MX2011000006A - Polipeptidos funcionalizados. - Google Patents

Polipeptidos funcionalizados.

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Abstract

La invención proporciona polipéptidos funcionalizados, especialmente polipéptidos terapéuticos (por ejemplo, scFv), que comprenden una secuencia enlazadora que puede funcionalizarse rápida y específicamente mediante la adición de una o de porciones funcionales (por ejemplo, PEG) o especificidades de unión (por ejemplo, una secuencia de aminoácidos con una especificidad de unión particular). Tales polipéptidos funcionalizados son ventajosos porque tienen propiedades farmacocinéticas mejoradas (por ejemplo, vida media in vivo mejorada, penetración de tejido y tiempo de residencia de tejido) sobre polipéptidos no funcionalizados. También se proporcionan métodos para la generación rápida y reproducible de polipéptidos funcionalizados.

Description

POLIPEPTIDOS FÜNCIONALIZADOS SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama la prioridad para la Solicitud Provisional Estadounidense No. de Serie 61/076,775, intitulada "Methods And Compositions For Modifying Immunobinders" , presentada el 30 de junio del 2008, los contenidos de la cual se incorporan en la presente para referencia en sus totalidades.
INFORMACIÓN BÁSICA La eficiencia de polipéptidos terapéuticos se limita a menudo en gran medida por sus propiedades f rmacocinéticas intrínsecas. Por ejemplo, en el caso de anticuerpos terapéuticos, se reportan frecuentemente problemas con la penetración de tejido, residencia de tejido y vida media en suero. Las mejoras en las propiedades farmacocinéticas de un polipéptido terapéutico pueden resultar en una eficacia mejorada y regímenes de dosificación reducidos. Métodos actuales para modular las propiedades farmacocinéticas de polipéptidos terapéuticos se limitan típicamente para abordar el problema de vida media en suero. Además, estos métodos implican típicamente el tiempo que se consume o la alteración química no específica de polipéptidos existentes.
Por consiguiente, existe una necesidad en la técnica para métodos mejorados para modular las propiedades farmacéuticas de polipéptidos terapéuticos que proporcionan un medio rápido y específico de modificación de aminoácidos, y que aborde parámetros farmacocinéticos adicionales a la vida media.
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La invención proporciona polipéptidos funcionalizados , especialmente polipéptidos terapéuticos (por ejemplo, scFv) . Los polipéptidos de la invención comprenden una secuencia enlazadora que puede funcionalizarse rápida y específicamente por la adición de una o más porciones funcionales (por ejemplo, PEG) y/o especificidades de unión (por ejemplo, una secuencia de aminoácidos con una especificidad de unión particular) . Tales polipéptidos funcionalizados son ventajosos en que tienen propiedades f rmacocinéticas mejoradas (por ejemplo, vida media in vivo mejorada, penetración de tejido y tiempo de residencia de tejido) sobre polipéptidos no funcionalizados . Se proporcionan también métodos para la generación rápida y reproducible de polipéptidos funcionalizados .
Por consiguiente, en un aspecto, la invención proporciona un polipéptido, tal como un inmuno-aglutinante (por ejemplo, un scFv) , que comprende dos dominios conectados por un enlazador de aminoácidos. El enlazador comprende especialmente dos cisteínas capaces de formar una unión disulfuro de intra-cadena, y los aminoácidos en la secuencia enlazadora entre estas dos cisteínas forman un bucle cuando las dos cisteínas son disulfuro unidas entre sí. En una modalidad particular, el enlazador comprende la secuencia establecida en la SEC. de IDENT. No: 1 ó 2.
En ciertas modalidades, el enlazador contiene un bucle que se une a una molécula objetivo tal como un modificador PK (por ejemplo, ácido hialurónico, y albúmina de suero) . Al unirse a la molécula objetivo, la vida media en suero y/o la eficacia de penetración en tejidos y/o la especificidad particular de unión del enlazador que comprende polipéptido se mejora. En una modalidad particular, el enlazador comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEC. de IDENT. NO. 3 ó 4. En una modalidad preferida, el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEC. de IDENT. No. 6 u 8.
En ciertas modalidades, por lo menos un residuo de cisteína en el enlazador se enlaza covalentemente a una porción funcional. En una modalidad particular, dos residuos de cisteína en el enlazador se enlazan covalentemente a la misma porción funcional. Porciones funcionales adecuadas incluyen, por ejemplo, PEG, moléculas de carbohidrato y almidón de hidroxietilo (HES) . En la conexión covalente de üna porción funcional tal como PEG o HES a un polipéptido, la vida media de tal polipéptido dentro de un sujeto se prolonga .
En otro aspecto, la invención proporciona composiciones que comprenden uno o más polipéptidos de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable.
En otros aspectos, la invención proporciona moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, vectores) que codifican los polipéptidos de la invención, y células huéspedes que contienen tales moléculas de ácido nucleico.
En otro aspecto, la invención proporciona métodos que producen un polipéptido funcionalizado . Tales métodos generalmente implican proporcionar una biblioteca de secuencias peptídicas, identificando a partir de la biblioteca por lo menos una secuencia peptídica que se une a una molécula objetivo, y modificando la región de bucle de un polipéptido que contiene un enlazador que comprende por lo menos una secuencia peptídica identificada. Las secuencias peptídicas deseadas pueden identificarse mediante cualesquier medios reconocidos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, despliegue de fago, despliegue de levadura o despliegue de ARNm.
DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS , La Figura 1 describe un SDS page de moléculas ÉSBA105 diversamente tratadas (líneas 3-10). Línea 1: Marcador; línea 2: no específica; línea 3: reducida con DTT; línea 4: reducida y dializada; línea 5: reducida, cisterna-PEGilada; línea 6; cisteína-PEGilada, dializada; línea 7; Control; línea 8: Lisina-PEGilada; línea 9: Laisina-PEGilada, dializada; línea: 10 control. El tamaño molecular de PEG fue de aproximadamente 0.7 kDa/PEG.
La Figura 2 muestra análisis de ELISA de la actividad de unión TNFalfa de (A) cisteína-PEGilada ESBA105 y (B) lisina-PEGilada ESBA105. A: El EC50 para ESBA105 fue 0.9833; para ESBA105 reducida: 1.291; y para Cys pegilada ESBA105: 1.164. R2 para ESBA105 fue 0.9814;' para ESBA105 reducida: 0.9891; Cys pegilada ESBA105 : 0.9857. B: El EC50 para ESBA105 fue 0.8073 y para Lys pegilada ESBA105: 1.326. R2 para ESBA105 fue 0.9870 y para ESBA105 pegilada 0.9640.
La Figura 3 muestra (a) una representación esquemática de un enlazador ESBA105-SS oxidado, no modificado, (b) enlazador ESBA105-SS de PEGilación (ESBA105- S2-PEG2) utilizando un reactivo 1 de PEGilación monofuncional , y (c) el enlazador ESBA105-SS PEGilado (ESBA105-S2-PEG) utilizando un reactivo 2 de PEGilación bifuncional.
La Figura 4 muestra: (A) análisis de ELISA de la actividad de unión TNFalfa de ESBA105 y ESBA105-SS-enlazador ; (B) un gel SDS-PAGE de ESBA105 sometido a varios tratamientos; y, (C) una técnica de transferencia Western evaluando el grado de PEGilación de ESBA105 y ESBA105-SS-enlazador utilizando un anticuerpo anti-PEG de conejo. La Figura 4 (B) : línea 1: enlazador ESBA105 SS reducido . + dializado + sobre-concentrado; línea 2: enlazador ESBA105 SS reducido + dializado; línea 3: enlazador ESBA105 SS reducido + pegilado; línea 4: enlazador ESBA105 SS reducido + pegilado + dializado; línea 5: enlazador ESBA105 SS .
La Figura 5 muestra una representación esquemática que ilustra la presentación del bucle peptídico de una molécula 1 scFv en la superficie del bacteriófago 2 para los propósitos de despliegue de fago (la molécula scFv y el fago no están en escala) . En el caso descrito, el bucle comprende 7 aminoácidos los cuales pueden interactuar con una molécula 3 objetivo tal como albúmina de suero (prolongación de vida media) , FcRx (transporte de placenta) , mucina (prolongación de tiempo de residencia epitelial) , Integrina (péptidos RGD) , Complemento, proteínas de unión Estrecha, Multimerización, etc .
La Figura 6 muestra un análisis de ELISA de la actividad de unión TNFalfa de ESBA105 y el enlazador ESBA105-SS de cisteína-PEGilado. La EC50 para ESBA105 fue 0.9980; y para ESBA105 con el enlazador pegilado SS; 1.181. R2 fue para ESBA105 0.9397; y para ESBA105 con el enlazador pegilado SS; 0.9851. · La Figura 7a muestra las cinéticas de unión VEGF de ESBA903. Ajuste: unión: 1:1; ka (I/Ms) : 7.68E+5; kd (1/s); 4.310E-5; KD (M) : 5.608E-I 1. La Figura 7b muestra las cinéticas de unión de ESBA903 -Pepl . Ajuste: unión: 1:1; ka (I/Ms) : 1.133E+6; kd (l/s) : 5.026E-5. Para ambos, 7a y 7b, -5 los valores del eje X se dan en segundos, los valores del eje Y se dan en unidades de resonancia (RU) .
DESCRIPCIÓN DETALLADA Definiciones 0 El término "dominio" con respecto al polipéptido, toma su significado reconocido en la técnica y se refiere a una unidad discreta de estructura terciaria. Ejemplos de dominios incluyen, sin limitación, anticuerpo VH o dominios VL, dominios de fibronectina y dominios de repetición de 15 anquirina.
El término "enlazador" se refiere a una secuencia de aminoácidos lineal que enlaza dos dominios. Los enlazadores de la invención pueden fusionarse genética y/o químicamente a un dominio. En ciertas modalidades, los 20 enlazadores contienen un bucle.
El término "bucle" se refiere a una secuencia de , ·; aminoácidos cíclica formada por una unión de disulfuro de intra-cadena dentro de un enlazador. 25 El término "polietilenglicol" o "PEG" se refiere a un poliéter neutro lineal o ramificado con la fórmula química H0- (CH2CH20)m-H, y derivados reactivos de la misma. Los derivados de PEG reactivos son bien conocidos en la técnica e incluyen, sin limitación, PEG acoplado con metil-PE012-maleimida, carbonato de N-hidroxisuccinimidilo, propionato de N-hidroxisuccinimidilo , carbonato de p-nitrofenilo , carbonato de benzotriazol y un aldehido. En una modalidad particular, el derivado de PEG amino reactivo es un PEG acoplado con bis-sulfona capaz de reaccionar específicamente con uniones disulfuro (véase por ejemplo, Brocchini et al, Nature Protocols, 2006; 1(5), 241). Las moléculas de PEG adecuadas son de un tamaño molecular entre 0.5 kDa y 50 kDa.
El término "molécula objetivo" se refiere a cualquier molécula específicamente unida por la región de bucle de un polipéptido de la invención. Las moléculas objetivo, incluyen, por ejemplo, azúcares, proteínas y lípidos .
El término "porción funcional" se refiere a una entidad biológica o química que imparte funcionalidad adicional a una molécula a la cual se une (por ejemplo, una molécula de PEG, una o más moléculas de carbohidrato o almidón de hidroxietilo (HES) ) .
El término "modificador de PK" se refiere a cualquier molécula que altera el perfil farmacocinético de una proteína cuando se une a esa proteína. Un modificador de PK es típicamente, aunque no necesariamente, una molécula endógena, de origen natural, presente en un sujeto (por ejemplo, un paciente) . La localización y abundancia de tal modificador de PK dentro de un sujeto puede ser fisiológica o patológica (por ejemplo, sobre-expresarse en la superficie de las células cancerígenas, o en un sitio inflamado) . Los modificadores de PK adecuados incluyen, por ejemplo, ácido hialurónico, colágeno tipo II, albúmina de suero, receptores de anticuerpos Fe (por ejemplo, FcRx) , regiones de anticuerpo Fe, mucinas, integrinas, proteínas de unión estrecha, transferrina y factores de complemento.
El término "modificado" o "que modifica" , con respecto a la secuencia de aminoácidos de un polipéptido, se refiere tanto a la adición de aminoácidos en la secuencia de polipéptidos como a la sustitución de aminoácidos existentes en la secuencia de polipéptidos. Los aminoácidos adecuados para modificar un polipéptido incluyen todos los aminoácidos naturales conocidos, aminoácidos no naturales y derivados funcionalizados de los mismos (véase, por ejemplo, las Patentes Estadounidenses 7,045,337 y 7,083,070 las cuales se incorporan en la presente para referencia en sus totalidades) .
El término "inmuno-aglutinante" se refiere a' una molécula que contiene todo o una parte del sitio de unión de antígenos de un anticuerpo, por ejemplo, todo o parte del dominio de variable de cadena pesada y/o ligera, de manera que el inmuno-aglutinante reconoce específicamente un antígeno objetivo. Ejemplos no limitantes de inmuno-aglutinantes incluyen moléculas de inmunoglobulina de longitud total y scFvs, así como fragmentos de anticuerpos, incluyendo aunque sin limitarse a (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste de dominios VL, VH, CL y CHI ; (ü) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados mediante un puente disulfuro en la región de bisagra: (iii) fragmento de Fab, el cual es esencialmente un Fab con parte de la región de bisagra, (véase, Fundamental Immunology (Paul ed. , 3.sup.rd.ed. 1993) ; (iv) un fragmento Fd que consiste de los dominios VH y CHI ; (v) un fragmento Fv que consiste de los dominios VL y VH de un brazo sencillo de un anticuerpo; y (vi i) un nanocuerpo, una región variable de cadena pesada que contiene un dominio variable sencillo y dos dominios constantes .
El término "anticuerpo" como se utiliza en la presente es un sinónimo para "inmunoglobulina" . Los anticuerpos de acuerdo con la presente invención pueden ser inmunoglobulinas completas o fragmentos de las mismas, que comprenden por lo menos un dominio variable de una inmunoglobulina, tal como dominios variables sencillos, Fv (Skerra A. and Pluckthun, A. (1988) Science 240:1038-41), scFv (Bird, R.E. et al. (1988) Science 242:423:26; Huston, J.S. et al. (1988) Proc . Nati . Acad. Sci. USA 85:5879-83), Fab, (Fab')2 u otros fragmentos bien conocidos por una persona experta en la técnica.
El término "anticuerpo de cadena sencilla" o "scFv" se refiere a una molécula que comprende una región variable de cadena pesada de anticuerpo (VH) y una región variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) conectada mediante un enlazador. Tales moléculas de scFV pueden tener las estructuras generales: NH2-VL-enlazador-VH-COOH o NH2-VH-enlazador-VL-COOH.
Como se utiliza en la presente, el término "propiedad funcional" es una propiedad de un polipéptido (por ejemplo, un inmuno-aglutinante) incluye, sin limitación, la estabilidad (por ejemplo, estabilidad térmica) , solubilidad (por ejemplo, in vivo y en cultivo celular) , y afinidad de unión de antígeno.
Los términos "unión específica" , "unión selectiva" "une selectivamente" y "une específicamente" , se refiere a la unión de anticuerpos a un epítope en un antígeno predeterminado. Típicamente, el anticuerpo se une con una afinidad (K73) de aproximadamente menos de 10"7 M, tal como aproximadamente menos de aproximadamente 10"8 M, 10"9 M o 10"10 M.
El término "molécula de ácido nucleico" se refiere a moléculas de ADN y moléculas de ARN. Una molécula de ácido nucleico puede ser un ADN de hebra sencilla o de doble hebra, aunque de preferencia es de doble hebra. Un ácido nucleico se "enlaza operablemente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor o mej orador se enlaza operablemente a una secuencia de codificación si afecta la transcripción de la secuencia .
El término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual se ha enlazado. Un tipo de vector es un "plásmido" , el cual se refiere a un bucle de ADN de doble hebra, circular en cuyos segmentos de ADN adicionales pueden ligarse. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde los segmentos de ADN adicionales pueden ligarse en el genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped en la cual se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano para replicación y vectores mamíferos episomales) . Otros vectores (por ejemplo, vectores mamíferos no episomales) pueden integrarse en el genoma de una célula huésped en la introducción en la célula huésped, y por consiguiente se replican junto con el genoma huésped.
El término "célula huésped" se refiere a una célula en la cual se ha introducido un vector de expresión. Las células huéspedes pueden incluir células bacterianas, microbianas, vegetales o animales. Las bacterias, las cuales son susceptibles a transformación, incluyen miembros de las enterobacterias , tal como cepas de Escherichia coli o Salmonella; Bacillaceae, tal como Bacillus subtilis; Pneumococcus ; Streptococcus y Haemophilus influenzae. Microbios adecuados incluyen Saccharo yces cerevisiae y Pichiapastoris . Las líneas celulares huéspedes animales adecuadas incluyen CHO (líneas de Ovario de Hámster Chino) y células NSO.
A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por alguien de experiencia en la técnica a la cual esta invención pertenece. Aunque pueden utilizarse métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente, en la práctica o prueba de la presente invención, se describen posteriormente métodos y materiales adecuados. En caso de conflicto, la presente especificación, incluyendo las definiciones, será controlada. Además, los materiales, métodos y ejemplos son ilustrativos únicamente y no se pretenden para ser limitantes.
Varios aspectos de la invención se describen en detalle adicional en las siguientes sub-secciones . Se entiende que las diversas modalidades pueden combinarse según se desee .
Enlazadores de Polipéptidos En un aspecto, la invención proporciona polipéptidos, que comprenden dos dominios, en donde los dominios se unen por un enlazador de aminoácido, y en donde el enlazador contiene dos residuos de cisteína que son capaces de formar un enlace disulfuro de intra-cadena. Tales enlazadores son particularmente ventajosos en que permiten la ádición sitio-específica de una porción funcional (por ejemplo, PEG) y/o la adición de una o más afinidades de unión al polipéptido. Los enlazadores de' la invención se unen de preferencia genéticamente a un dominio mediante ingeniería genética, más preferiblemente entre dos dominios, por lo que se enlazan para formar un polipéptido sencillo. Alternativamente, los enlazadores de la invención pueden unirse químicamente a un dominio utilizando cualquier química reconocida en la técnica para efectuar la unión de aminoácidos. Las porciones funcionales pueden conectarse al enlazador mediante cualquier química reconocida en la técnica. De preferencia, se conectan a una o más cisteínas presentes en el enlazador.
En ciertas modalidades, el enlazador de aminoácidos es de la fórmula general: (X) a-C- (X) b-C- (X) c, en donde C es cisteína; X es cualquier aminoácido, incluyendo aminoácidos naturales, no-naturales, y derivados químicos de los aminoácidos; y a, b y c corresponde al número de aminoácidos y puede ser cualquier número natural. De preferencia, a y c son números entre 1-25, b es un número entre 3-250. Más preferiblemente, a y c son núméros entre 1-20, b es un número entre 3-100.
En una modalidad, el enlazador comprende una secuencia peptídica en la región Xb que forma el bucle. En tal caso, b es de preferencia cualquier número de 3-30 aminoácidos, es decir, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30. De mayor preferencia b es 7 ó 12. De preferencia, la región Xb que forma el bucle no comprende un residuo de cisterna .
En ciertas modalidades, el enlazador comprende un dominio de polipéptido el cual se pliega. En la fórmula general: (X) a-C- (X) b-C- (X) c, b es de preferencia un número entre 30 y 250, por ejemplo, 50-200, 125-225, 75-225, 125-225, tal como 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240 ó 250. Se entiende que cualquier número natural en el margen indicado se describe aquí. Por consiguiente, el enlazador de aminoácidos es de la fórmula general (X) a-C-dominio-C- (X) b, en donde C es cisterna; X es cualquier aminoácido, incluyendo aminoácidos naturales, no naturales, y derivados químicos de los mismos; el dominio es un dominio como se define anteriormente; y a, b corresponde al número de aminoácidos y pueden ser i cualquier número natural.
En ciertas modalidades, el enlazador de aminoácidos es de la fórmula general: (X) n=s-is-C- (X) n=3-so-C (X) n=es (SEC. de IDENT. No. 1 en la Tabla 1), en donde C es cisteína; X es cualquier aminoácido, incluyendo aminoácidos naturales, no naturales, y derivados químicos de los mismos; y, n es el número de aminoácidos. El número de residuos aminoácidos en cada región del enlazador puede variar de acuerdo con la estructura del polipéptido al cual se une, siempre que los residuos cisteína en el enlazador sean capaces de formar una unión disulfuro de intra-cadena bajo condiciones sin reducción. Además, la longitud y la secuencia del enlazador debe ser tal que el enlazador no deteriora sustancialmente una o más propiedades funcionales del polipéptido al cual es una parte. En una modalidad particular, el enlazador de aminoácidos comprende la secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de la SEC. de IDENT. No. 2, 3 y 4 (véase la Tabla 1) .
Los enlazadores de la invención son particularmente bastante adecuados para unir los dominios VH y VL en scFv, especialmente aquellos scFv que son altamente estables y solubles, tal como aquellos descritos en WO09/000098, los contenidos de los cuales se incorporan en la presente para 'referencia. Las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos scFv ejemplares que comprenden los enlazadores de la invención establecidos en la SEC. de IDENT. No. 6 y 8 (véase la Tabla 1) .
Polipéptidos La invención proporciona polipéptidos funcionalizados , especialmente polipéptidos terapéuticos (por ejemplo, scFv) . Los polipéptidos de la invención comprenden una secuencia enlazadora que puede funcionalizarse rápida y específicamente mediante la adición de una o m s porciones funcionales (por ejemplo, PEG) y/o especificidades de unión (por ejemplo, una secuencia de aminoácidos con una especificidad de unión particular) .
Cualquier polipéptido puede funcionalizarse utilizando los métodos y composiciones de la invención, incluyendo sin limitación, polipéptidos que comprenden un dominio de inmunoglobulina (por ejemplo, un dominio VH o VL) . En una modalidad particular, el polipéptido es un inmuno-aglutinante (por ejemplo, un scFv) .
En una modalidad preferida, los polipéptidos de la presente invención son de la siguiente fórmula general: dominio 1- (X) a-C- (X) b-C- (X) c-dominio 2, en donde C es cisteína; dominio 1 y 2 son dominios como se definen anteriormente; X es cualquier aminoácido, incluyendo aminoácidos naturales, no naturales, y derivados químicos de los mismos; y a, b y c son el número de aminoácidos. De preferencia, el dominio 1 y 2 son dominios VH y VL o dominios V-h y vH; respectivamente.
Adición de Porciones Funcionales a Enlazadores Los enlazadores de la invención contienen por lo menos dos residuos cisteína que bajo condiciones sin reducción forman una unión disulfuro de intra-cadena (véase la Figura 3) . Esta unión disulfuro permite la adición sitio específica de una porción funcional (por ejemplo, PEG) al enlazador utilizando los métodos descritos en la presente. Específicamente, los residuos cisteína en la unión disulfuro pueden enlazarse covalentemente a una porción funcional (por ejemplo, PEG) . Ya que las cisteínas expuestas permiten una mucha mejor pegilación dirigida, se logra una ventaja de fabricación sobre los sitios de unión PEG convencionales, lo cual a menudo produce una población no homogénea con respecto a los sitios de unión de PEG. Si se emplea una porción ^ cional que contiene un grupo reactivo monofuncional , la porción funcional se enlazará a un residuo de cisteína sencillo. Sin embargo, si se emplea una porción funcional que contiene un grupo reactivo bifuncional específico de unión disulfuro, la porción funcional se enlazará a ambos residuos cisteína de una unión disulfuro de intra-cadena . Tales reactivos bifuncionales son bien conocidos en la técnica e incluyen, bi-sulfonas (véase por ejemplo, Brocchini et al, Nature Protocols, 2006: 1(5), 241).
En ciertas modalidades, la invención proporciona un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEC. de IDENT. No. 2, 3, 4, 6 y 8 (véase la Tabla 1) , en donde por lo menos un residuo cisteína en el enlazador se enlaza covalentemente a una porción funcional (por ejemplo, PEG) . En otras modalidades, la invención proporciona un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEC. de IDENT. No. 2, 3, 4, 6 y 8 (véase la Tabla 1) , en donde ambos residuos cisteína en el enlazador se enlazan covalentemente a la misma porción funcional (por ejemplo, PEG) utilizando un grupo reactivo bifuncional (por ejemplo, bis-sulfona) .
Funcionalización de Bucles La formación de uniones disulfuro de intra-cadena por residuos cisteína en los enlazadores de la invención resulta en la ciclización de la secuencia de aminoácidos enlazadora entre los residuos cisteína para formar un bucle (véanse Figuras 3 y 5) . Esta estructura de bucle es particularmente ventajosa porque puede modificarse para comprende una secuencia de aminoácidos con una o más especificidades de unión particular, y por lo tanto agrega funcionalidad adicional a un polipéptido del cual el bucle es una parte .
La secuencia de bucle puede, por ejemplo, tener una especificidad de unión para cualquier molécula objetivo. Las moléculas objetivo adecuadas incluyen, sin limitación, modificadores PK tales, como ácido hialurónico, albúmina de suero, una integrina, una región Fe de anticuerpo, transferrina y similares. Por ejemplo, la unión a albúmina de suero prolonga la vida media del polipéptido. La unión a FcRx mejora el transporte del polipéptido en la placenta, mientras que la unión a mucina prolonga el tiempo de residencia en el epitelio. En el caso de un inmunoaglutinante con especificidad para un antígeno, en ciertas modalidades, la región de bucle entre los dominios VH y VL puede diseñarse para unirse al antigeno y de este modo mejorar la afinidad del inmunoaglutinante. En otra modalidad, la molécula objetivo es el polipéptido mismo. En otras palabras, el bucle puede proporcionar una función de multimerización que causa que el polipéptido construya dímeros, trímeros o multímeros del orden superior. Los multímeros tienen una urgencia más fuerte en comparación a los monómeros . Además, los multímeros permiten la reticulación y es seguida eventualmente por una activación, por ejemplo, de receptores en la superficie de una célula. En otra modalidad, la molécula objetivo es otro inmunoaglutinante que despliega un bucle complementario en su enlazador, es decir los bucles de las dos moléculas unidas entre sí, mientras que los bucles podrían ser idénticos o diferentes. Esto permite la formación de complejos inmuno-aglutinantes biespecíficos o multiespecíficos . Los complejos biespecíficos o multiespecíficos que permiten el reclutamiento de moléculas o células a otra célula o molécula, por ejemplo, el reclutamiento de células T a células cancerígenas resulta en la eliminación de la célula cancerígena (Cáncer Res. Volumen 69, página 4941).
Cualquier secuencia corta de aminoácidos con una especificidad de unión para una molécula objetivo deseada c puede introducirse en los bucles de la invención. En una modalidad preferida, la secuencia de bucle consiste de 5 a 15 aminoácidos (es decir, b es 5-15 en la fórmula general (X)a_ C- (X) b-C- (X) c) y no contiene cisteínas. Las secuencias de aminoácidos adecuadas que pueden incorporarse en un bucle incluyen, sin limitación, un péptido de unión de ácido hialurónico (por ejemplo, un péptido que comprende residuos 12 a 23 de la SEC. de IDENT. No. 4 en la Tabla 1) y un péptido de unión de integrina (por ejemplo, un péptido RGD) .
Nuevos péptidos con especificidades de unión a moléculas objetivo deseadas, adecuados para la incorporación en un bucle, pueden identificarse por medios reconocidos en la técnica tal como por ejemplo, despliegue de fago, despliegue de levadura y despliegue de ARNm. Tales sistemas de despliegue son bien conocidos en la técnica (véase por ejemplo, patentes Estadounidenses 66248558, 6699658; y 7118879, las cuales se incorporan en la presente para referencia) . A modo de ejemplo, para realizar una pantalla de despliegue de fago, el bucle formado por las dos cisteínas del enlazador puede fusionarse a una proteína . cápside de fago para despliegue en una superficie de fago (véase la Figura 5 para un dibujo esquemático) . La secuencia de bucle, la cual idealmente comprende entre 5-15 aminoácidos y no contiene cisteínas a diferencia de aquellas requeridas para formar el bucle,, se escoge al azar para proporcionar una biblioteca de secuencias de bucle a la pantalla. Las colecciones de fago adecuadas están comercialmente disponibles, por ejemplo, la biblioteca de heptapéptidos limitados por disulfuro (Ph.D.-C7C) de New England Biolab. Las moléculas objetivo para tales pantallas de fago incluyen, por ejemplo, modificadores PK, tal como, colágeno tipo II, albúmina, regiones de anticuerpo Fe, receptores de anticuerpo Fe (por ejemplo, FcRx) , mucinas, integrinas, proteínas de unión estrecha y factores complementarios.
Polipéptidos Modificados D :.
'. Adicional o alternativamente, los polipéptidos de la invención pueden enlazarse covalentemente a una porción funcional (por ejemplo, PEG) en uno o más residuos aminoácidos fuera de la región enlazadora. Cualquier residuo aminoácido que no deteriora sustancialmente una o más propiedades funcionales del polipéptido puede emplearse, por ejemplo, residuos de lisina y cisteina expuestos a la superficie. Si se desea, un polipéptido puede modificarse (por la adición o sustitución) para introducir aminoácidos reactivos adicionales, adecuados para la conexión a una porción funcional. En una modalidad particular, un polipéptido se modifica para contener por lo menos un par de residuos cisteina, y en donde por lo menos un par de los residuos cisteina forman una unión disulfuro de intra-cadena en el polipéptido maduro. Una porción funcional puede enlazarse a un residuo reactivo sencillo (por ejemplo, una cisteina) utilizando un grupo reactivo monofuncional , o enlazarse a dos cisteínas unidas con disulfuro, utilizando un grupo reactivo especifico de unión disulfuro bifuncional (por ejemplo, una bis-sulfona) .
Por consiguiente, en una modalidad, la invención proporciona un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEC. de IDENT. No. 5, en donde por lo menos un residuo aminoácido seleccionado del grupo que consiste de Lys40, Lys43, Lys46, Lysl07, Lysl76, Lysl97 y Lys208 se enlaza covalentemente a una porción funcional (por ejemplo, PEG) .
En otra modalidad, la invención proporciona un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEC. de IDENT. No. 5, en donde por lo menos .un par de residuos cisteína seleccionados del grupo que consiste de C24-C89 y C154-C228 se enlaza covalentemente a la misma porción funcional (por ejemplo, PEG) .
En otra modalidad, la invención proporciona un polipéptido que comprende la secuencia establecida en la SEC. de IDENT. NO. 6, en donde por lo menos un residuo aminoácido seleccionado del grupo que consiste de Cysl23 y Cysl36 se enlaza covalentemente a una porción funcional (por ejemplo, PEG) .
En otra modalidad, la invención proporciona un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEC. de IDENT. No. 6, en donde el par de residuos cisteína Cysl23-Cysl36 se enlaza covalentemente a la misma porción funcional (por ejemplo, PEG) .
En otra modalidad, la invención proporciona un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEC. de IDENT. No. 7, en donde por lo menos un residuo aminoácido seleccionado del grupo que consiste de Lys44, Lys47, Lysl05, Lysl09, Lysl42, Lysl43, Lysl49, Lysl73, Lysl93 y Lysl95 se enlaza covalentemente a una porción funcional (por ejemplo, PEG) .
En otra modalidad, la invención proporciona un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEC. de IDENT. NO. 7, en donde por lo menos un par de residuos cisteína seleccionados a partir del grupo que consiste de Cys25-Cys90 y Cysl52-Cys226 se enlaza covalentemente a la misma porción funcional (por ejemplo, PEG) .
; En otra modalidad, la invención proporciona un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEC. de IDENT. No. 8, en donde por lo menos un residuo aminoácido seleccionado del grupo que consiste de Cysl21 y Cysl29 se enlaza covalentemente a una porción funcional (por ejemplo, PEG) .
En otra modalidad, la invención proporciona un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEC. de IDENT. No. 8, en donde el par de residuos cisteína Cysl21-Cysl29 se enlaza covalentemente a la misma porción funcional (por ejemplo, PEG) .
En otra modalidad, la invención proporciona un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEC. de IDENT. No. 5, 6, 7 u 8, en donde el polipéptido se modifica para contener por lo menos un aminoácido reactivo (por ejemplo, cisteína o lisina) . Tales aminoácidos reactivos pueden enlazarse covalentemente a una porción funcional (por ejemplo, PEG) .
' En otra modalidad, la invención proporciona un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEC. de IDENT. No. 5, 6, 7 u 8, en donde el polipéptido se modifica para contener por lo menos un par de residuos cisteína, y en donde por lo menos un par de residuos cisteína son capaces de formar en una unión disulfuro de intra-cadena en el polipéptido maduro. En una modalidad particular, por lo menos un par de residuos cisteína se enlazan covalentemente a la misma porción funcional (por ejemplo, PEG) del grupo reactivo bifuncional (por ejemplo, bis-sulfona) .
* Como se sabe en la técnica, la unión de PEG mejora ciertas características de biof rmacéuticos sin alterar su función, por lo que se mejora su efecto terapéutico. Efectos ejemplares son (i) farmacocinéticos mejorados a través de solubilidad mejorada, estabilidad mejorada, absorción sostenida y/o acción biofarmacéutica continua; (ii) tiempo de circulación incrementado el cual disminuye la cantidad terapéuticamente' efectiva y/o la frecuencia de dosificación; y/o (iii) toxicidad reducida, por ejemplo, debida a un perfil mejorado de seguridad, una inmunogenicidad reducida, una antigenicidad reducida y/o proteólisis reducida.
Composiciones y Formulaciones de Polipéptidos Otro aspecto de la invención se refiere a formulaciones farmacéuticas de las composiciones de polipéptidos (por ejemplo, ScFv) de la invención. Tales formulaciones típicamente comprenden la composición de polipéptidos (por ejemplo, ScFv) y un portador farmacéuticamente aceptable. Como se utiliza en la presente, "portador farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos , agentes isotónicos y que retrasan la absorción, y similares que son fisiológicamente compatibles. De preferencia, el portador es adecuado para, por ejemplo, administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, tópica (por ejemplo, para ojo, piel o capa epidérmica), inhalación, parenteral, espinal o epidérmica (por ejemplo, por inyección o infusión) . Dependiendo de la ruta de administración, los polipéptidos (por ejemplo, ScFv) pueden recubrirse en un material para proteger el compuesto de la acción de ácidos y otras condiciones naturales que pueden inactivar el compuesto.
Los compuestos farmacéuticos de la invención pueden incluir una o más sales farmacéuticamente aceptables . Una "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sal que retiene la actividad biológica deseada del compuesto progenitor y no imparte ningunos efectos toxicológicos indeseados (véase por ejemplo, Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19). Ejemplos de tales sales incluyen sales de adición de ácido y sales de adición de base. Las sales de adición de ácido incluyen aquellas derivadas de ácidos inorgánicos no tóxicos, tal como clorhídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromhídrico, yodhídrico, fosforoso y similares, así como de ácidos orgánicos no tóxicos tales como ácidos mono y dicarboxílieos alifáticos, ácidos alcanoicos sustituidos con fenilo, ácidos hidroxíalcanoicos , ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos alifáticos y aromáticos y similares. Las sales de adición de base incluyen aquellas derivadas de metales alcalinotérreos , tal como sodio, potasio, magnesio, calcio y similares, así como de aminas orgánicas no tóxicas, tal como N, N' -dibenciletilendiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina , etilendiamina, procaína y similares.
Una composición farmacéutica de la invención también puede incluir un anti-oxidante farmacéuticamente aceptable. Ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) antioxidantes solubles en agua, tal como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio y similares; (2) antioxidantes solubles en aceite, tal como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA) , hidroxitolueno butilado (BHT) , lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol y similares; y (3) agentes quelantes metálicos, tal como ácido cítrico, ácido etilendiamina tetraacético (EDTA) , sorbitol, ácido tartárico, acido fosfórico y similares.
Ejemplos de portadores acuosos y no acuosos adecuados que pueden emplearse en las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen agua, etanol, polioles (tal como glicerol, propilenglicol , polietilenglicol , y similares) , y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tal como aceite de oliva, y ásteres orgánicos inyectables tal como oleato de etilo. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de materiales de recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones, y por el uso de tensioactivos .
Estas composiciones pueden también contener adyuvantes tal como conservadores, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevención de presencia de microorganismos puede asegurarse tanto por procedimientos de esterilización, supra como por la inclusión de varios agentes antibacterianos y antifúngicos , por ejemplo, parabeno, clorobutanol, ácido fenolsórbico y similares. Puede también ser deseable incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro de sodio, y los similares en las composiciones. Además, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede llevarse a cabo mediante la inclusión de agentes que retardan la absorción tal como monoestearato de aluminio y gelatina.
Portadores farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas, se conoce en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional es incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso del mismo en las composiciones farmacéuticas de la invención. Compuestos activos suplementarios pueden también incorporarse en las composiciones .
Las composiciones terapéuticas típicamente deben ser estériles y estables bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición puede formularse como una solución, microemulsión, liposoma u otra estructura ordenada ¡i' adecuada para una concentración farmacéutica superior. El portador puede ser un solvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y por el uso de tensioactivos . En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes , tal como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede llevarse a cabo incluyendo en la composición un agente que retarda absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.
Pueden prepararse soluciones inyectables estériles incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, como se requiere, seguido por microfiltración de esterilización. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básica y los otros ingredientes requeridos a partir de aquellos enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de la preparación son secado al vacío y liofilizado ( liofilización) que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una solución filtrada previamente estéril de los mismos.
La cantidad del ingrediente activo el cual puede combinarse con un material portador para producir una forma de dosis sencilla, variará dependiendo del sujeto que se trata, y el modo particular de administración. La cantidad del ingrediente activo el cual puede combinarse con un material portador para producir una forma de dosis sencilla generalmente será aquella cantidad de la composición la cual produce un efecto terapéutico. Generalmente, entre cien por ciento, esta cantidad variará de aproximadamente 0.01 por ciento a aproximadamente noventa y nueve por ciento del ingrediente activo, de preferencia de aproximadamente 0.1 por ciento a aproximadamente 70 por ciento, de mayor preferencia de aproximadamente 1 por ciento a aproximadamente 30 por ciento del ingrediente activo en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable.
Los regímenes de dosis se ajustan para proporcionar ia respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica) . Por ejemplo, un bolo sencillo puede administrarse, diversas dosis divididas pueden administrarse con el tiempo o la dosis puede reducirse o incrementarse proporcionalmente como se indica por las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular las composiciones parenterales en forma de unidad de dosis para facilidad de administración y uniformidad de dosis. La forma de unidad de dosis como se utiliza en la presente se refiere a unidades físicamente discretas apropiadas como dosis unitarias para los sujetos que se tratan; cada unidad contiene una cantidad predeterminada del compuesto activo calculado para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido. La especificación para las formas de unidad de dosis de la invención se estipulan por y dependen directamente de (a) las únicas características del compuesto activo y el efecto terapéutico particular que se logra, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica al combinar un compuesto activo para el tratamiento de sensibilidad en individuos.
Tabla 1 : Enlazador y secuencias scFv SEC. de Enlazador Secuencia IDENT. No. 1 enlazador (X)3-15C(X)3-50C(X)3-1S SS 2 enlazador GGGGSGGGGSC (X) 3-50CGGGGSGGGGS SS 3 enlazador GGGGSGGGGSCGGGSGGGCGGGGSGGGGS SS 4 enlazador GGGGSGGGGSCGAHWQFNALTVRCGGGGSGGGGS SS Pep-1 5 enlazador MEIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASEIIHSWLAWYQQ PGKA ESBA903 PKLLIYLASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYY Normal CQNVYLASTNGANFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLTDYYYMTWVRQAPGK GLEWVGFIDPDDDPYYATWA GRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRA EDTAVYYCAGGDHNSGWGLDIWGQGTLVTVSS 6 enlazador MEIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASEIIHSWLAWYQQ PG A ESBA903 PKLLIYLASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYY SS Pep-1 CQNVYLASTNGANFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSCGAHWQFNAL TVRCGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLT DYYY TWVRQAPGKGLEWVGFIDPDDDPYYATWAKGRFTISRDT SKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGDHNSGWGLDIWGQGTLVTV SS 1 enlazador MADIVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDVVWYQQRPGK ESBA105 APKLLIYSAFNRYTGVPSRFSGRGYGTDFTLTISSLQPEDVAVY Normal YCQQDYNSPRTFGQGTKLEVKRGGGGSGGGGSGGGGSSGGGSQV QLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYTFTHYGMNWVRQAPG GLE WMGWINTYTGEPTYAD FKDRFTFSLETSASTVYMELTSLTSDD TAVYYCARERGDAMDYWGQGTLVTVSS 8 enlazador MADIVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDVVWYQQRPG APKLLI YSAFNRYTGVPSRFSGRGYGTDFTLTISSLQPEDVAVY ESBA105 YCQQDYNSPRTFGQGT LEVKRGGGGSGGGCSCCCGSGGCCGCC SS GSGGGGSQVQLVQSGAEVK PGASVKVSCTASGYTFTHYGMNWV RQAPG GLEWMGWINTYTGEPTYADKFKDRFTFSLETSASTVYM ELTSLTSDDTAVYYCARERGDAMDYWGQGTLVTVSS Ejemplificación La presente descripción se ilustra además mediante los siguientes ejemplos, los. cuales no deben interpretarse como limitaciones adicionales. Los contenidos de todas las figuras, referencias, patentes y solicitudes de patentes publicadas citadas en toda esta solicitud se incorporan expresamente en la presente para referencia en sus totalidades .
En general, la práctica de la presente invención emplea, a menos que se indique de otra manera, técnicas convencionales de química, biología molecular, tecnología recombinante de ADN, e inmunología (especialmente, por ejemplo, tecnología de inmunoglobulina) . Véase por ejemplo, Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) ; Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology) , 510, Paul, S., Humana Pr (1996) ; Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169) , McCafferty, Ed. , Irl Pr .(1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al., C.S.H.L. Press, Pub. (1999); Current Protocols in Molecular Biology, eds . Ausubel et al . , John Wiley & Sons (1992). Véase también por ejemplo, Polytherics US6803438; EP1701741A2 ; EP1648518A2; WO05065712A2 ; WO05007197A2 ; EP1496941A1 ; EP1222217B1; EP1210093A4; EP1461369A2 ; WO03089010A1 ; WO03059973A2 ; y EP1210093A1) ; Genentech US20070092940A1 y EP1240337B1; y ESBATech U.S.S.N. 60/899,907 y WO03097697A2.
PEGilación de ESBA105 t; Metil-PEOi2-Malemida (Pierce) , un reactivo de PEGilación reactivo con sulfhidrilo se utilizó para modificación de grupos sulfhidrilo en ESBA105 (SEC. de IDENT. No. 7) y el ENLAZADOR ESBA105-SS (SEC. de IDENT. NO: 8). Ya • que ESBA105 contiene residuos cisteína cuyos átomos de azufre de cadena lateral tienen lugar en pares como uniones disulfuro, se requiere la reducción de estas uniones disulfuro para exponer los grupos sulfhidrilo que sirven como un objetivo para PEGilación con Metil-PEOi2-Malemida . La pegilación de ESBA105 y el ENLAZADOR ESBA105-SS se realizó como se recomendó por el proveedor de PEG (Thermo Scientific: Pierce Protein Research Products) . En poco tiempo, se redujeron las uniones disulfuro mediante incubación de aproximadamente 2 mg de ESBA105 en la presencia de 20 mM de DTT durante 30 minutos a 4°C. Para la remoción de DTT se dializó la ESBA105 contra PBS (pH 6.5) utilizando casetes de Diálisis Slide-A-Lyzer (Pierce; corte: 7000 Da). Después de la diálisis y la sobre-concentración se pegiló 2 mg/ml de proteína mediante incubación de un exceso molar de 20 veces de Metil-PEOi2-Malemida a 4°C durante la noche. Las proteínas etiquetadas se purificaron a partir de Metil-PEOi2-Malemida por diálisis utilizando casetes de Diálisis Slide-A-Lyzer (Pierce; corte: 7000 Da) .
SDS-PAGE Se realizó SDS-PAGE bajo condiciones sin reducción utilizando el sistema de electroforesis Bis-Tris comercialmente disponible a partir de Invitrogen de acuerdo con las recomendaciones del proveedor, se cargaron 5 pg de muestras de proteínas en pre-vaciado de 12% de geles Bis-Tris. Los geles se tiñeron utilizando un reactivo Coomassie (0.1% (p/v) Coomassie G250, 10% de ácido acético glacial, 50% de etanol) durante 15 minutos. Se realizó el desteñido utilizando 10% (v/v) de ácido acético.
Análisis de transferencia western para confirmar la pegilación Se cargó 1, 10 y 100 ng del ENLAZADOR ESBA105-SS PEGilado en un pre-vaciado de 12% de gel Bis-Tris. Las "I-muestras se tiñeron en membranas de nitrocelulosa y la porción de PEG se detectó con un anticuerpo anti-PEG monoclonal de conejo (Epitomics) . Después de la incubación con el anticuerpo primario, se incubaron membranas con anticuerpo policlonal anti-conejo de cabra conjugado con peroxidasa de rábano (HRP) (Santa Cruz) . La unión específica de anticuerpos a las membranas se detectó mediante un sistema de detección quimioluminiscente (Pierce) .
ELISA Directo para confirmar la unión de ESBA105 pegilada a TNF alfa humano Se evaluó la unión de ESBA105 y sus derivados mediante un ELISA directo. El TNF alfa humano (PeproTech EC Ltd) se recubrió en una placa microtituladora de 96 pozos y luego se bloqueo utilizando BSA (albúmina de suero de bovino) . ESBA105 y derivados de ESBA105 fueron probados en concentraciones de 50 nM, 12.5 nM, 3.13 nM, 1.56 nM, 0.78 nM, 6.39 nM, 0.20 nM, 0.10 nM y 0.05 nM. La unión de ESBA105 y sus derivados a TNF alfa humano se visualizó por la adición subsiguiente de un anticuerpo anti-ESBA105 policlonal de conejo bio-tinilado (AK3A, generado en ESBATech) , estreptavidina Poli HRP y un sustrato cromogénico (POD) . El producto de esta reacción se detectó al medir la densidad óptica (OD) a 450 nM utilizando un espectrofotómetro . Los datos se analizaron utilizando un ajuste de curva logística de 4 parámetros, y se calcularon los valores EC5o a partir de las curvas de respuesta de dosis de la scFvs.
Análisis de resonancia de plasmón superficial de1 ESBA903 y ESBA903 con Pepl en el enlazador Para mediciones de afinidad de unión, se emplearon mediciones de resonancia de plasmón superficial con BIAcore™-T100. En estos experimentos, se utilizó VEGFi65 .humana recombinante expresada con Escherichia coli purificada (PeproTech EC Ltd) . Se activaron chips biosensores de dextrano carboximetilados (CM4, GE Healthcare) con clorhidrato de N-etil-N' - (3-dimetilaminopropil) carbodiimida y N-hidroxisuccinimida de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Se acopló VEGFi65 humano a 1 de 4 diferentes células de . flujo en un chip sensor CM4 utilizando un procedimiento de acoplamiento de amina estándar. El margen de respuestas obtenido con la molécula hVEGF165 inmovilizada después del acoplamiento y bloqueo fue aproximadamente 120-140 unidades de respuesta (RU) . La cuarta célula de flujo de cada chip fue tratada de forma similar excepto que no se inmovilizaron proteínas antes del bloqueo, y la célula de flujo se utilizó como en la referencia en línea. Varias concentraciones de scFvs anti-VEGF (20 nM, 10 nM, 5 nM, 2.5 nM, 1.25 nM, 0.63 nM, 0.31 nM y 0.16 nM) en tampón HBS-EP (0.01 M de HEPES, pH 7.4, 0.15 M de NaCl, 3 mM de EDTA, ?.005% de tensioactivo P20) se inyectaron en las células de flujo en un índice de flujo de 30 µ?/min durante 5 minutos. La disociación del scFv anti-VEGF a partir del VEGF en el chip CM4 se dejó proseguir durante 10 minutos a 25°C. Los sensogramas fueron generados para cada muestra de scFv anti-VEGF después de la corrección celular de referencia en línea seguida por sustracción de muestra de tampón. La constante de índice de disociación aparente (Ka), la constante de índice de disociación aparente (Ka) y la constante de equilibrio de disociación aparente (KD) fueron calculadas utilizando un modelo de unión Langmuir uno a uno con Software de evaluación BIAcore T100 versión 1.1.
Clonación y expresión de scFvs Los scFvs descritos y caracterizados en la presente fueron producidos como sigue. En algunos casos las secuencias de ADN que codifican diversos scFvs fueron de nuevo sintetizados por el proveedor de servicios Entelechon GmbH (www . entelechon . com) . Se clonaron los insertos de ADN resultantes en el vector de expresión bacteriana pGMP002 mediante sitios de restricción Ncol y HindIII introducidos en el extremo 5' y 3' de la secuencia de ADN de scFv, respectivamente. En algunos casos se introdujeron los enlazadores modificados mediante métodos actualizados como oligos complementarios, endurecidos que codifican las respectivas moléculas de aminoácido, clonándolas en sitios de restricción adecuados entre los dominios VH y VL respectivos. En otros casos, se introdujeron mutaciones de punto en el dominio VH y/o VL utilizando métodos de PCR de ensamble actualizados. La clonación de GMP002 se describe en el Ejemplo 1 de la O2008006235. La producción del scFvs se realizó como se describe para ESBA105 en el Ejemplo 1 de la WO08/006235, la cual se incorpora en la presente para referencia .
EJEMPLO 1 PEGILACIÓN DE ESBA105 Y ENLAZADOR ESBA105-SS ESBA105 (SEC. de IDENT. No. 7) es un anticuerpo de cadena sencilla que une específicamente e inhibe TNFalfa humano (véase por ejemplo, WO 06/131013, la cual se incorpora en la presente para referencia) . El enlazador ESBA105-SS (SEC. de IDENT. No. 8) es una variante ESBA105, en la cual el enlazador fue reemplazado por el enlazador SS (SEC. de IDENT. No. 3) .
Fueron analizados ESBA105, ESBA105 reducido con DTT, ESBA105 reducido y sometido a pegilación con cisteína y ESBA105 reducido y sometido a pegilación con cisteína seguido por diálisis por SDS-PAGE. En la pegilación de la proteína, se espera uri incremento del peso molecular de aproximadamente 4 kDa. "ESBA105 reducido" y "ESBA105 reducido, pegilado con cisteína" migra en una posición ligeramente más alta en comparación a ESBA105. En la diálisis de ESBA105 pegilado con cys , la proteína migra en la misma posición como ESBA105 sugiriendo que el cambio de proteína no se debe a la pegilación sino más bien se debe a la reducción de las uniones disulfuro que fueron formadas contra la oxidación de grupos sulfhidrilo durante la diálisis. Estos datos indican que las cisteínas intramoleculares reducidas (SH) de ESBA105 tienen baja accesibilidad para PEG-NHS. En contraste a los grupos sulfhidrilo de las cisteínas intramoleculares en ESBAS105 , las aminas primarias (residuos Lisina en el término N) son accesibles para PEG-NHS, como se muestra en la línea 6 y 7 de la Figura 1.
¦; Las actividades de preparaciones de ESBA105 tratadas en forma diferente como se describe anteriormente fueron evaluadas en experimentos de ELISA. El análisis de ELISA descrito en la Figura 2 muestra que el ESBA105 reducido es tan activo como ESBA105 oxidado. ESBA105 pegilado con Cys muestra únicamente una ligera pérdida de actividad de unión en comparación a ESBA105. Sin embargo, como se muestra en la Figura 1, el grado de PEGilacion de disulfuros de intra-cadena en ESBA105 es bajo. La pegilación de Lys fue exitosa con pérdida únicamente menor de actividad de unión hacia TNF alfa humano.
Un propósito de la presente invención fue proporcionar anticuerpos scFv que son susceptibles a pegilación de cys. En una primera etapa, se examinó, si la molécula del enlazador ESBA105-SS no pegilada está aún activa en comparación con ESBA105. Una vez que se confirmó esto por medio de un ensayo de ELISA como se describe en la Figura 4a, se sometió el enlazador ESBA105-SS a pegilación cys. A prueba de éxito la pegilación de cys, el enlazador ESBA105-SS , el enlazador ESBA105-SS reducido, el enlazador ESBA105 -SS pegilado con cys reducido y el .enlazador ESBA105-SS pegilado con cys sometido a diálisis fueron analizados por SDS-PAGE (véase la Figura 4B) . El enlazador ESBA105-SS PEGilado migra a una posición más elevada en comparación al enlazador ESBA105-SS que indica PEGilación exitosa del enlazador ESBA105-SS. La PEGilación del enlazador ESBA105 -SS fue confirmada por análisis de transferencia Western utilizando un anticuerpo monoclonal anti-PEG de conejo (véase la Figura 4C) . Se detectó una señal en el tamaño esperado con 100 ng/ml del enlazador ESBA105-SS pegilado. Además, el ensayo de ELISA como se describe en la Figura 6, confirma que el enlazador ESBA105-SS pegilado con cys casi es completamente activo en comparación con ESBA105 desnudo.
La pegilación con cys convencional del enlazador ESBA105-SS utilizando un PEG con un grupo reactivo monoespecífico se describe esquemáticamente en la Figura 3 .mitad) . Un método alternativo de pegilación cys se describe también en la Figura (3) derecha) . Este método final emplea un PEG unido a un grupo reactivo bifuncional '(esquemáticamente representado como una "T" horizontal que tiene una molécula de PEG en su extremo izquierdo) , el cual permite la conexión de una molécula de PEG en ambos residuos cisteína de una unión disulfuro en una proteína. Tal tecnología del enlazador se describe por Shaunak et al. Nature Chemical Biology 2006, volumen 2, página 312; Brocchini et al, Nature Protocols, 2006: 1(5), 241, y WO05/007197.
EJEMPLO 2 INTRODUCCIÓN DE UNA ACTIVIDAD DE UNIÓN EN EL ENLAZADOR SS Una segunda aplicación de la presente invención es introducir una especificidad de unión en polipéptidos (por ejemplo, scFv) . En este ejemplo, el péptido Pep-1, el cual fue identificado para unir al acido hialurónico durante una selección de despliegue de fago (Mummert et al. J. Exp. Med. 2000, volumen 192, página 769), fue introducido en la región de bucle del enlazador SS para dar lugar al enlazador SSP Pepl (SEC. de IDENT. No. 4) . El enlazador SS Pepl fue introducido en el ESBA903 de scFv para producir el enlazador ESBA903 SS Pepl (algunas · veces también referido como ESBA903 -Pepl; SEC. de IDENT. No. 6) . Como se demostró por los resultados de resonancia de plasmón superficial mostrados en la Figura 7, ESBA903-Pepl que despliega el pétido Pepl 12mer en su bucle, se une igualmente bien a su objetivo (VEGF) como ESBA903 sin modificar (SEC. de IDENT. No. 5) , y por lo tanto es aún completamente funcional (valores Kd medidos fueron 4.436E-11 M y 5.608E-11 M, respectivamente). ESBA903-Pepl fue diseñado para prolongar la vida media local en comparación con ESBA903 desnudo cuando se aplica a un sitio en donde se presenta el ácido hialurónico, por ejemplo, tal como el cuerpo vitreo de una articulación.
Equivalentes Aquellos expertos en la técnica reconocerán, o podrán ser capaces de determinar utilizando no más que la experimentación de rutina, muchos equivalentes a las modalidades especificas de la invención descrita en la presente. Tales equivalentes están destinados para estar integrados por las siguientes reivindicaciones.

Claims (20)

REIVINDICACIONES
1. Un polipéptido que comprende dos dominios de anticuerpo conectados por un enlazador de aminoácido; en donde el enlazador comprende dos cisteínas capaces de formar una unión disulfuro · de intra-cadena, y en donde los aminoácidos entre las cisteínas en la secuencia enlazadora forman un bucle cuando las dos cisteínas son disulfuro unido entre sí.
2. El polipéptido de la reivindicación 1, en donde él enlazador comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEC. de IDENT. No. 1.
3. El polipéptido de la reivindicación 1, en donde el enlazador comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEC. de IDENT. No. 2.
4. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el bucle se une a una molécula objetivo.
, 5. El polipéptido de la reivindicación 4, en donde la molécula objetivo es un modificador PK.
6. El polipéptido de la reivindicación 5, en donde el modificador PK es albúmina de suero.
7. El polipéptido de la reivindicación 5, en donde el modificador PK es un ácido hialurónico.
8. El polipéptido de la reivindicación 1, en donde el enlazador comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEC. de IDENT. No. 3.
9. El polipéptido de la reivindicación 1, en donde el enlazador comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEC. de IDENT. No. 4.
10. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el polipéptido es un inmuno-aglutinante .
11. El polipéptido de la reivindicación 10, el cual es un scFv.
12. El polipéptido de la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEC. de IDENT. No. 6 u 8.
13. Un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde (a) un residuo cisteína en el enlazador se enlaza covalentemente a una porción funcional; o (b) ambos de los residuos cisteína se enlazan covalentemente a una porción funcional.
14. El polipéptido de la reivindicación 13, en donde la porción funcional es PEG.
15. Una composición que comprende el polipéptido, de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, y un portador farmacéuticamente aceptable.
16. Una molécula de acido nucleico aislada que codifica el polipéptido, de cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
17. Un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 16.
18. Una célula huésped que comprende el vector de expresión de la reivindicación 17.
19. Un método para producir un polipéptido funcionalizado que comprende: (a) proporcionar una biblioteca de secuencias peptídicas; (b) identificar a partir de la biblioteca en al menos una secuencia peptídica que se une a una molécula obj etivo; (c) identificar la región de bucle de un polipéptido que contiene un enlazador que comprende por lo menos una secuencia peptídica identificada en la etapa (b) , por lo que se produce un polipéptido funcionalizado .
20. El método de la reivindicación 19, en donde se realiza la etapa de identificación utilizando un despliegue de fago, despliegue de levadura o despliegue de ARNm.
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