CN108690137A - M8Sac71抗体及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种M8Sac71抗体，其制备方法为：(一)MARCH8Sac71肽段的合成：制备MARCH8Sac71肽段，该肽段的氨基酸序列如下所示：Ac‑T(Sac)ITPSSQDICRICHCEGDC‑NH2；(二)MARCH8Sac71肽段与BSA或KLH偶联；(三)免疫兔子制备抗体；(四)抗体的纯化：上述得到的血清，先利用非乙酰化肽段进行负筛选，再利用MARCH8Sac71肽段进行正筛选，得抗体，即为M8Sac71抗体。本发明的M8Sac71抗体，通过dot‑blot和竞争性实验证明了M8Sac71抗体的特异性，并进一步证明与丝氨酸乙酰化酶YopJ共转的MARCH8乙酰化水平大大提高，印证了M8Sac71抗体的有效性，可应用于检测MARCH8上的71位丝氨酸位点是否被乙酰化。

Description

M8Sac71抗体及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种丝氨酸乙酰化抗体，具体涉及一种针对71位丝氨酸位点被乙酰化的MARCH8的抗体，及其制备方法与应用。
背景技术
MARCH8是一个由291个氨基酸组成的膜相关的E3泛素连接酶，可以靶向MHC II(HLA-DP，DQ，DR，HLA-DO，HLA-DM)]、共刺激分子CD86(B7-2)和CD8139]、黏附分子CD44、凋亡相关分子Fas(CD95)、Trail R、细胞运输分子TfR、IL-1receptor accessory protein等多种跨膜分子，通过泛素化、内吞作用及溶酶体降解途径下调这些分子的表面呈递，调控抗原提呈、T细胞活化、细胞凋亡与细胞运输。已知71位和75位丝氨酸(S)以及237位的酪氨酸(Y)是磷酸化位点，252位的赖氨酸(K)是泛素化位点，但MARCH8上是否有乙酰化位点尚未见报道。
本发明的发明人用质谱检测发现，MARCH8可以在71位、253位等多处丝氨酸位点被乙酰化，代表着MARCH8上的一种新的修饰形式，可能对MARCH8的功能有重要影响。但是如何证明这些乙酰化的存在，尚需制备针对这些位点的特异性抗体。
发明内容
针对上述现有技术，针对丝氨酸乙酰化抗体的缺乏，本发明提供了一种特异性好的M8Sac71抗体(所述M8Sac71是指71位丝氨酸位点被乙酰化了的MARCH8)，并设计了一套制备M8Sac71抗体的方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种M8Sac71抗体的制备方法，包括以下步骤：
(一)MARCH8 Sac71肽段的合成：制备MARCH8Sac71肽段(71位丝氨酸乙酰化肽段)，该肽段的氨基酸序列如下所示：
Ac-T(Sac)ITPSSQDICRICHCEGDC-NH2；
同时，制备非乙酰化肽段(未修饰肽段)，该肽段的氨基酸序列如下所示：
Ac-TSITPSSQDICRICHCEGDC-NH2。
(二)MARCH8 Sac71肽段与BSA(牛血清白蛋白)或KLH偶联：将上述合成的MARCH8Sac71肽段与BSA或KLH偶联，得偶联产物。偶联的具体操作步骤为常规技术手段。
优选的，MARCH8 Sac71肽段与BSA偶联的具体方法如下：
将BSA配成10mg/ml的溶液；sulfo-SMCC【4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐】用0.5×purification buffer配成10mg/ml的溶液，50℃孵育几分钟，使溶液澄清；
按0.5ml BSA+750μl sulfo-SMCC的比例配置偶联试剂，室温静置数分钟后，37℃孵育30min，期间轻轻振摇数次透析，用Conjugation buffer做透析液，透析1h，换透析液，再透析1h(透析过程中不要剧烈搅动，以免透析袋破裂)；透析结束后，小心将袋内液体吸到15ml离心管中，用Conjugation buffer补足到1.5ml，加入0.5ml的含有MARCH8 Sac71肽段的液体(肽段的浓度为10mg/ml)，混匀后，室温反应4h；
用Purification buffer透析1h，换透析液，透析过夜(所述过夜是指8～12h，下同)，吸出透析后偶联产物，用0.5ml的Purification buffer洗涤一次，合并于一个管中；取4μl用BCA法测浓度，确定是否偶联上，8％SDS-PAGE电泳，观察偶联结果；偶联产物经适当稀释(比如稀释至1mg/ml)后，过滤除菌，分装，冻存于-80℃备用。
(三)免疫兔子制备抗体，包括以下步骤：
(1)第一次免疫(0day)：用偶联产物免疫兔子，免疫方式为：四肢腹侧4处注射，每只兔子的用量为：400μg/只的偶联产物。
进一步地，具体的免疫方式如下：取400μg/只偶联产物与弗氏完全佐剂按1:1(V:V)混合，乳化(注射器推打1h，乳化液打到水中不扩散即可)，免疫兔子，免疫方式为：四肢腹侧4处注射。
(2)第二次免疫(28day)：第28天，进行第二次免疫，免疫方式为：四肢腹侧4处注射，每只兔子的用量为：200μg/只的偶联产物。
进一步地，具体的免疫方式如下：取200μg/只偶联产物与弗氏不完全佐剂按1:1(V:V)混合，乳化(注射器推打1h，乳化液打到水中不扩散即可)，免疫兔子，免疫方式为：四肢腹侧4处注射。
(3)第三次免疫(49day)：第49天，进行第三次免疫，免疫方式为：静脉注射，每只兔子的用量为：400μg/只的偶联产物。
进一步地，具体的免疫方式如下：取400μg/只偶联产物与适当体积的PBS缓冲液混合，免疫兔子，免疫方式为：静脉注射。
(4)采血：第59～61天，兔子耳缘静脉取血，经ELISA检测效价符合要求(效价>1:1000)后，颈总动脉采血,制备血清。
(四)抗体的纯化：上述得到的血清，先利用非乙酰化肽段进行负筛选，再利用MARCH8 Sac71肽段进行正筛选，得抗体，即为M8Sac71抗体。纯化的原理为现有技术，操作步骤为常规技术手段。
上述方法制备得到的M8Sac71抗体，经试验证明，特异性好，能有效检测71位丝氨酸位点被乙酰化了的MARCH8，可应用于检测MARCH8上的71位丝氨酸位点是否被乙酰化。
本发明具有以下优点：不同于传统的赖氨酸乙酰化，丝氨酸乙酰化的基团是羟基而非氨基，其免疫原性较弱，而且目前没有丝氨酸的Pan-乙酰化抗体，制备靶蛋白特异性抗体也因为较难合成丝氨酸乙酰化肽段而增加了难度。本发明合成了丝氨酸乙酰化肽段——Sac71肽段，与BSA偶联以后，免疫新西兰大白兔，制得针对M8Sac71的抗血清，再通过负筛选与正筛选得到M8Sac71抗体，通过dot-blot和竞争性实验证明了M8Sac71抗体的特异性，并进一步证明与丝氨酸乙酰化酶YopJ共转的MARCH8乙酰化水平大大提高，印证了M8Sac71抗体的有效性。
本发明建立了有效制备弱修饰抗原的多克隆抗体的免疫程序与纯化程序，通过皮下与静脉联合给予抗原法获得效价较好的抗血清，建立了卓有成效的免疫程序。再通过首先用非乙酰化肽段进行负筛选去掉了与非乙酰化肽段结合的组分(必要的时候可以再进行一次负筛选)，然后用乙酰化肽段进行正筛选的纯化程序，成功钓到与乙酰化肽段结合的抗体，避免了先用正筛选所造成的乙酰化结合位点被抢占而纯化不到有效抗体的缺陷。另外，我们选用了BSA与KLH做载体，结果BSA载体成功制备了有效的M8Sac71抗体，而KLH载体的结果不甚理想。M8Sac71抗体的有效性与特异性破除了丝氨酸乙酰化抗体难于制备的魔咒，证明经过合适的免疫程序与纯化程序，弱修饰抗原的抗体制备同样可以成功。
本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义；若提及的术语和短语有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
附图说明
图1：Sac71合成肽段的质谱图。
图2：乙酰化肽段与载体BSA、KLH偶联的SDS-PAGE电泳示意图，其中，M：低分子量蛋白marker；B:BSA；B253：BSA与Sac253偶联产物；B71：BSA与Sac71偶联产物；K：KLH；K253：KLH与Sac253偶联产物；K71：KLH与Sac71偶联产物。
图3：Sac71抗体的特异性实验结果示意图，其中，
a：斑点杂交实验结果；两个乙酰化肽段Ac-T(Sac)ITPSSQDICRICHCEGDC-NH2(Sac71),Ac-KS(ac)PLTEPNFEN KC-NH2(Sac253)和非乙酰化肽段Ac-TSITPSSQDICRICHCEGDC-NH2(S71),Ac-KSPLTEPNFENKC-NH2(S253)被点到NC膜上，用Sac71和IRDye680-conjugated goat anti-rabbit IgG抗体检测，Sac71抗体仅识别Sac71肽段。
b：斑点杂交竞争实验结果；乙酰化Ac-T(Sac)ITPSSQDICRICHCEGDC-NH2(Sac71)和非乙酰化肽段Ac-TSITPSSQDICRICHCEGDC-NH2(S71)被点到NC膜上，用Sac71抗体或预先与Sac71肽段、S71肽段预孵育的Sac71抗体检测，与Sac71肽段预孵育的点杂交信号被竞争掉而与S71肽段预孵育则保留了点杂交信号。
c：western blot竞争实验结果；转染截短体March8的HeLa细胞抽提物用Flag抗体进行免疫沉淀，SDS-PAGE分离，用Sac71抗体(左侧)或Flag抗体(右侧)进行western blot检测，与乙酰化肽段Sac71的预孵育完全竞争掉了ΔM8信号，而与非乙酰化肽段S71的预孵育只竞争掉一小部分信号。M：蛋白分子量标准。
图4：M8Sac71抗体的有效性检测结果示意图；MARCH8单转及MARCH8与YopJ共转HeLa细胞后，用Flag抗体做免疫沉淀后，用Flag抗体(上栏)检测MARCH8表达水平，用M8Sac71抗体(下栏)检测MARCH8乙酰化水平。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
实施例1M8Sac71抗体的制备与检测
一、材料与仪器：
(1)Purification buffer：
磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O)，29.01g；
磷酸二氢钠(NaH2PO4.2H2O)，2.964g；
氯化钠，9.00g；
ddH2O至1L，pH＝7.4。
(2)Conjugation buffer：Purification bu+5mM EDTA。
(3)5mg BSA，Sigma A1933。
(4)Sulfo-SMCC(5mg/ml)Thermo Scientific#22322,50mg。
(5)弗氏完全佐剂与弗氏不完全佐剂：Sigma产品。
(6)密封度较好的玻璃注射器(10ml)。
(7)手术器械：手术刀、剪、镊子数套。
(8)动脉夹，采血管，注射器等。
(9)麻醉剂：水合氯醛(10％)。
(10)ELISA相关试剂：0.1MNa2CO3(PH＝9.6)，TBST等。
(11)IRDye 680或IRDye 800标记的羊抗兔抗体。
(12)sulfolink coupling gel slurry。
二、抗体的制备与检测：
(一)MARCH8 Sac71肽段的合成：制备MARCH8 Sac71肽段(71位丝氨酸乙酰化肽段)，该肽段的氨基酸序列如下所示：
Ac-T(Sac)ITPSSQDICRICHCEGDC-NH2；
同时，制备非乙酰化肽段，该肽段的氨基酸序列如下所示：
Ac-TSITPSSQDICRICHCEGDC-NH2。
上述MARCH8Sac71肽段的设计原理为：根据质谱确定的修饰位点，选择30-40AA的肽段，用肽段设计程序检索，选择抗原性好、修饰位点靠近N端的肽段，设计合成修饰、未修饰肽段如下：Ac-T(Sac)ITPSSQDICRICHCEGDC-NH2,Ac-TSITPSSQDICRICHCEGDC-NH2；交由上海吉尔公司合成后(常规方法合成)。
(二)MARCH8Sac71肽段与BSA(牛血清白蛋白)或KLH偶联：将上述合成的MARCH8Sac71肽段与BSA或KLH偶联，得偶联产物。
MARCH8Sac71肽段与BSA偶联的具体方法如下：
将BSA配成10mg/ml的溶液；sulfo-SMCC【4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐】用0.5×purification buffer配成10mg/ml的溶液，50℃孵育几分钟，使溶液澄清；
按0.5ml BSA+750μl sulfo-SMCC的比例配置偶联试剂，室温静置数分钟后，37℃孵育30min，期间轻轻振摇数次透析，用Conjugation buffer做透析液，透析1h，换透析液，再透析1h(透析过程中不要剧烈搅动，以免透析袋破裂)；透析结束后，小心将袋内液体吸到15ml离心管中，用Conjugation buffer补足到1.5ml，加入0.5ml的含有MARCH8 Sac71肽段的液体(肽段的浓度为10mg/ml)，混匀后，室温反应4h；
用Purification buffer透析1h，换透析液，透析过夜，吸出透析后偶联产物，用0.5ml的Purification buffer洗涤一次，合并于一个管中；取4μl用BCA法测浓度，确定是否偶联上，8％SDS-PAGE电泳，观察偶联结果(结果如图2所示)；偶联产物经适当稀释(稀释至1mg/ml)后，过滤除菌，分装，冻存于-80℃备用。
MARCH8 Sac71肽段与KLH偶联的方法同上。
同时，以Sac253与BSA、KLH的偶联作为对照。结果如图2所示。
Sac253的氨基酸序列为：Ac-KS(ac)PLTEPNFEN KC-NH2，由上海吉尔公司合成(常规方法合成)。
(三)免疫兔子制备抗体，用MARCH8 Sac71肽段与BSA的偶联产物免疫兔子，步骤如下：
(1)第一次免疫(0day)：用偶联产物免疫兔子，免疫方式为：四肢腹侧4处注射，每只兔子的用量为：400μg/只的偶联产物。
具体的免疫方式如下：取400μg/只的偶联产物与弗氏完全佐剂按1:1(V:V)混合，乳化(注射器推打1h，乳化液打到水中不扩散即可)，免疫兔子，免疫方式为：四肢腹侧4处注射。
(2)第二次免疫(28day)：第28天，进行第二次免疫，免疫方式为：四肢腹侧4处注射，每只兔子的用量为：200μg/只的偶联产物。
具体的免疫方式如下：取200μg/只的偶联产物与弗氏不完全佐剂按1:1(V:V)混合，乳化(注射器推打1h，乳化液打到水中不扩散即可)，免疫兔子，免疫方式为：四肢腹侧4处注射。
(3)第三次免疫(49day)：第49天，进行第三次免疫，免疫方式为：经脉注射，每只兔子的用量为：400μg/只的偶联产物。
具体的免疫方式如下：取400μg/只的偶联产物与适量PBS混合，免疫兔子，免疫方式为：静脉注射。
(4)采血测抗体效价(59～61day)：第59～61天，兔子耳缘静脉取血，ELISA法检测抗体效价超过1:1000。颈总动脉采血，收集血清。
ELISA法检测抗体效价的具体方式如下：
①抗原包被(原则是：偶联KLH的肽段制备的抗体用BSA偶联肽段包被，偶联BSA肽段制备的抗体用KLH偶联肽段包被)：取冻存于-80℃的抗原，冰上解冻后，取55μl抗原(浓度1mg/ml)，加1050μl Na2CO3溶液(浓度0.1M)，混匀后，稍离心，每孔50μl于酶标板上，1000rpm离心1min后，置4℃冰箱过夜；
②用TBST洗板5次；
③每孔加200μl 5％BSA-TBST，37℃封闭2h以上；
④准备血清系列稀释液(1:100to 1:400,000),每孔加50μl稀释的血清，每个稀释度做3个复孔；
⑤37℃孵育1h；
⑥用TBST洗板5次；
⑦加Li-Cor IRDye 680羊抗兔二抗，37℃孵育1h；
⑧用TBST洗板5次；
⑨用Odyssey扫描仪扫描各孔的荧光强度；
(四)抗体的纯化：
准备两个管子，修饰与未修饰肽段(指步骤一中合成的MARCH8 Sac71肽段及非乙酰化肽段)各一个；
(1)吸2ml sulfolink coupling gel slurry到每个15ml管中；
(2)加5ml coupling buffer，颠倒混匀；
(3)1000g，3min，弃上清；
(4)重复(2)～(3)三次；
(5)肽段的溶解：合成肽段10mg加50μl乙腈，450μl coupling buffer溶解，从中取400μl用coupling buffer稀释至2ml后与sulfolink coupling gel混合；
(6)4℃振摇30min,室温放置1h；
(7)1000g 3min,吸上清1μl测浓度；
(8)在沉淀中加5ml coupling buffer,RT 30min,颠倒混匀数次；
(9)1000g 3min,弃上清；
(10)重复(2)～(3)两次；
(11)加L-cysteine(PH＝8.5)到sulfolink coupling gel中，混匀；
(12)RT 30min；
(13)1000g 3min,弃上清；
(14)加5ml 1M NaCl,1000g 3min,弃上清,重复4次；
(15)加5ml PBS,1000g 3min,弃上清,重复4次；
(16)加2ml PBS,4℃保存备用；
(17)负筛选：待纯化血清先过未修饰肽段的柱子，收集滤过成分(注意血清加入量要合适，不能过多)；
(18)正筛选：取负筛选的滤过成分，再过修饰肽段的柱子，过两遍，用0.2MGlycine(PH＝2.8)洗脱，滤过液接到含150μl 1M Tris(PH＝8.8)的管子中，每管约接0.5ml；滤过液用BCA法测浓度，合并吸光度高的管子，用PBS透析过夜后，测浓度，4℃保存备用。
(五)抗体的鉴定：
dot-blot实验：
(1)点膜：将乙酰化与非乙酰化肽段稀释为2μg/μl,然后依次按1:3稀释5个梯度，每个稀释度取1μl点到NC膜上，80℃烤干2h；
(2)封闭：5％BSA RT 1h；
(3)抗体孵育：待测抗体用1:1000或1:2000稀释，与膜共育,RT 2h或4℃过夜；
(4)二抗孵育：加Li-cor IRDye 680羊抗兔二抗，37℃孵育1h；
(5)TBST洗三次后，用Odyssey扫描仪扫膜；
竞争实验(competition assay)：
(1)dot-blot的竞争实验：与dot-blot实验过程相同，不同的是，所孵育的抗体先与5:1,1:1,1:5的乙酰化肽段37℃孵育1h,同时设未竞争对照，5:1非乙酰化肽段共育对照，然后与点有乙酰化肽段的膜共育；假如与乙酰化肽段的共育，dot-blot信号被竞争掉，证明抗体是乙酰化特异的；
(2)特异性蛋白的竞争实验：与MARCH8的western blotting过程相同，不同的是一抗孵育前需先与5:1,1:1,1:5的乙酰化肽段37℃孵育1h,同时设未竞争对照，5:1非乙酰化肽段共育对照，然后与转有MARCH8的膜共育；假如与乙酰化肽段的共育竞争掉大部分的MARCH8信号，而与非乙酰化肽段共育保留了大部分的乙酰化信号，则证明抗体是乙酰化特异且靶蛋白特异的。
以Sac253及S253作为对照。
所述S253的氨基酸序列为：Ac-KSPLTEPNFENKC-NH2，，由上海吉尔公司合成(常规方法合成)。
(六)M8Sac71抗体检测MARCH8乙酰化：
(1)样品的处理：与YopJ共转的或MARCH8单转的MARCH8真核表达细胞抽提物免疫沉淀后，用PBS洗4次后，加20μl 2×凝胶上样缓冲液,煮沸后上样；
(2)电泳：积层胶电压60V，分离胶电压120V，直至溴酚蓝到达胶的低端；
(3)转膜：电泳结束后，将胶浸泡在转膜缓冲液中，转膜夹子从黑面开始，依次铺上海绵、滤纸、凝胶、NC膜、滤纸、海绵，用玻璃管赶走气泡，200mA湿转1h；
(4)封闭：转膜结束后，NC膜用TBS漂洗5min,于5％BSA或脱脂奶粉中封闭1-2h；
(5)封闭结束后，将膜转移至一抗溶液(M8Sac71抗体)中，4℃过夜；
(6)TBST洗膜三次，每次5min后，将膜转移至二抗(IRDye 680标记的羊抗兔抗体)溶液中，室温(RT)避光震荡1h；
(7)TBST避光洗膜三次后，用Odessey扫描仪扫膜。
三、结果：
(1)M8Sac71乙酰化肽段的成功合成：本发明合成了包含71位丝氨酸乙酰化的肽段Ac-T(Sac)ITPSSQDICRICH CEGDC-NH2，经质谱鉴定乙酰化肽段纯度在90％以上，肽段的二级质谱图见图1，从图中可以看出，b3离子的出现证明TSI上有两个乙酰化修饰，而Y19的出现锁定了两个修饰是在T和S上。
(2)BSA与乙酰化肽段的偶联：从图2可以看出，Sac71与Sac253(对照肽段)与BSA及KLH均偶联成功。
(3)M8Sac71抗体的鉴定：
合成肽段与载体BSA偶联成功后，免疫新西兰大白兔。所得抗血清用ELISA法测定其效价大于1:10000(BSA抗体效价在1:10000～1:100000，而KLH抗体效价在1:1000～1:10000，1:10000信号很低)；取效价高的抗血清，先用非乙酰化肽段(Ac-TSITPSSQDICRICHCEGDC-NH2)进行负筛选，然后用乙酰化肽段进行正筛选。正筛选洗脱下来的血清用斑点杂交(dot-blot)与蛋白MARCH8的western-blot竞争实验确定抗体特异性。在斑点杂交实验中，MARCH8Sac71抗体特异性地识别Sac71肽段，但不识别同一位点的非修饰肽段S71，也不识别其他位点的乙酰化肽段(图3a)。在竞争实验中，Sac71肽段有效竞争掉了点杂交的阳性信号，但同一位点的非修饰肽段则对点杂交的阳性信号基本无作用(图3b)。
为检测MARCH8乙酰化，本发明将MARCH8截断体与YopJ共转染HeLa细胞，用Flag抗体做免疫沉淀，用Sac71抗体做western-blot，在孵育抗体前，抗体分别与BSA、Sac71肽段及非乙酰化肽段S71预孵育30分钟，再进行正常的western-blot实验，乙酰化的阳性信号被Sac71肽段有效竞争掉，而S71肽段的竞争仅对乙酰化阳性信号有微弱影响(图3c)，这证明了MARCH8Sac71抗体的特异性。
(4)M8Sac71抗体检测MARCH8的乙酰化水平：
YopJ是迄今为止所知的唯一丝氨酸乙酰化酶，为证明M8Sac71抗体的有效性，本发明建立了MARCH8单转和MARCH8与YopJ共转HeLa细胞体系，用Flag抗体免疫沉淀MARCH8蛋白，并用Flag抗体做western-blot，检测MARCH8的表达水平，用M8Sac71抗体检测MARCH8乙酰化水平，结果如图4所示，与丝氨酸乙酰化酶YopJ共转后，MARCH8的71位丝氨酸乙酰化水平明显提高，证明了M8Sac71抗体的有效性。
给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。本说明书引述的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，如同这些出版物、专利和专利申请各自特别地和个别地表明通过引用并入本文。

Claims (9)

1.一种M8Sac71抗体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(一)MARCH8 Sac71肽段的合成：制备MARCH8 Sac71肽段，该肽段的氨基酸序列如下所示：
Ac-T(Sac)ITPSSQDICRICHCEGDC-NH2；
(二)MARCH8 Sac71肽段与BSA或KLH偶联：将上述合成的MARCH8 Sac71肽段与BSA或KLH偶联，得偶联产物；
(三)免疫兔子制备抗体，包括以下步骤：
(1)第一次免疫(0day)：用偶联产物免疫兔子，免疫方式为：四肢腹侧4处注射，每只兔子的用量为：400μg/只的偶联产物；
(2)第二次免疫(28day)：第28天，进行第二次免疫，免疫方式为：四肢腹侧4处注射，每只兔子的用量为：200μg/只的偶联产物；
(3)第三次免疫(49day)：第49天，进行第三次免疫，免疫方式为：静脉注射，每只兔子的用量为：400μg/只的偶联产物；
(4)采血：第59～61天，兔子耳缘静脉取血，经ELISA检测效价符合要求后，颈总动脉采血,制备血清；
(四)抗体的纯化：上述得到的血清，先利用非乙酰化肽段进行负筛选，再利用MARCH8Sac71肽段进行正筛选，得抗体，即为M8Sac71抗体；所述非乙酰化肽段的氨基酸序列如下所示：
Ac-TSITPSSQDICRICHCEGDC-NH2。
2.根据权利要求1所述的M8Sac71抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤(二)中，MARCH8 Sac71肽段与BSA偶联的具体方如下：
将BSA配成10mg/ml的溶液；sulfo-SMCC【4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐】用0.5×purification buffer配成10mg/ml的溶液，50℃孵育几分钟，使溶液澄清；
按0.5ml BSA+750μl sulfo-SMCC的比例配置偶联试剂，室温静置数分钟后，37℃孵育30min，期间轻轻振摇数次透析，用Conjugation buffer做透析液，透析1h，换透析液，再透析1h；透析结束后，小心将袋内液体吸到15ml离心管中，用Conjugation buffer补足到1.5ml，加入0.5ml的含有MARCH8 Sac71肽段的液体(肽段的浓度为10mg/ml)，混匀后，室温反应4h；
用Purification buffer透析1h，换透析液，透析过夜，吸出透析后偶联产物，用0.5ml的Purification buffer洗涤一次，合并于一个管中；偶联产物经适当稀释后，过滤除菌，分装，冻存于-80℃备用。
3.根据权利要求1所述的M8Sac71抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤(三)(1)中，具体的免疫方式为：400μg/只偶联产物与弗氏完全佐剂按1:1混合，乳化，免疫兔子，免疫方式为：四肢腹侧4处注射。
4.根据权利要求1所述的M8Sac71抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤(三)(2)中，进一步地，具体的免疫方式如下：取200μg/只偶联产物与弗氏不完全佐剂按1:1混合，乳化，免疫兔子，免疫方式为：四肢腹侧4处注射。
5.根据权利要求1所述的M8Sac71抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤(三)(3)中，具体的免疫方式为：取400μg/只偶联产物与适量的PBS缓冲液混合，免疫兔子，免疫方式为：静脉注射。
6.根据权利要求1所述的M8Sac71抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤(三)(4)中，所述经ELISA检测效价符合要求是指效价>1:1000或效价>1:10000。
7.根据权利要求1所述的M8Sac71抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤(四)中，抗体的纯化的具体方式如下：
准备两个管，MARCH8 Sac71肽段及非乙酰化肽段各一个；
(1)吸2ml sulfolink coupling gel slurry到每个15ml管中；
(2)加5ml coupling buffer，颠倒混匀；
(3)1000g，3min，弃上清；
(4)重复(2)～(3)三次；
(5)肽段的溶解：合成肽段10mg加50μl乙腈，450μl coupling buffer溶解，从中取400μl用coupling buffer稀释至2ml后与sulfolink coupling gel混合；
(6)4℃振摇30min,室温放置1h；
(7)1000g 3min,吸上清1μl测浓度；
(8)在沉淀中加5ml coupling buffer,RT 30min,颠倒混匀数次；
(9)1000g 3min,弃上清；
(10)重复(2)～(3)两次；
(11)加L-cysteine(PH＝8.5)到sulfolink coupling gel中，混匀；
(12)RT 30min；
(13)1000g 3min,弃上清；
(14)加5ml 1M NaCl,1000g 3min,弃上清,重复4次；
(15)加5ml PBS,1000g 3min,弃上清,重复4次；
(16)加2ml PBS,4℃保存备用；
(17)负筛选：待纯化血清先过非乙酰化肽段的柱子，收集滤过成分；
(18)正筛选：取负筛选的滤过成分，再过MARCH8 Sac71肽段的柱子，过两遍，用0.2MGlycine(pH＝2.8)洗脱，滤过液接到含150μl 1MTris(pH＝8.8)的管子中，每管约接0.5ml；滤过液用BCA法测浓度，合并吸光度高的管子，用PBS透析过夜后，测浓度，4℃保存备用。
8.利用权利要求1～7中任一项所述的M8Sac71抗体的制备方法制备得到的M8Sac71抗体。
9.权利要求8所述的M8Sac71抗体在检测MARCH8上的71位丝氨酸位点是否被乙酰化中的应用。
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