CN108387747A - 一种双抗体夹心化学发光免疫分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医学领域，涉及一种双抗体夹心化学发光免疫分析方法，采用抗RPTN N‑端鼠单抗作为捕获抗体包被于酶标板，洗涤后加入待测血清或者RPTN标准，经洗涤后加入抗RPTN C‑端的兔多抗作为检测抗体；洗涤后加入羊抗兔IgG‑HRP，洗涤后加入鲁米诺反应液；洗涤后在化学发光免疫分析仪上测定化学发光(RLU),RLU的强度代表RPTN的含量。本发明首次发现了RPTN在精神分裂症患者血清减少的现象，进一步研制RPTN化学发光免疫方法并检测确定血清RPTN的正常范围，将为精神分裂症的诊断及疗效评估提供新的方法；为其他神经精神类疾病的研究及抗精神类药物的研发提供新的工具。
Description
技术领域
本发明属于生物医学领域，特别涉及一种双抗体夹心化学发光免疫分析方法。
背景技术
目前，对精神分裂症的诊断及药物疗效评估多采用阳性和阴性症状量表(PANSS)等方法，而血清学指标的研究仍然没有理想的标志物)。RPTN是哺乳动物高度保守的S100钙结合蛋白家族成员，此前被认为是皮肤细胞特有的参与形成皮肤屏障的蛋白。我们报道了精神分裂症患者和慢性甲基安非他明(冰毒)吸食者血清的RPTN水平显著低于正常人(图1，a)，而慢性冰毒吸食者被认为是人类精神分裂症的模型；同时，我们发现非典型抗精神分裂药物奥氮平(Olanzapine)能够显著增加血清RPTN的水平(图1，b)。因此，血清RPTN水平不但是精神分裂症的标志物，也可评估药物治疗后的症状缓解。
目前用于科研分析血清RPTN的酶联免疫分析试剂盒是华美公司生产的(CSB-EL020501HU),我们采用该试剂盒检测的正常人血清RPTN平均水平为915.0pg/ml，部分正常人和大部分精神分裂症患者血清RPTN的水平低于该方法的最小检出量156pg/ml(图1，a)。现有的该RPTN酶联分析方法仅用于科学研究，而且灵敏度太低，也缺乏临床检验试剂所需的质量控制指标，无法提供正常人和精神分裂症患者的血清RPTN的含量范围。
发明内容
本发明的目的在于提供一种双抗体夹心化学发光免疫分析方法，建立了一种灵敏度更高的血清RPTN化学发光免疫分析方法，由于化学发光免疫分析方法比传统的酶联分析法具有更高的灵敏度，本发明研制了一种人血清RPTN化学发光免疫分析试剂盒，能够分析正常人及精神分裂症患者血清RPTN的水平范围，确定诊断及评估精神分裂症严重程度的RPTN检测值。
本发明的技术方案如下：
一种双抗体夹心化学发光免疫分析方法，采用抗RPTN N-端鼠单抗作为捕获抗体包被于酶标板，洗涤后加入待测血清或者RPTN标准，经洗涤后加入抗RPTN C-端的兔多抗作为检测抗体；洗涤后加入羊抗兔IgG-HRP(辣根过氧化物酶)(abcam产品)，洗涤后加入鲁米诺反应液；洗涤后在化学发光免疫分析仪上测定化学发光(RLU),RLU的强度代表RPTN的含量。
具体步骤如下：
分析人RPTN蛋白序列的抗原决定簇，设计N-端抗原决定簇序列，设计C-端抗原决定簇序列；将N-端抗原决定簇序列与KLH蛋白交联后，免疫Balb小鼠，制备脾细胞，并与骨髓瘤细胞融合，然后制备N-端单抗，包被于酶标板，作为捕获抗体；将C-端抗原决定簇序列与KLH蛋白交联后，免疫新西兰大兔，制备抗C-端兔多抗，将抗C-端兔多抗作为检测抗体；抗RPTN N-端鼠单抗作为捕获抗体包被于酶标板，洗涤后加入待测血清或者RPTN标准，经洗涤后加入抗RPTN C-端的兔多抗作为检测抗体；洗涤后加入羊抗兔IgG-HRP(辣根过氧化物酶)(abcam产品)，洗涤后加入鲁米诺反应液；洗涤后在化学发光免疫分析仪上测定化学发光(RLU),RLU的强度代表RPTN的含量。
本发明的有益效果：首次发现了RPTN在精神分裂症患者血清减少的现象，进一步研制RPTN化学发光免疫方法并检测确定血清RPTN的正常范围，将为精神分裂症的诊断及疗效评估提供新的方法；为其他神经精神类疾病的研究及抗精神类药物的研发提供新的工具。
附图说明
图1为正常人、精神分裂症患者、吸毒者血清RPTN水平及抗精神药物对血清RPTN水平的影响。a:正常人(control)、精神分裂症患者(SCZ)、吸毒者(drug users)血清RPTN水平。b:抗精神药物对小鼠血清RPTN水平的影响，对照鼠(control)，奥氮平(Olanzapine),喹硫平(Quetiapine),阿立哌唑(Aripiprazole)，抑郁模型小鼠(CUMS)。*p<0.05；**p<0.0001；
图2为本发明的制备过程图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明。
分析人RPTN蛋白序列的抗原决定簇，设计N-端抗原决定簇序列，设计C-端抗原决定簇序列；将N-端抗原决定簇序列与KLH蛋白交联后，免疫Balb小鼠，制备脾细胞，并与骨髓瘤细胞融合，然后制备N-端单抗，包被于酶标板，作为捕获抗体；将C-端抗原决定簇序列与KLH蛋白交联后，免疫新西兰大兔，制备抗C-端兔多抗，将抗C-端兔多抗作为检测抗体；抗RPTN N-端鼠单抗作为捕获抗体包被于酶标板，洗涤后加入待测血清或者RPTN标准，经洗涤后加入抗RPTN C-端的兔多抗作为检测抗体；洗涤后加入羊抗兔IgG-HRP(辣根过氧化物酶)(abcam产品)，洗涤后加入鲁米诺反应液；洗涤后在化学发光免疫分析仪上测定化学发光(RLU),RLU的强度代表RPTN的含量。
国家对临床应用的试剂盒有严格的质量控制要求，但是，目前缺乏化学发光免疫分析试剂盒的质量检验标准，国外市场上也没有临床应用的RPTN检测的试剂盒。为此，我们参考中国药品生物制品检定所徐立根的文章(放射免疫学杂志2006；19(3):230-234)，确定RPTN试剂盒研发中的关键质量标准。
4-1)试剂盒的灵敏度：采用竞争法和夹心法求出20个或以上零剂量管的发光值，计算均值和标准差，再以均值±2倍标准差在剂量-反应曲线上查出相应的剂量，所得结果就是试剂盒的灵敏度。
4-2)剂量-反应曲线拟合的相关系数：无论采用那种数学模型拟合剂量-反应曲线，其相关系数应大于0.9900。
4-3)试剂盒的特异性：采用交叉反应率和表观测定值反映试剂盒的特异性。RPTN属于S100钙结合蛋白家族，我们将采用该家族的成员S100A和S100B等作为RPTN的类似物测定试剂盒的特异性。
4-4)试剂盒的准确性：用回收率法测定试剂盒的准确性，回收率在90-110％之间。
4-5)试剂盒的精密度：精密度是试剂盒分析结果的重现性，通过分析内及分析间变异系数计算试剂盒的精密度，分别控制在<10％及<15％。
4-6)质控样品测定值：以正常人血清为基质制备，质控样品测定值应在说明书规定的参考范围内。
4-7)稳定性：准确性和精密度反映试剂盒的稳定性。采用热加速降解法确定试剂盒的稳定性。370C放置一天，相当于有效期2个月，试剂盒的有效期应在6个月以上。
人类RPTN含有784个氨基酸，属于S100钙结合蛋白家族，此前认为RPTN是皮肤特有的和皮肤屏障形成相关的蛋白质。由于S100蛋白在精神分裂症发生中的特殊作用，我们于是研究了RPTN在CNS系统的表达以及与精神分裂症的关系(Scientific Reports,2015)。该研究结果的核心内容是:①RPTN在CNS广泛表达，其中海马、前额叶、蓝斑核等区域高表达，这些高表达区域与抑郁症、精神分裂症的关系密切；②在CUMS小鼠模型中，RPTN在海马和前额叶的表达随着CUMS的发展而显著减少；③精神分裂症患者和吸毒者血清RPTN的水平显著低于正常人；④抗精神分裂症药物奥氮平能够显著增加小鼠血清RPTN的水平，提示RPTN与5-羟色胺及多巴胺受体之间的密切关系。⑤探讨了RPTN作为精神分裂症血清学诊断指标的可能性。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作出的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施仅限于这些说明。对于本发明所属领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以作出若干简单推演或替换，都应该视为属于本发明的保护范围。
Claims (2)
1.一种双抗体夹心化学发光免疫分析方法，其特征在于：采用抗RPTN N-端鼠单抗作为捕获抗体包被于酶标板，洗涤后加入待测血清或者RPTN标准，经洗涤后加入抗RPTN C-端的兔多抗作为检测抗体；洗涤后加入羊抗兔IgG-HRP，洗涤后加入鲁米诺反应液；洗涤后在化学发光免疫分析仪上测定化学发光RLU的强度，RLU的强度代表RPTN的含量，从而测定RPTN的含量。
2.如权利要求1所述双抗体夹心化学发光免疫分析方法，其特征在于，具体步骤如下：
分析人RPTN蛋白序列的抗原决定簇，设计N-端抗原决定簇序列，设计C-端抗原决定簇序列；将N-端抗原决定簇序列与KLH蛋白交联后，免疫Balb小鼠，制备脾细胞，并与骨髓瘤细胞融合，然后制备N-端单抗，包被于酶标板，作为捕获抗体；将C-端抗原决定簇序列与KLH蛋白交联后，免疫新西兰大兔，制备抗C-端兔多抗，将抗C-端兔多抗作为检测抗体；抗RPTN N-端鼠单抗作为捕获抗体包被于酶标板，洗涤后加入待测血清或者RPTN标准，经洗涤后加入抗RPTN C-端的兔多抗作为检测抗体；洗涤后加入羊抗兔IgG-HRP，洗涤后加入鲁米诺反应液；洗涤后在化学发光免疫分析仪上测定发光RLU的强度，RLU的强度代表RPTN的含量，从而测定RPTN的含量。
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