JP2009197033A - 抗ｈｃｖコア蛋白質モノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

【課題】 Ｃ型肝炎ウイルス（以下、ＨＣＶと略記する）の検出または定量に用いる、抗ＨＣＶコア蛋白質モノクローナル抗体を提供する。
【解決手段】 ＨＣＶコア蛋白質のＮ末から４１〜５０番のアミノ酸配列部位を認識するモノクローナル抗体。特に、ハイブリドーマＫＴＭ−１４５（ＦＥＲＭ ＢＰ−６８３８）が産生する、ＨＣＶコア蛋白質のＮ末から４１〜５０番のアミノ酸配列部位を認識するモノクローナル抗体。
【選択図】 なし

Description

本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（以下、ＨＣＶと略記する）の検出または定量に用いる、抗ＨＣＶコア蛋白質モノクローナル抗体に関する。

感染症の原因であるウイルスの検査は、抗体検査、抗原検査および遺伝子検査と種々の方法で行われている。ウイルスに対する抗体検査およびウイルス自身の抗原検査は、免疫測定法が主流でウイルス感染の診断や輸血用血液のウイルススクリーニング検査、ウイルス治療におけるモニターなどに幅広く活用されている。また、遺伝子検査は遺伝子を増幅させるポリメラーゼ・チェイン・リアクション（polymerase chain reaction：ＰＣＲ）法，リガーゼ・チェイン・リアクション（ligase chain reaction：ＬＣＲ）法，ヌクレイック・アシド・シークエンス・ベースド・アンプリフィケーション（nucleic acid sequence based amplification：ＮＡＳＢＡ）法や標識化効率を上げたブランチド・ディーエヌエー（branched DNA：ｂＤＮＡ）法などが開発され、高感度な測定が可能となっている。

遺伝子検査は確定診断といった目的とともに、前述の抗体検査や抗原検査では検出できない感度領域での検査や治療におけるウイルス排除評価などで活用されている。最近では、遺伝子増幅法を抗体検査や抗原検査では感度的に検出できないウイルス感染初期での輸血血液のスクリーニング検査に応用しようとしている。
しかしながら、遺伝子検査は、操作が煩雑で特殊な装置を必要とすること、技術的な熟練を要すこと、高いコスト、再現性や測定精度が悪いこと、大量検体処理に向かないこと、検体中の阻害因子により偽陰性化すること、蛋白質に比べ核酸自体が検体中で不安定であること、遺伝子の増幅化効率が一定ではないことなどの問題点を抱えている。ウイルス由来の核酸がＲＮＡである場合はさらに不安定で、操作の過程や検査検体の保存状態により値が大きく振れることが報告されている。

ウイルスに対する抗体測定は生体内の免疫機構によって生成するウイルスに対する抗体を検出するもので、ウイルス感染の影響を観察する方法である。従って個体によっては抗原に対する抗体産生が異なり、高い抗体価を示すものや、全く抗体を産生しない個体が存在する。また抗体量は必ずしもウイルス量と相関しないことから実際の病態や体内のウイルス量を予測することが難しい。またウイルス感染初期では抗体が産生されておらず、感染初期での検出が不可能なこと、さらに抗体の非特異的な反応も認められることなどから正確な判定ができない問題点がある。

抗原検査はウイルス由来の抗原を検出する方法で、各種ウイルス由来抗原測定系が発売されている。抗原検査はウイルス由来の抗原を認識する抗体を用いた免疫測定が中心であるが、遺伝子増幅法と比較すると感度が不足している。そのためウイルス量が少なくなると十分に検出できない問題点がある。また体内ではウイルスと共にウイルスに対する抗体が共存しており、この共存抗体が免疫測定の材料である抗体と競合反応するために感度良く抗原を測定することができない場合がある。ＨＢＶや他の肝炎ウイルス、ＨＩＶなどにおいても抗原測定法が存在するが、ＰＣＲといった遺伝子増幅法と比較して感度面で劣っており、診断や治療のマーカーとして十分と言えるものではない。

最近になってＨＣＶの内部抗原であるＨＣＶコア蛋白質測定系が開発されている（特許文献１）。本法は遺伝子を測定する方法と比較して簡便でかつ安定に測定できＨＣＶの確定診断や、治療における効果予測、治療効果判定に使えるキットである。しかし感度はＰＣＲ定量法と比較して不足しており、ＨＣＶコア蛋白質測定だけで診断や治療のモニターができる訳ではないという問題点を抱えている。実際該方法の検出限界は８ｐｇ／ｍＬ（ＰＣＲタイターに換算して１０^４〜５ウイルス粒子／ｍＬ）であり、ＰＣＲに比べ検出限界は１０倍以上高い。したがって治療効果を判定する際、８ｐｇ／ｍＬ以下になった検体は陰性と判定されてしまい、低値でのウイルス量を把握することはできない。

一般的に抗原と抗体との反応において高濃度の塩を使用することは、抗原と抗体の反応を阻害すること、また抗原抗体反応物から抗原を解離させることが知られている。例えば、超高感度酵素免疫測定法［石川栄治著、学会出版センター、（１９９３）］の第９章には、以下のように記載されている。「タンパク質の固相への非特異吸着は種々の条件により増減するので、非特異的吸着が減少するような条件にすれば血清干渉は少なくなるはずである。インスリンのサンドイッチ法で、抗インスリンＩｇＧ不溶化ポリスチレンボールと血清のインキュベーション濃度を下げ、時間を短縮すると血清干渉は少なくなる（表ＩＸ−１４）（Ruan et al.,1986）。また、無機塩の濃度を高くするとタンパク質の固相への非特異吸着が減少するので、血清干渉を減少させることができる。（表ＩＸ−１５、図ＩＸ−１８〜ＩＸ―２１）（Hashida et al.,1983）。無機塩の種類により効果的な濃度が異なるが、あまり高い濃度では免疫反応そのものが阻害される。食塩では０．３〜０．４ｍｏｌ／ｌが上限であろう。」

特開平８−２９４２７号公報

本発明の目的は、血液事業や健康診断におけるスクリーニング用途のように多数の検体を処理するのに適した、ＨＣＶ陽性検体を簡便で高感度に検出または定量するＨＣＶ抗原検出または定量方法およびそれに用いる検出または定量試薬を提供することである。

本発明者らは、意外にも、アルカリ性ホスファターゼ標識した抗ＨＣＶコア蛋白質抗体を用いることにより、高濃度の塩を含む水溶液中でＨＣＶコア蛋白質と抗原抗体反応を行わせると、アルカリ性ホスファターゼ以外の標識物質で標識した抗ＨＣＶコア蛋白質抗体を用いる場合と異なり、免疫反応を阻害することなく該抗原をより高感度に検出することができることを見出し本発明を完成させた。

本発明は、下記（１）〜（２）に関する。
（１） ＨＣＶコア蛋白質のＮ末から４１〜５０番のアミノ酸配列部位を認識するモノクローナル抗体。
（２） ハイブリドーマＫＴＭ−１４５（ＦＥＲＭ ＢＰ−６８３８）が産生する（１）記載のモノクローナル抗体。

本発明はＣ型肝炎の原因であるＨＣＶ由来の抗原を感度良く検出するための免疫測定方法と免疫測定方法に用いる試薬およびキットを提供する。本発明により、従来のＨＣＶコア抗原測定系では検出できない検体を感度良く検出することができ、ＨＣＶの抗原検査に幅広く活用できる。またＰＣＲによる高感度な遺伝子測定法と同等な感度を有する免疫測定を簡便に構築でき、医学分野へ幅広く貢献できる。

以下、本発明について詳細に説明する。
本発明のアルカリ性ホスファターゼ標識した抗ＨＣＶコア蛋白質抗体中のアルカリ性ホスファターゼとしては、いかなる起源のアルカリ性ホスファターゼも使用できる。例えば、大腸菌等の微生物および牛等の動物由来のアルカリ性ホスファターゼがあげられる。

本発明のアルカリ性ホスファターゼ標識した抗ＨＣＶコア蛋白質抗体中の抗ＨＣＶコア蛋白質抗体としては、特開平７−１４５１９４号またはHepatology, 16, 886 (1992)に記載のＨＣＶコア蛋白質に反応する抗体であればいずれでも使用できる。該ＨＣＶコア蛋白質は、特開平７−１４５１９４号、特開平８−２９４２７号ならびにHepatology, 16, 886 (1992)に記載の遺伝子組換え方法を用いて調製することができる。該抗体は、前述の遺伝子組換えＨＣＶコア蛋白質を免疫原として用い、公知のモノクローナル抗体の製造法に従い製造することができる。モノクローナル抗体の製造法としては、例えば「富山朔二編、単クローン抗体実験マニュアル、講談社」等に記載された方法により行うことができる。

このようにして得られた免疫原を投与する動物としてはマウス、ラット、ハムスター、ウサギ、モルモット、ヤギ、ヒツジ、ニワトリなどがあげられ、モノクローナル抗体作製にはマウス、ラットを用いるのが好ましい。免疫方法としては、例えば［西道、豊島、新生化学実験講座、1, 389 (1990)、東京化学同人］等に記載の方法を用いて行うことができる。例えば免疫原をフロイントの完全または不完全アジュバントにエマルジョン化し、腹腔内、皮下、筋肉内に投与することにより行われる。例えば、７ないし３０日、好ましくは１２ないし１６日間隔の一定間隔をおいて２回以上好ましくは２回〜４回投与し、免疫を完成させることができる。

抗体産生細胞の採取源としては免疫した動物の脾臓、リンパ節、末梢血液などがあげられる。また免疫を行っていない動物の脾臓、リンパ節、末梢血液等より抗体産生担当細胞を取り出し、これら細胞に対し直接免疫を行って抗体産生細胞とする所謂 in vitro 免疫［新井、太田、実験医学、6, 43(1988)］を行った細胞を用いてもよい。

抗体産生細胞と骨髄腫細胞との細胞融合を行う際に使用する骨髄腫細胞は特に限定はないが、抗体産生細胞と同種の動物由来の細胞株を使用するのが好ましい。また適切に細胞融合が行われた細胞のみを効率よく選択するために、特定の薬物マーカーを有する骨髄腫細胞が好ましい。例えば８−アザグアニン耐性の骨髄腫細胞はヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含有した培地（以下、ＨＡＴ培地と称する。）中では生育できないが、この細胞と正常細胞とが融合した細胞はＨＡＴ培地中で生育できるようになり、未融合の骨髄腫細胞と区別できることから好んで使用される。具体的にはＰ３×６３−Ａｇ．８．６５３［ジャーナル・オブ・イムノロジー（J. Immunol.）,123, 1548 (1979)］やＰ３×６３−Ａｇ．８．Ｕ１[Curr. Topics. Microbiol. Immunol.,81, 1 (1978)]（以下、単にＰ３Ｕ１と略記する。）、Ｓｐ／Ｏ−Ａｇ１４［ネイチャー（Nature）, 276, 269 (1978)］などがあげられる。

細胞融合はケーラーとミルシュタイン［ネイチャー(Nature), 256, 495 (1975)］によって開発された方法ならびにその改良方法が応用できる。良く用いられる方法としては抗体産生細胞と骨髄腫細胞を１０〜３：１の割合で混合し、３０〜５０％のポリエチレングリコール（平均分子量１，５００〜６，０００）を融合剤に用いて処理する方法である。また電気パルスにより融合することもできる［大河内ら、実験医学、6, 50 (1988)］。

細胞融合を終えた細胞は選択培地（例えばＨＡＴ培地）に浮遊し、９６ウェル培養プレートのような後の目的細胞選択に有利な培養容器を用いて融合細胞のみを生育させる。融合細胞のみが選択的に生育した段階で、ＨＣＶコア蛋白質に対する抗体を産生している細胞のみを選択する。この選択は融合細胞の培養上清中の目的抗体の有無を、例えば酵素免疫測定や放射線免疫測定などの方法を用いて調べる。選択された細胞はたとえば限界希釈法や軟寒天培地法などの方法を用いて単クローン化し、ＨＣＶコア蛋白質特異的モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞株を樹立する。

モノクローナル抗体は樹立したハイブリドーマ細胞株を適当な培地で培養してその培養液を回収し、あるいは細胞株を動物の腹腔内に移植して腹水中で増殖させて腹水を回収し、得られた培養液または腹水から得ることが出来る。培養液あるいは腹水中の抗体は必要に応じて精製して使用することができる。精製方法としては例えば硫酸アンモニウムを用いた塩析分画、イオン交換クロマトグラフィー法、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー法、プロテインＡやプロテインＧを用いたアフィニティカラムクロマトグラフィー法、さらに抗原を固相化したゲルを用いるアフィニティカラムクロマトグラフィー法など様々な方法またはこれらの方法を組合わせた方法があげられる。また、本発明に使用する抗体としては上述の方法で得られた抗体をペプシン等の酵素処理および／または還元処理して得られるＦａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ）2などの抗体フラグメントを用いてもよい。

本発明の抗体としては、ＨＣＶコア蛋白質のＮ末から１１〜５０番目のアミノ酸配列の内、少なくとも５個の連続するアミノ酸配列を認識する抗体であるものが好ましい。本発明のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマの具体例としては、ハイブリドーマＫＴＭ−１４５、ハイブリドーマＫＴＭ−１５３、ハイブリドーマＫＴＭ−１５７、ハイブリドーマＫＴＭ−１６３およびハイブリドーマＫＴＭ−１６７等があげられる。

ハイブリドーマＫＴＭ−１４５、ハイブリドーマＫＴＭ−１５３、ハイブリドーマＫＴＭ−１５７、ハイブリドーマＫＴＭ−１６３およびハイブリドーマＫＴＭ−１６７は、平成１１年８月１２日付で、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５−８５６６）通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−６８３８、ＦＥＲＭ ＢＰ−６８３９、ＦＥＲＭ ＢＰ−６８４０、ＦＥＲＭ ＢＰ−６８４１およびＦＥＲＭ ＢＰ−６８４２としてそれぞれ寄託されている。ハイブリドーマＫＴＭ−１４５、ハイブリドーマＫＴＭ−１５３、ハイブリドーマＫＴＭ−１５７、ハイブリドーマＫＴＭ−１６３およびハイブリドーマＫＴＭ−１６７の生産するモノクローナル抗体を、以下それぞれ単にＫＴＭ−１４５、ＫＴＭ−１５３、ＫＴＭ−１５７、ＫＴＭ−１６３およびＫＴＭ−１６７と称する。

本発明のアルカリ性ホスファターゼ標識した抗ＨＣＶコア蛋白質抗体は、該抗ＨＣＶコア蛋白質抗体と該アルカリ性ホスファターゼとの間に共有結合を作る方法を利用して結合させたものである。該方法としては、例えばグルタールアルデヒド法、過ヨウ素酸法、マレイミド法、ピリジル・ジスルフィド法、公知の架橋剤を用いる方法などをあげることができる（例えば石川栄治著「酵素免疫測定法」医学書院発行参照）。

具体的調製方法としては、例えば、イミノチオラン等でスルフヒドリル化した抗体と、ＳＭＣＣ（succinimidyl 4-[N-maleimidomethyl]-cyclohexane-1-carboxylate）でマレイミド化したアルカリ性ホスファターゼを混合して調製することができる。
本発明の高濃度の塩を含む水溶液とは、無機塩を０．５Ｍ以上含有する水溶液をいう。無機塩としては、ハロゲン化アルカリ金属塩があげられ、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化リチウム等があげられる。無機塩濃度としては０．５Ｍ〜飽和濃度が好ましく、１〜３Ｍがより好ましい。該高濃度の塩を含む溶液には、必要に応じて緩衝剤、塩化ナトリウム以外の塩、界面活性剤、血清、防腐剤、免疫反応における非特異的吸着阻害剤等を含有していてもよい。

緩衝剤としては、特に制限がないが、トリス緩衝剤等があげられる。界面活性剤としては、例えばトリトンＸ−１００、トリトンＸ−７０５、ツイーン２０等があげられる。防腐剤としては、アジ化ナトリウム等があげられる。血清としては、正常マウス血清等があげられる。塩化ナトリウム以外の塩としては、塩化亜鉛、塩化マグネシウム等があげられる。免疫反応における非特異的吸着阻害剤としては、例えば牛血清アルブミン、カゼイン等の蛋白質があげられ、市販品としてはブロックエース（大日本製薬社製）等があげられる。

本発明の対象となる検体としては、例えば全血、血清、血漿、尿、リンパ液などがあげられる。ＨＣＶ抗原の有無を検出すべき検体は、そのまま用いても良いが、ウイルス分画剤などを用いて濃縮処理したものを用いることができる。具体的分画剤としてはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）試薬，パーコールといった密度勾配用試薬などがあげられる。ＰＥＧの分子量および使用濃度は特に限定されないが、分子量１，０００〜２０，０００のものが好ましく、使用濃度は３〜１０％の範囲が好ましい。

また検体は、蛋白質変性作用、蛋白質可溶化作用、蛋白質分散作用を有する試薬で処理することが好ましい。該試薬としては、例えばカオトロピック物質、アルカリ剤、酸性剤および界面活性剤などがあげられ、カオトロピック物質またはアルカリ剤が好ましい。カオトロピック物質としてはウレア、塩酸グアニジン、グアニジウムチオシアン酸塩などがあげられ、ウレアや塩酸グアニジンが好ましい。塩酸グアニジンの濃度は１〜８Ｍが好ましい。

アルカリ剤としては水溶液中でｐＨ１０以上のアルカリを示すアルカリ剤であれば良く、例えば水酸化アルカリ金属塩があげられ、好ましくは水酸化ナトリウム溶液があげられる。酸性剤としては、塩酸、硫酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、トリクロル酢酸等があげられる。界面活性剤としては、非イオン性、陰イオン性、陽イオン性、両性界面活性剤があげられる。

検体の処理としては、カオトロピック物質とアルカリ剤での併用処理が好ましい。アルカリ剤での処理は４５〜５５℃の温度で行うことが好ましい。酸性剤またはアルカリ剤で処理した検体は中和処理した後抗原抗体反応に供するのが好ましい。中和には、酸性剤を使用した場合にはアルカリを、アルカリ剤を使用した場合には酸性剤をそれぞれ使用するが、いずれの場合にも高い緩衝能を持つ溶液も用いることができる。

本発明の免疫測定方法には特に制限が無いが、例えばサンドイッチ法等のように免疫測定法で幅広く行われている方法があげられる。具体的には、本発明の免疫測定方法は抗体結合固相およびアルカリ性ホスファターゼ標識されたＨＣＶコア蛋白質抗体を用いて周知の１ステップ法、ディレイ１ステップ法、２ステップ法などのサンドイッチ法により行うことがでる。サンドイッチ法としては、２ステップ法が好ましい。例えば、抗体結合固相と抗原を含む検体とを水溶液中でインキュベーションした後、固相を洗浄液で洗浄する。次に標識抗体と高濃度の塩を含む水溶液を加え、さらにインキュベーションした後、固相を再び洗浄する。次いで、固相上に形成された免疫複合体のアルカリ性ホスファターゼ活性の測定を行う方法である。

固相は従来の免疫測定に使用される各種固相を用いることができる。固相としては例えばプラスチック製の試験管、マイクロプレートウエル、ガラスビーズ、プラスチックビーズ、各種メンブレン、磁性粒子などをあげることができる（例えば石川栄治著「酵素免疫測定法」医学書院発行参照）。固相に結合させる抗体は、前述の抗ＨＣＶコア蛋白質モノクローナル抗体があげられ、アルカリ性ホスファターゼで標識された抗体とは異なるエピトープを認識する抗体を用いることが好ましい。固相と抗体との結合は、物理吸着、化学結合等公知の方法で行うことができる。

アルカリ性フォスファターゼ活性は、色原体、蛍光試薬、発光試薬等を用いて常法（丸尾文治監修、酵素ハンドブック、朝倉書店）で測定することができる。色原体としては、様々なものが知られておりいずれも使用可能であるが、高感度な検出が可能である酵素サイクリング反応試薬、具体的には補酵素ＮＡＤの酸化―還元をサイクルさせる酵素を用いる酵素サイクリング反応試薬［ＡｍｐｌｉＱ、ダコ（DAKO）社製］等があげられる。蛍光試薬としては、４−メチルウンベリフェロン誘導体、２−ヒドロキシビフェニル誘導体等があげられる。

発光試薬としてはジオキセタン構造を持つ誘導体、具体的にはＡＭＰＰＤ［３−（２'−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３''−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン］、ＣＤＰ−スター［４−クロロ−３−（メトキシスピロ｛１、２−ジオキセタン−３，２'−（５'−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１^３，７］デカン｝−４−イル）フェニル リン酸二ナトリウム］、ＣＳＰＤ［３−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２'−（５'−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１^３，７］デカン｝−４−イル）フェニル リン酸二ナトリウム］などがあげられる。またジオキセタン構造を有さないルミゲン（Lumigen）誘導体ＡＰＳ化合物（［１０−メチル−９（１０Ｈ）−アクリジニルイデン］フェノキシメチル リン酸二ナトリウム塩）などがあげられる。

本発明の定量試薬は、アルカリ性ホスファターゼ標識した抗ＨＣＶコア蛋白質抗体、０．５Ｍ〜飽和濃度の塩およびアルカリ性ホスファターゼ活性測定用試薬を含む。該定量試薬は、また抗ＨＣＶコア蛋白質抗体を固定化した固相を含む試薬、ＨＣＶコア蛋白質標準品を含む試薬等を含む。本発明の定量試薬は前述の各試薬がキットの形態で構成されていてもよい。

該キットは、さらに検体濃縮試薬を含む試薬、検体処理試薬を含む試薬等が組み込まれていてもよい。検体濃縮試薬としては、上述の分画剤があげられる。検体処理試薬としては前述の蛋白質変性作用、蛋白質可溶化作用、蛋白質分散作用を有する試薬があげられる。アルカリ性ホスファターゼ定量試薬とは、前述の色原体、蛍光試薬または発光試薬等を含有する試薬があげられる。抗ＨＣＶコア蛋白質抗体としては、例えば前述のモノクローナル抗体があげられる。

以下の実施例は本発明を具体的に説明するものであるが、これによって本発明の範囲を制限するものではない。なお、血清検体は、ユニグローブ（Uniglobe）社またはボストン・バイオメディカ（Boston Biomedica, Inc．：ＢＢＩ）社より購入したものを用いた。

参考例１ ＨＣＶコア蛋白質の作製
特開平８−２９４２７号公報に記載の方法に従い、ＨＣＶコア蛋白質のＮ末から１２５アミノ酸残基を有する遺伝子組換えＨＣＶコア蛋白質を調製し精製した。精製された遺伝子組換えＨＣＶコア蛋白質はバイオラッド蛋白質定量キット（バイオラッド社製）およびＢＣＡ蛋白質定量キット（ピアス社製）で蛋白質濃度を算出した。

参考例２ 抗ＨＣＶコア蛋白質抗体の作製
参考例１で得られたＨＣＶコア蛋白質２５〜１００μｇを、フロイント完全アジュバンドでエマルジョン化しＢＡＬＢ／ＣマウスまたはＳＤラットに初回免疫を行った。２〜３週間後、ＨＣＶコア蛋白質２５〜１００μｇをフロイント不完全アジュバンドでエマルジョン化し、追加免疫を行った。抗体価の上昇を確認後、ＨＣＶコア蛋白質２５〜１００μｇを静脈内に投与し、その３〜４日後、マウスから脾臓を取り出し脾細胞を調製した。次に前もってＲＰＭＩ−１６４０培地で培養したマウスミエローマ細胞（Ｐ３Ｕ１）と脾細胞を１：２〜１：５の比率で混合し、ポリエチレングリコールを用いて細胞融合を行った。融合した細胞はＨＡＴ培地に浮遊した後、９６ウエル培養プレートに分注し３７℃炭酸ガスインキュベーターで培養した。抗ＨＣＶコア蛋白質抗体のスクリーニングは以下のようにして実施した。

ＨＣＶコア蛋白質を８Ｍ塩酸グアニジン溶液または１０Ｍウレア溶液で２μｇ／ｍＬに懸濁し、９６ウエルＥＬＩＳＡプレート（Nunc社製）に５０μｌ／ウエル分注し、４℃一晩放置することによりＨＣＶコア蛋白質をプレートに吸着させた。１％牛血清アルブミン（以下、ＢＳＡと略する）を含むリン酸緩衝液含有生理食塩水（以下、ＰＢＳ溶液と略する）でブロッキングした後、融合した細胞の培養上清５０μｌを各ウエルに加えて室温で１時間反応させた。洗浄後パーオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体を加え、室温１時間反応させた。洗浄後基質ＡＢＴＳを加え発色が見られるウエルを選択し、ＨＣＶコア蛋白質を認識する抗体を産生するハイブリドーマＫＴＭ−１４５、ハイブリドーマＫＴＭ−１５３、ハイブリドーマＫＴＭ−１５７、ハイブリドーマＫＴＭ−１６３およびハイブリドーマＫＴＭ−１６７を取得した。該ハイブリドーマをそれぞれプリスタン等で処理したマウス腹腔に移植し腹水中に産生されてくるモノクローナル抗体を取得した。該モノクローナル抗体の精製は常法（富山朔二編、単クローン性抗体実験マニュアル、講談社）に従いプロテインＡカラムを用いて精製した。得られた抗体はそれぞれＫＴＭ−１４５，ＫＴＭ−１５３、ＫＴＭ−１５７、ＫＴＭ−１６３およびＫＴＭ−１６７と命名した。

参考例３ モノクローナル抗体の反応特異性
参考例２で得られたモノクローナル抗体の反応特異性はＨＣＶコア蛋白質または大腸菌のライゼートを吸着させた９６ウエルマイクロタイタープレートを用いて確認した。その結果、ＫＴＭ−１４５、ＫＴＭ−１５３、ＫＴＭ−１５７、ＫＴＭ−１６３およびＫＴＭ−１６７はＨＣＶコア蛋白質と特異的に反応することが確認された。また同様にウエスタンブロットでも同様の反応性を確認した。さらにＨＣＶコア蛋白質の部分ペプチドを用いて抗体の認識するＨＣＶコア蛋白質のエピトープを解析した結果、ＫＴＭ−１４５はＨＣＶコア蛋白質のＮ末から４１番目〜５０番目を、ＫＴＭ−１５３は１１番目〜３０番目を、ＫＴＭ−１５７は３１番目〜５０番目を、ＫＴＭ−１６３とＫＴＭ−１６７は２１番目〜４０番目をそれぞれ認識することが確認された。

参考例４ アルカリ性ホスファターゼ標識モノクローナル抗体の作製法
参考例２で取得したモノクローナル抗体とアルカリ性ホスファターゼ（ベーリンガー・マンハイム社製）を常法（石川栄治著、酵素免疫測定法、医学書院発行）に従いマレイミド法によって結合させた。モノクローナル抗体５ｍｇを５０ｍＭトリスバッファー（ｐＨ８）で透析し、イミノチオランを用いてスルフヒドリル化した。イミノチオラン化した抗体はセファデックスＧ−２５カラム（ファルマシア社製）でフリーのイミノチオランを除去した。アルカリ性ホスファターゼは、マレイミド試薬ＳＭＣＣ（ピアス社製）を用いてマレイミド化し、Ｇ−２５カラムでフリーのＳＭＣＣを除去した。

上述のスルフヒドリル化したモノクローナル抗体とマレイミド化したアルカリ性ホスファターゼを混合し、４℃で一晩反応させた。反応後生成したアルカリ性ホスファターゼで標識化されたモノクローナル抗体をセファクリルＳ−２００カラム（ファルマシア社製）で精製した。精製したアルカリ性ホスファターゼ標識抗体は標識抗体希釈液［５０ｍＭトリスバッファー（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭ塩化亜鉛、２０％ブロックエース（大日本製薬社製）を含む水溶液］で所定濃度に希釈し酵素標識免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）に用いた。

参考例５ 抗ＨＣＶコア蛋白質抗体を固定した固相の作製
参考例２で得られたモノクローナル抗体を終濃度５μｇ／ｍＬになるように０．１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳで希釈し、固相用の９６穴マイクロタイタープレートの各ウエルに２００μｌずつ添加した。４℃で１晩静置後、ＰＢＳで洗浄し、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳを３００μｌ加え４℃で１晩静置しブロッキングした。

参考例６ パーオキシダーゼ酵素標識モノクローナル抗体の作製
参考例２で得られたモノクローナル抗体とパーオキシダーゼ（東洋紡社製）とを常法（石川栄治著、酵素免疫測定法、医学書院発行）に従いマレイミド法によって結合させた。モノクローナル抗体５ｍｇを５０ｍＭトリスバッファー（ｐＨ８）で透析し、イミノチオランを用いてスルフヒドリル化した。イミノチオラン化した抗体はセファデックスＧ−２５カラム（ファルマシア社製）でフリーのイミノチオランを除去した。パーオキシダーゼは、マレイミド試薬ＳＭＣＣ（ピアス社製）を用いてマレイミド化し、セファデックスＧ−２５カラムでフリーのＳＭＣＣを除去した。
上述のスルフヒドリル化したモノクローナル抗体とマレイミド化したパーオキシダーゼとを混合し、４℃で一晩反応させ、パーオキシダーゼで標識化されたモノクローナル抗体を取得し、セファクリルＳ−２００カラム（ファルマシア社製）で精製した。精製した標識抗体は標識抗体希釈液［５０ｍＭトリスバッファー（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭ塩化亜鉛、２０％ブロックエース（大日本製薬社製）を含む水溶液］で所定濃度に希釈しＥＬＩＳＡに用いた。

遺伝子組換えＨＣＶコア蛋白質の測定
参考例１で得られた遺伝子組換えＨＣＶコア蛋白質を０または１００ｐｇ／ｍＬとなるよう０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳで希釈した。
希釈された遺伝子組換えＨＣＶコア蛋白質溶液を参考例５で作製されたマイクロプレート上の各ウエルへ２００μｌずつ添加し、室温で１時間反応させた。洗浄液（ＡＭＰＡＫ増感系試薬添付、ダコ社製）で洗浄後、参考例４で得られた標識抗体を添加した。標識抗体は５０ｍＭトリスバッファー（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭ塩化亜鉛、２０％ブロックエース（大日本製薬社製）および０〜３Ｍの塩化ナトリウムを含む溶液で希釈して用い、各ウエルへ２００μｌずつ添加した。室温で１時間攪拌反応後、洗浄液で洗浄後、発色試薬である酵素サイクリング反応試薬（ダコ社製）２００μＬを添加し室温で攪拌しながら２０分間反応させた。該試薬に添付されている停止液を１００μｌ添加し、主波長４９０ｎｍ、副波長６６０ｎｍで吸光度を測定した。本実験では固相用としてＫＴＭ−１４５をアルカリ性ホスファターゼ標識用としてＫＴＭ−１６３を用いた。

結果を第１表に示す。第１表中、各抗原濃度に対する数字は吸光度（Ａｂｓ）を示す。

標識抗体を含む希釈液中の塩化ナトリウム濃度を高めることで、抗原のない試験区（０ｐｇ／ｍＬ）では、塩化ナトリウム濃度を高めても吸光度はほとんど変化しないのに対し、抗原が存在する試験区（１００ｐｇ／ｍＬ）では、塩化ナトリウム濃度を高めることにより得られる吸光度が増加した。表中、Ｓ／Ｎ比とは、抗原非存在区（０ｐｇ／ｍＬ）での吸光度に対する抗原存在区（１００ｐｇ／ｍＬ）での吸光度の比を示す。塩化ナトリウムを添加することで、Ｓ／Ｎ比が増加し、抗原をより高感度に検出することが可能となることが判る。すなわち、塩化ナトリウムを使用しない場合、抗原が存在しても吸光度の増加が抗原非存在検体に比べわずかしかなく、抗原陽性と判定できないサンプルでも、本発明の方法を適用することにより、抗原陽性と判定できることを示している。

遺伝子組換えＨＣＶコア蛋白質の測定
参考例１で得られた遺伝子組換えＨＣＶコア蛋白質を０〜２０ｐｇ／ｍＬの濃度範囲になるよう０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳで希釈した。
希釈された遺伝子組換えＨＣＶコア蛋白質溶液を参考例５で作製されたマイクロプレートの各ウエルへ２００μｌずつ添加し、室温で１時間反応させた。洗浄液（ＡＭＰＡＫ増感系試薬添付、ダコ社製）で洗浄後、参考例４で得られた標識抗体を添加した。標識抗体は５０ｍＭトリスバッファー（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭ塩化亜鉛、２０％ブロックエース（大日本製薬社製）および０〜２Ｍの塩化ナトリウムを含む溶液で希釈して用い、各ウエルへ２００μｌずつ添加した。室温で１時間攪拌反応後、洗浄液で洗浄後、発色試薬である酵素サイクリング反応試薬（ダコ社製）２００μＬを添加し室温で攪拌しながら４０分間反応させた。該試薬に添付されている停止液を１００μｌ添加し、主波長４９０ｎｍ、副波長６６０ｎｍで吸光度を測定した。本実験では固相用としてＫＴＭ−１４５をアルカリ性ホスファターゼ標識用としてＫＴＭ−１６３を用いた。

結果を第２表に示す。第２表中、各抗原濃度に対する数字は吸光度（Ａｂｓ）を示す。

標識抗体を含む希釈液中の塩化ナトリウム濃度を高めることで、抗原のない試験区では、塩化ナトリウム濃度を高めても吸光度はほとんど変化しないのに対し、抗原が存在する試験区では、塩化ナトリウム濃度を高めることにより得られる吸光度が増加した。このことは、塩化ナトリウムを使用しない場合、抗原が存在しても吸光度の増加が、抗原非存在検体に比べわずかしかなく、抗原陽性と判定できないサンプルでも、本発明の方法を適用することにより、抗原陽性と判定できることを示している。

検出限界
参考例１で取得された遺伝子組換えＨＣＶコア蛋白質を０〜１０ｐｇ／ｍＬの濃度範囲になるよう０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳで希釈した。
希釈された遺伝子組換えＨＣＶコア蛋白質溶液を参考例５で得られたマイクロプレートの各ウエルへ２００μｌずつ添加し、室温で１時間反応させた。洗浄液（ＡＭＰＡＫ増感系試薬添付、ダコ社製）で洗浄後、参考例４で得られた標識抗体を添加した。標識抗体は５０ｍＭトリスバッファー（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭ塩化亜鉛、２０％ブロックエース（大日本製薬社製）および０または１Ｍの塩化ナトリウムを含む溶液で希釈して用い、各ウエルへ２００μｌずつ添加した。室温で１時間攪拌反応後、洗浄液で洗浄後、発色試薬である酵素サイクリング反応試薬（ダコ社製）１００μＬを添加し室温で攪拌しながら３０分間反応させた。該試薬に添付されている停止液を１００μｌ添加し、主波長４９０ｎｍ、副波長６６０ｎｍで吸光度を測定した。本実験では固相用としてＫＴＭ−１４５をアルカリ性ホスファターゼ標識用としてＫＴＭ−１６３を用いた。

結果を第３表に示す。第３表中、各塩濃度に対する数字は吸光度（Ａｂｓ）を示す。

標識抗体を含む希釈液中の塩化ナトリウム濃度を高めることで、抗原の存在を検出できる抗原濃度が極めて低濃度となった。第３表に示すように、塩化ナトリウム無添加では１ｐｇ／ｍＬで抗原０の吸光度と１０ｍＡｂｓオーダーの差が認められるのみであるのに対し、１Ｍの塩化ナトリウムを添加することにより、０．１２５ｐｇ／ｍＬで抗原０の吸光度と１０ｍＡｂｓオーダーの差が認められ検出感度が向上した。

比較例１
参考例１で取得された遺伝子組換えＨＣＶコア蛋白質を０、１０、１００または１０００ｐｇ／ｍＬとなるよう０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳで希釈した。
希釈された遺伝子組換えＨＣＶコア蛋白質溶液を参考例５で作製されたマイクロプレートの各ウエルへ２００μｌずつ添加し、室温で１時間反応させた。洗浄液（ＡＭＰＡＫ増感系試薬添付、ダコ社製）で洗浄後、参考例６で得られたパーオキシダーゼ標識抗体を添加した。標識抗体は５０ｍＭトリスバッファー（ｐＨ７．２）、０．１％ＢＳＡおよび０〜４Ｍの塩化ナトリウムを含む溶液で希釈して用い、各ウエルへ２００μｌずつ添加した。室温で１時間攪拌反応後、洗浄液で洗浄後、発色試薬であるＴＭＢ（テトラメチルベンジジン、インタージェン社製）２００μＬを添加し室温で攪拌しながら３０分間反応させた。１Ｎ硫酸を１００μｌ添加し発色反応を停止させ、主波長４５０ｎｍ、副波長６６０ｎｍで吸光度を測定した。本実験では固相用としてＫＴＭ−１４５をパーオキシダーゼ標識用としてＫＴＭ−１６３を用いた。

結果を第４表に示す。第４表中、各抗原濃度に対する数字は吸光度（Ａｂｓ）を示す。

パーオキシダーゼ標識抗体を用いた場合、抗原が存在しない反応系では塩化ナトリウムを添加すると反応特異性が低下した。また、抗原の存在する反応系で塩化ナトリウム濃度を上げても反応特異性の向上は認められなかった。

ヒト検体の測定
特開平８−２９４２７号公報記載の方法でヒト血清を処理した。すなわち、血清検体２００μｌに２０％のＰＥＧ４０００を５０μｌ加え、氷上で１時間静置した。４０００×ｇ，５分間，４℃の条件で遠心分離後、沈殿画分を５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）５０μｌで懸濁し、さらに０．５Ｍの水酸化ナトリウム溶液を５０μｌ加え３７℃，３０分間処理した。その後０．３％のトリトンＸ−１００を含む０．５Ｍのリン酸水素ナトリウム溶液５０μＬで中和した。最後に０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液３００μＬを加えて３倍に希釈し測定用の溶液とした。測定対象は抗ＨＣＶ抗体陽性の血清検体（Ｕｎｉ−２および０４０１）と対照として正常人の血清検体を用い、実施例１と同様に試験し吸光度（Ａｂｓ）を測定した。結果を第５表に示す。

第５表に示すように、正常人血清検体を用いたときは標識抗体を含む溶液中の塩化ナトリウム濃度を高めても吸光度がわずかにしか増加しないが、抗ＨＣＶ抗体陽性血清検体を用いたときは、標識抗体を含む溶液中の塩化ナトリウム濃度を高めることにより、得られる吸光度が増加した。これによりより低濃度の抗原を含む検体でも抗原陽性判定が可能となる。またＳ／Ｎ比より、塩化ナトリウム濃度は、０．５〜３Ｍ、特に１〜３Ｍで感度が大幅に上昇することがわかる。

検体の塩酸グアニジンとアルカリ処理
血清検体２００μｌに２０％のＰＥＧ４０００を５０μｌ加え、氷上で１時間静置した。４０００×ｇ，５分間，４℃の条件で遠心分離後、沈殿を０〜８Ｍの塩酸グアニジンを含む５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）５０μｌで懸濁し変性させた。さらに０．５Ｍの水酸化ナトリウム溶液を５０μｌ加え３７℃，３０分間処理後、０．５Ｍのリン酸水素ナトリウム溶液で中和した。その後０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液で３倍に希釈し測定用の溶液とした。測定は、塩化ナトリウム濃度を１Ｍとする以外は実施例４と同様の方法で行った。測定対象は正常人血清検体、抗ＨＣＶ抗体陽性の３血清検体（Ｕ−１９、Ｕ−２１およびＵ−２９）を用いた。結果を第６表に示す。第６表中、各検体に対する数字は吸光度（Ａｂｓ）を示す。

第６表に示されるように塩酸グアニジンの濃度依存的に吸光度が上昇することがわかる。

ウレアと塩酸グアニジンを用いて、実施例５と同様な手法で試験した。ウレアの濃度は１０Ｍとし塩酸グアニジンの濃度は８Ｍとした。検体は正常人血清検体と抗ＨＣＶ抗体陽性の４血清検体（１０４，１０６、１８７および１９７）を用いた。結果を第７表に示す。第７表中、各処理試薬に対する数字は吸光度（Ａｂｓ）を示す。

第７表に示すように、検体１０４および検体１９７では、ウレア処理した場合は正常人血清と吸光度の顕著な差は認められず、陽性を判定できなかったが、塩酸グアニジンで血清を処理することで陽性と判定できた。

アルカリ処理における温度検討
実施例６においてアルカリ処理における温度条件を代える以外は実施例６と同様に試験した。血清検体は、６、９および１３８を用い、アルカリ処理における温度は３７℃、５０℃、７０℃、１００℃とした。結果を第８表に示す。第８表中、各検体に対する数字は吸光度（Ａｂｓ）を示す。

第８表に示すように、血清のアルカリ処理温度は５０℃近傍が好ましいことがわかる。

各種検出方法との比較
本発明による測定は以下の通り行った。各種血清検体２００μｌに２０％のＰＥＧ４０００を５０μｌ加え、氷上で１時間静置した。４０００×ｇ，５分間，４℃で遠心分離後、沈殿を８Ｍの塩酸グアニジンを含む５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）５０μｌで懸濁し変性させた。さらに０．５Ｍの水酸化ナトリウム溶液を５０μｌ加え５０℃，３０分間処理後、０．３％トリトンＸ−１００を含む０．５Ｍのリン酸水素ナトリウム溶液で中和した。その後０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液で３倍に希釈し測定用の溶液とした。測定は、標識抗体溶液中に塩化ナトリウムを２Ｍ使用する以外は実施例４記載の方法と同様にして行った。

また、ＨＣＶコア蛋白質を測定するキットであるイムノチェック，Ｆ−ＨＣＶＡｇコア（国際試薬社製、以下単にＨＣＶコア蛋白質測定キットという）、抗ＨＣＶ抗体を測定するキットである第III世代抗ＨＣＶ抗体（オーソ社製、以下単に抗ＨＣＶ抗体測定キットという）およびＰＣＲ法によりＨＣＶのＲＮＡを測定するキットであるアンプリコア定性（ロッシュ社製、以下単にＲＮＡ測定キットという）の各市販試薬を用いて同一検体を測定し本発明方法と感度を比較した。結果を第９表に示す。第９表中、判定欄の「−」は検出できないことを、判定欄の「＋」は検出できることを示す。

第９表に示すように、本発明方法によればＨＣＶコア蛋白質測定キット（国際試薬社製）では検出できない検体まで検出可能である。正常人を除くこれら血清検体は抗ＨＣＶ抗体陽性であり、ＲＮＡ測定キット（ロッシュ社製）で検査した検体はＨＣＶ陽性と判定されている。血清検体での感度はＨＣＶコア蛋白質測定キット（国際試薬社製）では１０^４ウイルス／ｍＬであるが、本発明方法を用いるとＲＮＡ測定キット（ロッシュ社製）と同等の１０^３ウイルス／ｍＬが検出可能となる。

抗体の組合わせ
固相に使用する抗体と、アルカリ性ホスファターゼ標識する抗体の種類を代え、検体として、ＨＣＶ非感染血清とＨＣＶ感染血清を用い、標識抗体を希釈する水溶液の塩化ナトリウム濃度を０または１Ｍとする以外は実施例６と同様に試験しそれぞれ吸光度を測定し、Ｓ／Ｎ比を求めた。結果を第１０表に示す。第１０表中、各塩化ナトリウム濃度に対する数字はＳ／Ｎ比を示す。

第１０表に示すように、固相に使用する抗体と標識抗体いずれの組合わせにおいても、標識抗体を希釈する溶液中に塩化ナトリウムを添加することで、Ｓ／Ｎ比が増加した。このことは、ＨＣＶ感染検体がより感度良く検出できることを示している。

検出限界
検体（Ｕ１４およびＵ１９）溶液を１倍とし、正常血清溶液で系列希釈した検体を調製した。系列希釈した検体２００μｌに２０％のＰＥＧ４０００を５０μｌ加え、氷上で１時間静置した。４０００×ｇ，５分間，４℃で遠心分離後、沈殿を８Ｍの塩酸グアニジンを含む５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）５０μｌで懸濁し変性させた。さらに０．５Ｍの水酸化ナトリウム溶液を５０μｌ加え５０℃，３０分間処理後、０．３％トリトンＸ−１００を含む０．５Ｍのリン酸水素ナトリウム溶液で中和した。その後０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液で３倍に希釈し測定用の溶液とした。各希釈検体を実施例４記載の方法で測定した。標識抗体溶液中の塩化ナトリウムの濃度は２Ｍとした。

参考例１で得られた既知濃度のＨＣＶコア蛋白質を標準物質としてそれぞれ検量線を作成し、各検体の吸光度（Ａｂｓ）からＨＣＶコア蛋白質量を求めた。Ｕ１４検体を用いた結果を第１１表に、Ｕ１９検体を用いた結果を第１２表にそれぞれ示す。

第１１表および第１２表に示すように、本発明の定量方法は、ＨＣＶコア蛋白質を０．１ｐｇ／ｍＬオーダーまで検出することが可能である。

セロコンバージョンパネル検体でのＨＣＶコア抗原の検出
市販セロコンバージョンパネルＰＨＶ９０８（ＢＢＩ社）を検体として実施例８記載の方法でＨＣＶコア抗原を測定した。ＨＣＶコア抗原は正常人の吸光度を１．０としてそれに対する比率（Ｓ／Ｎ）で表した。
また、該検体を抗ＨＣＶ抗体測定キット（オルソ社製）でも測定した。抗体価はカットオフインデックス（Ｓ／ＣＯ）で表され、１．０以上が陽性と判定される。結果を第１３表に示す。

第１３表に示すように、本願発明の方法によれば、抗ＨＣＶ抗体が陽性になる前にコア抗原を検出することができ感染初期で検出が可能であった。

ＨＣＶコア蛋白質定量用試薬キット
下記の各試薬からなる試薬キットを構成した。
抗体コートプレート（参考例２で得られたＫＴＭ−１４５を用いて参考例５と同様に調製したもの）
検体希釈液
（０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳおよび１％正常マウス血清を含む水溶液）
酵素標識抗体
（参考例２で得られたＫＴＭ−１６３を参考例４と同様に調製したもの）
標準抗原 ０ｐｇ／ｍＬおよび１０ｐｇ／ｍＬ
（参考例１で得られたＨＣＶコア蛋白質を、０．０６７％ＢＳＡ含有ＰＢＳ、０．８９Ｍ 塩酸グアニジン、５．５６ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ８）、０．０５６Ｍ 水酸化ナトリウム、０．０５６Ｍ リン酸二水素ナトリウム、０．００５％ トリトンＸ−１００を含む溶液に、０または１０ｐｇ／ｍＬとなるように溶解したもの）
標識抗体希釈液
［５０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ 塩化マグネシウム、０．２ｍＭ 塩化亜鉛、２０％ ブロックエース、２Ｍ 塩化ナトリウム、０．１％アジ化ナトリウム、０．１％ トリトンＸ−７０５および１％ 正常マウス血清を含む］
発色試薬
［酵素サイクリング反応試薬（ＡｍｐｌｉＱ、ダコ社製）に含まれる発色試薬］
停止液
［酵素サイクリング反応試薬（ＡｍｐｌｉＱ、ダコ社製）に含まれる停止液］

沈殿試薬
（２０％ＰＥＧ４０００）
分散試薬
［８Ｍ塩酸グアニジンおよび５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８）］
アルカリ試薬
（０．５Ｍ 水酸化ナトリウム溶液）
中和試薬
（０．５Ｍリン酸二水素ナトリウムおよび０．３％トリトンＸ−１００）

Claims (2)

1. ＨＣＶコア蛋白質のＮ末から４１〜５０番のアミノ酸配列部位を認識するモノクローナル抗体。
2. ハイブリドーマＫＴＭ−１４５（ＦＥＲＭ ＢＰ−６８３８）が産生する請求項１記載のモノクローナル抗体。