RU2582244C2 - Функционализированные полипептиды - Google Patents

Функционализированные полипептиды Download PDF

Info

Publication number
RU2582244C2
RU2582244C2 RU2011103168/10A RU2011103168A RU2582244C2 RU 2582244 C2 RU2582244 C2 RU 2582244C2 RU 2011103168/10 A RU2011103168/10 A RU 2011103168/10A RU 2011103168 A RU2011103168 A RU 2011103168A RU 2582244 C2 RU2582244 C2 RU 2582244C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
linker
esba105
cysteines
binding
scfv
Prior art date
Application number
RU2011103168/10A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2011103168A (ru
Inventor
Дэвид УРЕХ
Original Assignee
ИЭсБиЭйТЕК, ЭН АЛЬКОН БАЙОМЕДИКАЛ РИСЕРЧ ЮНИТ ЭлЭлСи
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ИЭсБиЭйТЕК, ЭН АЛЬКОН БАЙОМЕДИКАЛ РИСЕРЧ ЮНИТ ЭлЭлСи filed Critical ИЭсБиЭйТЕК, ЭН АЛЬКОН БАЙОМЕДИКАЛ РИСЕРЧ ЮНИТ ЭлЭлСи
Publication of RU2011103168A publication Critical patent/RU2011103168A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2582244C2 publication Critical patent/RU2582244C2/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1037—Screening libraries presented on the surface of microorganisms, e.g. phage display, E. coli display
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1062—Isolating an individual clone by screening libraries mRNA-Display, e.g. polypeptide and encoding template are connected covalently
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Изобретение относится к биохимии. Описано одноцепочечное антитело (scFv), связывающееся с TNFα, содержащее домен VH и домен VL, связанные линкером; где линкер включает два цистеина, способных к образованию внутрицепочечной дисульфидной связи, и где аминокислоты между цистеинами в последовательности линкера образуют петлевой фрагмент, когда два цистеина связаны друг с другом дисульфидной связью; и при этом scFv имеет последовательность SEQ ID No. 8. Раскрыто применение аминокислотного линкера для связывания VH и VL доменов scFv, где линкер включает два цистеина, способных к образованию внутрицепочечной дисульфидной связи, и где аминокислоты между цистеинами в последовательности линкера образуют петлевой фрагмент, когда два цистеина связаны друг с другом дисульфидной связью; при этом scFv имеет последовательность SEQ ID No. 8. Изобретение улучшает фармакокинетические свойства (например, период полураспада in vivo, проницаемость ткани и время нахождения в ткани). 2 н.п. ф-лы, 7 ил., 1 табл., 2 пр.

Description

Родственные заявки
Данная заявка претендует на приоритет по предварительной заявке на патент США сер. № 61/076775, озаглавленной "Способы и композиции для модификации связывающих иммунопрепаратов", поданной 30 июня 2008 г., содержание которой включено в данное описание путем ссылки во всей своей полноте
Предпосылки создания изобретения
Эффективность терапевтических полипептидов часто в существенной степени ограничена присущими им фармакокинетическими свойствами. Например, в случае терапевтических антител часто сообщается о проблемах, связанных с проницаемостью тканей, нахождением в ткани и периодом полувыведения из сыворотки крови. Улучшение фармакокинетических свойств терапевтического полипептида может привести к повышенной эффективности и сниженным режимам дозировки. Современные способы модулирования фармакокинетических свойств терапевтических полипептидов обычно ограничены своей направленностью к периоду полужизни в сыворотке крови.
Соответственно, в данной области существует необходимость в усовершенствованных способах модификации фармакокинетических свойств терапевтических полипептидов, обеспечивающих быстрые и специфические возможности модификации аминокислот и адресованных к дополнительным фармакокинетическим параметрам, помимо периода полураспада.
Краткое изложение сущности изобретения
Данное изобретение относится к функционализированным полипептидам, в частности к терапевтическим полипептидам (например, scFv). Полипептиды по данному изобретению включают линкерную последовательность, которую можно быстро и специфически функционализировать путем присоединения одного или несколько функциональных фрагментов (например, ПЭГ) и/или фрагментов специфического связывания (например, аминокислотная последовательность с определенной специфичностью связывания). Такие функционализированные полипептиды являются выгодными по той причине, что они обладают улучшенными фармакокинетическими свойствами (например, улучшенным периодом полураспада in vivo, проницаемостью ткани и временем нахождения в ткани) по сравнению с нефункционализированными полипептидами. Также разработаны способы быстрого и воспроизводимого образования функционализированных полипептидов.
Соответственно, в одном аспекте данное изобретение относится к полипептиду, такому как связывающий иммунопрепарат (например, scFv), включающему два домена, связанных аминокислотным линкером. Линкер обычно включает два цистеина, способных образовывать внутрицепочечную дисульфидную связь, а аминокислоты в линкерной последовательности между двумя цистеинами образуют петлю, когда два цистеина связаны дисульфидной связью друг с другом. В конкретном варианте осуществления изобретения линкер включает последовательность, представленную в SEQ ID No:1 или 2.
В некоторых вариантах осуществления линкер содержит петельный фрагмент, который связывается с молекулой-мишенью, такой как РК-модификатор (например, гиалуроновая кислота и сывороточный альбумин). Посредством связывания с молекулой-мишенью увеличивается период полураспада в сыворотке крови и/или эффективность проницаемости тканей и/или определенная специфичность связывания полипептида, включающего линкер. В конкретном варианте осуществления линкер включает последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID No:3 или 4. В предпочтительном варианте осуществления полипептид включает последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID No:6 или 8.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один цистеиновый остаток в линкере является ковалентно связанным с функциональным фрагментом. В конкретном варианте осуществления два цистеиновых остатка в линкере являются ковалентно связанными с одним и тем же функциональным фрагментом. Подходящие функциональны фрагменты включают, например, ПЭГ, молекулы углеводов и гидроксиэтилкрахмал (HES). При ковалентном связывании функционального фрагмента, такого как ПЭГ или HES, с полипептидом продлевается период полувыведения такого полипептида в организме субъекта.
В другом аспекте данное изобретение относится к композициям, включающим один или несколько полипептидов по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.
В других аспектах изобретение относится к молекулам нуклеиновых кислот (например, векторам), кодирующим полипептиды по изобретению и клеткам-хозяевам, содержащим молекулы таких нуклеиновых кислот.
В другом аспекте данное изобретение относится к способам получения функционализированного полипептида. Такие способы обычно включают обеспечение библиотеки пептидных последовательностей, выявление из данной библиотеки по меньшей мере одной пептидной последовательности, которая связывается с молекулой-мишенью и модификацию области петли линкер-содержащего полипептида для того, чтобы она включала по меньшей мере одну выявленную последовательность. Желаемые пептидные последовательности могут быть выявлены с помощью любых признанных в данной области средств, включая, например, фаговое отображение, дрожжевое отображение или мРНК отображение.
Описание фигур
На фиг.1 показан электрофорез на полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS) различным образом обработанных молекул ESBA105 (полосы 3-10). Полоса 1: маркер; полоса 2: не определена; полоса 3: восстановленный DDT; полоса 4: восстановленный и подвергнутый диализу; полоса 5: восстановленный цистеин-ПЭГилированный; полоса 6: цистеин-ПЭГилированный, подвергнутый диализу; полоса 7: контроль; полоса 8: лизин-ПЭГилированный; полоса 9: лизин-ПЭГилированный, подвергнутый диализу; полоса 10: контроль. Молекулярный размер ПЭГ составлял приблизительно 0,7 кДа/ПЭГ.
На фиг.2 показан анализ ELISA для TNF-альфа связывающей активности (А) цистеин-ПЭГилированного ESBA105 и (В) лизин-ПЭГилированного ESBA105. А: Значение ЕС50 для ESBA105 составляло 0,9833; для восстановленного ESBA105: 1,291; и для Cys-пэгилированного ESBA105: 1.164. R2 для ESBA105 составлял 0,9814; для восстановленного ESBA105: 0,9891; для Cys-пэгилированного ESBA105: 0,9857. В: Значение ЕС50 для ESBA105 составляло 0,8073 и для Lys-пэгилированного ESBA105: 1,326. R2 для ESBA105 составлял 0,9870 и для пэгилированного ESBA105 - 0,9640.
На фиг.3 показаны (а) схематическое изображение немодифицированного окисленного ESBA105-SS-линкера, (b) ESBA105-SS-линкера ПЭГилированного (ESBA105-S2-PEG2) с использованием монофункционального ПЭГилирующего реагента 1 и (с) ESBA105-SS-линкера ПЭГилированного (ESBA105-S2-PEG) с использованием бифункционального ПЭГилирующего реагента 2.
На фиг.4 показаны: (А) анализ ELISA для TNF-альфа связывающей активности ESBA105 и ESBA105-SS-линкер; (В) SDS-PAGE гель ESBA105, подвергнутого различной обработке и (С) вестерн-блот, оценивающий степень ПЭГилирования ESBA105 и ESBA105-SS-линкер с использованием кроличьего анти-ПЭГ антитела. Фиг.4 (В): полоса 1: ESBA105-SS-линкер восстановленный + диализованный + сконцентрированный; полоса 2: ESBA105-SS-линкер восстановленный + диализованный; полоса 3: ESBA105-SS-линкер восстановленный + пэгилированный; полоса 4: ESBA105-SS-линкер восстановленный + пэгилированный + диализованный; полоса 5: ESBA105-SS-линкер.
На фиг.5 показано схематическое изображение, иллюстрирующее презентирование петельного фрагмента пептида молекулы scFv 1 на поверхности бактериофага 2 в целях фагового отображения (молекула scFv и фаг не масштабированы). В указанном случае петельный фрагмент включат 7 аминокислот, которые могут взаимодействовать с молекулой-мишенью 3, такой как сывороточный альбумин (продление периода полураспада) FcRx (транспорт через плаценту), муцин (продление времени нахождения в эпителии), интегрин (пептиды RGD), комплемент, плотно соединенные белки, мультимеризация и т.д.
На фиг.6 показан анализ ELISA для TNF-альфа связывающей активности ESBA105 и цистеин-пэгилированного ESBA105-SS-линкера. Значение ЕС50 для ESBA105 составляло 0,9980 и для ESBA105 с пэгилированным SS-линкером: 1,181. R2 для ESBA105 составлял 0,9397 и для ESBA105 с пэгилированным SS-линкером: 0,9851.
На фиг.7А показана кинетика связывания VEGF для ESBA903. Подгонка: 1:1 связывание; ka (I/Ms): 7,68E+5; kd (1/с): 4,310E-5; KD (M): 5,608E-11. На фиг.7B показана кинетика связывания ESBA903-Pepl. Подгонка: 1:1 связывание; ka (I/Ms): 1,133E+6; kd (1/с): 5,026E-5. Для обоих, 7а и 7b, значения по оси Х приведены в секундах, значения по оси Y в резонансных единицах (РЕ).
Подробное описание
Определения
Термин "домен", применительно к полипептиду, имеет признанное в данной области значение и относится к дискретной единице третичной структуры. Примеры доменов включают, без ограничения, домены антител VH (вариабельная область тяжелой цепи) или VL (вариабельная область легкой цепи), домены фибронектина и анкирин-повторяющиеся домены.
Термин "линкер" относится к линейной последовательности аминокислот, связывающей два домена. Линкеры по изобретению могут быть генетически и/или химически сконденсированы с доменом. В некоторых вариантах осуществления линкеры содержат петлю.
Термин "петельный фрагмент (петля)" относится к циклической последовательности аминокислот, образованной за счет внутрицепочечной дисульфидной связи в линкере.
Термин "полиэтиленгликоль" или "ПЭГ" относится к линейному или разветвленному нейтральному полиэфиру с химической формулой HO-(CH2CH2O)n-H и его реакционно-способным производным. Реакционно-способные производные ПЭГ хорошо известны в данной области и включают, без ограничения, ПЭГ, связанный с метил-PEO12-малеимидом, N-гидрокси-сукцинимидилкарбонатом, N-гидрокси-сукцинимидилпропионатом, п-нитрофенилкарбонатом, бензотриазолкарбонатом и альдегидом. В конкретном варианте осуществления амино-реакционно-способное производное ПЭГ представляет собой бис(сульфон)-связанный ПЭГ, способный специфически взаимодействовать с дисульфидными связями (см., например, Brocchini et al., Nature Protocols, 2006; 1(5), 241). Подходящие молекулы ПЭГ имеют молекулярный размер между 0,5 кДа и 50 кДа.
Термин "молекула-мишень" относится к любой молекуле, специфически связанной посредством петельной области полипептида по изобретению. Молекулы-мишени включают, например, сахара, белки и жиры.
Термин "функциональный фрагмент" относится к биологическому или химическому объекту, который придает дополнительную функциональность молекуле, к которой он присоединен (например, молекула ПЭГ, одна или несколько молекул углеводов или гидрокисэтилкрахмал (HES)).
Термин "РК-модификатор" относится к любой молекуле, которая изменяет фармакокинетический профиль белка, будучи связанной с белком. РК-модификатор обычно, но не обязательно, представляет собой природную эндогенную молекулу, присутствующую в организме субъекта (например, пациента). Локализация и распространенность такого РК-модификатора в организме субъекта может быть физиологической или патологической (например, при сверхэкспрессии на поверхности раковых клеток или в месте воспаления). Подходящие РК-модификаторы включают, например, гиалуроновую кислоту, коллаген типа II, сывороточный альбумин, рецепторы антител Fc (например, FcRx), Fc-области антител, муцины, интегрины, плотно соединенные белки, трансферрин и факторы комплемента.
Термин "модифицированный" или "модификация", применительно к последовательности аминокислот полипептида, относится как к добавлению аминокислот в последовательность полипептида, так и к замещению существующих в последовательности полипептида аминокислот. Аминокислоты, подходящие для модификации полипетида, включают все известные природные аминокислоты, синтетические аминокислоты и их функционализированные производные (см., например, патенты США 7045337 и 7083970, которые включены в данное описание путем ссылки во всей своей полноте).
Термин "связывающий иммунопрепарат" относится к молекуле, которая содержит весь или часть антиген-связывающего сайта антитела, например, весь или часть вариабельного домена тяжелой и/или легкой цепи, так что связывающий иммунопрепарат специфически распознает антиген-мишень. Неограничивающие примеры связывающих иммунопрепаратов включают полные (непроцессированные) молекулы иммуноглобулинов и scFv, а также фрагменты антител, включая, но не ограничиваясь указанным, (i) Fab фрагмент, одновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и CH1; (ii) F(ab)' фрагмент, двухвалентный фрагмент, состоящий из двух Fab фрагментов, связанных с помощью дисульфидного мостика в шарнирном участке; (iii) Fab' фрагмент, который по существу представляет собой Fab с частью шарнирной области (см., Fundamental immunology (Paul ed., 3. дополненное издание. 1993); (iv) Fd фрагмент, состоящий из доменов VH и CH1; (v) Fv фрагмент, включающий в себя домены VH и VL одной цепи антитела, и (vii) нанотело, вариабельная область тяжелой цепи, содержащая один вариабельный домен и два константных домена.
Термин "антитело", как он использован в данном описании, является синонимом "иммуноглобулина". Антитела согласно изобретению могут представлять собой полные иммуноглобулины или их фрагменты, включающие по меньшей мере один вариабельный домен иммуноглобулина, такой как одноцепочечные вариабельные домены, Fv (Skerra A and Pluckthun A (1988) Science 240:1038-41), scFv (Bird R.E. et al. (1988) Science 242:423-26; Huston, J.S. et al. (1988; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-83), Fab, (Fab')2 или другие фрагменты, известные специалисту в данной области.
Термин "одноцепочечное антитело" или "scFv" относится к молекуле, включающей вариабельную область тяжелой цепи антитела (VH) и вариабельную область легкой цепи антитела (VL), связанные линкером. Такие молекулы scFv могут иметь общие структуры: NH2-VL-линкер-VH-COOH или NH2-VH-линкер-VL-COOH.
Как использовано в данном описании термин "функциональное свойство" представляет собой свойство полипептида (например, связывающего иммунопрепарата), включая, без ограничения, стабильность (например, термическую стабильность), растворимость (например, in vivo и в клеточной культуре) и связывающую способность по отношению к антигену.
Термины "специфическое связывание", "селективное связывание", "селективно связывается" и "специфически связывается" относятся к связыванию антитела с эпитопом на предварительно определенном антигене. Обычно антитело связывается с аффинностью (К73) приблизительно менее чем примерно 10-7 М, например, меньше чем примерно 10-8 М, 10-9 М или 10-10 М.
Термин "молекула нуклеиновой кислоты" относится к молекулам ДНК и молекулам РНК. Молекула нуклеиновой кислоты может быть однонитевой или двухнитевой ДНК, но предпочтительно представляет собой двухнитевую ДНК. Нуклеиновая кислота является "функционально связанной", когда она находится в функциональных взаимоотношениях с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, промотор или энхансер является функционально связанным с кодирующей последовательностью, если это оказывает влияние на транскрипцию последовательности.
Термин "вектор" относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной транспортировать другую кислоту, с которой она связана. Одним типом вектора является "плазмида, которая относится к кольцевому петельному фрагменту двухнитевой ДНК, в который могут быть лигированы дополнительные сегменты ДНК. Другим типом вектора является вирусный вектор, где дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы в вирусный геном. Некоторые векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальное происхождение репликации и эписомальные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомальные векторы млекопитающих) могут быть интегрированы в геном клетки-хозяина при введении в клетку-хозяин и поэтому реплицируются вместе с геномом хозяина.
Термин "клетка-хозяин" относится к клетке, в которую был введен вектор экспрессии. Клетки-хозяева могут включать бактериальные, микробные, растительные или животные клетки. Бактерии, которые восприимчивы к трансформации, включают представителей энтеробактерий, такие как штаммы Escherichia coli или Salmonella; Bacillaceae, такие как Bacillus subtilis, пневмококки (Pneumococcus); стрептококки (Streptococcus) и бактерии гемофильной инфекции (Haemophilis influenzae). Подходящие микробы включают Saccharomyces cerevisiae и Pichiapastoris. Подходящие животные клетки-хозяева включают СНО (линии яичника китайского хомячка) и клетки NSO.
Если не определено другого, все технические и научные термины, использованные в данном описании, имеют такие же значения, какие обычно понимаются обычным специалистом в данной области, к которой принадлежит изобретение. Хотя для практической реализации или проверки изобретения можно использовать способы и материалы, аналогичные или эквивалентные приведенным в данном описании, ниже описаны подходящие способы и материалы. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие отмеченные в описании ссылки включены в него путем ссылки во всей своей полноте. В случае конфликта настоящее описание, включая определения, будет иметь преимущественную силу. Кроме того, материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения.
Различные аспекты изобретения далее описаны подробно в следующих подразделах. Понятно, что различные варианты осуществления могут быть объединены по желанию.
Полипептидные линкеры
В одном аспекте данное изобретение относится к полипептидам, включающим два домена, где домены соединены аминокислотным линкером и где линкер содержит два цистеиновых остатка, которые способны образовывать внутрицепочечную дисульфидную связь. Такие линкеры являются особенно выигрышными, поскольку дают возможность сайт-специфического присоединения функционального фрагмента (например, ПЭГ) и/или присоединения фрагментов с аффинностью связывания к полипептиду. Линкеры по изобретению предпочтительно генетически связаны с доменом посредством генетической инженерии, более предпочтительно расположены между двумя доменами, тем самым связывая их в единый полипептид. Альтернативно, линкеры по изобретению могут быть химически связаны с доменом с использованием любых известных химических реакций для эффективного связывания аминокислот. Функциональные фрагменты могут быть соединены с линкером с помощью любых известных химических реакций. Предпочтительно, они связаны с одним или несколькими из цистеинов, присутствующих в линкере.
В некоторых вариантах осуществления аминокислотный линкер имеет общую формулу: (X)a-C-(X)b-C-(X)c, где С представляет собой цистеин; Х представляет собой любую аминокислоту, включая природные, синтетические аминокислоты и их химические производные; и a, b и с соответствуют числу аминокислот и могут представлять собой любое натуральное число. Предпочтительно, а и с являются числом между 1-25, b представляет собой число между 3 и 250. Более предпочтительно, а и с являются числом между 1-20, b представляет собой число между 3 и 100.
В одном варианте осуществления линкер включает пептидную последовательность в области образования петлевого фрагмента Xb. В указанном случае, b предпочтительно представляет собой любое число из 3-30 аминокислот, т.е. 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30. Наиболее предпочтительно b равно 7 или 12. Предпочтительно область образования петлевого фрагмента Xb не включает остаток цистеина.
В некоторых вариантах осуществления линкер включает в себя полипептидный домен, который является свернутым. В общей формуле: (X)a-C-(X)b-C-(X)c, b предпочтительно представляет собой число между 30 и 250, например, 50-200, 100-200, 25-225, 75-225, 125-225, такое как 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240 или 250. Следует понимать, что посредством этого раскрывается любое натуральное число в указанном диапазоне. Соответственно, аминокислотный линкер имеет общую формулу (X)a-C-домен-С-(X)b, где С представляет собой цистеин; Х представляет собой любую аминокислоту, включая природные, синтетические аминокислоты и их химические производные; домен представляет собой домен, как определено выше; и а, b соответствуют числу аминокислот и могут представлять собой любое натуральное число.
В некоторых вариантах осуществления аминокислотный линкер имеет общую формулу: (X)n=S-15-C-(X)n=3-5o-C-(X)n=3 представляет собой (SEQ ID No:1 в таблице 1), где С представляет собой цистеин; Х представляет собой любую аминокислоту, включая природные, синтетические аминокислоты и их химические производные и n представляет собой число аминокислот. Число аминокислотных остатков в каждой области линкера может изменяться в соответствии со структурой полипептида, к которому он присоединен, при условии, что цистеиновые остатки в линкере способны образовывать внутрицепочечную дисульфидную связь в невосстанавливающих условиях. Более того, длина и последовательность линкера могут быть такими, что линкер по существу не ухудшает одно или несколько функциональных свойств полипептида, частью которого он является. В конкретном варианте осуществления аминокислотный линкер включает последовательность аминокислот, представленную в любой из SEQ ID No: 2, 3 и 4 (см., таблица 1).
Линкеры по изобретению являются особенно хорошо подходящими для присоединения доменов VH и VL к scFv, в особенности к тем scFv, которые являются высокостабильными и растворимыми, таким как описанные в WO09/000098, содержание которого включено в данное описание путем ссылки. Последовательности аминокислот иллюстративных scFv-полипептидов, включающие линкеры по изобретению приведены в последовательностях SEQ ID No:6 и 8 (см., таблица 1).
Полипептиды
Изобретение относится к функционализированным полипептидам, в особенности терапевтическим полипептидам (например, scFv). Полипептиды по изобретению включают линкерную последовательность, которая может быть быстро и специфически функционализирована путем присоединения одного или нескольких функциональных фрагментов (например, ПЭГ) и/или фрагментов специфического связывания (например, последовательность аминокислот с определенной специфичностью связывания).
Любой полипептид может быть функционализирован с использованием способов и композиций по изобретению, включая, без ограничения, полипептиды, включающие домен иммуноглобулина (например, домен VH или VL). В конкретном варианте осуществления полипетид представляет собой связывающий иммунопрепарат (например, scFv).
В предпочтительном варианте осуществления полипептиды по настоящему изобретению имеют следующую общую формулу: домен 1-(X)a-C-(X)b-C-(X)c-домен 2, где С представляет собой цистеин; домен 1 и домен 2 представляют собой домены, как определено выше; Х представляет собой любую аминокислоту, включая природные, синтетические аминокислоты и их химические производные; и a, b и с представляют собой число аминокислот. Предпочтительно домены 1 и 2 представляют собой домены VH и VL или домены VL и VH соответственно.
Присоединение функциональных фрагментов к линкерам
Линкеры по изобретению содержат по меньшей мере два цистеиновых остатка, которые в невосстанавливающих условиях образуют внутрицепочечную дисульфидную связь (см., фиг.3). Такая дисульфидная связь дает возможность сайт-специфического присоединения функционального фрагмента (например, ПЭГ) к линкеру с использованием способов, описанных в данном описании. В частности, цистеиновые остатки в дисульфидной связи могут быть ковалентно связаны с функциональным фрагментом (например, ПЭГ). Поскольку незащищенные цистеины дают возможность намного лучше направленного пэгилирования, достигается выгодность при получении по сравнению с обычными сайтами ПЭГ-присоединения, которые часто приводят к негомогенной популяции сайтов ПЭГ-присоединения. Если используется функциональный фрагмент, содержащий монофункциональную реакционно-способную группу, функциональный фрагмент окажется связанным с одним цистеиновым остатком. Однако если используется функциональный фрагмент, содержащий специфическую в отношении дисульфидной связи бифункциональную реакционно-способную группу, функциональный фрагмент становится связанным с обоими цистеиновыми остатками внутрицепочечной дисульфидной связи. Такие бифункциональные реагенты хорошо известны в данной области и включают биссульфоны (см., например, Brocchini et al., Nature Protocols, 2006: 1(5), 241).
В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к полипептиду, включающему последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID No: 2, 3, 4, 6 и 8 (см., таблица 1), где по меньшей мере один цистеиновый остаток в линкере является ковалентно связанным с функциональным фрагментом (например, ПЭГ). В других вариантах осуществления изобретение относится к полипептиду, включающему последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID No: 2, 3, 4, 6 и 8 (см. таблицу 1), где оба цистеиновых остатка в линкере являются ковалентно связанным с одним и тем же функциональным фрагментом (например, ПЭГ) с использованием бифункциональной реакционно-способной группы (например, биссульфон).
Функционализация петельных областей
Образование внутрицепочечных дисульфидных связей между цистеиновыим остатками в линкерах по изобретению приводит к циклизации последовательности аминокислот линкера между цистеиновыми остатками с образованием петли (см. фиг.3 и 5). Такая петельная структура являются особенно выигрышной поскольку она может быть модифицирована так, чтобы включать последовательность аминокислот одного или нескольких фрагментов специфического связывания и тем самым присоединять дополнительную функциональность к полипептиду, частью которого является петельный фрагмент.
Последовательность петельного фрагмента может, например, обладать специфичностью связывания в отношении любой молекулы-мишени. Подходящие молекулы-мишени включают, без ограничения, РК-модификаторы, такие как гиалуроновая кислота, сывороточный альбумин, интегрин, Fc-области антитела, трансферрин и тому подобные. Например, связывание с сывороточным альбумином продлевает период полураспада полипептида. Связывание с FcRx улучшает транспорт полипептида в плаценту, тогда как связывание с муцином продлевает время нахождения в эпителии. В случае связывающего иммунопрепарата со специфичностью для антигена, в некоторых вариантах осуществления петельная область между VH и VL доменами может быть сконструирована таким образом, чтобы связываться с антигеном и тем самым улучшать аффинность связывающего иммунопрепарата. В другом варианте осуществления молекула-мишень представляет собой сам полипептид. Другими словами, петельная область может обеспечить функцию мультимеризации, которая вызывает построение полипептидом димеров, тримеров или мультимеров более высокого порядка. Мультимеры обладают более сильной авидностью по сравнению с мономерами. Кроме того, мультимеры дают возможность структурирования и в конечном счете последующую активацию, например, рецепторов на поверхности клетки. В другом варианте осуществления молекула-мишень представляет собой другой связывающий иммунопрепарат, имеющий комплементарную петельную область в своем линкере, т.е. петельные области двух молекул связываются друг с другом, при этом петельные фрагменты могут быть одинаковыми или разными. Это дает возможность образования биспецифического или мультиспецифических иммуносвязывающих комплексов. Биспецифические или мультиспецифические комплексы дают возможность собирать молекулы или клетки к другой клетке или молекуле, например, увеличение численности Т-клеток у раковых клеток приводит к ликвидации раковой клетки (Cancer Res, том 69, стр.4941).
Любая короткая последовательность аминокислот, обладающая специфичностью связывания с желаемой молекулой-мишенью, может быть введена в петельные области по данному изобретению. В предпочтительном варианте осуществления последовательность петельного фрагмента состоит из 5-15 аминокислот (т.е. b составляет 5-15 в общей формуле (X)a-C-(X)b-C-(X)c) и не содержит цистеинов. Подходящие последовательности аминокислот, которые могут быть введены в петельную область, включают, без ограничения, пептид, связывающий гиалуроновую кислоту (например, пептид, включающий остатки 12-23 последовательности SEQ ID No:4 в таблице 1), и интегрин-связывающий пептид (например, RGD пептид).
Новые пептиды, обладающие фрагментами специфического связывания с желаемыми молекулами-мишенями, могут быть выявлены с помощью известных в данной области способов, таких как, например, фаговое отображение, дрожжевое отображение и мРНК отображение. Такие системы отображения хорошо известны в данной области (см., например, патенты США 66258558, 6699658 и 7118879, которые включены в данное описание путем ссылки). В качестве примера, для осуществления скрининга методом фагового отображения, петельный фрагмент, образованный двумя цистеинами линкера, может быть слит с капсидным белком фага для проявления на поверхности фага (см., фиг.5 в качестве схематического рисунка). Последовательность петельного фрагмента, которая в идеале включает 5-15 аминокислот и не содержит других цистеинов, помимо тех, которые необходимы для образования петельного фрагмента, рандомизируют для получения библиотеки последовательностей петельной области для скрининга. Подходящие фаговые библиотеки являются коммерчески доступными, например, библиотека дисульфид-принужденных гептапептидов (Ph.D-C7C) от New England Biolab. Молекулы-мишени для такого фагового скрининга включают, например, РК модификаторы, такие как коллаген типа II, альбумин, области Fc антител, рецепторы Fc антител (например, FcRx), муцины, интегрины, белки плотного контакта и факторы комплемента.
Модифицированные полипептиды
Дополнительно или альтернативно полипептиды по изобретению могут быть ковалентно связаны с функциональным фрагментом (например, ПЭГ) при одном или нескольких аминокислотных остатках вне линкерной области. Можно использовать любой аминокислотный остаток, который существенно не ухудшает одно или несколько функциональных свойств полипептида, например, выставленные к поверхности остатки лизина и цистеина. При желании полипептид может быть модифицирован (путем присоединения или замещения) для введения дополнительных реакционно-способных аминокислот, походящих для связывания с функциональным фрагментом. В конкретном варианте осуществления полипептид модифицирован таким образом, чтобы он содержал по меньшей мере одну пару цистеиновых остатков и при этом по меньшей мере одна пара цистеиновых остатков образует внутрицепочечную дисульфидную связь в зрелом полипептиде. Функциональный фрагмент может быть связан с единственным реакционно-способным остатком (например, цистеином) с использованием монофункциональной реакционно-способной группы или связан с двумя дисульфидно-связанными цистеинами с использованием бифункциональной, специфической в отношении дисульфидной связи реакционно-способной группы (например, бис-сульфон).
Соответственно, в одном варианте осуществления, изобретение относится к полипептиду, включающему последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID No.5, где по меньшей мере один аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Lys40, Lys43, Lys46, Lys107, Lys176, Lys197 и Lys208, является ковалентно связанным с функциональным фрагментом (например, ПЭГ).
В другом варианте осуществления данное изобретение относится к полипептиду, включающему последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID No.5, где по меньшей мере одна пара цистеиновых остатков, выбранных из группы С24-С89 и С154-С228 является ковалентно связанной с одним и тем же функциональным фрагментом (например, ПЭГ).
В другом варианте осуществления данное изобретение относится к полипептиду, включающему последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID No.6, где по меньшей мере один остаток аминокислоты, выбранный из группы, состоящей из Cys123 и Cys136, является ковалентно связанным с функциональным фрагментом (например, ПЭГ).
В другом варианте осуществления данное изобретение относится к полипептиду, включающему последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID No.6, где пара цистеиновых остатков Cys123-Cys136 является ковалентно связанной с функциональным фрагментом (например, ПЭГ).
В другом варианте осуществления изобретение относится к полипептиду, включающему последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID No.7, где по меньшей мере один аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Lys44, Lys47, Lys105, Lys109, Lys142, Lys143, Lys149, Lys173, Lys193 и Lys195, является ковалентно связанным с функциональным фрагментом (например, ПЭГ).
В другом варианте осуществления данное изобретение относится к полипептиду, включающему последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID No.7, где пара цистеиновых остатков Cys25-Cys90 и Cys152-Cys226 является ковалентно связанной с функциональным фрагментом (например, ПЭГ).
В другом варианте осуществления изобретение относится к полипептиду, включающему последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID No.8, где по меньшей мере один аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Cys121 и Cys129 является ковалентно связанным с функциональным фрагментом (например, ПЭГ).
В другом варианте осуществления данное изобретение относится к полипептиду, включающему последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID No.8, где пара цистеиновых остатков Cys121-Cys129 является ковалентно связанной с функциональным фрагментом (например, ПЭГ).
В другом варианте осуществления данное изобретение относится к полипептиду, включающему последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID No.5, 6, 7 или 8, где полипептид модифицирован таким образом, чтобы он содержал по меньшей мере одну реакционно-способную аминокислоту (например, цистеин или лизин). Такие реакционно-способные аминокислоты могут быть ковалентно связанными с функциональным фрагментом (например, ПЭГ).
В другом варианте осуществления данное изобретение относится к полипептиду, включающему последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID No.5, 6, 7 или 8, где полипептид модифицирован таким образом, чтобы он содержал по меньшей мере одну пару цистеиновых остатков, и где по меньшей мере одна пара цистеиновых остатков способна к образованию внутрицепочечной дисульфидной связи в зрелом полипептиде. В конкретном варианте осуществления по меньшей мере одна пара цистеиновых остатков является ковалентно связанной с одним и тем же функциональным фрагментом (например, ПЭГ) посредством бифункциональной реакционно-способной группы (например, бис-сульфон).
Как известно в данной области присоединение ПЭГ улучшает некоторые характеристики биофармацевтических веществ без изменения их функции, тем самым улучшая их терапевтическое действие. К иллюстративным действия относятся (i) улучшенная фармакокинетика благодаря повышенной растворимости, улучшенной стабильности, продолжительной абсорбции и/или непрерывному биофармацевтическому действию; (ii) увеличенное время циркуляции, которое снижает терапевтически эффективное количество и/или частоту дозирования; и/или (iii) пониженная токсичность, например, вследствие улучшенного профиля безопасности, пониженной иммуногенности, сниженной антигенности и/или сниженному протеолизу.
Полипептидные композиции и препараты
Другой аспект изобретения относится к фармацевтическим препаратам композиций полипептида (например, scFv) по изобретению. Такие препараты обычно включают композицию полипептида (например, scFv) и фармацевтически приемлемый носитель. Как использовано в данном описании, "фармацевтически приемлемый носитель" включает любые и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и замедляющие поглощение агенты и тому подобные, которые являются физиологически совместимыми. Предпочтительно носитель является подходящим для, например, внутривенного, внутримышечного, подкожного, местного (например, в глаз, на кожу или слой эпидермиса) ингаляционного, парентерального, спинального или эпидермального введения (например, с помощью инъекции или вливания). В зависимости от пути введения полипептиды (например, scFv) могут быть покрыты материалом для защиты соединения от действия кислот или других природных условий, которые могут дезактивировать соединение.
Фармацевтические композиции по данному изобретению могут включать одну или несколько фармацевтически приемлемых солей. Выражение "фармацевтически приемлемая соль" относится к соли, которая сохраняет желаемую биологическую активность исходного соединения и не оказывает каких-либо нежелательных токсикологических эффектов (см., например, Berge, S. M., et al. (1977) J Pharm. Sci. 66:1-19). Примеры таких солей включают кислотно-аддитивные соли и основно-аддитивные соли. Кислотно-аддитивные соли включают те, которые получены из нетоксичных неорганических кислот, таких как хлористоводородная, азотная, ортофосфорная, серная, бромистоводородная, иодистоводородная, фосфорная и тому подобные, а также из нетоксичных органических кислот, таких как алифатические моно- и дикарбоновые кислоты, фенилзамещенные алкановые кислоты, гидроксиалкановые кислоты, ароматические кислоты, алифатические и ароматические сульфоновые кислоты и тому подобные. Основно-аддитивные соли включают производные щелочно-земельных металлов, таких как натрий, калий, магний, кальций и тому подобные, а также нетоксичных органических аминов, таких как N,N'-дибензилэтилендиамин, N-метилглюкамин, хлоропрокаин, холин, диэтаноламин, этилендиамин, прокаин и тому подобные.
Фармацевтическая композиция по изобретению также может включать фармацевтически приемлемый антиоксидант. Примеры фармацевтически приемлемых антиоксидантов включают: (1) водорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, гидрохлорид цистеина, бисульфат натрия, метабисульфит натрия, сульфит натрия и тому подобные; (2) маслорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбилпальмитат, бутилированный гидроксианизол (ВНА), бутилированный гидрокситолуол (ВНТ), лецитин, пропилгаллат, альфа-токоферол и тому подобные и (3) метал-хелатирующие агенты, такие как лимонная кислота, этилендиаминотетрауксусная кислота (ЭДТА), сорбит, винная кислота, ортофосфорная кислота и тому подобные.
Примеры подходящих водных и неводных носителей, которые могут использоваться в фармацевтических композициях по изобретению, включают воду, этанол, многоатомные спирты (такие как глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и тому подобные) и их подходящие смеси, растительные масла, такие как оливковое масло и органические сложные эфиры для инъекций, такие как этилолеат. Подходящую текучесть можно поддерживать, например, за счет использования материалов покрытий, таких как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсий или за счет использования поверхностно-активных веществ.
Данные композиции также могут содержать вспомогательные добавки, такие как консерванты, увлажняющие агенты, эмульгирующие агенты и диспергирующие агенты. Защиту от присутствия микроорганизмов можно гарантировать как с помощью методов стерилизации, (см. выше), так и путем включения в состав различных атибактериальных и противогрибковых агентов, например, парабена, хлорбутанола, фенолсорбитановой кислоты и тому подобного. Также может оказаться желательным включение в состав композиций изотонических агентов, таких как сахара, хлорид натрия и тому подобные. Кроме того, пролонгированное поглощение фармацевтической инъекционной формы можно достичь путем включения агентов, которые замедляют поглощение, таких как моностеарат алюминия и желатин.
Фармацевтически приемлемые носители включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для приготовления стерильных инъекционных растворов или дисперсий для последующего применения. Применение таких сред и агентов для фармацевтически активных веществ известно в данной области. За исключением тех случаев, когда какая-либо обычная среда или агент являются несовместимыми с активным соединением, подразумевается их применение в фармацевтических композициях по данному изобретению. В состав композиций также могут быть включены добавочные активные соединения.
Терапевтические композиции обычно должны быть стерильными и стабильными в условиях производства и хранения. Композиция может быть получена в виде раствора, микроэмульсии, липосомного препарата или другой упорядоченной структуры, подходящей для высокой концентрации лекарственного средства. Носитель может представлять собой растворитель или дисперсионную среду, содержащую, например, воду, этанол, многоатомный спирт (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и тому подобные) и их подходящие смеси. Подходящую текучесть можно поддерживать, например, за счет использования материалов покрытий, таких как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии или за счет использования поверхностно-активных веществ. Во многих случаях предпочтительным будет включение в состав композиций изотонических агентов, например, сахаров, многоатомных спиртов, таких как маннит, сорбит, или хлорида натрия. Пролонгированное поглощение инъекционных композиций можно достичь путем включения в композицию агентов, которые замедляют поглощение, например, моностеаратные соли и желатин.
Стерильные растворы для инъекций могут быть получены путем введения активного соединения в необходимом количестве в подходящий растворитель вместе с одним из или с комбинацией перечисленных выше ингредиентов, как это требуется, с последующей стерилизаций путем микрофильтрования. Обычно дисперсии получают путем введения активного соединения в стерильный носитель, который содержит базовую дисперсионную среду и требуемые другие ингредиенты из числа перечисленных выше. В случае стерильных порошков для получения стерильных инъекционных растворов, предпочтительными методами получения являются вакуумная сушка и сушка вымораживанием (лиофилизация), с помощью которых получают порошок активного ингредиента плюс любого дополнительного желательного ингредиента из предварительно стерилизованного фильтрованием их раствора.
Количество активного ингредиента, которое может быть объединено с материалом-носителем для получения единичной препаративной лекарственной формы, будет изменяться в зависимости от субъекта, подвергаемого лечению, и конкретного пути введения. Количество активного ингредиента, которое может быть объединено с материалом-носителем для получения единичной препаративной лекарственной формы, обычно будет представлять собой количество композиции, которая вызывает терапевтическое действие. Обычно из расчета на сто процентов, данное количество будет колебаться от примерно 0,01 процента до примерно девяносто девяти процентов активного ингредиента, предпочтительно примерно от 0,1 процента до примерно 70 процентов, наиболее предпочтительно примерно от 1 процента до примерно 30 процентов активного ингредиента в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем.
Режимы дозировки регулируют для обеспечения оптимальной желаемой ответной реакции (например, терапевтической ответной реакции). Например, можно ввести один болюс, можно на протяжении времени вводить несколько раздельных доз или дозировка может быть пропорционально снижена или повышена в соответствии с показаниями по необходимости для терапевтической ситуации. Особенно выгодно получать парентеральные композиции в виде единичной дозированной лекарственной формы для легкости введения и равномерности дозирования. Термин "единичная дозированная лекарственная форма", как он использован в данном описании, относится к физически дискретным единицам, подходящим в качестве единичных дозировок для субъектов, подвергаемых лечению; каждая единица содержит предварительно определенное количество активного соединения, рассчитанное для оказания желаемого терапевтического действия, в сочетании с требуемым фармацевтическим носителем. Подробное описание единичных препаративных лекарственных форм по изобретению диктуется и непосредственно зависит от (а) уникальных характеристик активного соединения и конкретного терапевтического действия, которое нужно достичь и (b) ограничений, присущих в данной области компаундированию такого активного соединения, для лечения чувствительности у индивидуумов.
Таблица 1
Линкер и последовательности scFv
SEQ ID No: Линкер Последовательность
1 Линкер SS
Figure 00000001
2 Линкер SS
Figure 00000002
3 Линкер SS
Figure 00000003
4 Линкер SS Рер 1
Figure 00000004
5 Нормальный линкер ESBA 903
Figure 00000005
6 Линкер ESBA 903 SS Рер 1
Figure 00000006
7 Нормальный линкер ESBA 105
Figure 00000007
Figure 00000008
8 Линкер ESBA 105 SS
Figure 00000009
Иллюстративные примеры
Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано с помощью следующих примеров, которые не следует рассматривать сверх того как ограничивающие. Содержание всех фигур, ссылок, патентов и опубликованных патентных заявок, процитированных в данной заявке, четко включено в данное описание путем ссылки во всей своей полноте.
В общем, при практической реализации настоящего изобретения используют, если не указано другого, общепринятые методы химии, молекулярной биологии, рекомбинантной ДНК технологии и иммунологии (в особенности, например, технологии иммуноглобулина). См., например, Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: Cols Spring Harbor Laboratory Press (1989); Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, paul, S., Humana Pr (1996); Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, ed., IrI Pr (1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al., C.S.H.L. Press, Pub (1999); Current protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons (1992). См., также Polytherics US6803438; EP1701741A2; EP1648518F2; WO05065712A2; WO05007197A2; EP1496941A1; EP1222217B1; EP1210093A4; EP1461369A2; WO03089010A1; WO03059973A2 и EP1210093A1); Genentech US20070092940A1 и EP1240337B1; и ESBATech U.S.S.N. 60/899907 и WO03097697A2.
ПЭГилирование ESBA105
Метил-РЕО12-Малеимид (Pierce), сульфгидрил-реакционно-способный ПЭГилирующий реагент использовали для модификации сульфгидрильных групп в ESBA105 (SEQ ID No:7) и ESBA105-SS-Линкер (SEQ ID No:8). Поскольку ESBA105 содержит цистеиновые остатки, атомы серы в боковых группах которых существуют попарно в виде дисульфидных связей, необходимо восстановление данных дисульфидных связей для открытия сульфгидрильных групп, которые служат мишенью для ПЭГилирования при использовании Метил-РЕО12-Малеимида. ПЭГилирование ESBA105 и ESBA105-SS-Линкера проводили так, как рекомендовано поставщиком ПЭГ (Thermo Scientific: Pierce Protein Reseach Porducts). Кратко, дисульфидные связи восстанавливали путем инкубирования приблизительно 2 мг ESBA105 в присутствии 20 мМ DTT в течение 30 минут при 4°С. Для удаления DDT восстановленный ESBA105 подвергали диализу против PBS (pH 6,5) с использованием кассет для диализа Slide-A-Lyzer (Pierce, отсекание: 7000 Да). После диализа и концентрирования 2 мг/мл белка пэгилирования путем инкубирования в присутствии 20-кратного мольного избытка метил-РЕО12-малеимида при 4°С в течение ночи. Меченные белки очищали от непрореагировавшего Метил-РЕО12-Малеимида путем диализа с использованием кассет для диализа Slide-A-Lyzer (Pierce, отсекание: 7000 Да).
Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE)
SDS-PAGE проводили в невосстанавливающих условиях с использованием коммерчески доступной системы электрофореза Bis-Tris от Invitrogen в соответствии с рекомендациями поставщика. 5 мкг образцов белка загружали на готовые 12% Bis-Tris гели. Гели окрашивали с использованием реагента кумасси (0,1% (вес./об.), Кумасси G250, 10% ледяная уксусная кислота, 50% этанол) в течение 15 минут. Удаление красителя проводили с использованием 10% (об./об.) уксусной кислоты.
Вэстерн-блоттинг для подтверждения пэгилирования
1, 10 и 100 нг ПЭГилированного ESBA105-SS-линкера загружали на готовый 12% Bis-Tris гель. Проводили блоттинг образцов на нитроцеллюлозных мембранах и фрагмент ПЭГ обнаруживали с использованием кроличьего моноклонального анти-ПЭГ антитела (Epitomics). После инкубирования с первичным антителом, мембраны инкубировали с пероксидазой хрена (HRP)-конъюгированной с козьим анти-кроличьим поликлональным антителом (Santa Cruz). Специфическое связывание антител с мембранами обнаруживали с помощью хемолюминесцентной системы детектирования (Pierce).
Прямой анализ ELISA для подтверждения связывания пэгилированного ESBA105 с TNF-альфа человека
Связывание ESBA105 и его производных оценивали с помощью прямого анализа ELISA. TNF-альфа человека (PeproTech EC Ltd) наносили на 96-луночные планшеты для микротитрования и затем блокировали с использованием БСА (бычий сывороточный альбумин). ESBA105 и его производные тестировали в концентрациях 50 нМ, 12,5 нМ, 3,13 нМ, 1,56 нМ, 0,78 нМ, 0,39 нМ, 0,20 нМ, 0,10 нМ и 0,05 нМ. Связывание ESBA105 и его производных с TNF-альфа человека визуализировали путем последовательного добавления биотинилированного кроличьего поликлонального анти-ESBA105 антитела (АК3А, генерированное на ESBATech), стрептавидина Poly HRP и хромогенного субстрата (POD). Продукт данной реакции обнаруживали путем измерения оптической плотности (ОП) при 450 нМ с использованием спектрофотометра. Данные анализировали с использованием 4-параметровой логистической подгонки кривой и значения ЕС50 рассчитывали из кривых доза-ответная реакция для scFv.
Анализ ESBA903 и ESBA903 с Pepl в линкере методом поверхностного плазмонного резонанса
Для измерения аффинности связывания использовали измерения поверхностного плазмонного резонанса на приборе BIAcoreTM-T100. В экспериментах применяли очищенный экспрессированный Escherichia coli рекомбинантный VEGF165 человека (PeproTech EC Ltd). Карбоксиметилированные декстрановые биосенсорные чипы (CM4, GE Healthcare) активировали гидрохлоридом N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)карбодиимида и N-гидроксисукцинимидом в соответствии с инструкциями производителя. VEGF165 человека конденсировали с 1 из 4 различных проточных кювет на сенсорном чипе СМ4 с использованием стандартного способа связывания амина. Диапазон полученных ответных реакций для иммобилизованной молекулы hVEGF165 после конденсации и блокирования составлял приблизительно 120-140 единиц ответа (ЕО). 4-ю проточную кювету каждого кристалла обрабатывали аналогично за исключением того, что белки не были иммобилизованы на ней перед блокированием, и проточная кювета была использована в качестве поточной ссылочной кюветы. В проточные кюветы инжектировали различные концентрации анти-VEGF scFv (20 нМ, 10 нМ, 5 нМ, 2,5 нМ, 1,25 нМ, 0,63 нМ, 0,31 нМ и 0,16 нМ) в буфере HBS-EP (0,01 V HEPES, pH 7,4, 0,15 V NaCl, 3 vV EDTA, 0,005% поверхностно-активного вещества Р20) при скорости потока 30 мкМ/мин в течение 5 минут. Диссоциации анти-VEGF scFv от VEGF на чипе СМ4 давали возможность протекать в течение 10 минут при 25°С. Сенсограммы генерировали для каждого образца анти-VEGF scFv после коррекции с поточной ссылочной кюветой с последующим вычитанием данных для образца буфера. Наблюдаемую константу скорости диссоциации (ki), наблюдаемую константу скорости ассоциации (ka) и наблюдаемую константу равновесия диссоциации (KD) рассчитывали с использование один-к-одному модели связывания Лангмюра с использованием программного обеспечения для оценки BIAcore T100 версия 1.1.
Клонирование и экспрессия scFv
Описанные и охарактеризованные в данном описании scFv были получены следующим образом. В некоторых случаях последовательности ДНК, кодирующие различные scFv, были вновь синтезированы сервисной службой Entelechon GmbH (www.entelechon.com). Полученные ДНК-вставки были клонированы в бактериальный вектор экспрессии pGMP002 через Ncol и HindIII сайты рестрикции, введенные в 5' и 3' концы последовательности ДНК scFv, соответственно. В некоторых случаях модифицированные линкеры вводили общепринятыми в данной области методами в качестве аннелированных комплементарных олигомеров, которые кодируют соответствующие молекулы аминокислот, путем их клонирования в подходящие сайты рестрикции между доменами VH и VL. В других случаях точечные мутации вводили в VH и/или VL домены с использованием известных в данной области методов ПЦР сборки. Клонирование pGMP002 описано в примере 1 WO2008006235. Продуцирование scFv осуществляли, как описано для ESBA105 в примере 1 WO08/006235, включенном в данное описание путем ссылки.
Пример 1
Пэгилирование ESBA105 и ESBA105-SS-линкера
ESBA105 (SEQ ID No:7) представляет собой одноцепочечное антитело, которое специфически связывается и ингибирует TNF-альфа человека (см., например, WO 06/131013, включенное в данное описание путем ссылки). ESBA105-SS-линкер (SEQ ID No:8) представляет собой вариант ESBA105, в котором линкер был заменен на SS-линкер (SEQ ID No:3).
ESBA105, ESBA105 восстановленный с помощью DDT, ESBA105 восстановленный и подвергнутый пэгилированию цистеина и ESBA105 восстановленный и подвергнутый пэгилированию цистеина с последующим диализом были проанализированы методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE). При пэгилировании исследуемого белка ожидаемое увеличение молекулярной массы составляло приблизительно 4 кДа. "ESBA105 восстановленный" и "ESBA105 восстановленный cys-пэгилированный" перемещались в несколько более высокое положение по сравнению с ESBA105. При диализе cys-пэгилированного ESBA105 белок перемешался в то же положение, что и ESBA105, позволяя предположить, что сдвиг белка был связан не с пэгилированием, а являлся следствием восстановления дисульфидных связей, которые опять образовывались при окислении сульфгидрильных групп во время диализа. Эти данные указывают, что восстановленные внутримолекулярные цистеины (SH) в ESBA105 обладают низкой доступностью для ПЭГ-NHS. В противоположность сульфгидрильным группам внутримолекулярных цистеинов в ESBA105 первичные амины (остатки лизина на N-концах) доступны для ПЭГ-NHS, как показано на полосе 6 и 7 на фиг.1.
Активность обработанных разным образом препаратов ESBA105, как описано выше, была оценена в экспериментах ELISA. Анализ ELISA, представленный на фиг.2, показал, что восстановленный ESBA105 является таким же активным, что и окисленный ESBA105. Cys-пэгилированный ESBA105 демонстрирует лишь незначительную потерю активности связывания по сравнению с ESBA105. Однако, как показано на фиг.1, степень пэгилирования внутрицепочечных дисульфидов в ESBA105 является низкой. Lys-пэгилирование было успешным при лишь минимальной потере активности связывания по отношению к TNF-альфа человека.
Одна из целей настоящего изобретения заключалась в разработке антител scFv, которые поддаются пэгилированию. На первой стадии было исследовано, является ли непэгилированная молекула ESBA105-SS-линкер все еще активной по сравнению с ESBA105. После того, как этот было подтверждено с помощью анализа ELISA, как оказано на фиг.4, ESBA105-SS-линкер подвергали cys-пэгилированию. Для тестирования успешности проведения cys-пэгилирования ESBA105-SS-линкер и cys-пэгилированный ESBA105-SS-линкер, подвергнутые диализу, анализировали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (см. фиг.4В). ПЭГилированный ESBA105-SS-линкер перемещается в более высокое положение по сравнению с ESBA105-SS-линкером, указывая на успешное ПЭГилирование ESBA105-SS-линкера. ПЭГилирование ESBA105-SS-линкера было подтверждено с помощью вэстерн-блоттинга с использованием кроличьего анти-ПЭГ моноклонального антитела (см. фиг.4с). Сигнал ожидаемого размера был обнаружен с использованием 100 нг/мл пэгилированного ESBA105-SS-линкера. Кроме того, анализ ELISA, как показано на фиг.6, подтверждает, что cys-пэгилированный ESBA105-SS-линкер является почти полностью таким же активным при сравнении с лишенным поверхностных оболочек ESBA105.
Обычное cys-пэгилирование ESBA105-SS-линкера с использованием ПЭГ с моноспецифической реакционно-способной группой показано схематически на фиг.3 (в середине). Альтернативный способ cys-пэгилирования также показан на фиг.3 (справа). В данном последнем способе используется ПЭГ, присоединенный к бифункциональной реакционно-способной группе (схематически представленной как горизонтальное "Т", имеющее ПЭГ-молекулу на своем левом конце), что позволяет связывать молекулу ПЭГ с обоими цистеиновыми остатками дисульфидной связи белка. Такая линкерная технология описана Shaunak et al., Nature Chemical Biology, 2006, том 2, стр.312; Brocchini et al., Nature Protocols, 2006: 1(5), 241 и WO05/007197.
Пример 2
Введение активности связывания в SS-линкер
Второе применение настоящего изобретения заключается в введении дополнительного фрагмента со специфическим связыванием в полипептиды (например, scFv). В данном примере пептид Рер-1, который, как было установлено, связывался с гилауроновой кислотой при отборе методом фагового отображения (Mmumer et al., J.Exp.Med. 2000, том 192, стр.769), вводили в петельную область линкера SS, получая линкер SS Pepl (SEQ ID No:4). Линкер SS Pepl вводили в scFv ESBA903, получая ESBA903- SS Pepl линкер (иногда также упоминаемый как ESBA903-Pepl; SEQ ID NO:6). Как показывают результаты, полученные методом поверхностного плазмонного резонанса, показанные на фиг.7, ESBA903-Pepl, имеющий Pepl 12mer пептид в своем петельном фрагменте, связывается равным образом хорошо со своей мишенью (VEGF), что и немодифицированный ESBA903 (SEQ ID NO:5) и соответственно все еще является полностью функциональным (измеренные значения Kd составляли 4,436Е-11М и 5,608Е-11М, соответственно). ESBA903-Pepl был разработан для увеличения продолжительности локального периода полураспада по сравнению с не имеющим поверхностных оболочек ESBA903 при нанесении на место, где присутствует гиалуроновая кислота, например такое, как стекловидное тело сустава.
Эквиваленты
Специалистам в данной области будет понятны, или они будут способны выявить с использованием не более чем рутинных экспериментов многие эквиваленты конкретных вариантов осуществления описанного здесь изобретения. Подразумевается, что формула изобретения охватывает такие эквиваленты.

Claims (2)

1. Применение аминокислотного линкера для связывания VH и VL доменов scFv, где линкер включает два цистеина, способных к образованию внутрицепочечной дисульфидной связи, и где аминокислоты между цистеинами в последовательности линкера образуют петлевой фрагмент, когда два цистеина связаны друг с другом дисульфидной связью; при этом scFv имеет последовательность SEQ ID No. 8.
2. Одноцепочечное антитело (scFv), связывающееся с TNFα, содержащее домен VH и домен VL, связанные линкером; где линкер включает два цистеина, способных к образованию внутрицепочечной дисульфидной связи, и где аминокислоты между цистеинами в последовательности линкера образуют петлевой фрагмент, когда два цистеина связаны друг с другом дисульфидной связью; и при этом scFv имеет последовательность SEQ ID No. 8.
RU2011103168/10A 2008-06-30 2009-06-30 Функционализированные полипептиды RU2582244C2 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US7677508P 2008-06-30 2008-06-30
US61/076,775 2008-06-30
PCT/CH2009/000225 WO2010006454A2 (en) 2008-06-30 2009-06-30 Functionalized polypeptides

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2016108598A Division RU2016108598A (ru) 2008-06-30 2009-06-30 Функционализированные полипептиды

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2011103168A RU2011103168A (ru) 2012-08-10
RU2582244C2 true RU2582244C2 (ru) 2016-04-20

Family

ID=41139486

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2011103168/10A RU2582244C2 (ru) 2008-06-30 2009-06-30 Функционализированные полипептиды
RU2016108598A RU2016108598A (ru) 2008-06-30 2009-06-30 Функционализированные полипептиды

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2016108598A RU2016108598A (ru) 2008-06-30 2009-06-30 Функционализированные полипептиды

Country Status (12)

Country Link
US (3) US8637022B2 (ru)
EP (2) EP2304033B1 (ru)
JP (3) JP5988580B2 (ru)
KR (2) KR101678925B1 (ru)
CN (2) CN102089431A (ru)
AU (1) AU2009270405B2 (ru)
BR (1) BRPI0915343A2 (ru)
CA (1) CA2729185A1 (ru)
MX (2) MX344076B (ru)
RU (2) RU2582244C2 (ru)
WO (1) WO2010006454A2 (ru)
ZA (1) ZA201008596B (ru)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20110031373A (ko) 2008-07-10 2011-03-25 에스바테크, 언 알콘 바이오메디칼 리서치 유닛 엘엘씨 마크로분자 전달을 증강하는 방법 및 조성물
US20100056766A1 (en) * 2008-08-27 2010-03-04 Abbott Laboratories Purification of biological conjugates by size exclusion chromatography
AR083495A1 (es) 2010-10-22 2013-02-27 Esbatech Alcon Biomed Res Unit Anticuerpos estables y solubles
CN109608543A (zh) 2011-10-20 2019-04-12 艾斯巴技术-诺华有限责任公司 稳定的多抗原结合抗体
EP3122777B1 (en) 2014-03-26 2020-12-23 Cell Medica Switzerland AG Binding members to tnf alpha
TWI806150B (zh) 2014-11-07 2023-06-21 瑞士商諾華公司 穩定的含有高濃度抗vegf抗體之蛋白質溶液調配物
KR20220062494A (ko) * 2019-08-15 2022-05-17 얀센 바이오테크 인코포레이티드 개선된 단일 사슬 가변 단편을 위한 재료 및 방법

Family Cites Families (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB9225453D0 (en) * 1992-12-04 1993-01-27 Medical Res Council Binding proteins
US6699658B1 (en) 1996-05-31 2004-03-02 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Yeast cell surface display of proteins and uses thereof
WO1998031700A1 (en) 1997-01-21 1998-07-23 The General Hospital Corporation Selection of proteins using rna-protein fusions
US20050159343A1 (en) * 1999-03-26 2005-07-21 Board Of Regents, University Of Texas System Inhibitors of glycosaminoglycans
DK1165112T3 (da) 1999-03-26 2006-10-09 Univ Texas Modulatorer af polysaccharider og anvendelser deraf
AU7346400A (en) 1999-09-03 2001-04-10 School Of Pharmacy, University Of London, The Degradable polymers
EP1222217B1 (en) 1999-09-08 2005-06-15 Polytherics Limited Uniform molecular weight polymers
US20050287153A1 (en) * 2002-06-28 2005-12-29 Genentech, Inc. Serum albumin binding peptides for tumor targeting
CA2390691C (en) 1999-12-24 2016-05-10 Genentech, Inc. Methods and compositions for prolonging elimination half-times of bioactive compounds
CA2406593A1 (en) * 2000-04-20 2001-11-01 Cangene Corporation Rhamm peptide conjugates
US7211395B2 (en) * 2001-03-09 2007-05-01 Dyax Corp. Serum albumin binding moieties
CA2444098C (en) * 2001-04-19 2016-06-21 The Scripps Research Institute Methods and composition for the production of orthogonal trna-aminoacyltrna synthetase pairs
GB0131112D0 (en) 2001-12-31 2002-02-13 Univ London Pharmacy Block copolymers
GB0209022D0 (en) 2002-04-19 2002-05-29 Imp College Innovations Ltd Compounds
DK1506236T3 (da) * 2002-05-22 2013-03-04 Esbatech A Novartis Co Llc Immunglobulin-frameworks, der udviser forbedret stabilitet i det intracellulære miljø og fremgangsmåder til identifikation deraf
AU2003301122B2 (en) 2002-12-19 2009-11-26 Nektar Therapeutics Cyanovirin variant-polymer conjugates
US7834258B2 (en) * 2003-06-30 2010-11-16 Mu-Hyeon Choe Dimer of chimeric recombinant binding domain-functional group fusion formed via disulfide-bond-bridge and the processes for producing the same
GB0316294D0 (en) 2003-07-11 2003-08-13 Polytherics Ltd Conjugated biological molecules and their preparation
GB0400264D0 (en) 2004-01-07 2004-02-11 Polytherics Ltd Complexes
EP1769000B1 (en) * 2004-07-16 2014-12-24 Amgen Research (Munich) GmbH Expression-enhanced polypeptides
NZ553500A (en) * 2004-09-23 2009-11-27 Genentech Inc Genentech Inc Cysteine engineered antibodies and conjugates withCysteine engineered antibodies and conjugates with a free cysteine amino acid in the heavy chain a free cysteine amino acid in the heavy chain
CA2580796C (en) * 2004-09-24 2013-03-26 Amgen Inc. Modified fc molecules having peptides inserted in internal loop regions
US20060147862A1 (en) * 2005-01-06 2006-07-06 Jeffrey Bell Reduced smoking wick and candle
US7723472B2 (en) * 2005-02-28 2010-05-25 The Regents Of The University Of California Extracellular matrix binding chimeric proteins and methods of use thereof
KR101457223B1 (ko) 2005-06-07 2014-11-04 에스바테크 - 어 노바티스 컴파니 엘엘씨 ＴＮＦα를 억제하는 안정적이고 가용성인 항체
JP2009509535A (ja) * 2005-09-27 2009-03-12 アムニクス， インコーポレイテッド タンパク様薬剤およびその使用
KR101571027B1 (ko) * 2006-06-12 2015-11-23 이머전트 프로덕트 디벨롭먼트 시애틀, 엘엘씨 효과기 기능을 갖는 단일쇄 다가 결합 단백질
RU2438708C2 (ru) 2006-07-10 2012-01-10 Эсбатек, Эн Элкон Биомедикал Рисёрч Юнит Ллк ScFv-АНТИТЕЛА, КОТОРЫЕ ПРОХОДЯТ ЧЕРЕЗ ЭПИТЕЛИАЛЬНЫЙ И/ИЛИ ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫЙ СЛОИ
RU2010102064A (ru) 2007-06-25 2011-07-27 Эсбатек, Эн Элкон Биомедикал Рисёрч Юнит Ллк (Ch) Способ конструирования, основанный на определении последовательностей, способ оптимизации одноцепочечных антител
MX2009013328A (es) * 2007-06-25 2010-06-02 Esbatech An Alcon Biomedical R Metodos para modificar anticuerpos, y anticuerpos modificados con propiedades funcionales mejoradas.
EP3216803B1 (en) * 2008-06-25 2020-03-11 Novartis Ag Stable and soluble antibodies inhibiting vegf

Also Published As

Publication number Publication date
WO2010006454A2 (en) 2010-01-21
WO2010006454A3 (en) 2010-03-25
ZA201008596B (en) 2012-02-29
AU2009270405A1 (en) 2010-01-21
CN102089431A (zh) 2011-06-08
US8637022B2 (en) 2014-01-28
US9371525B2 (en) 2016-06-21
JP2016147909A (ja) 2016-08-18
BRPI0915343A2 (pt) 2015-10-27
RU2016108598A (ru) 2018-11-23
JP5988580B2 (ja) 2016-09-07
MX2011000006A (es) 2011-08-03
EP3130603A1 (en) 2017-02-15
RU2011103168A (ru) 2012-08-10
JP2011526145A (ja) 2011-10-06
KR20160046927A (ko) 2016-04-29
EP2304033B1 (en) 2016-09-07
CA2729185A1 (en) 2010-01-21
MX344076B (es) 2016-12-05
KR101678925B1 (ko) 2016-11-24
KR101711472B1 (ko) 2017-03-02
US20160354479A1 (en) 2016-12-08
CN105153300A (zh) 2015-12-16
EP2304033A2 (en) 2011-04-06
AU2009270405B2 (en) 2014-06-05
JP2014111670A (ja) 2014-06-19
US20110200594A1 (en) 2011-08-18
KR20110039274A (ko) 2011-04-15
US20140178386A1 (en) 2014-06-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2582244C2 (ru) Функционализированные полипептиды
JP6038248B2 (ja) プロリン／アラニンランダムコイルポリペプチドの生合成およびその使用
US8426357B2 (en) Multimeric conjugate
CN105979971B (zh) 抗体-药物缀合物和免疫毒素
EP3564258B1 (en) Fibronectin based scaffold domain proteins that bind to myostatin
US9867886B2 (en) Complex in which anti-cotinine antibody is bound to conjugate of cotinine and binding substance, and use thereof
WO2013192546A1 (en) Activatable antibodies having non-binding steric moieties and mehtods of using the same
Braun et al. Bioresponsive release of insulin-like growth factor-I from its PEGylated conjugate
KR20160138133A (ko) 안정화된 피브로넥틴 기반 스캐폴드 분자
US20220288223A1 (en) Activatable specific binding member complexes, and methods of making and using same
JP6484607B2 (ja) アフィニティー樹脂を使用するａｄｃの合成方法
CN112135843A (zh) 抗sez6抗体药物缀合物和使用方法
NL2026400B1 (en) Methods for the preparation of bioconjugates
AU2014215955B2 (en) Functionalized polypeptides
AU2016253633A1 (en) Functionalized polypeptides
Gong Releasable and Traceless PEGylation of Arginine Residues

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20180701