JPH0327297A - Ｂ型肝炎ウイルスエンベロープＰｒｅＳ１およびＰｒｅＳ２タンパク質に特異的なモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、Ｂ型肝炎ウィルス（■ＢＶ）エンベローブＰ
ｒｅＳ１およびＰｒｅＳ２タンパク質に特異的なモノク
ローナル抗体、および該抗体を用いたＨＢＶＰｒｅＳｌ
タンパク質おＪ；びＰｒｅＳ２タンパク質の検出方法に
関する。

（従来の技術および発明が解決しようとする課題）Ｂ型
肝炎ウィルス（１−ＩＢＶ）感染は、世界中の主要な公
衆衛生問題である。急性のＢ型肝炎ウィルス感染および
その慢性の続発症（たとえば肝硬変や肝癌）を防ぐのに
最も有効な方法は予防接種である。使用して良好な効果
が得られているＢ型肝炎ワクチンは、該ウィルスの表面
抗原（Ｈｌ’３ｓＡｇ）からなり、該抗原は慢性のウィ
ルス保菌者の血液から非感染性の２２開の粒子として単
離されたものである。この２２ｎｍの粒子は、２　４　
．０　０　０ｄの主要タンパク質（ｐ２４）および該タ
ンパク質のグリコシル化されたもの（ｇｐ２７）を主と
１７で含有している。最近開発されたワクチンは、ｐ２
４をコードずるＩ−｛　１３　ＶのＳ遺伝子で形質転換
しノ、；酵母細胞により合成ｊ２たｐ２４を含有してい
る。これらワクチンの安全性および有効性に関しでは確
立されているが、その免疫原性に関しては、ある割合の
受容者において不充分である。それゆえ、免疫原性の一
胴大きいＨ　Ｂ　Ｖワクチンに対する必要性が存在しで
おり、そのようなワクチンの同定のためにはＨ　１３　
Ｖタンパク買上の抗原の位置、構造および免疫原性につ
いてのより進んだ知見が必要どされるであろう。

１−Ｉ　Ｂ　Ｖエンベローブのタンパク質組成は決定さ
れており、ウィルスゲノム内でマッピングされている。

第ｌ図にはハーマン（Ｈ　ｅｒｒｍａｎｎ）らによって
提唱されたモデルを要約Ｉ７てある［Ｊ．　Ｖｉｒｏｌ
．．５２、３９６（１９８４）］。このモデルによれば
、３種のＨ　Ｂ　Ｖエンベローブタンパク質およびそれ
らのグリコシル化体は１つの連続１，たオーブンリーデ
ィングフレーム（ＯＲＦ）に由来（７ており、Ｓ領域、
ＰｒｅＳ２領域およびＰｒｅＳ１領域に分けられる。Ｓ
遺伝子は、ウィルスのサブタイプに依存ｊ７てこのＯＲ
Ｆの第三または第四の開始コドンから始まっており、主
要なＨ　Ｂ　Ｖエンベローブタンパク質であるＳタンパ
ク質（ｐ２４タンパク質およびそのグリコシル化体であ
るｇｐ２７を含む）をコードしている。ＰｒｅＳ領域は
、同リーディングフレーム中にさらに２つの開始部位を
含んでおり、２つのー・層大きな｝−Ｉ　Ｂ　Ｖ表面抗
原分子であるＭタンパク質（５５個のアミノ酸であるＰ
ｒｅＳ２＋Ｓタンパク質からむる）およびＬタンパク質
ｃｉｏｓ個および１１９個のアミノ酸であるＰｒｅＳ１
＋Ｐｒｅｓ　２　＋　Ｓタンパク質からなる）の発現を
可能にしている。Ｍタンパク質は、それぞれ！箇所また
は２箇所がグリコシル化きれたｇｐ３３およびｇｐ３Ｇ
からなる。！７タンパク質は、グリコシル化されていな
いｐ３９および１箇所がグリコシル化されたｇｐ４ｔか
らなる。

１１　Ｂ　Ｖ感染者の１０１液においては、全Ｂ型肝炎
表面抗原のうち極めて少攬が完全なウィルス粒子（ゲイ
ン粒子）中に存在するに過ぎない。他の２つの形態であ
る２２ｎｍの球状粒子および直径が２２ｎｍで種々の長
さのフィラメントはカプシドまたはＤＮＡを欠いており
、４２開の「デイン」粒子に比べてＩＸＩＯ＠：Ｉも過
剰に生産される。これらの形態のタンパク質組成は著し
く異なっている。ＨＢＶデイン粒子ではＬタンパク質は
全エンベロープタンパク質の２０％までを占めるのに対
（２て、２２ｒｎの球状粒子では全タンパク質の約目％
を占めるに過ぎない。

形質転換細胞中でしタンパク質か過剰生産されると、こ
れら細胞からの■、タンパク質粒子の分泌が抑制される
。■，タンパク質は分泌、Ｊ−３よび完全なウィルス粒
子の形態形成において本質的な役割゛を果た１，ている
という仮説が立てられている。

Ｌタンパク質のＰｒｅＳｌ領域は、ＨｅｐＧ２細胞との
結合能により示されるようにヒト肝細胞の特定のレセプ
ターを含んでいるかもしれない［ノイラス（Ａ．Ｒ．Ｎ
ｅｕｒａｔｈ）ら、Ｃｅｌｌ、４６、４２９（１９８６
）］。ＰｒｅＳ２領域と重含ヒト血清アルブミン乙の特
異的結合もまた、Ｈ　Ｂ　Ｖと肝細胞原形質膜との結合
の可能な機構として提唱されている［イマイ（Ｍ．　Ｋ
　ｍａｉ）ら、Ｇ　ａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、
７６、２４２（１９７９）］。

ウィルスの構造および機能におけるＰｒｅＳ含有タンパ
ク質の役割にもかかわらず、ＰｒｅＳ＋およびＰｒｅＳ
２タンパク質はマウスにおける免疫原性が高いことが示
されており、これらタンパク質をＳタンパク質と組み合
わせるとＳタンパク質に対する免疫応答が増強される［
ミリッヒ（Ｍｉｌｉｃｈ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２　
２　８、１　１　９　５（１　９　８　５）］．，Ｐｒ
ｅＳ２ｇｉ域の一郎分のみを含白゛４”る合成ベプチド
ワクヂンはＰｒｅＳ２に対する免疫応答を引き起こし、
接種しノ、ニチンパンジーをウィルス攻撃後のＨ　Ｂ　
Ｖ感染から保護］２た［ノイラスら、Ｖａｃｃｉｎｅ，
４、３　５（１　９　８　Ｇ）］。入手可能な［Ｓ型肝
炎ワクヂンはＰｒｅＳ組成が昔しく兄な．っており、Ｐ
ｒｅＳ含有ワクチンのヒトでの相対的免疫原性は未だ解
明すべき課題として残っている。

アウスリアＩＩ　（Ａ　ｕｓｒｉｎ　１種　）、アウス
ザイム１種（Ａｕｓｚｙｍｅ　ＩＩ　）およびモノク［
７　−　テルアウスザイムは、Ｈ型肝炎表面抗原（Ｉ｛
Ｉ｛ＳＡｇ）の検出のための市販のアッセイである（ア
ボッｌ・・ラボラトリーズ、ノースシカゴ、ＩＬ）。モ
ノクローナルアウスザイノへは、Ｓタンパク質に対する
七ノク口ーナル抗体のみを用いている１，これらのＬＩ
Ｌ１ｓＡｇアッセイでは、Ｌタンパク質、Ｍタンパク質
およびＳタンパク質の間の識別をすることができない。

抗１４　Ｂ　ｓ抗体の検出および定量のための市販の直
接固相ラジオイムノアッセイ（Ｒ　Ｉ　Ａ）は、ｌ９７
５年以来利用されている（アウザブ（ＡＵＳＡＢ）、ア
ポット・ラボラトリーズ）［ムシャウオー（［　．Ｋ．
Ｍｕｓｈａｈｗａｒ）ら、Ｊ　．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．
，２、７　７（１　９７８）］。このアブセイでは、ヒ
ト血漿由来ｎ型肝炎表面抗原（ｈｐ｝Ｉ　Ｂ　ｓ　Ａ　
ｇ）をコーティングした固相（ポリスヂレンビーズ）と
ともに血清または血Ｌ＆料をインキユベートしている。

もしも血清中にＨＩ３ｓＡｇに対する抗体（抗ＨＢｓ抗
体）が存在しているならば、それらは固相の抗原に結合
するであろう。第二の工程においては、放射性標識した
Ｈ　ＢｓＡｇ（”’　Ｉ　−１４　ＢｓＡｇ）を加え、
固定化された抗体と反応させている。固相に結合した放
射性標識の量は、もとの試料中に含まれていた抗Ｈ　１
３　ｓ抗体の量に適庶に正比例する。この試験の酵素結
合イムノアッセイ（Ｅｌ八）態様（アウザブＥＲＡ）は
１９８３年以来利用されており、ビオチン化Ｈ［３ｓＡ
ｇ／西洋ワザビベルオキシダーゼ結合アビジン混合物を
プローブ「検出試薬」と１７で用いている［Ａシャウォ
ー、Ｊ　．　Ｖ　ｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、ｌ６、ｌ
０９８７）］。この試験の改良された形態においては、
ビオヂン／アビジン検出系の代わりにビオヂン／抗ビオ
チン検出系が用いられているＥ人シャウォーら、Ｊ　．
Ｖ　ｉｒｏｌＪ４ｅｔｈｏｄｓ，　１　６、４　５（１
　９　８　７）］．しかしながら、これらアッセイは主
として抗Ｓ抗体を検出する。これらアッセイは抗Ｐｒｅ
Ｓｌ抗体および抗ＰｒｅＳ２抗体を検出せず、また抗Ｐ
ｒｅＳ１抗体を主として含有する試料、抗ＰｒｅＳ２抗
体を主として含有する試料または抗Ｓ抗体を主として含
有する試料を識別することも全くできない。

何人かの研究者の報告によれば、抗ＰｒｅＳｌ抗体およ
び抗ＰｒｅＳ２抗体はしばしばヒトにおけるＨＢＶ感染
の最も早期の抗体応答であり、ウィルスのクリアランス
に関係付けることができ、中和抗体として働くかもしれ
ないとざれていることから、ＰｒｅＳｌおよびＰｒｅＳ
２の両タンパク質およびこれらに対する抗体を検出する
ことのできるアッセイを開発する必要性が存在する［た
とえば、タリンカート（Ｋ　ｌｉｎｋｅｒｔ）らのＪ　
．Ｖ　ｉｒｏｌ．，　５　Ｂ、５２２（１．９８６）を
参照］。

ヘス（Ｈｅｓｓ）ら［Ｌｉｖｅｒ，　７、２４５（ｆｉ
９８７）］は、ＨＢＶにより引き起こされた細胞病理と
肝臓生検からの細胞中のＰｒｅＳ１染色の存在との間の
関係を示ｊ７たが、ＰｒｅＳ１発現の潜在的病原的役割
については未だわかっていない。アルバーチ（Ａｌｂｅ
ｒｔｉ）ら［Ｈｅｐａｊｏｌ．　，　７、２０７（１９
８７）コは、ＰｒｅＳ２に対する抗体の存在がウィルス
複製の終了および回復期の始まりの証拠と相関関係を有
することを見出した。それゆえ、抗ＰｒｅＳ１抗体およ
び／または抗ＰｒｅＳ２抗体を暴露患者または［ｉ１１
　Ｖ　患者に投与することは、高度免疫グロブリン（Ｈ
Ｂ１Ｇ）を用いた現在の治療法にとって重要な補助法で
ある。幾つかのＨＢｒＧ製剤にはＰｒｅＳｌおよび／ま
たはＰｒｅＳ２に対する抗体か含まれているので、これ
ら抗体を定電することのできるアッセイを開発する必要
性が存在する。

［１　１３　ｓ　Ａ　ｇはまた抗原性の観点で複合型で
あり、ずべてのＨＢｓＡｇ粒子に存在する型特異「ａ−
１抗原決定基、および通常相互に排他的な２セットのサ
ブタイプ特異抗原決定基であるｄ／ｙおよびｗ／ｒが含
まれている。このことによりＨＢｓＡｇの４Ｎの主要な
サブタイプとしてａｄｗ．．ａｄｒ，　ａｙｗおよびａ
ｙｒが得られる。さらに別の抗原決定基も記載されてお
り、その結果、１０種の異なるＨＢｓＡｇサブタイプが
普遍的に認識される。たとえば、これらサブタイプのう
ちの２つはａｄｙｗおよびａｄｙｗ＋ｒＦｉされ、ｒｄ
ＪとｒｙＪまたはｒｙＪ＝！：ｒｗＪの両方ともが同一
物中に存在する例として挙げられる。ＰｒｅＳ２の５種
の閏なるｌ−１　［３　Ｖサブタイプのアミノ酸配列は
、ノイラスらにより示きれている［Ｓｅｉｅｎｅｅ，　
２　２４、３９２（１９８４）］。

これらのサブタイプの混合サブタイプは、おそらく別の
遺伝子梨を有オる２種またはそれ以上のウィルスにより
細胞が感染した結果によるものである。その結果と１５
での混合表現型は、兄なるサブタイプの粒子の混合物か
または両方のサブタイプを含む粒子として生じる。両サ
ブタイプの抗原決定暴が各粒子Ｌに存在ｔる場合には、
この混合サブタイプ粒子は、単に表現型の混合により、
すなわち１クイルスエンベローブのアセンブリー上で２
つの異なるウィルスＳ遺伝子によりコードされるｐ２５
タンパク質およびｇｐ３０タンパク質という２つの異な
るサブタイプの混合により生じろものと思われる。それ
ゆえ、これら雨タンパク質からなる粒子は、両方のサブ
タイプ抗原決定基を有している。ウィルスの伝播により
別々のサブタイプの抗原決定基を有する粒子が生戊され
る［ポール（Ｄ．Ａ．Ｉ’ａｕｌ）ら、Ｊ　．Ｖ　ｉｒ
ｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．．ｌ　３、４３（１９８６）参
照］。このような抗原性の複雑さのために、感染個体の
ｌＩ　Ｂ　ｓ　Ａ　ｇサブタイプを決定するための方法
を開発する必要性が現在まで続いできている。１４ＢＳ
サブタイプを追跡することは、Ｈ　１３　Ｖ感染の疫学
を七二ターするのに役立ち、屍合■ｎ■サブタイプの起
源を解明する。

（課題を解決するための手段） 本発明は、アミノ酸配列： Ｈ　Ｑ　Ｉ，　Ｄ　Ｐ　Ａ　Ｉ”　Ｇ　Ａ　Ｎ　Ｓから
なる■型肝炎ウィルス（１−ＩＢＶ）ＰｒｅＳ　１タン
パク質の領域中のエビト・−ブどは結合ずるが、Ｉ−Ｉ
Ｕ３ＶＭタンパク質とは結合しないモノクローナル抗体
； アミノ酸配列： ＨＧＧＬＬＧＷＳＰＱＡＱＧ　ＩＭＱ’Ｉ’ＬＰＡＮＰ
Ｐ　Ｐ　Ａ　Ｓ　Ｔ’　Ｎ　Ｒ．Ｑ　Ｓ　ＧからなるＢ
型肝炎ウィルス（Ｈ　Ｂ　Ｖ　）Ｐ　ｒｅＳ　１タンパ
ク質の領域中のエビ１・−プとは結合ずるが、ＨＩ３Ｖ
Ｍタンパク質とは結合１，ないモノクローナル抗体； アミノ酸配列； ＭＱＷＮＳ　ＴＡＦ　ＨＱＴ　ＬＱＤＰ　ＲＶＲＧ　Ｌ
　Ｙ　ＬＰＡＧＧ からなる８型肝炎ウィルス（ＨＩ３Ｖ）ＰｒｅＳ２タン
パク質の領域中のエビ！・・−ブと結合し、Ｈ　Ｂ　Ｖ
Ｍタンパク質およびＨＴ３ＶＬタンパク質とも結合する
モノクローナル抗体； Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）ＰｒｅＳ２タンパク質のア
スパラギン（１２３）における炭水化物残基を含むエピ
トープと結合；２％ＨＢＶＭタンパク質とは結合するが
ＨＢＶ　Ｓタンパク質またはＨＢＶ■７タンパク質とは
結合しないモノクローナル抗体；生理学的試料中のＢ型
肝炎ウィルス（ＨＢＶ）ＰｒｅＳｌタンパク質の検出方
法であって、 （ａ）該生理学的試料を、ＰｒｅＳｌタンパク質からな
るＨ　ｉ｛　Ｖタンパク質と結合する固定化゛抗体（第
一抗体）と反応させて該第一抗体と該ＰｒｅＳＩタンパ
ク質からなるＨＢＶタンパク質との間に複合体をＺＪＥ
戊させ、 （ｂ）該複合体を、検出可能な標識を含む上記モノクロ
ーナル抗体、またはその混合物と反応させて３量複合体
を生成させ、ついで （ｃ）該標識を検出して該生理学的試料中のＨ　Ｉ−３
　ＶＰｒｅＳ１タンパク質の濃度を測定する（その際、
ＨＢＶＳタンパク質の存在はＰｒｅＳ１タンパク質詐度
の測定を妨害しない） ことを特徴εする方法： 生理学的試料中のＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）ＰｒｅＳ
２タンパク質の検出方法であって、 ０）該止理学的試料を、ＰｒｅＳ２タンパク質からなる
１１　Ｂ　Ｖタンパク質と結合する固定化抗体（第一抗
体）と反応さぜて該第一抗体た該ＰｒｅＳ２タンパク質
からなるＨ　Ｂ　Ｖタンパク質との間に曳合体を生成さ
仕、 （ｂ）該複合体を、検出可能な標識を含む−１−記モノ
クローナル抗体、また（ｉその混合物と反応さＵ゛て３
潰複合体を東成させ、ついで （ｃ）該標識を検出ｊ２て該生理学的試料中のＨ　Ｂ　
ＶＰｒｅＳ２タンパク質の濃度を測定する（その際、Ｈ
ＢＶ　　Ｓタンパク質の存在はＰｒｅＳ２タンパク質濃
度の測定を妨害ｊ７ない） ことを特徴とする方法； Ｂ型肝炎ウィルス０｛ｎＶ）のサブタイプを完全に決定
する方法であって、 （ａ）既知のａｙザブタｆプまたはａｄサブタイプの固
定化ｎ型肝炎ウィルス（ＨＩ３Ｖ）表面抗原の試料の第
一部分を、｝ＩＢＶ　　ＰｒｅＳ１タンパク質まノこは
ＰｒｅＳ２タンパク質と結合し検出可能な標識を含む第
−モノク口ーナル抗体と反応さ什、（ｌ））該試料の第
二部分を、Ｉ−ＩｎＶ　　ＰｒｅＳ　１タンパク質また
はＰｒｅＳ２タンパク質と桔合１，検出可能な標識を含
む第−ニモノクロー・ナル抗体と反応さＵ・、ついで （ｃ）結合した標識第−モノクローナル抗体と結合した
標識第二モノクローナル抗体との比企計算＋，て該試料
の完全なサブタイプを決定することを特徴とする方法； Ｌ記モノク口ーナル抗体の少なくともｌ種の有効唄を含
むことを特徴とする、ｎ型肝炎ウィルス（　｝Ｉ［１■
）に対する血漿免疫原性を起こさせる単位投与製剤：お
よび Ｉ３型肝炎ウィルス（ＨＩ３Ｖ）に感染した生理学的試
料中の抗ＰｒｅＳタンパク質抗体の定風法であって、（
ａ）（ｉ）　Ｐ　ｒｅＳタンパク質を含む固定化抗原、
（口）該ＰｒｅＳタンパク質と結合する抗体を含む生理
学的試料、および （ｉｉｉ）該ＰｒｅＳタンパク質と結合し検出可能な標
識を含むモノクローナル抗体 を前以て選択した飛で混合して該固定化抗原に対して該
モノクａ−ナル抗体および該生理学的試刺中の該抗体を
競合的に結合させ、ついで（ｂ）該固定化抗原に結合１
，た標識の量を測定することを特徴とする方法を提供す
るものである。

本発明は、ＨＢＶエンベロープのＰｒｅＳｌタンバク質
の少なくとも３つの異なるエピトープおよびＰｒｅＳ２
タンパク質内の４つの異なるエピトープを定める２つの
パネルのモノクローナル抗体を提｛共する。モノクロー
ナル抗体のこれら６つの「型」のアイソタイプおよび結
合特性については以下に詳述する。４一つの型のエピト
ープ特兄性は、下記第ｌ表にまとめてある。

第ｉ表（ＰｒｅＳＩタンパク質およびＰｒｅＳ２タンパ
ク質に対するモノクローナル抗体）ラスらのＣｅ口、４
６、４２９（１９ｔ’ｌ６）の第１図におけるＰｒｅＳ
ｌメヂオニンから下流のアミノ酸｛）′Ｌ置。

これらエピトープはＰｒｅＳｌまノこはＰｒｅＳ２に特
異的であり、たとえば、Ｓタンパク質の実質的にすべて
の抗原性を破壊ずる処理をＨＢｓＡｇ含存試料（たとえ
ばデイン粒子など）に施１７だ後にも保持される。各型
のモノクローナル抗体の幾つか（、Ｌ１それらのエピ１
・−ブに対して「高アフィニテイー−１結合（Ｋ−＝　
ｌ　Ｏ’−１　０　’りを示す。これらの七ノクＧ−ｆ
ル抗体は、本発明のこの観点の好ましい態様を表す。

本明細吉において定めるようζこ、ＰｒｅＳＩまたはＰ
ｒｅＳ２タンパク質の領域を含むエピトープは、少なく
εも一部は第「表に示しｔこ領域のアミノ酸配列中に含
まれ、また該領域の両側５支たはＰ接するアミノ酸配列
をも含んでいてよい。

イムノアッセイ Ｌ抗原アッセイ： 本発明のモノクローナル抗体は、生理学的試料（ヒト血
清まノ，；は血漿など）中のｌ［　ＩＩＶおよび１４１
｝ｓＡｇを検出ずるための特興的で高感度のイムノアッ
セイを開発するために用いることができる。ｉ−ｔ　｝
３Ｖ変界体が既知の変異体と余りにも異なっているため
に抗Ｓ抗体に基づく検出系（モノクローナルアウスザイ
ムアブセイなど）では反応しないときは、本発明の抗Ｐ
ｒｅＳ抗体に基づく検出系を用いて疑わしい試料をスク
リーニングすることができる。

本発明のモノクローナル抗体を用いて開発したアッセイ
の−つはザンドイッチタイプのラジオイムノアッセイ（
Ｒ　Ｉ　Ａ）または酵素結合イムノアッセイ（Ｅ　Ｉ　
Ａ）であり、、二のアッセイ１こよれば、Ｐｒｅｓ１ま
たはｉ’ｒｅｓ２タンパク質をたとえばＬタンパク質お
よび／またはＭタンパク質と１，て含む液体試料を、、
二４１らタンパク質に対ケる「捕捉抗体」（モノクロー
ナル抗体上た（よポリクローナル抗体のいずれであ、一
）でもよい）を含む同相と反応させろ。この捕捉抗体は
Ｓタンパク質領域と結合する抗体であー〕（もよいし，
、またはＰｒｅＳ１またはＰｒｅＳ２領域中のエビ１・
−ブに特界的に結合する本発明のモノクローナル抗体の
−っであ−）てら，Ｌい。捕捉されノζｐｒｅＳ１また
はＰｒｅＳ２を含むタンパク質を、・ついで検山可能な
標識（放射性同位元素や酵素など）を結合した本発明の
抗ｔ’ｒｅｓ１抗体または抗ＰｒｅＳ２抗体一二反応，
Ｓぜることにより検出し測定する。

別のやり方として、「検出抗体」が検出可能な標識のた
めの結合部位を含んでいて、結合した検出モノクａ−ナ
ル抗体に別の工程で検出可能な標識を加えるようにして
もよい。この検出可能な標識のための結合部位は、該検
出抗体に対する第三の標識抗体？こより結金されるエピ
トープであってよい。たとえば、本発明のように、結合
したマウスモノクローナル抗体を検出ずるためｌ．二酵
素標識抗マウス抗体を用いることができる。ついで捕捉
されたＰｒｅＳＩまたはＰｒｅＳ２含有タンパク質に結
合した標識を、たとえば放射性標識の場合はカウント／
分で、酵素標識により触媒される発焼反応の場合は吸光
度（Ａ）単位により定量し、標やのＰｒｅｓｌまたはｉ
’ｒｅｓ２含Ｎ試料と相関さ（ｉ“て試利中に存在する
ＰｒｅＳＩ含有タンパク質またはＰｒｅＳ２含有タンパ
ク質の量を測定する。

たとえば、本発明のモノクローナル抗体を用いたＰｒｅ
ＳＩ抗原アッセイを下記第２表にまとめてある。

第２表 固相」二の捕捉抗体 （ａ）　ｌ型抗ＰｒｅＳ１抗体 （１））　　ボリク０−ナルＹウスザイム（｛ルモ１ト
：高度免疫血？ｆｆ） （ｃ）　１型抗ＰｒｅＳ１抗体 （ｄ）２型抗ＰｒｅＳ１抗体 （ｃ）　　ボリク■−ナル１ウスザイム（ｒ）　　モノ
クＩ１−ナル１ウスザイム（Ｓタンパク質に対する モノクロ−ナル抗体） 検出七ノクａ−ナル抗体 ２型抗ＰｒｅＳｌ抗体 ｌ型抗ＰｒｅＳ１抗体 ｌ型抗ＰｒｅＳ１抗体 ２型抗ＰｒｅＳ１抗体 ！型＋２型抗ＰｒｅＳ１抗体 ｌ型および／または２型抗ＰｒｅＳｌ 抗体 ＰｒｅＳ２抗原アッセイもまた、Ｉ型、２望および／ま
たは３型抗ＰｒｅＳ２モノクローナル抗体を単独または
ポリクローナルもしくはモノクローナルアウスザイムビ
ーズまたは固相結合抗ＰｒｅＳ２モノクローナル抗体と
組み合わせて用いて開発ｊ７た。

本発明にａ用な固相とｊ２ては、゛プラスチックビーズ
（アウスザイムアッセイに用いるポリスヂレンビーズな
と）；プラスヂックマイクロタイタープレートおよび他
のブラスヂブク細胞培養基体（中空繊維およびシートな
ど）；織物または不織固相（紙、フェルトまたは合戚繊
鞘．でつくられたものなど）、ラテックス微細粒子、多
孔質セラミックｌコ−ズ（ンリカ、アルミナまたはＺｒ
Ｏ＊など）などが挙げられる。捕捉抗体は、これら基体
上、または基体中に物理的に吸着させることができ、ま
た公知の共有桔会法により結合させてもよい。

検出モノクローナル抗体は、当該技術分野で知られた幾
つかの方法のいずれにょっでら標識するこたができる。

広範囲の標識法が、フＪトヌ（Ｆｅｔｅａｎｕ）らの「
ラベルド・アンティボディーズ・イン・バイオロジー・
アンド・ミディスン（ＬａｂｅｌｅｄＡｎｔｉｂｏｄｉ
ｅｇｉｎ　Ｂ　ｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｍｅｄｉｃｉｎ
ｅ）Ｊ［マツクグローヒル・インターナショナル・ブッ
ク（ＭｃＧｒｑｗ−ＬＩｉｌｌ　　Ｉ　ｎｔ．ｒ３ｏｏ
ｋ　Ｃｏ、，）、ニューヨーク（１９７８）３２１４〜
３０９頁に開示されている。

種々の金属放射性同位元素を導入することは、ハントウ
ィッチ（Ｄ　．　Ｊ　．　Ｈ　ａｎｔｏｗｉｅｈ）ら［
Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２０、６　１　３（１　９　８　３
）］：ワグナー（Ｗａｇｎｅｒ）ら［Ｊ　．ＮｕｅｌＪ
４ｅｄ．．２　０，　４　２　８（１　９　７　９）］
；サンドバーグ（　Ｓ　ｕｎｄｂｅｒｇ）ら［Ｊ　．Ｍ
ｅｄ．　ＣＪｅｍ．　，　ｌ　７、１３０４（＋９７４
）］およびザハ（　Ｓ　ａｈａ）ら［Ｊ．Ｎｕｅｌ．Ｍ
ｅｄ．．６、５４２（＋９７６）］の手順に従って行う
ことができる。

使用する放射性同位元累の中で、Ｘ線エミ＝ｚ夕、γ線
工こツター、陽電子エミッターおよび蛍光工Ｅツターが
抗体検出に適１７ている。抗体を標識するのに好ましい
放射性同位元素としては、ヨウ素＋２５、＋３１または
＋２３、インジウ，／−，　１ｌ１、ルテニウム９７、
銅６７、およびテクニチウム９９などが挙げられる。ハ
ロゲン原子を多かれ少なかれ交換して用いることができ
る。

−っの好ま］２い標識法ε。二は、酸化的方法を用いて
ヨウ素−１３１（１−Ｂ！）かまたはヨウ素＋２５（１
−１２５）で標識することが含まれ、該方法では放射性
のヨウ化カリウムも１２＜はヨウ化ナトリウムと抗体と
の混合物を、たとえばグリーンウッド（　（；　ｒｅｅ
ｎｗｏｏｄ）ら［Ｂ　ｉｏｅｈｅｍ．　Ｊ　，　，　８
　９、ｉ１４（１９６３）］により報告されマッコネイ
（ＭｅＣ　ｏｎａｈｅｙ）ら［１　ｎｔ．Ａｒｅｈ．Ａ
　ｌｌｅｒｇｙ　Ａｐｐｌｎ．　Ｉ　ｅｍｕｎｏ１．，
２９、１８５（１９６９）］により改良されているよう
に、ク口ラミン−Ｔ（Ｎ−クロロー１）−トルエンスル
ホンアミドナトリウム塩）で処理する。

一般に、抗体分子の免疫特異性を損なうことなく、でき
るだけ高比率の標識を抗体分子中に導入することが望ま
１，い。各標識抗体について、標識抗体−抗原結合の減
少の程度を標準競合細胞結合アッセイにより確立するこ
とができる．，［−１２Ｓまたは［−１３１を標識とし
て用いたときに、抗体の最初の結会能の少なくとも約３
０％が保持されているこ占が好ましい。

本発明の検出モノク口ーナル抗体は、酵素を直接共有結
合するか、またはビオチン化酵素とアビジン化酵素との
間の反応のような結合を用いることにより酵素標識する
ことができる（ヨーロッパ特許出願公開２９１．１８０
号（１９８８年１１月１１８）公報を参照）。有用な醇
素標識としては、西洋１ノザビベルオキシダーゼ（｝［
Ｒ．Ｐ）、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダ
ーゼおよびグルコースオキシダーゼなどが挙げられる。

本発明のモノクローナル抗体は標的のタンパク質（Ｍま
たはＩ７タンパク質）の固相への結合を妨げは１，ない
ので、本発明のアッセイはまたｌ工程にて行うこともで
きる。ｌ工程アッセイにおいては、試料、捕捉抗体を含
む固相４ｊよび検出モノクローナル抗体を適当な液相中
で一緒に混合する。ついで、固相に結合した標識の量を
」二記のように１，て検出する。

さらに詳しくは、２工程アッセイの一つの好ましい態様
では、捕捉抗体としてのアウスザイム１種ビーズ、およ
び検出抗体どｊ２ての１１　Ｒ　Ｐ結合もしくは１２′
Ｘ　−ＰｒｅＳ　２モノクローナル抗体（ｌ型またはｌ
型／２型混合物）を用いる。このＰｒｅＳ２アッセイの
感度は非常に高く、約１ｎｇＰｒｅｓ２タンパク質／１
ｌＱ仝ｈｐＨＢｓＡｇまたは約０．１５ｎ９Ｐ　ｒｅＳ
　２　／ｖｒ（ｌ　Ｍクンバク質を検出することができ
る。このアッセイはまた、実験的に加えた８０．０００
倍過剰のＳタンパク質の存往下でらＰｒｅＳ２タンパク
質を検出することができる程ＰｒｅＳ２に特売的であっ
た。

ＰｒｅＳｌ含有■７タンパク質は、捕捉抗体として（３
）モノクローナノレ了一ノス４Ｐイムビーズ　すナ・け
ｒｈ）アウスザイム■ビーズを、検出モノク１ｌ−ナル
抗体として（ａ）Ｈ［ＩＰ標ｉｉ型ＰｒｅＳＩモノクロ
ーナル抗体、（ｂ）　［Ｉ　Ｒ　ＰもしくはＩｔｌｉ［
標識ＰｒｅＳ１３型モノクローナル抗体、または（Ｃ）
１″５［標識目型および２型ＰｒｅＳｌモノクローナル
抗体を用い、Ｓタンパク質を添加することにより有為に
妨害されることなく≦Ｉｎ９／ｘ（２試料で検出するこ
とができる。ＰｒｅＳＩモノク［１−ナル抗体をコーテ
ィングしたビーズを用いれば、Ｓタンパク質を添加する
ことによるアッセイへのあらゆる妨害を除くことができ
る。感染１，た患者の血液中におけるＰｒｅＳ抗原の出
現および消失は該疾患の経過および予後と関連すること
が報告されているので、これらのアッセイは１１　Ｂ　
Ｖの管裡において臨床的ｆｆ用シＬがあることがわかっ
ている。たとえば、これらタンパク質「マーカー」の存
在または不在のみを示すアッセイは本発明の定噴的アッ
セイ法ほど有用ではない。

２。抗体アッセイ： 本発明のモノクローナル抗体は、Ｈ　１３　Ｖ上のＰｒ
ｅＳ　１およびＰｒｅＳ２領域へのヒト抗体応答を検出
するための競合イムノアッセイにおいて検出抗体どして
用いることができる。捕捉抗原と（７ては、ヒト血漿由
来表面抗原（Ｓ＋Ｍ＋１，タンパク質からなる）を還元
剤（ジスルフィド結合を開裂するため）およびヨードア
セトアミド（ジスルフィド結合の再生戊を防ぐため）で
処理してＳ領域を変性させたものを用いるのが好まｊ７
い。こうして変性させた捕捉抗原を吸着に上り固相−Ｌ
に固定化する。

ついで、この固定化捕捉抗原を０）前以て選択ｌ７た量
の内因性目ＢＶ抗原含有（ｔ［　８　Ｖ感染のため）ヒ
ト血清または血漿、および（ｂ）前以て選択した量の本
発明の標識抗ＰｒｅＳ１または抗ＰｒｅＳ２モノクロー
ナル抗体占混合する。固相を洗浄ｌ一で未結合物質を除
き、結合（７た標識の量を測定する。

結合した標識モノクロ−ナル抗体の積は、結合した抗［
−１　Ｂ　Ｖ抗体の増に反比例する。このアッセイは、
該疾徹の経過中の抗［｛　Ｈ　Ｖ抗体の＃ＩＪ１７を測
定し、またはＩ−｛　Ｂ　Ｖワクチンレシピエントにお
ける抗体産生をモニターする方法を提供ケるらのである
。このアッセイはまた、１１　１　Ｉ　Ｇ製剤中の内因
比または外因性抗ＰｒｅＳＸおよび抗ＰｒｅＳ２抗体を
測定するために用いることかできる。

競合ザンドイッチアッセイにおいて捕捉抗原と１７で有
用な他の抗原としては、Ｐｒｅｓタンパク質を含む融合
タンパク質上の非ＰｒｅＳエピトープと結合する噛乳類
ポリクローナル抗体が挙げられる。

そのような非ＰｒｅＳエピトープは、たとえばＣＫＳ（
３’−ＣＭＰ−ＫＤＯシンセターゼ）ｌにみられる。Ｃ
　Ｋ　Ｓに対するポリクローナル抗体を固定化し、血清
１場性血清または血漿および前以て選択ｊ２た量の（ａ
）　Ｇ　Ｋ　Ｓ酵素の少なくとも一部とＰｒｅＳ抗原を
含む融合タンパク質および（ｂ）標識ＰｒｅＳモノクロ
ーナル抗体と混合する。この固定化抗体は、ＣＫＳ酵素
の一部およびＰｒｅＳタンパク質を含む組換え抗原融合
タンパク質のＣＫＳ領域に結合する。

Ｌ記融合タンパク質のＰｒｅＳ領域は、内因性抗Ｐｒｅ
Ｓ抗体および添加した本発明の標識抗ＰｒｅＳモノクｎ
−ナル抗体が競合的に結合する結合部位を提供ｔる。そ
れゆえ、検出された結合標識１．二基づくシグナルの強
度は、試料中に存在ずる抗ＰｒｅＳ抗体の量に反比例す
る。上記ＰｒｅＳｌおよびＰｒｅＳ２アッセイの場合ど
同様に、血清および検出モノクローナル抗体は捕捉抗原
に連統的に加えることらできるし、または浦捉抗原とと
もに１工程で混合することもできる。

■ＲｓＡｇのサブタイプ分け 本発明はまた、ヒト血清や血漿などの生理学的流体中に
存在する｝Ｉ　Ｂ　Ｖの特定のサブタイプを決定１る方
法をし提供する。この方法を開発するために、まず既知
のサブタイプの｝Ｉ　Ｉ３　Ｖを含む試料を、固相支持
体に結合させたモノクローナルもしくはポリクローナル
抗Ｓ抗体の試料と接触さ仕る。

Ｓ含有タンパク質の結合により、■７タンパク質やＭタ
ンパク質中にみられるようなＰｒｅＳｌタンパク質およ
びＰｒｅＳ２タンパク質も捕捉される。ついで、結合タ
ンパク質のザブクイブパネルの構成部分（Ｉｌｌｅｍｂ
ｅｒｓ）を２つの部分に分け、同−または異なる型から
の抗Ｔ’ｒｅＳｌまたは抗ＰｒｅＳ２モノクローナル抗
体（検出可能な標識を含む）のベアと連続的に反応さ仕
る。場合により、試料の複敢の希釈を各モノクローナル
抗体と反応させる。ついで結合標識を定量する。

モノクローナル抗体の選択ベアについて、既知のサブタ
イプの一連の試料中の結合標識の相対量は、特定のサブ
タイプに独特なパターンを与える。

ａｙサブタイプおよびａｄサブタイプは一対の既知の抗
Ｓモノクローナル抗体を用いて容易に同定することがで
きるので、既知のａｙまたはａｄ　ＨＢｓＡｇ試料を抗
ＰｒｅＳｌまたは抗ＰｒｅＳ２モノクローナル抗体で「
スキャニング（ｓｅａｎｎ　ｉｎｇ）Ｊすることにより
タイプ分けを存効に完了することができる。たとえば、
ａｙｗ１サブタイプのＨＢｓＡｇ＆の反応により得られ
た２つのＰｒｅＳ２（ｌ型）モノクローナル抗体である
５０−８（１−１９４および１１６８３−４０６につい
ての標識（たとえばカウント／分での）の比は、他のあ
らゆるＩ−ＩＢＶサブタイプのものと比べて５０倍以」
二ある。上記平均（ｌとして）よりも比が約５−７増加
もしくは減少することによりサブタイプを識別すること
ができろ。

このことは、ＰｒｅＳｌタンパク質またはＰｒｅＳ２タ
ンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体をＨ　
Ｂ　Ｖのサブタイプ分けに使用した最初のものである。

多数の患者の血漿または血清試料との本発明のモノク口
ーＪ−ル抗体の反応性のパターンを観察するこ占により
、Ｓ特兄的七ノクローナル抗体の場合についてクルース
（　Ｃ　ｏｕｒｏｕｅｅ）ら「Ｄｅｖｅｌｏｐ．　Ｂ　
ｉｏｌ　．　Ｓ　ｔａｎｄａｒｄ，　５　４、５２７（
＋９８２）］およびウォンズ（Ｊ　．Ｉ１．Ｗａｎｄｓ
）ら［Ｐ　Ｎ　Ａ　ＳＵＳＡ，８１、２７３７（＋９８
４）］により報告されているように、サブタイプ分１」
試薬として本発明のモノクローナル抗体を侠用すること
ができる。本発明のモノクローナル抗体は、抗Ｓモノク
ローナル抗体に基づくサブタイプ分け法では見透される
ような水平伝播の間や種々の集団内でのＨＩ３ｖ株の抗
原性特性における興質性を一層完全に分析するのに有用
である。このことは、Ｓタンパク質の抗原性領域が比較
的小さいことを考慮すると特に真実である。

ワクチンおよびモノクローナル抗体療法本発明のモノク
ローナル抗体により認識されるエピトープの少なくとも
幾つか（．４．、これらエピトープに対するマウスモノ
クローナル抗体と競合する内因社抗体を血清陽性個体で
検出することができるという意味で免疫優性（ｉｌｌｌ
ｌｍｕｎｏｄｏ＋ｍｉｎａｎｔ）’″ｒ！ある。これら
のエピトープには、第ｌ表および第４表に掲げたＰｒｅ
Ｓ２（２型）Ａｓｎｔ２３エピトープが含まれる。それ
ゆえ、本発明のモノクローナル抗体は、ＰｒｅＳｉおよ
びＰｒｅＳ２上のエピトープ部位を検出し、特徴付け、
単離するために用いることができ、ザブユニット１１　
Ｂ　Ｖワクチンの威分と１７で有用である。これらのワ
クチンはまた、ヒトにおける抗ＰｒｅＳｌ抗体および／
または抗ＰｒｅＳ２抗体の力価を増大させるのに有用で
あり、これらの抗体に寓んだＢ型肝炎免疫グロブリンＯ
Ｉ１３１Ｇ）を提供することができる。

本発明はまた、本発明の抗体のｌｆｌ１ｉまたは２Ｍ以
上の有効量を含むことを特徴とずゐ、Ｈ　Ｂ　Ｖに対す
る血漿免疫原性を起こさ仕る単位投与製剤にも関する。

それゆえ、本発明の抗体は、疾患の臨床的進゜行を遅滞
させることによって、感染した患者および／まノニは病
気になった患者の予後を改善するための予防剤としてか
、またはひよっと１，てウィルスの毒性を除く治療剤と
して治療学的有用性を有している。本発明の抗体はまた
、Ｂ型肝炎免疫グロブリン（１４８ＮＧ）の添加物とし
て非常に有用でもある。抗ＰｒｅＳｌモノクローナル抗
体および／または抗ＰｒｅＳ２モノクローナル抗体を添
加したＨＢｔＧ治療剤は、Ｈ　Ｂ　Ｖ感染重者に肝臓移
植（７た後に肝臓が再感染するのを防ぐのに有用である
。

単離したモノクローナル抗体は、対生物活性をアッセイ
したり単位投り．製剤としてインビボで投与する前に、
水性■液体（ａｑｕｅｏｕｓ　ＩＶ　ｌｉｑｕｉｄ）の
ような薬理学的に許容し得る液体担体で希釈するのが好
ましい［１ノミングトン（　Ｒ　ｅｍ　ｉｎｇｔｏｎ）
のＰ　ｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓ　ｅｉｅｎｅｅ
ｓ，オソル（Ａ　．　Ｏ　ｓｏｌ）編、マツク・パブリ
ケーション（Ｍａｅｋ　Ｐｕｂ．Ｃｏ．，）、イースト
ン、ＰＡ（１　６版、１９８０）、ｌ４８８へ一目４９
６頁参照：該文献を参照のため本明細書中に引用するコ
。得られた溶液をたとえば濾過により滅菌する。マルト
ース、グリシンまたはチメ口ザールなどのＩｇＧ製剤に
一般に用いられる防腐剤を薬理学的に許容し得る量で用
いてもよい。

得られた溶肢は、非経口的に、たとえば静脈内注入また
は注射により投（｝ずるのが好ましい。投ｌ−ｊ．’ｆ
るモノク［１−ナル抗体組成物の量は幅広く変化ｊ２て
よく、Ｉ−Ｉ　Ｂ　Ｖ感染患者の体格および身体のコン
ディションに依存する。そのような因子は必然的に経験
的なものであり、公知のＨ　Ｂ　Ｖステージング基ｔｖ
１（１４ＲＶ　ｓｔａｇｉｎｇ　ｃｒｉｔｅｒｉａ）を
用いて臨床医が決定することができる。ある種の臨床場
面においては、感染した標的細胞からウィルス粒子が放
出されろときに該ウィルス粒子の感染性を中和するため
ζ，二、複数の投与量のモノクローナル抗体組成物を投
与する必要があることがある。

つぎに実施例に基づいて本発明をさらに詳しく説明する
が、本発明はこれらに限られるものではない。なお、下
記実施例において、プロテインＡセファ口−スＣＬ−４
８，ＣＮｌ’３ｒ活ｉｔ化セフγロースＣＬ−４Ｂ，セ
ファロースＳ　　３００および他のずべてのクロマ１・
グラフイーゲルはファルマシア（ビス力夕ウエイ、ＮＪ
）から入手ｊ２たものであった。１！気泳動およびウエ
スタンブロツテイング試薬は、パイローラド（Ｂ　ｉｏ
　−　１１ａｄ）（リッチモンド、ＣＡ）から人手した
。西洋ワサビベルオキシダーゼ（ＨＲＰ）は、｝・ヨバ
（ＴｏｙｏｂＰＡ）（ニコ．一ヨーク、ＮＹ）から人手
した。Ｎａ”’Ｉは、アマーシャム（アーリント・ンハ
イツ、イリノイ）から得た。９戊分１−１　１３　ｓ　
Ａ　ｇサブタイプパネルは、Ａ−Ｍクルース（　Ａ−Ｍ
　Ｃ　ｏｕｒｏｕｃｅ）　［インターナシリナル・ワー
クショップ・オプ・ＨＢｓＡｇ・サブタイブス（　Ｉ　
ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｗｏｒｋｓｈｏｐ　ｏｆ　
Ｈ　ＢｓＡｇ　Ｓｕｂｔｙｐｅｓ）、パリ、１９７６年
４月から１から得た。

組換えＰ　ｒｅＳ　Ｉ　（ｒＰ　ｒｅＳ　Ｉ　）および
組換えＰｒｅＳ２　（ｒＰ　ｒｅＳ　２　）は、オカシ
ンスキー（Ｇ．ＯｋａｓｉｎｓｋｉＸアボット・ラボラ
トリーズ、シカゴ、ＩＬ）から贈られたものであった。

ｒＰｒｅｓ１＋よ、ＣＭＰＫ　Ｄ　Ｏソンセターゼ（Ｃ
ＫＳ）のアミノ末端部分とＰｒｏＳｌ残基１２〜［２０
を含むカルボキシ末端を有４゛る融合タンパク質である
。ｒＰｒｅＳ２は、ＣＫＳのアミノ末端部分＆ＰｒｅＳ
２残基１２３〜１７５を含むカルボキシ末端を有ずる融
合タンパク質であった。ｒＰｒｏｓｌおよびｒＰｒｅＳ
２の両方とも１１　１３　Ｖサブタイプａｄｗ２であっ
た。モノクローナル抗体ｌ８／！およびＱ１９／１０は
ガーリッヒ（Ｗ　．　Ｇ　ｅｒ　ｌ　ｉｅｈ）から贈ら
れたものであった［ハーマン（Ｋ　．　１４　．　Ｈ　
ｅｒｒｍａｎｎ）ら、Ｊ　．Ｖ　ｉｒｏｌ．，　５　２
、３９６（１９８４）参照〕。

血清試料の試験は、アボット・ラボラトリーズから市販
されているＲＩＡ−ＥＩＡ試薬、すなわちＨＢｓＡｇに
ついてはモノクローナルアウスザイムおよびアウスリア
■；抗ＨＢｅ抗体についてはクラブ（Ｃｏｒａｂ）；Ｈ
ＢｏＡｇおよび抗ｔｌＢｅ抗体についてはアボットＨ　
Ｂ　ｅ．およびアボットゲノスティックス（Ａｂｂｏｔ
．ｔ　Ｇｅｎｏｓｔｉｃ！＋）を用いて行い１４　Ｂ　
Ｖ１）　Ｎ　Ａを検山した。

デイン粒子調製物中のＨＢｃＡｇを試験ずるために、猷
料（０．２３Ｉ１２）をモノクローナルアウスザイムビ
ーズとともに４０℃で２時間インキスベートした。ビー
ズを水で洗浄し、ついでトリスバッファ一塩中の１％ツ
イーン２　０（２　０　０μの．！：とも《こ４０℃で
３０分間インキ，ベートした。ビーズを洗浄し、ｔｌＲ
Ｐに結合した抗Ｈ　Ｂ　ｅモノクローナル抗体を含む溶
液，！：εもにインキユベートした。

ビーズを洗浄し、」二記基質溶液とともにインキコベー
トした。

実施例ｌ ＰｒｅＳｌおよびＰｒｅＳ２に対するモノクローナル抗
体・ Ａ．ゲイン粒子の精製： 高い■ｒ３ｓＡｇ力価をｆｉするヒトｌｆｒｌ漿を２０
０ｏｒｐｍで２０分間遠心分離することにより清澄化し
た。この上清をＳＷ２８ローター中、２７。０００　ｒ
ｐｍで８時間遠心分離した。得られたベレットを０．０
１Ｍｌ−リス、ｌｌ！ｌＭ　ＥＤＴＡ，ｐＨ７．６（バ
ブファ一Ａ）中に再！！濁１−、この再懸濁混会物を、
２肩Ｑの６２％シジ糖／バッファ一八パッド上に重層し
ておいたバッファ一Ａ中のｌＯ％シヨ糖」二に層状に重
ねた。Ｓ　Ｗ　２　８ローター中、２　７，０　００ｒ
ｐｍで８時間遠心分離した後、フラクシジンを集め、ｌ
−ＩＢｃＡｇについてアッセイした。Ｈ　Ｂ　ｅ　Ａ　
ｇのピークのフラクションをプールし、バッファ−Ａ中
でＩ：４に希釈し、連続１５〜６２％シヨ糖勾配上に重
層し、２７．００Ｏｒｐｍで２４時間回転さＵ′た。フ
ラクシタンを集め、｝｛ＢｓＡｇ、ＰｒｅＳ２　　Ａｇ
％ＰｒｅＳ　Ｉ　　Ａｇおよ゛びＨＢｃＡｇについてア
ッセイした。

Ｂ．免疫： ８週齢の雌Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　Ｃ　ｖウスを、Ｍ　Ｐ
　Ｌ　＋　ＴＤＭアジュバント［＃Ｒ−７００、リビ・
イムノケム小リザーチ（Ｉｌｉｈｉ　　Ｉ　＋ｕｕｎｏ
ｃｈｅｍ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉ　ｎｅ．）］中に懸濁
した精製デイン粒子００μいて３週間間隔で３回免疫し
た。最後のブースター投与の２週間後に血清試料を採り
、酵素結合イムノアッセイ（Ｅ　Ｉ　Ａ）およびウエス
タンブロッティングにより力価を評価した。

Ｃ．抗デイン抗体の検出のためのイムノアッセイ：５％
β−メルカプトエタノール（Ｊ３ＭＥ）、ｌ％Ｓ　Ｄ　
Ｓ中で３分間沸騰さ仕て変性さＵ“たデイン粒子をＰＢ
Ｓ中で２μ９／ＩＩＱ．に希釈し、室温で−夜インキコ
ベートする間にマイクロプレートウエル上にコーティン
グｌ７た。ウエルを蒸留水で洗浄し、ＰｒＪＳ中の３％
ＢＳＡ（２　０　０　７ｚｌ！）テ３　０分間プロツキ
ングした。プレートを洗浄し、空気乾燥した。アッセイ
において、試料をウエル中、室温にて２時間インキュベ
−１・シ、インキコベーションウエルを洗浄し、Ｉ−Ｉ
　Ｉｔ．　Ｐ結会ヤギ抗マウスＩ　ｇ［＃１４−１８−
０９、キルケガール＆ぺりー・ラボラトリーズＣＫ　ｉ
ｒｋｅｇａａｒｄ＆　Ｐ　ｅｒｒｙ　Ｌ　ａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）］を加え、１時間インキュベ−
１・シた。最後の洗浄の後、ＯＰＤ基質溶液（ｌｏＯｌ
ｌｃ：アボット・ラボラトリーズ）を各ウエルに加えた
。１種硫酸を加えて発色反応を停出させた。

Ｄ、融合手順： 応答マウスを２−４箇月休ませ、ついでリン酸緩衝食塩
水（ＰＢＳ）中のデイン粒子（１０μのを前融合静脈内
ブースター投与した。３日後、標準ブロトコールに少１
，変更を加え［コーラー（Ｇ　．Ｋｏｈｌｅｒ）ら、Ｎ
ａｔｕｒｅ，　　２　５　６、４９５（１９７５）］、
牌臓細胞をｓｒ’２／０ミエ〔１−マ細胞昧とｌ：ｌで
融合させた。この融合べＬ／ットを５０％ＰＥＧ（Ａｉ
”ＣＣ　ＮＷ１　４　５　０ＸＩ肩Ｑ）で！分間激しく
分散さＵ、培地（２０＋ｆｆ）中で遠心分離し、細胞を
１１　Ａ　Ｔ選択Ｉ　Ｍ　Ｉ）　Ｍ中に再Ｑ濁して９Ｇ
−ウエル組織培養プレー１−（＃１６７００８、ＮＵＮ
Ｃ）中に１，５ｘｌＯＳリンパ球／ウエルとなるように
プレーティングした。ハイブリソドの生γＩを促すため
に、ＳＴＭマイトジエン（＃Ｒ−５１０、リビ）を最初
のプレーティング培地中にｌ〜２００倍希釈で加えた。

マイトジェンは、その後の培地の変更むよび浦給には用
いなかった。

Ｅ．クローンの確立： 抗デインスクリーニングＥＩＡにおいて陽仕であること
がわかったハイブリッド上冫青を、ウエスタンブロツテ
ィングにより評価して特定のバンドパターンを同定した
。ＥＩＡおＪ；びウエスタンブロッティングで陽性のハ
イブリッドを限界希釈法によりクローニングした。評価
のために選択したクローンは、ブ１／一ト当たり約１０
％の増殖を示したプレートからのものであった。確立し
たクローンを上記のように］２てアッセイし、Ｔ型フラ
スコ中で増殖させ、ブリスタンで初回抗原したｎＡＬ，
　［３　／　Ｃ　７ウス［ドミニオン・ラブズ（Ｄｏｍ
ｉｎｉｏｎＬａｈｓ）］にＩＸＩＯ？細胞／マウスを注
射してモノクローナル抗体含有腹水を生成さ｛ｌ”た。

Ｆ．アイソタイプの決定： モノクローナル抗体のアイソタイプは、ＳｎＡク口ノタ
イピングシステ人■キット（ＳＢＡ　Ｃｌｏｎｏｔｙｐ
ｉｎｇＳｙｓｔｅｍ　ＩＩ　ｋｉｔ）［＃　５　０　３
　０、ササーン・バイオテクノ口ノー・アソシエーツ（
　Ｓ　ｏｕｔｈｅｒｎ　ｎ　ｉｏｔｅｅｈｎｏｌｏｇｙ
　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，　Ｉ　ｎｅ．）ｌを用い、少
し変更を加えて決定した。ｉεＩＡ９６−ウェルマイク
ロプレートを、上記デイン粒子について記載ｊ２たのと
同様にしてｌ：１０００希釈のヤギ抗マウスＩ　ｇＧ　
＋　Ｍ（Ｈ　＋　Ｌ　Ｘキルケガール＆ベリー・ラボラ
トリーズ）（ＩＯＯμＱ／ウエル）で室温にて一夜コー
ティングした。プレートを洗浄し、クローン−１−．／
ｆｔ（５０μ１２）を適当なウエルに加え、室温で２時
間インキュベ−１・シた。プレートを洗浄し、Ｉ：１０
００希釈のキットアイソタイプ持異的結合体（＋００μ
Ｑ／ウエル）を各試料に加えて３０分間インキユベート
した。最後の洗浄の後、色原体をＬ記のようにして加え
た。

Ｇ．モノクローナル抗体の精製・ アッフィーゲルプロテインＡＭＡＰＳ１種キット（Ａ『
ｒｉ−Ｇｅｌ　　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ　　ＭＡＰＳ　Ｉ
ｌｋｉｔＸバイオ・ラド）を用い、ＩｇＧクローニング
株からの抗体をマウス腹水から精製した。カラムを結合
バッファーで平衡化した後、腹水を結合バッフγ−とｌ
；ｌの比で混合し、０．２１１ｍのフィルターを通し、
ついでカラムに負荷した。試料をカラムに負荷した後、
１０−　ｌ５カラム容量の結合バッファーがカラムを通
過した。ついで、供給ｊ一た溶出バッファーでＩｇＧを
溶出し、ｐＨ７．２に中和し、４℃にてＰＢＳ中に一夜
透析した。

■．合成ベブヂド： Ｍｅｔ１２０の丁流のＰｒｅＳ２遺伝子およびＧｌ１１
３の下流のＰｒｅＳ１遺伝子の翻訳生戊物の部分に対応
する合成ベブチドを、ＡＢＩ固相ベブチドシンセザイザ
−［アブライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌ　ｉｅｄ
　Ｂ　ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）］を用いて調製した。２つ
のベブヂドを構築し、ついで高圧液体クロマトグラフィ
ーにより精製してＰｒｅＳ２：ＭＱＷＮＳＴＡＦ　｝Ｉ
　Ｑ　Ｔ　Ｌ　Ｑ　Ｄ　Ｐ　Ｒ　Ｖ　Ｒ　Ｇ　Ｌ　￥　
Ｌ　Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｇ　（　ｔ　２０−１４５）およびＰ
ｒｅＳ　ｌ：ＧＴＮＬｓＶＰＮＰＬＧＦＩｌ’ＤＨＱＬ
ＤＰＡＦＧＡＮＳＮＮＰＯＷＤＦＮＰＶＫＤＤ（１　３
〜５１）を得た。上記ベブヂドにおいてアミノ酸残基の
略語は以下の通りである。

Ａ：アラニン、ｎ；アルギニン、Ｎ：アスパラギン、Ｄ
：アルバラギン酸、Ｃ・ンステイン、Ｑ：グルタミン、
Ｅ：グルタミン酸、Ｇ：グリシン、■：ヒスチジン、Ｉ
：イソロイシン、Ｌ：口インン、Ｋ：リノン、Ｆ：７ェ
ニルアラニン、Ｍ：メヂオニン、Ｐ：ブ〔１リン、Ｓ・
セリン、Ｔ：スレオニン、Ｗ：１・リブトファン、Ｙ：
チロシン、■：バリン■．モノクローナル抗体のデイン
粒子への結合に対するベブヂド抑制 ＰｒｅＳ１残基Ｂ〜５ＫおよびＰｒｅＳ２残基１２０−
１４５をコードする合成ベブヂドを抑制アッセイに用い
た。変性デイン粒子（２　ｉｔ　９／　１１２）を含む
ｌ’Ｂｓ溶液を家温で１８時間インキコ、ベートするこ
とにより、マイクロタイターＥＩＡプレートをコーティ
ングした。モノクローナル抗体をＥ！Ａプレートに加え
る前に、モノクローナル抗体（ＩＯμｙ／ｉ（２）を！
０μＶの１３〜５ｌベブチドかまたは！２０〜１４５ペ
プチドとともに３０分間プレインキコベートした。試料
（５０μσ／ウェル）をプレートに加え、２０分間イン
キユベートし、洗浄した。Ｉ：１０００希釈のＨ　Ｒ　
Ｐ結合ヤギ抗マウスＩ　ｇＧ　（Ｋ　Ｐ　ＬＸ５　０μ
１２／ウ五ル）を加え、３０分間インキュベ−１・シ、
洗浄し、０−フエニレンジアξン（ＯＰＤ）基質で発色
させた。

Ｊ．モノクローナル抗体の親和性： ハイニンゲン（Ｖ　．ｖａｎ　Ｈｅｙｎｉｎｇｅｎ）の
プロトコール［「メソッズ・イン・エンザイモロジー（
Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）Ｊ、ラ
ンゴン（Ｊ　，Ｊ　，Ｉ，ａｎｇｏｎｅ）ら編、アカデ
ミックプレス、ｌ９８Ｇ、４７２ｒ頁１により抗体親和
性を決定した。抗体を低親和性（Ｋ＝Ｉ　Ｏ’−１　０
’）、中間親和性（Ｋ＝１０７−１０’）および高親和
性（Ｋ−１０”〜ｌＱ＋１）εして評価した。精製培養
上清または非精製培養上清でのモノクローナル抗体の親
和性は、該モノクローナル抗体の変性デイン粒子への５
０％最大結合を与える希釈係数または鼎度として決定し
た。結合抗体を検出ずるのにｔ［　Ｒ　Ｐ結合ヤギ抗マ
ウス頁ｇを用いた。

Ｋ．ポリアクリルアミドゲル電気泳動／ウェスタンブロ
ツティング： 分析ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を、
１２％ラニングゲル（ｒｕｎｎｉｎｇ　ｇｅｔ）および
４％スタッキングゲル（ｓｔａｃｋｉｎｇ　ｇｅｔ）を
６するバイ才一ラドスラブゲル装置を用いて行った。ゲ
ルおよびバッファ一組成は、レムリ（Ｕ．Ｋ．Ｉ，ａｅ
ｍｌｌｉ）、Ｎａｔｕｒｅ，　　２　２　７、６８０（
１９７０）のものを用いた。試料を一般にトリスバッフ
ァ一中の１％ＳＯＳ，２．５２％ＤＭＥ中で５分間沸騰
さ１Ｉた。ウエスタンプロッティングは、本質的にタウ
ビン（１種　．　Ｔ　ｏｗｂｉｎ）らのＪ　，　Ｉ　ｍ
ｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏａｓ，　　７２、３１３（１９
８４）に記載されたようにして行った。試料をニトロセ
ルロースに移した後、このニトロセルロースをブロッキ
ングバッファ一（１％ウシヘモグロプリン，ＰＢＳ中の
０１％（Ｖ／Ｖ）ツイーン２０）中に浸漬した。ブロッ
キングバッファ一中の試験すべきモノクローナル抗体（
ｏ．５〜ｌＪＪｇ／ｘＱ）とともにニトロセルロースを
ｌ一・２時間インキユベートし、ついでリン酸緩衝食塩
水（ＰＢＳ）で洗浄し、Ｈ　Ｒ　Ｉ’結合ヤ゛ギ抗マウ
スＩｇＧまた＋ｉｌｇＭ（０．５　〜Ｉ．Ｏμ９／ｚ（
２）とともニｌへ−２時間インキスベー■２た。ストリ
ップを洗浄し、ついで４−クロ口ーｌ−ナフ１・−ル／
過酸化水素基質で発色させた。

Ｌ．放射性ヨウ素化および酵素結合： モノクローナル抗体のタンパク質濃度を、２８０ｎｓで
の吸光度を吸光係数１．３８で除することによりＲ９７
Ｒ（ｌ単位で決定した。他のタンパク質の濃度は、ウシ
血清アルブミンを標準として用いたＢＣＡ［ビチンコン
酸（ｂｉｅｈｉｎｃｈｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）］法［ビア
ス・ケミカル（Ｐ　ｉｅｒｃｏ　ＣｈｃＩＩｉｃａｌ）
、ロックフオード、ＩＬ］により決定した。精製モノク
ローナル抗体を、クロラミンＴ法を用いて２０〜３０Ｉ
ＩＣｉ／μ♂の比活性まで放射性ヨウ素化した［グリー
ンウッド（　Ｇ　ｒｅｏｎｖｏｏａ）ら、Ｂ　ｉｏｅｈ
ｅｍ．　Ｊ　．　，　８　９、１ｆｆｉ４（１９６３）
］。反處混合物をセファデックスＧ−５０カラムに通ず
ことにより、遊離の１１Ｊを結合標識から分ＩＩＩき０
゛た。ナカネ（Ｐ．Ｎａｋａｎｅ）らの方法［　Ｊ　．
　Ｈ　ｉｓｔ．ｏｅｈｅｍ　Ｃ　ｙｔｏｅｈｅｔ　，　
２　２、１０８４（１９７４）］を用い、モノクローナ
ル抗体を西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲｒ’）に結
合させた。結合比は〜般に１：ｌ〜ｌ　：　４　ｏ／ｍ
ｙ（モノクローナル抗体：ＨＲＰ）の範囲である。

Ｍ，相互（Ｒ．ｅｅｉｐｒｏｃａｌ）抑制アッセイニ放
射性ヨウ素化したモノクローナル抗体を陰性のヒト血漿
中に希釈してト１ノ−サー溶液（０．２μｅｉ／ｘｃ）
を調製した。このトレーサー溶液（！００μＱ）を、競
合に用いるモノクローナル抗体を種々の濃度で含む陰性
のヒト血漿０００μＱ）に加えた。ゲイン粒子な２μ９
／ｘ１２でコーティング；２たポリスチレンビーズを加
え、この混会物を４０℃で２時間、または室温で一夜イ
ンキュベ−１・した。このビーズを蒸留水で洗浄ｊ７、
放射能をカウントした。

Ｎ．サンドイッチ抗原イムノアッセイ：ポリスチレンビ
ーズ（直径６　ｘｘ）を濃度２０μグ／岬の捕捉抗体で
４０℃にて２時間コーティングした。ビーズをＰＢＳで
濯ぎ、ついで３％１３　Ｓ　Ａを含むｐ［１ｓ溶液で４
０℃にて１時間インキクベートした。３％シヨ糖を含む
Ｐ　Ｂ　Ｓでビーズを濯ぎ、ついで空気乾燥させた。

試料（０．２０）を抗体コーティングビーズどともに２
０へ−２５℃で一夜、または４０℃で２時間インキスベ
ートした。水で洗浄した後、このビーズを０．２一のｌ
ＩＩｉ［標識検出抗体または［−１　Ｒ　Ｐ結合検山抗
体とεもに４０℃にて２時間インキＪ−ベートした。こ
のビーズを水洗し、ラジオイムノアッセイ（ＲＩ　Ａ）
のためにガンマカウンター中で放射能をカウントするか
、または酵素結合イムノアッセイ（ＥＸＡ）のために０
。０２％Ｈ　＊　Ｏ　＊を含むＯ１Ｍクエン酸一リン酸
バッファ一（ｐＨ５。５）中の０．３％０−フェニレン
ジアミン２｝｛ＣＩ（０．３ｘｆｆ）のＨＲＰ基質溶液
とともにインキユベートした。

酵素反応を室温にて３０分間進行古せ・、ついでｌＮ　
Ｈａｓ　Ｏ４（１ｘｆ２）を加えて反応を停止させた。

クオンタム（Ωｕａｎｔｕｍ）　１種分光光度計（アボ
ッ１・・ラボラトリーズ）を用いて４９２ｎｌ！１にお
ける吸光度を測定した。

Ｏ．試験結果： ０）デイン粒子の精製： ヒト血漿中のＢ型肝炎ウィルス粒子を、大部分の２　２
ｎｍ　ｌｌｎｓＡｇ粒子および他の血漿タンパク質から
シヨ糖勾配遠心分離に五り純粋な形で分離した。フラク
ションをＨＢｅＡｇ，　ＰｒｅＳ　Ｉ　　Ａｇ，ＨＢｓ
Ａｇ、およびＰｒｅＳ２Ａｇの検出のための特兄的イム
ノアッセイによりモニターした。ＳおよびＰｒｅＳ２抗
原活性は２２ｎｍ粒子たと６に沈降したが、ＰｒｅＳ１
抗原およびｔｌＢｅＡｇは４２ｎｍデイン拉子に対応ず
る有為に大きな粒子とともに沈降した。これらのデータ
は、小さな２２ｒｕａ体からデイン粒子を識別するため
にはＰｒｅＳ２やＳではな＜：ＰｒｅＳｌおよびＨＢｃ
Ａｇが役に立つことを示している。Ｌ記ハーマンらの文
献ですでに報告されているように、猜製ＨＢｓＡｇ粒Ｉ
に比べてデイン粒子中にはＬタンパク質（ｐ３９、ｇｐ
４１）が侵勢に存在することが観察された。

（２）免疫： 精製デイン粒子（サブタイプａｄ：サブタイプａｙにつ
いても同様の結果を得ることができる）を用いてマウス
を免疫した。ウエスタンブロブティングおよびゲイン粒
子コーティングビーズイムノアソセイでの反応性により
測定されるように、ｌ〇四のゲイン粒子免疫マウスのう
ち１０匹から検出可能な抗ＰｒｅＳｌおよび抗ＰｒｅＳ
２力価が得られた。

ＰｒｅＳ２合或ベブチド（１２０−１４５）を接種する
こεにより、ある種の免疫応答を起こさせた。

デイン粒子はまた、遊離のベブヂドとしてまたはアジュ
バント中のＫ　Ｌ　！−１またはＢＳＡに結合させて接
種ｌ７た合成ＰｒｅＳｌペブチド（＋２＝５３）に比べ
て有為に良好なマウスでの免疫原であることがわかった
。

デイン粒子コーティング同相を用いた固相ＥＩＡによる
反応性およびデイン拉子のウエスタンブロッティングに
より、ハイブリドーマを始めにスクリーニングした。反
応性のクローンを腹水中で増殖させ・、腹水からプロテ
インＡアフィニテイークロマ１・グラフィーによりモノ
クリーナル抗体を精製した。

（３）抗ＰｒｅＳＩモノクローナル抗体：ａｄサブタイ
プおよびａｙサブタイプの精製デイン拉子とのウエスタ
ンブロソティング反応性、合威ベブチドおよび組換えＰ
ｒｅＳｔまノこはＰｒｅＳ２タンパク質一・の結合、お
よび相亙競合研究により精製モノクローナル抗体を特徴
付けた。相対親和性らまた−Ｌ記試験方法で述べたよう
にして決定した。

これらの結果を抗ＰｒｅＳｌモノクローナル抗体につい
てまとめて第３表に示す。

抗ＰｒｅＳＩモノクローナル抗体のグループ分けを川互
競合イムノアッセイ（変性デイン粒子コーティングビー
ズへの結合に対してモノクローナル抗体が競合する）に
より決定した。これらの研究により、ずべての抗Ｐｒｅ
Ｓｌモノクローナル抗体を３つの異なる型に識別するこ
とができた。ｌ型および２型の抗ＰｒｅＳＩモノクロー
ナル抗体は組換えＰｒｅＳＩに結合し、ウエスタンブロ
ブテイングによりデイン粒子（サブタイプａｄおよびａ
ｙ）のＬタンパク質（ｐ３９およびｇｐ４１）とも反応
する。

これらのモノクローナル抗体は、ＨＢｓＡｇ　Ｓタンパ
ク質（ｐ２４および肝２７）またはＭタンパク質（ｇｐ
３３およびｇｐ３６）とは反応ｊ７ない。Ｉ型および２
型のモノクローナル抗体は、デイン粒子コーティングビ
ーズへの結合に対して競合１，ない。

ｌ型のモノクローナル抗体は合成ベブチド（１３〜５１
）と特異的に結合するが、２型および３型のモノクロー
ナル抗体はこのベブヂドと結合しない。１型のモノク口
ーナル抗体はまた、公知の抗ＰｒｅＳＩモノクローナル
抗体ｌ８／７と有効に競合する。欠失マッピング研究は
、ｌ型のモノクローナル抗体が領域２７〜３５に結合し
、２型のモノク口ーナル抗体が領域７２〜１０２に結合
することを示１２ている。

３型のモノクロー→−ル抗体は、他の２つのモノクロー
ナル抗体とは非常に異なった挙動を示す。

これら３型のモノクローナル抗体は、ａｄサブタイプに
ついてはウエスタンブロツテイングに３Ｌり［，タンパ
ク質とのみ反応するが、ａｙサブタイプについては検出
可能な反応ｗｈは示ざれていない。３型のモノクローナ
ル抗体は、ゲイン粒子ａｄサブタイプコーティングビー
ズと競合的に結合した。これらの抗体はまた、サンドイ
ッチイムノアツセイ（アウスザイム■ビーズを４５μ９
／Ｍ（ｌまでの１１！’｛ｓＡｇと反応させ、ついで＋
！’ｉｔｌｐ識モノクローナル抗体と反応させた）にお
いていずれの｝［ｔｌｓＡｇザンドイッヂとも反応しな
かった。３型のモノクローナル抗体は、固相イムノアッ
セイにおいてらウエスタンブロッティングによー）てｔ
）実質的にｒＰｒｅＳｌへの結合を示さなかった。ｌつ
の高親和性抗ＰｒｅＳ２モノクローナル抗体（５０−８
（Ｌ−１９４）が、３つの４゛べての型の抗ＰｒｅＳｌ
モノク〔Ｊーナル抗体のゲイン粒子への結合を高濃度に
おいて部分的に（２１〜３４％）抑制（２た。

他のずべての抗ＰｒｅＳ２モノクローナル抗体お上び２
つの抗Ｓモノク〔１−ナル抗体（Ｈ３５およびＩ１　１
　６　６　）は、抗ＰｒｅＳｌモノクローナル抗体の結
合の低いまたはごくわずかの抑制を示した。

１１３５および１１　１　６　６は非競合型特與的ｒａ
Ｊ抗原決定基と結合し、すでにピータースン（　Ｐ　ｅ
ｔｅｒｓｏｎ）ら［Ｊ　．　Ｉ　ｍｍｕｎｏｌ．．　Ｉ
　３　２、９２０（１９Ｂ４）］により記載されている
。観察された部分的な抑制は、送体的な制約によるもの
である。｝［　Ｉ　６　６は、ｌ型の抗ＰｒｅＳｌモノ
クローナル抗体の結合を２５％抑制したが、２型および
３型についてはｌＯ％未満の抑制を示した。

（４）抗ＰｒｅＳ２モノクＩＵ−ナル抗体：抗ＰｒｅＳ
２モノクローナル抗体は、相互競合実験により４つの型
に分けることができた。これらモノク口ーナル抗体の反
応性のプロフィルを下記第４表にまとめて示す。

（以下余白） ４型の抗ＰｒｅＳ２モノク口ーナル抗体は、ウエスタン
ブ口ツティングによりＭおよび１，両タンパク質上の線
状エピｌ・−ブ、合成ベプチド１２０〜１４５、および
残基１２３　〜＋７５を含むｒＰｒｅＳ２融合タンパク
質と反応した。

１型の抗ＰｒｅＳ２モノク口ーナル抗体は、さらにｌａ
型およびｌｂ型に細分することができる。高親和性のｌ
ａ型モノクローナル抗体（たとえば５０８０−１９４）
は高親和性のｔｂ型モノクローナル抗体２５−１９−１
１７の結合を完全に抑制するが、モノクローナル抗体２
５−１９−１１７は２０μ９／岬の濃度においてさえも
モノクローナル抗体５　０−８　０−１　９　４のゲイ
ン粒子コーティングビーズへの結合の５０％を抑制する
にすぎない。このような抑制の違いは、幾つかのＩａａ
モノクローナル抗体（たとえば５５−３９１−２６０）
がモノクローナル抗体２５−１９〜＋１７に比べてデイ
ン粒子への親和性が有為に低いことを考えるど、おそら
くデイン粒子へのモノクローナとありそうなこと（よ、
ｌａ型およびＩｂ型モノクローナル抗体は、異なるが空
間的に近接したエ，ビ１一一ブに結合し、そのため立体
的な制約によって競合が起こることである。この現象は
、公知の抗Ｓモノクローナル抗体である！４　９　５と
［１　３　５どの間にみられる［ビータースンら、．Ｊ
　，　Ｉ　ｍｍｕｎｏｌｏｇ）’，１３２、９２０（１
９８４）］。

２型の抗ＰｒｅＳ２モノクローＪ−ル抗体（ｉ、Ｍタン
パク質（ｇｐ３３おｊ；びｇｐ３６）とば結合−４゛る
がＳまたはＬタンパク質（ｐ３９およびｇｐ４２）とは
結合しない。このことは、このモノク〔１−ナル抗体が
遊離のＰｒｅＳ２アミノ末端またはＡ　Ｓ　Ｎ　ｌ　２
　３にある炭水化物残基に結合するかもし相ないことを
示している。炭水化物残基が２型のエピトープの一部を
構成しているかどうかを決定するために、ゲイン粒子を
エンドグリコシダーゼＦで処理した。

ｇｐ３３お３Ｌび．，ｐ３６は、脱グリコンルＭタンパ
ク質（ｐ３０）に対応４″る３０ｋＤのタンパク質バン
ドに変換された。２型のモノクローナル抗体のｐ３位の
本質部分をみめでいることが示された。これらの結果は
、２型のモノクローナル抗体が合威ペブヂド（１２０〜
１４５）および大腸菌内で製造されたｒＰ　ｒｅＳ　２
　（両者ともＡ　Ｓ　Ｎ　Ｉ　２　３における高マンノ
ース炭水化物鎖を欠いている）どの反応性を欠如してい
ることと矛盾しない。

３型の抗ＰｒｅＳ２モノクローナル抗体は、Ｍ抗原デイ
ン粒子とのみ反応１るとｌ，＋う２型と同様のウエスタ
ンブロツティングパターンを示した。２型のモノクロー
ナル抗体は３型のモノクローナル抗体のゲイン粒子への
結合を完全に抑制したが、３型のモノクローナル抗体は
デイン粒子への結合に対して２型のモノクローナル抗体
と部分的に（５０％）競合したにすぎなかった。炭水化
物は結合エピトープの一郎であるように思われる。これ
らのデータは、２型および３型のモノクローナル抗体が
、異なってはいるが立体的に制限された部位を定めてい
ることを示している。

４型のモノクローナル抗体は他のいずれの型の抗Ｐｒｅ
Ｓ２モノクローナル抗体とも相互抑制を示さず、デイン
粒子ａｄサブタイプとは強く反応したがゲイン粒子ａｙ
サブタイプとは反応しなかった。

これらのモノクローナル抗体は、ｒＰｒｅｓ２または１
２０＝１４５（ａｄｗ２）ペブチドとは反応しなかった
。このモノクローナル抗体は、タイプａｙｗｌのｐｒｅ
ｓ２タンパク質と反応する。

抗ＰｒｅＳ１モノクローナル抗体または抗ＳモノクＬ：
７　−　ｆル抗体のいずわら、これら抗ＰｒｅＳ２モノ
クローナル抗体のゲイン粒子（ａｄサブタイプ）への結
合を抑制しなかった６ＩｌｌＩＴｉ．的に、抗ＰｒｅＳ
ｊモノクローナル抗体または抗ＰｒｅＳ２モノクローナ
ル抗体のいずれら、抗Ｓモノクローナル抗体であるＩ１
９５および＋｛　１　６　６と＋ｒ効に競合しなかった
。

果塵創英 Ｈ１３　Ｖサブタイプ分け： Ｈ　Ｂ　Ｖサブタイプ親和性の幾つかの明らかな差異を
モノクローナル抗体型の間で観察した。これらの差異を
Ｆ記第５表にまとめて示す。

チフ′タイフ゜ ａｙｗｌ ａｙｗ２ ａｙｗ３ ａｙｗ４ ａｒｙ ａｄｗ２ ａｄ智４ ａｄｒ ａｄｙｗ 第　　５　　表 抗ｉ’ｒｅｓ２七ノク１１−ナル抗体 ｌａ／ｌａ　　　　　Ｉｂ／ｌａ　　　　　ｌａ／２　
　　　　１ａ／３５０−８０／　　　　２５−１９／　
　　　５０−８０／　　　　５（１８０／１１６−８３
　　　５０−８０　　　　１１６−３４　　　１１５−
３２［＝３．．　　　　　　．ｘ二３＊　　１．２７　
　　　４．２１４，２９　　　　１．５０　　　　　０
，８３　　　　２．６８４，５９　　　　１．３９　　
　　　０．９５　　　　３．１６６．４３　　　　１．
４８　　　　　１．１７　　　　４．１４８．５０　　
　［二二Ｄ二二ｌ−二］　　　　　０．７５７，２０　
　　　１．（１０　　　　　１．３４　　　　５．２２
８，５０　　　６．９６　　　０１３Ｈ二Ｌ−１＝Ｈ目
８　５０ ４．９６　　　　１．４２　　　　　０．９９　　　　
３．００抗ＰｒｅＳ１モノクａ−ナル抗ｆ本 １／１　　　　　　　　２／２　　　　　　　２／１１
１６−８０／　　　　１１６−８／　　　　ｌｌ６−８
／１１６−２９　　　　１１５−１６　　　１１６．．
−８０４．１５１１ｍ加王Ｔｆｉ［二］　１．０２４．
３３　　　　　１．７０　　　　　３．１４３．５９　
　　　　１．５６　　　　　１．６７３．３１　　　　
　１．５８　　　　　１．２３５．６１　　　ＩＩ二’
Ｔ［−ｒ’Ｊ　　２．２８８．５８　　にＬＩＴ］？Ｉ
ニコＩ、３９４．９３　　　　　２．０５　　　［１二
］口Ｌ羽］　　　１．７３　　　２．０９４．５０　　
　　　１．９５　　　　　１．０４抗Ｓモノク■−ナル
抗体 ！１９５／＋１１０ ＠ＴｆＬ玉［コ ０、０２ ０　０１ ０．０２ ０．０２ ａｙａコ ［二１種Ｎゴ］σ「」 ［Ｉ目ｎ二−１ １　３４ （注）四角で囲んだ比は、 ベアの平均値よりも有為に高いかまたは低いものを表す
。

２型の抗ＰｒｅＳ１モノクロ一ノール抗体はａｄｗ４サ
ブタイプとの結合実験においてＩ型の抗ＰｒｅＳｌモノ
クローナル抗体Ｊ；りも９倍以上高いシグナルを示した
が、他のサブタイプとの結合においては約３倍を越える
ことはなかった。同様に、２型および３型の抗ＰｒｅＳ
２モノク口ー→−ル抗体はａｄｒおよびａｄｗ　４サブ
タイプとの反応性がｌ型の抗ＰｒＯｓ２モノクローナル
抗体に比べて３０倍以」二大きかったが、他のサブタイ
プとの反応性についてはｌ型のモノクローナル抗体は２
型または３型のモノクローナル抗体よりも大きかった。

従って、２１！Ｊ．の抗ＰｒｏＳ２モノクローナル抗体
はすべてのＨ　ｒ３　Ｖサブタイプと実質的に等しく結
合することができるので、サンドイッヂ型におけるイ人
ノアッセイの検出抗体として好ましい。

ｌ　ｆｆ！の抗ＰｒｅＳ１モノクローナル抗体のうちで
、一つのモノクローナル抗体であるｌｌＧ−８０１７９
は、この型中の他のモノクローナル抗体に比べてａｄｗ
　２およびａｄｗ４サブタイプについてのシグナルが４
〜ＩＯ倍高かった。２型の抗ＰｒｅＳｌモノクローナル
抗体の一つである＋１５−１６４０７は、この型中の他
の抗ＰｒｅＳ１モノクローナル抗体に比へてａｙｗ　ｌ
　，　ａｙｒ，およびａｄｗ２に対する結合が有為に低
かった。

ｌ型の抗ＰｒｅＳ２モノクローナル抗体のうちで、モノ
クローナル抗体５　０−８　０−１　９　４はモノクロ
ーナル抗体１１６−１８３−４０６に比べてａｙｗｌサ
ブタイプに対して５０倍強く反応する。興味深いことに
、Ｓ　Ｄ　Ｓ変性デイン粒子サブタイブａｄおよびａｙ
で免疫したマウスから得られたモノクローナル抗体５０
−８０−１９４を除いて、すべてのモノクａ−ナル抗体
はゲイン粒子（ａｄサブタイプ）で免疫１，たマウスか
ら得られ、引き続きマウスを合成ベプチド１２０〜ｌ　
４　５　（ａｄψ２サブタイプ）を前融合ブースター没
！テした。モノクロー・ノ・ル抗体２５−１９−１１７
は、合成ベブヂＩ川２０〜１４５で免疫したマウスから
得られた。モノクローナル抗体＋　１　６−３４−２６
３は、モノクローナル抗体５０−８０−１９４に比べて
ａｄｗ４、ａｙｒ，およびａｄｒサブタイプとはるかに
強く反応する。

これらのデータから、種々の感染徹者のＨ　Ｂ　ＳＡｇ
サブタイプを決定することが可能となる。サブタイプｄ
とサブタイプｙとは、それぞれサブタイプ（ｌまたはサ
ブタイプｙと強く反応する公知の抗Ｓモノクローナル抗
体である１１　９　５およびｌ｛　Ｉ　Ｏに対する血清
ＨＢｓＡｇの反応性を測定することにより容易に識別す
ることができる。これらの結果は、抗ＰｒｅＳ２モノク
ローナル抗体５（１８０−１９４および＋１６−３１−
２６３を用いてａｄ＊４およびａｄｒｈ｛ａｄｗ２から
容易に識別されること、およびａｙｗがａｙｒから容易
に識別されることを示Ｉ７ていろ。

袈塵廻−ま ＰｒｅＳｌおよびＰｒｅＳ２ｔｉ原アッセイ：Ａ．Ｐｒ
ｅＳ２抗原アッセイ： 特にＰｒｅＳ２抗原アブセイのために、ヤギ抗■１１１
ｓ抗体（アボヅト・ラボラトリーズ）コーティングビー
ズを放射性標識または酵素標識したモノクローナル抗体
（５０−８０−１９４または２５１９−１１７）ととも
に用いた。大部分の研究は、モルモット抗Ｓボリクロー
ナル抗体を結合さ１１−たアウスザイム■ビーズ（アボ
ット・ラボラトリーズ）、１′Ｉ標識抗ＰｒｅＳ２モノ
クローナル抗体の混合物（２型のＩ　Ｉ　６　−　３　
４−２　６　３および／またはｌ型の５０−８０−１９
４）を含むトレーザー溶肢を用いて行っｔ二。

■３、ＰｒｅＳｌ抗原アッセイ： ＰｒｏＳＩ抗原を検出ケるために、モノクローナルアウ
スザイムまたはアウスザイム１１ビーズを、放射姓漂識
または酔素標識モノクローナル抗体１１６−２９−１２
９（Ｉ型）とともに用いた。モノクローナル抗体１１６
−８０−１７９（Ｉ型）をコーティング］刀、ニビ′−
ズらまた、ブローブとしての放射性漂識または醇素標識
モノクｔ７−ナル抗体ｌ１　６　．−．．−　８−１　
５　１また！ｉ　Ｉ　１　６　−．　７　２　．−　２
　７　０　Ｃともに２聖）とともに用いた。

Ｃ．試験結果： （　Ｉ．　）Ｐ　ｒｅＳ　２抗原アッセイヤギ抗１−Ｉ
　Ｂ　ｓ抗体（アボソト・ラボラトリーズ）コーディン
グビーズ、第−二工程での抗ＰｒｅＳ２モノク口〜Ｊ−
ル抗体（２　５−　１　９−　１　１　７Ｘｌｂ型）、
ついでｔ［　ｒ？　Ｐ結合ヤギ抗マウスＩｇＧを用いた
検出工程からなる３工程アッセイを多くの実験に使用し
、良好な感度と選択性を得た。同等の感度と選択４１ｌ
１を有する２工程アッセイ手順もまた、アウスザイム■
ビーズおよび検出ブローブとしてｔｔｒｔｌ）結合また
ｕｌ＊５ｔ標識抗ＰｒｅＳ２モノクローナル抗体［５０
−．８０−１９４（１ｙＭ）まノ，二は５０８（１−１
９４＋１　１６−３４−２６３（２型）］を用いて開発
した。モノクロ−ナルアウスザイムで１［ＢｓＡｇにつ
いて陰性と試験ざイ］た１００個の試料は、上記Ｐｒｅ
Ｓ２抗原アッセイにおいてずべて非反応性であった。こ
れらの陰性集団に基づき、Ｅ　［　Ａアッセイについて
のカットオフ値として０．０５＋ＮＣκまたはｎ　Ｉ　
Ａアッセイのためのカッ１・オフ値として４ｘＮＣｘを
選択ｊ２た（陰性集団の・Ｖ均からの７標準偏差よりも
大きい）。ＰｒｅＳ２Ａｇを定量するために、ｈｐＨＢ
ｓＡｇ調製物の希釈液を各アッセイにかＩ』た。ｈｐＨ
ＢｓＡｇ調製物中に含まれる全Ｍタンパク質の％を、ク
ーマシーブルー染色Ｓ　Ｄ　Ｓゲルのスキャニング密度
計測により決定した。これらの定徂実験に用いた調製物
は、１５％のＭタンパク質を含んでいた。このＰｒｅＳ
２アッセイの感度は、全ｈｐＨ　Ｂ　ｓ　Ａ　ｇに対し
て約１ｎ９／ｍ（ｌまたはＭタンパク質に対（２て約０
。１５ｎｇ／岬と決定された。

Ｓ遺伝子を３００μ９／籾までの濃度でしか含有しない
組換えＨ　１３　ｓ　Ａ　ｚは抗ＰｒｅＳ２アッセイを
抑制（−２゛ず、コノコとはＰｒｅｓ２Ａｇｉ１８０，
０００昨過剰のＳタンパク質のａｌＥ下で検出し得るこ
とを示していた。ＨＢＶ保菌者からの２００の血漿拭料
を用い、Ｈ　１３　ｓ　Ａ　ｇについてはモノクローナ
ルアウスザイムアッセイにより、Ｍタンパク質について
は１二記ＰｒｅＳ２Ａｇアッセイにょり定吊的にアッセ
イした。ｌｉＢｅＡｇ陽性の保菌者のうちの９９％（１
　０　２／１　０　３’）Ｊ；よび抗１１Ｂｅ陽性音の
うちの９５％（８１／８５）がＰｒｅＳ２抗原アッセイ
で反応性でありた。Ｍタンパク質１ノベルは、１種Ｆ｝
ｅＡｇ陽性保菌者における方か抗Ｈ　Ｒ　ｅ陽性グルー
プにおｉｔるよりも平均して１１倍高かった（１［３ｓ
Ａｇレベル（よ５倍高かりた）。

ｌＯμ曾／ＩＩＱよりも高いＭタンパク質濃度をＹｉ−
４″る試料は、もっぱらＨＢｅＡｇ陽性グループに含ま
れる。この値より低いＭタンパク質濃度ではＩ−ＩＩ３
　ｅ　Ａ　ｇ陽性試利ど抗ｔｉ　Ｆ３　ｅ陽性試料との
間に広範な重複部分が存在゛４′る。これら集団の部分
集合においてＨＩＪＶ　ＤＮＡａ度を測定したところ、
Ｍタンパク質とは不充分な相関しか示されなかった（デ
ータは示していない）。

以上のデータを総合ずると、ＰｒｅＳ２抗原からは抗Ｓ
特異的試験（モノクローナルアウスザイｌ・）から得ら
れる以−Ｌの情報は得られず、活性なウィルス増殖の正
確な指標とはならノ、よいことが示唆されノこ。

（２）ＰｒｃＳｌ抗原アソセイ． １’ｒｅＳＩＡｇを検出するために３つのザンドイッヂ
イ五ノアッセイを開発した。一つはモノクローナルアウ
スザイムビーズおよび検出系としてのＩ［Ｒ　Ｐ結合抗
１’ｒｅｓＩモノクローナル抗体（１１６２９−１２９
、ｌ型）を用いたものであり、第二は固相捕捉抗体とｊ
７ての抗ＰｒｅＳ１モノク［Ｊ一ナル抗体（１　１６−
８０−１７９、ｌ型）および検出モノクローナル抗体ど
してのＩ−Ｉ　Ｒ　Ｐ結合または放射性ヨウ素化抗Ｐｒ
ｅＳ１モノク口ーナル抗体（ｌ１６−７２−２７０、３
型）を用いたものであり、第三はアウスザイムＨビーズ
および検出モノクローナル抗体としての１２５１標識＋
１６−２９−１２９および＋　１　６−８−　１　５　
１（２型）を含むトｌノーザーを用いたものである。

ＰｒｅＳＩＡｇを定量ずるために、精製ディン拉子の希
釈液を各アッセイにか：上た。このディン調製物中に含
まれる全１，タンパク質の％を、Ｍタンパク質の場合に
用いた手順と同様に１２て決定した。

定量に用いたゲイン粒子調製物（．！．、約１０％のＩ
、タンパク質を含んでいた。アッセイのカットオフ値を
決定するために、ｌ００のｔｌｒ３ｓＡｇ陰性血清わよ
び１抽漿をアッセイにかけた。Ｅ［Ａにおいては０．０
５４ＮＣｘのカットオフ値を、ＲＩＡ＋．：むいて｛１
４倍のＮＣｘを（陰性集団くＩξ均からの７標準偏差よ
り６大きい）を用いたときには、すべての試料は非反応
性であった。

！−Ｉ　Ｉ３　Ｖ保菌者からのすべてのＨＢｅＡｇ陽性
試料および抗１［Ｉ３　ｅ陽性絨料の９６．６％（５　
７／５　９）がＰｒｅＳＩＡｇアッセイにおいて反応性
であった。

ＰｒｅＳＩＡｇ濃度は、８ｎ９，／＋Ｃ未満から１６μ
９／岬以−Ｌまでの肱範囲にわたった。０．９μ９／ｌ
（ｌ以Ｌの【７抗原を含む抗［｛Ｆ｛ｅ抗体陽性の試料
はなかったのに対し、ＨＢｅＡｇ陽性試料では３７．５
％であった。血清中の１，タンパク質の濃度が０　．　
９　ｔｔ　９／Ｍ（ｌ未満では、ＨＢｅＡｇ反応性試料
と抗ＨＢｅ反応姓試料との間に血清中のＰｒｅＳＩＡｇ
濃度に関して有為の重複部分が観察される。

ＩＩＢｅＡｇ陽性試料の９３％が血清中に■Ｂ　ＶＩ）
　Ｎ　Ａが検出された（平均［Ｈ【３Ｖ　　ＤＮＡ］＝
６３．８ｐ９／＊ｉ２，範囲二０．５〜４　４　５　ｐ
９／ｚＱ）のに対し、抗ＩＩ　Ｂ　ｅ抗体陽性試料では
２０％であった（平均［Ｈｎｖ　ＤＮＡ］＝２．１　４
ｐ９／ｘ（！，範囲．１．７−２．４　ｐ９／，ｗｆ２
）。

１−ＩＢＶ　　ＤＮＡｉｌ１度の高い血清はＰｒｅＳＩ
Ａｇ濃度も高いという傾向はあったが、これらのマーカ
ーの間には中位の定量的相関しかなかった（ＲＯ．５２
）。Ｐ　ｒｅＳ　Ｉ　Ａｇｅ度と１４ＢｓＡｇａ度との
間には低い相関が観察された（Ｒ＝０．３８）。

実施例４ 抗体アッセイ： 血清陽性個体の血液中の抗ＰｒｅＳ２抗体をアツセイす
るために、還元しヨードアセトアミドをかぶせた（ｉｏ
ｄｏａｅｅｔａｍｉｄｅ　−　ｃａｐｐｅｄ）　Ｓタン
パク質を含む！−［ＢｓＡｇでコーティングした単一の
０．２５インヂポリスチレンビーズに血ｌｑ（２００μ
１２）を加えた。この混合物を２５℃で１８時間インキ
ユベートし、ついで水で洗浄し、動物血清を含む希釈液
中のｌ！Ｉ標識モノクローナル抗体５０−８０−１９４
（２００μＱ１　ｌＩＩＣｉ／肩１２）を加えた。

この混合物を４０℃で２．０時間インキコベートし、洗
浄してａｍのモノク［１−ナル抗体を除き、ビーズをカ
ウントした。あるー・人のＨ　Ｂ　Ｖ　患者の１−ＩＢ
ｓＡｇ，抗Ｉ−Ｉ　Ｂ　ｓ抗体および抗ＰｒｅＳ２抗体
の時間経過を下記第６表にまとめてある。

寒克及 ントロールの値は２である。もしＳ／Ｃｏがくし日であ
れば試料はＰｒｅＳ２タンパク質に対する抗体に関して
陽性（ト）であると考えられる。

検討 １１　Ｉ３　ＶエンベロープのＰｒｅＳｌ領域中の少な
くとも３つの異なるエピトープおよびＰｒｅＳ２領域中
の４つの異なるエピトープを定めるモノクローナル抗体
が製造された。ウエスタンブロッテイングにより観察さ
れるように、これらのすべてのパターンは、ゲイン粒子
を熱、Ｓ　ｆ）　Ｓおよびβ−メルカブトエタノール（
Ｉ３ＭＥ）で処即した後にも保抗原性部（在は大部分破
壊される。抗原決定基は、線状エピトープであるか、ま
たはタンパク質をニトロセルロースに移した後に再形成
することのできろ奈体配座的なエピトープである。Ｐｒ
ｅＳＩおよびＰｒｅＳ２領域にはシステインは存在して
いないので、天然の立体配座を保持ずるためにジスルフ
ィド結合を適当に再形或する必要はない。このことはＳ
の大郎分の抗原性エピトープ（ｐ２４およびｇｐ２７）
と（よ顕著な対ｕｆｌをな１，、これらエピトープでは
ジスルフィド結合の生成および球への適当な組み逢てに
大きく依存している。大部分のＳ抗原決定基は、ウエス
タンブロッティングのための拭料凋製の間のＳ　Ｄ　Ｓ
　／　ｔ｛　Ｍ　Ｅ変性工程で破壊されてしまう。

ウエスタンブロッティングは抗［’ｒｅＳ２モノクロー
ナル抗体および抗ＰｒｅＳｌモノクローナル抗体をスク
リーニングするための梧本的な方法であるので、これら
の領域中の立体配座に依存するエピトープに結合するモ
ノクローナル抗体は見落とｔｈについてもまたすべての
モノクローナル抗体を試験した。それゆえ、これらのモ
ノクローナル抗体により定められるすべてのエピトープ
をウィルス表面にさらさなければならない。

データの示すところによれば、抗ＰｒｅＳ２モノクロー
ナル抗体の−つの型（２型）に関しては、ＰｒｅＳ２領
域中のアスパラギン（Ａｓｎ）　！　２　３におけるグ
リカンは抗原決定基の本質部分を構成していることがわ
かった。このモノクローナル抗体は他の血清グリカンに
は結合しないので、ヒト血液型タンパク質であるグリコ
ホリンＡ（ＭＮ抗原）につい示されているように、抗原
決定基は炭水化物とタンパク質の両方からなっている可
能性がある。

本発明の抗ＰｒｅＳ２モノクローナル抗体おｊ；び抗Ｐ
ｒｅＳＩモノク口ーナル抗体は、ヒト血清および血漿中
のＭタンパク質およびＬタンパク質を検出４゛るための
特異的で高感度のイムノアッセイを開発するのに有用で
あることがわかった。従来の報告では、ＨＩ３ｅＡｇの
血清マーカーの存在とＭタンパク質の存在との間の絶対
的な相関が主張された「イマイら、Ｇ　ａｓＬｒｏｅｎ
ｔ．　，　７　６−、２４２（１９７９）］。文献中の
他の主張は、ＰｒｅＳＩＡｇの存否が感染性およびＨＢ
ＶＤＮＡの仔在と相関があるというものであった。デー
タはヒヌーら（」二掲）の仕事を支持しており、ＨＩ’
３ｅＡｇ個体ではＨＢｓＡｇ，　ＰｒｅＳ　２　Ａｇ，
　ＰｒｅＳ　Ｉ　ＡｇおよびＩ−ＩＢＶＤＮＡの平均濃
度が高いけれども、ｔｌＢｅＡｇ状態と定ｔｈ的な相関
が欠如していることを示していた。

本発明の高感度のイムノアッセイを検出に用いれば、実
質的にずべてのＨｌ’３ｓＡｇ保菌者が、その血清また
は血漿中に検出可能なＰｒｅＳＩＡｇおよびＰｒｅＳ２
Ａｇを有ずることがわかった。従って、このＰｒｅＳ　
　Ａｇアッセイからしまた、Ｓタンパク質（ＨＢｓＡｇ
）特異的試験（モノクローナルアウスザイム）から得ら
れるのと同様の診断およびスクリーニング情報が得られ
ることが明らかである。

ＨＢｓＡｇ，ＰｒｅＳ　Ｉ抗原およびＰｒｅＳ２抗原の
定量により、Ｓタンパク質、Ｍタンパク質およびＬタン
パク質の−Ｌ記濃度がそれぞれＩ　０　０　ｕｌ？／ｍ
（！、ｌＯμＬＩ／ｘＱ．および０．８μｆ／／ｆｆ（
の閾値を越える個体はｆ−ＩＩ３ｅＡｇ陽性でありＨＢ
ＶＤＮＡ陽性である（感度−０　．　５　９ｇ／　ｘ１
２）という点でさらに他の情報が得られる。しかしなが
ら、Ｂ型肝炎エンベローブ抗原の濃度がこれらの閾値を
下回るＨ　Ｂ　Ｖ感染患者の大部分については、抗ＨＢ
ｅ抗体／ＨＩ３ｅＡｇの状聾またはＨＢＶ　ＤＮＡの検
出可能性は正確には予測し難かった。

高アフィニティー抗ＰｒｅＳ２モノクローナル抗体およ
び抗ＰｒｅＳＩモノクローナル抗体のための他の使用と
しては、Ｌタンパク質の肝細胞結合領域をマッピングす
ること、およびＩ−Ｉ　Ｂ　Ｖ感染肝細胞および実験的
に形質転換した肝癌細胞株の細胞内および細胞表面染色
がある。本発明の低アフィニティーＰｒｅＳＩおよびＰ
ｒｅＳ２モノクローナル抗体は、組換えまたは血漿山来
のＰｒｅＳ２およびＰｒｃＳＩ含有タンパク質を高収率
でアフィニティー精製するために首尾よく用いろことが
できた。

本発明のモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマ
株の幾つかの試料は、特許手続上の微生物の寄託の国際
的承認に関するブダペスト条約に従い、アメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　
Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；Ａ
ＴＣＣＸＩ　２　３　０　１　　パークローンドライブ
、ロックビル、メリーランド２０８５２）に寄託してあ
り、下記第７表に示す受託番号を得た。

寒Ｌ表

【図面の簡単な説明】

第ｌは、Ｈ　Ｉ３　Ｖエンベ口ーブのタンパク質組成を
アミノ酸スケール、Ｌタンパク質、Ｍタンパク質および
Ｓタンパク質として示した模式図である。

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. （１）アミノ酸配列： ＨＱＬＤＰＡＦＧＡＮＳ からなるＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）ＰｒｅＳ１タンパ
   ク質の領域中のエピトープとは結合するが、ＨＢＶＭタ
   ンパク質とは結合しないモノクローナル抗体。
2. （２）放射性同位元素または酵素からなる検出可能な量
   の結合標識をさらに含む請求項（１）に記載のモノクロ
   ーナル抗体。
3. （３）アミノ酸配列： ＨＧＧＬＬＧＷＳＰＱＡＱＧＩＭＱＴＬＰＡＮＰＰＰＡ
   ＳＴＮＲＱＳＧ からなるＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）ＰｒｅＳ１タンパ
   ク質の領域中のエピトープとは結合するが、ＨＢＶＭタ
   ンパク質とは結合しないモノクローナル抗体。
4. （４）放射性同位元素または酵素からなる検出可能な量
   の結合標識をさらに含む請求項（３）に記載のモノクロ
   ーナル抗体。
5. （５）アミノ酸配列： ＭＱＷＮＳＴＡＦＨＱＴＬＱＤＰＲＶＲＧＬＹＬＰＡＧ
   Ｇ からなるＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）ＰｒｅＳ２タンパ
   ク質の領域中のエピトープと結合し、ＨＢＶＭタンパク
   質およびＨＢＶＬタンパク質とも結合するモノクローナ
   ル抗体。
6. （６）放射性同位元素または酵素からなる検出可能な量
   の結合標識をさらに含む請求項（５）に記載のモノクロ
   ーナル抗体。
7. （７）Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）ＰｒｅＳ２タンパク
   質のアスパラギン（１２３）における炭水化物残基を含
   むエピトープと結合し、ＨＢＶＭタンパク質とは結合す
   るがＨＢＶＳタンパク質またはＨＢＶＬタンパク質とは
   結合しないモノクローナル抗体。
8. （８）放射性同位元素または酵素からなる検出可能な量
   の結合標識をさらに含む請求項（７）に記載のモノクロ
   ーナル抗体。
9. （９）生理学的試料中のＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）Ｐ
   ｒｅＳ１タンパク質の検出方法であって、（ａ）該生理
   学的試料を、ＰｒｅＳ１タンパク質からなるＨＢＶタン
   パク質と結合する固定化抗体（第一抗体）と反応させて
   該第一抗体と該ＰｒｅＳ１タンパク質からなるＨＢＶタ
   ンパク質との間に複合体を生成させ、 （ｂ）該複合体を、検出可能な標識を含む請求項（１）
   に記載のモノクローナル抗体、請求項（３）に記載のモ
   ノクローナル抗体またはそれらモノクローナル抗体の混
   合物と反応させて３量複合体を生成させ、ついで （ｃ）該標識を検出して該生理学的試料中のＨＢＶＰｒ
   ｅＳ１タンパク質の濃度を測定する（その際、ＨＢＶＳ
   タンパク質の存在はＰｒｅＳ１タンパク質濃度の測定を
   妨害しない） ことを特徴とする方法。
10. （１０）生理学的試料中のＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）
    ＰｒｅＳ２タンパク質の検出方法であって、（ａ）該生
    理学的試料を、ＰｒｅＳ２タンパク質からなるＨＢＶタ
    ンパク質と結合する固定化抗体（第一抗体）と反応させ
    て該第一抗体と該ＰｒｅＳ２タンパク質からなるＨＢＶ
    タンパク質との間に複合体を生成させ、 （ｂ）該複合体を、検出可能な標識を含む請求項（５）
    に記載のモノクローナル抗体、請求項（７）に記載のモ
    ノクローナル抗体またはそれらモノクローナル抗体の混
    合物と反応させて３量複合体を生成させ、ついで （ｃ）該標識を検出して該生理学的試料中のＨＢＶＰｒ
    ｅＳ２タンパク質の濃度を測定する（その際、ＨＢＶＳ
    タンパク質の存在はＰｒｅＳ２タンパク質濃度の測定を
    妨害しない） ことを特徴とする方法。
11. （１１）Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）のサブタイプを完
    全に決定する方法であって、 （ａ）既知のａｙサブタイプまたはａｄサブタイプの固
    定化Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）表面抗原の試料の第一
    部分を、ＨＢＶＰｒｅＳ１タンパク質またはＰｒｅＳ２
    タンパク質と結合し検出可能な標識を含む第一モノクロ
    ーナル抗体と反応させ、 （ｂ）該試料の第二部分を、ＨＢＶＰｒｅＳ１タンパク
    質またはＰｒｅＳ２タンパク質と結合し検出可能な標識
    を含む第二モノクローナル抗体と反応させ、ついで （ｃ）結合した標識第一モノクローナル抗体と結合した
    標識第二モノクローナル抗体との比を計算して該試料の
    完全なサブタイプを決定する ことを特徴とする方法。
12. （１２）請求項（１）、請求項（３）、請求項（５）ま
    たは請求項（７）に記載のモノクローナル抗体の少なく
    とも１種の有効量を含むことを特徴とする、Ｂ型肝炎ウ
    ィルス（ＨＢＶ）に対する血漿免疫原性を起こさせる単
    位投与製剤。
13. （１３）Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）に感染した生理学
    的試料中の抗ＰｒｅＳタンパク質抗体の定量法であって
    、 （ａ）（ｉ）ＰｒｅＳタンパク質を含む固定化抗原、（
    ｉｉ）該ＰｒｅＳタンパク質と結合する抗体を含む生理
    学的試料、および （ｉｉｉ）該ＰｒｅＳタンパク質と結合し検出可能な標
    識を含むモノクローナル抗体 を前以て選択した量で混合して該固定化抗原に対して該
    モノクローナル抗体および該生理学的試料中の該抗体を
    競合的に結合させ、ついで （ｂ）該固定化抗原に結合した標識の量を測定すること
    を特徴とする方法。