CN110003326A - 乙肝病毒前s1蛋白特异性抗体的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种乙肝病毒前S1蛋白特异性抗体的制备方法，包括抗合成前S1多肽‑1和抗合成前S1多肽‑2的鼠单克隆抗体，制备时使用合成前S1片段多肽‑1和多肽‑2制备的人工抗原作为免疫原。使用抗合成前S1多肽‑1的鼠单抗和抗合成前S1多肽‑2的鼠单抗共同作为包被抗体，辣根过氧化物酶标记的抗HBsAg的抗体作为标记抗体，建立检测血清中的前S1蛋白的ELISA方法，具有较高的灵敏度和特异性。申请人团队在现有技术的基础上，在前S1已知的B细胞识别位点（21aa‑47aa）外寻找其他的B细胞识别位点，制备特异性鼠单克隆抗体，以提升前S1蛋白的检出率，为临床乙型肝炎病毒感染的早期筛查、预后诊断提供更精准的参考数据。
Description
技术领域
本发明涉及体外诊断技术，尤其是涉及一种乙肝病毒前S1蛋白特异性抗体的制备方法，本发明还涉及该方法制备出的特异性抗体在检测前S1蛋白试剂盒方面的应用。
背景技术
乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)是引起乙型肝炎(简称乙肝)的病原体，属嗜肝DNA病毒科。该科病毒包含正嗜肝DNA病毒属和禽嗜肝DNA病毒属两个属，引起人体感染的是正嗜肝DNA病毒属。HBV感染是全球性的公共卫生问题，严重威胁人类健康。乙肝病毒表面抗原（HBsAg）是位于乙型肝炎病毒颗粒外壳的一种膜蛋白，根据其组成可以分为三类：大蛋白（LHBs，包括前S1、前S2和S）、中蛋白（MHBs，包括前S2、S）、小蛋白（SHBs，仅包括S）。
HBV主要有三种不同的形态：小球形颗粒（直径22nm）、管状颗粒（直径22nm、长度100-1000nm）、Dane颗粒。其中大蛋白主要分布在Dane颗粒和管状颗粒上，具有很强的免疫原性。完整的HBV病毒颗粒外模的组成依赖于LHBs、MHBs、SHBs三种蛋白的共同作用，在LHBs缺少的情况下，HBV只能形成小球形颗粒，因此LHBs实际上代表着病毒外模的组装能力。只有当LHBs蛋白浓度达到一定量时，HBV的管状颗粒和Dane颗粒才能形成。因此，检测LHBs实际上反应的是管状颗粒和Dane颗粒的浓度，鉴于Dane颗粒代表着病毒基因在血液中的实际存在，因此可以根据检测血液中LHBs的含量，来判断病毒携带者体内的乙肝病毒是否进行复制。
目前临床上用于检测前S1蛋白的试剂盒中，使用的抗体一般都是利用重组大蛋白（LHBs）或者化学合成前S1片段作为免疫原来制备出的特异性单克隆抗体。在《乙型肝炎病毒大蛋白前S区抗原检测试剂盒》（申请号200510077451.6）以及《乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S区化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法》（申请号200710176332.5）等公开的专利文献中，认为在乙型肝炎病毒大蛋白上并不存在单独的前S1区段，而是存在前S1和前S2组成的构象型前S区，由前S区和S区一块构成大蛋白，单独使用前S1片段制备单克隆抗体，在进行血清检测时会导致不同程度漏检。前S1区段的（21aa-47aa）氨基酸多肽序列高度保守，肝细胞表面存在其结合受体，一般认为该片段在HBV感染肝细胞的过程中起到重要作用。专利文献（CN 101863975B）合成前S1区段内的（27aa-59aa）多肽和（83aa-111aa）多肽，来分别制备鼠单克隆抗体并混合使用作为包被抗体，用于检测HBsAg阳性样本，阳性检出率为86%；用于检测HBV DNA阳性样本45例，阳性检出率达到93.3%。
发明内容
本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种新的乙肝病毒前S1蛋白特异性抗体的制备方法，以提升前S1蛋白的检出率，为临床乙肝病毒感染患者的早期筛查、预后诊断提供更精准的参考数据。
为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：
本发明所述的乙肝病毒前S1蛋白特异性抗体的制备方法，包括抗合成前S1多肽-1和抗合成前S1多肽-2的鼠单克隆抗体，制备时使用合成前S1片段多肽-1和多肽-2制备的人工抗原作为免疫原。
制备时，合成前S1片段多肽-1和多肽-2通过在其羧基端添加的半胱氨酸，偶联至BSA（牛血清白蛋白）或者KLH（钥孔血蓝蛋白）表面制备成人工抗原，用于免疫Balb/c小鼠；三次免疫后采集小鼠血清，用ELISA间接法检测小鼠血清效价，取效价超过1/8K的小鼠脾脏与小鼠骨髓瘤细胞NS1融合；用ELISA间接法筛选特异性针对合成前S1多肽-1和多肽-2的杂交瘤细胞，注射小鼠腹腔产生腹水，通过纯化小鼠腹水得到鼠单克隆抗体。
本发明制备的乙肝病毒前S1蛋白特异性抗体在双抗夹心法检测前S1蛋白的ELISA方法中的应用：使用抗合成前S1多肽-1的鼠单克隆抗体和抗合成前S1多肽-2的鼠单克隆抗体共同作为包被抗体，辣根过氧化物酶标记的抗HBsAg的抗体作为标记抗体，建立检测血清中的前S1蛋白的ELISA方法，具有较高的灵敏度和特异性。
本发明的优点在于：申请人科研团队在现有技术的基础上，在前S1已知的B细胞识别位点（21aa-47aa）外寻找其他的B细胞识别位点，制备特异性鼠单克隆抗体，以提升前S1蛋白的检出率，为临床乙型肝炎病毒感染的早期筛查、预后诊断提供更精准的参考数据。
具体实施方式
下面通过具体实例，对本发明方法作更加详细的说明,以便于本领域技术人员对本申请的理解。如无特别说明，本申请所用的试剂和仪器均为市售产品，采用的试验方法也为本领域常规方法。
实施例1 制备抗前S1多肽-1、多肽-2的鼠单克隆抗体
1、制备免疫原
多肽-1的氨基酸序列（Seq ID 1）：tsnplgffpdhqldpc
多肽-2的氨基酸序列（Seq ID 2）：pafrantanpdwdfnpnkdtwpdankvc
委托上海生工生物工程有限公司对多肽-1和多肽-2进行多肽序列合成；合成后通过羧基端的半胱氨酸与BSA或者KLH偶联，制备成具有免疫原性的人工抗原：多肽-1-BSA/KLH，多肽-2-BSA/KLH。
2、制备杂交瘤细胞
将多肽-1-KLH、多肽-2-KLH用0.01M PH=7.4的PBS溶解，与同体积的弗氏完全佐剂在置于4℃的磁力搅拌器上混合使其充分乳化，腹腔结合皮下注射免疫Balb/c小鼠，初免剂量为100ug/只小鼠；第一次免疫后间隔21天、42天分别进行第二次和第三次免疫，免疫剂量均为50ug/只小鼠；第三次免疫后10天左右采血，用分别包被有多肽-1-BSA、多肽-2-BSA的96孔板间接法检测小鼠血清效价，选择效价大于104的小鼠进行脾内加强免疫；加强免疫后3天取小鼠脾脏与小鼠骨髓瘤细胞NS1按照10:1的比例融合，融合后的细胞在含HAT的DMEM培养基（Gibco）上进行培养。
融合后6-7天左右，用分别包被有多肽-1-BSA、多肽-2-BSA的96孔板间接法检测细胞培养上清中的特异性抗体含量，选择OD值不低于0.5的阳性孔用有限稀释法进行3轮亚克隆，最终分别得到能稳定分泌抗多肽-1的杂交瘤细胞31株，得到能稳定分泌抗多肽-2的杂交瘤细胞28株。
3、抗多肽-1、抗多肽-2的鼠单克隆抗体纯化
将得到的能稳定分泌抗多肽-1、抗多肽-2的鼠杂交瘤细胞注射至小鼠腹腔内，收集腹水通过SPA纯化即可得到纯度超过90%的抗多肽-1、抗多肽-2的鼠单克隆抗体。
实施例2 建立双抗夹心法检测前S1蛋白的ELISA方法
1、磁微粒包被
取30 μl混匀后的磁微粒原液用300 μl的PBS缓冲液洗涤5次，然后用10%的戊二醛对磁微粒活化1小时，接着用pH 7～8 PBS缓冲液将活化后的磁微粒洗涤2次。
将实施例1制备的抗多肽-1的鼠单克隆抗体与抗多肽-2的鼠单克隆抗体按照质量比1:1混合后，以0.3 μg/人份的量加入磁珠中，4℃包被2小时；最后用含BSA的封闭液封闭2小时。
2、HRP标记抗HBsAg兔多克隆抗体
将抗HBsAg兔多克隆抗体与HRP（罗氏）按照质量比1.5:1的比例进行标记；标记后的HRP标记抗体用稀释液稀释至1:4000备用。
实施例3 临床样本检测
收集来自医院的HBsAg阳性样本156例，均为阿尔法试剂盒检测阳性样本；31例健康人体检血清样本，经阿尔法preS1试剂盒检测均为阴性。
用本发明实施例2建立的双抗夹心法进行阴阳符合率分析，结果如表1。
表1
表1结果显示，在156例HBsAg阳性样本中，本发明方法可以检出全部156例阳性样本，与阿尔法preS1试剂盒阳性符合率达到100.00%；31例阴性样本中，检测出27例阴性，有4例检测为阳性，与阿尔法preS1试剂盒阴性符合率为87.10%，总符合率为97.86%。
Claims (3)
1.一种乙肝病毒前S1蛋白特异性抗体的制备方法，其特征在于：包括抗合成前S1多肽-1和抗合成前S1多肽-2的鼠单克隆抗体，制备时使用合成前S1片段多肽-1和多肽-2制备的人工抗原作为免疫原。
2.根据权利要求1所述的乙肝病毒前S1蛋白特异性抗体的制备方法，其特征在于：合成前S1片段多肽-1和多肽-2，通过在其羧基端添加的半胱氨酸，偶联至牛血清白蛋白或者钥孔血蓝蛋白表面制备成人工抗原，用于免疫Balb/c小鼠；三次免疫后采集小鼠血清，用ELISA间接法检测小鼠血清效价，取效价超过1/8K的小鼠脾脏与小鼠骨髓瘤细胞NS1融合；用ELISA间接法筛选特异性针对合成前S1多肽-1和多肽-2的杂交瘤细胞，注射小鼠腹腔产生腹水，通过纯化小鼠腹水得到鼠单克隆抗体。
3.一种乙肝病毒前S1蛋白特异性抗体在双抗夹心法检测前S1蛋白的ELISA方法中的应用, 其特征在于：使用抗合成前S1多肽-1的鼠单克隆抗体和抗合成前S1多肽-2的鼠单克隆抗体共同作为包被抗体，辣根过氧化物酶标记的抗HBsAg的抗体作为标记抗体，夹心法检测。
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| CN102030824A (zh) * | 2009-09-30 | 2011-04-27 | 王虹 | 一种乙型肝炎病毒x蛋白单克隆抗体及用途 |
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2019
- 2019-04-15 CN CN201910297150.6A patent/CN110003326A/zh active Pending
Patent Citations (3)
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