CN112135843A - 抗sez6抗体药物缀合物和使用方法 - Google Patents

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Abstract

提供了新颖的抗SEZ6抗体和抗体药物缀合物，以及使用此类抗SEZ6抗体和抗体药物缀合物治疗癌症的方法。

Description

抗SEZ6抗体药物缀合物和使用方法
相关申请的交叉引用
本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求于2018年5月30日提交的美国临时申请第62/678,061号的权益，所述美国临时申请的内容通过引用整体并入本文。
序列表的引用
本申请含有已经以ASCII格式电子提交并且在此通过引用以其整体并入的序列表。创建于2019年5月30日的所述ASCII副本命名为381493-703WO(167862)_SL.txt并且大小为28,992字节。
技术领域
本申请涉及一种用于治疗、诊断或预防癌症和其任何复发或转移的新型抗SEZ6抗体药物缀合物、其组分和包括所述缀合物的组合物。
背景技术
干细胞和祖细胞的分化和增殖是在器官形成、细胞修复和细胞替代期间协同地起支持组织生长作用的正常的持续进行过程。严格调节系统，以确保仅基于生物体的需求产生适当的信号。细胞增殖和分化通常仅在替代受损或垂死的细胞或生长所需的时候发生。然而，这些过程的破坏可能由许多因素(包含各种信号传导化学物质的不足或过量、存在微环境的改变、基因突变或其组合)触发。正常细胞增殖和/或分化的破坏可以导致各种病症，包含如癌症等增殖性疾病。
癌症的常规治疗性治疗包含化学疗法、放射疗法和免疫疗法。这些治疗通常无效，并且手术切除可能无法提供可行的临床替代方案。在患者接受一线治疗并且随后复发的情况下，当前护理标准的限制尤其明显。在此类情况下，通常会出现侵袭性和无法治愈的难治性肿瘤。这些年来，许多肿瘤的总存活率在很大程度上保持不变，这至少部分是由于现有疗法未能预防复发、肿瘤复发和转移。因此，非常需要开发针对增殖性病症更具靶向性和更强效的疗法。本发明解决了此需求。
发明内容
在广义方面，本发明提供了一种与人SEZ6决定簇特异性结合的抗体药物缀合物或其组合物。在某些实施例中，所述SEZ6决定簇是在肿瘤细胞上表达的SEZ6蛋白，而在其它实施例中，所述SEZ6决定簇在肿瘤起始细胞上表达。在优选的实施例中，所述SEZ6抗体药物缀合物将包括：
Figure BDA0002784769840000021
其中Ab包括具有SEQ ID NO:3的重链和SEQ ID NO:4的轻链的抗SEZ6抗体，并且其中n为2。出于本公开的目的，除非另有说明，否则此抗体药物缀合物应称为“hSEZ6-1.ss1ADC1”。
在所选的实施例中，本发明包括一种抗体，所述抗体包括SEQ ID NO:3的重链和SEQ ID NO:4的轻链。在某些方面，本发明包括一种核酸，所述核酸对本发明的抗SEZ6抗体或其片段的重链(SEQ ID NO:3)或轻链(SEQ ID NO:4)进行编码。在其它实施例中，本发明包括一种载体或一种宿主细胞，所述载体包括上文所描述的核酸中的一种或多种核酸，所述宿主细胞包括所述核酸或载体。
在又另一个实施例中，本发明包括一种包括式II中所示的结构的卡奇霉素(calicheamicin)药物接头或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
Figure BDA0002784769840000031
如上文所阐述的，本发明提供了一种抗SEZ6抗体药物缀合物，其中所述抗体与式II的一种或多种不可切割的卡奇霉素有效负载缀合。进一步提供了包括如本文所公开的抗SEZ6 ADC的药物组合物。在某些实施例中，所述组合物将包括所选的药物-抗体比率(DAR)，其中所述主要的ADC物种(例如，包括2个卡奇霉素弹头)占存在的物种的大于约50％、大于约60％、大于约70％、大于约80％、大于约90％或大于约95％。优选地，所述主要的物种的载药量将为2。
本发明的另一方面是一种治疗癌症的方法，所述方法包括将抗体药物缀合物或药物组合物(如本文所描述的那些抗体药物缀合物或药物组合物)施用于有需要的受试者。在某些实施例中，所述受试者将患有肺癌，并且在所选的实施例中，将患有小细胞肺癌(SCLC)。
在其它实施例中，所公开的ADC将包括大于6的安全裕量(根据本文所述推导)。在其它实施例中，所述安全裕量将大于7并且在又其它实施例中，所述安全裕量将大于8或大于9。在仍其它实施例中，所述安全裕量将为约10。
在仍另一个实施例中，本发明包括一种减少肿瘤细胞群体中的肿瘤起始细胞的方法，其中所述方法包括使肿瘤起始细胞群体与如本文所描述的抗体药物缀合物接触(例如，在体外或体内)，从而降低了所述肿瘤起始细胞的频率。
在一个方面，本发明包括一种向细胞递送细胞毒素的方法，所述方法包括使所述细胞与所公开的抗体药物缀合物接触。
在另一个方面，本发明还提供了可用于治疗肺癌的试剂盒或装置以及相关方法。为此，本发明优选地提供一种可用于治疗肺癌的制品，所述制品包括含有SEZ6 ADC的贮器和用于使用所述ADC治疗肺癌(例如，小细胞肺癌)或为所述治疗肺癌提供给药方案的指导材料。在其它实施例中，所公开的试剂盒将包括指示所述试剂盒或装置用于治疗肺癌或为其提供给药方案的说明书、标签、插入物、阅读器等。
前述内容是概述，并且因此必然含有简化、概括和省略细节；因此，本领域技术人员将理解的是，概述仅是说明性的并且绝非旨在是限制性的。本文所描述的方法、组合物和/或装置和/或其它主题的其它方面、特征以及优点在本文所阐述的教导中将变得明显。提供本概述以便以简化的形式介绍下文在具体实施方式中进一步描述的一系列概念。
附图说明
图1是hSEZ6-1.ss1 ADC1的示意图；
图2提供了结合曲线，所述结合曲线表明包括S60N突变的SEZ6抗体的亲和力曲线与不具有S60N突变的SEZ6抗体的亲和力曲线基本上相同；
图3表明了所公开的SEZ6 ADC以剂量依赖性方式有效地杀死表达hSEZ6的细胞，同时不耗尽不表达hSEZ6的原初对照细胞；
图4A和4B描绘了所公开的SEZ6 ADC减缓植入有SCLC LU 95(图4A)和SCLC LU 149(图4B)的免疫受损小鼠中小细胞肺癌肿瘤生长的能力；并且
图5A-5D表明了SCLC肿瘤特别容易受到用包括不可切割的卡奇霉素接头药物的ADC进行的治疗的影响，其中图5A和5B分别示出了SEZ6和阳性对照抗原在各种肿瘤细胞系中的相对表达水平，图5C示出了PBD毒素均匀地杀死不同类型的癌细胞，并且图5D示出了卡奇霉素在杀死SCLC细胞中活性特别高。
具体实施方式
本文公开了本发明的例示其原理的非限制性说明性实施例。本文使用的任何章节标题仅用于组织目的，而不应被解释为限制所描述的主题。出于本公开的目的，除非另有说明，否则可以在NCBI参考序列(RefSeq)数据库和/或NCBI
Figure BDA0002784769840000051
归档序列数据库中找到所有鉴别序列登录号。
本发明提供了新颖的抗SEZ6 ADC和其组分(包含hSEZ6-1.ss1抗体和式II的卡奇霉素药物接头)，所述新颖的抗SEZ6 ADC和其组分包括位点特异性抗SEZ6抗体靶向剂和卡奇霉素细胞毒性有效负载。如以下更详细讨论并且在所附实例中阐述的，与其它抗SEZ6ADC相比，所公开的抗SEZ6 ADC在抑制肿瘤生长方面特别有效。
通过使用本文所公开的SEZ6 ADC有效减少或消除肿瘤和/或癌症干细胞的能力是由于非位点毒性相对较低，而这允许增加给药。这进而在肿瘤位点处提供比其它卡奇霉素ADC高的卡奇霉素水平并且使得细胞杀伤力增加。如所附实例所示，在肿瘤位点处增加的毒素浓度为免疫受损的小鼠提供了延长的肿瘤抑制。因此，本文所公开的SEZ6 ADC将可能表现出有利的治疗性指数，并且可以用于治疗和/或预防所选的增殖性病症(如小细胞肺癌)或其进展或复发。
SEZ6癌症干细胞
已经假设的是，SCLC起源于支气管，部分源自肺神经内分泌细胞(Galluzzo和Bocchetta,2011；PMID:21504320)。无论这些肿瘤起源的细胞来源是什么，很明显所述肿瘤显示出分化不良的内分泌表型，通常是高度增殖和侵袭性的，并且常常过度表达神经蛋白。以其它方式可能主要局限于神经系统或在发育期间示出表达受限的这些肿瘤(其中SEZ6可以是其实例)中的神经表达标志物的所得升高可以因此为具有神经内分泌表型的肿瘤提供独特的治疗性靶标。
SEZ6表达以使得各种致瘤细胞亚群易受如本文所阐述的治疗的影响的方式与所述各种致瘤细胞亚群相关。在此方面，本发明提供了hSEZ6-1.ss1 ADC1，其对于靶向致瘤细胞特别有用，从而促进癌症的治疗、管理和/或预防。无论是通过抑制或消除致瘤细胞、修饰其潜能(例如，通过诱导的分化或小生境破坏)还是以其它方式干扰致瘤细胞影响肿瘤环境或其它细胞的能力，本发明都通过抑制肿瘤发生、肿瘤维持和/或转移和复发而允许更有效地治疗癌症。将进一步理解的是，所公开抗体的相同特性使其在治疗已证明对标准治疗方案具有抗性或难治性的复发性肿瘤方面特别有效。
可以用于评定致瘤细胞频率降低的方法包含但不限于细胞计数或免疫组织化学分析，优选地通过体外或体内有限稀释分析(Dylla等人2008,PMID:PMC2413402和Hoey等人2009,PMID:19664991)。
因此，可以使用本领域已知的技术和标志物来确定本发明的抗体减少致瘤细胞的频率的能力。在一些情况下，抗SEZ6 ADC可以将致瘤细胞的频率降低10％、15％、20％、25％、30％或甚至35％。在其它实施例中，致瘤细胞的频率降低可以为大约40％、45％、50％、55％、60％或65％。在某些实施例中，所公开的化合物可以将致瘤细胞的频率降低70％、75％、80％、85％、90％或甚至95％。应当理解的是，致瘤细胞频率的任何降低都可能使得瘤形成的致瘤性、持久性、复发性和侵袭性相应降低。
抗体结构
抗体和其变体和衍生物(包含公认的命名法和编号系统)已在以下中进行了广泛描述：例如Abbas等人(2010),《细胞与分子免疫学(Cellular and MolecularImmunology)》(第6版),W.B.桑德斯公司(W.B.Saunders Company)；或Murphey等人(2011),《詹韦氏免疫生物学(Janeway's Immunobiology)》(第8版),加兰科学(Garland Science)。
“抗体”或“完整抗体”通常是指包括通过共价二硫键和非共价相互作用保持在一起的两条重(H)多肽链和两条轻(L)多肽链的Y形四聚体蛋白。每条轻链由一个可变结构域(VL)和一个恒定结构域(CL)构成。每条重链包括一个可变结构域(VH)和恒定区，在IgG、IgA和IgD抗体的情况下，其包括三个称为CH1、CH2和CH3的结构域(IgM和IgE具有第四结构域CH4)。在IgG、IgA和IgD类别中，CH1和CH2结构域被柔性铰链区分开，所述柔性铰链区是可变长度(在各种IgG亚类中为约10到约60个氨基酸)的脯氨酸和半胱氨酸富集的区段。轻链和重链中的可变结构域均通过约12个或更多个氨基酸的“J”区连接到恒定结构域，并且重链还具有约10个另外的氨基酸的“D”区。每个类别的抗体进一步包括由配对的半胱氨酸残基形成的链间和链内二硫键。
如本文所使用的，术语“抗体”具体包含包括κ轻链的人源化IgG1单克隆抗体。
抗体的可变结构域示出从一种抗体到另一种抗体的氨基酸组成的显著变化，并且主要负责抗原识别和结合。每个轻链/重链对的可变区形成抗体结合位点，使得完整的IgG抗体具有两个结合位点(即，所述IgG抗体是二价的)。VH和VL结构域包括具有极端变异性的三个区域，其被称为高变区，或更通常地，由称为框架区(FR)的四个较少可变区框架化和分离的互补决定区(CDR)。VH区与VL区之间的非共价缔合形成Fv片段(用于“片段可变”)，所述Fv片段含有抗体的两个抗原结合位点之一。
如本文所使用的，除非另有说明，否则将氨基酸分配给每个结构域、框架区和CDR将根据由以下提供的方案之一：Kabat等人(1991)《具有免疫学意义的蛋白质序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)》(第5版),美国卫生和人类服务部(US Dept.of Health and Human Services),公共卫生署(PHS),美国国立卫生研究院(NIH),NIH公开号91-3242；Chothia等人,1987,PMID:3681981；Chothia等人,1989,PMID:2687698；MacCallum等人,1996,PMID:8876650；或Dubel,编辑(2007)《治疗性抗体手册(Handbook of Therapeutic Antibodies)》,第3版,威利-VCH出版社公司(Wily-VCHVerlag GmbH and Co)或AbM(牛津分子/MSI药典)。如本领域所熟知的，可变区残基编号通常如Chothia或Kabat中所阐述。如从Abysis网站数据库(下文)获得的包括如由Kabat、Chothia、MacCallum(也称为Contact)和AbM所定义的CDR的氨基酸残基在下表1中示出。请注意，MacCallum使用Chothia编号系统。
表1
Kabat Chothia MacCallum AbM
VHCDR1 31-35 26-32 30-35 26-35
VHCDR2 50-65 52-56 47-58 50-58
VHCDR3 95-102 95-102 93-101 95-102
VLCDR1 24-34 24-34 30-36 24-34
VLCDR2 50-56 50-56 46-55 50-56
VLCDR3 89-97 89-97 89-96 89-97
抗体序列中的可变区和CDR可以根据本领域已经开发的一般规则(例如，如上文所阐述的)或通过将序列与已知可变区的数据库比对来鉴别。用于鉴别这些区域的方法在以下中进行描述：Kontermann和Dubel,编辑,《抗体工程化(Antibody Engineering)》,施普林格出版社(Springer),纽约,纽约州(NewYork,NY),2001以及Dinarello等人,《免疫学实验指南(Current Protocols in Immunology)》,约翰·威利父子出版公司(John Wiley andSons Inc.),霍博肯,新泽西州(Hoboken,NJ),2000。抗体序列的示例性数据库在以下进行描述，并且可以通过以下进行访问：网址为www.bioinf.org.uk/abs的“Abysis”网站(由英国伦敦伦敦大学生物化学与分子生物学系的A.C.Martin维护)以及网址为www.vbase2.org的VBASE2网站，如以下中所描述的：Retter等人,《核酸研究(Nucl.Acids Res.)》,33(数据库问题):D671-D674(2005)。
优选地，使用Abysis数据库分析序列，所述数据库将来自Kabat、IMGT和蛋白质数据库(PDB)的序列数据与来自PDB的结构数据进行整合。参见Andrew C.R.Martin博士的书“抗体可变结构域的蛋白质序列和结构分析(Protein Sequence and Structure Analysisof Antibody Variable Domains)”一章。所述文献载于：《抗体工程化实验室手册(Antibody Engineering Lab Manual)》(编辑：Duebel,S.和Kontermann,R.,施普林格出版社,海德尔堡(Heidelberg),ISBN-13:978-3540413547，也可以在网站bioinforg.uk/abs上找到)。Abysis数据库网站进一步包含已开发的用于鉴别CDR的通用规则，所述规则可以根据本文的教导使用。除非另有说明，否则本文所阐述的所有CDR均根据Kabat等人的Abysis数据库网站得出。
对于本发明中讨论的重链恒定区氨基酸位置，编号是根据在以下中首先描述的Eu索引进行的：Edelman等人,1969,《美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》63(1):78-85，所述文献描述了据报道首先进行人IgG1测序的骨髓瘤蛋白Eu的氨基酸序列。Edelman的Eu索引还在Kabat等人,1991(同上)中示出。因此，在重链的上下文中，术语“在Kabat中示出的Eu索引”或“Kabat的Eu索引”或“Eu索引”或“Eu编号”是指基于如Kabat等人,1991(同上)中示出的Edelman等人的人IgG1 Eu抗体的残基编号系统。用于轻链恒定区氨基酸序列的编号系统在Kabat等人(同上)中类似地示出。
本领域技术人员将理解的是，如本文所公开的，已对hSEZ6-1.ss1抗体的重链和轻链恒定区序列进行了工程化以提供未配对的半胱氨酸。然后，使用标准分子生物学技术将这些恒定区与所公开的重链和轻链可变区可操作地缔合，以提供并入所公开的hSEZ6-1.ss1中的全长抗体链。
抗体产生与生产
如所附实例1和2所阐述的，产生人源化抗体hSEZ6-1.ss1，并且所得的全长重链和全长轻链的氨基酸序列紧接着在下文作为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4示出。如下文所讨论的，人源化抗体的重链包括被设计成使糖基化位点失活的S60N突变和在轻链上提供游离半胱氨酸的C220S突变(根据Kabat的EU索引编号)。注意，在重链中，S60N突变和C220S突变用下划线标出，而在轻链中在位置214处的所得的游离半胱氨酸用下划线标出。两条链的可变区均以粗体类型描绘。
Figure BDA0002784769840000091
Figure BDA0002784769840000101
另外，对上述全长重链和轻链进行编码的相容核酸序列分别紧接着在下文作为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6示出。
重链核酸序列(具有内含子)
gaagtccaactcgtccaatccggtgccgaagtgaaaaagcctggggaatccctgaagatcagctgcaagggatccggttactcgttcacctcctcctggattaactgggtccggcagatgcccggaaagggactggagtggatgggcagaatctatccgggcgaaggggacactaattacaacggaaacttcgagggccaggtcaccatttcggccgataagagcatctcaaccgcgtacttgcagtggtcaagcctgaaggcttccgacaccgccatgtactactgtactcgcggccttgtgatggactactggggacagggaactctcgtgaccgtgtcgtccgcctctaccaagggcccttccgtgttccctctggccccctcgagcaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgagccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttggtgagaggccagcacagggagggagggtgtctgctggaagccaggctcagcgctcctgcctggacgcatcccggctatgcagccccagtccagggcagcaaggcaggccccgtctgcctcttcacccggaggcctctgcccgccccactcatgctcagggagagggtcttctggctttttccccaggctctgggcaggcacaggctaggtgcccctaacccaggccctgcacacaaaggggcaggtgctgggctcagacctgccaagagccatatccgggaggaccctgcccctgacctaagcccaccccaaaggccaaactctccactccctcagctcggacaccttctctcctcccagattccagtaactcccaatcttctctctgcagagcccaaatctagtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccaggtaagccagcccaggcctcgccctccagctcaaggcgggacaggtgccctagagtagcctgcatccagggacaggccccagccgggtgctgacacgtccacctccatctcttcctcagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaaggtgggacccgtggggtgcgagggccacatggacagaggccggctcggcccaccctctgccctgagagtgaccgctgtaccaacctctgtccctacagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggt(SEQ ID NO:5)
轻链核酸序列
gaaatcgtgttgacccagtcccccgctaccctgtcactgagccccggagaacgcgcgactctgtcctgccgggcatcccagtccgtggactacaacggaatctcctacatgcactggtatcagcaaaagccaggccaagccccgagactgctcatctacgccgcctcgaacgtgcagagcggtattccggcgcggttctccggctcgggcagcggaaccgattttaccctcactatctcgtcacttgaacctgaggacttcgccgtgtactactgccagcagtccattgaggacccgcctactttcggggggggaaccaaagtcgagatcaagcggactgtggctgcaccaagtgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt(SEQ ID NO:6)
已经对本发明的SEZ6抗体组分进行了工程化，以促进卡奇霉素毒素的有效缀合。在此方面，本发明的抗体药物缀合物(ADC)制剂在细胞毒素在抗体上的位置和药物与抗体的比率(DAR)方面均包括相对均匀的ADC分子群体。基于本公开，本领域技术人员可以容易地制作所公开的包括SEQ ID NO:3和4的位点特异性工程化构建体。如本文所使用的，“位点特异性抗体”或“位点特异性构建体”意指其中重链或轻链中的至少一个氨基酸被缺失、改变或取代(优选被另一个氨基酸取代)以提供至少一个游离半胱氨酸的抗体。类似地，“位点特异性缀合物”应该保持意指包括位点特异性抗体和与一个或多个未配对或游离半胱氨酸缀合的至少一种细胞毒素的ADC。在本发明中，在重链的位置220处(Kabat的Eu编号)的半胱氨酸已突变为丝氨酸，从而破坏了与κ轻链恒定区的位置214处的末端半胱氨酸天然形成的二硫桥。根据本文的教导，这使得在位置214处的半胱氨酸成为然后与所公开的卡奇霉素药物接头缀合的游离或未配对的半胱氨酸。
如本文所使用的，除非上下文另有指示，否则术语“游离半胱氨酸”或“未配对的半胱氨酸”可以互换使用，并且应意指抗体的无论是天然存在的还是使用分子工程化技术特异性并入所选残基位置的半胱氨酸(或含硫醇)成分(例如，半胱氨酸残基)，在生理条件下，所述半胱氨酸成分不是天然存在的(或“天然”)二硫键的一部分。在所选的实施例中，游离半胱氨酸可以包括天然存在的半胱氨酸，其天然的链间或链内二硫桥配偶体已被取代、消除或以其它方式改变以在生理条件下破坏天然存在的二硫桥，从而使未配对的半胱氨酸适合于位点特异性缀合。应当理解的是，在缀合之前，游离的或未配对的半胱氨酸可以以硫醇(还原的半胱氨酸)、被封端的半胱氨酸(氧化的)或与相同或不同分子上的另一种半胱氨酸或硫醇基形成的非天然的分子内或分子间二硫键(氧化的)的一部分的形式存在，这取决于系统的氧化态。如下文更详细讨论的，适当工程化的抗体构建体的温和还原将提供可用于位点特异性缀合的硫醇。因此，在特别优选的实施例中，将使游离或未配对的半胱氨酸经受选择性还原并且随后缀合以提供均匀的DAR组合物。一旦“游离”或“未配对”的此类残基位置与药物接头共价结合，所述此类残基位置就不再可以称为“工程化缀合位点”。
可以使用从产生抗体的细胞和重组技术获得的基因材料来产生或修饰抗体和其片段(参见例如，Dubel和Reichert(编)(2014)《治疗性抗体手册(HandbookofTherapeuticAntibodies)》,第2版,威利-布莱克威尔出版社(Wiley-Blackwell GmbH)；Sambrook和Russell(编)(2000)《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》(第3版),纽约,冷泉港实验室出版社(Cold Spring HarborLaboratory Press)；Ausubel等人(2002)《精编分子生物学实验指南：当代分子生物学实验指南的方法概要(Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methodsfrom Current Protocols in Molecular Biology)》,约翰威立父子公司(Wiley,John&Sons,Inc.)；以及美国专利7,709,611)。
本发明的另一方面涉及对本发明的抗体进行编码的核酸分子。核酸可以存在于全细胞中、细胞溶解产物中或以部分纯化或基本上纯的形式存在。当通过标准技术而与其它细胞组分或其它污染物(例如，其它细胞核酸或蛋白)分开时，核酸是“分离的”或使得基本上纯的，所述标准技术包含碱/SDS处理、CsCl条带、柱色谱法、琼脂糖凝胶电泳以及其它本领域熟知的技术。本发明的核酸可以是例如单链或双链DNA(例如，基因组DNA、cDNA)、RNA和其人工变体(例如，肽核酸)或RNA、RNA，并且可以含有或可以不含有内含子。在所选的实施例中，核酸是cDNA分子。
本发明的核酸可以使用标准分子生物学技术获得。对于由杂交瘤表达的抗体(例如，如以下实例所描述而制备的杂交瘤)，可以通过标准PCR扩增或cDNA克隆技术获得对抗体的轻链和重链进行编码的cDNA。对于从免疫球蛋白基因文库获得的抗体(例如，使用噬菌体展示技术)，可以从文库中回收对抗体进行编码的核酸分子。
对VH和VL区段进行编码的DNA片段可以通过标准重组DNA技术进一步操纵，例如以将可变区基因转化为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操纵中，对VL或VH进行编码的DNA片段可操作地连接到对另一种蛋白质(如抗体恒定区或柔性接头)进行编码的另一个DNA片段。如在此上下文中所使用的，术语“可操作地连接”意指将两个DNA片段连接，使得由这两个DNA片段编码的氨基酸序列保持在框内。
通过将对VH进行编码的DNA与对重链恒定区(在IgG1的情况下为CH1、CH2和CH3)进行编码的另一个DNA分子可操作地连接，可以将对VH区进行编码的分离的DNA转化为全长重链基因。人重链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如，Kabat等人(1991)(同上))，并且可以通过标准PCR扩增来获得涵盖这些区域的DNA片段。
通过将对VL进行编码的DNA与对轻链恒定区CL进行编码的另一个DNA分子可操作地连接，可以将对VL区进行编码的分离的DNA转化为全长轻链基因。人轻链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如，Kabat等人(1991)(同上))，并且可以通过标准PCR扩增来获得涵盖这些区域的DNA片段。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区，但最优选地是κ恒定区。
在每种情况下，VH或VL结构域可以可操作地连接到其相应的恒定区(CH或CL)，其中所述恒定区是位点特异性恒定区并且提供位点特异性抗体。在所选的实施例中，所得的位点特异性抗体将包括CL结构域中的两个未配对的半胱氨酸。
为了长期、高产率地生产重组蛋白，稳定表达是优选的。因此，可以使用标准技术公认的技术来工程化稳定表达所选抗体的细胞系，并且所述细胞系形成本发明的一部分。可以使用由适当的表达控制元件(例如，启动子或增强子序列、转录终止子、多腺苷酸化位点等)控制的DNA以及可选标志物来转化宿主而不使用含有病毒复制起点的表达载体来转化宿主细胞。可以使用本领域熟知的选择系统中的任何选择系统，包含提供了用于在所选条件下增强表达的有效方法的谷氨酰胺合成酶基因表达系统(GS系统)。结合EP 0 216846、EP 0 256 055、EP 0 323 997和EP 0 338 841以及美国专利第5,591,639号和第5,879,936号，整体或部分地讨论了GS系统。用于开发稳定细胞系的另一种相容表达系统是FreedomTM CHO-S试剂盒(生命技术公司(Life Technologies))。
一旦通过重组表达或所公开的技术中的任何其它技术产生了本发明的抗体，就可以通过本领域已知的方法纯化或分离本发明的抗体，因为其被鉴别并从其天然环境中分离和/或回收，并且与会干扰抗体或相关ADC的诊断或治疗用途的污染物分离。分离的抗体包含重组细胞内的原位抗体。
这些分离的制剂可以使用各种本领域公认的技术进行纯化，例如离子交换和尺寸排阻色谱法、透析、渗滤和亲和色谱法，特别是蛋白A或蛋白G亲和色谱法。
抗体缀合物
如上文所讨论的，本发明的抗体与两种卡奇霉素毒素缀合以形成“抗体药物缀合物”(ADC)或“抗体缀合物”。术语“缀合物”被广泛使用，并且意指卡奇霉素与本发明的抗体的共价缔合。在本文中，缔合是通过轻链恒定区的位置214处的半胱氨酸残基实现的。
应当理解的是，本发明的ADC可以用于选择性地将预定的卡奇霉素弹头递送到致瘤细胞和/或表达SEZ6的细胞。如本文所述，术语“药物”或“弹头”可以互换地使用，并且将意指卡奇霉素分子。“有效负载”包括卡奇霉素与不可切割的接头化合物的组合，所述接头化合物提供稳定的药物复合物，直到ADC到达靶标为止。式II(如上文所述)是具有卡奇霉素弹头的示例性有效负载。
在优选的实施例中，在释放和活化卡奇霉素毒素之前，所公开的ADC将以相对无反应性、无毒的状态将结合的有效负载(例如，式II)引导到靶标位点。弹头的这种有靶向性的释放优选地通过有效负载的稳定缀合和使过缀合的有毒ADC物种最少化的ADC制剂的相对均匀的组合物来实现。与被设计成在递送到肿瘤位点时释放弹头的特别稳定的不可切割的药物接头偶联，本发明的缀合物可以显著降低不期望的非特异性毒性。这有利地在肿瘤位点处提供相对较高水平的活性细胞毒素，同时使非靶向细胞和组织的暴露最小化，从而提供增强的功效。
本发明的缀合物通常可以由式III表示：
Ab-[L-D]n
其中：
a)Ab包括具有SEQ ID NO:3的重链和SEQ ID NO:4的轻链的抗SEZ6抗体；
b)[L-D]包括与Ab共价连接的式II接头药物；并且
c)n为2。
在一些优选的实施例中，本发明包括使用与如本文所描述的温和的还原剂组合的稳定剂，将卡奇霉素有效负载与游离半胱氨酸选择性缀合。此类反应条件倾向于提供更均匀的制剂，其具有更少的非特异性缀合和污染物，并且相应地具有更低的毒性。
卡奇霉素弹头
如本文所讨论的，本发明的抗体与卡奇霉素毒素缀合。也就是说，本发明的所公开的SEZ6ADC可以包括式Ab-[L-D]n(式III)或其药学上可接受的盐，其中在本文所提供的分子结构中的任何分子结构中，D是卡奇霉素或其类似物。如本领域中已知的，卡奇霉素是一类源自细菌棘孢小单孢菌的烯二炔抗肿瘤抗生素，包含分离和表征的卡奇霉素γ1 I、卡奇霉素β1 Br、卡奇霉素γ1 Br、卡奇霉素α2 I、卡奇霉素α3 I、卡奇霉素β1 i和卡奇霉素δ1 i。前述卡奇霉素类似物中的每种类似物的结构是本领域熟知的(例如参见，Lee等人,《抗生素杂志(Journalof Antibiotics)》,1989年7月，所述文献通过全文引用的方式并入本文)，并且与本文所公开的卡奇霉素药物接头构建体和抗体药物缀合物相容。
通常，卡奇霉素γ1含有两个不同的结构区，每个结构区在化合物的生物活性中发挥具体作用。两个结构区中较大的结构区由延伸的糖残基组成，所述糖残基包括四个单糖单元和一个六取代的苯环；这些通过非常不寻常的一系列糖苷键、硫酯键和羟胺键连接在一起。第二结构区，即糖苷配基(称为卡奇霉素1(calicheamicinone))，含有紧凑的高度官能化的双环核，所述双环核在桥连式10元环内容纳受压的烯二炔单元。此糖苷配基亚基进一步包括烯丙基三硫化物，如下文所描述的，所述烯丙基三硫化物用作活化剂以产生分子的细胞毒性形式。
通过实例的方式，紧接着以下在式IV中示出了三硫化物卡奇霉素γ1 I的结构：
Figure BDA0002784769840000171
如本文所使用的，术语“卡奇霉素”应被理解为意指卡奇霉素γ1 I、卡奇霉素β1 Br、卡奇霉素γ1 Br、卡奇霉素α2 I、卡奇霉素α3 I、卡奇霉素β1 i和卡奇霉素δ1以及其N-乙酰基衍生物、硫化物类似物和类似物中的任何一种。因此，如本文所使用的，术语“卡奇霉素”应理解为涵盖自然界中发现的任何卡奇霉素以及具有二硫部分的卡奇霉素分子，所述二硫部分具有与另一个分子(例如，抗体药物缀合物)和其类似物的连接点。通过实例的方式，如本文所使用的，卡奇霉素γI应理解为解释为包括以下分子：
Figure BDA0002784769840000181
以及
Figure BDA0002784769840000182
其中R1是如以下所定义的。
应当理解的是，上述化合物中的任何化合物都与本文的教导相容，并且可以用于制作所公开的卡奇霉素药物接头构建体和抗体药物缀合物。在某些实施例中，如式II中所示，所公开的抗体药物缀合物的卡奇霉素组分将包括N-乙酰基卡奇霉素γ1 I(N-Ac卡奇霉素)。
卡奇霉素靶向核酸并且引起链断裂，从而杀死靶细胞。更具体地，已经发现卡奇霉素结合DNA的小沟，其中卡奇霉素然后进行类似于Bergman环化的反应以产生双自由基物种。在此方面，芳基四糖亚基用于将药物递送到其靶标，从而与双螺旋DNA的小沟紧密结合，如Crothers等人(1999)所证明的。当亲核体(例如，谷胱甘肽)攻击三硫基的中心硫原子时，其会引起结构几何形状发生重大变化，并且在10元烯二炔环上施加很大的应变。通过烯二炔经历环合芳构化反应，产生高反应性的1,4-苯型双自由基，并且通过从脱氧核糖DNA主链吸引氢原子导致链断裂而最终导致DNA切割，从而完全缓解了此应变。注意，在本发明的卡奇霉素二硫化物类似物构建体中，亲核体切割受保护的二硫键以产生所期望的双自由基。
更特别地，应理解的是，D明确包括本领域已知的卡奇霉素类的任何成员，其中末端--S-S-S-CH3部分可以被
Figure BDA0002784769840000191
替代，其中符号
Figure BDA0002784769840000192
表示接头的连接点。
因此，在某些实施例中，D具有式V，
Figure BDA0002784769840000193
其中R1是氢、卤素、经取代或未经取代的烷基、经取代或未经取代的杂烷基、经取代或未经取代的环烷基、经取代或未经取代的杂环烷基、经取代或未经取代的芳基或经取代或未经取代的杂芳基、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-C(O)R1E、-OR1A、-NR1BR1C、-C(O)OR1A、-C(O)NR1BR1C、-SR1D、-SOn1R1B或–SOv1NR1BR1C。在某些所选的实施例中，R1将包括H。在其它所选的实施例中，R1将包括-C(O)CH3。
R1A、R1B、R1C、R1D和R1E独立地为氢、卤素、–CF3、–CCl3、–CBr3、–CI3、–OH、–NH2、–COOH、–CONH2、–N(O)2、–SH、-S(O)3H、-S(O)4H、-S(O)2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHS(O)2H、-NHC(O)H、-NHC(O)-OH、–NHOH、–OCF3、–OCCl3、–OCBr3、–OCI3、–OCHF2、–OCHCl2、–OCHBr2、–OCHI2、经取代或未经取代的烷基、经取代或未经取代的杂烷基、经取代或未经取代的环烷基、经取代或未经取代的杂环烷基、经取代或未经取代的芳基或经取代或未经取代的杂芳基。
在一些实施例中，与相同氮原子结合的R1B和R1C取代基可以任选地连接以形成经取代或未经取代的杂环烷基或经取代或未经取代的杂芳基。符号n1独立地是0到4的整数，符号v1独立地是1或2，并且符号
Figure BDA0002784769840000201
表示接头的连接点。
关于式V，应理解的是，所展示的化合物包括优选地与二硫保护基团(在由
Figure BDA0002784769840000202
表示的连接点处)结合的二硫化物卡奇霉素类似物(例如，N-乙酰基卡奇霉素类似物，如式II所示)，所述二硫保护基团与接头的其余部分共价结合。二硫保护基团改善了血流中二硫键的稳定性，并且允许有效合成所公开的卡奇霉素-接头构建体。在某些实施例中，卡奇霉素二硫基团优选地受提供稳定性(例如，血浆稳定性)的短链的经取代或未经取代的双官能脂肪族或芳基(“二硫保护基团”)保护，直到ADC到达靶标细胞为止。更具体地，二硫保护基团的构型为二硫键提供了一定的空间位阻，从而降低了其通过硫醇-二硫化物交换反应切割的敏感性。在此位置中，二硫保护基团将卡奇霉素二硫基团与不可切割的接头的其余部分共价连接。
到达靶标(例如，癌细胞)后，优选地将接头切断或降解以释放通过二硫保护基团与接头的一部分连接的卡奇霉素。在某些实施例中，一旦接头最初被切割超出二硫保护基团(即，距卡奇霉素的远端)，则与卡奇霉素连接的接头的其余部分将在生理条件下降解到二硫键被切断(优选地在细胞内)的程度，然后进行重新布置并形成活性双自由基卡奇霉素物种。卡奇霉素弹头的这种形式与细胞DNA的小沟结合并且诱导期望的细胞毒性作用(参见Walker等人,《生物化学(Biochemistry)》89:4608-4612,5/92，所述文献通过全文引用的方式并入本文)。
接头化合物
如上所述，与本发明相容的有效负载包括一个或多个弹头和使弹头与抗体靶向剂缔合的不可切割的接头。相容的不可切割的接头通过二硫部分与抗体上的反应性残基(优选地为半胱氨酸或赖氨酸)和卡奇霉素共价结合。
在特别优选的实施例中，接头将包括所选的不可切割的接头。在某些实施例中，ADC将包括相容的不可切割的接头，所述接头含有在靶标细胞内的ADC的溶酶体降解期间释放卡奇霉素有效负载的酰胺连接的聚乙二醇或烷基间隔物。式II中使用的特别相容的不可切割的接头紧接着在下文的式VII中示出，其中波浪线指示与卡奇霉素的二硫基团的连接点。
Figure BDA0002784769840000211
包含接头组分的式II的合成在以下实例3中示出，其中伴有条件。
缀合
用于将治疗性化合物与半胱氨酸残基缀合的各种方法是本领域已知的，并且对技术人员而言是显而易见的。在碱性条件下，半胱氨酸残基将被去质子化以产生硫醇盐亲核体，所述硫醇盐亲核体可以与如马来酰亚胺和碘乙酰胺等软亲电体反应。通常，用于此类缀合的试剂可以与半胱氨酸硫醇直接反应以形成缀合蛋白，或者可以与接头药物反应以形成接头药物中间体。在接头的情况下，本领域技术人员已知采用有机化学反应、条件和试剂的几种途径，包含：(1)使本发明的蛋白质的半胱氨酸基团与接头试剂反应以通过共价键形成蛋白质接头中间体，然后与活化的化合物反应；以及(2)使化合物的亲核基团与接头试剂反应以通过共价键形成药物接头中间体，然后与本发明的蛋白质的半胱氨酸基团反应。
在缀合之前，可以通过用还原剂(如二硫苏糖醇(DTT)或三(2-羧乙基)膦(TCEP))处理使抗体具有反应性以与接头试剂缀合。在其它实施例中，通过赖氨酸与试剂(包含但不限于2-亚氨基硫烷(Traut's试剂)、SATA、SATP或SAT(PEG)4)的反应，可以将另外的亲核基团引入到抗体中，从而将胺转化为硫醇。
缀合试剂通常包含马来酰亚胺、卤代乙酰基、碘乙酰胺琥珀酰亚胺酯、异硫氰酸酯、磺酰氯、2,6-二氯三嗪基、五氟苯基酯和亚磷酰胺，但是也可以使用其它官能团。在某些实施例中，方法包含例如使用马来酰亚胺、碘乙酰亚胺或卤代乙酰基/烷基卤化物、氮丙啶、丙烯酰基衍生物与半胱氨酸的硫醇反应以产生与化合物反应的硫醚。游离硫醇与活化的吡啶基二硫化物的二硫化物交换也可用于制备缀合物(例如，使用5-硫-2-硝基苯甲(TNB)酸)。优选地，使用马来酰亚胺。
如上文所讨论的，位点特异性抗体或工程化抗体允许至少部分由于提供一个或多个工程化的游离半胱氨酸位点和/或本文所阐述的新颖的缀合程序而表现出增强的稳定性和基本均匀性的缀合物制剂。与完全或部分还原链内或链间抗体二硫键中的每个以提供缀合位点(并且与本发明完全相容)的常规缀合方法不同，本发明另外提供了某些制备的游离半胱氨酸位点的选择性还原和药物接头与其的连接。
在这方面，将理解的是，由工程化位点和选择性还原促进的缀合特异性允许在期望的位置处高百分比的定点缀合。明显地，这些缀合位点中的一些缀合位点(如存在于轻链恒定区的末端区中的那些)通常难以有效地缀合，因为所述缀合位点倾向于与其它游离半胱氨酸交叉反应。然而，通过分子工程化和选择性还原所得的游离半胱氨酸，可以获得高效的缀合率，这大大降低了不需要的高DAR污染物和非特异性毒性。更通常地，工程化构建体和所公开的包括选择性还原的新颖的缀合方法提供了具有改善的药代动力学和/或药效动力学以及潜在地改善的治疗指数的ADC制剂。
在某些实施例中，位点特异性构建体呈现一种或多种游离半胱氨酸，当还原时，所述一种或多种游离半胱氨酸包括亲核的并且能够与接头部分(如上文所公开的那些)上的亲电基团反应形成共价键的硫醇基团。如上文所讨论的，本发明的抗体优选地具有可还原的未配对链间半胱氨酸，即提供此类亲核基团的半胱氨酸。因此，在某些实施例中，还原的游离半胱氨酸的游离巯基与相容性药物接头的末端马来酰亚胺基或卤代乙酰胺基的反应将提供期望的缀合。在此类情况下，可以通过用还原剂(如二硫苏糖醇(DTT)或三(2-羧乙基)膦(TCEP))处理使抗体的游离半胱氨酸具有反应性以与接头试剂缀合。因此，每个游离半胱氨酸理论上将呈现反应性硫醇亲核体。尽管此类试剂与本发明特别相容，但是应当理解的是，可以使用本领域技术人员通常已知的各种反应、条件和试剂来实现位点特异性抗体的缀合。
另外，已经发现工程化抗体的游离半胱氨酸可以被选择性地还原以提供增强的定点缀合和减少不需要的、潜在的毒性污染物。更具体地，已发现如精氨酸等“稳定剂”可以调节蛋白质中的分子内和分子间相互作用，并且可以与所选的还原剂(优选地相对温和)结合使用，以选择性地还原游离半胱氨酸并且促进如本文所阐述的位点特异性缀合。如本文所使用的，术语“选择性还原”或“选择性地还原”可以互换使用，并且应意指一种或多种游离半胱氨酸的还原而基本上不破坏工程化抗体中存在的天然二硫键。在所选的实施例中，此选择性还原可以通过使用某些还原剂或某些还原剂浓度来实现。在其它实施例中，工程化构建体的选择性还原将包括与还原剂(包含温和还原剂)结合使用稳定剂。将理解的是，术语“选择性缀合”应意指在存在本文所描述的细胞毒素的情况下已经选择性地还原的工程化抗体的缀合。在此方面，将此类稳定剂(例如，精氨酸)与所选的还原剂组合使用可以显著提高位点特异性缀合的效率，如通过重抗体链和轻抗体链上的缀合程度和制剂的DAR分布所确定的。相容的抗体构建体以及选择性缀合技术和试剂在WO2015/031698中广泛公开，所述文献关于此类方法和构建体被明确地并入本文。
尽管不希望受到任何特定理论的束缚，但此类稳定剂可以用于调节静电微环境和/或调节期望的缀合位点处的构象变化，从而允许使用相对温和的还原剂(其不会实质性地还原完整的天然二硫键)以促进在一个或多个期望的游离半胱氨酸位点处的缀合。已知此类试剂(例如，某些氨基酸)会形成盐桥(通过氢键和静电相互作用)，并且可以以赋予稳定作用的方式调节蛋白质-蛋白质相互作用，从而可能引起有利的构象变化和/或降低不利的蛋白质-蛋白质相互作用。此外，此类试剂可以在还原后用于抑制不期望的分子内(和分子间)半胱氨酸-半胱氨酸键的形成，从而促进期望的缀合反应，其中工程化位点特异性半胱氨酸与药物结合(优选地通过接头)。由于选择性还原条件不能使完整的天然二硫键显著还原，因此随后的缀合反应自然被驱动到游离半胱氨酸上相对较少的反应性硫醇(例如，每个抗体优选地2个游离硫醇)。如先前所提及的，此类技术可以用于显著降低根据本公开制作的缀合物制剂中的非特异性缀合和对应的不需要的DAR物种的水平。
在所选的实施例中，与本发明相容的稳定剂通常将包括具有至少一个具有碱性pKa的部分的化合物。在某些实施例中，所述部分将包括伯胺，而在其它实施例中，胺部分将包括仲胺。在仍其它实施例中，胺部分将包括叔胺或胍基。在其它所选的实施例中，胺部分将包括氨基酸，而在其它相容的实施例中，胺部分将包括氨基酸侧链。在又其它实施例中，胺部分将包括蛋白原氨基酸。在仍其它实施例中，胺部分包括非蛋白原氨基酸。在一些实施例中，相容的稳定剂可以包括精氨酸、赖氨酸、脯氨酸和半胱氨酸。在某些优选的实施例中，稳定剂将包括精氨酸。另外，相容的稳定剂可以包含胍和具有碱性pKa的含氮杂环。
在某些实施例中，相容的稳定剂包括具有至少一个pKa大于约7.5的胺部分的化合物，在其它实施例中，主题胺部分的pKa将大于约8.0，在又其它实施例中，胺部分的pKa大于约8.5，并且在仍其它实施例中，稳定剂将包括pKa大于约9.0的胺部分。其它实施例将包括其中胺部分的pKa大于约9.5的稳定剂，而某些其它实施例将包括表现出至少一个胺部分的pKa大于约10.0的稳定剂。在仍其它实施例中，稳定剂将包括胺部分的pKa大于约10.5的化合物，在其它实施例中，稳定剂将包括胺部分的pKa大于约11.0的化合物，而在仍其它实施例中，稳定剂将包括pKa大于约11.5的胺部分。在又其它实施例中，稳定剂将包括胺部分的pKa大于约12.0的化合物，而在仍其它实施例中，稳定剂将包括pKa大于约12.5的胺部分。本领域技术人员将理解的是，可以使用标准技术容易地计算或确定相关的pKa，并且相关pKa用于确定使用所选的化合物作为稳定剂的适用性。
当与某些还原剂组合时，示出所公开的稳定剂在与游离位点特异性半胱氨酸靶向缀合上特别有效。出于本发明的目的，相容的还原剂可以包含产生用于缀合的还原的游离位点特异性半胱氨酸而不会显著破坏工程化抗体的天然二硫键的任何化合物。在优选地由所选的稳定剂和还原剂的组合提供的此类条件下，活化的药物接头在很大程度上限于与一个或多个期望的游离位点特异性半胱氨酸位点的结合。相对温和的还原剂或以相对低的浓度使用以提供温和条件的还原剂是特别优选的。如本文所使用的，术语“温和还原剂”或“温和还原条件”应保持为意指由在一个或多个游离半胱氨酸位点处提供硫醇而基本上不破坏工程化抗体中存在的天然二硫键的还原剂(任选地在稳定剂存在下)引起的任何试剂或状态。也就是说，温和的还原剂或条件(优选地与稳定剂组合)能够有效还原一种或多种游离半胱氨酸(提供硫醇)，而不会显著破坏蛋白质的天然二硫键。可以由建立了用于选择性缀合的适当环境的许多基于巯基的化合物提供期望的还原条件。在实施例中，温和的还原剂可以包括具有一种或多种游离硫醇的化合物，而在一些实施例中，温和的还原剂将包括具有单一游离硫醇的化合物。与本发明的选择性还原技术相容的还原剂的非限制性实例包括谷胱甘肽、正乙酰半胱氨酸、半胱氨酸、2-氨基乙烷-1-硫醇和2-羟基乙烷-1-硫醇。
将进一步理解的是，能够缀合的工程化抗体可以含有游离的半胱氨酸残基，所述游离的半胱氨酸残基包括在产生或储存抗体时被封闭或封端的巯基。此类帽包含小分子、蛋白质、肽、离子和与巯基相互作用并且防止或抑制缀合物形成的其它材料。在一些情况下，未缀合的工程化抗体可以包括与相同或不同抗体上的其它游离半胱氨酸结合游离半胱氨酸。如本文所讨论的，此类交叉反应性可能在制作程序期间导致各种污染物。在一些实施例中，在缀合反应之前，可能需要将工程化抗体解封端。在具体实施例中，本文的抗体是解封端的并且显示能够缀合的游离巯基。在具体实施例中，使本文的抗体进行不会干扰或重新布置天然存在的二硫键的解封端反应。应当理解的是，在大多数情况下，解封端反应将在正常还原反应(还原或选择性还原)期间发生。
DAR分布与纯化
在所选的实施例中，与本发明相容的缀合和纯化方法有利地提供了产生包括窄DAR分布的相对均匀的ADC制剂的能力。在此方面，所公开的构建体(例如，位点特异性构建体)和/或选择性缀合提供了根据药物与工程化抗体之间的化学计量比率以及相对于毒素位置的样品内ADC物种的均匀性。如上文简要讨论的，术语“药物与抗体的比率”或“DAR”是指ADC制剂中药物与抗体的摩尔比。在某些实施例中，缀合物制剂就其DAR分布而言可以是基本上均匀的，这意指在ADC制剂内是具有相对于负载位点(即，在游离半胱氨酸上)也是一致的特定载药量(例如，载药量为2)的位点特异性ADC的主要物种。在本发明的其它某些实施例中，通过使用位点特异性抗体和/或选择性还原和缀合，可以实现期望的均匀性。在其它实施例中，通过使用与选择性还原组合的位点特异性构建体，可以实现期望的均匀性。在又其它实施例中，可以使用分析或制备色谱技术纯化相容的制剂以提供期望的均匀性。在这些实施例中的每个实施例中，可以使用本领域已知的各种技术来分析ADC样品的均匀性，所述技术包含但不限于质谱分析、HPLC(例如，尺寸排阻HPLC、RP-HPLC、HIC-HPLC等)或毛细管电泳。
关于ADC制剂的纯化，应当理解的是，可以采用标准的药物制备方法来获得期望的纯度。如本文所讨论的，液相色谱法如反相(RP)和疏水相互作用色谱法(HIC)可以通过载药量值来分离混合物中的化合物。在一些情况下，也可以使用离子交换(IEC)或混合模式色谱法(MMC)来分离具有具体载药量的物种。
在任何情况下，所公开的ADC和其制剂可以包括各种化学计量摩尔比的药物和抗体部分，这取决于抗体的构型，并且至少部分地取决于用于实现缀合的方法。在某些优选的实施例中，每ADC的载药量可以包括2个卡奇霉素弹头。
尽管本发明提供了相对较高水平的均匀性，但是所公开的组合物实际上包括缀合物与一系列药物化合物的混合物。如此，所公开的ADC组合物包含缀合物的混合物，其中大多数构成抗体与一个或多个药物部分(尽管工程化构建体和选择性还原提供了相对的缀合物特异性)共价连接，其中药物部分可以通过各种硫醇基团与抗体连接。也就是说，在缀合后，本发明的组合物将包括处于各种浓度的具有不同载药量的ADC的混合物(以及主要由游离半胱氨酸交叉反应性引起的某些反应污染物)。然而，使用选择性还原和制作后纯化，可以将缀合物组合物驱动到以下程度：所述缀合物组合物主要含有单一主要的期望的ADC物种(例如，载药量为2)和相对较低水平的其它ADC物种(例如，载药量为1、4、6等)。平均DAR值表示整个组合物(即，所有ADC物种加在一起)的载药量的加权平均值。本领域技术人员将理解，可接受的DAR值或规格通常被表示为平均值、范围或分布(即，平均DAR为2+/-0.5)。优选地，包括在范围(即1.5到2.5)内的测量的平均DAR的组合物将用于药物配置。
因此，在一些实施例中，本发明将包括平均DAR为2+/-0.5的组合物。在其它实施例中，本发明将包括2+/-0.4的平均DAR或2+/-0.3的DAR或2+/-0.2的DAR。在其它实施例中，IgG1缀合物组合物将优选地包括具有相对较低水平(即，小于30％)的非主要ADC物种(例如，载药量为0、1、3、4、5等的ADC)的组合物。在一些实施例中，ADC组合物将包括2+/-0.4的平均DAR以及相对较低水平(<30％)的非主要ADC物种。在一些实施例中，ADC组合物将包括2+/-0.3的平均DAR以及相对较低水平(<30％)的非主要ADC物种。在又其它实施例中，当相对于组合物中存在的所有其它DAR物种进行测量时，主要的ADC物种(例如，载药量为2)将以大于50％的浓度、以大于55％的浓度、以大于60％的浓度、以大于65％的浓度、以大于70％的浓度、以大于75％的浓度、以大于80％的浓度、以大于85％的浓度、以大于90％的浓度、以大于93％的浓度、以大于95％的浓度或甚至以大于97％的浓度存在。
如以下实例中详述的，来自缀合反应的ADC的制剂中每种抗体的药物的分布可以通过常规手段如UV-Vis分光光度法、反相HPLC、HIC、质谱、ELISA和电泳来表征。还可以确定ADC在每种抗体的药物方面的定量分布。
药物制剂和治疗性用途
可以使用本领域公认的技术以各种方式调配本发明的抗体或ADC。在一些实施例中，本发明的治疗性组合物可以纯净地或与最小量的另外组分一起施用，而其它组分可以任选地调配成含有适合的药学上可接受的载剂。如本文所使用的，“药学上可接受的载剂”包括本领域公知的赋形剂、媒剂、佐剂和稀释剂。
剂量和给药方案
特定的剂量方案，即剂量、时程和重复，将取决于特定的个体，以及如药代动力学(例如，半衰期、清除率等)等经验考虑。施用频率可以由本领域技术人员如主治医生基于对所治疗的病状和病状的严重性、所治疗的受试者的年龄和总体健康状况等的考虑来确定。可以基于所选的组合物的功效和给药方案的评定在治疗过程中调节施用频率。可以基于具体疾病、病症或病状的标志物进行此类评定。在个体患有癌症的实施例中，这些包含通过触诊或视觉观察来直接测量肿瘤大小；通过x射线或其它成像技术间接测量肿瘤大小；通过直接肿瘤活检和肿瘤样品的显微镜检查评定的改善；根据本领域公认的技术对间接肿瘤标志物或所鉴别的抗原的测量；减少增殖或致瘤细胞的数量、维持此类赘生性细胞的减少；减少赘生性细胞的增殖；或延迟转移的发展。
适应症
本发明提供了本发明的ADC用于治疗各种赘生性病症的用途。在某些实施例中，要治疗的疾病是包括实体瘤的赘生性病状。在所选的实施例中，本发明的ADC将用于治疗表达SEZ6决定簇的肿瘤或致瘤细胞。在某些其它实施例中，所公开的ADC将用于治疗患有小细胞肺癌(SCLC)的受试者。优选地，要治疗的“受试者”或“患者”将是人类，但是如本文所使用的，术语被明确地认为包括任何哺乳动物物种。
在所选的实施例中，ADC可以施用于表现出有限阶段疾病或广泛阶段疾病的小细胞肺癌患者。在其它实施例中，所公开的ADC将被施用于难治性患者(即，那些在完成初始治疗过程期间或之后不久疾病复发的患者)；敏感性患者(即，复发时间长于初级治疗后2-3个月的患者)；或对铂类药剂(例如，卡铂、顺铂、奥沙利铂)和/或紫杉烷(例如，多西紫杉醇、紫杉醇、拉罗他赛或卡巴他赛)表现出抗性的患者。在某些优选的实施例中，可以将本发明的SEZ6 ADC施用于一线患者。在其它实施例中，可以将本发明的SEZ6 ADC施用于二线患者。在仍其它实施例中，可以将本发明的SEZ6 ADC施用于三线患者或四线患者。
制品
本发明包含包括一个或多个容器或贮器的药物包和试剂盒，其中容器可以包括一个或多个剂量的本发明的ADC。在某些实施例中，所述包或试剂盒含有单位剂量，意指预定量的组合物，所述组合物包括例如本发明的ADC，具有或不具有一种或多种另外的试剂以及任选地一种或多种抗癌试剂。
当试剂盒的组分以一种或多种液体溶液的形式提供时，水溶液或非水溶液(但通常地，水溶液)是优选的，其中特别优选地是无菌水溶液。试剂盒中的调配物也可以以可以在添加适当液体后重构的一种或多种干粉或冻干形式提供。用于重构的液体可以容纳在单独的容器中。此类液体可以包括一种或多种无菌、药学上可接受的缓冲液或一种或多种其它稀释剂，如用于注射的抑菌水。在试剂盒包括与另外的治疗剂或试剂组合的本发明的ADC情况下，溶液可以以摩尔当量组合预先混合或与超过另一组分的一种组分预先混合。可替代地，本发明的ADC和任何任选的抗癌剂或其它试剂可以在施用于患者之前单独地维持在不同的容器中。
在某些优选的实施例中，并入有本发明的组合物的上述试剂盒将包括指示试剂盒内容物可以用于治疗癌症的标签、标志物、包装插入物、条形码和/或阅读器。在其它优选的实施例中，试剂盒可以包括指示试剂盒内容物可以根据某种剂量或给药方案施用以治疗患有癌症的受试者的标签、标志物、包装插入物、条形码和/或阅读器。在其它特别优选的方面，标签、标志物、包装插入物、条形码和/或阅读器指示试剂盒内容物可以用于治疗小细胞肺癌或用于治疗小细胞肺癌的给药方案。
适合的容器或贮器包含例如瓶子、小瓶、注射器、输注袋(静脉注射(i.v.)袋)等。容器可以由各种材料(如玻璃或药学上相容的塑料)制成。在某些实施例中，一个或多个贮器可以包括无菌进入端口。例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有可以被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶。
在一些实施例中，试剂盒可以含有一种用于通过其向患者施用ADC和任何任选组分的装置，例如一个或多个针或注射器(预填充或空)或其它类似的设备，可以将调配物从所述设备中注射或引入到受试者中或应用于身体的病变区域。本发明的试剂盒通常还将包含用于以紧密封闭的方式容纳小瓶或类似物以及其它组分以用于商业销售的装置，例如将期望的小瓶和其它设备放入其中并且保留在其中的吹塑成型的塑料容器。
混杂物
除非本文另外定义，否则结合本发明使用的科学和技术术语应当具有本领域的普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另外要求，否则单数术语应当包含复数含义并且复数术语应当包含单数含义。另外，说明书和所附权利要求书中提供的范围包含端点和端点之间的所有点。因此，2.0到3.0的范围包含2.0、3.0以及2.0与3.0之间的所有点。
通常，本文所描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和化学的技术是本领域熟知的和常用的。本文结合此类技术使用的命名法在本领域中也是常用的。除非另外说明，否则通常根据本领域熟知的常规方法以及如在本说明书通篇引用各种参考文献中所描述的方法进行本发明的方法和技术。
参考文献
本文引用的所有专利、专利申请和公开以及可电子获得的材料(包含例如，例如GenBank和RefSeq中的核苷酸序列提交，以及例如SwissProt、PIR、PRF、PDB中的氨基酸序列提交，以及GenBank和RefSeq中带注释的编码区的翻译)的完整公开内容均通过引用并入，无论短语“通过引用并入”是否相对于特定参考文献使用。仅出于清楚理解的目的给出了前述详细描述和以下实例。不应将其理解成不必要的限制。本发明不限于所示出和描述的确切细节。对于本领域技术人员显而易见的变化包含在由权利要求书限定的本发明中。本文使用的任何章节标题仅用于组织目的，而不应被解释为限制所描述的主题。
实例
通过参考以下实例，将更容易地理解上文总体上描述的本发明，所述实例是通过说明的方式提供的，并不旨在限制本发明。实例不旨在表示以下实验是所进行的全部或仅有的实验。除非另外指明，否则份数是重量份，分子量是重均分子量，温度是摄氏度，并且压力是在大气压下或接近大气压。
序列表概述
表2提供了本文包含的氨基酸和核酸序列的概述。
表2
SEQ ID NO 描述
1 癫痫发作蛋白6同源同种型1前体(NP_849191)
2 癫痫发作蛋白6同源同种型2前体(NP_001092105)
3 hSEZ6-1.ss1重链蛋白质序列
4 hSEZ6-1.ss1轻链蛋白质序列
5 对包含内含子的hSEZ6-1.ss1重链蛋白质序列进行编码的核酸序列
6 对hSEZ6-1.ss1轻链蛋白质序列进行编码的核酸序列
实例1：产生SEZ6抗体
根据本文的教导，通过人SEZ6-Fc接种而产生SEZ6小鼠抗体。在此方面，使用三个小鼠品系来产生高亲和力鼠类单克隆抗体调节剂，所述调节剂可以用于与人SEZ6(例如，NP_849191：癫痫发作蛋白6同源同种型1前体；NP_001092105：癫痫发作蛋白6同源同种型2前体)缔合和/或抑制其作用，以预防和/或治疗各种增生性病症。具体地，将Balb/c、CD-1和FVB小鼠品系用人重组SEZ6-Fc免疫并且用于产生杂交瘤。
SEZ6-Fc抗原从来自过表达SEZ6-Fc构建体的CHO-S细胞的上清液中纯化。使用10μg的SEZ6-Fc免疫原进行第一次免疫，随后分别用5μg和2.5μg的SEZ6-Fc免疫原进行随后的三次免疫和五次免疫。所有免疫使用用等体积的
Figure BDA0002784769840000321
Gold(CytRx公司)或明矾佐剂乳化的免疫原进行。对于所有注射，经由足垫途径通过免疫六只雌性小鼠(Balb/c、CD-1、FVB各两只)，从而产生鼠类抗体。
固相ELISA测定法用于筛选小鼠血清中对人SEZ6具有特异性的小鼠IgG抗体。高于背景的阳性信号指示对SEZ6具有特异性的抗体。简而言之，将96孔板(VWR国际公司(VWRInternational)，目录号610744)用含0.5μg/ml重组SEZ6-His的ELISA涂布缓冲液涂布过夜。用含有0.02％(v/v)吐温(Tween)20的PBS洗涤后，在室温(RT)下用200μL/孔的含3％(w/v)BSA的PBS封闭孔1小时。对小鼠血清进行滴定(1:100、1:200、1:400和1:800)，并且将其以50μL/孔添加到SEZ6涂布的板中，并且在室温下温育1小时。将板进行洗涤，并且然后在室温下，将其与50μL/孔的在3％BSA-PBS或含2％FCS的PBS中以1:10,000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG一起温育1小时。再将板进行洗涤，并且在室温下添加40μL/孔的TMB底物溶液(赛默科技公司(Thermo Scientific)34028)，持续15分钟。显影后，添加等体积的2NH2SO4以停止底物显影，并且通过分光光度计在OD 450下对板进行分析。
处死血清阳性的经免疫的小鼠，并且切去引流淋巴结(腿弯部和腹股沟，并且如果放大的话，髂内侧)，并且将其用作抗体产生细胞的来源。通过电融合以1:1的比率将B细胞的单细胞悬浮液(228.9×106个细胞)与非分泌性P3x63Ag8.653骨髓瘤细胞(ATCC#CRL-1580)融合。使用BTX HybrimmuneTM系统(BTX哈佛设备公司(BTX Harvard Apparatus))按照制造商的指导进行电融合。在融合程序后，将细胞重悬浮于补充有重氮丝氨酸(西格玛公司(Sigma)#A9666)的杂交瘤选择培养基，即，具有丙酮酸钠(赛格公司(Cellgro)，目录号15-017-CM)的含有15％胎儿克隆I血清(海可隆公司(Hyclone))、10％BM Condimed(罗氏应用科学公司(Roche Applied Sciences))、4mM L-谷氨酰胺、100IU青霉素-链霉素和50μM 2-巯基乙醇的高葡萄糖DMEM培养基中，并且然后以每个烧瓶90mL选择培养基将其铺板于三个T225烧瓶中。然后将烧瓶置于含有5％CO2和95％空气的潮湿的37℃培养箱中，持续6-7天。
生长六到七天后，使用Aria I细胞分选仪，将由在T225中大量生长的细胞组成的文库以每孔1个细胞铺板在Falcon 96孔U型底板中。然后将所选的杂交瘤在200μL的培养基中生长，所述培养基含有15％胎儿克隆I血清(海可隆公司)、10％BM-Condimed(罗氏应用科学公司)、1mM丙酮酸钠、4mM L-谷氨酰胺、100IU青霉素-链霉素、50μM 2-巯基乙醇和100μM次黄嘌呤。冷冻任何剩余的未使用的杂交瘤文库细胞以供将来的文库测试。在生长十到十一天后，通过ELISA和FACS测定法测定来自铺板的细胞的每个孔的上清液中对SEZ6具有反应性的抗体。
为了通过ELISA筛选，将96孔板用含0.3μg/mL SEZ6-Fc的PBS在4℃下涂布过夜。将板进行洗涤并且在37℃下用含3％BSA的PBS/吐温封闭一小时，并且立即使用或保持在4℃下。将未稀释的杂交瘤上清液在板上于室温下温育一小时。将板进行洗涤，并且用在3％BSA-PBS中以1:10,000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG在室温下探测一小时。然后将板与如上文所描述的底物溶液一起温育，并且在OD 450下读取。对含有优先结合人SEZ6(如通过高于背景的信号所确定)的免疫球蛋白的孔进行转移并扩增。
还使用基于流式细胞术的测定，利用被工程化以过表达所选物种特异性抗原的293细胞，针对人SEZ6特异性以及食蟹猕猴、大鼠和鼠类SEZ6交叉反应性对分泌鼠类免疫球蛋白的所选生长阳性杂交瘤孔进行筛选。
对于流式细胞术测定，分别用人、食蟹猕猴、大鼠或鼠类SEZ6转导的50×104个h293细胞与25-100μL杂交瘤上清液温育30分钟。将细胞用PBS、2％FCS洗涤两次，并且然后与在PBS/2％FCS中以1:200稀释的50μL缀合到DyLight649的山羊抗小鼠IgGFc片段特异性二次抗体一起温育。温育15分钟后，将细胞用PBS、2％FCS洗涤两次，并且然后重悬浮于具有DAPI的同一缓冲液中，并且按照制造商的说明书使用FACSCanto II通过流式细胞术进行分析。对含有优先结合SEZ6+GFP+细胞的免疫球蛋白的孔进行转移并扩增。将所得的hSEZ6特异性克隆杂交瘤冷冻保存在CS-10冷冻培养基(生物生命解决方案公司(BiolifeSolutions))中，并且储存在液氮中。将与人、食蟹猕猴、大鼠或鼠类SEZ6细胞结合的抗体标注为交叉反应性的。
ELISA和流式细胞术分析证实，来自大多数或所有这些杂交瘤的纯化抗体以浓度依赖性方式结合SEZ6。对含有结合SEZ6 GFP细胞的免疫球蛋白的孔进行转移并扩增。将所得的克隆杂交瘤冷冻保存在CS-10冷冻培养基(生物生命解决方案公司)中，并且储存在液氮中。
进行一次融合并且将其接种在48个板中(4608个孔，克隆效率为大约40％)。初步筛选产生了与人SEZ6缔合的六十三种鼠类抗体。随后进行第二次筛选，并且产生134种与人SEZ6缔合的抗体。
实例2：人源化位点特异性SEZ6抗体的制作
选择来自实例1的抗体用于进一步加工和人源化。使用标准的本领域公认的技术对来自表达所选抗体的杂交瘤的RNA进行分离、扩增和测序。从核苷酸序列信息中，获得了关于主题鼠类抗体的重链和轻链的V、D和J基因区段的数据。将V-(D)-J序列与小鼠Ig种系序列比对，并且基于其与受试者小鼠框架序列的最高序列同源性以及其用于CDR移植的规范结构来选择受体人可变框架区。抗体的人源化可变区的所得基因排列紧接着在下表3A中示出。
表3A
mAb 人VH 人JH FW变化 人VK 人JK FW变化
SEZ6-1 IGHV5-51 JH4 无 IGKV-L6 JK4 无
然后，将工程化的可变区用于产生人IgG1/κ抗SEZ6位点特异性抗体，所述抗体包括经突变以提供未配对的半胱氨酸的天然κ轻链(LC)恒定区和重链(HC)恒定区。在此方面，用丝氨酸(C220S)取代HC的上铰链区中的半胱氨酸220(C220)，以提供hSEZ6-1.ss1抗体。当组装时，HC和LC形成在轻链恒定区(例如，C214)的c端包括适合与治疗剂缀合的两个游离半胱氨酸的抗体。除非另有说明，否则恒定区残基的所有编号均按照如Kabat等人所阐述的EU编号方案进行。
为了产生位点特异性构建体，将VH核酸克隆到含有C220S突变的HC恒定区的表达载体上。将对突变体C220S HC进行编码的所得的载体与对与野生型IgG1κLC可操作地缔合的所选轻链可变区进行编码的载体一起在CHO-S细胞中共转染，并且使用哺乳动物瞬时表达系统进行表达。
除了用于在恒定区提供游离半胱氨酸的C220S突变外，还对重链进行了两种另外的修饰。首先，缺失C端赖氨酸以减少表达的异质性。其次，在重链可变区进行保守性突变以改善分子稳定性并且促进抗体产生。更具体地，将保守性突变并入重链CDR2(如由Kabat所定义的)中以消除规范糖基化位点。在此位点的糖基化可能潜在地在经表达的蛋白质中赋予异质性，这可能导致结合亲和力降低。因此，将丝氨酸对Kabat位置60处的天冬酰胺的取代(S60N)并入到重链中以消除糖基化位点。具有这些突变的所得人源化抗体被称为hSEZ6-1.ss1。如下文更详细讨论的，证实了hSEZ6-1.ss1与亲本人源化抗体和鼠源抗体关于亲和力的实质等效性。
经突变的抗体的人源化可变区的所得基因排列紧接着在下表3B中示出。
表3B
Figure BDA0002784769840000361
全长hSEZ6-1.ss1位点特异性抗体重链的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，其具有可变区突变位点S60N和恒定区突变位点C220S。重链可变区的氨基酸序列在以下被示出为SEQID NO:7，其具有用下划线标出的S60N突变。
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSSWINWVRQMPGKGLEWMGRIYPGEGDTNYNGNFEGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCTRGLVMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:7)
全长hSEZ6-1.ss1位点特异性抗体轻链的氨基酸序列为SEQ ID NO:4，其在C214处具有毒素缀合残基。轻链可变区的氨基酸序列如下所示为SEQ ID NO:8。
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVDYNGISYMHWYQQKPGQAPRLLIYAASNVQSGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSIEDPPTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:8)
实例3：hSEZ6-1.ss1药物接头的制备
根据式II的药物接头化合物
Figure BDA0002784769840000371
如紧接着的下文所述进行合成。
Figure BDA0002784769840000372
步骤1.叔丁基[34-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4,32-二氧代-7,10,13,16,19,22,25,28-八氧-3,31-二氮杂四环三十烷醇(diazatetratriacontan)-1-基]氨基甲酸酯
将3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{27-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-27-氧代-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧二十七烷(octaoxaheptacosan)-1-基}丙酰胺(434mg)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(5mL)中并且用(2-氨乙基)氨基甲酸叔丁酯(108.1mg)处理。6小时后，将反应混合物浓缩，并且将残基通过硅胶色谱法进行纯化，用0％CH3OH/CH2Cl2到10％CH3OH/CH2Cl2洗脱以得到标题化合物(154.2mg)。LC/MS(分析方法A)：Rt＝1.65分钟，m/z 735.46[M+H]+。
Figure BDA0002784769840000381
步骤2.N-(2-氨乙基)-31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧-28-氮杂三十烷醇-1-酰胺
将叔丁氧羰基保护性胺(步骤1，154.2mg)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(5mL)中，在30秒内添加三氟乙酸(500μL)，并且将所得混合物搅拌30分钟。反应完成后，将反应混合物浓缩，并且无需进一步纯化即可使用。LC/MS(分析方法A)：Rt＝1.29分钟，m/z 635.39[M+H]+。
Figure BDA0002784769840000391
步骤3.4-{[(2E)-2-{(1R,4Z,8S)-8-({(2R,3R,4S,5S,6R)-3-({(2S,4S,5S)-5-[乙酰基(乙基)氨基]-4-甲氧恶烷-2-基}氧基)-5-[({(2S,4S,5S,6R)-5-[(4-{[(2S,3R,4R,5S,6S)-3,5-二羟基-4-甲氧基-6-甲基恶烷-2-基]氧基}-3-碘代-5,6-二甲氧基-2-甲基苯甲酰基)磺酰基]-4-羟基-6-甲基恶烷-2-基}氧基)氨基]-4-羟基-6-甲基恶烷-2-基}氧基)-1-羟基-10-[(甲氧羰基)氨基]-11-氧代二环[7.3.1]十三烷-4,9-二烯-2,6-二炔-13-亚基}乙基]二磺酰基}-4-甲基戊酸
将N-乙酰基卡奇霉素γ1(0.2g，0.142mmol，1当量)溶解于乙腈(30mL)中，并且将所得溶液冷却到-15℃。将4-巯基-4-甲基戊酸(0.420mL，2.837mmol，20当量)溶解于乙腈(10mL)中，并且缓慢添加到冷却的N-乙酰基卡奇霉素γ1的溶液中。将三乙胺(0.377mL，2.837mmol，20当量)添加到反应混合物中，并且然后在3-18小时内使反应混合物升温到室温。反应完成后，将混合物浓缩，并且将残基干燥加载到硅胶上，进行快速色谱纯化，用2-20％的甲醇/二氯甲烷洗脱，以得到标题化合物。从冷的乙醚中沉淀出标题化合物。LC/MS(分析方法A)：Rt＝1.92分钟，m/z 1478.64[M+H]+。
Figure BDA0002784769840000401
步骤4.S-[(2R,3S,4S,6S)-6-({[(2R,3S,4S,5R,6R)-5-({(2S,4S,5S)-5-[乙酰基(乙基)氨基]-4-甲氧恶烷-2-基}氧基)-6-{[(2S,5Z,9R,13E)-13-[43-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5,5-二甲基-8,13,41-三氧代-16,19,22,25,28,31,34,37-八氧-3,4-二硫杂-9,12,40-三氮杂三环四十烷-1-亚基]-9-羟基-12-[(甲氧羰基)氨基]-11-氧代二环[7.3.1]十三烷-1(12),5-二烯-3,7-二炔-2-基]氧基}-4-羟基-2-甲基恶烷-3-基]氨基}氧基)-4-羟基-2-甲基恶烷-3-基]4-{[(2S,3R,4R,5S,6S)-3,5-二羟基-4-甲氧基-6-甲基恶烷-2-基]氧基}-3-碘代-5,6-二甲氧基-2-苯基甲烷-1-硫代硫酸盐
将N-乙酰基卡奇霉素酸(步骤3，100mg，0.068mmol，1当量)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(3.4mL)中并且冷却到0℃。然后按顺序添加N,N-二异丙基乙胺(176μL，1.01mmol，15当量)和(1-氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基氨基氧基)二甲基氨基-吗啉代-六氟磷酸碳(COMU，43mg，0.1mmol，1.5当量)。2分钟后，添加含N-(2-氨基乙基)-31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧-28-氮杂三十烷醇-1-酰胺(步骤2，51.4mg，0.08mmol，1.2当量)的N,N-二甲基甲酰胺(200μL)。1小时后，将反应混合物浓缩，并且将残基通过制备型HPLC(方法pA)纯化，以得到标题化合物(16.8mg，12％产率)。LC/MS(分析方法B或C)：Rt＝8.18分钟。HRMS：计算值[M+H]+＝2094.7049，观测值[M+H]+＝2094.6902。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.03(s,1H),8.01(t,J＝5.5Hz,1H),7.86(s,2H),7.01(s,3H),6.80(d,J＝8.0Hz,1H),6.30–6.18(m,1H),6.13(dd,J＝9.5,7.1Hz,1H),6.09–5.99(m,2H),5.56(d,J＝4.0Hz,1H),5.45(s,1H),5.43–5.37(m,2H),5.12(dd,J＝13.4,5.1Hz,2H),4.94(d,J＝9.9Hz,1H),4.63–4.47(m,2H),4.27–4.13(m,2H),4.11(s,1H),4.08–3.97(m,1H),3.91(dd,J＝10.8,6.1Hz,1H),3.81(s,3H),3.78–3.81(m,1H),3.77(s,3H),3.73–3.63(m,1H),3.63–3.55(m,7H),3.55–3.46(m,30H),3.41(s,3H),3.25(d,J＝2.3Hz,3H),3.15(q,J＝5.8Hz,2H),3.07(s,5H),2.93(d,J＝17.7Hz,1H),2.47–2.38(m,1H),2.36–2.26(m,7H),2.15–2.06(m,2H),2.01(d,J＝2.7Hz,3H),1.87(d,J＝12.3Hz,1H),1.80–1.62(m,3H),1.26(dd,J＝6.1,3.3Hz,4H),1.24–1.19(m,2H),1.19–1.12(m,7H),1.09(t,J＝7.1Hz,2H),0.95(t,J＝6.9Hz,1H)。
有关分析型和制备型HPLC方法的一般信息。
分析方法A：
MS：
Figure BDA0002784769840000411
超SQ检测器ESI，扫描范围120-2040Da。
柱：WatersAcuity
Figure BDA0002784769840000412
BEH C18，1.7μm，2.1×50mm
柱温：50℃
流速：0.6mL/min
流动相A：含0.1％甲酸的水。
流动相B：含0.1％甲酸的乙腈。
梯度：
时间，分钟 ％A ％B
0 95 5
0.25 95 5
2 0 100
2.5 0 100
3 95 5
4 95 5
分析方法B：
MS：
Figure BDA0002784769840000421
超SQ检测器ESI，扫描范围120-2040Da，
柱：WatersAcuity
Figure BDA0002784769840000422
BEH C18，1.7μm，2.1×50mm
柱温：60℃
流速：0.4mL/min
流动相A：含0.1％甲酸的水。
流动相B：含0.1％甲酸的乙腈。
梯度：
时间，分钟 ％A ％B
0 95 5
2 95 5
3 80 20
13 20 80
14 20 80
14.10 5 95
15 5 95
15.10 95 5
20 95 5
分析方法C：
HRMS：AB Sciex 5600Plus三重飞行时间
Figure BDA0002784769840000423
扫描范围250-2500Da
柱：WatersAcuity
Figure BDA0002784769840000424
BEH C18，1.7μm，2.1×50mm
柱温：60℃
流速：0.4mL/min
流动相A：含0.1％甲酸的水。
流动相B：含0.1％甲酸的乙腈。
梯度：
时间，分钟 ％A ％B
0 95 5
2 95 5
3 80 20
13 20 80
14 20 80
14.10 5 95
15 5 95
15.10 95 5
20 95 5
分析方法D
柱：EMD Millipore
Figure BDA0002784769840000431
Flash RP-18封端25-2mm。
柱温：40℃
波长：220nm
流速：1.5mL/分钟
流动相A：H2O(4L，其中具有1.5mL三氟乙酸)
流动相B：乙腈(4L，其中具有0.75mL三氟乙酸)
梯度：
时间，分钟 ％A ％B
0 95 5
0.01 95 5
0.70 5 95
1.15 5 95
1.16 95 5
1.60 95 5
分析方法E
柱：Halo C18 2.1×30mm，2.7μm
检测：二极管阵列和正/负电喷雾电离
流速：1.0mL/分钟
流动相A：含0.0375％三氟乙酸的水
流动相B：含0.018％三氟乙酸的乙腈
梯度：
时间，分钟 ％A ％B
0 90 10
2.00 20 80
2.48 20 80
2.50 90 10
3.00 90 10
分析方法F
柱：Venusil XBP-C18，2.1×50mm，5μm
检测：二极管阵列和正/负电喷雾电离
流速：0.8mL/分钟
流动相A：含0.0375％三氟乙酸的水
流动相B：含0.018％三氟乙酸的乙腈
梯度：
时间，分钟 ％A ％B
0 99 1
3.40 10 90
3.85 0 100
3.86 99 1
4.51 99 1
制备型HPLC方法pA：
柱：Waters XBridgeTM prep C18 5μm OBD，19×100mm
柱温：环境
流速：15mL/min
流动相A：含0.1％甲酸的水。
流动相B：含0.1％甲酸的乙腈。
梯度：
时间，分钟 ％A ％B
0 95 5
5 95 5
8 80 20
50 20 80
52.59 20 80
52.92 5 95
55.87 5 95
56.20 95 5
60 95 5
制备型HPLC方法pB：
柱：Phenomenex
Figure BDA0002784769840000451
C18(2)，250×50mm内径，10μm波长：220和254nm
流速：80mL/分钟
流动相A：含0.01M NH4HCO3的H2O。
流动相B：乙腈
梯度：经20分钟的30-50％流动相B
制备型HPLC方法pC：
柱：Phenomenex
Figure BDA0002784769840000452
C18(2)，250×50mm内径，10μm
波长：220和254nm
流速：80mL/分钟
流动相A：含0.075％v/v三氟乙酸的水
流动相B：乙腈
梯度：经20分钟的10-40％流动相B
制备型HLC方法pD：
柱：Phenomenex
Figure BDA0002784769840000453
C18(2)，250×50mm内径，10μm
波长：220和254nm
流速：80mL/分钟
流动相A：含0.09％v/v三氟乙酸的水
流动相B：乙腈
梯度：经20分钟的15-43％流动相B
实例4：hSEZ6-1.ss1抗体药物缀合物的制备
根据本文的教导制备抗hSEZ6-1.SS1 ADC用于进一步的体外和体内测试。
在此方面，来自实例2的hSEZ6-1.SS1通过具有游离巯基的末端马来酰亚胺基部分与不可切割的卡奇霉素药物接头(如实例3中制备的式II)缀合以产生所公开的在本文被称为hSEZ6-1.ss1 ADC1的SEZ6ADC。另外，通过将hSEZ6-1.ss1与相同但包括可切割的接头的卡奇霉素有效负载缀合，制作了三个对照SEZ6ADC(ADC2、ADC3和ADC4)。最后，制备了包括无S60N突变的hSEZ6-1.ss1的对照ADC。
使用经修饰的部分还原工艺来缀合位点特异性的人源化SEZ6 ADC(hSEZ6-1.ss1)。期望的产物是在每个LC恒定区上的未配对的半胱氨酸(C214)上最大缀合，并且使载药量大于2的ADC最小化，同时使载药量为2的ADC最大化的ADC。为了进一步改善缀合的特异性，在与接头药物缀合之前，使用包括稳定剂(例如，L-精氨酸)和温和的还原剂(例如，谷胱甘肽)的工艺选择性地还原抗体，然后进行渗滤和调配步骤。
更具体地，在室温下，在含有1M L-精氨酸/5mM EDTA和预定浓度的还原型谷胱甘肽(GSH)(pH 8.0)的缓冲液中部分还原每种抗体的制剂至少20小时。然后将所有制剂使用30kDa膜(密理博公司(Millipore Amicon Ultra))缓冲液交换到20mM Tris/3.2mM EDTA(pH 7.0)的缓冲液中以去除还原缓冲液。然后在室温下将所得的部分还原的制剂通过马来酰亚胺基团与相应的卡奇霉素药物接头缀合至少60分钟。然后通过添加0.5M乙酸将pH调节到6.0。通过使用30kDa膜的渗滤将ADC的制剂缓冲液交换到渗滤缓冲液中。然后用蔗糖和聚山梨酯-20将经渗滤的SEZ6ADC调配到目标最终浓度。
然后通过反相HPLC(RP-HPLC)分析所得调配物的蛋白质浓度(通过测量UV)、聚集(SEC)、药物与抗体的比率(DAR)和活性(体外细胞毒性)。然后将其冷冻并且储存直至使用。
hSEZ6-1.ss1 ADC1的示意图呈现在此后所附的图1中。
实例5：hSEZ6-1.ss1抗体的体外特性
进行实验以测试S60N突变是否影响hSEZ6-1.ss1 mAb与SEZ6抗原之间的相互作用。在此方面，在Biacore T200(抗人捕获芯片)上测量了可溶性SEZ6-his抗原与具有和不具有S60N突变的表面固定的SEZ6抗体和SEZ6 ADC的结合。
更具体地，使5μg/mL IgG以5μL/min流动12秒，产生115-124RU的固定化反应。以30μL/min注入22、66和200nM hSEZ6-his，持续90秒，然后解离300秒。在每个循环结束时，通过使2M氯化镁(30μL/min，30秒)流动来再生表面。传感器图被双重引用(缓冲液注入和对照流动池)并且在图2中示出，其中具有突变的抗体标记为hSEZ6-1.ss1，并且不具有突变的源抗体标记为hSEZ6-1.ss1亲本。
另外，使用Biacore T200进行亲和力测量，以确定包括S60N的hSEZ6-1.ss1的结合特性。在此方面，制作和纯化具有和不具有S60N突变的hSEZ6-1.ss1抗体的Fab构建体。然后在Biacore T200(抗His捕获芯片)上比较Fab构建体与可溶性表面固定的人SEZ6-His配体的结合。更具体地，将2μg/mL的人SEZ6-His以5μL/min流过芯片12秒，从而产生45-66RU的固定化反应。22、66和200nM的Fab注射以30μL/min进行90秒，然后进行了400-450秒的解离。通过以30uL/min使pH 1.5的10mM甘氨酸流动60秒来再生表面。传感器图被双重引用(缓冲液注入和对照流动池)。结果紧接着在下表4中示出。
表4
Figure BDA0002784769840000481
对图2的评论表明，与缺乏突变的亲本抗体相比，S60N突变和重链可变区中的糖基化位点的去除不会实质性地改变hSEZ6-1.ss1抗体的结合性质。类似地，表4中所示的亲和力测量证明，引入的突变不会不利地影响所公开的ADC中使用的抗体的结合。如此，在不损害分子的药物效力的情况下，可以修饰潜在的不稳定位置。
实例6：hSEZ6ADC在体外有效地杀死hSEZ6表达性细胞
为了确定本发明的抗SEZ6 ADC是否可以有效地介导缀合的细胞毒剂向活细胞的递送，使用在上文实例4中产生的抗SEZ6 ADC进行了体外细胞杀伤测定。
将过表达hSEZ6的HEK293T细胞或原初HEK293T细胞的单细胞悬浮液以每孔500个细胞的铺板到BD组织培养板(BD生物科学公司(BD Biosciences))中。一天后，将各种浓度的与卡奇霉素缀合的纯化ADC添加到培养物中。将细胞温育96小时。温育后，根据制造商的说明书使用
Figure BDA0002784769840000482
(普洛麦格公司(Promega))计数活细胞。将使用含有未经处理细胞的培养物的原始发光计数设置为100％参考值，并且所有其它计数都计算为参考值的百分比。
图3示出了，与原初HET293T细胞相比，所处理的所有hSEZ6表达性细胞对抗SEZ6ADC的敏感性高得多，这证明了ADC对SEZ6抗原的特异性。
以上结果证明了抗SEZ6 ADC特异性地介导直接缀合的细胞毒性有效负载的内在化和递送到表达SEZ6的细胞中的能力。
实例7：免疫受损小鼠的ADC药代动力学
在NOD SCID小鼠中评估了hSEZ6-1.ss1 ADC1、hSEZ6-1.ss1 ADC2和hSEZ6-1.ss1ADC3的药代动力学(PK)。将小鼠(每组n＝4只雌性)随机分为平均体重相等的处理组，并且然后通过单次静脉内注射(100μL体积)用相同量的ADC进行处理。ADC各自与10mg/kg未缀合的HuIgG1抗体共同施用，以使FcγR介导的清除率饱和并且提供适合的ADC暴露。每次给药后5分钟、4小时、24小时、72小时、120小时、168小时、216小时和336小时时收集血清样品，并且通过MSD免疫测定评定总抗体(TAb)和ADC浓度。使用非房室分析方法评估了药代动力学参数，包含最大浓度(Cmax)、暴露(从给药后0到14天的时间评估的曲线下面积或AUC)和半衰期。
所有ADC的ADC和TAb血清药代动力学以双指数的方式下降，并且在给药后5分钟观察到峰值浓度(Cmax)。经测试的SEZ6 ADC之间的ADC暴露(AUC 0-14天)没有显著差异。ADC之间的ADC血清最终半衰期类似。ADC稳定性是通过TAb与ADC暴露的比率来测量的，并且对于测试的化合物而言是类似的，范围为1.4到1.6。综上所述，这些数据证明，hSEZ6-1.ss1ADC1、hSEZ6-1.ss1 ADC2和hSEZ6-1.ss1 ADC3在NOD SCID小鼠中的药代动力学相当。
实例8：hSEZ6-1.ss1抗体药物缀合物抑制体内肿瘤生长
进行体内实验以证实实例6中所证明的hSEZ6-1.ss1 ADC1、hSEZ6-1.ss1 ADC2和hSEZ6-1.ss1 ADC3的细胞杀伤能力。为此，测试了如前述实例中所述的制备的靶向SEZ6的位点特异性ADC在免疫受损的NOD SCID小鼠中的体内治疗性效果，所述NOD SCID小鼠携带具有内源性SEZ6细胞表面蛋白表达的皮下源于患者的异种移植(PDX)小细胞肺癌(SCLC)肿瘤。抗SEZ6缀合物hSEZ6-1.ss1 ADC1、hSEZ6-1.ss1 ADC2和hSEZ6-1.ss1 ADC3各自在两种不同的SCLC模型中进行测试。
SCLC-PDX系、LU95和LU149各自作为解离的细胞接种物被注入在乳腺脂肪垫区域附近的皮肤下，并且每周用卡尺测量(椭球体积＝a×b2/2，其中a为长直径，并且b为椭圆的短直径)。在肿瘤生长到130-200mm3(范围为100-300mm3)的平均大小后，将小鼠随机分为肿瘤体积平均值相等的处理组(每组n＝5只小鼠)。通过腹膜内注射(100μL体积)用相同的单剂量媒剂(含5％葡萄糖的无菌水)或HuIgG1-或SEZ6-ADC制剂处理小鼠(每组5只)。为了使药代动力学线性化，将SEZ6-ADC与10mg/kg裸HuIgG1抗体共同施用。
通过每周肿瘤体积(使用上述卡尺)和重量测量评定治疗性效果。单个小鼠或处理组的终点标准包含健康评定(任何疾病迹象)、重量减轻(从研究开始重量减轻超过20％)和肿瘤负荷(肿瘤体积>1000mm3)。通过每周肿瘤体积测量(mm3)监测功效，直到各组达到大约800-1000mm3的平均值。将肿瘤体积计算为处理组中的所有小鼠的具有平均标准误差的平均值，并且相对于自初始处理以来的时间(天数)进行绘图。处理的结果在图4A和4B进行描绘，其中示出了每个处理组5只小鼠的具有平均标准误差(SEM)的平均肿瘤体积。
在携带SCLC PDX-LU95(图4A)或PDX-LU149(图4B)的小鼠中评估了与卡奇霉素缀合的SEZ6结合ADC(hSEZ6-1.ss1 ADC1、hSEZ6-1.ss1 ADC2和hSEZ6-1.ss1 ADC3)。与可切割的接头ADC2相比，不可切割的接头ADC1具有类似或更高的功效，而在2mg/kg下，可切割的接头ADC3与ADC1相比具有更高的功效。在任何情况下，hSEZ6-1.ss1 ADC1和hSEZ6-1.ss1ADC3在SCLC PDX中可以达到50天或更长时间的持久反应。反应是SEZ6-ADC特异性的，因为在用与相同卡奇霉素药物接头缀合的非结合ADC(HuIgG1)处理后未观察到反应(数据未示出)。
此类结果证明，如本文所述制作的hSEZ6-1.ss1 ADC1具有药学上有效减缓小细胞肺癌细胞生长的潜力。
实例9：hSEZ6-1.ss1 ADC1表现出强大的安全裕量
进行了分析以确定由hSEZ6-1.ss1 ADC1提供的安全裕量。
在此方面，hSEZ6-1.ss1 ADC1、hSEZ6-1.ss1 ADC2和hSEZ6-1.ss1 ADC3包括相同的靶向mAb(hSEZ6-1.ss1)和弹头(N-乙酰基γ卡奇霉素)，其中接头药物连接有所不同。hSEZ6-1.ss1 ADC1的独特之处在于，与其它基于组织蛋白酶B易感二肽的接头药物相比，其包括不可切割的接头。在四个离散的高表达SEZ6 SCLC小鼠PDX模型(LU64、LU86、LU95和LU149)中以及在食蟹猴的探索性重复剂量毒性研究中对SEZ6 ADC进行了评估。
基于小鼠的未经处理的肿瘤生长和经SEZ6 ADC处理的肿瘤反应数据的半机械PK/PD模型用于预测与导致患者肿瘤停滞的ADC浓度相对应的肿瘤静态浓度(TSC)。随后，基于食蟹猴PK数据模拟了人PK。然后使用人PK的预测来估算在相当于TSC的患者剂量间隔处达到血浆谷浓度所需的剂量。通过比较食蟹猴在最大耐受剂量(MTD)下的ADC暴露与预测的人有效剂量下的ADC暴露来估算安全裕量。对于评估的每个肺PDX模型(LU64、LU86、LU95和LU149)重复进行此分析。
表5提供了SEZ6 ADC中的每个SEZ6 ADC的预测安全裕量。基于此分析，预测hSEZ6-1.ss1 ADC1比与相同有效负载缀合但带有可切割的接头的其它SEZ6 ADC(hSEZ6-1.ss1ADC2、hSEZ6-1.ss1 ADC3)具有更高的耐受性。此分析预测，hSEZ6-1.ss1 ADC1的安全裕量为大约10，其远高于两个带有可切割接头的构建体。
表5
化合物 估算的安全裕量
hSEZ6-1.ss1 ADC1 10
hSEZ6-1.ss1 ADC2 0.3
hSEZ6-1.ss1 ADC3 5.5
基于在食蟹猴中获得的数据的预测的更高的人安全裕量以及对应的给药灵活性指示hSEZ6-1.ss1 ADC1是强力治疗性候选物。
实例10：hSEZ6-1.ss1 ADC1在SCLC中活性特别高
为了进一步证明所公开的ADC的潜在功效，使用各种肿瘤异种移植细胞系进行了毒素特异性测定。最初，通过微阵列分析询问SCLC、BR、CR、GA、NSCLC和PA PDX细胞系，以确定SEZ6抗原(图5A)和CD46(已知的阳性对照抗原)(图5B)的相应表达水平。使用AffymetrixClariomD测定对源自人PDX的纯化RNA样品进行了微阵列分析。图5A和5B的综述表明，尽管与其它肿瘤类型相比，SCLC肿瘤中SEZ6的表达上调，但阳性抗原对照CD46在源于患者的异种移植(PDX)的小组上始终表现出较高的mRNA表达水平。因此，CD46抗原被用作替代ADC靶标，以评估所公开的新型卡奇霉素药物接头(式II)对各种肿瘤类型的影响。
在此方面，人源化CD46抗体(美国专利10,017,565 B2)N149与本文所述的卡奇霉素药物接头或吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)药物接头对照缀合。基本上如上文实例4中所述产生ADC。在制备后，将CD46 ADC冷冻并且储存直至使用。
将PDX细胞接种到NOD-SCID小鼠的侧腹。当肿瘤达到100-300mm3之间时，针对除SCLC PDX以外的所有类型的肿瘤，以1.6mg/kg的单剂量形式引入PBD ADC制剂(图5C)，而以8mg/kg的单剂量形式施用卡奇霉素ADC制剂(图5D)。对于SCLC PDX，卡奇霉素ADC制剂以2mg/kg或4mg/kg的剂量施用(图5D)。然后，与具有相同弹头的非靶向ADC制剂相比，监测肿瘤的变化。通过从靶向剂的进展时间中减去非靶向ADC的进展时间来计算到肿瘤进展的增量时间(dTTP)。肿瘤进展定义为时间点，其中观察到的测量值比处理后的最低体积再生长至少100mm3。图5C和5D中的每个数据点表示相应的肿瘤类型的单独的PDX细胞系。
如图5C所示，无论PDX肿瘤的类型如何，PBD ADC制剂均提供相对一致的肿瘤反应。具体地，SCLC PDX对PBD毒素引起的杀伤的敏感性与其它肿瘤细胞系的敏感性很大程度上相当。与之形成鲜明对比的是，与其它PDX细胞系相比，SCLC PDX细胞系被证明更容易被卡奇霉素ADC杀死(图5D)。更具体地，在8mg/kg单剂量的卡奇霉素ADC后，大多数来自BR、CR、GA和NSCLC肿瘤的源于患者的异种移植表现出最小的反应，甚至无反应。在胰腺肿瘤中存在多种反应，但即使是胰腺肿瘤，在大多数测试的细胞系中也示出最小的反应(<25天dTTP)。相反，较低的2mg/kg(黑圆圈)或4mg/kg(白色圆圈)剂量的卡奇霉素ADC持续减少SCLC肿瘤生长比较高剂量的卡奇霉素ADC在其它PDX肿瘤上实现的肿瘤生长减少明显更多。此外，与携带相同弹头的非靶向抗体相比，大多数SCLC肿瘤表现出超过40天的生长延迟(数据未示出)。
这些数据表明，SCLC肿瘤对卡奇霉素弹头比其它DNA损坏弹头更敏感。此结果是出乎意料的，因为据预期卡奇霉素弹头将提供与用PBD弹头观察到的结果类似的结果。
实施例
1.一种特异性结合人SEZ6的分离抗体，其中所述抗体包括SEQ ID NO:3的重链序列和SEQ ID NO:4的轻链序列。
2.根据实施例1所述的抗体，其中所述抗体与卡奇霉素有效负载缀合。
3.根据实施例2所述的抗体，其中所述卡奇霉素有效负载包括N-Ac卡奇霉素。
4.根据实施例3所述的抗体，其中所述卡奇霉素有效负载包括式II。
5.一种治疗小细胞肺癌的方法，所述方法包括将根据实施例1到4中任一项所述的抗体施用于有需要的受试者。
6.一种试剂盒，其包括含有根据实施例1到4中任一项所述的抗体的一个或多个容器。
7.根据实施例6所述的试剂盒，其进一步包括与所述一个或多个容器相关的指示所述抗体用于治疗患有小细胞肺癌的受试者的标签或包装插入物。
8.一种药物组合物，其包括根据实施例1到4中任一项所述的抗体。
9.一种试剂盒，其包括含有根据实施例8所述的药物组合物的一个或多个容器。
10.根据实施例9所述的试剂盒，其进一步包括与所述一个或多个容器相关的指示所述药物组合物用于治疗患有小细胞肺癌的受试者的标签或包装插入物。
11.一种核酸，其编码根据实施例1到4中任一项所述的抗体的全部或部分。
12.一种载体，其包括根据实施例11所述的核酸。
13.一种宿主细胞，其包括根据权利要求11所述的核酸或根据实施例12所述的载体。
14.一种以下结构的SEZ6 ADC：
Figure BDA0002784769840000541
其中Ab包括具有SEQ ID NO:3的重链序列和SEQ ID NO:4的轻链序列的抗SEZ6抗体，并且其中n为2。
15.一种治疗小细胞肺癌的方法，所述方法包括将根据实施例14所述的SEZ6 ADC施用于有需要的受试者。
16.一种试剂盒，其包括含有根据实施例14所述的SEZ6 ADC的一个或多个容器。
17.根据实施例16所述的试剂盒，其进一步包括与所述一个或多个容器相关的指示所述SEZ6 ADC用于治疗患有小细胞肺癌的受试者的标签或包装插入物。
18.一种药物组合物，其包括根据实施例14所述的SEZ6 ADC。
19.根据实施例18所述的药物组合物，其中根据权利要求14所述的SEZ6 ADC是主要的ADC物种。
20.根据实施例19所述的药物组合物，其中所述主要的ADC物种占所述组合物中存在的所述ADC物种的大于约70％。
21.根据实施例19所述的药物组合物，其中所述主要的ADC物种占所述组合物中存在的所述ADC物种的大于约80％。
22.根据实施例19所述的药物组合物，其中所述主要的ADC物种占所述组合物中存在的所述ADC物种的大于约90％。
23.一种试剂盒，其包括含有根据实施例18到22所述的药物组合物中的任一种药物组合物的一个或多个容器。
24.根据实施例23所述的试剂盒，其进一步包括与所述一个或多个容器相关的指示所述药物组合物用于治疗患有小细胞肺癌的受试者的标签或包装插入物。
25.一种治疗小细胞肺癌的方法，所述方法包括施用根据实施例18到22所述的药物组合物中的任一种药物组合物。
26.一种减少肿瘤细胞群体中的肿瘤起始细胞的方法，其中所述方法包括使包括肿瘤起始细胞和除肿瘤起始细胞以外的肿瘤细胞的肿瘤细胞群体与根据实施例14所述的SEZ6 ADC接触，从而降低肿瘤起始细胞的频率。
27.根据实施例26所述的方法，其中所述接触是在体内进行的。
28.根据实施例26所述的方法，其中所述接触是在体外进行的。
29.一种向细胞递送细胞毒素的方法，所述方法包括使所述细胞与根据实施例14所述的SEZ6ADC接触。
30.一种产生根据实施例14所述的ADC的方法，所述方法包括以下步骤：将具有SEQID NO:3的重链序列和SEQ ID NO:4的轻链序列的hSEZ6-1.ss1抗体与包括式II的药物接头缀合。
31.根据实施例30所述的方法，其进一步包括将所述ADC冻干的步骤。
32.一种治疗有需要的受试者的小细胞肺癌的方法，所述方法包括施用安全裕量大于6的SEZ6 ADC，其中所述SEZ6 ADC包括以下结构：
Figure BDA0002784769840000561
其中Ab包括具有SEQ ID NO:3的重链序列和SEQ ID NO:4的轻链序列的抗SEZ6抗体，并且其中n为2。
33.根据实施例32所述的方法，其中所述安全裕量为约10。
34.一种卡奇霉素药物接头或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其包括以下结构：
Figure BDA0002784769840000562
本领域技术人员将进一步理解的是，在不脱离本发明的精神或其中心属性的情况下，本发明可以以其它具体形式具体化。由于本发明的前述描述仅公开了其示例性实施例，所以应理解的是，其它变型被设想为在本发明的范围内。因此，本发明不限于本文已经详细描述的特定实施例。相反，应当参考所附权利要求来指示本发明的范围和内容。
Figure IDA0002784769900000011
Figure IDA0002784769900000021
Figure IDA0002784769900000031
Figure IDA0002784769900000041
Figure IDA0002784769900000051
Figure IDA0002784769900000061
Figure IDA0002784769900000071
Figure IDA0002784769900000081
Figure IDA0002784769900000091
Figure IDA0002784769900000101
Figure IDA0002784769900000111
Figure IDA0002784769900000121
Figure IDA0002784769900000131
Figure IDA0002784769900000141
Figure IDA0002784769900000151

Claims (20)

1.一种特异性结合人SEZ6的分离抗体，其中所述抗体包括SEQ ID NO:3的重链序列和SEQ ID NO:4的轻链序列。
2.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体与卡奇霉素(calicheamicin)有效负载缀合。
3.根据权利要求2所述的抗体，其中所述卡奇霉素有效负载包括N-Ac卡奇霉素。
4.根据权利要求3所述的抗体，其中所述卡奇霉素有效负载包括式II。
5.一种核酸，其编码根据权利要求1到4中任一项所述的抗体的全部或部分。
6.一种载体，其包括根据权利要求5所述的核酸。
7.一种宿主细胞，其包括根据权利要求5所述的核酸或根据权利要求6所述的载体。
8.一种以下结构的SEZ6 ADC：
Figure FDA0002784769830000011
其中Ab包括具有SEQ ID NO:3的重链序列和SEQ ID NO:4的轻链序列的抗SEZ6抗体，并且其中n为2。
9.一种治疗小细胞肺癌的方法，所述方法包括将根据权利要求8所述的SEZ6ADC施用于有需要的受试者。
10.一种药物组合物，其包括根据权利要求8所述的SEZ6 ADC。
11.根据权利要求10所述的药物组合物，其中根据权利要求8所述的SEZ6ADC是主要的ADC物种。
12.根据权利要求11所述的药物组合物，其中所述主要的ADC物种占所述组合物中存在的所述ADC物种的大于约70％。
13.根据权利要求11所述的药物组合物，其中所述主要的ADC物种占所述组合物中存在的所述ADC物种的大于约80％。
14.根据权利要求11所述的药物组合物，其中所述主要的ADC物种占所述组合物中存在的所述ADC物种的大于约90％。
15.一种治疗小细胞肺癌的方法，所述方法包括施用根据权利要求8到14所述的药物组合物中的任一种药物组合物。
16.一种产生根据权利要求8所述的ADC的方法，所述方法包括以下步骤：将具有SEQ IDNO:3的重链序列和SEQ ID NO:4的轻链序列的hSEZ6-1.ss1抗体与包括式II的药物接头缀合。
17.根据权利要求16所述的方法，其进一步包括：将所述ADC冻干的步骤。
18.一种治疗有需要的受试者的小细胞肺癌的方法，所述方法包括施用安全裕量大于6的SEZ6ADC，其中所述SEZ6 ADC包括以下结构：
Figure FDA0002784769830000021
其中Ab包括具有SEQ ID NO:3的重链序列和SEQ ID NO:4的轻链序列的抗SEZ6抗体，并且其中n为2。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述安全裕量为约10。
20.一种卡奇霉素药物接头或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其包括以下结构：
Figure FDA0002784769830000031
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