JPWO2008053901A1 - B型肝炎ウイルスs抗原の分析方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明者らは、これらの従来のHBs抗原の分析方法では、測定値が低くなる検体及び偽陰性となる検体について、HBs抗原の量を正確に測定できるようにするために、鋭意研究を重ねた結果、HBs抗原の特定の領域のペプチドを認識する抗体を組合せることによって、偽陰性の発生を無くし、HBs抗原の量を正確に測定することができるHBs抗原の分析方法を見出した。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
本発明によるB型肝炎ウイルスs抗原の分析方法の別の好ましい態様においては、前記内側捕捉プローブが、配列番号1で表されるアミノ酸配列における51〜60番のアミノ酸配列からなるペプチドに結合するプローブであり、前記外側捕捉プローブが配列番号1で表されるアミノ酸配列における111〜130番のアミノ酸配列からなるペプチドに結合するプローブであり、前記内側検出プローブが、配列番号1で表されるアミノ酸配列における51〜69番のアミノ酸配列からなるペプチドに結合するプローブであり、前記外側検出プローブが配列番号1で表されるアミノ酸配列における98〜156番のアミノ酸配列からなるペプチドに結合するプローブである。
本発明によるB型肝炎ウイルスs抗原の分析方法の別の好ましい態様においては、前記プローブが、モノクローナル抗体又はその抗体フラグメントであり、特には、内側捕捉モノクローナル抗体がFERM BP−10117抗体、FERM BP−10702抗体、FERM BP−10700抗体及びFERM BP−10698抗体からなる群から選択されるモノクローナル抗体であり、前記内側検出モノクローナル抗体が、FERM BP−10117抗体、FERM BP−10702抗体、FERM BP−10700抗体及びFERM BP−10698抗体からなる群から選択されるモノクローナル抗体であり、前記外側捕捉モノクローナル抗体がFERM BP−10699抗体、FERM BP−10703抗体、FERM BP−10701抗体及びFERM BP−10697抗体からなる群から選択されるモノクローナル抗体であり、前記外側検出モノクローナル抗体がFERM BP−10699抗体、FERM BP−10703抗体、FERM BP−10701抗体及びFERM BP−10697抗体からなる群から選択されるモノクローナル抗体であって、前記内側捕捉モノクローナル抗体と前記内側検出モノクローナル抗体とが異なる抗体であり、前記外側捕捉モノクローナル抗体と前記外側検出モノクローナル抗体とが異なる抗体である。
なお、本明細書における「分析」には、分析対象化合物の存在の有無を判定する「検出」と、分析対象化合物の存在量を決定する「定量」との両方が含まれる。
また、本発明による「B型肝炎ウイルスs抗原の分析方法」は、「B型肝炎ウイルスの診断方法」として用いることが可能である。
また、第2外側領域ペプチドは、好ましくは、HBs抗原の98〜156番のアミノ酸残基からなるHBV粒子の脂質二重膜の外側のERルーメンに存在する親水性のペプチドである。その標準的なアミノ酸配列は、配列番号1の98〜156番のアミノ酸配列である。しかしながら、本明細書における第2外側領域ペプチドは、HBs抗原のN末側から第2番目の脂質二重層の外側(ルーメン側)に存在するペプチドであればHBs抗原の配列番号1の98〜156番のアミノ酸配列からなるペプチドに限定されず、例えば、N末側からのアミノ酸の番号が異なるペプチドや、配列番号1の98〜156番のアミノ酸配列の1又は複数の箇所において、1又は複数個のアミノ酸が置換(変異)、欠失及び/又は挿入されたアミノ酸配列からなるペプチドを含むことができる。
以下、プローブとして抗体、特にはモノクローナル抗体を用いた態様について説明を行うが、その他のプローブを用いても、本発明のHBs抗原の分析方法を同様に実施することが可能である。
HBs抗原の分析方法は、B型肝炎ウイルスs抗原の第1内側領域ペプチドに結合する少なくとも1つの内側捕捉抗体及び第2外側領域ペプチドに結合する少なくとも1つの外側捕捉抗体、被検試料、並びに前記第1内側領域ペプチドに結合する少なくとも1つの内側検出抗体及び前記第2外側領域ペプチドに結合する少なくとも1つの外側検出抗体を接触させる接触工程;及び検出抗体のシグナルを検出する検出工程を含むことができる。
また、前記接触工程は、B型肝炎ウイルスs抗原の第1内側領域ペプチドに結合する少なくとも1つの内側捕捉抗体及び第2外側領域ペプチドに結合する少なくとも1つの外側捕捉抗体並びに被検試料を接触させる第1接触工程と、第1接触工程で形成された抗原抗体複合体及び前記第1内側領域ペプチドに結合する少なくとも1つの内側検出抗体及び前記第2外側領域ペプチドに結合する少なくとも1つの外側検出抗体を接触させる第2接触工程に分けて行うことも可能である。
更に、本発明における標識抗体は、検出マーカーとしてハプテンや低分子量のペプチド、レクチンなどの抗原抗体反応のシグナルの検出に利用できる物質を結合させた抗体も含む。ハプテンにはビオチン、ジニトロフェニル(DNP)、FITCなどが含まれる。例えばビオチンを抗体に結合させ、プローブ複合体を作成した場合、ビオチンに親和性のあるアビジンにHRPなどの酵素、フルオレセインなどの蛍光物質、又はアクリジニウム誘導体などの発光物質を標識し、プローブ複合体と反応させ発色、蛍光、発光などによりシグナルを検出することができる。
次に、増殖してきたハイブリドーマの培養上清中の抗体産生の有無をスクリーニングする。スクリーニングは、HBs抗原、第1内側領域ペプチド及び第2外側領域ペプチドに対する特異抗体の産生を固相酵素免疫測定法(ELISA法)などを用いて測定することによって実施することができる。目的の抗体を分泌しているハイブリドーマのクローンを選択し、更に限界希釈法によってサブクローニングを繰り返すことによって、モノクローナル抗体のクローン性を保証することができる。このようにして、本発明の抗体を産生するハイブリドーマを選択することができ、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株HBs121〔国際受託番号FERM BP−10697〕、HBs123〔国際受託番号FERM BP−10698〕、HBs136〔国際受託番号FERM BP−10699〕、HBs163〔国際受託番号FERM BP−10700〕、HBs605C3〔国際受託番号FERM BP−10701〕、SF111〔国際受託番号FERM BP−10702〕、SF124CS〔国際受託番号FERM BP−10703〕は、平成18年10月12日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(あて名:〒305−8566 日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6)に国際寄託された。また、ハイブリドーマ細胞株6G6〔国際受託番号FERM BP−10117〕は、平成16年9月9日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに国際寄託された。
なお、本明細書において、ハイブリドーマ細胞株から産生された抗体は、そのハイブリドーマ細胞株の名称又は国際受託番号に「抗体」を付けた名称で表す。例えば、ハイブリドーマ細胞株HBs121から産生された抗体は「HBs121抗体」又は「FERM BP−10697抗体」と称する。
(A)HBs抗原
HBs抗原の26〜80番からなるペプチドをコードするDNA断片を発現ベクターであるpATtrpEベクターに導入した。得られたpATtrpE−HBs(26−80)を、大腸菌HB101株で発現させ、菌体を回収した。発現抗原をゲルろ過及びイオン交換カラムで精製し、TrpE−HBs(26−80)抗原を取得した。このTrpE−HBs(26−80)抗原、購入したrHBsAg(Yeast;Advanced Chemical社)及びrHBsAg(CHO;anapure社)を免疫及びELISA法によるマウスの抗体価の測定及びスクリーニングに使用した。
(B)免疫
TrpE−HBs(26−80)抗原、rHBsAg(Yeast)又はrHBsAg(CHO)の抗原溶液(2mg/mL)を等量のTiter−Max Gold(Titer Max USA社)と乳化するまで混和し、その混合液0.1mLを4〜6週齢のメスのBalb/cマウス、の腹腔内又はフットパッドに注射することにより、免疫を行った(第1回免疫)。1週おきに2回、同様の方法で調整した混合液0.1mLを腹腔内に投与した(第2及び3回免疫)。第2及び第3回、場合によっては第4回又は第5回の免疫を行って1週後にマウスから採血し、抗体価を後述の(C)の方法に従い、測定した。抗体価の上昇したマウスに対し、TrpE−HBs(26−80)抗原、rHBsAg(Yeast)、又はrHBsAg(CHO)の抗原溶液(0.1mg/mL)を等量のPBSで希釈し、その希釈液0.1mLをマウスの静脈内に投与した(最終免疫)。最終免疫から3日経過した後に、マウスから脾臓又は鼠径リンパ節を無菌的に摘出し、以下の(D)の細胞融合の工程に使用した。
96穴ELISA用プレート(Nunc社)に、TrpE−HBs(26−80)抗原、rHBsAg(Yeast)抗原、又はrHBsAg(CHO)抗原(1μg/mL)を各々100μLずつ分注し、4℃で一夜放置した。次に、このプレートの各ウェルを0.5%カゼインナトリウム及び2%スクロースを含むリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)で30分ブロッキングした。このブロッキング液を除去した後、前記工程(B)で得られた血清を0.1%カゼインナトリウム、1%ウシ血清アルブミン(BSA)、1mM EDTA、0.01%Tween20を含むPBSで1,000倍から、1,000,000倍まで希釈し、100μLをウェルに添加した。室温で60分放置した後、0.05%Tween20/PBS(以下、PBSTと称する)で3回洗浄した。続いて、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)標識抗マウスIgG抗体(ヤギ;Jackson社)100μL(0.08μg/mL)を加え、室温で1時間放置した後、再び、PBSTで4回洗浄した。OPD基質溶液[2.2mMo−フェニレンジアミン、0.03%過酸化水素水を含む0.075Mクエン酸リン酸緩衝液(pH5.0)]100μLを各ウェルに加え、25℃で30分間反応させ、1M硫酸100μLを各ウェルに加え、各ウェルの492nmにおける吸光度を測定した。
無菌的に摘出したマウスの脾臓又は鼠径リンパ節をRPMI1640培地8mLの入ったシャーレーに入れた。脾臓細胞を流出させた後、この脾臓又は鼠径リンパ節細胞懸濁液をメッシュに通し、50mL遠心チューブに集めてRPMI1640培地32mLを加え、懸濁後、150×gで5分間遠心した。上清を吸引後、RPMI培地40mLに懸濁し、150×gで5分間遠心した。この操作を2回行った。このようにして得られた細胞ペレットをRPMI1640培地40mLで再懸濁し、脾細胞又はリンパ節細胞数を測定した。
血清試料の代わりに、ハイブリドーマの培養上清100μLを用いること以外は、前記工程(C)のELISA法による抗体価の測定を繰り返して、ハイブリドーマのスクリーニングを行った。抗体産生が認められたウェル中の各ハイブリドーマを、限界希釈法によりクローニングした。10日後に、同様にELISA法を行って、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのクローンをスクリーニングした。その結果、ハイブリドーマ細胞株HBs121〔国際受託番号FERM BP−10697〕、HBs123〔国際受託番号FERM BP−10698〕、HBs136〔国際受託番号FERM BP−10699〕、HBs163〔国際受託番号FERM BP−10700〕、HBs605C3〔国際受託番号FERM BP−10701〕、SF111〔国際受託番号FERM BP−10702〕、SF124CS〔国際受託番号FERM BP−10703〕のハイブリドーマ株を樹立した。各ハイブリドーマは、平成18年10月12日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(あて名:〒305−8566 日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6)に国際寄託された。
(A)培養上清からのモノクローナル抗体の調製
樹立したマウスハイブリドーマを、無血清培地(Hybridoma−SFM、GIBCO)で、37℃にて5%炭酸ガス雰囲気中において72〜96時間培養した。培養液を、リコンビナントプロテインAカラム(GEヘルスケアバイオサイエンス社)にアプライした。カラムから抗体をpH5.5の緩衝液で溶出して、精製された本発明のモノクローナル抗体を得た。培養液500mLから約10mgの抗体を取得することができた。
(B)腹水からのモノクローナル抗体の調製
4〜6週齢のBalb/cマウスの腹腔内に、マウス1匹あたりプリスタン0.5mLを投与し、7日後に、増殖させた各ハイブリドーマをマウス一匹あたり5×106細胞となるように腹腔内に接種した。5匹のマウスから約15mLの腹水が得られ、2mLの腹水から約10mgの抗体が得られた。腹水中のモノクローナル抗体の精製は、前記の培養上清中からの精製と同様の方法で行った。
抗体のHRP標識は、Pierce社のEZ−Link Plus Activated Peroxidaseを用いて行った。この方法は、抗体分子中のアミノ基にアルデヒド基が導入されたHRPを結合させる方法である。標識はメーカーの提供するプロトコールに従って実施した。
本実施例4では、サンドイッチ法の捕捉抗体に内側捕捉抗体単独、外側捕捉抗体単独、又は内側捕捉抗体及び外側捕捉抗体の組み合わせを用い、検出抗体に内側検出抗体単独、外側検出抗体単独、又は内側検出抗体及び外側検出抗体の組み合わせを用い、HBV感染患者の検体のHBs抗原を測定した。
内側捕捉抗体として6G6抗体、外側捕捉抗体としてHBs136抗体、内側検出抗体としてSF111抗体、外側検出抗体としてSF124CS抗体を使用した。6G6抗体単独、HBs136抗体単独、6G6抗体及びHBs136抗体の等量混合の抗体を、4μg/mLの濃度で96穴マイクロプレート(Costar2592)の各ウェルに100μL加え、4℃で一晩インキュベートした。0.15M NaClを含む10mMリン酸緩衝液pH7.3で2回洗浄後、0.5%カゼインナトリウムを含む10mMリン酸緩衝液を各ウェルに350μL加え、37℃で5時間ブロッキングを行った。ブロッキング液除去後、2%Nラウロイルサルコシン酸ナトリウム(NLS)(WAKO)を含む反応緩衝液(pH7.2)25μLと健常人検体又はHBV陽性検体75μLを各ウェルに加え、攪拌しながら室温で1時間反応させた。反応後、0.05%Tween20を含む10mMリン酸緩衝液pH7.3(洗浄液)で8回洗浄した。次に、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識したSF124CS抗体、SF111抗体、またはSF124CS抗体及びSF111抗体の等量混合抗体を2%BSA、1%マウス血清、0.2%TritonX−100を含む10mMリン酸緩衝液pH7.3で希釈して各ウェルに100μL添加し、攪拌しながら室温で1時間反応させた。洗浄液で8回洗浄し、基質溶液(オルトフェニレンジアミン、SIGMA)を各ウェルに100μL加え、室温で30分間インキュベートし、2N硫酸を各ウェルに100μL加えて反応を停止させた。TOSOHの検出器を用いて波長620nmの吸光度を対照として492nmの吸光度(O.D.)を測定した。結果を表2に示した。健常人検体の結果はO.D.で示し、HBV陽性検体はそのO.D.を健常人のO.D.で除したSignal/Negative(S/N)で示した。S/Nが1以下はN.D.(Nondetectable)とした。なお、表2における捕捉抗体のIntは6G6抗体、ExtはHBs136抗体、検出抗体のIntはSF111抗体、ExtはSF124CS抗体である。
本実施例5では、実施例4の捕捉抗体及び検出抗体の組み合わせの抗体を用いるHBs抗原の分析方法で、HBs抗体陰性の条件とHBs抗体陽性条件でのHBs抗原を測定した。具体的には、HBs抗原陽性の被検試料に、抗体価の高いHBs抗体陽性の血漿を添加して、その影響を調べた。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
Claims (8)
- B型肝炎ウイルスs抗原の第1内側領域ペプチドに結合する少なくとも1つの内側捕捉プローブ及び第2外側領域ペプチドに結合する少なくとも1つの外側捕捉プローブを捕捉プローブとして使用し、前記第1内側領域ペプチドに結合する少なくとも1つの内側検出プローブ及び前記第2外側領域ペプチドに結合する少なくとも1つの外側検出プローブを検出プローブとして使用することを特徴とする、B型肝炎ウイルスs抗原の分析方法。
- 前記内側捕捉プローブが結合するエピトープと前記内側検出プローブが結合するエピトープが異なり、前記外側捕捉プローブが結合するエピトープと外側検出プローブが結合するエピトープが異なる、請求項1に記載のB型肝炎ウイルスs抗原の分析方法。
- 前記内側捕捉プローブが、配列番号1で表されるアミノ酸配列における51〜60番のアミノ酸配列からなるペプチドに結合するプローブであり、前記外側捕捉プローブが配列番号1で表されるアミノ酸配列における111〜130番のアミノ酸配列からなるペプチドに結合するプローブであり、前記内側検出プローブが、配列番号1で表されるアミノ酸配列における51〜69番のアミノ酸配列からなるペプチドに結合するプローブであり、前記外側検出プローブが配列番号1で表されるアミノ酸配列における98〜156番のアミノ酸配列からなるペプチドに結合するプローブである、請求項1又は2に記載のB型肝炎ウイルスs抗原の分析方法。
- 前記プローブが、モノクローナル抗体又はその抗体フラグメントである、請求項1〜3のいずれか一項に記載のB型肝炎ウイルスs抗原の分析方法。
- 前記内側捕捉モノクローナル抗体がFERM BP−10117抗体、FERM BP−10702抗体、FERM BP−10700抗体及びFERM BP−10698抗体からなる群から選択されるモノクローナル抗体であり、前記内側検出モノクローナル抗体が、FERM BP−10117抗体、FERM BP−10702抗体、FERM BP−10700抗体及びFERM BP−10698抗体からなる群から選択されるモノクローナル抗体であり、前記外側捕捉モノクローナル抗体がFERM BP−10699抗体、FERM BP−10703抗体、FERM BP−10701抗体及びFERM BP−10697抗体からなる群から選択されるモノクローナル抗体であり、前記外側検出モノクローナル抗体がFERM BP−10699抗体、FERM BP−10703抗体、FERM BP−10701抗体及びFERM BP−10697抗体からなる群から選択されるモノクローナル抗体であって、前記内側捕捉モノクローナル抗体と前記内側検出モノクローナル抗体とが異なる抗体であり、前記外側捕捉モノクローナル抗体と前記外側検出モノクローナル抗体とが異なる抗体である、請求項4に記載のB型肝炎ウイルスs抗原の分析方法。
- B型肝炎ウイルスs抗原の第1内側領域ペプチドに結合する少なくとも1つの内側捕捉プローブ及び第2外側領域ペプチドに結合する少なくとも1つの外側捕捉プローブを捕捉プローブとして含む抗体固相担体、及び前記第1内側領域ペプチドに結合する少なくとも1つの内側検出プローブ及び前記第2外側領域ペプチドに結合する少なくとも1つの外側検出プローブを検出プローブとして含む試薬を含むことを特徴とする、B型肝炎ウイルスs抗原の分析キット。
- 国際受託番号FERM BP−10702であるマウスハイブリドーマ、国際受託番号FERM BP−10698であるマウスハイブリドーマ、国際受託番号FERM BP−10699であるマウスハイブリドーマ、国際受託番号FERM BP−10703であるマウスハイブリドーマ、国際受託番号FERM BP−10701であるマウスハイブリドーマ、国際受託番号FERM BP−10700であるマウスハイブリドーマ又は国際受託番号FERM BP−10697であるマウスハイブリドーマ。
- 国際受託番号FERM BP−10702であるマウスハイブリドーマ、国際受託番号FERM BP−10698であるマウスハイブリドーマ、国際受託番号FERM BP−10699であるマウスハイブリドーマ、国際受託番号FERM BP−10703であるマウスハイブリドーマ、国際受託番号FERM BP−10701であるマウスハイブリドーマ、国際受託番号FERM BP−10700であるマウスハイブリドーマ、及び国際受託番号FERM BP−10697であるマウスハイブリドーマからなる群から選択されるハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体。
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