CN102030824A - 一种乙型肝炎病毒x蛋白单克隆抗体及用途 - Google Patents

Abstract

一种乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)单克隆抗体，其特征是对HBx N-端表位或C-端表位有特异性反应，对载体蛋白匙孔血蓝蛋白(KLH)和HBV其他的表达蛋白无反应。该单抗的制备方法是通过HBx N-端和C-端抗原表位多肽分别与KLH的交联途径免疫接种小鼠、与骨髓瘤细胞融合而筛选获得的，可用于各种HBx蛋白或HBx抗体的免疫检测试剂和导向性治疗药物，应用于乙肝病毒(HBV)感染和肝细胞癌(HCC)等疾病诊断和治疗。

Description

一种乙型肝炎病毒X蛋白单克隆抗体及用途

技术领域

本发明涉及一种单克隆抗体，具体地说，是一种乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)特异性的单克隆抗体，以及该单克隆抗体在制备HBx免疫检测试剂和肝病治疗药物中的用途。

背景技术

我国是乙型肝炎病毒(HBV)感染高发地区，超过10％的人携带乙肝病毒。HBV感染是引发肝纤维化、肝硬化和肝癌等肝病的主要因素。在我国，目前约80％的肝细胞癌(HCC)患者合并乙型肝炎病毒(HBV)感染，HBV感染者发生HCC的危险性是无感染者的200余倍。

最新的研究显示，HBV X蛋白(HBx)具有广泛的基因转录调控作用，与慢性HBV感染者发展成为HCC密切相关^[1，2]。X基因位于HBV基因组的1374-1836位置，编码155个氨基酸的多肽，即HBV X蛋白(HBx)^[3，4]。X基因常随HBV基因组一同整合于肝细胞的染色体中，利用宿主细胞转录和翻译体系合成HBx。HBx具有广泛的基因转录调控作用，不仅能够激活病毒基因调控序列，而且能够与宿主细胞多种蛋白相互作用，从而影响宿主细胞周期、影响细胞增殖分化与凋亡、使肝细胞发生恶性转化。HBx可与转录因子XPA-1、DDB1、RPB5和TFIIB结合，以提高基因转录水平、抑制DNA的修复、促进病毒自身复制；HBx还具有反式激活作用，可上调多种细胞因子及其受体，如血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素样生长因子(IGF)及其受体的表达；激活C-myt、N-ras等癌基因，与抑癌基因p53结合，抑制P53的核转移及正常的转录调节功能。此外，HBx还可上调HepG-2的细胞端粒酶活性，改变抑癌基因p55负调控功能，抑制细胞凋亡，四细胞发生恶性转化，与HCC的发生密切相关^[5，6]。近几年，国外研究显示，在40％HBV感染者和60-70％HCC患者的血清中可检测到HBx或HBx抗体^[7，8]。国内已有用HBxd单抗用于肝癌放射免疫显像诊断和治疗的研究^[9，10]。血清HBx水平可能成为急慢性乙型肝炎、肝硬化，尤其是肝癌实验室诊断的良好指标。

血清免疫学测定方法是检测HBx水平的最有效方法。HBx单克隆抗体的筛选和制备是免疫检测HBx的必要条件。目前，HBx单克隆抗体的制备方法多采用基因工程表达并分离HBx全长蛋白作为免疫动物和筛选单克隆抗体的抗原，存在HBx自身免疫原性较弱，获得单克隆抗体效率低的问题。

参考文献：

[1]范红梅，杨林.乙型肝炎X蛋白的生物学功能研究进展.国际流行病学传染病学杂志，2006，33(2)：100～103

[2]彭玉莲.乙型肝炎病毒X蛋白与肝细胞癌.实用医学杂志，2008，24(14)：2536～2539

[3]Tang H，Delgermaa L，Huang FJ，et al.The transcriptional transactivation function of HBxprotein is important for its augmentation role in hepatitis B virus replication.J Virol，2005，79(9)：5548～5556

[4]Koike K，Tsutsumi T，Fujie H，et al.Molecular mechanism of viral hepatocarcinogenesis.JOncology，2002，61(1)：29～37

[5]Zhang XD，Zhang H，Ye LH.Effects of hepatitis B virus X protein on the development of livercancer.J Lab Clin Med，2006，147(2)：58～66

[6]Tang H，Oishi N，Kaneko Shuichi，et al.Molecular functions and biological roles of hepatitisB virus X protein.Cancer Sci，2006，97(10)：977～983

[7]Hwang GY，Lin CY，Huang LM，et al.Detection of the hepatitis B virus X protein(HBx)antigenand anti-HBx antibodies in cases of human hepatocellular carcinoma.J Clin Microbiology，2003，41(12)：5598～5603

[8]Pal JO，Nyarady Z，Marczinovits I，et al.Comprehensive regression analysis of hepatitisB virus X antigen level and anti-HBx antibody titer in the sera of patients with HBV infection.Pathology Oncology Research，2006，12(1)：34～40

[9]左强，张军一，陈锦章，罗荣城.131I标记抗CD20单克隆抗体在荷瘤裸鼠内的放射免疫显像。肿瘤防治研究，2007，34(7)：473-477

[10]李君，汤献猷，刘康达，等.抗HBx单抗用于肝癌导向治疗的实验研究。当代肿瘤学杂志，1995，2(1)：13-17

发明内容

本发明目的之一是提供HBx蛋白的单克隆抗体，所述的单克隆抗体对HBx N-端或C-端有特异性反应，对载体蛋白匙孔血蓝蛋白(KLH)和其他的HBV表达蛋白无反应。

本发明目的之二是提供HBx N-端和C-端抗原表位多肽通过与载体蛋白——匙孔血蓝蛋白(KLH)的交联激发免疫反应，筛选、制备HBx单克隆抗体的方法，所述的HBx N-端抗原表位多肽和C-端抗原表位多肽是人工化学合成的分别为多肽序列1(SEQ 1)和多肽序列2(SEQ 2)所示的HBx蛋白N-端11-20位氨基酸序列PARDVLCLRP和HBx蛋白C-端127-150位氨基酸序列I RLKVFVLGGCRHKLVCSPAPCNF多肽。

本发明目的之三是提供HBx单克隆抗体在制备HBx蛋白或HBx抗体免疫检测试剂的应用方法，所述的HBx蛋白和HBx抗体免疫检测试剂盒是以HBx单克隆抗体为主要材料，与酶、同位素、生物素、荧光物质和高分子微球等标记物质结合制备的各种酶联免疫吸附(ELISA)、增强化学发光、放射免疫检测(RIA)、免疫比浊、免疫组织化学(IHC)、免疫荧光(IF)和免疫印迹(WB)等各种免疫检测试剂。

本发明目的之四是提供HBx单克隆抗体在制备放射免疫显像诊断试剂和免疫导向治疗药物的应用方法，所述的放射免疫显像诊断试剂是用¹³¹I、¹⁶¹Tb、¹⁵³Sm或¹⁸⁶Re等放射性同位素标记的HBx单克隆抗体，此标记抗体注射到体内后，会选择性聚结在肝脏HBx阳性组织，用电子发射断层扫描仪(ECT)或正电子发射断层扫描仪(PECT)显像，用于HBV感染、肝硬化和肝癌等疾病的诊断方法；所述的免疫导向治疗药物是用¹³¹I、¹⁶¹Tb、¹⁵³Sm、¹⁸⁶Re等放射性同位素或细胞毒素标记的HBx单克隆抗体，此标记抗体注射到体内后，会因单抗选择性聚结在HBx阳性肝癌病灶组织局部而产生的导向性抗肿瘤治疗作用。

实现上述目的的具体方案是：

本发明涉及的免疫原——HBx N-端和C-端抗原表位多肽的合成是在对HBx蛋白氨基酸序列的抗原表位进行分析的基础上，采用人工化学合成方法合成如多肽序列1(SEQ 1)和多肽序列2(SEQ 2)所示的两条HBx N-端和C-端抗原表位多肽。

为提高复合多肽的免疫原性，本领域通用的方法是分别用HBx N-端和C-端抗原表位多肽与载体蛋白交联，以便更好地激发免疫反应，获得单克隆抗体。载体蛋白包括匙孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或其他一些免疫原性较高的大分子蛋白。本发明优选匙孔血蓝蛋白(KLH)作为HBx抗原表位多肽的载体蛋白。

动物免疫方法采用HBx表位多肽和KLH的交联蛋白加完全福氏佐剂充分混匀，皮下注射法免疫接种BAL B/C小鼠，每只小鼠背部皮下分多点注射共100μg抗原。2周后，用交联蛋白加不完全福氏佐剂加强免疫1次，3周后再加强免疫1次。在确认小鼠已激发产生抗HBx抗体后，分离小鼠脾脏细胞与同系小鼠骨髓瘤融合，HAT选择培养基筛选能分泌HBx单克隆抗体的杂交瘤细胞。上述方法是示例性的，同样可以用复合多肽和KLH交联蛋白免疫接种到大鼠、兔、羊和鸡等其他动物激发产生分泌抗体的浆细胞(免疫细胞)，与同系动物骨髓瘤细胞融合，筛选获得分泌HBx单克隆抗体的其他种属杂交瘤细胞。

小鼠浆细胞与骨髓瘤细胞的融合按常规方法操作。具体来说，无菌取脾脏，400目筛网过滤制备成细胞悬液，按5∶1的比例与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0混合进行细胞融合，融合促进剂为50％聚乙二醇4000(PEG₄₀₀₀)，细胞培养基为含HAT的10％胎牛血清RPMI1640选择培养基。除上述常规细胞融合方法外，可以选择电穿孔(点击)融合方法，也可以选择仙台病毒(HVJ)作为融合促进剂，或添加二甲亚砜(DMSO)等增效剂，也能达到获得杂交瘤细胞的目的。

杂交瘤细胞克隆化培养采用有限稀释法获得单克隆杂交瘤细胞。用来源于BALB/C小鼠的巨噬细胞作为饲养细胞先接种于96孔板，然后每种杂交瘤细胞按每孔10、5、1个细胞接种于铺有饲养细胞的96孔板中，置5％CO2培养箱37℃培养。4-5天半量换液，2周左右可用ELISA法测定HBx单抗。

杂交瘤细胞和HBx单克隆抗体的筛选采用ELISA法来测定和筛选。用分别包被有HBx N-端和C-端抗原表位多肽的微孔板测定HBx抗体，以单纯饲养细胞培养上清作阴性对照；以包被有匙孔血蓝蛋白(KLH)的微孔板鉴别抗KLH抗体，以剔除抗KLH单克隆抗体。只有抗HBx阳性、抗KLH阴性杂交瘤细胞用作进一步筛选培养。

HBx单克隆抗体的制备与纯化可采用二条途径。一是从杂交瘤细胞体外培养上清中收集；二是将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中，从小鼠腹水中收集。前一种方法适用于获取少量高纯度抗体，后一种方法适合大量获取抗体。获取的抗体溶液可以用盐析、凝胶过滤、亲和层析等方法进行纯化。本发明优选硫酸铵——辛酸盐析沉淀法进行纯化。

本发明所涉及的HBx单克隆抗体与其他单克隆抗体的用途一样，可用于制备各种HBx蛋白和HBx抗体的免疫检测试剂，包括酶联免疫吸附(ELISA)、增强化学发光(ECL)、放射免疫检测(RIA)、免疫比浊(IT)、免疫组织化学(IHC)、免疫荧光(IF)和免疫印迹(WB)等各种免疫检测试剂。ELISA检测试剂及基于ELISA的增强化学发光检测试剂是目前临床上最常用的免疫检测试剂，其通用的制备方法是选用两株分别与HBx N-端和C-端抗原表位反应的单克隆抗体，一株作为捕获抗体，一株作为检测抗体。其中检测抗体用辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)标记。检测HBx蛋白时用捕获抗体包被微孔板，酶标抗体为检测抗体；检测HBx抗体时用抗人IgG抗体包被微孔板，加入HBx抗原和酶标抗体。ELISA检测试剂用四甲基联苯胺(TMB)、或邻苯二胺(OPD)或其他化学显色底物显色，用酶标仪测定结果；增强化学发光检测试剂用化学发光底物鲁米诺(luminol)显示结果，用化学发光检测仪测定结果。本发明涉及的HBx单克隆抗体还可以用任何已知的方法与同位素、生物素、荧光物质和高分子微球等标记物质结合，制备成放射免疫检测(RIA)、免疫组织化学(IHC)、免疫荧光(IF)和免疫比浊(IT)检测试剂。

本发明所涉及的HBx单克隆抗体也可应用于制备放射免疫显像诊断试剂和免疫导向治疗药物。通用的方法是，用¹³¹I、¹⁶¹Tb、¹⁵³Sm或¹⁸⁶Re等放射性同位素标记单克隆抗体制备放射免疫显像诊断试剂，标记抗体注射到体内后，会选择性聚结在肝脏HBx阳性组织，用电子发射断层扫描仪(ECT)或正电子发射断层扫描仪(PECT)显像，用于HBV感染、肝硬化和肝癌等疾病的诊断；用¹³¹I、¹⁶¹Tb、¹⁵³Sm、¹⁸⁶Re等放射性同位素或细胞毒素标记单克隆抗体制备免疫导向治疗药物，标记抗体注射到体内后，会因单抗选择性聚结在HBx阳性肝癌病灶组织局部而产生导向性抗肿瘤治疗作用。还有一种新的方法是应用基因扩增和基因重组技术对HBx单克隆抗体可变区eDNA基因进行扩增和重组，获得人源性HBx单克隆抗体、单链抗体等基因工程抗体药物，可直接注射到体内用于原发性肝癌治疗。

本发明的突出特点是通过化学合成方法分别HBx N-端和C-端抗原表位多肽，并与载体蛋白——匙孔血蓝蛋白(KLH)交联途径来免疫动物，筛选获得HBx单克隆抗体。所获得的单克隆抗体分别是HBx N-端表位特异性反应抗体和C-端抗原表位特异性反应抗体，有利于通过双抗体夹心方法制备各种用于HBx蛋白或HBx抗体检测的ELISA和化学发光免疫检测试剂。

附图说明：

附图1.Western免疫印迹分析HBx N-端表位单克隆抗体N2F2的特异性。Lane1：阴性对照肝细胞HepG2裂解液；lane2：HBV基因转染肝细胞HepG2.2.15裂解液；lane3：HBx N-端抗原表位多肽；lane4：单纯匙孔血蓝蛋白(KLH)；lane5：HBx C-端表位合成多肽。如图所示，HBx N-端表位单克隆抗体对HBx N-端抗原表位多肽和肝细胞HepG2.2.15表达HBx蛋白有较高的特异性反应(显示单一条带)，而不与单纯匙孔血蓝蛋白(KLH)，HBx表达阴性肝细胞HepG2和HBx C-端表位合成多肽发生反应。

附图2.Western免疫印迹分析HBx C-端表位单克隆抗体C3B2的特异性。Lane1：阴性对照肝细胞HepG2裂解液；lane2：HBV基因转染肝细胞HepG2.2.15裂解液；lane3：HBx C-端抗原表位多肽；lane4：单纯匙孔血蓝蛋白(KLH)；lane5：HBx N-端抗原表位合成多肽。如图所示，HBx C-端表位单克隆抗体对HBx C-端抗原表位多肽和肝细胞HepG2.2.15表达HBx蛋白有较高的特异性反应(显示单一条带)，而不与单纯匙孔血蓝蛋白(KLH)，HBx表达阴性肝细胞HepG2和HBx N-端抗原表位合成多肽发生反应。

具体实施方式

实例一、HBx单克隆抗体的筛选

1.HBx N-端和C-端抗原表位多肽的合成：采用Antigenic Peptides抗原表位分析在线软件，对HBx蛋白氨基酸序列的抗原表位进行分析。结果显示，HBx蛋白N-端11-20位氨基酸序列PARDVLCLRP和HBx蛋白C-端127-150位氨基酸序列IRLKVFVLGGCRHKLVCSPAPCNF是抗原表位指数较高的区段。采用人工或化学合成方法分别合成如多肽序列1(SEQ 1)和多肽序列2(SEQ 2)所示的HBx N-端和C-端抗原表位多肽。

2.HBx N-端或C-端抗原表位多肽与载体蛋白匙孔血蓝蛋白(KLH)的交联：用水溶解马来酰亚胺活化的匙孔血蓝蛋白(KLH)maKLH(美国Themo Scientific公司产品)，使其浓度为10mg/ml，取200μl maKLH与400μl 10mg/ml的抗原表位多肽磷酸缓冲液(PBS)混合，迅速混匀，室温放置2小时使二者交联形成共价复合物。将交联产物移至孔径为1KD的微量透析管内，对PBS透析2-3次以去除金属螯合剂EDTA，最后用PBS调节交联物至10mg/ml年度。

3.免疫动物：首次接种取100μl交联物与100μl完全福氏佐剂充分混合，免疫接种BALB/C小鼠4-5只，每只小鼠背部皮下分2点接种20μl共100μg抗原，接种前同时取尾静脉血作为阴性对照；14天后取100μl交联物与100μl不完全福氏佐剂充分混合，小鼠皮下免疫接种，同时取尾静脉血ELISA法测定HBx抗体滴度；21天后取100μl交联物与100μl不完全福氏佐剂充分混合，小鼠皮下免疫接种，同时取尾静脉血ELISA法测定HBx抗体滴度；如果21天抗体滴度还不够高，于28天再次取100μl交联物与100μl不完全福氏佐剂充分混合，小鼠皮下免疫接种，同时取尾静脉血EIA法测定HBx抗体滴度。

4.鼠脾细胞与杂交瘤细胞的融合与培养：末次免疫后第3天，无菌取脾脏，在400目的筛网碾磨过筛，RPMI1640基础培养基冲洗制备成细胞悬液，1000rpm低速离心弃上清，加入含10％胎牛血清的RPMI1640完全培养基，调节细胞密度为10⁷/ml，取1ml细胞按5∶1的比例与2×10⁶小鼠SP2/0骨髓瘤细胞混合，低速离心弃上清，用手指弹匀沉淀细胞，在37℃水浴中逐滴加入预热的50％聚乙二醇4000(PEG4000)，边加边混匀，2分钟后加入10ml无血清RPMI1640基础培养基，低速离心弃上清，沉淀细胞用HAT选择培养基重悬，接种于24孔板，置5％CO₂培养箱37℃培养。每3-4天换半量HAT选择培养基，15天后改用HT培养基，21天后改用10％胎牛血清的RPMI1640完全培养基。克隆形成后，接种只培养瓶中扩大培养。用ELISA检测到HBx抗体后，冻存部分克隆细胞。克隆化培养采用有限稀释法获得单克隆杂交瘤细胞。用来源于BALB/C小鼠的巨噬细胞为饲养细胞接种于96孔板，每孔接种10⁴饲养细胞。悬浮杂交瘤细胞，每组杂交瘤细胞按每孔10、5、1个细胞接种于铺有饲养细胞的96孔板中，置5％CO₂培养箱37℃培养。4-5天半量换液，2周左右可用ELISA法测定HBx抗体。

5.杂交瘤细胞和HBx单克隆抗体的筛选：采用ELISA法测定每孔杂交瘤细胞培养上清HBx抗体。分别HBx N-端和C-端抗原表位多肽包被微孔板，1％牛血清蛋白(BSA)封闭，加入待测培养上清孵育1小时，以无杂交瘤细胞培养上清作阴性对照。用含0.1％Twen-20的PBS洗涤液洗涤3次，加入辣根过氧化酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG孵育30分钟，PBS洗涤液洗涤5次，加入100μl四甲基联苯胺(TMB)显色液避光显色10分钟，加2N硫酸终止显色，在酶标仪上于450nm处测定吸光度值(OD值)。以包被有匙孔血蓝蛋白(KLH)的微孔板筛选抗KLH阳性抗体，以剔除抗KLH单克隆抗体。只有抗N-端表位或C-端表位阳性、抗KLH阴性杂交瘤细胞才用作进一步筛选。

实例二、HBx单克隆抗体的制备、纯化及鉴定

1.HBx单克隆抗体的制备与纯化：对于大量制备单克隆抗体，选择将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中，收集小鼠腹水获得抗体。抗体的纯化可以用盐析、凝胶过滤、亲和层析等方法进行纯化。我们优选硫酸铵——辛酸盐析沉淀法进行纯化。(1)腹水的制备：先腹腔注射0.5ml Pristane(降植烷)或液体石腊于BaLb/c鼠，1～2周后腹腔注射1×10⁶个杂交瘤细胞，接种细胞7～10天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，收集腹水。(2)单抗的纯化：收集的腹水用滤纸过滤去除沉淀和脂质，滤液用4倍体积60mmol/L醋酸缓冲液(pH4.0)稀释后，用NaOH调，PH值至4.5。逐滴加入辛酸(终浓度25ul/ml)，室温h搅拌30分钟后，以6000-8000r/min，离心30分钟，收集上清液。上清液经滤纸过滤2次，将滤液与10×PBS(0.1mol/L，pH7.4按10∶1比例混合，调pH至7.4，置冰浴冷至4℃)。每毫升上述混合液加0.2778固体硫酸铵，4℃搅拌30分钟，以4000-6000r/min离心10-20分钟，将沉淀溶于少量PBS，对PBS缓冲液4℃透析过夜，次日收集抗体溶液冻存，以备抗体效价及蛋白含量测定。

2.HBx单克隆抗体效价的测定：采用ELISA方法，用包被有HBx N-端或C-端抗原表位多肽的包被微孔板测定杂交瘤细胞培养上清、腹水和纯化后抗体的效价。将各种含抗体的液体以10倍稀释的方式不断稀释，每个反应设3个复孔，无细胞培养基、腹水和相应的抗体稀释液作阴性对照。以3个复孔OD_450nm值大于阴性对照的最低稀释度为抗体效价。本发明共获得5株培养上清抗体效价大于10^-4的杂交瘤细胞。其中HBx N-端表位特异性抗体3株，分别为N1E3、N2F2、N2G4；HBx C-端表位特异性抗体2株，分别为C3B2和C5E8。各株抗体效价见表1。

3.HBx单克隆抗体亚类的鉴定：用购自美国Sigma公司的ISO-1ELISA试剂盒对上述N1E3、N2F2、N2G4、C3B2和C5E8杂交瘤细胞所分泌的单克隆抗体进行亚类分析。此试剂盒可分析IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA和IgM等抗体亚类。N1E3、N2F2、N2G4、C3B2和C5E8单克隆抗体的亚类分别为IgG2a、IgG2b、IgG1、IgG2a和IgG1。

表1.各株单克隆抗体的效价

4.Western免疫印迹验证抗体的特异性：分别用1×SDS上样缓冲液溶解HBx抗原表位复合多肽与载体蛋白匙孔血蓝蛋白(KLH)交联蛋白1μg和HBV基因转染肝细胞HepG2.2.15，100℃煮沸变性5分钟，12000rpm离心10分钟，取上清分别点样到小板15％聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)中，恒压100V电泳1小时。电泳后取下凝胶，浸泡于电转移缓冲液中。裁剪等大的PVDF膜，经甲醇活化后放在凝胶的正极面，于湿式电转移槽中恒压45V转膜1小时。取出PVDF膜，用5％脱脂奶粉封闭1小时，按1∶2000加入抗HBx单克隆抗体室温振摇孵育2小时，用含0.05％Twen-20的PBS洗涤液洗涤3次，加入HRP标记的羊抗鼠IgG孵育30分钟，0.05％Tween-PBS洗涤5次。取出膜置二甲基联苯胺(DAB)显色液中避光显色，直到条带清晰为止，PBS洗涤后照相。结果如附图1和附图2所示，HBx N-端表位合成多肽在1.3KD显示单一条带，HepG2.2.15裂解液在17KD处显示单一条带，而单纯的KLH蛋白，HBx C-端表位合成多肽和未转染HBV的HepG2裂解液无特异性条带显示；HBxC-端表位合成多肽在3.0KD显示单一条带，HepG2.2.15裂解液在17KD处显示单一条带，而单纯的KLH蛋白，HBx N-端表位合成多肽和未转染HBV的HepG2裂解液无特异性条带显示。说明本发明所选的几个HBx N-端表位和HBx C-端表位单克隆抗体特异性较高。

实例三、HBx单克隆抗体用于制备HBx蛋白增强化学发光免疫检测试剂盒

1.HBx N-端与C-端表位特异性单克隆抗体配对实验：对HBx N-端表位特异性单抗N1E3、N2F2、N2G4和HBx C-端表位特异性单抗C3B2、C5E8进行相互配对实验。实验一：分别用50μl20μg/ml的N-端表位特异性单抗N1E3、N2F2和N2G4作为捕获抗体包被微孔板，包被缓冲液是碳酸盐缓冲液(PH9.5)，分别用HRP标记HBx C-端表位特异性单抗C3B2和C5E8作为检测抗体，加入梯度稀释的重组HBx蛋白和HBx阳性质控血清，洗涤液洗涤3次洗去非特异性结合抗原，分别加入HRP标记的1E34和3B23单抗做配对比较实验，TMB显色后置酶标仪测定OD₄₅₀值。记录灵敏度和稳定性最好的抗体组合。实验一：与实验一刚好相反，用HBx C-端表位特异性单抗C3B2和C5E8作为捕获抗体，用HRP标记的HBx N-端表位特异性单抗N1E3、N2F2和N2G4为检测抗体进行配对实验，记录灵敏度和稳定性最好的抗体组合。实验结果显示，C3B2为捕获抗体，N2F2为检测抗体的这对抗体组合灵敏度和稳定性最好。试剂盒选用C3B2为捕获抗体，N2F2为检测抗体。

2.板条包被：利用琥珀酰亚胺酯活化聚苯乙烯(PVC)板条，用0.05mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液配置C3B2单抗成5μg/ml的浓度，以100μl/孔加入活化板条，4℃过夜包被微孔板，0.05％Tween-PBS洗涤液洗涤3次，加3％BSA-PBS于37℃封闭1h，再次洗涤3次，吸干残余液体，置4-8℃保存备用。

3.N2F2单抗的HRP标记：采用简易过碘酸钠法标记抗体。称取5mg HRP溶解于1ml蒸馏水中，加入0.2ml新配的0.1M NaIO₄溶液，室温下避光搅拌20分钟。将上述溶液装入透析袋中，对1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜。加20μl 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使反应液物的PH升高到9.0～9.5，然后立即加入10mg N2F2单抗在1ml 0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时，加入0.1ml新配的4mg/ml NaBH₄液混匀，再置4℃2小时。最后将上述液装入透析袋中，对0.15M PH7.4PBS透析，换液2-3次，4℃过夜。分光光度计测定(光程1cm)OD_403nm×0.4测定酶量(mg/ml)，用〔OD280nm-(OD403nm×0.42))×0.94×0.62测定抗体IgG量(mg/ml)，计算单位抗体结合的HRP酶量。利用酶标记抗体的化学发光滴定方法确定酶标抗体稀释度，即为该标记物的工作浓度。HRP标记N2F2单抗的工作浓度一般为1∶5000-1∶10000。

4.试剂盒组成：96孔板条，HRP标记N2F2单抗、20×0.05％Tween-PBS洗涤液、化学发光底物溶液(A液和B液)、HBx标准品(10)和说明书。

5.HBx定量检测试剂盒(增强化学发光法)的技术指标分析

(1)灵敏度分析：用10％小牛血清将重组HBx蛋白分别稀释至0.01ng/ml、0.05ng/ml、0.1ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml。使用HBx定量检测试剂盒检测，记录发光强度，做3组平行实验，取数据平均值，以PBS为阴性对照组，进行t检验，统计每组数据与阴性对照组的差异，p＜0.01为阳性。检测结果显示，试剂盒的检测灵敏度为0.1ng/ml(见表2)。

表2.HBx定量检测试剂盒灵敏度

t检验：与PBS比较，^*p＜0.05，^**p＜0.01

(2)特异性分析：使用HBx定量检测试剂盒分别检测25mg/ml球蛋白、1mg/ml脂蛋白、0.1mg/ml血红蛋白、2mg/ml HBc、2mg/ml HBe、2mg/ml HBs、2mg/mlHBVDNAP，记录发光强度，做3组平行实验，取数据平均值，以PBS为阴性对照，进行t检验，统计每组数据与阴性对照组的差异，p＜0.05为阳性。结果显示25mg/ml球蛋白、1mg/ml脂蛋白、0.1mg/ml血红蛋白、2mg/ml HBc、2mg/ml HBe、2mg/ml HBs、2mg/mlHBVDNAP与HBx定量检测试剂盒均不会发生反应(见表3)。

表3.HBx定量检测试剂盒(增强化学发光法)特异性

t检验：与PBS比较，^*p＜0.05，^**p＜0.01

(3)临床标本检测：应用HBx定量检测试剂盒(增强化学发光法)检测95例乙型肝炎病人血清(包括急性肝炎、慢性肝炎)、25例肝硬化、30例肝癌病人血清，及80例健康体检血清，按照标准曲线公式计算血清HBx浓度，分别统计阳性率。结果显示，应用HBx定量检测试剂盒检测慢性乙肝阳性率为48％，而肝癌的阳性率高达67％(见表4)。

表4.HBx定量检测试剂盒(增强化学发光法)的临床标本检测

实例四、HBx单克隆抗体用于制备HBx蛋白ELISA免疫检测试剂盒

HBx蛋白ELISA免疫检测试剂盒的制备方法与实例三制备增强化学发光免疫检测试剂盒基本相同，试剂盒的组成除化学发光底物溶液(A液和B液)换成TMB显色底物外，其他成分完全相同(注：由于ELSA的灵敏度比化学发光法低，HBx标准品浓度和HRP标记N2F2单抗的稀释度比化学发光法高10-100倍)。

实例五、HBx单克隆抗体用于制备放射免疫显像诊断试剂

¹³¹I、¹⁶¹Tb、¹⁵³Sm和¹⁸⁶Re等放射性同位素都可以用来标记单克隆抗体，制备放射免疫显像诊断试剂。其中放射性碘标记操作简单，标记效率稳定，有氯胺T法、Iodogen法等多种标记方法。以下以Iodogen标记方法为例说明放射性同位素¹³¹I标记抗体用于制备放射免疫显像诊断试剂。

标记之前，先把Iodogen溶于甲醇或乙醇等有机溶剂，涂于管底，并使之干燥。标记时，将抗体溶液10～20μg/10μl(0.5mol/L，pH7.5PBS)加入反应管中，反应管置于冰浴中。碘化时，¹³¹I与蛋白质克分子之比例为1～1.2，连续温和搅拌10min。从反应管中转移出反应混合液，反应液转移到含有200μl 0.01mol/LpH7.2PB和0.15mol/LNaCl溶液中放置5min，使其反应停止，并使其未标记的碘离子还原成分子碘，以避免在带有缓冲液的柱中使白蛋白碘化。纸层析法测定标记物标记率和放化纯度，过量HBx抗原结合法测量标记抗体免疫活性。

标记抗体的用量为0.01mg～1.0mg/kg体重，一般用0.37～11.1GBq(10～300mCi)。标记抗体注射到体内后，会选择性聚结在肝脏HBx阳性组织，在多点不同时间(10分钟-1小时)用电子发射断层扫描仪(ECT)或正电子发射断层扫描仪(PECT)显像。

实例六、HBx单克隆抗体用于制备免疫导向治疗药物

用¹³¹I、¹⁶¹Tb、¹⁵³Sm和¹⁸⁶Re等放射性同位素标记HBx单克隆抗体制备免疫导向治疗药物的方法与实例五制备放射免疫显像诊断试剂基本相同，应用方法和剂量也相似。不同的是HBx单克隆抗体制备免疫导向治疗药物可以根据病情多次用药，可以同时做显像观察，或不做显像观察，用其他检查方法代替。

用细胞毒素与HBx单克隆抗体制备免疫导向治疗药物的方法有两种。一种是蛋白交联方法，一般用戊二醛、聚乙烯亚胺、DSS等交联剂把细胞毒素和HBx单抗共价交联在一起形成治疗药物。另外一种是通过基因工程技术将细胞毒素与基因工程HBx抗体融合的方法，通过基因重组将细胞毒素与HBx抗体cDNA编码基因连接在一起形成融合基因，基因工程表达后形成融合蛋白药物。

此外，利用基因工程技术进行扩增和重组HBx单抗可变区eDNA编码基因，获得HBx单链抗体、单区抗体等基因工程抗体药物；HBx单链抗体、单区抗体与人源Fab片段融合，可获得人-鼠嵌合源性抗体药物。这些在HBx单抗基础上制备的基因工程抗体药物可直接注射到体内用于原发性肝癌治疗。

需要指明的是，本发明并不限于上述具体实例。实例是用于更清楚地说明本发明。事实上，根据本发明说明书文字、表格及附图的描述，本领域的技术人员可以在上述实例的基础上作出某些改变。这些用本领域已知，且功能上等同的其他方法和物质对本发明做出的改变，应视为可以推知的改变，包含在本发明的范围内。

序列表

1.Seq 1的信息

(1)序列特征

(A)名称：HBx N-端抗原表位多肽

(B)类型：多肽链

(C)长度：10aa

(D)拓扑结构：线性

(2)来源：HBV病毒

(3)氨基酸序列

1        10

N-PARDVLCLRP-C

2.Seq 2的信息

(2)序列特征

(E)名称：HBx C-端抗原表位多肽

(F)类型：多肽链

(G)长度：24aa

(H)拓扑结构：线性

(4)来源：HBV病毒

(5)氨基酸序列

1         10          20

N-IRLKVFVLGG CRHKLVCSPA PCNF-C

Claims (5)

1.一种单克隆抗体，其特征是此单克隆抗体与乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)有特异性反应，可用于制备HBx免疫检测试剂和导向性治疗药物。

2.权利要求1所述的单克隆抗体，其特征是对HBx N-端表位或C-端表位有特异性反应，对载体蛋白匙孔血蓝蛋白(KLH)和HBV其他的表达蛋白无反应。

3.权利要求1所述的单克隆抗体的制备方法，方法包括HBx N-端和C-端抗原表位多肽的化学合成，表位多肽与匙孔血蓝蛋白(KLH)的交联，免疫接种小鼠，分离脾细胞与骨髓瘤细胞融合，有限稀释法筛选、克隆对HBx N-端和C-端抗原表位有反应，对KLH无反应的能分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，从杂交瘤细胞培养上清或小鼠腹水分离、纯化，获得单克隆抗体。

4.权利要求1所述的单克隆抗体在制备HBx免疫检测试剂的用途，其特征是用酶、同位素、生物素、荧光物质和高分子微球等物质标记可制备用于诊断乙肝病毒(HBV)感染、肝硬化和肝细胞癌(HCC)等疾病的各种HBx蛋白或HBx抗体免疫检测试剂，包括酶联免疫吸附(ELISA)、增强化学发光(ECL)、放射免疫检测(RIA)、免疫比浊(IT)、免疫组织化学(IHC)、免疫荧光(IF)和免疫印迹(WB)检测试剂。

5.权利要求1所述的单克隆抗体在制备导向性治疗药物的用途，其特征是(1)用放射性同位素或细胞毒素标记或交联此单克隆抗体可制备用于治疗乙肝病毒(HBV)感染和肝细胞癌(HCC)疾病的导向性治疗药物；(2)用基因重组技术对此单克隆抗体进行重组和改造可获得的单链、单区、嵌合等基因工程抗体药物。

Images