CN107223136A - 一种将抗体导入细胞内的方法 - Google Patents

Abstract

一种将抗体导入细胞内的方法，包括通过将穿膜肽与抗体融合表达，所述抗体能够穿透细胞膜进入细胞内与靶分子结合，所述抗体保持对抗原的特异性结合功能。其成功地将抗体通过融合表达的穿膜肽导入细胞内，并且在细胞内发挥抗体作用，成功实现了针对胞内靶标的抗体治疗方法，并且显著提高疗效。

Description

一种将抗体导入细胞内的方法

技术领域

本发明涉及抗体药物技术领域，尤其涉及一种借助于穿膜肽将抗体导入细胞内的方法。

背景技术

在分子生物学中，胞内抗体(intrabody)指的是识别细胞内的蛋白并在细胞内发挥作用的抗体。由于缺乏有效的将抗体导入细胞内的手段，胞内抗体主要通过在靶细胞内表达抗体分子的手段实现，并应用基因重组技术对抗体分子进行适当修饰，使之有不同的亚细胞定位，如线粒体、高尔基体、溶酶体或细胞核，从而可以阻断某些重要的过程，或者干扰靶分子的加工分泌过程，从而发挥其生物学功能。早期通过抗体阻断细胞内的蛋白之间的相互作用是通过显微注射(microinjection)这种技术实现的，对成熟抗体在细胞内的稳定性及功能进行了研究。然而，这方面的研究报道很少，可能是这种技术需要复杂的操作过程。因此迫切需要开发更加广泛应用的技术来实现将抗体分子导入活细胞内。

自然产生的抗体来源于B细胞，并且在细胞外发挥作用，目前临床上使用的抗体药物一般针对的是细胞表面的靶标，通过循环系统被运送至靶部位，而胞内抗体则是可以进入到靶细胞内部发挥其作用的抗体。自然产生的抗体是高度复杂的有序结构，抗体的结构对于维持抗体识别抗原及引起免疫效应起着重要的作用。虽然抗体分子可以在不同的细胞内表达，但是由于不同类型的细胞由于细胞质中的环境不同，最终导致产生出的抗体结构会有较大差别，甚至完全不能识别抗原。不仅如此，在临床应用时，若通过使用抗体基因运送到靶细胞表达的方式产生胞内抗体会受到载体的限制。其它用于基因治疗的将胞内抗体导入细胞的方法，包括病毒转运系统和非病毒转运系统，也面临各种问题。病毒转运系统包括腺病毒、慢病毒及腺相关病毒等，存在安全性(如引起癌基因的表达)及免疫排斥等问题。而利用非病毒转运系统，例如裸露DNA、各种DNA的包裹技术，虽然安全性得到提高，但存在其它方面的问题，如靶向性差，转染效率低和基因表达的瞬时性表达量低等问题。

细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides，CPPs)是一段短的多肽，通常小于30个氨基酸，不仅本身具有穿越细胞膜的能力，还可以作为载体将生物大分子一同转到细胞内。目前研究较多的是1988年Green等首次发现的HIV-Ⅰ的转录活化因子TAT，后续的研究表明有转导功能的结构存在于49～57位氨基酸，被称为蛋白转导域(protein transductiondomain，PTD)，在此之后，很多具类似跨膜功能的多肽分子陆续被发现。

通过穿膜肽将亲水的物质导入活细胞在基础研究和治疗学上都具有强大的应用潜力。而且，在实际中所转导的货物可以不受尺寸的限制，从而极大的提高可以转运的货物的范围。穿膜肽在介导生物分子进入细胞有很多优势，表现在：首先，细胞穿膜肽转导的货物不受分子量和其性质的显著影响，应用范围广泛；其次，研究表明细胞穿膜肽毒性相对较小，具有良好的临床应用潜力；再次，细胞穿膜肽可以穿越多种类型的组织细胞，无显著的特异性，可以广泛的应用于不同疾病的治疗；最后，细胞穿膜肽穿膜能力强，可以通过粘膜进入组织细胞，不局限于静脉注射，可以用于口服或鼻黏膜给药。理论上，细胞穿膜肽可以携带的货物种类非常多，包括：小分子蛋白，多肽，质粒，核酸，寡聚核苷酸，脂质体及纳米颗粒物等。

在将胞内抗体导入细胞的技术中，至今尚未成功地采用穿膜肽将抗体导入细胞内，同时还能保持抗体的生物学功能。因此，研究穿膜肽介导的胞内抗体导入细胞技术具有重要意义和应用价值，也将为针对胞内靶标的治疗性抗体研究提供了新的思路。

发明内容

本发明提供一种将抗体导入细胞内的方法，使用穿膜肽能够成功地将融合表达的抗体导入细胞内，并且保持抗体的生物学活性不受影响，该抗体能够用于抗体药物的制备中。

根据本发明的第一方面，本发明提供一种将抗体导入细胞内的方法，通过将穿膜肽与抗体融合表达，上述抗体能够穿透细胞膜进入细胞内与靶分子结合，上述抗体保持对抗原的特异性结合功能。

进一步地，上述抗体包括完整抗体以及抗体片段。

进一步地，上述穿膜肽与上述抗体的重链C端连接。

进一步地，上述穿膜肽与上述抗体直接连接或通过连接序列介导连接。

进一步地，上述穿膜肽的序列选自SEQ ID NO：5-17中任意一种。

进一步地，上述穿膜肽是来源于HIV-Ⅰ的转录活化因子TAT_(48-60)，上述抗体是针对HBx蛋白的单克隆抗体，并且上述穿膜肽与上述抗体的重链连接后形成的氨基酸序列是SEQID NO：1，上述抗体的轻链的氨基酸序列是SEQ ID NO：2。

根据本发明的第二方面，本发明提供一种第一方面的方法中得到的穿膜肽与抗体融合表达产物在制备抗体药物中的用途。

进一步地，上述抗体药物是用于治疗和/或预防肿瘤的抗肿瘤药物。

根据本发明的第三方面，本发明提供一种将抗体药物偶联物导入细胞内的方法，通过将穿膜肽与抗体融合表达，上述抗体能够穿透细胞膜进入细胞内与靶分子结合，上述抗体保持对抗原的特异性结合功能，并且上述抗体上偶联有药物分子。

进一步地，上述偶联的药物是细胞毒性药物或放射性核素。

进一步地，上述偶联的药物是抗肿瘤药物。

进一步地，上述穿膜肽是来源于HIV-Ⅰ的转录活化因子TAT_(48-60)，上述抗体是针对HBx蛋白的单克隆抗体，并且上述穿膜肽与所述抗体的重链连接后形成的氨基酸序列是SEQID NO：1，上述抗体的轻链的氨基酸序列是SEQ ID NO：2。

进一步地，上述偶联的药物分子是甲基澳瑞他汀E(Monomethyl auristatin E，MMAE)。

根据本发明的第四方面，本发明提供一种第三方面的方法中得到的穿膜肽与抗体融合表达并且偶联有药物分子的产物在制备抗体药物中的用途。

进一步地，上述抗体药物是用于治疗和/或预防肿瘤的抗肿瘤药物。

本发明的将抗体导入细胞内的方法，通过将穿膜肽与抗体融合表达，能够成功地将抗体导入细胞内，并且保持抗体的生物学活性不受影响，该抗体能够用于抗体药物的制备中。

附图说明

图1为本发明一个实施例中在6D12抗体不同末端融合表达TAT后对HBx的反应动力学曲线；其中，对照表示未融合表达TAT的6D12抗体，C:H-TAT表示融合于重链C端，C:L-TAT表示融合于轻链C端，N:H-TAT表示融合于重链N端，N:L-TAT表示融合于轻链N端；

图2为本发明一个实施例中将TAT融合表达于抗体Fc末端的模式图；

图3为本发明一个实施例中重组表达的TAT-6D12进入细胞的实验结果图，采用免疫荧光用共聚焦显微镜；

图4为本发明一个实施例中几种胞吞抑制剂可以阻断TAT-6D12可以进入细胞的实验结果图，采用免疫荧光用共聚焦显微镜；

图5为本发明一个实施例中细胞内TAT-6D12对HBx的反应活性的实验结果图；

图6为本发明一个实施例中TAT-6D12与HBx在细胞内的共定位的实验结果图，采用激光共聚焦显微镜；

图7为本发明一个实施例中进入细胞内的TAT-6D12可以降解其靶标HBx的实验结果图；

图8为本发明一个实施例中TAT-6D12与Trim21在细胞内共定位的实验结果图，采用激光共聚焦显微镜；

图9为本发明一个实施例中突变后的TAT-6D12不能降解细胞内HBx的实验结果图；

图10为本发明一个实施例中穿膜肽与ADC融合表达TAT-3G11-MMAE治疗组与对照组3G11-MMAE相比的实验结果图，治疗组显著减小肿瘤的体积，提高其抗肿瘤疗效。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。

本发明首次成功地将穿膜肽与抗体融合表达在一起，形成能够穿透细胞膜并在细胞内发挥抗体活性作用的融合抗体。本发明通过具体实验证实了穿膜肽能够将与其融合的抗体导入细胞。基于各种穿膜肽的一般共性和各种抗体的一般共性，能够知道本发明的穿膜肽与抗体形成融合抗体并具有穿膜功能和抗体活性作用的技术方案，广泛地适用于各种穿膜肽和抗体。

合适的穿膜肽按照其来源特征包括但不限于：来源于天然蛋白中的穿膜肽，如TAT、pVEC和penetratin等；模式(model)穿膜肽，它们是模拟穿膜肽的结构通过人工合成的两亲性α螺旋结构，如MAP和(Arg)7等；完全人工设计合成的穿膜肽，如Transportan和MPG等，它们通常是嵌合多肽、两性分子。可用于本发明中的一些典型的穿膜肽及其来源和功能性肽序列如表1所示。

表1 细胞穿膜肽的种类

可用于本发明的合适的抗体指完整抗体以及抗体片段如Fab片段，单链抗体(single-chain Fv,ScFv)，双特异性单克隆抗体(bispecific monoclonal antibodies,BsAb)，二硫键稳定抗体(disulfied-stablizedFv,dsFv)，单域抗体(single domainantibody,SDAb)。抗体可以是多克隆抗体也可以是单克隆抗体，优选单克隆抗体，本发明中的抗体是重组表达的抗体，优选重组表达的抗体作为单克隆抗体。重组表达的抗体能够通过重组表达的方式与穿膜肽融合在一起直接形成融合抗体。

本发明发现，在穿膜肽与抗体融合表达时，穿膜肽与抗体的重链C端连接比与抗体的其它部位(例如重链N端、轻链C端和轻链N端等)连接能够更好地保持抗体活性作用不受影响。因此，优选穿膜肽与抗体的重链C端连接。

穿膜肽与抗体之间的连接可以是直接连接，也可以是通过连接序列(linker)介导连接。典型但非限定性的连接序列比如(GGGS)4。在不影响抗体活性作用的前提下，优选穿膜肽与抗体之间直接连接。在某些情况下，穿膜肽与抗体之间直接连接会影响抗体活性作用，而通过连接序列连接能够消除这种影响，在这样的情况下，穿膜肽与抗体之间最好通过连接序列。具体地，可以根据具体的抗体特性和采用的穿膜肽的类型和特性选择连接方式。

在本发明的一个实施例中，穿膜肽是来源于HIV-Ⅰ的转录活化因子TAT_(48-60)，抗体是针对HBx蛋白的单克隆抗体，其是通过重组表达获得的抗体。TAT_(48-60)与针对HBx蛋白的单克隆抗体通过重组表达方式形成融合抗体，二者直接连接在一起，并且优选地将TAT_(48-60)连接在针对HBx蛋白的单克隆抗体的重链C端。在该优选实施例中，穿膜肽与抗体的重链C端连接后形成的氨基酸序列是SEQ ID NO：1(参见序列表)，抗体的轻链的氨基酸序列是SEQ ID NO：2(参见序列表)。

本发明的融合抗体可以直接作为抗体药物使用，也可以用于药物的制备中。这种抗体药物带有穿膜肽，因此能够穿透细胞膜进入细胞内，抗体能够靶向细胞内的靶标，提高治疗的靶向性和疗效。这种抗体药物优选是用于治疗和/或预防肿瘤的抗肿瘤药物。由于肿瘤治疗中存在靶向性不足和对正常组织造成负面性杀伤问题，而本发明的融合抗体能够穿透细胞膜进入肿瘤细胞内，克服了抗体药物难以进入细胞内的难题，从而对于细胞内靶标分子引起的肿瘤具有明显的疗效。

在进一步研究中，本发明的融合抗体可以与目前的抗体药物偶联物(antibodydrug conjugate,ADC)结合在一起，形成带有穿膜肽的抗体药物偶联物，该抗体药物偶联物包括融合抗体和偶联的药物，其中融合抗体包括融合在一起的穿膜肽和抗体，并且融合抗体能够穿透细胞膜进入细胞内与靶分子结合。一方面，抗体能够发挥对靶标分子的特异性结合作用，进而清除靶标分子或清除其影响；另一方面，偶联的药物也能靶向性地发挥其治疗作用，提高靶向性和疗效。偶联的药物可以是细胞毒性药物或放射性核素等，其可以是用于治疗和/或预防肿瘤的抗肿瘤药物。

在本发明的一个实施例中，所形成的带有穿膜肽的抗体药物偶联物，包括来源于HIV-Ⅰ的转录活化因子TAT_(48-60)作为穿膜肽，针对HBx蛋白的单克隆抗体作为抗体，甲基澳瑞他汀E(Monomethyl auristatin E，MMAE)作为偶联的药物分子。其中，穿膜肽和抗体通过重组表达方式以直接连接的形式形成融合抗体，而偶联的药物与融合抗体通过化学偶联的方式偶联在一起，优选在活化后通过EDC(1-Ethyl-3-(3A-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride)偶联在一起。

本发明的融合抗体包括融合在一起的穿膜肽和抗体，能够成功地导入细胞内，并且保持抗体的生物学活性不受影响，该融合抗体能够用于抗体药物的制备中。

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，应当理解的是，实施例仅是示例性的，并不构成对本发明保护范围的限制。

实施例1：穿膜肽TAT_(48-60)与抗HBx蛋白的抗体形成融合抗体TAT-6D12

本实施例采用融合表达的方法，分别将TAT_(48-60)(具体的氨基酸序列是：GRKKRRQRRRPPQ)添加到已经构建好的重组表达6D12抗体的重链C端(C:H-TAT)、轻链C端(C:L-TAT)、重链N端(N:H-TAT)或轻链N端(N:L-TAT)四种方式。

首先评价改造后的抗体对HBx的反应活性是否发生变化。用不同浓度重组HBx蛋白包板，以间接化学发光免疫检测精细评估各融合抗体的反应动力学曲线，图1所示的结果显示，将TAT_(48-60)加在重链或者轻链的N端都导致抗体对HBx蛋白反应性的完全消失，而加在轻链的C端，虽然保留了与HBx蛋白的反应性，但与未改造的抗体相比反应活性下降了近两个数量级，只有将TAT_(48-60)融合表达于抗体的重链C端(C:H-TAT)，即抗体的Fc端，不影响6D12对HBx的反应活性。将TAT融合表达于抗体的Fc端的模式图如图2所示。

实施例2：融合表达的TAT-6D12抗体的穿膜效果

将在6D12Fc末端融合TAT_(48-60)构建的重组质粒转染CHO细胞进行表达，并用Protein A亲和层析纯化分泌到培养基上清的抗体，进而开展生物学功能分析。将重组表达的TAT-6D12和未改造的6D12分别添加到HuH7的细胞培养基中，终浓度为0.3mg/ml，孵育12h，然后做免疫荧光用共聚焦显微镜分析TAT-6D12能否进入细胞内。结果如图3所示，重组表达的TAT-6D12可以显著地进入HuH7细胞内(注：荧光原来为绿色，转化后为灰白色)，进入效率接近100％，非常高效，并且呈弥散状分布，提示抗体在细胞质中分布。进而在不同种属及组织来源的细胞系如，人肝癌细胞系HepG2、鼠肝癌细胞系Hepa1-6、人胚肾细胞系HEK-293、人肺癌细胞系A549等研究发现，TAT-6D12都可以有效的穿越细胞膜进入到细胞内(结果未示出)。提示重组表达的TAT-6D12可以非特异性的高效进入细胞内。

实施例3：融合表达的抗体TAT-6D12的穿膜机制研究

TAT介导的穿膜机制目前还没有彻底研究清楚，最新的研究结果表明，胞吞作用(endocytosis)在其内化过程中占有重要地位，普遍认为TAT接到的大分子转运依赖于胞吞作用。因此，采用几种常用的胞吞抑制剂进行研究，研究能否阻断TAT-6D12进入细胞内部。这几种常用的胞吞抑制剂的作用机制如表2所示。首先将这些抑制剂分别加入到HuH7细胞培养基中，然后将终浓度为0.3mg/ml TAT-6D12添加到细胞培养基中，孵育12h，然后做免疫荧光用共聚焦显微镜分析TAT-6D12进入细胞的过程是否被阻断。结果如图4所示，非律平(Filipin)、细胞松弛素D(Cytochalasin D，Cyto D)、氯喹(Chloroquine，Chlo)这三种抑制剂能够显著阻断TAT-6D12进入细胞内，甲基-β-环糊精(Methyl-β-cyclodextrin，MβCD)对TAT-6D12的内化过程也有一定程度的抑制作用。综上所述，TAT-6D12穿越细胞膜进入到细胞内部是一个依赖胞吞的过程，并且，网格蛋白介导的内吞(CME,clathrin-mediatedendocytosis)、网格蛋白独立的内吞(CIE,clathrin-independent endocytosis)、巨胞饮(macropinocytosis)以及脂筏(Lipid raft)四种模式都可能参与了TAT介导的抗体入胞过程。

表2 几种常用胞吞抑制剂及作用模式

(CCVs，clathrin-coated vesicles,网格蛋白包被的囊泡)

实施例4：进入细胞内的TAT-6D12仍具有对HBx的反应活性

为了研究内化到细胞中的TAT-6D12是否还具有对HBx的反应活性，将终浓度0.3mg/ml的TAT-6D12分别孵育HuH7细胞0.5h、2h、4h、6h、8h、10h、12h，然后用PBS洗涤5遍，并用非变性裂解液DDM裂解细胞，并将细胞裂解液添加到HBx包被的ELISA板，检测其对HBx的亲和力。图5所示的结果显示，进入细胞内的TAT-6D12对HBx仍具有良好的反应活性(注：荧光原来为绿色，转化后为灰白色)，提示TAT-6D12在细胞内仍能够保持其活性。

实施例5：进入细胞内的TAT-6D12可以识别其靶标HBx

为了研究内化到细胞中的TAT-6D12是否能够识别细胞内的HBx蛋白，通过免疫荧光的方法，研究二者在细胞内是否共定位。如图6所示，绿色荧光代表HBx蛋白(注：右上图，荧光原来是绿色，转化后成灰白色)，红色荧光代表TAT-6D12(注：左下图，荧光原来是红色，转化后成灰白色)，通过激光共聚焦显微镜拍摄，然后将图片合并在一起，结果显示绿色荧光与红色荧光重叠在一起(注：右下图，荧光原来是绿色和红色，转化后成灰白色)，表明细胞内的TAT-6D12与HBx蛋白形成复合物，进入细胞内的TAT-6D12可以识别其靶标HBx。

实施例6：进入细胞内的TAT-6D12可以降解其靶标HBx

通过蛋白印迹(Western Blot)检测进去到细胞内的TAT-6D12是否降解其靶标HBx，内参蛋白为微管蛋白(TUBLIN)，用于表示所使用蛋白总量一致。图7所示的结果显示，TAT-6D12处理组中的HBx量显著少于6D12处理组及对照抗体处理组，表明进入细胞内的TAT-6D12可以降解其靶标HBx。

实施例7：进入细胞内的TAT-6D12与TRIM21相互作用

最新的研究表明，当腺病毒感染细胞后，吸附在腺病毒表面上的抗体也随之被一起带入细胞内，并可以与细胞质中的抗体Fc受体——TRIM21结合，激发起细胞内免疫反应以消灭病毒。作为一种存在于细胞内部的Fc受体，TRIM21与IgG的结合力比目前已知的所有Fc受体都要强。TRIM21识别吸附在病毒表面的抗体分子，然后通过其E3泛素化配体的功能催化K48和KK63泛素化链的形成。催化形成的K48能够通过AAA ATPase VCP和蛋白酶体(proteasome)降解系统，将病毒颗粒在几小时内快速消灭。同时，TRIM21催化形成的K63链能够激活下游的固有免疫信号通路，例如NFκB、AP-1和IRF3/5/7，这导致细胞因子和趋化因子等抗病毒分子的大量表达，上调NKG2D配体和MHCⅡ类分子，使细胞处于抗病毒状态。猜测通过基因改造过的在细胞内发挥作用的TAT-6D12抗体，其作用机制很可能是通过类似的途径，因此，对这一猜测进行验证。TRIM21是目前唯一被报道的细胞质中的抗体Fc受体，通过改造过的可以进入细胞内的抗体很可能是通过这个Fc受体发挥作用。为了研究TRIM21与进入细胞内的TAT-6D12之间是否存在相互作用，通过免疫荧光的检测方法，用共聚焦显微镜观察他们在细胞内是否共定位。图8所示的结果表明，代表TAT-6D12的绿色信号(注：左上图，荧光信号原来为绿色，转化后为灰白色)与代表TRIM21的红色信号(注：右上图，荧光信号原来为红色，转化后为灰白色)重叠在一起，显示TAT-6D12和TRIM21之间存在相互作用，形成复合物。

实施例8：突变后的TAT-6D12抗体不能降解细胞内HBx蛋白

为了进一步确认抗体在细胞内发挥作用是依赖TRIM21分子的模式，首先构建了CH3缺失的TAT-6D12克隆(TAT-6D12-CH3^-)，然后表达纯化，结果显示TAT-6D12-CH3^-与HBx的结合活性没有发生显著的改变，表明抗体的Fc端CH3区域在介导细胞内免疫起着重要的作用。

为了进一步评价TAT-6D12在细胞内发挥作用依赖于与TRIM21的相互作用，通过将其与抗体结合的热点(hot-spots)做点突变，为H433A、N434A、H435A，更深入的研究TRIM21在抗体介导的细胞内免疫所起的作用。图9所示的结果显示，突变后的TAT-6D12由于不能与TRIM21形成复合物，因此不能降解细胞内的HBx蛋白。

实施例9：穿膜肽提高ADC的治疗效果

近几年发展起来的抗体药物偶联物(antibody drug conjugate,ADC)，即将细胞毒性药物或放射性核素与抗体偶联并带入至靶细胞，从而实现对肿瘤细胞的高效特异的杀伤，是新一代抗体技术临床应用的发展方向。虽然ADC获得了巨大的成功，引起了广泛的关注，但是ADC开发技术要求高，工艺复杂，其中ADC被靶细胞吞噬的效率低是目前临床应用的瓶颈问题，数据显示仅有极少数的ADC分子可以进入肿瘤细胞，吞噬的效率的提高对于抗肿瘤疗效的提升至关重要。

本研究发现，将穿膜肽与抗体融合表达可以显著的提高抗体的内化效率，该技术可应用于ADC药物的开发，提高内化效率及对肿瘤的杀伤能力。本研究的数据显示，穿膜肽不具有靶向性，然而将针对HBs的抗体(3G11)与穿膜肽(TAT)融合表达后，一方面可以将抗体导入细胞，另一方面提高了穿膜肽的靶向性，即TAT-3G11在HBV阳性的肝癌细胞(Hepa1-6-N10)进入效率更高。由于抗体进入细胞后没有显著的细胞毒性，为了提高对肝癌细胞的杀伤力，将前期研究过的小分子毒素MMAE(Monomethyl Auristain E)与TAT-3G11偶联在一起，即TAT-3G11-MMAE。其中，TAT与3G11抗体的重链C端融合后形成的氨基酸序列是SEQ IDNO：3(参见序列表)，3G11抗体的轻链的氨基酸序列是SEQ ID NO：4(参见序列表)。

体外的细胞测定表明TAT-3G11-MMAE对HBV阳性的肝癌细胞(Hepa1-6-N10)具有更显著的细胞毒性，随后的动物实验(图10)也证实了该偶联物对由Hepa1-6-N10所形成的肿瘤具有显著的治疗作用。以上实验结果表明穿膜肽与ADC融合表达可以提高其在靶细胞的内化效率，提高其抗肿瘤疗效。对于ADC药物的开发策略具有重要的指导意义。

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 张军方

<120> 一种将抗体导入细胞内的方法

<130> 16P22628

<160> 17

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 456

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Leu His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Ser Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Arg Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Gly Arg Glu Asp Asp Asp Gly Pro Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Arg Pro Thr Pro Pro Ser Val Tyr

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser

195 200 205

Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys

210 215 220

Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro

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Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr

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260 265 270

Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg

275 280 285

Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile

290 295 300

Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn

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Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys

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Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu

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Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe

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<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

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1 5 10 15

Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn Ile Tyr Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val

35 40 45

His Asn Ala Lys Ile Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His His Ser Gly Ile Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala

100 105 110

Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly

115 120 125

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Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser

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180 185 190

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<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

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1 5 10 15

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35 40 45

Gly Asn Phe His Pro Tyr Asn Asp Asp Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Lys Leu Thr Gly Glu Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Asp Asp Ser Gly Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ala Thr Leu Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala Arg Pro Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro

115 120 125

Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val

130 135 140

Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser

145 150 155 160

Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu

165 170 175

Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser

180 185 190

Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val

195 200 205

Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys

210 215 220

Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys

225 230 235 240

Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val

245 250 255

Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp

260 265 270

Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe

275 280 285

Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp

290 295 300

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe

305 310 315 320

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys

325 330 335

Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys

340 345 350

Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp

355 360 365

Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys

370 375 380

Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser

385 390 395 400

Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr

405 410 415

Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser

420 425 430

Leu Ser His Ser Pro Gly Lys Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg

435 440 445

Arg Pro Pro Gln

450

<210> 4

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Asp Val Gln Leu Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Leu Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ile Asn Leu Asp Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ile Asn Thr Leu Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala

100 105 110

Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly

115 120 125

Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile

130 135 140

Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu

145 150 155 160

Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr

180 185 190

Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Asn Glu Cys

210

<210> 5

<211> 13

<212> PRT

<213> Tat

<400> 5

Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln

1 5 10

<210> 6

<211> 16

<212> PRT

<213> Penetratin

<400> 6

Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys

1 5 10 15

<210> 7

<211> 18

<212> PRT

<213> pVEC

<400> 7

Leu Leu Ile Ile Leu Arg Arg Arg Ile Arg Lys Gln Ala His Ala His

1 5 10 15

Ser Lys

<210> 8

<211> 27

<212> PRT

<213> Transportan

<400> 8

Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu

1 5 10 15

Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu

20 25

<210> 9

<211> 27

<212> PRT

<213> MPG

<400> 9

Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly

1 5 10 15

Ala Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val

20 25

<210> 10

<211> 21

<212> PRT

<213> Pep-1

<400> 10

Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys

1 5 10 15

Lys Lys Arg Lys Val

20

<210> 11

<211> 7

<212> PRT

<213> Poly(Arg)n

<400> 11

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg

1 5

<210> 12

<211> 8

<212> PRT

<213> Poly(Arg)n

<400> 12

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg

1 5

<210> 13

<211> 9

<212> PRT

<213> Poly(Arg)n

<400> 13

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg

1 5

<210> 14

<211> 10

<212> PRT

<213> Poly(Arg)n

<400> 14

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg

1 5 10

<210> 15

<211> 11

<212> PRT

<213> Poly(Arg)n

<400> 15

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg

1 5 10

<210> 16

<211> 18

<212> PRT

<213> MAP

<400> 16

Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys

1 5 10 15

Leu Ala

<210> 17

<211> 9

<212> PRT

<213> R6W3

<400> 17

Arg Arg Trp Trp Arg Arg Trp Arg Arg

1 5

Claims (15)

1.一种将抗体导入细胞内的方法，其特征在于，通过将穿膜肽与抗体融合表达，所述抗体能够穿透细胞膜进入细胞内与靶分子结合，所述抗体保持对抗原的特异性结合功能。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗体包括完整抗体以及抗体片段。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述穿膜肽与所述抗体的重链C端连接。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述穿膜肽与所述抗体直接连接或通过连接序列介导连接。

5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述穿膜肽的序列选自SEQ ID NO：5-17中任意一种。

6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述穿膜肽是来源于HIV-Ⅰ的转录活化因子TAT_（48-60），所述抗体是针对HBx蛋白的单克隆抗体，并且所述穿膜肽与所述抗体的重链连接后形成的氨基酸序列是SEQ ID NO：1，所述抗体的轻链的氨基酸序列是SEQ ID NO：2。

7.权利要求1所述的方法中得到的穿膜肽与抗体融合表达产物在制备抗体药物中的用途。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述抗体药物是用于治疗和/或预防肿瘤的抗肿瘤药物。

9.一种将抗体药物偶联物导入细胞内的方法，其特征在于，通过将穿膜肽与抗体融合表达，所述抗体能够穿透细胞膜进入细胞内与靶分子结合，所述抗体保持对抗原的特异性结合功能，并且所述抗体上偶联有药物分子。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述偶联的药物是细胞毒性药物或放射性核素。

11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述偶联的药物是抗肿瘤药物。

12. 根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述穿膜肽是来源于HIV-Ⅰ的转录活化因子TAT_（48-60），所述抗体是针对HBx蛋白的单克隆抗体，并且所述穿膜肽与所述抗体的重链连接后形成的氨基酸序列是SEQ ID NO：1，所述抗体的轻链的氨基酸序列是SEQ ID NO：2。

13.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述偶联的药物分子是甲基澳瑞他汀E。

14.权利要求9所述的方法中得到的穿膜肽与抗体融合表达并且偶联有药物分子的产物在制备抗体药物中的用途。

15.根据权利要求14所述的用途，其特征在于，所述抗体药物是用于治疗和/或预防肿瘤的抗肿瘤药物。