KR20090084822A - Ｂ형 간염 바이러스 ｓ 항원의 분석방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명의 과제는 종래의 HBs 항원 분석방법에서는 측정치가 낮아지는 검체 및 위음성이 되는 검체에 대해서, HBs 항원의 양을 더 정확하게 측정할 수 있게 하는 것이다. 본 발명의 HBs 항원 분석방법에 있어서는 B형 간염 바이러스 s 항원의 26∼80번 아미노산 잔기로 이루어진 제 1 내측영역 펩티드에 결합하는 1개 이상의 내측 포착 프로브, 및 98∼156번 아미노산 잔기로 이루어진 제 2 외측영역 펩티드에 결합하는 1개 이상의 외측 포착 프로브를 포착 프로브로서 사용하고, 상기 제 1 내측영역 펩티드에 결합하는 1개 이상의 내측 검출 프로브 및 상기 제 2 외측영역 펩티드에 결합하는 1개 이상의 외측 검출 프로브를 검출 프로브로서 사용한다.
Figure P1020097008032
B형 간염 바이러스 s 항원

Description

Ｂ형 간염 바이러스 ｓ 항원의 분석방법{METHOD FOR ANALYSIS OF HEPATITIS B VIRUS s ANTIGEN}
본 발명은 B형 간염 바이러스 s 항원의 분석방법 및 B형 간염 바이러스 s 항원에 결합하는 모노클로날 항체에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, B형 간염 바이러스 s 항원(이하, HBs 항원이라고 하는 경우도 있음)의 제 1 내측영역 펩티드에 결합하는 프로브 및 제 2 외측영역 펩티드에 결합하는 프로브, 특히 모노클로날 항체를 이용하여 HBs 항원을 측정함으로써 피검 시료(이하, 검체라고 하는 경우도 있음) 중의 HBs 항원을 정확하게 분석하는 것이 가능하다.
수혈에 사용하는 혈액은 종종 수혈 후 감염증의 원인이 되는 경우가 있다. B형 간염 바이러스(이하, HBV라고 하는 경우가 있음)는 수혈 후 간염의 원인 바이러스이며, 수술시 수혈 등에 의해 감염된다. 그 때문에 수혈용 혈액의 스크리닝에 의해 혈액의 HBV로의 감염 유무를 진단하는 것은 매우 중요하다. 이 HBV 감염을 진단하는 방법으로서 HBs 항원을 검출 및 정량하는 HBs 항원의 분석방법이 널리 사용되고 있다.
HBs 항원은 감염성을 갖는 HBV 입자 표면의 주요 구성 외피단백이며, HBV-DNA를 포함하는 코어 입자를 감싸고 있는 간세포 유래의 지질 2중막에 포함되어 있 다. 또한, HBV 감염자의 혈액 중에는 코어 입자가 없이 HBs 항원으로 이루어진 감염성이 없는 소형 구형 입자나 관상 입자도 존재한다. 소형 구형 입자는 혈중에 가장 다량으로 존재하고 있어 HBV 입자가 1∼수 개에 대해 약 1000개의 비율로 관찰된다. 현재 시판되고 있는 HBs 항원 검사약은 주로 이 소형 구형 입자의 형태로 있는 HBs 항원을 검출하는 것이다.
HBs 항원은 전체 길이 226 아미노산 잔기로 이루어진 지질 2중막을 4회 관통하는 막단백질이다. HBs 항원의 막관통 구조 모델은 완전히 해명되어 있는 것은 아니지만, Howard 들은 HBs 항원은 HBs 항원의 N말단측의 1∼11번 아미노산 잔기로 이루어진 지질 2중층의 제 1 외측(ER루멘측)영역, 12∼28번 아미노산 잔기로 이루어진 지질 2중막을 관통하는 소수성의 제 1 막관통영역, 29∼80번 아미노산 잔기로 이루어진 지질 2중층의 제 1 내측영역, 81∼97번 아미노산 잔기로 이루어진 소수성의 제 2 막관통영역, 98∼156번 아미노산 잔기로 이루어진 친수성의 제 2 외측(ER루멘)영역, 그리고 157번째 이후의 소수성 제 3 막관통영역, 제 2 내측영역, 제 4 막관통영역, 및 제 3 외측(ER루멘)영역으로 형성된다고 제창하고 있다(비특허문헌 1: 도 1).
종래의 HBs 항원의 분석방법으로서는 HBs 항원의 공통 항원결정기 a에 결합하는 항체를 사용하는 방법이 일반적이었다. 공통 항원결정기 a는 HBs 항원의 제 2 외측(ER루멘)영역, 즉 바이러스 입자 표면에 국재하고 있는 98번째부터 156번째 아미노산 잔기 중 110∼156번 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드 상에 위치하고 있다. 이 공통 항원결정기 a는 복잡한 고차 구조로 이루어지고, 그 위에 4개 이상의 에피 토프가 존재한다고 보고되고 있다(비특허문헌 2).
한편, 상기 항원결정기 a에 결합하는 항체를 사용하는 HBs 항원의 분석방법은 HBs 항원의 a영역에 아미노산 변이를 갖는 HBV를 검출할 수 없는 경우가 있다. 그 때문에, 최근 26∼80번 아미노산 잔기로 이루어진 지질 2중층의 제 1 내측영역 펩티드에 결합하는 항체를 사용하는 HBs 항원의 분석방법이 개발되었다(특허문헌 1).
특허문헌 1: 국제공개 제 2006/033368호 팸플릿
비특허문헌 1: Howard et al. 「Viral Hepatitis and Liver Disease (ed by Zuckerman AJ, Alan R)」(미국) Liss Inc, New York, 1988년, p.1094-1101
비특허문헌 2: 오카모토 히로키 「일본임상, 분자 간염 바이러스 병학 기초·임상·예방 하권 A, B, D, E형 간염 바이러스 편」, 1995년 10월 26일 발행, p.212-222
HBV 급성 감염 환자에 있어서는 감염 초기에 있어서 HBs 항원이 양성이지만, 그 후 HBs 항체가 양성이 되어 HBs 항원이 음성이 된다. 환자의 혈액 중의 HBs 항체가 양성일 경우 상기 공통 항원 결정기a에 결합하는 항체를 사용한 방법으로 HBs 항원을 분석하면 환자의 HBs 항체에 의해 분석 방법에 사용하는 항체의 HBs 항원에의 결합이 저해되어 측정치가 낮아지는 것을 알 수 있다. 또한, 26∼80번 아미노산 잔기로 이루어진 지질 2중층의 제 1 내측영역의 펩티드에 결합하는 항체를 사용하는 HBs 항원의 분석방법을 이용하여 HBs 항원을 측정한 바, 바이러스가 혈액 중에 존재함에도 불구하고 분석할 수 없는 위음성의 검체가 존재하는 것을 알 수 있다.
본 발명자들은 이들 종래의 HBs 항원의 분석방법에서는 측정치가 낮아지는 검체 및 위음성이 되는 검체에 대해서 HBs 항원의 양을 정확하게 측정할 수 있게 하기 위해서 예의 연구를 거듭한 결과, HBs 항원의 특정 영역의 펩티드를 인식하는 항체를 조합시킴으로써 위음성의 발생을 없애어 HBs 항원의 양을 정확하게 측정할 수 있는 HBs 항원의 분석방법을 발견했다.
본 발명은 이러한 지견에 근거하는 것이다.
따라서, 본 발명은 B형 간염 바이러스 s 항원의 제 1 내측영역 펩티드에 결합하는 적어도 1개의 내측 포착 프로브 및 제 2 외측영역 펩티드에 결합하는 적어도 1개의 외측 포착 프로브를 포착 프로브로서 사용하고, 상기 제 1 내측영역 펩티드에 결합하는 적어도 1개의 내측 검출 프로브 및 상기 제 2 외측영역 펩티드에 결합하는 적어도 1개의 외측 검출 프로브를 검출 프로브로서 사용하는 것을 특징으로 하는 B형 간염 바이러스 s 항원의 분석방법에 관한 것이다.
본 발명에 의한 B형 간염 바이러스 s 항원의 분석방법의 바람직한 실시형태에 있어서는, 상기 내측 포착 프로브가 결합하는 에피토프와 상기 내측 검출 프로브가 결합하는 에피토프가 다르고, 상기 외측 포착 프로브가 결합하는 에피토프와 외측 검출 프로브가 결합하는 에피토프가 다른 것이다.
본 발명에 의한 B형 간염 바이러스 s 항원의 분석방법의 다른 바람직한 실시형태에 있어서는, 상기 내측 포착 프로브가 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에 있어서의 51∼60번 아미노산 서열로 이루어진 펩티드에 결합하는 프로브이며, 상기 외측 포착 프로브가 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에 있어서의 111∼130번 아미노산 서열로 이루어진 펩티드에 결합하는 프로브이며, 상기 내측 검출 프로브가 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에 있어서의 51∼69번 아미노산 서열로 이루어진 펩티드에 결합하는 프로브이며, 상기 외측 검출 프로브가 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에 있어서의 98∼156번 아미노산 서열로 이루어진 펩티드에 결합하는 프로브이다.
본 발명에 의한 B형 간염 바이러스 s 항원의 분석방법의 다른 바람직한 실시형태에 있어서는, 상기 프로브가 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편이며, 특히 내측 포착 모노클로날 항체가 FERM BP-10117 항체, FERM BP-10702 항체, FERM BP-10700 항체 및 FERM BP-10698 항체로 이루어진 군에서 선택되는 모노클로날 항체이며, 상기 내측 검출 모노클로날 항체가 FERM BP-10117 항체, FERM BP-10702 항체, FERM BP-10700 항체 및 FERM BP-10698 항체로 이루어진 군에서 선택되는 모노클로날 항체이며, 상기 외측 포착 모노클로날 항체가 FERM BP-10699 항체, FERM BP-10703 항체, FERM BP-10701 항체 및 FERM BP-10697 항체로 이루어진 군에서 선택되는 모노클로날 항체이며, 상기 외측 검출 모노클로날 항체가 FERM BP-10699 항체, FERM BP-10703 항체, FERM BP-10701 항체 및 FERM BP-10697 항체로 이루어진 군에서 선택되는 모노클로날 항체이며, 상기 내측 포착 모노클로날 항체와 상기 내측 검출 모노클로날 항체가 다른 항체이며, 상기 외측 포착 모노클로날 항체와 상기 외측 검출 모노클로날 항체가 다른 항체이다.
또한, 본 발명은 B형 간염 바이러스 s 항원의 제 1 내측영역 펩티드에 결합하는 적어도 1개의 내측 포착 프로브 및 제 2 외측영역 펩티드에 결합하는 적어도 1개의 외측 포착 프로브를 포착 프로브로서 포함하는 항체 고상 담체, 및 상기 제 1 내측영역 펩티드에 결합하는 적어도 1개의 내측 검출 프로브 및 상기 제 2 외측영역 펩티드에 결합하는 적어도 1개의 외측 검출 프로브를 검출 프로브로서 포함하는 시약을 포함하는 것을 특징으로 하는 B형 간염 바이러스 s 항원의 분석 키트에도 관한 것이다.
또한, 본 발명은 국제수탁번호 FERM BP-10702인 마우스 하이브리도마, 국제수탁번호 FERM BP-10698인 마우스 하이브리도마, 국제수탁번호 FERM BP-10699인 마우스 하이브리도마, 국제수탁번호 FERM BP-10703인 마우스 하이브리도마, 국제수탁번호 FERM BP-10701인 마우스 하이브리도마, 국제수탁번호 FERM BP-10700인 마우스 하이브리도마 또는 국제수탁번호 FERM BP-10697인 마우스 하이브리도마에도 관한 것이다.
또한, 본 발명은 국제수탁번호 FERM BP-10702인 마우스 하이브리도마, 국제수탁번호 FERM BP-10698인 마우스 하이브리도마, 국제수탁번호 FERM BP-10699인 마우스 하이브리도마, 국제수탁번호 FERM BP-10703인 마우스 하이브리도마, 국제수탁번호 FERM BP-10701인 마우스 하이브리도마, 국제수탁번호 FERM BP-10700인 마우스 하이브리도마 또는 국제수탁번호 FERM BP-10697인 마우스 하이브리도마, 및 이들의 하이브리도마로부터 산생되는 모노클로날 항체에도 관한 것이다.
또한, 본 발명은 B형 간염 바이러스 s 항원의 제 1 내측영역 펩티드에 결합하는 적어도 1개의 내측 포착 프로브 및 제 2 외측영역 펩티드에 결합하는 적어도 1개의 외측 포착 프로브, 피검시료, 및 상기 제 1 내측영역 펩티드에 결합하는 적어도 1개의 내측 검출 프로브 및 상기 제 2 외측영역 펩티드에 결합하는 적어도 1개의 외측 검출 프로브를 접촉시키는 접촉 공정; 및 검출 프로브의 시그널을 검출하는 검출 공정을 포함하는 B형 간염 바이러스 s 항원의 분석방법에 관한 것이다.
또한, 본 명세서에 있어서의 「분석」에는 분석 대상 화합물의 존재 유무를 판정하는 「검출」과 분석 대상 화합물의 존재량을 결정하는 「정량」 모두가 포함된다.
또한, 본 발명에 의한 「B형 간염 바이러스 s 항원의 분석방법」은 「B형 간염 바이러스의 진단 방법」이라고 사용하는 것이 가능하다.
(발명의 효과)
본 발명에 의하면 종래의 HBs 항원의 분석방법에서는 위음성이 되는 검체의 HBs 항원을 분석하는 것이 가능하다. 또한, 종래의 항원의 분석방법에서는 측정치가 낮아지는 검체의 HBs 항원의 양을 정확하게 분석하는 것이 가능하다.
도 1은 HBs 항원의 막관통 모델의 모식도이다.
본 발명의 HBs 항원의 분석방법은 B형 간염 바이러스 s 항원의 제 1 내측영역 펩티드에 결합하는 적어도 1개의 내측 포착 프로브, 및 제 2 외측영역 펩티드에 결합하는 적어도 1개의 외측 포착 프로브를 포착 프로브로서 사용하고, 상기 제 1 내측영역 펩티드에 결합하는 적어도 1개의 내측 검출 프로브 및 상기 제 2 외측영역 펩티드에 결합하는 적어도 1개의 외측 검출 프로브를 검출 프로브로서 사용한 다.
본 발명의 HBs 항원의 분석방법으로 측정되는 HBs 항원은 지질 2중막을 4회 관통하는 226 아미노산 잔기로 이루어진 막 단백질이다. HBV에는 몇개의 유전자형, 예컨대 유전자형 A, B, C, D, E, F, 및 G가 있는 것이 알려져 있고, 그 유전자형에 따라서 HBs 항원의 아미노산 서열이 다르다. 또한, 바이러스주에 의해도 유전자 변이, 특히 HBV 입자의 지질 2중막의 외측 110∼156번 영역의 아미노산 서열에는 많은 변이가 있는 것이 알려져 있다. 본 발명의 HBs 항원의 분석방법에 의해 측정되는 HBs 항원은 이들 불균일성이 있는 아미노산 서열을 갖는 HBs 항원을 측정 대상으로 해서 본 발명의 분석 방법에 의해 그들을 측정하는 것이 가능하다.
도 1에 Howard 들이 제창하는 HBs 항원의 막관통 구조 모델을 나타낸다. 제 1 내측영역 펩티드는, 예컨대 Howard 들이 제창하는 HBs 항원의 막관통 구조 모델에 있어서의 29∼80번 아미노산 잔기로 이루어진 지질 2중층의 제 1 내측영역에 상당하는 것이지만, HBs 항원의 29∼80번 아미노산 번호로 특정되는 것은 아니고, HBs 항원의 아미노산 변이, 결실 및/또는 삽입에 의해 아미노산 번호는 다른 경우가 있다. 또한, 제 2 외측영역 펩티드는, 예컨대 막관통 구조 모델에 있어서의 98∼156번 아미노산 잔기로 이루어진 친수성의 제 2 외측(ER루멘)영역에 상당하는 것이지만, HBs 항원의 98∼156번 아미노산 번호로 특별히 한정되는 것은 아니고, HBs 항원의 아미노산의 변이, 결실 및/또는 삽입에 의해 아미노산 번호가 다른 경우가 있다.
제 1 내측영역 펩티드로서는 바람직하게는 HBs 항원의 26∼80번 아미노산 잔 기로 이루어진 HBV 입자의 지질 2중막의 내측에 존재하는 친수성 펩티드이다. 그 표준적인 아미노산 서열은 서열번호 1의 26∼80번 아미노산 서열이다. 그러나, 본 발명에 있어서의 제 1 내측영역 펩티드는 HBs 항원의 N말단측으로부터 제 1 번째의 지질 2중층의 내측이 존재하는 펩티드이면 HBs 항원의 서열번호 1의 26∼80번 아미노산 서열로 이루어진 펩티드에 한정되지 않고, 예컨대 N말단측에서의 아미노산의 번호가 다른 펩티드나 서열번호 1의 26∼80번 아미노산 서열의 1 또는 복수의 장소에 있어서 1개 또는 복수 개의 아미노산이 치환(변이), 결실 및/또는 삽입된 아미노산 서열로 이루어진 펩티드가 포함될 수 있다.
또한, 제 2 외측영역 펩티드는 바람직하게는 HBs 항원의 98∼156번 아미노산 잔기로 이루어진 HBV 입자의 지질 2중막 외측의 ER루멘에 존재하는 친수성 펩티드이다. 그 표준적인 아미노산 서열은 서열번호 1의 98∼156번 아미노산 서열이다. 그러나, 본 발명에 있어서의 제 2 외측영역 펩티드는 HBs 항원의 N말단측으로부터 제 2 번째의 지질 2중층의 외측(루멘측)에 존재하는 펩티드이면 HBs 항원의 서열번호 1의 98∼156번 아미노산 서열로 이루어진 펩티드에 한정되지 않고, 예컨대 N말측에서의 아미노산의 번호가 다른 펩티드나 서열번호 1의 98∼156번 아미노산 서열의 1 또는 복수의 장소에 있어서 1개 또는 복수 개의 아미노산이 치환(변이), 결실 및/또는 삽입된 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용할 수 있는 내측 포착 프로브 및 내측 검출 프로브는 상기 제 1 내측영역 펩티드를 인식하여 결합할 수 있는 프로브이면 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 서열번호 1의 26∼80번 아미노산 서열로 이루어진 펩티드에 결합하는 프로브 및 서열번호 1의 26∼80번 아미노산 서열의 1 또는 복수의 장소에 있어서 1개 또는 복수 개의 아미노산이 치환(변이), 결실 및/또는 삽입된 아미노산 서열로 이루어진 펩티드에 결합하는 프로브를 포함할 수 있다. 더욱 구체적으로는, 서열번호 1로 표시되는 아미노산에 있어서의 31∼50번 아미노산 서열로 이루어진 펩티드, 51∼60번 아미노산 서열로 이루어진 펩티드, 51∼69번 아미노산 서열로 이루어진 펩티드, 51∼70번 아미노산 서열로 이루어진 펩티드, 21∼40번 아미노산 서열로 이루어진 펩티드, 71∼90번 아미노산 서열로 이루어진 펩티드, 및 61∼80번 아미노산 서열로 이루어진 펩티드, 또는 그들 펩티드의 일부 아미노산이 치환된 펩티드 등에 결합하는 프로브가 포함된다.
본 발명에서 사용할 수 있는 외측 포착 프로브 및 외측 검출 프로브는 상기 제 2 외측영역 펩티드를 인식하여 결합할 수 있는 프로브이면 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 서열번호 1의 98∼156번 아미노산 서열로 이루어진 펩티드에 결합하는 프로브 및 서열번호 1의 98∼156번 아미노산 서열의 1 또는 복수의 장소에 있어서 1개 또는 복수 개의 아미노산이 치환(변이), 결실 및/또는 삽입된 아미노산 서열로 이루어진 펩티드에 결합하는 프로브를 포함할 수 있다. 더욱 구체적으로는, 서열번호 1로 표시되는 아미노산에 있어서의 121∼130번 아미노산 서열로 이루어진 펩티드, 151∼170번 아미노산 서열로 이루어진 펩티드, 111∼130번 아미노산으로 이루어진 펩티드, 121∼140번 아미노산으로 이루어진 펩티드, 98∼156번 아미노산 서열로 이루어진 펩티드, 또는 그들 펩티드의 일부 아미노산이 치환된 펩티드 등에 결합하는 프로브가 포함된다. 또한, 외측 포착 프로브가 결합하는 에피토프는 복잡 한 고차 구조로 이루어진 구조 에피토프, 예컨대 공통 항원결정기 a도 포함하고 있다. 따라서, 서열번호 1의 98∼156번 아미노산 서열만으로 이루어진 부분 펩티드에서는 형성할 수 없고, 그 부분 펩티드보다 긴 펩티드, 예컨대 HBs 항원의 전체 길이 226 아미노산 잔기로 이루어진 전체 길이 펩티드에 의해 형성되는 에피토프도 존재한다. 본 발명에서 사용할 수 있는 외측 포착 프로브 및 외측 검출 프로브는, 예컨대 서열번호 1의 아미노산에 있어서의 98∼156번 아미노산 서열만으로 이루어진 부분 펩티드보다 긴 펩티드에 의해 형성되어 98∼156번 아미노산 서열로 이루어진 영역에 존재하는 구조 에피토프(이하, 「제 2 외측영역의 영역구조 에피토프」라고 함)에 결합할 수 있는 프로브를 포함한다.
본 발명에서 사용할 수 있는 프로브로서는 제 1 내측영역 펩티드, 제 2 외측영역 펩티드 또는 제 2 외측영역의 영역구조 에피토프와 결합할 수 있는 분자이면 특별히 한정되지 않는다. 예컨대, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 재조합 항체, 리셉터, 또는 아날로그 등을 들 수 있지만, 바람직하게는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편이다.
모노클로날 항체의 항체 단편으로서는 제 1 내측영역 펩티드, 제 2 외측영역 펩티드 또는 제 2 외측영역의 영역 구조 에피토프와 결합하는 항원 결합 영역을 포함하는 항체 단편이면 한정하지 않지만, 예컨대 Fab, Fab', F(ab')2, 또는 Fv 등을 들 수 있다. 이들 항체 단편은, 예컨대 본 발명의 모노클로날 항체를 상법에 의해 단백질 분해 효소(예컨대, 펩신 또는 파파인 등)에 의해 소화하고, 이어서 상법의 단백질 분리 정제 방법에 의해 정제함으로써 얻을 수 있다.
이하, 프로브로서 항체, 특히 모노클로날 항체를 사용한 실시형태에 관해 설명하지만, 그 외의 프로브를 이용해도 본 발명의 HBs 항원 분석방법과 동일하게 실시하는 것이 가능하다.
HBs 항원 분석방법의 측정 원리는 HBs 항원을 포착 항체와 검출 항체를 사용해서 검출하는 방법이면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 샌드위칭법이다. 샌드위칭법으로서는 2스텝법인 포워드 샌드위칭법, 리버스 샌드위칭법, 및 1스텝법을 들 수 있다.
HBs 항원의 분석방법은 B형 간염 바이러스 s 항원의 제 1 내측영역 펩티드에 결합하는 적어도 1개의 내측 포착 항체 및 제 2 외측영역 펩티드에 결합하는 적어도 1개의 외측 포착 항체, 피검시료, 및 상기 제 1 내측영역 펩티드에 결합하는 적어도 1개의 내측 검출 항체 및 상기 제 2 외측영역 펩티드에 결합하는 적어도 1개의 외측 검출 항체를 접촉시키는 접촉 공정; 및 검출 항체의 시그널을 검출하는 검출 공정을 포함할 수 있다.
또한, 상기 접촉 공정은 B형 간염 바이러스 s 항원의 제 1 내측영역 펩티드에 결합하는 적어도 1개의 내측 포착 항체 및 제 2 외측영역 펩티드에 결합하는 적어도 1개의 외측 포착 항체 및 피검시료를 접촉시키는 제 1 접촉 공정과 제 1 접촉 공정에서 형성된 항원 항체 복합체 및 상기 제 1 내측영역 펩티드에 결합하는 적어도 1개의 내측 검출 항체 및 상기 제 2 외측영역 펩티드에 결합하는 적어도 1개의 외측 검출 항체를 접촉시키는 제 2 접촉 공정으로 나누어서 행하는 것도 가능하다.
더욱 구체적으로는, 포워드 샌드위칭법은 이하와 같이 행할 수 있다. 우선, 마이크로플레이트나 비즈 등의 불용성 담체에 HBs 항원과 결합하는 포착 항체를 고상화한다. 다음에, 포착 항체나 불용성 담체로의 비특이적인 흡착을 방지하기 위해서 적당한 블로킹제(예컨대, 소 혈청 알부민이나 젤라틴 등)로 불용성 담체의 블로킹을 행한다. 포착 항체가 고상화된 플레이트나 비즈에 측정하는 HBs 항원이 포함된 피검시료를 1차 반응액과 함께 가하여 포착 항체와 HBs 항원을 접촉시켜 결합시킨다(1차 반응공정). 그 후, 포착 항체에 결합되지 않은 항원이나 불순물을 적당한 세정액(예컨대, 계면활성제를 포함하는 인산 완충액)으로 세정한다. 다음에, 포착된 HBs 항원을 인식하는 항체와 서양 고추냉이 퍼옥시다제(HRP) 등의 효소가 결합된 표지 항체를 첨가하고, 포착된 항원에 표지 항체를 결합시킨다(2차 반응공정). 이 반응에 의해 포착 항체-항원-표지 항체의 면역복합체가 마이크로플레이트 등의 담체 상에 형성된다. 결합되지 않은 표지 항체를 세정액으로 세정하고, 표지 항체의 효소에 대한 발색 기질이나 발광 기질을 첨가해서 효소와 기질을 반응시킴으로써 시그널을 검출한다.
본 발명의 HBs 항원의 분석방법에 있어서 사용하는 포착 항체란 피검 시료 중의 HBs 항원을 포착하는 항체이지만, 상기 불용성 담체를 사용한 샌드위칭법에서는 불용성 담체에 고상화되는 고상 항체이다. 이 포착 항체는 B형 간염 바이러스 s 항원의 제 1 내측영역 펩티드에 결합하는 적어도 1개의 내측 포착 항체, 및 제 2 외측영역 펩티드에 결합하는 적어도 1개의 외측 포착 항체를 조합시켜서 사용한다. 이 2개의 항체 이외에, 다른 항체를 더 추가해서 포착 항체로서 사용하는 것도 가 능하다.
본 발명의 HBs 항원의 분석방법에 있어서 사용하는 검출 항체란 포착 항체에 의해 포착된 피검 시료 중의 HBs 항원을 검출하는 항체이지만, 상기 불용성 담체를 사용하는 샌드위칭법에서는 효소 등에 의해 표지된 표지 항체이다. 이 검출 항체는 B형 간염 바이러스 s 항원의 제 1 내측영역 펩티드에 결합하는 적어도 1개의 내측 검출 항체, 및 제 2 외측영역 펩티드에 결합하는 적어도 1개의 외측 검출 항체를 조합시켜서 사용한다. 이 2개의 항체 이외에 다른 항체를 더 추가해서 검출 항체로서 사용하는 것도 가능하다.
B형 간염 바이러스 s 항원의 제 1 내측영역 펩티드에 결합하는 내측 포착 항체와 내측 검출 항체는 그들이 결합하는 에피토프가 다른 항체가 바람직하다. 「에피토프가 다름」이란 에피토프가 완전히 일치하지 않는 것을 의미한다. 예컨대, 2개의 항체가 동일한 모노클로날 항체일 경우나 2개의 항체가 에피토프 저해 시험에 의해 완전히 저해되는 항체일 경우는 2개의 항체의 에피토프가 완전히 일치한다. 내측 포착 항체 에피토프와 내측 검출 항체의 에피토프가 일부 중복하여 있을 경우에도 대부분의 경우 본 발명의 HBs 항원의 분석방법에 있어서 사용할 수 있다.
또한, B형 간염 바이러스 s 항원의 98∼156번 아미노산 잔기로 이루어진 제 2 외측영역 펩티드에 결합하는 외측 포착 항체와 외측 검출 항체도 그들이 결합하는 에피토프가 다른 항체가 바람직하다. 「에피토프가 다름」이란 에피토프가 완전히 일치하지 않는 것을 의미한다. 예컨대, 2개의 항체가 동일한 모노클로날 항체일 경우나 2개의 항체가 에피토프 저해 시험에 의해 완전히 저해되는 항체일 경우는 2 개의 항체의 에피토프가 완전히 일치한다. 내측 포착 항체 에피토프와 내측 검출 항체의 에피토프가 일부 중복하여 있을 경우에도 대부분의 경우 본 발명의 HBs 항원의 분석방법에 있어서 사용할 수 있다.
본 발명의 프로브, 특히 모노클로날 항체나 그 항체 단편이 인식하는 에피토프는 연속하는 아미노산 잔기로 구성되는 연속 에피토프, 및 HBs 항원 시트 구조나 헬릭스 구조에 의해 형성되는 연속되지 않은 아미노산의 조합으로 구성되는 구조 에피토프(불연속 에피토프)가 포함된다.
항체를 표지하는 효소로서는 서양 고추냉이 퍼옥시다제(HRP), 알칼리 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 및 루시페라아제 등을 들 수 있다. 또 효소 이외에도 표지 물질로서 아크리디늄 유도체 등의 발광 물질, 유로퓸 등의 형광물질, I125 등의 방사성 물질 등을 사용할 수 있다. 또한, 표지 물질에 맞추어 기질이나 발광 유도 물질을 적당히 선택할 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서의 표지 항체는 검출 마커로서 하프텐이나 저분자량의 펩티드, 렉틴 등의 항원 항체 반응 시그널의 검출에 이용할 수 있는 물질을 결합시킨 항체도 포함한다. 하프텐에는 비오틴, 디니트로페닐(DNP), FITC 등이 포함된다. 예컨대, 비오틴을 항체에 결합시켜 프로브 복합체를 작성했을 경우 비오틴에 친화성이 있는 아비딘에 HRP 등의 효소, 플루오레세인 등의 형광물질, 또는 아크리디늄 유도체 등의 발광 물질을 표지하고, 프로브 복합체와 반응시켜 발색, 형광, 발광 등에 의해 시그널을 검출할 수 있다.
항체의 표지방법은 특별히 한정되지 않고, 종래 공지의 방법을 사용할 수 있지만, 예컨대 항체를 효소 등의 표지물에 직접 표지하는 방법, 덱스트란 등의 고분자 화합물에 항체와 효소 등의 표지물을 결합시키는 방법, 표지 항체를 덱스트란 등의 고분자 화합물에 결합시키는 방법 등이 포함된다.
본 발명의 항체에는 동물의 폴리클로날 항체 및 인간이나 마우스의 모노클로날 항체를 포함하지만, 항체를 얻기 위해서 동물을 면역하는 방법, 및 모노클로날 항체를 산생하는 하이브리도마를 얻기 위한 방법은 HBs 항원이나 HBs 항원의 부분 펩티드를 면역원으로서 사용하는 것을 제외하고는 공지의 방법에 의해 실시할 수 있고, 예컨대 속 생화학 실험강좌(일본 생화학회 편), 또는 면역생화학연구법(일본 생화학회 편)에 기재된 방법에 따라 행할 수 있다. 면역용 HBs 항원은 바이러스 입자, 또는 바이러스 입자로부터 HBs 항원을 정제해서 사용할 수 있다. 또한, HBs 항원, 제 1 내측영역 펩티드 및 제 2 외측영역 펩티드는, 예컨대 그들 항원을 유전자 재조합에 의해 대장균에서 발현시켜 정제함으로써 얻을 수 있다. 또한, HBs 항원의 부분 펩티드는 화학 합성에 의해 조제할 수 있고, 예컨대 Fmoc 고상합성법, Boc 고상합성법에 의해 합성할 수 있다. 합성한 펩티드는 HPLC 등의 공지의 방법으로 정제할 수 있고, 말단 아미노산을 시스테인으로 해서 그 SH기를 이용해 펩티드를 담체 단백질에 결합시켜 면역원으로서 사용할 수도 있다.
HBs 항원, 제 1 내측영역 펩티드 및 제 2 외측영역 펩티드를 면역원으로서 사용하여 동물을 면역함으로써 본 발명의 항체를 취득할 수 있다. 면역에 사용하는 동물은 특별히 한정되지 않지만, 양, 염소, 토끼, 마우스, 래트, 모르모트, 새, 소, 말 등을 사용할 수 있다. HBs 항원, 제 1 내측영역 펩티드 및 제 2 외측영역 펩티드를, 예컨대 등량의 프로인트의 완전 아쥬반트 또는 Titer-Max gold(Titer Max사)와 유화 혼합해서 토끼의 피하나 마우스의 복강내에 투여한다. 이후, 1∼2주간 간격으로 동일한 면역 조작을 행한다. 이렇게 하여 면역한 동물로부터 채혈해서 혈청 또는 혈장으로 함으로써 본 발명의 항체를 조제할 수 있다.
본 발명의 모노클로날 항체를 산생하는 본 발명의 하이브리도마는 상기 면역조작을 행한 동물로부터 취득할 수 있다. 예컨대, 마우스에 수회의 면역조작을 행한 2주 후에 미정맥으로부터 인산 완충화 생리식염수(PBS) 등에 용해한 HBs 항원, 제 1 내측영역 펩티드 및 제 2 외측영역 펩티드를 접종한다. 그 2∼3일 후에 마우스로부터 항체를 산생하는 림프구를 포함하는 비장을 무균적으로 적출한다. 이 림프구를, 예컨대 골수종 세포와 세포 융합시킴으로써 모노클로날 항체를 산생하는 하이브리도마를 수립하는 것이 가능하다.
세포융합은, 예컨대 폴리에틸렌글리콜 존재 하에서 림프구 및 골수종 세포를 융합시킴으로써 행할 수 있다. 골수종 세포는, 예컨대 하이포크산틴-구아닌-포스포리보실트랜스퍼라제 결손 또는 티미딘 키나제 결손과 같은 마커를 갖는 공지의 세포를 사용할 수 있다. 구체적으로는, 예컨대 p3·NS-1/1·Ag4.1 또는 SP2/0-Ag14 등의 세포를 들 수 있다. 융합한 세포는 선택배지, 예컨대 HAT 배지를 이용하여 융합하지 않은 세포를 사멸시킴으로써 선택한다.
다음에, 증식해 온 하이브리도마의 배양 상청 중의 항체 산생 유무를 스크리닝한다. 스크리닝은 HBs 항원, 제 1 내측영역 펩티드 및 제 2 외측영역 펩티드에 대한 특이항체의 산생을 고상 효소 면역측정법(ELISA법) 등을 이용하여 측정함으로써 실시할 수 있다. 목적한 항체를 분비하고 있는 하이브리도마의 클론을 선택하고, 더욱 한계희석법에 의해 서브클로닝을 더 반복함으로써 모노클로날 항체의 클론성을 보증할 수 있다. 이렇게 하여, 본 발명의 항체를 산생하는 하이브리도마를 선택할 수 있고, 본 발명의 모노클로날 항체를 산생하는 하이브리도마 세포주 HBs121[국제수탁번호 FERM BP-10697], HBs123[국제수탁번호 FERM BP-10698], HBs136[국제수탁번호 FERM BP-10699], HBs163[국제수탁번호 FERM BP-10700], HBs605C3[국제수탁번호 FERM BP-10701], SF111[국제수탁번호 FERM BP-1070], SF124CS[국제수탁번호 FERM BP-10703]은 2006년 10월 12일에 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(수신자: 우편 305-8566 일본국 이바라켄 츠쿠바시 1-1-1 중앙 제 6)에 국제 기탁되었다. 또한, 하이브리도마 세포주 6G6[국제수탁번호 FERM BP-10117]은 2004년 9월 9일에 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁 센터에 국제 기탁되었다.
또한, 본 발명에 있어서 하이브리도마 세포주로부터 산생된 항체는 그 하이브리도마 세포주의 명칭 또는 국제 수탁번호에 「항체」를 붙인 명칭으로 나타낸다. 예컨대, 하이브리도마 세포주 HBs121로부터 산생된 항체는 「HBs121 항체」또는 「FERM BP-10697 항체」라고 한다.
본 발명의 하이브리도마는 공지의 임의의 배지, 예컨대 RPMI1640에서 계대배양할 수 있다. 본 발명의 모노클로날 항체는 이 하이브리도마를 배양함으로써 조제 할 수 있지만, 예컨대 RPMI1640 배지에 10% 소 태아 혈청을 가하고, 5% CO2 존재하 37℃에서 배양함으로써 배양 상청 중에 항체가 산생된다. 또한, 프리스탄(pristane)으로 전처리한 마우스의 복강 내에 하이브리도마를 접종하고, 10∼20일 후에 복수를 회수함으로써 복수 중에 항체를 산생시키는 것이 가능하다. 본 발명의 항체는 공지의 방법에 의해 정제할 수 있지만, 예컨대 단백질 G 또는 단백질 A 컬럼을 사용한 정제법, HBs 항원을 결합시킨 친화성 컬럼을 사용하는 방법, 또는 이온 교환 컬럼을 사용하는 방법 등으로 정제할 수 있다.
얻어진 모노클로날 항체가 인식하는 에피토프는 HBs 항원 유래의 서열로부터 제작한 재조합 항원, 제 1 내측영역 펩티드, 제 2 외측영역 펩티드 또는 화학합성 한 10∼20 아미노산 정도의 합성 펩티드를 이용하여 고상 효소 면역측정법(ELISA법)에 의해 결정할 수 있다. 본 발명의 각 하이브리도마로부터 산생되는 모노클로날 항체의 에피토프는 유전자형이 다른 HBs 항원의 아미노산 서열에 의거하여 10잔기씩 오버랩핑하여 화학합성한 20 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드에 대한 반응성에 따라 결정했다. HBs121 항체는 유전자형 C 및 D의 151∼170번 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드에 결합하고, 유전자형 A 및 B의 151∼170번 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드에는 결합하지 않는 항체이다. HBs123 항체는 유전자형 A∼D의 31∼50번 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드에 결합하는 항체이다. HBs136 항체는 유전자형 A, C 및 D의 111∼130번 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드에 결합하는 항체이다. HBs163 항체는 유전자형 A∼D의 31∼50번 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드에 결합하는 항체이다. SF111 항체는 유전자형 A, B 및 C의 51∼69번 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드와 결합하는 항체이다. 한편, HBs605C3 항체, 및 SF124CS 항체는 20 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드 모두와 결합하지 않았다. HBs605C3 항체 및 SF124CS 항체는 1∼226번 아미노산 잔기로 이루어진 HBs 항원과는 결합하여 98∼156번 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드와 결합하기 때문에 B형 간염 바이러스 s 항원의 구조 에피토프, 예컨대 공통 항원결정기 a를 인식하는 항체이다. 또한, 후술하는 실시예에서 사용하고 있는 6G6 항체는 51∼60번 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드에 결합하는 항체이며, 구체적으로는 HBs 항원의 41∼60번 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드 및 51∼70번 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드와 결합한다.
본 발명의 샌드위칭법에 의한 HBs 항원의 분석 키트는 HBs 항원의 제 1 내측영역 펩티드에 결합하는 적어도 1개의 내측 포착 프로브 및 제 2 외측영역 펩티드에 결합하는 적어도 1개의 외측 포착 프로브가 고상화된 불용성 담체(예컨대, 96 웰 플레이트 또는 비즈), 및 상기 제 1 내측영역 펩티드에 결합하는 적어도 1개의 내측 검출 프로브 및 상기 제 2 외측영역 펩티드에 결합하는 적어도 1개의 외측 검출 프로브를 검출 프로브로서 포함하는 HBs 항원의 분석 시약을 포함할 수 있다. HBs 항원의 분석 시약은 용액의 상태로 제공되어서 좋지만, 동결 건조시킨 분말상태로 제공되어도 좋다. 본 발명의 HBs 항원의 분석 키트는 B형 간염 바이러스 항원, 기타 항 B형 간염 바이러스 항체, 사용 설명서 등을 포함할 수 있다.
실시예
이하에 실시예 및 비교예를 나타내서 본 발명의 구체적인 설명을 하지만, 이 들은 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
<실시예 1> 모노클로날 항체 산생 하이브리도마의 수립
(A) HBs 항원
HBs 항원의 26∼80번으로 이루어진 펩티드를 코딩하는 DNA 단편을 발현 벡터인 pATtrpE 벡터에 도입했다. 얻어진 pATtrpE-HBs(26-80)를 대장균 HB101주에 의해 발현시켜 균체를 회수했다. 발현 항원을 겔 여과 및 이온 교환 컬럼으로 정제하여 TrpE-HBs(26-80) 항원을 취득했다. 이 TrpE-HBs(26-80) 항원, 구입한 rHBsAg(Yeast; Advanced Chemical사) 및 rHBsAg(CHO; Anapure사)를 면역 및 ELISA법에 의한 마우스 항체가의 측정 및 스크리닝에 사용했다.
(B) 면역
TrpE-HBs(26-80) 항원, rHBsAg(Yeast) 또는 rHBsAg(CHO)의 항원 용액(2mg/mL)을 등량의 Titer-Max Gold(Titer Max USA사)와 유화할 때까지 혼화하고, 그 혼합액 0.1mL를 4∼6주령의 암컷 Balb/c 마우스의 복강내 또는 풋 패드에 주사함으로써 면역을 행했다(제 1 회 면역). 1주 걸러 2회, 동일한 방법에서 조정한 혼합액 0.1mL를 복강내에 투여했다(제 2 및 3회 면역). 제 2 및 제 3 회, 경우에 따라서는 제 4 회 또는 제 5 회 면역을 해서 1주 후에 마우스로부터 채혈하고, 항체 가를 후술하는 (C) 방법에 따라 측정했다. 항체가가 상승한 마우스에 대하여, TrpE-HBs(26-80) 항원, rHBsAg(Yeast), 또는 rHBsAg(CHO)의 항원 용액(0.1mg/mL)을 등량의 PBS로 희석하고, 그 희석액 0.1mL를 마우스의 정맥 내에 투여했다(최종 면역). 최종 면역으로부터 3일 경과한 후에 마우스로부터 비장 또는 서경 림프절을 무균적으로 적출해서 이하의 (D) 세포융합 공정에 사용했다.
(C) ELISA법에 의한 항체가의 측정
96구멍 ELISA용 플레이트(Nunc사)에 TrpE-HBs(26-80) 항원, rHBsAg(Yeast) 항원, 또는 rHBsAg(CHO) 항원(1㎍/mL)을 각각 100㎕씩 나누어 주입하고, 4℃에서 하룻밤 방치했다. 다음에, 이 플레이트의 각 웰을 0.5% 카세인 나트륨 및 2% 수크로오스를 포함하는 인산 완충화 생리식염수(PBS)에서 30분 블로킹했다. 이 블로킹액을 제거한 후 상기 공정(B)에서 얻어진 혈청을 0.1% 카세인 나트륨, 1% 소 혈청 알부민(BSA), 1mM EDTA, 0.01% Tween20을 포함하는 PBS로 1,000배부터 1,000,000배까지 희석해서 100㎕를 웰에 첨가했다. 실온에서 60분 방치한 후 0.05% Tween20/PBS(이하, PBST라고 칭함)로 3회 세정했다. 이어서, 서양 고추냉이 퍼옥시다제(HRP) 표지항 마우스 IgG 항체(염소; Jackson사) 100㎕(0.08㎍/mL)를 가하고 실온에서 1시간 방치한 후 다시 PBST로 4회 세정했다. OPD 기질 용액[2.2mMo-페닐렌디아민, 0.03% 과산화수소수를 포함하는 0.075M 시트르산 인산 완충액(pH 5.0)] 100㎕를 각 웰에 가하여 25℃에서 30분간 반응시키고, 1M 황산 100㎕를 각 웰에 가하여 각 웰의 492nm에 있어서의 흡광도를 측정했다.
(D) 세포융합
무균적으로 적출한 마우스의 비장 또는 서경 림프절을 RPMI1640 배지 8mL가 든 샬레에 넣었다. 비장 세포를 유출시킨 후 이 비장 또는 서경 림프절 세포 현탁액을 메쉬에 통과시키고, 50mL 원심 튜브에 모아서 RPMI1640 배지 32mL를 가하여 현탁한 후 150×g에서 5분간 원심했다. 상청을 흡인한 후 RPMI 배지 40mL에 현탁해 서 150×g에서 5분간 원심했다. 이 조작을 2회 했다. 이렇게 하여 얻어진 세포 펠렛을 RPMI1640 배지 40mL에서 재현탁하여 비세포 또는 림프절 세포수를 측정했다.
한편, 50mL 튜브에 미리 배양해 둔 마우스 골수중 세포 SP2/0-Ag14[이화학연구소 진뱅크](약 2×107개)에 상기 비장 또는 림프절 세포(약 1×108개)를 가하고 RPMI1640 배지 중에서 잘 혼합해서 원심분리를 했다(150×g, 5분간). 그 상청을 흡인하고 펠렛을 잘 풀어내어 37℃로 보온해 둔 50% 폴리에틸렌글리콜(PEG) 4000 용액 1mL를 적하하고, 원심 튜브를 손으로 1분간 온화하게 회전함으로써 PEG 용액과 세포 펠렛을 혼합시켰다. 다음에, 37℃로 보온해 둔 RPMI1640 배지 9mL를 더해 튜브를 온화하게 회전시켰다. 그 후, 원심분리(150×g, 5분)를 행하고, 상청을 제거한 후 세포 펠렛을 10% 소 태아 혈청과 5% Briclone(인간 IL-6, Dainippon Pharmaceutical Company Limited)을 포함하는 HAT 배지(RPMI1640 배지에 아미노프테린 4×10-7M, 티미딘 1.6×10-5M, 및 하이포크산틴 1×10-4M이 되도록 첨가한 것) 50mL에 현탁했다. 이 세포현탁액을 96웰 세포배양 플레이트의 각 웰에 100㎕씩 나누어 주입하고, 5% 탄산 가스를 포함하는 37℃의 탄산 가스 배양기에서 배양을 개시했다. 배양 중 2∼3일 간격으로 각 웰의 배지 약 100㎕를 제거하고, 새롭게 상기 HAT 배지 100㎕를 가함으로써 HAT 배지 중에서 증식하는 하이브리도마를 선택했다. 약 10일째에 이하의 하이브리도마의 스크리닝을 행했다.
(E) 하이브리도마의 스크리닝
혈청시료 대신에 하이브리도마의 배양 상청 100㎕를 사용하는 것 이외에는 상기 공정(C)의 ELISA법에 의한 항체가의 측정을 반복해서 하이브리도마의 스크리닝을 했다. 항체 산생이 확인된 웰 중의 각 하이브리도마를 한계희석법에 의해 클로닝했다. 10일 후에 동일하게 ELISA법을 행하여 본 발명의 모노클로날 항체를 산생하는 하이브리도마의 클론을 스크리닝했다. 그 결과, 하이브리도마 세포주 HBs121[국제수탁번호 FERM BP-10697], HBs123[국제수탁번호 FERM BP-10698], HBs136[국제수탁번호 FERM BP-10699], HBs163[국제수탁번호 FERM BP-10700], HBs605C3[국제수탁번호 FERM BP-10701], SF111[국제수탁번호 FERM BP-10702], SF124CS[국제수탁번호 FERM BP-10703]의 하이브리도마주를 수립했다. 각 하이브리도마는 2006년 10월 12일에 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(수신자: 우편 305-8566 일본국 이바라켄 츠쿠바시 1-1-1 중앙 제 6)에 국제 기탁되었다.
본 발명의 각 하이브리도마로부터 산생되는 모노클로날 항체의 에피토프를 HBs 항원 유래의 20 아미노산 잔기의 펩티드를 사용한 ELISA법으로 결정했다. 유전자형이 다른 HBs 항원의 아미노산 서열에 근거해 10잔기씩 오버랩핑한 20 아미노산 잔기 또는 19 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드를 화학합성해서 ELISA 법의 항원으로 사용했다. 에피토프의 결정에 사용한 펩티드를 표 1에 나타낸다. HBs 항원의 1∼20번 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드로서 PepHBS1AD(서열번호 2), PepHBS1B(서열번호 3), PepHBS1C2(서열번호 4) 및 PepHBS1C(서열번호 5)를, 11∼30번 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드로서 PepHBS2ACD(서열번호 6), PepHBS2B(서열번호 7)를, 21∼40번 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드로서 PepHBS3ACD(서열번호 8)를, 31∼50번 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드로서 PepHBS4A(서열번호 9), PepHBS4B(서열번호 10), PepHBS4C(서열번호 11) 및 PepHBS4D(서열번호 12)를, 41∼60번 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드로서 PepHBS5A(서열번호 13), PepHBS5B(서열번호 14), PepHBS5C(서열번호 15) 및 PepHBS5D(서열번호 16)를, 51∼69번 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드로서 PepHBS6AC(서열번호 17) 및 PepHBS6B(서열번호 18)를, 61∼80번 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드로서 PepHBS7AC(서열번호 19) 및 PepHBS7D(서열번호 20)를, 71∼90번 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드로서 PepHBS8ACD(서열번호 21) 및 PepHBS8B(서열번호 22)를, 81∼100번 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드로서 PepHBS9ACD(서열번호 23)를, 91∼110번 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드로서 PepHBS10C(서열번호 24)를, 101∼119번 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드로서 PepHBS11A(서열번호 25), PepHBS11BD(서열번호 26) 및 PepHBS11C(서열번호 27)를, 111∼130번 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드로서 PepHBS12A(서열번호 28), PepHBS12C(서열번호 29), PepHBS12D1(서열번호 30) 및 PepHBS12D2(서열번호 31)를, 121∼140번 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드로서 PepHBS13A(서열번호 32), PepHBS13B(서열번호 33), PepHBS13C(서열번호 34), PepHBS13D1(서열번호 35) 및 PepHBS13D2(서열번호 36)를, 131∼150번 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드로서 PepHBS14A(서열번호 37) 및 PepHBS14C(서열번호 38)를, 141∼160번 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드로서 PepHBS15C(서열번호 39)를, 151∼170번 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드로서 PepHBS16AB(서열번호 40), PepHBS16C2(서열번호 41), PepHBS16C(서열번호 42) 및 PepHBS16D(서열번호 43)를, 161∼180번 아미노산 잔기 로 이루어진 펩티드로서 PepHBS17C(서열번호 44) 및 PepHBS17D(서열번호 45)를, 171∼190번 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드로서 PepHBS18ABD(서열번호 46) 및 PepHBS18C(서열번호 47)를, 181∼200번 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드로서 PepHBS19A(서열번호 48) 및 PepHBS19C(서열번호 49)를, 191∼210번 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드로서 PepHBS20A(서열번호 50), PepHBS20B(서열번호 51) 및 PepHBS20C(서열번호 52)를, 201∼220번 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드로서 PepHBS21A(서열번호 53), PepHBS21B(서열번호 54), PepHBS21C(서열번호 55) 및 PepHBS21D(서열번호 56)를, 211∼226번 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드로서 PepHBS22CD(서열번호 57)을 사용했다. 각 펩티드 말미의 A, B, C, D 등의 문자는 그 펩티드의 아미노산 서열이 대표적인 유전자형의 아미노산 서열인 것을 나타내고 있다. 또한, AB의 문자는 그 펩티드의 아미노산 서열이 유전자형 A 및 B에 공통인 아미노산 서열인 것을 나타내고 있다.
에피토프 해석 결과, HBs121 항체는 151∼170번 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드이고, PepHBS16C2, PepHBS16C 및 PepHBS16D에 결합했지만 PepHBS16AB에는 결합하지 않았다. HBs123 항체는 31∼50번 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드이고, PepHBS4A, PepHBS4B, PepHBS4C에 결합했지만 PepHBS4D에는 결합하지 않았다. HBs136 항체는 111∼130번 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드이고, PepHBS12A, PepHBS12C, PepHBS12D1 및 PepHBS12D2에 결합했다. HBs163 항체는 31∼50번 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드이고, PepHBS4A, PepHBS4B, PepHBS4C에 결합했지만 PepHBS4D에는 결합하지 않았다. SF111 항체는 51∼69번 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드이고, PepHBS6AC에 결합했지만, PepHBS6B에는 결합하지 않았다. 한편, HBs605C3 항체 및 SF124CS 항체는 1∼226번 아미노산 잔기로 이루어진 HBs 항원과는 결합했지만 20 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드와는 결합하지 않았다.
Figure 112009023672519-PCT00001
<실시예 2> 수립한 모노클로날 항체의 조제
(A) 배양 상청으로부터의 모노클로날 항체의 조제
수립한 마우스 하이브리도마를 무혈청 배양지(Hybridoma-SFM, GIBCO)에서 37℃에서 5% 탄산 가스 분위기 중에서 72∼96시간 배양했다. 배양액을 재조합 단백질 A컬럼(GE Healthcare bio-science사)에 가했다. 컬럼으로부터 항체를 pH 5.5 완충액으로 용출하여 정제된 본 발명의 모노클로날 항체를 얻었다. 배양액 500mL로부터 약 10mg의 항체를 취득할 수 있었다.
(B) 복수로부터의 모노클로날 항체의 조제
4∼6주령의 Balb/c 마우스의 복강 내에 마우스 1마리당 프리스탄 0.5mL를 투여하고, 7일 후에 증식시킨 각 하이브리도마를 마우스 1마리당 5×1O6세포가 되도록 복강 내에 접종했다. 5마리의 마우스로부터 약 15mL의 복수를 얻었고, 2mL의 복수로부터 약 1Omg의 항체를 얻었다. 복수 중의 모노클로날 항체의 정제는 상기 배양 상청 중으로부터의 정제와 동일한 방법으로 했다.
<실시예 3> 모노클로날 항체의 HRP 표지
항체의 HRP표지는 Pierce사의 EZ-Link Plus Activated Peroxidase를 사용하여 행했다. 이 방법은 항체 분자 중의 아미노기에 알데히드기가 도입된 HRP를 결합시키는 방법이다. 표지는 제조자가 제공하는 프로토콜을 따라 실시했다.
<실시예 4>
본 실시예 4에서는 샌드위칭법의 포착 항체에 내측 포착 항체 단독, 외측 포착 항체 단독, 또는 내측 포착 항체 및 외측 포착 항체의 조합을 사용하고, 검출 항체에 내측 검출 항체 단독, 외측 검출 항체 단독, 또는 내측 검출 항체 및 외측 검출 항체의 조합을 사용하여 HBV 감염 환자의 검체의 HBs 항원을 측정했다.
내측 포착 항체로서 6G6 항체, 외측 포착 항체로서 HBs136 항체, 내측 검출 항체로서 SF111 항체, 외측 검출 항체로서 SF124CS 항체를 사용했다. 6G6 항체 단독, HBs136 항체 단독, 6G6 항체 및 HBs136 항체의 등량 혼합의 항체를 4㎍/mL의 농도에서 96구멍 마이크로플레이트(Costar 2592)의 각 웰에 100㎕ 가하여 4℃에서 밤새 배양했다. 0.15M NaCl을 포함하는 10mM 인산 완충액 pH 7.3으로 2회 세정한 후 0.5% 카세인 나트륨을 포함하는 10mM 인산 완충액을 각 웰에 350㎕ 가하고 37℃에서 5시간 블로킹했다. 블로킹액 제거 후 2%N 라우로일사르코신산 나트륨(NLS)(WAKO)을 포함하는 반응 완충액(pH 7.2) 25㎕와 건강인 검체 또는 HBV 양성 검체 75㎕를 각 웰에 가하고 교반하면서 실온에서 1시간 반응시켰다. 반응 후 0.05% Tween20을 포함하는 10mM 인산 완충액 pH 7.3(세정액)으로 8회 세정했다. 다음에, 서양 고추냉이 퍼옥시다제 표지한 SF124CS 항체, SF111 항체, 또는 SF124CS 항체 및 SF111 항체의 등량 혼합 항체를 2% BSA, 1% 마우스 혈청, 0.2% Triton X-100을 포함하는 10mM 인산 완충액 pH 7.3으로 희석해서 각 웰에 100㎕ 첨가하고 교반하면서 실온에서 1시간 반응시켰다. 세정액으로 8회 세정하고, 기질 용액(오르토 페닐렌디아민, SIGMA)을 각 웰에 100㎕ 가하여 실온에서 30분간 배양하고, 2N 황산을 각 웰에 100㎕ 가하여 반응을 정지시켰다. TOSOH 검출기를 이용하여 파장 620nm의 흡광도를 대조로 하여 492nm의 흡광도(O.D.)를 측정했다. 결과를 표 2에 나타냈다. 건강인 검체의 결과는 O.D.로 나타내고, HBV 양성 검체는 그 O.D.를 건강인의 O.D.로 나눈 Signal/Negative(S/N)으로 나타냈다. S/N이 1 이하는 N.D.(검출불능) 라고 했다. 또한, 표 2에 있어서의 포착 항체의 Int는 6G6 항체, Ext는 HBs136 항체, 검출 항체의 Int는 SF111 항체, Ext는 SF124CS 항체이다.
포착 항체에 Int만을 사용한 HBs 항원의 분석방법에서는 HBV 양성검체 4, 5 및 6의 HBs 항원을 측정할 수 없었다. 또한, 검출 항체에 Int만을 사용한 HBs 항원검출법에서는 HBV 양성검체 4, 5, 및 6의 HBs 항원을 측정할 수 없고, HBV 양성검체 10 및 12의 HBs 항원의 측정치가 현저하게 저하하여 있었다. 한편, 포착 항체에 Ext 및 검출 항체에 Ext를, 포착 항체에 Ext 및 검출 항체에 Int+Ext를, 포착 항체에 Int+Ext 및 검출 항체에 Ext를, 또는 포착 항체에 Int+Ext 및 검출 항체에 Int+Ext를 사용한 경우에는 모든 HBs 양성검체를 측정할 수 있었다.
Figure 112009023672519-PCT00002
<실시예 5>
본 실시예 5에서는 실시예 4의 포착 항체 및 검출 항체의 조합 항체를 사용하는 HBs 항원의 분석방법으로 HBs 항체 음성 조건과 HBs 항체 양성 조건에서의 HBs 항원을 측정했다. 구체적으로는, HBs 항원양성의 피검시료에 항체가가 높은 HBs항체 양성의 혈장을 첨가해서 그 영향을 조사했다.
내측 포착 항체로서 6G6 항체, 외측 포착 항체로서 HBs136 항체, 내측 검출 항체로서 SF111 항체, 외측 검출 항체로서 SF124CS 항체를 사용했다. 6G6 항체 단독, HBs136 항체 단독, 6G6 항체 및 HBs136 항체의 등량 혼합 용액을 4㎍/mL의 농도로 96구멍 마이크로플레이트(Costar 2592)의 각 웰에 100㎕ 가하고, 4℃에서 밤새 배양했다. 0.15M NaCl을 포함하는 10mM 인산 완충액 pH 7.3으로 2회 세정 후 0.5% 카세인 나트륨을 포함하는 10mM 인산 완충액을 각 웰에 350㎕ 가하여 37℃에서 5시간 블로킹을 했다. 블로킹액 제거 후 2% NLS(WAKO)를 포함하는 반응 완충액(pH 7.2) 25㎕와 HBs 항체 음성, 또는 HBs 항체 양성 혈장을 이용하여 건강인 검체 또는 HBV 양성검체를 희석하여 75㎕를 각 웰에 가하고 교반하면서 실온에서 1시간 반응시켰다. 반응 후 0.05% Tween20을 포함하는 10mM 인산 완충액 pH 7.3(세정액)으로 5회 세정했다. 다음에, 서양 고추냉이 퍼옥시다제 표지한 SF111 항체, SF124CS 항체 또는 그 등량 혼합 항체를 2% BSA, 1% 마우스 혈청, 0.2% Triton X-100을 포함하는 10mM 인산 완충액 pH 7.3으로 희석해서 각 웰에 100㎕를 첨가하고 교반하면서 실온에서 1시간 반응시켰다. 세정액으로 5회 세정하고, 기질 용액(오르토 페닐렌디아민, SIGMA)을 각 웰에 100㎕ 가하고 실온에서 30분간 배양하고, 2N 황산을 각 웰에 100㎕ 가하여 반응을 정지시켰다. TOSOH 검출기를 이용하여 파장 620nm의 흡광도를 대조로 하여 492nm의 흡광도를 측정했다. 측정 결과를 표 3에 나타냈다. HBs 항체 음성 혈장으로 희석한 값을 100%라고 했을 경우, HBs 항체 양성 혈장으로 희석한 값의 백분율을 억제율(%)로 표현했다. 또, 표 3에 있어서의 포착 항체(1stAb)의 Int는 6G6 항체, Ext는 HBs136 항체, 검출 항체(2ndAb)의 Int는 SF111 항체, Ext는 SF124CS 항체이다.
포착 항체에 EXt만을 사용한 HBs 항원의 분석방법에서는 HBV 양성검체 1 및 8에서는 모든 측정치가 63.5% 이하를, HBV 양성검체 3에서는 44.2% 이하를 나타냈다. 한편, 포착 항체에 Int 또는 Int+Ext를 사용한 HBs 항원의 분석방법에서는 HBV 양성검체 1 및 8의 모든 측정치가 72.3% 이상을, HBV 양성검체 3에서는 59.4% 이상을 나타냈다. 따라서, 포착 항체에 Int 또는 Int+Ext를 사용한 HBs 항원의 분석방법이 환자 체내의 항HBs 항체의 영향을 받기 어려운 것이 시사되었다.
Figure 112009023672519-PCT00003
상기 표 2 및 표 3의 결과를 표 4에 정리했다. 표 2는 실시예 4에서 모든 검체를 측정할 수 있는 항체의 조합을 ○라고 했다. 또한, 표 3은 실시예 5에서 HBV 양성검체 1에 있어서 측정치가 80% 이상, HBV 양성검체 3에 있어서 측정치가 60% 이상, HBV 양성검체 8에 있어서 측정치가 80% 이상을 나타낸 항체의 조합을 ○라고 했다.
Figure 112009023672519-PCT00004
표 4에 표시된 바와 같이 포착 항체에 Int+Ext 및 검출 항체에 Int+Ext를 사용했을 경우에 위음성의 발생이 저감하여 환자 생체내의 항 HBs 항체의 영향을 받기 어려운 HBs 항원의 분석방법을 개발하는 것이 가능한 것을 알 수 있다.
본 발명의 HBs 항원의 분석방법을 HBV 감염의 스크리닝에 사용함으로써 종래의 방법에서는 측정할 수 없었던 HBV에 감염된 피검시료를 측정하는 것이 가능해졌다. 또한, HBV 감염 환자의 HBs 항원량을 더 정확하게 측정할 수 있어 환자의 병태 파악에 유용하게 사용할 수 있다.
이상, 본 발명을 특정 실시형태에 따라 설명했지만, 당업자에 자명한 변형이나 개량은 본 발명 범위에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Advanced Life Science Institute, Inc. <120> Analysis method for Hepatitis B virus surface antigen <130> ALS-793 <150> JP 2006-294906 <151> 2006-10-30 <150> JP 2007-133539 <151> 2007-05-18 <160> 57 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 226 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 1 Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln 1 5 10 15 Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu 20 25 30 Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ser Pro Val Cys 35 40 45 Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser 50 55 60 Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe 65 70 75 80 Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Ile Val 85 90 95 Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly 100 105 110 Ser Thr Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala 115 120 125 Gln Gly Asn Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Thr Asp 130 135 140 Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys 145 150 155 160 Tyr Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu 165 170 175 Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu 180 185 190 Ser Ala Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile 195 200 205 Val Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val 210 215 220 Tyr Ile 225 <210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 2 Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln 1 5 10 15 Ala Gly Phe Phe 20 <210> 3 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 3 Met Glu Asn Ile Ala Ser Gly Leu Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln 1 5 10 15 Ala Gly Phe Phe 20 <210> 4 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 4 Met Glu Asn Thr Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln 1 5 10 15 Ala Gly Phe Phe 20 <210> 5 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 5 Met Glu Ser Thr Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln 1 5 10 15 Ala Gly Phe Phe 20 <210> 6 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 6 Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu 1 5 10 15 Thr Ile Pro Gln 20 <210> 7 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 7 Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Lys Ile Leu 1 5 10 15 Thr Ile Pro Gln 20 <210> 8 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 8 Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp 1 5 10 15 Thr Ser Leu Asn 20 <210> 9 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 9 Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ser Pro 1 5 10 15 Val Cys Leu Gly 20 <210> 10 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 10 Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr Pro 1 5 10 15 Val Cys Leu Gly 20 <210> 11 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 11 Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ala Pro 1 5 10 15 Thr Cys Pro Gly 20 <210> 12 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 12 Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr Thr 1 5 10 15 Val Cys Leu Gly 20 <210> 13 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 13 Phe Leu Gly Gly Ser Pro Val Cys Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro 1 5 10 15 Thr Ser Asn His 20 <210> 14 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 14 Phe Leu Gly Gly Thr Pro Val Cys Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Gln 1 5 10 15 Ile Ser Ser His 20 <210> 15 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 15 Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr Cys Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro 1 5 10 15 Thr Ser Asn His 20 <210> 16 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 16 Phe Leu Gly Gly Thr Thr Val Cys Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro 1 5 10 15 Thr Ser Asn His 20 <210> 17 <211> 19 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 17 Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys Pro 1 5 10 15 Pro Ile Cys <210> 18 <211> 19 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 18 Gln Asn Ser Gln Ser Gln Ile Ser Ser His Ser Pro Thr Cys Cys Pro 1 5 10 15 Pro Ile Cys <210> 19 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 19 Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys 1 5 10 15 Leu Arg Arg Phe 20 <210> 20 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 20 Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Thr Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys 1 5 10 15 Leu Arg Arg Phe 20 <210> 21 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 21 Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile 1 5 10 15 Leu Leu Leu Cys 20 <210> 22 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 22 Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Cys Ile 1 5 10 15 Leu Leu Leu Cys 20 <210> 23 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 23 Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Ile Val 1 5 10 15 Leu Leu Asp Tyr 20 <210> 24 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 24 Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val 1 5 10 15 Cys Pro Leu Leu 20 <210> 25 <211> 19 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 25 Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser Thr Thr Thr 1 5 10 15 Ser Thr Gly <210> 26 <211> 19 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 26 Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser Ser Thr Thr 1 5 10 15 Ser Thr Gly <210> 27 <211> 19 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 27 Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly Thr Ser Thr Thr 1 5 10 15 Ser Thr Gly <210> 28 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 28 Pro Gly Ser Thr Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr 1 5 10 15 Pro Ala Gln Gly 20 <210> 29 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 29 Pro Gly Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ile 1 5 10 15 Pro Ala Gln Gly 20 <210> 30 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 30 Pro Gly Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Thr Thr 1 5 10 15 Pro Ala Gln Gly 20 <210> 31 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 31 Pro Gly Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Met Thr 1 5 10 15 Thr Ala Gln Gly 20 <210> 32 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 32 Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Asn Ser Met Phe Pro Ser 1 5 10 15 Cys Cys Cys Thr 20 <210> 33 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 33 Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser 1 5 10 15 Cys Cys Cys Thr 20 <210> 34 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 34 Cys Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser 1 5 10 15 Cys Cys Cys Thr 20 <210> 35 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 35 Cys Arg Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Thr Ser Met Tyr Pro Ser 1 5 10 15 Cys Cys Cys Thr 20 <210> 36 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 36 Cys Arg Thr Cys Met Thr Thr Ala Gln Gly Thr Ser Met Tyr Pro Ser 1 5 10 15 Cys Cys Cys Thr 20 <210> 37 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 37 Asn Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Thr Asp Gly Asn 1 5 10 15 Cys Thr Cys Ile 20 <210> 38 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 38 Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn 1 5 10 15 Cys Thr Cys Ile 20 <210> 39 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 39 Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp 1 5 10 15 Ala Phe Ala Arg 20 <210> 40 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 40 Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys Tyr Leu Trp Glu Trp Ala 1 5 10 15 Ser Val Arg Phe 20 <210> 41 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 41 Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys Phe Leu Trp Glu Trp Ala 1 5 10 15 Ser Val Arg Phe 20 <210> 42 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 42 Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg Phe Leu Trp Glu Trp Ala 1 5 10 15 Ser Val Arg Phe 20 <210> 43 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 43 Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Gly Lys Phe Leu Trp Glu Trp Ala 1 5 10 15 Ser Ala Arg Phe 20 <210> 44 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 44 Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu 1 5 10 15 Val Pro Phe Val 20 <210> 45 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 45 Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu 1 5 10 15 Val Pro Phe Val 20 <210> 46 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 46 Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu 1 5 10 15 Ser Pro Thr Val 20 <210> 47 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 47 Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Ala Gly Leu 1 5 10 15 Ser Pro Thr Val 20 <210> 48 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 48 Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Ala Ile Trp 1 5 10 15 Met Met Trp Tyr 20 <210> 49 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 49 Gln Trp Phe Ala Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val Ile Trp 1 5 10 15 Met Met Trp Tyr 20 <210> 50 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 50 Trp Leu Ser Ala Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr 1 5 10 15 Ser Ile Val Ser 20 <210> 51 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 51 Trp Leu Ser Val Ile Trp Met Met Trp Phe Trp Gly Pro Ser Leu Tyr 1 5 10 15 Asn Ile Leu Ser 20 <210> 52 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 52 Trp Leu Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr 1 5 10 15 Asn Ile Leu Ser 20 <210> 53 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 53 Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile Val Ser Pro Phe Ile Pro Leu Leu 1 5 10 15 Pro Ile Phe Phe 20 <210> 54 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 54 Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Asn Ile Leu Ser Pro Phe Met Pro Leu Leu 1 5 10 15 Pro Ile Phe Phe 20 <210> 55 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 55 Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Asn Ile Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu 1 5 10 15 Pro Ile Phe Phe 20 <210> 56 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 56 Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu 1 5 10 15 Pro Ile Phe Phe 20 <210> 57 <211> 16 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 57 Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile 1 5 10 15 ALS-793（1）

Claims (8)

  1. B형 간염 바이러스 s 항원의 제 1 내측영역 펩티드에 결합하는 1개 이상의 내측 포착 프로브 및 제 2 외측영역 펩티드에 결합하는 1개 이상의 외측 포착 프로브를 포착 프로브로서 사용하고, 상기 제 1 내측영역 펩티드에 결합하는 1개 이상의 내측 검출 프로브 및 상기 제 2 외측영역 펩티드에 결합하는 1개 이상의 외측 검출 프로브를 검출 프로브로서 사용하는 것을 특징으로 하는 B형 간염 바이러스 s 항원의 분석방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 내측 포착 프로브가 결합하는 에피토프와 상기 내측 검출 프로브가 결합하는 에피토프가 다르고, 상기 외측 포착 프로브가 결합하는 에피토프와 외측 검출 프로브가 결합하는 에피토프가 다른 것을 특징으로 하는 B형 간염 바이러스 s 항원의 분석방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 내측 포착 프로브는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에 있어서의 51∼60번 아미노산 서열로 이루어진 펩티드에 결합하는 프로브이며, 상기 외측 포착 프로브는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에 있어서의 111∼130번 아미노산 서열로 이루어진 펩티드에 결합하는 프로브이며, 상기 내측 검출 프로브는 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열에 있어서의 51∼69번 아미노산 서열로 이루어진 펩티드에 결합하는 프로브이며, 상기 외측 검출 프로브는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에 있어서의 98∼156번 아미노산 서열로 이루어진 펩티드에 결합하는 프로브인 것을 특징으로 하는 B형 간염 바이러스 s 항원의 분석방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 프로브는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편인 것을 특징으로 하는 B형 간염 바이러스 s 항원의 분석방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 내측 포착 모노클로날 항체는 FERM BP-10117 항체, FERM BP-10702 항체, FERM BP-10700 항체 및 FERM BP-10698 항체로 이루어진 군에서 선택되는 모노클로날 항체이며, 상기 내측 검출 모노클로날 항체는 FERM BP-10117 항체, FERM BP-10702 항체, FERM BP-10700 항체 및 FERM BP-10698 항체로 이루어진 군에서 선택되는 모노클로날 항체이며, 상기 외측 포착 모노클로날 항체는 FERM BP-10699 항체, FERM BP-10703 항체, FERM BP-10701 항체 및 FERM BP-10697 항체로 이루어진 군에서 선택되는 모노클로날 항체이며, 상기 외측 검출 모노클로날 항체는 FERM BP-10699 항체, FERM BP-10703 항체, FERM BP-10701 항체 및 FERM BP-10697 항체로 이루어진 군에서 선택되는 모노클로날 항체이며, 상기 내측 포착 모노클로날 항체와 상기 내측 검출 모노클로날 항체는 다른 항체이며, 상기 외측 포착 모노클로날 항체와 상기 외측 검출 모노클로날 항체는 다른 항체인 것을 특징으로 하는 B형 간염 바이러스 s 항원의 분석방법.
  6. B형 간염 바이러스 s 항원의 제 1 내측영역 펩티드에 결합하는 1개 이상의 내측 포착 프로브 및 제 2 외측영역 펩티드에 결합하는 1개 이상의 외측 포착 프로브를 포착 프로브로서 포함하는 항체 고상 담체, 및 상기 제 1 내측영역 펩티드에 결합하는 1개 이상의 내측 검출 프로브 및 상기 제 2 외측영역 펩티드에 결합하는 1개 이상의 외측 검출 프로브를 검출 프로브로서 포함하는 시약을 포함하는 것을 특징으로 하는 B형 간염 바이러스 s 항원의 분석 키트.
  7. 국제수탁번호 FERM BP-10702인 마우스 하이브리도마, 국제수탁번호 FERM BP-10698인 마우스 하이브리도마, 국제수탁번호 FERM BP-10699인 마우스 하이브리도마, 국제수탁번호 FERM BP-10703인 마우스 하이브리도마, 국제수탁번호 FERM BP-10701인 마우스 하이브리도마, 국제수탁번호 FERM BP-10700인 마우스 하이브리도마 또는 국제수탁번호 FERM BP-10697인 것을 특징으로 하는 마우스 하이브리도마.
  8. 국제수탁번호 FERM BP-10702인 마우스 하이브리도마, 국제수탁번호 FERM BP-10698인 마우스 하이브리도마, 국제수탁번호 FERM BP-10699인 마우스 하이브리도마, 국제수탁번호 FERM BP-10703인 마우스 하이브리도마, 국제수탁번호 FERM BP-10701인 마우스 하이브리도마, 국제수탁번호 FERM BP-10700인 마우스 하이브리도 마, 및 국제수탁번호 FERM BP-10697인 마우스 하이브리도마로 이루어진 군에서 선택되는 하이브리도마로부터 산생되는 것을 특징으로 하는 모노클로날 항체.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR101281098B1 (ko) * 2011-06-30 2013-07-02 주식회사 녹십자 Ｂ형 간염 바이러스 표면 항원상의 에피토프 및 이의 용도
US11454632B2 (en) 2017-11-30 2022-09-27 Fujirebio Inc. Assay method and assay kit for hepatitis B virus S antigen
JP7320492B2 (ja) * 2018-04-06 2023-08-03 富士レビオ株式会社 Ｂ型肝炎ウイルス抗原の免疫測定方法

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5196194A (en) * 1979-05-24 1993-03-23 The Regents Of The University Of California Vaccines containing Hepatitis B S-protein
US4599231A (en) 1984-03-09 1986-07-08 Scripps Clinic And Research Foundation Synthetic hepatitis B virus vaccine including both T cell and B cell determinants
CA2041772A1 (en) 1990-05-11 1991-11-12 Larry T. Mimms Monoclonal antibodies to pres2 and pres1 polypeptide of the hepatitis b viral envelope
GB9608626D0 (en) * 1996-04-25 1996-07-03 Univ College Of London Hepatitis b monoclonal antibodies
CA2275465A1 (en) 1996-12-27 1998-07-09 Merck & Co., Inc. Galanin receptor galr2 and nucleotides encoding same
EP0948533A1 (en) * 1996-12-30 1999-10-13 Innogenetics N.V. ANNEXIN V-BINDING POLYPEPTIDES DERIVED FROM HBsAg AND THEIR USES
JP2003083976A (ja) 2001-09-12 2003-03-19 A & T:Kk ＨＢｓ抗原測定試薬
CA2580620C (en) 2004-09-22 2014-04-22 Advanced Life Science Institute, Inc. Method of detecting hepatitis b virus s antigen

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