특정 구체예들에서, 이 중쇄는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgA, IgD, 또는 IgM 이소타입의 중쇄다. 특정 구체예들에서, 포유류 세포들에서 발현을 위하여 항원 결합 단백질들이 클론되었다. 특정 구체예들에서, 항원 결합 단백질들은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgA, IgD, 및 IgM 이소타입의 임의의 불변 영역들을 제외한 불변 영역을 포함한다.

특정 구체예들에서, 항원 결합 단백질들은 인간 람다 경쇄 및 인간 IgG2 중쇄를 포함한다. 특정 구체예들에서, 항원 결합 단백질들은 인간 람다 경쇄 및 인간 IgG4 중쇄를 포함한다. 특정 구체예들에서, 항원 결합 단백질들은 인간 람다 경쇄 및 인간 IgG1, IgG3, IgE, IgA, IgD 또는 IgM 중쇄를 포함한다. 다른 구체예들에서, 항원 결합 단백질들은 인간 카파 경쇄 및 인간 IgG2 중쇄를 포함한다. 특정 구체예들에서, 항원 결합 단백질들은 인간 카파 경쇄 및 인간 IgG4 중쇄를 포함한다. 특정 구체예들에서, 항원 결합 단백질들은 인간 카파 경쇄 및 인간 IgG1, IgG3, IgE, IgA, IgD 또는 IgM 중쇄를 포함한다. 특정 구체예들에서, 항원 결합 단백질들은 IgG2 이소타입의 불변 영역, 또는 IgG4 이소타입의 불변 영역이 아닌 불변 영역에 결찰된 항체들의 가변 영역을 포함한다. 특정 구체예들에서, 항원 결합 단백질들은 포유류 세포들에서 발현을 위하여 클론되었다.

대조적으로, 특정 구체예들에서, EGFR에 대한 항체들의 기능적 및/또는 화학적 특징들에 있어서 실질적인 변형은 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열내에서 치환 영역 안에서 (a) 분자의 골격 고조의 유지, 예를 들면, 가령 쉬트 또는 나선형 모양의 유지, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성의 유지, 또는 (c) 측쇄의 벌크(bulk) 유지에 이들의 효과가 상당히 상이한 치환들을 선택함으로써 이루어질 수 있다.

예를 들면, "보존적 아미노산 치환"은 고유 아미노산 잔기를 그 위치에서 아미노산 잔기의 극성 또는 전하에 영향이 없는 또는 거의 영향이 없도록 하기 위하여 비-고유한 잔기로 치환하는 것을 포함할 수 있다. 더욱이, 폴리펩티드에서 임의의 고유 잔기는 "알라닌 스캐닝 돌연변이생성"에서 이미 설명된 것과 같이 알라닌으로 또한 치환될 수 있다.

바람직한 아미노산 치환들 (보존적 또는 비-보존적인)은 이러한 치환들이 필요한 시점에서 당해 숙련자들에 의해 결정될 수 있다. 특정 구체예들에서, 본 명세서에서 설명된 것과 같이, 아미노산 치환들을 이용하여 EGFR에 대한 항체들의 중요한 잔기들을 확인하거나, 또는 EGFR에 대한 항체들의 친화력를 감소시킬 수 있다.

특정 구체예들에서, 본 발명의 항체들은 하이브리도마 세포계통이외의 세포계에서 발현될 수 있다. 특정 구체예들에서, 특정 항체들을 인코드하는 서열들을 이용하여 적합한 포유류 숙주 세포를 형질변환시킬 수 있다. 특정 구체예들에 따르면, 형질변환은 폴리뉴클레오티드들을 숙주 세포 안으로 도입시키는 임의의 공지된 방법에 의해 일어나는데, 예를 들면 폴리뉴클레오티드를 바이러스(또는 바이러스성 벡터) 안에 포장해 넣고, 그리고 숙주 세포를 바이러스(또는 벡터)로 당분야에 공지된 형질도입 또는 형질감염 시키는데, 미국 특허. 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461, 및 4,959,455에서 설명되고 있다 (이들 특허는 여기에 참고자료로 편입된다). 특정 구체예들에서, 이용되는 형질변환 과정은 형질변환되는 숙주에 의존적이다. 이종(heterologous) 폴리뉴클레오티드들을 포유류 세포 안으로 도입시키는 방법들은 당업계에 잘 공지되어 있고, 그리고 덱스트란-중개된 형질감염, 인산칼슘 침전, 폴리브렌 중개된 형질감염, 원형질 융합, 전기천공리포좀내 폴리뉴클레오티드(들)의 포집, 그리고 핵으로 DNA를 직접 현미주사(microinjection)하는 것을 포함한다.

발현에 이용가능한 포유류 세포계는 당업계에 잘 공지되어 있고, 그리고 중국 헴스터 난소(CHO) 세포들, HeLa 세포들, 아기 헴스터 신장(BHK) 세포들, 원숭이 신장 세포들 (COS), 인간 간세포성 암종 세포들 (예컨데, Hep G2), 인간 상피 신장 293 세포들, 그리고 다수의 다른 계통 세포들을 포함하나 이에 한정되지 않는 American Type Culture Collection (ATCC)에서 이용가능한 많은 불사화된 세포계를 포함한다. 특정 구체예들에서, 특별히 선호되는 세포계통은 구성적 HGF 결합 성질들을 가진 항체를 생산하고 높은 발현 수준을 보유하는 세포계통을 결정함으로써 선별된다. 포유류 숙주 세포들에 대해 적합한 발현 벡터들은 잘 공지되어 있다.

특정 구체예들에서, 항원 결합 단백질들은 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드들을 포함한다. 특정 구체예들에서, 다양한 임의의 발현 벡터/숙주 시스템을 이용하여 하나 또는 그 이상의 항원 결합 단백질 성분들 또는 이 항원 결합 단백질 자체를 포함하는 폴리펩티드들을 인코드하는 폴리뉴클레오티드 분자들을 발현시킬 수 있다. 이러한 시스템들은 미생물들, 가령 재조합 박테리오파아지, 플라스미드, 또는 코스미드 DNA 발현 벡터들; 효모 발현 벡터들로 형질변환된 효모; 바이러스 발현 벡터들 (예컨데, 베큘로바이러스)에 감염된 곤충 세포 시스템들; 바이러스 발현 벡터들 (예컨데, 꽃양배추 모자이크 바이러스, CaMV, 담배 모자이크 바이러스, TMV)에 의해 형질감염된 또는 박테리아성 발현 벡터들 (예컨데, Ti 또는 pBR322 플라스미드)로 형질변환된 식물 세포 시스템들; 또는 동물 세포 시스템들을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

특정 구체예들에서, 하나 또는 그 이상의 항원 결합 단백질 성분들 또는 이 항원 결합 단백질 자체를 포함하는 폴리펩티드는 효모에서 재조합적으로 발견된다. 이러한 특정 구체예들은 제조업자의 지시에 따라 상업적으로 이용가능한 발현 시스템들을 이용하는데, 예컨데, Pichia 발현 시스템 (Invitrogen, San Diego, CA)을 이용한다. 특정 구체예들에서, 이러한 시스템은 분배를 지시하기 위하여 pre-pro-알파 서열에 의존한다. 특정 구체예들에서, 삽입체의 전사는 메탄올에 의한 유도시 알코올 산화효소 (AOX1) 프로모터에 의해 구동된다.

특정 구체예들에서, 하나 또는 그 이상의 항원 결합 단백질 성분들 또는 이 항원 결합 단백질 자체를 포함하는 분비된 폴리펩티드는 효모 성장 배지로부터 정제된다. 특정 구체예들에서, 효모 성장 배지로부터 폴리펩티드를 정제하는데 이용된 방법들은 박테리아성 그리고 포유류 세포 상청액으로부터 폴리펩티드를 정제하는데 이용된 것과 동일하다.

특정 구체예들에서, 하나 또는 그 이상의 항원 결합 단백질 성분들 또는 이 항원 결합 단백질 자체를 포함하는 폴리펩티드를 인코드하는 핵산은 베큘로바이러스 발현 벡터, 가령 pVL1393 (PharMingen, San Diego, CA) 안으로 클론된다. 특정 구체예들에서, 이러한 벡터를 이용하여 제조업자(PharMingen)의 지시에 따라, sF9 단백질-없는 배지에서 스포도프테라 푸루지페르다(Spodoptera frugiperda) 세포들을 감염시키고, 그리고 재조합 폴리펩티드를 만들 수 있다.. 특정 구체예들에서, 헤파린-세파로즈(Sepharose) 컬럼(Pharmacia)을 이용하여 이러한 배지로부터 폴리펩티드를 정제하고 농축시킨다.

특정 구체예들에서, 하나 또는 그 이상의 항원 결합 단백질 성분들 또는 이 항원 결합 단백질 자체를 포함하는 폴리펩티드는 곤충 시스템 안에서 발현된다. 폴리펩티드 발현을 위한 특정 곤충 시스템들은 당업계에 잘 공지되어 있다. 이러한 한 가지 시스템에서, 오토그라파 칼리포니카(Autographa californica) 핵 폴리헤드로시스(polyhedrosis) 바이러스 (AcNPV)를 벡터로 이용하여 스포도프테라 푸루지페르다(Spodoptera frugiperda) 세포들 또는 트리코풀루시아 라르베(Trichoplusia larvae)에서 외부 유전자들을 발현시킨다. 특정 구체예들에서, 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 분자를 바이러스의 비-필수 유전자 내, 예를 들면, 폴리헤드린 유전자내로 삽입시킬 수 있고, 이 유전자용 프로모터의 조절하에 위치시킬 수 있다. 특정 구체예들에서, 핵산 분자의 성공적인 삽입으로 비필수 유전자를 비활성화시킬 것이다. 특정 구체예들에서, 이러한 비활성화는 탐지가능한 특징을 초래한다. 예를 들면, 폴리헤드린 유전자의 비활성화는 코트(coat) 단백질이 없는 바이러스의 생산을 초래한다.

특정 구체예들에서, 재조합 바이러스들을 이용하여 스포도프테라 푸루지페르다(S. frugiperda) 또는 트리코풀루시아 라르베(Trichoplusia larvae)를 감염시킬 수 있다. 예컨데, Smith et al., J. Virol., 46: 584 (1983); Engelhard et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA), 91: 3224-7 (1994) 참고.

특정 구체예들에서, 박테리아성 세포내에서 만들어진 하나 또는 그 이상의 항원 결합 단백질 성분들 또는 이 항원 결합 단백질 자체를 포함하는 폴리펩티드들은 박테리아에서 불용성 봉입체들로 만들어진다. 특정 구체예들에서, 이러한 봉입체들을 포함하는 숙주 세포는 원심분리에 의해 수거되고; 0.15 M NaCl, 10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA에서 세척되고; 실온에서 15분간 0.1 mg/ml의 리소자임 (Sigma, St. Louis, MO)으로 처리된다. 특정 구체예들에서, 이 용해물을 초음파분쇄로 맑게 하고, 그리고 세포 잔해는 12,000 X g에서 10분간 원심분리에 의해 펠렛화된다. 특정 구체예들에서, 이 폴리펩티드-함유 펠렛은 50 mM Tris, pH 8, 및 10 mM EDTA에서 재현탁되고고; 50% 글리세롤에 적층되며; 그리고 30분간 6000 X g에서 원심분리된다. 특정 구체예들에서, 이 펠렛은 Mg⁺⁺ 및 Ca⁺⁺ 없는 표준 인산염 완충된 염수(PBS)에 재현탁될 수 있다. 특정 구체예들에서, 이 폴리펩티드는 변성 SDS 폴리아크릴아미드 겔에서 재현탁된 펠렛을 분획화(fractionating)함으로써 더 정제된다(예컨데, Sambrook et al., 상기와 동일). 특정 구체예들에서, 이러한 겔을 0.4 M KCl에 흠뻑 젖도록 하여 단백질을 볼 수 있는데, 이 단백질을 잘라내어, SDS가 부족한 겔-운영 완충액에서 전기용리시킬 수 있다. 특정 구체예들에 따르면, 글루타티온-S-전이효소 (GST) 융합 단백질는 가용성 단백질로 박테리아에서 생산된다. 특정 구체예들에서, 이러한 GST 융합 단백질은 GST 정제 모듈 (Pharmacia)을 이용하여 정제된다.

특정 구체예들에서, 특정 폴리펩티드들, 예컨데, 하나 또는 그 이상의 항원 결합 단백질 성분들 또는 이 항원 결합 단백질 자체를 포함하는 폴리펩티드들을 "재폴드(refold)"시키는 것은 바람직하다. 특정 구체예들에서, 이러한 폴리펩티드들은 본 명세서에서 논의되는 특정 재조합 시스템들을 이용하여 만들어진다. 특정 구체예들에서, 폴리펩티드들은 "재폴드되거나" 및/또는 산화되어 바람직한 3차 구조를 형성하거나 및/또는 이황화물 연계(linkages)를 만든다. 특정 구체예들에서, 이러한 구조 및/또는 연계는 폴리펩티드의 특정 생물학적 활성과 관련된다. 특정 구체예들에서, 재폴딩은 당업계에 잘 공지되어 있는 임의의 다수의 과정을 이용하여 실시된다. 예시적인 방법들은 가용화된 폴리펩티드 물질을 무질서유발제(chaotropic agent) 존재하에 전형적으로 pH7 이상에 노출시키는 것을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 예시적인 무질서유발제는 구아니딘이다. 특정 구체예들에서, 재폴딩/산화 용액은 환원 물질과 이 환원 물질의 산화된 형태를 또한 포함한다. 특정 구체예들에서, 환원 물질 및 이의 산화된 형태는 이황화물의 셔플링(shuffling)의 발생을 허용하는 특정 산화환원 가능성이 일어나게 되는 비율로 존재한다. 특정 구체예들에서, 이러한 셔플링은 시스테인 다리의 형성을 허용한다. 예시적인 산화환원 쌍은 시스테인/시스타민, 글루타티온/디티오비스GSH, 염화구리, 디티오트레톨 DTT/디티안 DTT, 그리고 2-멀캅토에탄올 (bME)/디티오-bME을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 특정 구체예들에서, 공-용매를 이용하여 재폴딩 효과를 증대시킨다. 예시적인 공용매는 글리세롤, 다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜, 그리고 아르기닌을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

특정 구체예들에서, 하나 또는 그 이상의 항원 결합 단백질 성분들 또는 이 항원 결합 단백질 자체를 포함하는 폴리펩티드를 실질적으로 정제한다. 특정 단백질 정제 기술들은 당업계 숙련자들에게 잘 공지되어 있다. 특정 구체예들에서, 단백질 정제는 비-폴리펩티드 분획물로부터 폴리펩티드 분별의 거친 분별을 포함한다. 특정 구체예들에서, 폴리펩티드들은 크로마토그래피 기술 및/또는 전기이동 기술을 이용하여 정제된다. 예시적인 정제 방법들은 황산암모늄을 이용한 침전; PEG를 이용한 침전; 면역침전; 열 변성에 이어서 원심분리; 친화력 크로마토그래피 (예컨데, 단백질-A-세파로즈), 이온 교환 크로마토그래피, 압출 크로마토그래피, 그리고 역상 크로마토그래피; 겔 여과; 히드록시아파타이트 크로마토그래피을 포함하나 이에 한정되지 않는 크로마토그래피; 등전위 포커싱(isoelectric focusing); 폴리아크릴아미드 겔 전기영동; 그리고 이러한 기술 및 다른 기술들의 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 특정 구체예들에서, 폴리펩티드는 신속한 단백질 액체 크로마토그래피 또는 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 정제된다. 특정 구체예들에서, 정제 단계들이 변경되거나 특정 단계들이 생략될 수 있고, 그리고 실질적으로 정제된 폴리펩티드의 준비를 위한 적합한 방법이 생길 수 있다.

특정 구체예들에서, 폴리펩티드 준비물의 정제 수준을 정량화한다. 정제 수준의 정량화를 위한 특정 당법들은 당업계의 숙련자들에게 잘 공지되어 있다. 특정 예시적인 방법들은 이 준비물의 특이적 결합 활성을 측정하고, SDS/PAGE 분석을 통하여 준비물내 폴리펩티드의 양을 평가하는 것을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 폴리펩티드 준비물의 정제된 양을 평가하는 예시적인 방법들은 준비물의 결합 활성을 계산하고, 초기 추출물의 결합 활성과 비교하는 것을 포함한다. 특정 구체예들에서, 이러한 계산 결과는 "배수 정제 (fold purification)"으로 나타낸다. 결합 활성의 양을 나타내는데 이용되는 단위는 실행된 특정 분석에 의존된다.

특정 구체예들에서, 하나 또는 그 이상의 항원 결합 단백질 성분들 또는 이 항원 결합 단백질 자체를 포함하는 폴리펩티드가 부분적으로 정제된다. 특정 구체예들에서, 일부(partial) 정제는 더 적은 정제 단계를 이용하거나 또는 동일한 전체 정제 과정의 상이한 형태를 이용함으로써 이루어질 수 있다. 예를 들면, 특정 구체예들에서, HPLC 기구를 이용하여 실시된 양이온-교환 컬럼 크로마토그래피는 저압 크로마토그래피 시스템을 이용하는 동일한 기술보다 더 큰 "배수 정제"를 일반적으로 초래할 것이다. 특정 구체예들에서, 더 낮은 수준의 정제를 야기하는 방법들은 총 회수 폴리펩티드, 또는 폴리펩티드의 결합 활성 유지에 잇점을 가질 수 있다.

특정 경우들에서, 폴리펩티드의 전기이동적 이동은 SDS/PAGE의 상이한 조건들에 의해 때로 상당히 다변화될 수 있다. 예컨데, Capaldi et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 76: 425 (1977) 참고. 상이한 전기영동 조건하에서 정제된 또는 일부 정제된 폴리펩티드의 겉보기 분자량이 달라질 수 있다는 것을 인지할 것이다.

예시적인 에피토프

항-EGFR 항체들이 결합되는 에피토프들에 대해 설명되어 있다. Freeman et al., Journal of Clinical Oncol., 26:14536 (2008); ASCO Annual Meeting Proceedings. 일부 구체예들에서, EGFR 에피토프에 결합하는, 또는 EGFR 항체 에피토프들에 경쟁적으로 결합하는 항원 결합 단백질들이 유용하다.

특정 치료요법적 용도 및 제약학적 조성물들

일부 구체예들에서, EGFR에 대한 하나 이상의 항원 결합 단백질을 이용하여 EGFR 활성을 조절한다.

특정 구체예들에서, EGFR에 대한 항원 결합 단백질은 단독으로 투여된다. 특정 구체예들에서, EGFR에 대한 항원 결합 단백질은 최소한 하나의 기타 치료제를 투여하기 전, 투여된다. 특정 구체예들에서, EGFR에 대한 항원 결합 단백질은 최소한 하나의 기타 치료제의 투여와 동시에 투여된다. 특정 구체예들에서, EGFR에 대한 항원 결합 단백질은 최소한 하나의 기타 치료제를 투여 한 후, 투여된다. 다른 구체예들에서, EGFR에 대한 항원 결합 단백질은 최소한 하나의 기타 치료제를 투여하기 전, 투여된다.

본 발명의 한 구체예에서, 항-EGFR 항체들은 하나 또는 그 이상의 기타 항-신형성 물질들과 복합되어 투여될 수 있다. 복합 요법의 예들은 예컨데, 미국 특허 제6,217,866호(Schlessinger et al.) (항-신형성 물질들과 복합된 항-EGFR 항체들); WO 99/60023 (Waksal et al.) (방사능과 항-EGFR 항체들의 복합). 임의의 적합한 항-신형성 물질이 이용될 수 있는데, 가령 화학치료제, 방사능 또는 이의 조합이 이용될 수 있다. 항-신형성 물질은 알킬화 물질 또는 항-대사물질일 수 있다. 알킬화 물질의 예로는 시스플라틴, 시클로포스파미드, 멜파란 및 다카르바진을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 항-대사물질의 예는 독소루비신, 다우노루비신, 그리고 파클리탁셀, 겜시타빈 그리고 토포이소머라제 억제제 이리노테칸(CPT-11), 아미노캄토테신, 캄토테신, DX-8951f, 그리고 토포테칸(토포이소머라제 I) 그리고 에토포시드(VP-16) 및 테니포시드(VM-26) (토포이소머라제 II)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 항-신형성 물질이 방사능일 때, 방사능의 원천은 치료될 환자의 외부(외부 빔 방사능 요법-EBRT) 또는 내부 (근접방사선요법-BT) 원천일 수 있다. 투여되는 항-신형성 물질의 투약량은 예를 들면, 물질의 유형, 치료될 종양의 유형 및 중증도, 그리고 물질의 투여 경로를 포함하는 여러 인자들에 따라 달라진다. 그러나, 본 발명은 임의의 특정 투약량에 제한되지 않는다는 것을 강조한다.

당업계에 현재 공지된 또는 평가중인 항-신형성 물질들은 예를 들면, 유사분열 억제제들, 알킬화 물질들, 항-대사물질들, 삽입 항생제(intercalating antibiotics), 성장 인자 억제제들, 세포 주기 억제제들, 효소들, 토포이소머라제억제제들, 항 생존 물질들, 생물학적 반응 변형제들, 항-호르몬, 그리고 항-신생혈관생성 물질들을 포함하는 다양한 분류로 구별될 수 있다.

이들 분류중에서, 본 명세서에서 보고된 데이터는 EGFR에 결합하는 항체들과 복합하여 사용되었을 때, 토포이소머라제 억제제들이 특이 효과적인 항-신형성 물질이라는 것을 암시한다. 따라서, 본 발명의 구체예들은 토포이소머라제 억제제를 EGFR에 결합하는 항체와 복합하여 투여하는 방법들을 포함한다. 이 억제제들은 토포이소머라제 I 또는 토포이소머라제 II의 억제제일 수 있다. 토포이소머라제 I 억제제들은 이리노테칸 (CPT-11), 아미노-캄토테신, 캄토테신, DX-8951f, 토포테칸을 포함한다. 토포이소머라제 II 억제제들은 에토포시드 (VP-16), 그리고 테니포시드(VM-26)를 포함한다. 다른 물질들은 토포이소머라제 억제제 활성과 비교하여 그리고 항-신형성 물질들로써의 효과에 대해 현재 평가되고 있다. 바람직한 구체예에서, 토포이소머라제 억제제는 이리노테칸 (CPT-11)이다. 복합되어 이용되는 항체들은 EGFR에 결합되는 본 발명의 항체들과 복합되어 이용되고, 다음중 최소한 하나의 특징을 보유한다: (i) EGF가 EGFR에 결합하는 것을 억제하고; (ii) EGF에 의한 EGFR의 활성화를 중화시키고 (iii) EGFR 표면 수용체를 감소시키고; 그리고 약 1×10^-10 M^-1 또는 그 미만의 Kd로 EGFR에 결합한다. 좀더 바람직한 구체예에서, 토포이소머라제 억제제와 복합되어 이용되는 항체들은 상기에서 제시된 인간 항체들의 특징들을 보유한다.

본 발명의 항-EGFR 항체들은 종양 성장 또는 신생혈관생성에 관련된 다른 수용체들을 중화시키는 항체들과 함께 투여될 수 있다. 본 발명의 한 구체예에서, 항-EGFR 항체는 EGFR에 특이적으로 결합하는 수용체 길항제와 복합되어 이용된다. EGFR의 세포외 도메인에 결합하고, 하나 또는 그 이상의 이의 리간드들의 결합을 차단하거나 및/또는 EGFR의 리간드-유도된 활성화를 중화시키는 항원-결합 단백질들이 특히 바람직하다. EGFR 길항제는 EGFR 또는 EGFR의 리간드에 결합하고, EGFR가 이의 리간드에 결합하는 것을 억제하는 항체일 수 있다. EGFR에 대한 리간드들은 예를 들면, EGF, TGF-α, 암피레굴린, 헤파린-결합 EGF (HB-EGF) 그리고 베타셀룰린을 포함한다. 비록 TGF-α은 신생혈관생성을 촉진시키는데 더 강력한 것으로 보여졌지만, EGF 및 TGF-α은 주요 내인성 리간드들로써 EGFR-중개된 자극을 초래하는 것으로 생각된다. EGFR 길항제는 EGFR의 세포외 일부에 외부적으로 결합할 수 있거나, 티로신 키나제 도메인에 내부적으로 결합할 수 있고, 이때 외부적 결합은 리간드의 결합의 결합을 억제하거나 또는 억제하지 못할 수도 있다는 것을 인지해야만 한다. EGFR에 결합하는 예시적인 EGFR 길항제들은 생물학적 분자들, 가령 EGFR에 특이적인 항체들 ( 및 이의 기능적 등가체들), 그리고 작은 분자들, 가령 EGFR의 세포질 도메인상에 직접적으로 작용하는 합성 키나제 억제제들을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

이러한 수용체의 또다른 예는 VEGFR이다. 본 발명의 구체예에서, 항-EGFR 항체는 VEGFR 길항제와 복합되어 이용된다. 본 발명의 한 구체예에서, 항-EGFR 항체는 VEGFR-1/Flt-1 수용체에 특이적으로 결합하는 수용체 길항제와 복합되어 이용된다. 또다른 구체예에서, 항-EGFR 항체는 VEGFR-2/KDR 수용체에 특이적으로 결합하는 수용체 길항제와 복합되어 이용된다. VEGFR-1 또는 VEGFR-2의 세포외 도메인에 결합하여, 이들 리간드에 의한 결합을 차단시키거나(VEGFR-2는 VEGF에 의해 대부분 강력하게 자극되며; VEGFR-1은 P1GF에 의해 대부분 강력하게 자극되지만, VEGF에 의해서도 또한 자극된다) 및/또는 리간드-유도된 활성화를 중화시키는 항원-결합 단백질들이 특히 바람직하다. 예를 들면, IMC-1121은 VEGFR-2에 결합하여 이를 중화시키는 인간 항체다(WO 03/075840; Zhu). 또다른 예는 MAb 6.12으로써, 가용성 그리고 세포 표면-발현된 VEGFR-1에 결합하는 scFv다. ScFv 6.12는 마우스 단클론성 항체 MAb 6.12의 V_L 및 V_H 도메인들을 포함한다. MAb 6.12를 생산하는 하이브리도마 세포계는 특허 출원 및 등록 절차를 위한 목적으로 미생물의 국제 기탁에 관한 부타페스트 조약에 근거하여 ATCC 번호 PTA-3344로 기탁되었다(Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure and the regulations thereunder (Budapest Treaty)). 종양생성에 관련된 성장 인자 수용체들의 기타 예들은 혈소판-유도된 성장 인자 (PDGFR), 신경 성장 인자 (NGFR), 그리고 섬유아세포 성장 인자 (FGFR)용 수용체들이다.

추가적인 대체 구체예에서, EGFR 항체는 하나 또는 그 이상의 적합한 어쥬번트들, 가령, 예를 들면, 사이토킨 (IL-10 및 IL-13, 예를 들면) 또는 기타 면역 자극물질들, 가령, 케모킨, 종양-연관된 항원, 및 펩티드들을 포함하나 이에 한정되지 않는, 것들과 복합되어 투여될 수 있다. 예컨데, Larrivee et al ., 상기와 동일. 그러나, 항-EGFR 항체를 단독으로 투여하여도 치료요법적으로 효과적인 방식으로 종양의 진행을 억제, 저해 또는 감소시키는데 충분하다는 것을 인지해야 한다.

복합 요법에서, 항-EGFR 항체는 또다른 물질의 투여 전, 투여하는 동안, 투여 개시 후에 투여될 수 있고, 뿐만 아니라 이의 임의의 조합, 가령, 항-신형성 물질 요법 전과 요법 동안, 전과 후, 그리고 요법 동안과 요법 후, 또는 요법 전, 요법 동안 및 요법 후에 투여될 수 있다.

예를 들면, 항-EGFR 항체는 방사능 요법 시작 전, 1 내지 30일, 선호적으로 3 일 내지 20 일, 더 선호적으로 5일 내지 12일 사이에 투여될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 화학요법은 항체 요법과 동시에, 또는 더 선호적으로는 항체 요법에 후속적으로 투여된다. 본 발명의 또다른 측면에서, 본 발명의 항-EGFR 항체는 하나 또는 그 이상의 항-신형성 물질 또는 항-신생혈관생성 물질과 화학적으로 또는 생합성적으로 연계될 수 있다.

본 발명은 표적 또는 리포터 모이어티가 연계된 항-EGFR 항체들을 더 고려한다. 표적 모이어티는 결합 쌍들의 제 1 구성요소들이다. 항-신형성 물질들은 예를 들면, 이러한 쌍의 제 2 구성요소들에 접합되고, 이에 의해 항-EGFR 항체가 결합되는 부위로 지향된다. 이러한 결합 쌍의 흔한 예가 아비딘과 바이오틴이다. 바람직한 구체예에서, 바이오틴은 항-EGFR 항체에 접합되고, 이에 의해 항-신형성 물질 또는 다른 모이어티에 대한 표적을 제공하는데, 이들은 아비딘 또는 스트렙트아비딘에 접합된다. 대안으로, 바이오틴 또는 또다른 이러한 모이어티는 본 발명의 항-EGFR 항체에 연계되어, 예를 들면 탐지가능한 신호-생성 물질이 아비딘 또는 스트렙트아비딘에 접합된 진단 시스템에서 리포트로 이용된다.

본 발명의 항-EGFR 항체들이 예방 또는 치료 목적으로 포유동물에서 이용될 때, 약제학적으로 수용가능한 운반체를 추가적으로 포함하는 조성물의 형태로 투여될 수 있다는 것을 이해한다. 적합한 약제학적으로 수용가능한 운반체들은 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 물, 염수, 인산염 완충된 염수, 덱스트로즈, 글리세롤, 에탄올 및 그리고 이와 유사한 것들, 뿐만 아니라 이의 조합을 포함한다. 약제학적으로 수용가능한 운반체들은 결합 단백질들의 반감기 또는 효과를 강화시키는 소량의 보조 물질들 가령 습윤제 또는 유화제, 보존제 또는 완충제를 더 포함한다. 당업계에 공지된 바와 같이, 주사용 조성물은 포유동물에 투여 한 후, 활성 성분의 신속한, 지속적인 또는 지연된 방출을 제공하기 위하여 제형화될 수 있다.

본 발명은 치료요법적으로 유효량의 인간 항-EGFR 항체를 포함하는, 종양 성장 및/또는 신생혈관생성을 억제시키는 키트를 또한 포함한다. 이 키트는 예를 들면, 종양생성 또는 신생혈관생성과 연관된 또다른 성장 인자 수용체의 임의의 적합한 길항제 (예컨데, 상기에서 설명된 것과 같이 EGFR, VEGFR-1/Flt-1, VEGFR-2, PDGFR, NGFR, FGFR, 등)를 더 포함할 수 있다. 대안으로, 또는 추가적으로, 본 발명의 키트들은 항-신형성 물질을 더 포함할 수 있다. 본 발명의 문맥에서 적합한 항-신형성 물질들의 예들은 본 명세서에서 설명되었다. 본 발명의 키트들은 어쥬번트를 더 포함할 수 있는데; 이들의 예는 상기에서 또한 설명되었다.

더욱이, 본 발명의 범위내에는 조사 또는 진단 방법을 위하여 시험관 및 생체내에서 본 항체들의 이용이 포함되는데, 이는 당업계에 잘 공지되어 있다. 진단 방법들은 본 발명의 항체들을 포함하는 키드들이 포함된다.

따라서, 본 수용체 항체들은 조사, 진단, 예방 또는 치료 방법을 위하여 시험관 및 생체내에서 이용될 수 있는데, 당업계에 잘 공지되어 있다. 물론, 본 명세서에서 공개된 원리내에서 다양한 변화들은 당업계 숙련자들에 의해 만들어질 수 있으며, 그리고 이러한 변형들은 본 발명의 범위 내에 속함을 인지하고 예측한다.

이미 설명된 것과 같이 포유동물에게 유효량의 항체를 투여함으로써 포유동물에서 종양성장을 치료하는 방법이 본 발명의 방법에 의해 또한 제공된다. EGFR 신호생성 경로는 다양한 유형의 암의 발생에서 원인 인자로 강력하게 입증되어 왔었다.

본 발명에서, 임의의 적합한 방법 또는 경로를 이용하여 본 발명의 항-EGFR 항체들을 투여하고, 임의선택적으로 항-신형성 물질들 및/또는 다른 수용체들의 길항제들을 공동-투여할 수 있다. 본 발명에 따라 이용되는 항-신형성 물질 섭생들은 환자의 신형성 상태의 치료에 최적인 것으로 간주되는 임의의 섭생을 포함한다. 상이한 악성은 특이적 항-종양 항체들 및 특이적 항-신형성 물질들의 이용을 요구할 수 있는데, 환자에 따라 결정될 수 있다. 투여 경로는 예를 들면, 경구, 정맥내, 복막내, 피하, 또는 근육내 투여를 포함한다. 투여되는 길항제의 약량은 예를 들면, 길항제들의 유형, 치료될 종양의 유형 및 심각성, 그리고 길항제의 투여 경로를 포함하는 다수의 인자들에 따라 달라진다. 그러나, 본 발명은 임의의 특정 투여 방법 또는 경로에 국한되지 않음을 강조한다.

본 발명의 항-EGFR 항체는 접합체로 투여될 수 있는데, 이 접합체는 수용체에 특이적으로 결합하여 리간드-독소 내화(internalization) 이후 독성, 치명적 탑재량을 전달한다. 항체-약물/작은 분자 접합체는 서로 직접적으로 연계될 수 있거나, 또는 펩티드 또는 비-펩티드인 링커를 통하여 서로 연계될 수 있다.

특정 구체예들에서, EGFR에 대한 항원 결합 단백질은 다양한 암을 치료하기 위한 특정 치료제들과 함께 이용된다. 특정 구체예들에서, 상태 및 치료의 바람직한 수준에 근거하여, 2가지, 3가지 또는 그 이상 물질들이 투여될 수 있다. 특정 구체예들에서, 이러한 물질들은 동일한 제제에 포함되어 함께 제공될 수 있다. 특정 구체예들에서, 이러한 물질들은 별도로 제형화되고, 치료 키트에 포함되어 함께 제공될 수 있다. 특정 구체예들에서, 이러한 물질들과 EGFR에 대한 항원 결합 단백질은 별도로 제형화되고, 치료 키트에 포함되어 함께 제공될 수 있다. 특정 구체예들에서, 이러한 물질들은 별도로 제공될 수 있다. 특정 구체예들에서, 유전자 요법에 의해 투여될 때, 단백질 물질들 및/또는 EGFR에 대한 항원 결합 단백질을 인코드하는 유전자들이 동일한 벡터에 포함될 수 있다. 특정 구체예들에서, 단백질 물질들 및/또는 EGFR에 대한 항원 결합 단백질을 인코드하는 유전자들이 동일한 프로모터 영역의 조절하에 있을 수 있다. 특정 구체예들에서, 단백질 물질들 및/또는 EGFR에 대한 항원 결합 단백질을 인코드하는 유전자들이 별도의 벡터들 안에 존재할 수 있다.

특정 구체예들에서, 본 발명은 약제학적으로 수용가능한 희석제, 운반체, 가용화제, 유화제, 보존제 및/또는 어쥬번트와 함께, EGFR에 대한 항원 결합 단백질을 포함하는 제약학적 조성물을 제공한다.

특정 구체예들에서, EGFR에 대한 항원 결합 단백질은 염증용 최소한 하나의 치료제와 함께 이용될 수 있다. 특정 구체예들에서, EGFR에 대한 항원 결합 단백질은 면역 장애용 최소한 하나의 치료제와 함께 이용될 수 있다. 염증 및 면역 장애용 예시적인 치료제는 시클로옥시게나제 유형-1 (COX-1) 및 시클로옥시게나제 유형-2 (COX-2) 억제제들 38 kDa 미토겐-활성화된 단백질 키나제 (p38-MAPK)의 작은 분자 조절물질들; 염증 경로에 관련된 세포내 분자들의 작은 분자 조절물질들(이때 이러한 세포내 분자들은 jnk, IKK, NF-κB, ZAP70, 및 lck을 포함하나 이에 한정되지 않는다)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 염증용 특정 예시적인 치료제들은 예컨데, C.A. Dinarello & L.L. Moldawer Proinflammatory and Anti-Inflammatory Cytokins in Rheumatoid Arthritis: A Primer for Clinicians, 3rd Edition (2001) Amgen Inc., Thousand Oaks, CA에서 설명된다.

특정 구체예들에서, 제약학적 조성물들은 EGFR에 대한 하나 이상의 상이한 항원 결합 단백질을 포함할 것이다. 특정 구체예들에서, 제약학적 조성물들은 EGFR에 대한 하나 이상의 항원 결합 단백질을 포함할 것인데, 이때 EGFR에 대한 이 항원 결합 단백질들은 하나 이상의 에피토프에 결합한다. 일부 구체예들에서, 다양한 항원 결합 단백질들은 EGFR에 결합하는 것에 대해 서로 경쟁하지 않을 것이다. 일부 구체예들에서, 본 명세서에서 설명된 임의의 이 항원 결합 단백질들은 제약학적 조성물 내에서 함께 복합될 수 있다.

특정 구체예들에서, 수용가능한 제형화 물질들은 이용되는 약량 및 농도에서 수용자들에게 바람직하게는 비독성이다. 일부 구체예들에서, 제형화 물질(들)은 s.c. 및/또는 I.V. 투여용이다. 특정 구체예들에서, 제약학적 조성물은 예를 들면, pH, 삼투성, 점성, 투명, 색, 등장성, 냄새, 무균, 안정성, 조성물의 용해 또는 방출, 흡수 또는 침투 속도의 변형, 유지 또는 보존을 위한 제형화 물질들을 포함할 수 있다. 안정성, 특정 구체예들에서, 적합한 제형화 물질들은 아미노산들 (가령 글리신, 글루타민, 아스파라진, 아르기닌 또는 리신); 항균제; 항산화제 (가령 아스코르브산, 아황산나트륨염 또는 수소-아황산 나트륨염); 완충액 (가령 붕산염, 중탄산염, Tris-HCl, 구연산염, 인산염 또는 다른 유기산); 벌크제(가령 만니톨 또는 글리신); 킬레이트제 (가령 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA)); 착화 물질(가령 카페인, 폴리비닐피롤리돈, 베타-시클로덱스트린 또는 히드록시프로필-베타-시클로덱스트린); 충전제; 단당류들; 이당류들; 그리고 기타 탄수화물(가령 포도당, 만노즈 또는 덱스트린); 단백질들 (가령 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로블린); 발색제, 향료 및 희석제; 유화제; 친수성 폴리머들 (가령 폴리비닐피롤리돈); 저분자량 폴리펩티드들; 염-형성 카운터이온들(가령 나트륨); 보존제들 (가령 염화 벤자코니움, 벤조산, 살리실산, 티메로잘, 페닐에틸 알코올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로르헥시딘, 소르브산, 또는 과산화수소); 용매들(가령 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜); 당 알코올 (가령 만니톨 또는 솔비톨); 현탁제; 계면활성제 또는 습윤제 (가령 플루오닉스, PEG, 소르비탄 에스트르, 폴리소르베이트 가령 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 트리톤, 트로메타민, 레시틴, 콜레스테롤, 틸옥사팔); 안정성 강화 물질들(가령 슈크로즈 또는 솔비톨); 강장성 강화 물질들 (가령 알칼리 금속 할로겐화물, 선호적으로 염화 나트륨 또는 염화 칼륨, 만니톨 솔비톨); 운반 비이클; 희석제; 부형제 및/또는 약학적 어쥬번트들(Remington's Pharmaceutical Sciences, 18^th Ed., A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company (1995)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일부 구체예들에서, 제형화는 PBS; 20mM NaOAC, pH 5.2, 50mM NaCl; 및/또는 10mM NAOAC, pH 5.2, 9% 슈크로즈를 포함한다.

특정 구체예들에서, EGFR에 대한 항원 결합 단백질 및/또는 치료요법적 분자는 당업계에 잘 공지되어 있는 반감기 연장 비이클에 연계된다. 이러한 비이클은 폴리에틸렌 글리콜, 글리코겐 (예컨데, 이 항원 결합 단백질의 글리코실화), 및 덱스트란을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이러한 비이클은 예컨데, 미국 출원 번호 09/428,082-현재 미국 특허 제6,660,843호, 그리고 공개된 PCT 출원 번호 WO 99/25044에서 설명되며, 이들 여기에 참고자료로 편입된다.

특정 구체예들에서, 최적의 제약학적 조성물은 예를 들면, 의도된 투여 방식, 운반 형태 및 바람직한 투약량에 따라 당업계 숙련자들에 의해 결정될 것이다. 예컨데, Remington's Pharmaceutical Sciences, 상기와 동일. 특정 구체예들에서, 이러한 조성물들은 본 발명의 항체들의 물리적 상태, 안정성, 생체내 방출 속도 및 생체내 제거 속도에 영향을 줄 수 있다.

특정 구체예들에서, 제약학적 조성물 안에 근본적인 비이클 또는 운반체는 실제 수성 또는 비-수성일 수 있다. 예를 들면, 특정 구체예들에서, 적합한 비이클 또는 운반체는 장관외 투여용으로 조성물에 공통적인 다른 물질들이 바람직하게는 보충된, 주사용 물, 생리적 염 용액 또는 인공적인 뇌척수액이 될 수 있다. 일부 구체예들에서, 이 염수는 등장성 인산염-완충된 염수를 포함한다. 특정 구체예들에서, 중성 완충된 염수 또는 혈청 알부민과 혼합된 염수가 추가 예시적인 비이클이다. 특정 구체예들에서, 제약학적 조성물들은 약 pH 7.0 - 8.5의 트리스 완충액, 또는 약 pH 4.0 - 5.5의 아세테이트 완충액을 포함하며, 이들은 솔비톨 또는 이들의 적합한 치환체를 더 포함한다. 특정 구체예들에서, 최소한 하나의 추가 치료제들과 함께, 또는 추가 치료제 없이, EGFR에 대한 항원 결합 단백질을 포함하는 조성물들은 저장을 위하여 바람직한 순도를 가진 선택된 조성물을 선택적인 제형화 물질과 혼합함으로써, 동결건조된 케이크 또는 수성 용액의 형태로 만들 수 있다 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 상기와 동일). 더욱이, 특정 구체예들에서, 최소한 하나의 추가 치료제들과 함께, 또는 추가 치료제 없이, EGFR에 대한 항원 결합 단백질을 포함하는 조성물들은 적합한 부형제들, 가령 슈크로즈를 이용하여 동결건조물질(lyophilizate)로 제형화될 수 있다.

본 발명과 함께 이용하기 위한 항체들 및 면역-접합체 그리고 억제제들의 약학적 제형은 바람직한 순도를 가진 항체와 선택적으로 약제학적으로 수용가능한 운반체들, 부형제 또는 안정화제를 혼합함으로써 만들어질 수 있다. 이러한 제형은 동결건조된 제형 또는 수성 용액일 수 있다. 수용가능한 운반체들, 부형제들, 또는 안정화제는 이용된 약량 및 농도에서 수용자들에게 비독성이다. 수용가능한 운반체들, 부형제들 또는 안정화제들은 아세테이트, 포스페이트, 시트레이트, 및 기타 유기산; 항산화제 (예컨데, 아스코르브산) 낮은 분자량 폴리펩티드 보존제; 단백질들, 가령 혈청 알부민 또는 젤라틴, 또는 친수성 폴리머들 가령 폴리비닐필로이돈; 그리고 아미노산들, 단당류, 이당류 및 포도당, 만노즈, 또는 덱스트린을 포함하는 기타 탄수화물들; 킬레이트제; 그리고 이온 및 비-이온 계면활성제 (예컨데, 폴리소르베이트); 염-형성 카운트-이온 가령, 나트륨; 금속 복합체(예컨데, Zn-단백질 복합체들); 및/또는 비-이온계 계면활성제일 수 있다. 이 항체는 0.5-200 mg/ml, 또는 10-50 mg/ml 사이의 농도에서 제형화될 수 있다.

제형은 화학치료제, 세포독성 물질들, 사이토킨, 성장 억제 물질, 그리고 항-호르몬 물질을 포함하는, 추가 활성 화합물들을 또한 제공할 수 있다. 활성 성분들은 지속된-방출 조제물(예컨데, 고체 소수성 폴리머들의 반-투과성 매트릭스(예컨데, 폴리에스테르, 하이드로겔 (예를 들면, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락티드로 준비될 수 있다. 항체들과 면역접합체들은 콜로이드성 약물 운반 시스템들 (예를 들면, 리포좀, 알부민 미소구체, 미소유체, 나노-입자들, 그리고 나노캡슐) 또는 거대유체내에서 예를 들면, 코아세르베이션(coacervation) 기술에 의해 또는 접촉면 폴리머화에 의해 준비된 미소캡슐내, 예를 들면, 히드록시메틸셀룰로오즈 또는 젤라틴 미소캡슐 및 폴리-(메틸메타아크릴레이트) 미소캡슐에 각각 또한 포집될 수 있다.

이 조성물들은 치료요법적 또는 예방적 처리를 위하여 투여될 수 있다. 치료요법적 적용에서, 조성물들은 질환(예컨데, 암)을 앓는 환자에게 "치료요법적으로 유효약량"으로 투여된다. 이 경우 효과적인 양은 질환의 중증도 및 환자의 전반적인 건강 상태에 따라 달라질 것이다. 이 조성물들의 단일 또는 다중 투여는 환자가 필요한 그리고 용인하는 약량 및 빈도에 따라 투여될 수 있다. 본 발명의 목적을 위한 "환자" 또는 "개체"는 인간 및 기타 동물들, 특히 포유동물들을 모두 포함한다. 따라서, 이 방법들을 인간 요법 및 수의학적 용도에 모두 적용시킬 수 있다. 바람직한 구체예에서, 환자는 포유동물, 선호적으로 영장류이며, 가장 바람직한 구체예에서, 환자는 인간이다. 기타 공지의 암 요법은 본 발명의 방법들과 조합되어 이용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따른 용도를 위한 조성물들은 세포를 표적으로 하거나, 또는 기타 암 치료제들 가령 SFU, 빈블라스틴, 악티노마이신 D, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 그리고 이와 유사한 것들에 세포를 민감하게 하는데 또한 이용될 수 있다.

특정 구체예들에서, 이 제약학적 조성물은 장관외 운반용으로 선택될 수 있다. 특정 구체예들에서, 이 조성물들은 흡입 또는 소화기관, 가령 경구를 통하여 운반하도록 선택될 수 있다. 이러한 약제학적으로 수용가능한 조성물들의 제조는 당업계 숙련자의 능력 범위내에 있다.

특정 구체예들에서, 제형화 성분들은 투여 부위에 수용가능한 농도로 존재한다. 특정 구체예들에서, 완충액들은 조성물을 생리학적 pH 또는 약간 더 낮은 pH, 전형적으로 약 5 내지 약 8 범위의 pH 내에서 유지시키는데 이용된다.

특정 구체예들에서, 장관외 투여를 고려할 때, 치료요법적 조성물은 약제학적으로 수용가능한 비이클내에서, 추가 치료제와 함께 또는 추가 치료제 없이 EGFR에 바람직한 항원 결합 단백질을 포함하는 발열원-없는, 장관외 수용가능한 수성 용액의 형태가 될 수 있다. 특정 구체예들에서, 장관외 주사용 비이클은 멸균 증류된 물이며, 이때 추가 치료제와 함께와 또는 추가 치료제 없이 EGFR에 바람직한 항원 결합 단백질이 적절하게 보존된 멸균, 등장 용액으로 제형화된다. 특정 구체예들에서, 조제물은 바람직한 분자를 물질, 가령 주사가능한 미소구체, 생-부식가능한 입자들, 폴리머 화합물들 (가령 폴리락트산 또는 폴리글리콜산), 비드 또는 리포좀과의 제형화와 관련될 수 있는데, 이는 데포우 주사를 통하여 운반될 수 있는 산물의 조절된 또는 지속된 방출을 제공한다. 특정 구체예들에서, 히알루론산을 또한 이용할 수 있고, 그리고 이는 순환계에서 지속적인 유지를 촉진하는 효과를 가질 수 있다. 특정 구체예들에서, 이식가능한 약물 운반 장치를 이용하여 바람직한 분자를 도입시킬 수 있다.

특정 구체예들에서, 흡입용 제약학적 조성물이 제형화될 수 있다. 특정 구체예들에서, 최소한 하나의 추가 치료제와 함께 또는 치료제 없이, EGFR에 대한 항원 결합 단백질은 흡입용 건분말로 제형화될 수 있다. 특정 구체예들에서, 최소한 하나의 추가 치료제와 함께 또는 치료제 없이, EGFR에 대한 항원 결합 단백질을 포함하는 흡입용 용액은 에어로졸 전달을 위한 추진체와 함께 제형화될 수 있다. 특정 구체예들에서, 용액은 문무될 수 있다. 폐 투여에 대해서는 PCT 출원 번호 PCT/US94/001875에서 더 설명되며, 이 출원은 화학적으로 변형된 단백질들의 폐 전달을 설명한다.

특정 구체예들에서, 제형은 경구로 투여될 수 있다는 것도 고려된다. 특정 구체예들에서, 이러한 방식으로 투여되는 최소한 하나의 추가 치료제와 함께 또는 치료제 없이, EGFR에 대한 항원 결합 단백질은 고체 투약 형 가령 정제 및 캡슐의 화합물을에 전통적으로 이용되는 운반체들과 함께 또는 운반체들 없이 제형화될 수 있다. 특정 구체예들에서, 캡슐은 생체이용성이 최대화되고, 사전-진신 투여를 최소화 할 때, 위장관내 지점에서 제형의 활성 부분을 방출하도록 설계될 수 있다. 특정 구체예들에서, EGFR에 대한 항원 결합 단백질 및/또는 임의의 추가 치료제제의 흡수를 용이하게 하도록 최소한 하나의 추가 물질이 포함될 수 있다. 특정 구체예들에서, 희석제, 향료, 저융점 밀랍(waxes), 식물성 오일, 윤활제, 현탁제, 정제 붕해 물질들, 그리고 결합제 또한 이용될 수 있다.

특정 구체예들에서, 제약학적 조성물은 최소한 하나의 추가 치료제와 함께 또는 치료제 없이, 그리고 정제의 제조에 적합한 비-독성 부형제들과 혼합되어, EGFR에 대한 항원 결합 단백질의 유효량을 포함할 수 있다. 특정 구체예들에서, 멸균 수, 또는 또다른 적합한 비이클내에 정제를 용해시킴으로써, 용액은 단위 투약 형으로 준비될 수 있다. 특정 구체예들에서, 적합한 부형제들은 비활성 희석제들, 가령 탄산칼슘, 탄산 나트륨 또는 중탄산염, 락토즈, 또는 인산 칼슘; 또는 결합 물질들, 가령 전분, 젤라틴, 또는 아카시아; 또는 윤활성 물질들 가령 스테아레이트 마그네슘, 스테아르산, 또는 활석을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

추가 제약학적 조성물들은 지속적인 또는 조절된 운반 제형에서 최소한 하나의 추가 치료제와 함께 또는 치료제 없이, EGFR에 대한 항원 결합 단백질을 포함하는 제형은 당업계 숙련자들에게 자명할 것이다. 특정 구체예들에서, 기타 다양한 지속적인 또는 조절된 기타 운반 수단들, 가령 리포좀 운반체들, 생체-부식가능한 미립자들 또는 다공성 비드의 제형화 기술 또한 당분야 숙련자들에게 공지되어 있다. 예를 들면, PCT 출원 번호 PCT/US93/00829는 제약학적 조성물들의 운반을 위한 다공성 폴리머 미립자들의 조절된 방출을 설명한다. 특정 구체예들에서, 지속된-방출 조제물은 형태를 갖춘 물건, 예컨데 필름 또는 미소캡슐의 형태로 된 반투성 폴리머 매트릭스를 포함할 수 있다. 지속된 방출 매트릭스는 폴리에스테르, 하이드로겔, 폴리락티드 (U.S. 3,773,919 및 EP 058,481), L-글루타민산 및 감마 에틸-L-글루타메이트의 코폴리머들(Sidman et al., Biopolymers, 22:547-556 (1983)), 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277 (1981) 그리고 Langer, Chem. Tech., 12:98-105 (1982)), 에틸렌 비닐 아세테이트 (Langer et al., 상기와 동일) 또는 폴리-D(-)-3-히드록시부틸산 (EP 133,988)을 포함한다. 특정 구체예들에서, 지속된 방출 조성물들은 리포좀을 또한 포함할 수 있는데, 이는 당업계에 잘 공지되어 있는 임의의 몇 가지 방법들에 의해 준비될 수 있다. 예컨데, Eppstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688-3692 (1985); EP 036,676; EP 088,046 및 EP 143,949 참고.

생체내 투여에 이용되는 제약학적 조성물은 일반적으로 살균상태다. 특정 구체예들에서, 살균 여과 막을 통한 여과에 의해 이루어질 수 있다. 특정 구체예들에서, 조성물이 동결건조된 경우, 이 방법을 이용하는 살균은 동결건조(lyophilization) 및 재구성 전 또는 후에 실시될 수 있다. 특정 구체예들에서, 장관외 투여용 조성물은 동결건조된 형태 또는 용액에 보관될 수 있다. 특정 구체예들에서, 장관외 조성물들은 일반적으로 멸균 접근 포트를 보유한 용기, 예를 들면, 피하 주사 바늘로 찌를 수 있는 마개를 가진 정맥내 용액 주머니 또는 바이알내에 위치된다.

특정 구체예들에서, 일단 제약학적 조성물이 제형화되었을 때, 용액, 현탁 겔, 유체, 고체로써 멸균 바이알 내에 보관되거나, 또는 탈수된 또는 동결건조된 분말로 보관될 수 있다. 특정 구체예들에서, 이러한 제형은 바로-사용할 수 있는 형태(ready-to-use form) 또는 투여전 재구성되는 형태(예컨데, 동결건조된)로 보관될 수 있다.

특정 구체예들에서, 단일-투약량 투여 단위(single-dose administration unit)를 만드는 키트가 제공된다. 특정 구체예들에서, 키트는 건조된 단백질을 담고 있는 제 1 용기와 수성 제형을 담고 있는 제 2 용기를 모두 포함할 수 있다. 특정 구체예들에서, 단일 및 다중-실로된 사전에 채워진 주사기(예컨데, 액체 주사기 및 리소시린지(lyosyringes))를 보유하는 키트들이 포함된다.

특정 구체예들에서, 최소한 하나의 추가 치료제와 함께 또는 치료제 없이, EGFR에 대한 항원 결합 단백질을 포함하는, 치료요법적으로 이용되는 제약학적 조성물의 유효량은 예를 들면, 치료요법적 배경 및 목적에 따라 달라질 것이다. 당업계 숙련자는 치료를 위한 적합한 투약량(dosage) 수준을 인지할 것이며, 특정 구체예들에 따르면, 운반되는 분자, 최소한 하나의 추가 치료제와 함께 또는 치료제 없이, EGFR에 대한 항원 결합 단백질이 이용되는 징후, 투여 경로, 환자의 체격(체중, 체표면 또는 장기 크기) 및/또는 상태(나이 및 전반적인 건강)에 따라 부분적으로 달라질 것이다. 특정 구체예들에서, 임상의는 최적의 치료요법적 효과를 획득하기 위하여 투약량을 적정하고, 투여 경로를 변경시킬 수 있다. 특정 구체예들에서, 전형적인 투약량은 상기 언급된 인자들에 따라, 약 0.1 ㎍/kg 내지 최대 약 100 mg/kg 또는 그 이상의 범위가 될 수 있다. 특정 구체예들에서, 투약량은 0.1 ㎍/kg 내지 최대 약 100 mg/kg; 또는 1 ㎍/kg 내지 최대 약 100 mg/kg; 또는 5 ㎍/kg 내지 최대 약 100 mg/kg의 범위가 될 수 있다.

특정 구체예들에서, 투약의 빈도는 이용되는 제형에서 EGFR에 대한 항원 결합 단백질 및/또는 임의의 추가 치료제들의 약력학적 매개변수를 고려해야 할 것이다. 특정 구체예들에서, 임상의들은 바람직한 효과를 획득하는 투약량에 도달할 때까지 조성물을 투여할 것이다. 특정 구체예들에서, 따라서, 이 조성물은 단일 투여량으로 투여되거나, 또는 시간을 두고 2회 또는 그 이상의 투약량(바람직한 분자의 동일한 양을 포함하거나 또는 포함하지 않을 수 있다)을 투여하거나, 또는 이식 장치 또는 카테테르를 통한 연속 주입으로 투여할 수 있다. 적합한 투약량의 더 세밀한 고려는 당업계 숙련자들에 의해 통상적으로 이루어지며, 이들이 실행하는 통상적인 작업 범위내에 있다. 특정 구체예들에서, 적합한 투약량은 적합한 약량-반응 데이터를 통하여 확인될 수 있다.

특정 구체예들에서, 제약학적 조성물의 투여 경로는 공지된 방법에 따르는데, 예컨데 경구, 정맥내, 복막내, 대뇌 내(실질세포내), 뇌혈관내, 근육내, 피하내, 안구내, 동맥내, 문맥내(intraportal), 또는 병소내 경로를 통한 주사; 지속된 방출 시스템들을 통하여 또는 이식 장치를 통한 것이다. 특정 구체예들에서, 조성물들은 급속 주입(bolus injection) 또는 주입에 의해 연속적으로, 또는 이식 장치를 통하여 투여될 수 있다.

특정 구체예들에서, 조성물은 바람직한 분자들이 흡수된 또는 포집된 막, 스폰지, 또는 또다른 적합한 물질의 이식을 통하여 국소적으로 투여될 수 있다. 특정 구체예들에서, 이식 장치들이 이용될 때, 장치는 임의의 적합한 조직 또는 장기로 이식되며, 바람직한 분자는 확산, 시간이 되면 방출되는 환약(bolus), 또는 연속 투여를 통하여 운반된다.

특정 구체예들에서, 생체외(ex vivo) 방식으로 최소한 하나의 추가 치료제와 함께 또는 치료제 없이, EGFR에 대한 항원 결합 단백질을 포함하는 제약학적 조성물을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 경우들에서, 환자로부터 제거된 세포들, 조직 및/또는 장기들은 최소한 하나의 추가 치료제와 함께 또는 치료제 없이, EGFR에 대한 항원 결합 단백질을 포함하는 제약학적 조성물에 노출되고, 그 다음 세포들, 조직 및/또는 장기들은 환자에게 후속적으로 다시 이식된다.

특정 구체예들에서, EGFR에 대한 항원 결합 단백질 및/또는 임의의 추가 치료제들은 이 폴리펩티드들을 발현시키고, 분비되도록 하기 위하여, 가령, 본 명세서에서 설명된 방법들을 이용하여, 유전공학적으로 조작된 특정 세포들을 이식함으로써 운반될 수 있다. 특정 구체예들에서, 이러한 세포들은 동물 또는 인간 세포들일 수 있으며, 자가(autologous), 이형성(heterologous) 또는 이종성(xenogeneic)일 수 있다. 특정 구체예들에서, 이 세포들은 불사화(immortalized)될 수 있다. 특정 구체예들에서, 면역학적 반응의 기회를 감소시키기 위하여, 세포들은 주변 조직의 침투를 회피하도록 포집화될 수 있다. 특정 구체예들에서, 포집(encapsulation) 물질들은 전형적으로 단백질 산물들의 방출은 허용하지만, 환자의 면역계에 의한, 또는 주변 조직으로부터 임의의 해로운 인자들에 의한 세포들의 파괴를 막는, 생체적합성, 반-투성 폴리머 봉입물 또는 막이 된다.

진단적 용도(Diagnostic Applications)

일부 구체예들에서, 본 명세서에서 설명된 이 항원 결합 단백질들은 EGFR의 수준 변화와 연관된 질환 또는 장애를 스크리닝/진단하기 위하여 포유류 조직 또는 세포들에서 EGFR를 탐지하기 위한 분석 키트 및/또는 방법에 이용되거나 또는 제공된다. 키트는 EGFR에 결합하는 항원 결합 단백질, 그리고 EGFR이 존재하는 경우, EGFR에 항원 결합 단백질의 결합 및 선택적으로 EGFR 단백질 수준을 나타내는 수단들을 포함한다. 항원 결합 단백질의 존재를 나타내는 다양한 수단들이 이용될 수 있다. 예를 들면, 형광단(fluorophores), 기타 분자 탐침(probes), 또는 효소들이 이 항원 결합 단백질에 연계될 수 있고, 다양한 방식으로 이 항원 결합 단백질의 존재를 관찰할 수 있다. 이러한 장애들을 스크리닝하는 방법들은 키트를 이용하거나, 또는 공개된 항원 결합 단백질들중 하나를 단순히 이용하고, 그리고 이 항원 결합 단백질이 시료내 EGFR에 결합하는 지를 판단하는 것을 포함할 수 있다. 당업계 숙련자들이 인지할 수 있는 것과 같이, EGFR의 높은 수준 또는 상승된 수준은 시료 안에 EGFR에 대한 이 항원 결합 단백질의 더 많은 결합을 초래할 것이다. 따라서, 항원 결합 단백질 결합의 정도는 시료 안에 얼마나 많은 양의 EGFR가 존재하는 지를 판단하는데 이용될 수 있다. 예상된 양(예컨데, EGFR 관련된 장애가 없는 사람이 가지는 양 또는 범위)보다 많은 EGFR의 양을 가진 개체들 또는 시료들은 EGF 및/또는 EGFR 중개된 장애를 보유하는 것으로 특징을 지을 수 있다.

파니투무마브, 그리고 각 돌연변이체들의 관련 아미노산 및 핵산 서열들은 표 2에 제시된다.

다음의 명세서는 당업계 숙련자가 본 발명을 실시할 수 있는데 충분한 것으로 보인다. 전술한 설명 및 실시예들은 본 발명의 특정 바람직한 구체예들을 상세히 설명하고, 발명자들에 의해 고려되는 최적의 방식을 설명한다. 그러나, 전술한 내용이 단락에서 얼마나 상세하게 나타났는지에 관계없이, 본 발명은 다양한 방식으로 실시될 수 있으며, 본 발명은 첨부된 청구범위 및 이의 등가범위에 따른 것으로 간주되어야 함을 인지할 것이다.

실행된 실험 및 얻은 결과들을 포함하는 다음의 실시예들은 본 발명의 설명을 위한 목적으로만 제공된 것이며, 본 발명을 한정시키는 것으로 간주되어서는 안된다.

실시예 1

돌연변이생성(Mutagenesis)

파니투무마브의 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열 (서열번호 1 & 2)을 돌연변이 생성의 출발 물질로 이용하였다. PCR 프라이머는 Quik Change II XL® 부위 지향적 돌연변이 생성 키트(Stratagene (Now Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA))를 이용하여 부위 지향적 돌연변이생성을 실시하도록 설계되었다. 제조업자의 프로토콜에 따라, 올리고뉴클레오티드들을 이용하여 PCR 반응들을 설정하였고, XL-Gold 울트라-성분 세포들을 형질변환시키는데 이용되었다. 그 다음 이들 세포들을 TIM 선택적 플레이트에 도말하였다. 플레이트들을 37℃에서 하룻밤 두어, 콜로니 형성이 되도록 하였다. 각 구조체로부터 2개의 콜로니를 선택하여 TIM 플레이트에 다시-스트리크(streak)하였다. 그 다음 각 구조체의 한 개 콜로니를 맥시프레프(maxipreps)용으로 설정하였다. 맥시프레프(maxipreps)를 서열화하였고, 100% 정합(match)되었다. 맥시프레프(maxiprep) 상에서 Sal I-Not I 절단(digests)을 실시하여 관심 단편들을 선택하였다. 2개의 제한절단(restriction) 말단을 Sal I-Not I 절단된 pDC414에 결찰시켰다. 새로운 결찰들은 DH10B 컴피턴트(competent) 세포들안으로 형질도입되었고, TIM 선택 플레이트 상에 도말되었다. 플레이트들을 37℃에서 하룻밤 두어, 콜로니 형성이 되도록 하였다. 삽입 테스트를 위하여 몇 가지 콜로니들이 절단되었다. 각 돌연변이에 대해 한 개의 맥시프레프(maxipreps)를 만들었다: pDC414-AMG954 Asp92-Glu, 및 pDC414-AMG954 Asp92-Asn. 이 맥시프레프(maxipreps)를 서열화하였고, 100% 정합(match)되었다. 맥시프레프(maxipreps)는 293(E) 세포들을 이용하여 일시적으로 형질감염되었다. 이 세포들을 7일간 배양하고, 그 다음 수확하였다. 발현된 항체들은 단백질 A 컬럼 및 표준 기술들을 이용하여 상청액으로부터 정제되었다.

엔도프로테네이즈 Lys-C 및 트립신 펩티드 맵(Maps)

그 다음 생성된 분자는 변성되고, 환원되며, 그리고 설퍼히드릴은 알킬화된다. 환원된-알킬화된 분자는 겔 여과에 의해 탈염화되고, 효소적으로 탈글리코실화된다. 환원된-알킬화된-탈글리코실화 분자는 Lys-C 또는 트립신 엔도프로테네이즈으로 절단되었다. 반응을 식히고, 생성된 단편들은 Lys-C 절단의 경우 폴리머 컬럼 (Grace-Vydac, Deerfield, IL)에서, 그리고 트립신에 의한 절단의 경우 UPLC BEH 아미드 컬럼(Waters, Milford, MA)을 이용하여 아세토니트릴/TFA 그래디언트에서 역상 HPLC에 의해 분리되었다. 펩티드 용리는 UV 탐지로 모니터되었다. Lys-C 펩티드 지도에 의해 탐지된 Vectibix® (파니투무마브) D92 이성질체화 결과는 도 1에 제시된다.

실시예 2

구조적 모델

Vectibix® (파니투무마브)의 구조는 Molecular Operating Environment (MOE) 소프트웨어(Chemical Computing Group, Montreal, Canada)를 이용하여 분서되었다. 이성질체화는 MOE 내에 필수 원자 결합을 파괴하고, 형성시켜 손으로 모델화되었다. 특이적 돌연변이들은 MOE 모델화 소프트웨어 안에 만들어진 돌연변이 능력을 이용하여 모델화되었다. 결과는 도 2에 제시된다.

실시예 3

가속화된(Accelerated) 안정성 연구

Vectibix® (파니투무마브)의 안정성 연구는 50 mM의 아세테이트 나트륨 및 100 mM의 염화 나트륨, pH 5.8, 37℃에서 6개월간 실행되었다. 이성질체화를 가속화시키기 위하여, 돌연변이체들은 10mM 글루타민산, 2.6% w/v 글리세롤, pH 5.0로 완충액 교환되었고, 4주간 50℃에서 상승된 온도를 겪게 되었다. 결과는 도 3에 제시된다.

실시예 4

생물학적 분석(Bioassays)

포스포릴화(Phosphorylation) 생물학적 분석. 이용된 포스포릴화 생물학적 분석은 EGF 수용체의 EGF 유도된 티로신 포스포릴화 탐지에 근거하였다. Vectibix® (파니투무마브)는 EGF 수용체에 결합하여, EGF 결합을 억제시키고, 따라서 수용체 포스포릴화를 억제시킨다. 세포 표면 EGF 수용체를 발현시키는 A431 세포들은 고정된 양의 EGF와 변화된 양의 Vectibix®과 함께 미량적정 플레이트에서 항온처리되었다. 이 세포들은 용해되고, 가용성 EGF 수용체들은 항-EGF 수용체 항체로 피독된 제 2 미량적정 ELISA 플레이트 상에서 포집되었다. 포스포릴화된 EGF 수용체들은 HRP에 접합된 항-포스포티로신 항체 접합체와 발색 기질의 추가에 의해 탐지되었다. 그 다음 색의 발달은 흡수 플레이트 판독기를 이용하여 측정되었다. 상대적 강도는 평행 선 분석에 의해 측정되었다.

유전자 발현 생물학적 분석. 32D MRE-1/S#13 세포들은 10% FBS, 5 ng/mL mIL-3, 500 ug/mL G418, 및 700 ug/mL 히그로마이신-B를 포함하는 Glutamax™과 함께 RPMI 1640 배지에서 현탁 배양으로 성장되었다. 사용될 세포들의 분석 플라스크는 성장 배지 성분들을 제거하기 위하여 원심분리와 인산염 완충된 염수로 세척함으로써, 준비되었다. 그 다음 세포들은 분석 배지(Glutamax™, 1% FBS를 포함하는 RPMI 1640)에서 8E + 05 세포들/mL으로 재현탁되었다.

참조 표준, 대조군, 그리고 테스트 시료들은 분석 배지에서 440 ng/mL로 희석되었다. 참조 표준, 대조군, 그리고 테스트 시료의 일련의 희석물은 440 내지 87 ng/mL 범위 농도가 되도록 준비되었다. 이러한 희석물을 준비한 후, 고정된 농도의 TGF-α 동량을 각 튜브에 첨가하였다. 분석 웰내 최종 농도는 세포 추가 후, 110 내지 22 ng/mL의 Vectibix®이었다.

분석은 4개의 96-웰 플레이트와 부분적으로 무작위화된 시료 배치 계획을 이용하였다. TGF-α 스파이크와 혼합된 항체의 각 일련의 희석물 25μL를 분석 웰에 추가하였다. 분석 배지 25 μL를 세포 블랭크(blanks)로 삼을 세포 웰에 추가하였다. 분석 배지 50 μL를 배지 블랭크로만 삼을 배지에 추가하였다. 25 μL의 TGF-α스파이크 대조군은 배경 웰에 추가하였다(TGF-α 스파이크 조절). 모든 표준, 대조군 시료, 테스트 시료, 배경 그리고 세포만 있는 웰들은 8E + 05 세포들/mL에서 25 μL의 32D MRE-1/S #13 세포 현탁액을 제공받았다. 플레이트는 37℃/5% CO₂ 가습 배양기에서 3.5 ± 0.5 시간 동안 항온처리되었다.

항온처리 기간 후, 플레이트를 배양기로부터 빼내고, 10-20분간 실온으로 냉각시켰다. 50 μL의 SteadyGlo® (이 세포들을 용해시키기 위하여 세제, 그리고 루시퍼레이즈의 기질인 루시페린을 포함하는 시약 칵테일)을 각 웰에 첨가하였다. 분석 플레이트는 빛의 노출을 최소화시키기 위하여 덮개를 덮고, 30-120분간 실온에서 항온처리되었다. 발광 신호는 발광계를 이용하여 정량화되었다. 테스트 시료 활성은 참조 표준으로부터 획득한 반응에 대해 테스트 시료 반응을 비교하여 결정되었다.

데이터는 평행선 분석을 이용하여 분석되었다. 조절된 회계처리프로그램(spreadsheet)은 대조군과 참조 표준과 비교되는 각 테스트 시료의 경우 95% 신뢰 한계로 상대적 능력을 계산되었다. 회계처리프로그램은 참조 표준 대 조절 테스트 시료에 대해 분산 분석(ANOVA)을 작성하여 상대적 능력을 계산하였다. 시료에 대해 3가지 독립적인 분석으로부터 3가지 유효한 측정이 획득된다면, 조절된 회계처리프로그램을 이용하여 per USP <111>으로써 가중된 평균 결과를 계산하였다.

결과는 도 4에 제시된다.

SEQUENCE LISTING <110> Guo, Amy <120> NOVEL ANTIGEN BINDING PROTEINS <130> A-1628-US-NP <150> 61/473,014 <151> 2011-04-07 <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 445 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Panitumumab heavy chain (gamma) amino acid sequence, (including Fc Portion) <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly 20 25 30 Asp Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly His Ile Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Thr Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr 85 90 95 Cys Val Arg Asp Arg Val Thr Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu 210 215 220 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln 260 265 270 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300 Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 2 <211> 214 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Panitumumab light chain (kappa) amino acid sequence <400> 2 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln His Phe Asp His Leu Pro Leu 85 90 95 Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 3 <211> 214 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Panitumumab light chain (kappa) amino acid sequence with "E" mutation <400> 3 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln His Phe Glu His Leu Pro Leu 85 90 95 Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 4 <211> 214 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Panitumumab Light Chain (Kappa) amino acid sequence with "N" mutation <400> 4 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln His Phe Asn His Leu Pro Leu 85 90 95 Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Light chain kappa variable region CDR 3 amino acid sequence with "E" mutation <400> 5 Gln His Phe Glu His Leu Pro Leu Ala 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Light chain kappa variable region CDR 3 amino acid sequence with "N" mutation <400> 6 Gln His Phe Asn His Leu Pro Leu Ala 1 5 <210> 7 <211> 705 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Light chain (kappa) nucleic acid sequence with "92E" mutation <400> 7 atgagggtcc ctgctcagct cctggggctc ctgctgctct ggctctcagg tgccagatgt 60 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 120 atcacttgcc aggcgagtca ggacatcagc aactatttaa attggtatca gcagaaacca 180 gggaaagccc ctaaactcct gatctacgat gcatccaatt tggaaacagg ggtcccatca 240 aggttcagtg gaagtggatc tgggacagat tttactttca ccatcagcag cctgcagcct 300 gaagatattg caacatattt ctgtcaacac tttgagcatc tcccgctcgc tttcggcgga 360 gggaccaagg tggagatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 420 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 480 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 540 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 600 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 660 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 705 <210> 8 <211> 705 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Light chain (kappa) nucleic acid sequence with "92N" mutation <400> 8 atgagggtcc ctgctcagct cctggggctc ctgctgctct ggctctcagg tgccagatgt 60 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 120 atcacttgcc aggcgagtca ggacatcagc aactatttaa attggtatca gcagaaacca 180 gggaaagccc ctaaactcct gatctacgat gcatccaatt tggaaacagg ggtcccatca 240 aggttcagtg gaagtggatc tgggacagat tttactttca ccatcagcag cctgcagcct 300 gaagatattg caacatattt ctgtcaacac tttaatcatc tcccgctcgc tttcggcgga 360 gggaccaagg tggagatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 420 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 480 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 540 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 600 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 660 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 705 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Light chain kappa variable region CDR3 nucleic acid sequence with "E" mutation <400> 9 caacactttg agcatctccc gctcgct 27 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Light chain kappa variable region CDR3 nucleic acid sequence with "N" mutation <400> 10 caacacttta atcatctccc gctcgct 27

Claims (37)

1. 서열번호 3의 경쇄 및 서열번호 1의 중쇄를 포함하고, EGF (Epidermal Growth Factor, 상피 성장 인자)에 대한 EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor, 상피 성장 인자 수용체)의 결합을 감소시키는 항원 결합 단백질.
2. 제1항에 있어서, 단클론성 항체 또는 이의 단편인 항원 결합 단백질.
3. 제1항에 있어서, 인간 항체, 인간화된 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체, 또는 이의 단편인 항원 결합 단백질.
4. 제3항에 있어서, 인간 항체인 항원 결합 단백질.
5. EGFR에 결합하고, 아미노산 서열 SGDYYWT를 갖는 CDR-H1, 아미노산 서열 HIYYSGNTNYNPSLKS를 갖는 CDR-H2, 및 아미노산 서열 RVTGAFDI를 갖는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 아미노산 서열 QASQDISNYLN를 갖는 CDR-L1, 아미노산 서열 DASNLET를 갖는 CDR-L2, 및 아미노산 서열 QHFEHLPLA를 갖는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 이의 단편.
6. 제5항에 있어서, 단클론성 항체 또는 이의 단편인 항체 또는 이의 단편.
7. 제5항에 있어서, 인간 항체, 인간화된 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체, 또는 이의 단편인 항체 또는 이의 단편.
8. 제5항에 있어서, 인간 항체인 항체 또는 이의 단편.
9. 아미노산 서열 QASQDISNYLN를 갖는 CDR-L1, 아미노산 서열 DASNLET를 갖는 CDR-L2, 및 아미노산 서열 QHFEHLPLA를 갖는 CDR-L3 을 포함하는 경쇄 및 서열번호 1의 중쇄를 포함하고, EGF에 대한 EGFR의 결합을 감소시키는 항원 결합 단백질.
10. 제1항 내지 제4항 및 제9항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 항원 결합 단백질 또는 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 단편, 및
    약제학적으로 수용가능한 부형제
    를 포함하는 암의 치료 또는 예방용 제약학적 조성물.
11. 제10항에 있어서, 방사능동위원소, 방사성핵종, 독소, 치료제, 또는 화학치료제를 더 포함하는 제약학적 조성물.
12. 제10항에 있어서, 결장직장 암의 치료 또는 예방용 제약학적 조성물.
13. 제11항에 있어서, 결장직장 암의 치료 또는 예방용 제약학적 조성물.
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