KR20220152951A - 항체 결합 재조합 융합 단백질 및 이를 이용한 항체-약물 접합체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항체 결합 재조합 융합 단백질 및 이를 이용한 항체-약물 접합체에 관한 것으로, 상기 재조합 융합 단백질은 분비 펩타이드(Secretoty peptide), 알부민 결합 도메인(Albumin binding domain) 및 항체 결합 도메인(Antibody binding domain)으로 구성되고, 화학적 결합 없이 항체-약물 접합체를 제작할 수 있을 뿐만 아니라, 알부민 결합 도메인을 포함하므로 아브락산(Abraxane)을 포함한 알부민 기반 나노전달체에 포괄적으로 적용이 가능하므로 다양한 약물을 전달하기 위한 알부민 나노입자 등에 적용이 가능한 ADC 플랫폼 기술로 활용될 수 있다.

Description

항체 결합 재조합 융합 단백질 및 이를 이용한 항체-약물 접합체{Recombination fusion protein binding antibody and antibody-drug conjugates using the same}
본 발명은 항체 결합 재조합 융합 단백질 및 이를 이용한 항체-약물 접합체를 제공한다.
항체-약물 접합체(Antibody-drug conjugate, ADC) 기술은 암세포의 성장 또는 분열을 선택적으로 사멸시키거나 성장을 저해할 수 있는, 표적-지향 기술이다. 일반적으로 ADC는 항체를 사용하여 암세포를 표적화한 다음, 세포에서 독성 물질(즉, 약물)을 방출시켜 세포 사멸을 유발함으로써 기능한다. ADC 기술은 약물이 특정 표적으로 특이적으로 표적화되도록 허용하기 때문에 ADC 기술은 치료 항체의 효능을 증가시키고 부작용의 위험을 감소시킨다.
이러한 접근법은 미국 FDA 승인 의약품인 애드 세트리스(Adcetris)(브툭시맙 도틴)를 이용한 Hodgkin 림프종 치료, 및 미국 FDA 승인 의약품인 카드실라 (Kadcyla)(아도-트라스투주맙 엠탄신)을 이용한 HER-2 양성 유방암 치료에서 유망한 활성을 보여왔다. 지난 20년 동안 학계와 제약 산업 모두는 ADC에 시간과 돈을 투자해 왔다. 50개 이상의 ADC가 임상 시험 중이며, 제약 업계의 기대는 향후 몇 년 내에 또 다른 8-10개의 ADC 약물이 시장에서 승인될 수 있다는 것이다.
항체-약물 접합체의 기본 구조는 "항체-링커-저분자 약물"이며, 링커는 약물이 표적세포에 도달한 후, 예를 들어 항체로부터 분리된 후에 약물이 표적 세포에 대한 효과를 나타내도록 하는 것이 이상적이다. 링커는 또한 항체와 약물을 연결하는 기능적 역할을 한다. 따라서 항체-약물 접합체의 효능 및 독성은 부분적으로는 링커의 안정성에 의존하며, 따라서 링커는 약물 안전성(drug safety)에 중요한 역할을 한다.
현재 승인받은 링커의 수는 제한적이며 ADC에 적용하는데 어려움이 많다. 따라서 ADC 개발을 위한 적합한 링커의 개발이 요구되고 있는 실정이다.
1. 대한민국 공개특허 제2021-0018316호.
본 발명의 목적은 분비 펩타이드(Secretoty peptide), 알부민 결합 도메인(Albumin binding domain) 및 항체 결합 도메인(Antibody binding domain)을 포함하는 재조합 융합 단백질을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 재조합 세포를 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 세포를 배양하여 상기 재조합 융합 단백질을 발현시키는 단계; 및 상기 발현된 재조합 융합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 재조합 융합 단백질 생산방법을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 재조합 융합 단백질을 포함하는 항체-약물 접합체를 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 분비 펩타이드(Secretoty peptide), 알부민 결합 도메인(Albumin binding domain) 및 항체 결합 도메인(Antibody binding domain)을 포함하는 재조합 융합 단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 세포를 배양하여 상기 재조합 융합 단백질을 발현시키는 단계; 및 상기 발현된 재조합 융합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 재조합 융합 단백질 생산방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 재조합 융합 단백질을 포함하는 항체-약물 접합체를 제공한다.
본 발명은 항체 결합 재조합 융합 단백질 및 이를 이용한 항체-약물 접합체에 관한 것으로서, 기존 항체-약물 접합체를 제작하기 위한 링커 기술은 화학적 결합을 기반으로 하고 있는데 반해 화학적 결합 없이 항체-약물 접합체를 제작할 수 있을 뿐만 아니라, 알부민 결합 도메인을 포함하므로 아브락산(Abraxane)을 포함한 알부민 기반 나노전달체에 포괄적으로 적용이 가능하므로 다양한 약물을 전달하기 위한 알부민 나노입자 등에 적용이 가능한 항체-약물 접합체(ADC) 플랫폼 기술로 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 CA645-ED(이하 CA-ED라 함) 재조합 융합 단백질 구조를 나타내는 그림이다.
도 2는 본 발명의 GA123-B12(이하 GA-B라 함) 재조합 융합 단백질 구조를 나타내는 그림이다.
도 3은 본 발명의 재조합 융합 단백질을 항체 및 알부민과 결합하여 항체-약물 접합체(이하 ADC라 함)를 제조하는 개념도를 나타내는 그림이다.
도 4는 본 발명의 재조합 융합 단백질 발현에 대한 SDS-PAGE 및 Western blot 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 재조합 융합 단백질 CA-ED에 의해 ADC 복합체가 형성된 FITC-BSA의 FACS 분석결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 재조합 융합 단백질 GA-B에 의해 ADC 복합체가 형성된 FITC-BSA의 FACS 분석결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
기존 항체-약물 접합체는 항체와 약물에 링커를 연결하는데 링커를 만드는 과정이 복잡한 문제점이 있어, 본 발명자들은 생산단가를 낮추고 효율성과 경제성을 증가시키기 위해 연구 노력한 결과, 링커를 별도로 제작하여 사용 전 항체와 약물을 조합하여 ADC를 만든 뒤 사용하는 새로운 개념의 플랫폼을 발명하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 분비 펩타이드(Secretoty peptide), 알부민 결합 도메인(Albumin binding domain) 및 항체 결합 도메인(Antibody binding domain)을 포함하는 재조합 융합 단백질을 제공한다.
상기 알부인 결합 도메인은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 CA645이고, 항체 결합 도메인은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 ED일 수 있다.
상기 알부인 결합 도메인은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 GA123이고, 항체 결합 도메인은 서열번호 4로 표시되는 아미노산을 갖는 B12일 수 있다.
상기 재조합 융합 단백질은 IgG 카파 서열(IgG kappa chain)을 더 포함할 수 있다.
상기 재조합 융합 단백질은 프로모터를 더 포함할 수 있다.
상기 재조합 융합 단백질은 히스티딘 태그를 더 포함할 수 있다.
상기 재조합 융합 단백질은 서열번호 5 또는 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 갖을 수 있다.
또한, 본 발명은 재조합 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
본 발명에 있어서, “벡터”는 클론유전자를 운반하는데 사용되는 스스로 복제되는 DNA 분자를 의미한다.
본 발명에 있어서, “발현 벡터”는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동 가능한게 연결된 코팅 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질 전환된 세포를 비 형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다.
그 예로는 앰피실린(ampicilin), 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에 의해 적절히 선택 가능하다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 재조합 세포를 제공한다.
상기 재조합 세포는 HEK293E일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 세포를 배양하여 상기 재조합 융합 단백질을 발현시키는 단계; 및 상기 발현된 재조합 융합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 재조합 융합 단백질 생산방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 융합 단백질을 포함하는 항체-약물 접합체를 제공한다.
상기 재조합 융합 단백질의 항체 결합 도메인이 항체와 결합하며, 알부민 결합 도메인이 알부민과 결합할 수 있다.
상기 항체는 모노클로날 항체, 이중특이적 항체, 키메릭 항체, 인간 항체 및 인간화 항체로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 항체는 암 특이 항원, 세포 표면 수용체 단백질, 세포 표면 단백질, 막횡단 단백질, 신호전달 단백질, 세포생존 조절인자, 세포 증식 조절인자, 조직 발달 또는 분화와 연관된 분자, 림포카인, 사이토카인, 세포 주기 조절에 관련된 분자, 혈관형성에 관련된 분자, 또는 혈관신생에 관련된 분자에 대한 결합능과 특이성을 가질 수 있으나. 이에 한정되지 않는다.
상기 항체는 항-HER2 항체, 항-EGFR 항체, 항-CD19 항체, 항-CD33 항체, 항-메소텔린(mesothelin) 및 항-CD20로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 약물은 파클리탁셀, 젬시타빈, 시스플라틴, 엠탄신 및 플루다라빈으로 이루어진 군에서 선택된 약물을 알부민에 결합시킨 알부민 결합 나노입자일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예 등은 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예 등에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예 등은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실험예 1> 재조합 융합 단백질 발현
재조합 융합 단백질 발현을 위해 pcDNA3.1 발현 벡터(Thermo fisher, U.S.A) 에 CA-ED와 GA-B 도메인을 서브 클로닝하여 준비하였다. 클로닝은 코스모진텍에 의뢰하여 진행하였다. 250ml 삼각 플라스크에 50μg DNA와 1.5x108 셀(expi 293 cell) / 50ml 배지 기준으로 하고, 50μg DNA를 트랜스펙션 키트(ExpiFectaminTM 293 transfection Kit)의 에이전트 160μl를 섞어서 유전자를 293세포에 도입할 수 있는 콤플렉스를 제조사의 지침에 따라 만들었다. 상기 콤플렉스를 1.5x108 셀(expi 293 cell)에 처리하고 18~20시간 동안 배양하였다. 다음 날 키트의 인핸서 1, 2를 넣어주고 5일간 추가로 배양을 하였다. 배양이 끝난 후 스핀다운(1st 1300rpm, 5min, 4℃, 2nd 4000rpm, 20min, 4℃)을 진행하여 세포와 배지를 분리하였다. 단백질은 배지에 있기 때문에 이 배지를 모아서 500ml 날진 버틀 톱 필터(0.2μm)를 이용해 거르고 정제 전까지 냉장보관하였다.
<실험예 2> 재조합 융합 단백질 정제
상기 실시예 1에서 제조된 재조합 융합 단백질을 정제하였다. 5ml 히스-태그 콜럼(Bio-ScaleTM Mini ProfinityTM IMAC Cartridges)을 펌프에 연결하였다. 증류수(25ml), 세척 완충액(25ml), 중간, 용출 완충액(5ml) 순으로 진행하였으며 유량(flow rate)은 2ml/분으로 진행하였다. 이미다졸 농도는 세척 완충액 5mM, 용출 완충액 250mM 이었다. 용출된 단백질을 투석을 진행하여 용출 완충액을 PBS로 바꿔 주었다. 투석은 밤샘 후 새로운 PBS로 교체하여 3시간 동안 더 진행하였다.
<실험예 3> SDS-PAGE 확인
바이오 라드에서 판매하는 프리캐스트 프로테인 젤(Mini-Protean TGX, 12%)을 사용하였다. 실험예 2에 따라 정제한 단백질을 준비하고 바이오 라드의 2x 램리 샘플 완충액과 멜캡토에탄올을 95:5로 섞어서 샘플 로딩을 준비하였다. 상기 완충액과 단백질을 1:1로 섞고 프리캐스트 프로테인 젤의 웰에 넣어주었다. 이후 80~120V에서 약 1~2시간 정도 러닝하고 그 후 젤을 잘 꺼내서 증류수에서 세척을 진행하였다. 이후 바이오 라드에서 판매하는 바이오 세이프 코마시 스테인를 넣고 30~60분 동안 염색을 진행하였다. 염색된 젤을 증류수를 넣고 세척을 3회 반복하였다. 이후 젤을 젤-독으로 촬영하여 사진을 얻었다.
<실험예 4> Western blot 분석
바이오 라드에서 판매하는 프리캐스트 프로테인 젤(Mini-Protean TGX, 12%)을 사용하였다. 실험예 2에 따라 정제한 단백질을 준비하고 바이오-라드의 2x 램리 샘플 완충액과 멜캡토에탄올을 95:5로 섞어서 샘플 로딩을 준비하였다. 상기 완충액과 단백질을 1:1로 섞고 프리캐스트 프로테인 젤의 웰에 넣어주었다. 이 후 80~120V에서 약 1~2시간 정도 러닝하고 그 후 젤을 잘 꺼내서 증류수에서 세척을 진행하였다. 이후 바이오 라드의 트랜스-블롯 터보 트랜스퍼 팩(BR170-4156)을 준비하여 제조사의 지침에 따라 샌드위치를 만들었다. 상기 샌드위치를 트랜스 블롯 터보 블롯팅 시스템에 넣고 7분 동안 러닝을 하였다. 이때, 러닝 시간은 젤 개수 등에 따라 변동되었다. 트랜스퍼가 끝나면 멤브레인을 5% 스팀 밀크(TBS로 제작)에 넣고 4℃에서 1시간 동안 넣고 섞었다. 이후 상기 스팀 밀크를 버리고 TTBS(0.05% tween 20 in TBS)를 넣고 4℃에서 10분씩 3회 세척을 진행하였다. 1차 항체(6x his tag antibody, Invitrogen)를 상온에서 1시간 30분 동안 반응시키고 반응 후 TTBS로 5분씩 3회 세척을 진행하였다. 2차 항체(HRP conjugate, Invitrogen)을 상온에서 1시간 동안 반응시키고 반응 후 TTBS로 5분씩 3회 세척을 진행하였다. 이후 바이오라드의 옵티-4CN을 제조사 지침에 따라 멤브레인에 처리하고 10분동안 빛에 노출하지 않고 응시켰다. 이 멤브레인을 바이오라드의 캐미독(Bio-Rad)으로 촬영하여 데이터를 얻었다.
<실험예 5> 재조합 융합 단백질을 이용한 ADC 샘플 제조
약물을 결합한 알부민과 상기 실시예 2에서 제조한 항체 결합 재조합 단백질(CA-ED,GA-B)을 각각 1:2 의 몰비로 RT에서 30분 반응하였다. 그 후 상기 반응물들을 트라스투주맙 및 니볼루맙과 각각 몰 비율 8:1로 RT에서 1h 추가로 반응하였다.
<실험예 6> FACS(Fluorescence activated cell sorter) 분석
HER2 양성인 SK-BR-3와 HER2 음성인 MDA-MB-231를 6웰 플레이트에 각각 2x 105 셀을 시딩하고 RPMI1640배지에서 하루동안 배양(37℃, CO2 5%)하였다. 배지를 교체한 뒤 FITC-BSA 4μg을 기준으로 한 샘플을 추가로 넣어주었다. 37℃, CO2 5% 조건에서 4시간 동안 배양시키고 배양 후 배지를 버리고 PBS로 3회 세척하였다. 웰당 0.05% 트립신-EDTA를 500μl 넣고 셀이 떨어질 때까지 2분 기다렸다. 이후 배지를 500μl 넣고 모두 수거한 뒤 1500rpm에서 3분간 원심분리를 진행하였다. 1차 분리 후 상등액을 버리고 PBS로 세척한 뒤 다시 원심분리를 진행하였다. 2차 분리 후 다시 상등액을 버리고 4% 파라포름알데히드로 고정시켰다.
<실시예 1> CA-ED 단백질과 GA-B 단백질의 발현 확인
실험예에서 합성 및 정제된 재조합 융합 단백질 CA-ED와 GA-B이 제대로 발현되었는지 확인하기 위해 SDS-PAGE와 Western blot 분석을 진행하였다.
그 결과, 도 4에 따르면, 좌측 SDS-PAGE 결과에서 단백질 마커의 74.5 kDa와 비슷한 크기의 밴드가 확인되었고, 우측 Western blot 결과에서도 같은 크기의 밴드가 확인되어 CA-ED가 잘 발현되었음을 확인할 수 있었다. 또한 좌측 SDS-PAGE 결과에서 단백질 마커의 74.9kDa와 비슷한 크기의 밴드가 확인되었으며 우측 Western blot 결과에서도 비슷한 크기의 밴드가 확인되어 GA-B이 잘 발현되었음을 확인할 수 있었다.
<실시예 2> ADC의 세포 내 흡수 효과 확인
실험예 5에서 준비한 ADC 샘플의 항암효과를 확인하기 위해서, CA-ED에 의해 ADC 복합체가 형성된 FITC-BSA의 FACS 분석결과를 확인했다. 이때, 항체는 HER2 양성을 타겟으로 하기 위해 트라스투주맙(Trastuzumab)을 사용하였다.
그 결과, 도면 5a에 따르면, CA-ED에 의해 HER2 양성인 SK-BR-3에서 세포내 흡수 및 형광 강도가 증가하였으며 HER2 음성인 MDA-MB-231에서는 감소하였음을 확인하였다. 또한, 도면 5b에 따르면, GA-B에 의해 HER2 양성인 SK-BR-3에서 세포내 흡수 및 형광 강도가 증가하였음을 확인하였다.
또한, GA-B에 의해 ADC 복합체가 형성된 FITC-BSA의 FACS 분석결과를 확인했다. 이때, 항체는 HER2 양성을 타겟으로 하는 트라스투주맙과 타겟으로 하지 않는 니볼루맙(Nivolumab)을 사용하였다.
그 결과, 도 6a에 따르면, HER2 양성인 SK-BR-3에서는 트라스투주맙이 연결된 복합체는 세포내 흡수가 증가하였고 니볼루맙이 연결된 복합체는 감소하였음을 확인하였다. 또한, 도면 6b에 따르면, HER2 음성인 MDA-MB-231에서는 트라스투주맙과 니볼루맙 모두 표적이 불가능하여 세포내 흡수가 감소하였음을 확인하였다.
이러한 결과는 CA-ED와 GA-B 모두 항체에 FITC-BSA를 잘 결합하고 표적 세포내에 흡수됨을 알 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> University of Ulsan Foundation For Industry Cooperation <120> Recombination fusion protein binding antibody and antibody-drug conjugates using the same <130> ADP-2022-0205 <150> KR 10-2021-0059904 <151> 2021-05-10 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 459 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CA645 <400> 1 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Thr Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 225 230 235 240 Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser 245 250 255 Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Pro Ser Val Trp 260 265 270 Ser Asn Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 275 280 285 Leu Leu Ile Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg 290 295 300 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser 305 310 315 320 Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gly Gly Tyr Ser 325 330 335 Ser Ile Ser Asp Thr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 340 345 350 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Pro Lys Ala Asp Ala Gln 85 90 95 Gln Asn Asn Phe Asn Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu 100 105 110 Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Ala Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser 115 120 125 Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu Gly Glu Ala Lys 130 135 140 Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys 145 150 <210> 3 <211> 172 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GA123 <400> 3 Ala Lys Ala Leu Ala Glu Ala Lys Glu Thr Ala Lys Lys His Ile Asp 1 5 10 15 Ser Leu Asn His Leu Ser Glu Thr Ala Lys Lys Leu Ala Lys Asn Asp 20 25 30 Ile Asp Ser Ala Thr Thr Ile Asn Ala Ile Asn Asp Ile Val Ala Arg 35 40 45 Ala Asp Val Met Glu Arg Lys Thr Ala Glu Lys Glu Glu Ala Glu Lys 50 55 60 Leu Ala Ala Ala Lys Glu Thr Ala Lys Lys His Ile Asp Glu Leu Lys 65 70 75 80 His Leu Ala Asp Lys Thr Lys Glu Leu Ala Lys Arg Asp Ile Asp Ser 85 90 95 Ala Thr Thr Ile Asn Ala Ile Asn Asp Ile Val Ala Arg Ala Asp Val 100 105 110 Met Glu Arg Lys Thr Ala Glu Lys Glu Glu Ala Glu Lys Leu Ala Ala 115 120 125 Ala Lys Glu Thr Ala Lys Lys His Ile Asp Glu Leu Lys His Leu Ala 130 135 140 Asp Lys Thr Lys Glu Leu Ala Lys Arg Asp Ile Asp Ser Ala Thr Thr 145 150 155 160 Ile Asp Ala Ile Asn Asp Ile Val Ala Arg Ala Asp 165 170 <210> 4 <211> 145 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B12 <400> 4 Thr Pro Glu Pro Glu Glu Glu Val Thr Ile Lys Ala Asn Leu Ile Phe 1 5 10 15 Ala Asp Gly Ser Thr Gln Asn Ala Glu Phe Lys Gly Thr Phe Ala Lys 20 25 30 Ala Val Ser Asp Ala Tyr Ala Tyr Ala Asp Ala Leu Lys Lys Asp Asn 35 40 45 Gly Glu Tyr Thr Val Asp Val Ala Asp Lys Gly Leu Thr Leu Asn Ile 50 55 60 Lys Phe Ala Gly Lys Lys Glu Lys Pro Glu Glu Pro Lys Glu Glu Val 65 70 75 80 Thr Ile Lys Val Asn Leu Ile Phe Ala Asp Gly Lys Thr Gln Thr Ala 85 90 95 Glu Phe Lys Gly Thr Phe Glu Glu Ala Thr Ala Lys Ala Tyr Ala Tyr 100 105 110 Ala Asp Leu Leu Ala Lys Glu Asn Gly Glu Tyr Thr Ala Asp Leu Glu 115 120 125 Asp Gly Gly Asn Thr Ile Asn Ile Lys Phe Ala Gly Lys Glu Thr Pro 130 135 140 Glu 145 <210> 5 <211> 705 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CA-ED <400> 5 Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Asn Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val 20 25 30 Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp 35 40 45 Leu Ser Asn Tyr Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly 50 55 60 Leu Glu Trp Ile Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala 65 70 75 80 Thr Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe 115 120 125 Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 130 135 140 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 145 150 155 160 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 165 170 175 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 180 185 190 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 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Asn Gly Glu Tyr Thr Val Asp Val Ala Asp Lys Gly Leu Thr Leu 325 330 335 Asn Ile Lys Phe Ala Gly Lys Lys Glu Lys Pro Glu Glu Pro Lys Glu 340 345 350 Glu Val Thr Ile Lys Val Asn Leu Ile Phe Ala Asp Gly Lys Thr Gln 355 360 365 Thr Ala Glu Phe Lys Gly Thr Phe Glu Glu Ala Thr Ala Lys Ala Tyr 370 375 380 Ala Tyr Ala Asp Leu Leu Ala Lys Glu Asn Gly Glu Tyr Thr Ala Asp 385 390 395 400 Leu Glu Asp Gly Gly Asn Thr Ile Asn Ile Lys Phe Ala Gly Lys Glu 405 410 415 Thr Pro Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 420 425 430 Gly Ser Ile Glu His His His His His His Gly 435 440

Claims (17)

  1. 분비 펩타이드(Secretoty peptide), 알부민 결합 도메인(Albumin binding domain) 및 항체 결합 도메인(Antibody binding domain)을 포함하는 재조합 융합 단백질.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 알부인 결합 도메인은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 CA645이고, 항체 결합 도메인은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 ED인 것을 특징으로 하는 재조합 융합 단백질.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 알부인 결합 도메인은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 GA123이고, 항체 결합 도메인은 서열번호 4로 표시되는 아미노산을 갖는 B12인 것을 특징으로 하는 재조합 융합 단백질.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 재조합 융합 단백질은 IgG 카파 서열(IgG kappa chain)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 융합 단백질.
  5. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 상기 재조합 융합 단백질은 프로모터를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 융합 단백질.
  6. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 상기 재조합 융합 단백질은 히스티딘 태그를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 융합 단백질.
  7. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 상기 재조합 융합 단백질은 서열번호 5 또는 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 융합 단백질.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 재조합 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자.
  9. 제 8항 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터.
  10. 제 9항의 재조합 발현 벡터로 형질전환된 재조합 세포.
  11. 제 10항의 재조합 세포를 배양하여 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 따른 재조합 융합 단백질을 발현시키는 단계; 및 상기 발현된 재조합 융합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 따른 재조합 융합 단백질 생산방법.
  12. 제 1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 재조합 융합 단백질을 포함하는 항체-약물 접합체.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 재조합 융합 단백질의 항체 결합 도메인이 항체와 결합하며, 알부민 결합 도메인이 알부민과 결합하는 것을 특징으로 하는 항체-약물 접합체.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 항체는 모노클로날 항체, 이중특이적 항체, 키메릭 항체, 인간 항체 및 인간화 항체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 항체-약물 접합체.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 항체는 암 특이 항원, 세포 표면 수용체 단백질, 세포 표면 단백질, 막횡단 단백질, 신호전달 단백질, 세포생존 조절인자, 세포 증식 조절인자, 조직 발달 또는 분화와 연관된 분자, 림포카인, 사이토카인, 세포 주기 조절에 관련된 분자, 혈관형성에 관련된 분자, 또는 혈관신생에 관련된 분자에 대한 결합능과 특이성을 가지는 것을 특징으로 하는 항체-약물 접합체.
  16. 제 15항에 있어서, 상기 항체는 항-HER2 항체, 항-EGFR 항체, 항-CD19 항체, 항-CD33 항체, 항-메소텔린(mesothelin) 및 항-CD20로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 항체-약물 접합체.
  17. 제 15항에 있어서, 상기 약물은 파클리탁셀, 젬시타빈, 시스플라틴, 엠탄신 및 플루다라빈로 이루어진 군에서 선택된 약물을 알부민에 결합시킨 알부민 결합 나노입자인 것을 특징으로 하는 항체-약물 접합체.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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