WO2019013674A1 - Получение пегилированных фрагментов gd2-специфичных антител, индуцирующих прямую клеточную гибель gd2-позитивных опухолевых клеток, и их применение в терапии gd2-позитивных опухолей - Google Patents

Получение пегилированных фрагментов gd2-специфичных антител, индуцирующих прямую клеточную гибель gd2-позитивных опухолевых клеток, и их применение в терапии gd2-позитивных опухолей Download PDF

Info

Publication number
WO2019013674A1
WO2019013674A1 PCT/RU2018/050076 RU2018050076W WO2019013674A1 WO 2019013674 A1 WO2019013674 A1 WO 2019013674A1 RU 2018050076 W RU2018050076 W RU 2018050076W WO 2019013674 A1 WO2019013674 A1 WO 2019013674A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
fragments
sequence
antibodies
seq
multivalent
Prior art date
Application number
PCT/RU2018/050076
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Роман Васильевич ХОЛОДЕНКО
Игорь Игоревич Доронин
Ирина Викторовна ХОЛОДЕНКО
Original Assignee
Общество с ограниченной ответственностью "Реал Таргет"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Общество с ограниченной ответственностью "Реал Таргет" filed Critical Общество с ограниченной ответственностью "Реал Таргет"
Publication of WO2019013674A1 publication Critical patent/WO2019013674A1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3053—Skin, nerves, brain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3076—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties
    • C07K16/3084—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties against tumour-associated gangliosides

Definitions

  • This invention relates to biotechnology and medicine, in particular, to new protein structures based on antibody fragments that specifically bind GD2 ganglioside, and the use of these structures for the treatment of cancer.
  • GD2 ganglioside is specifically presented on the surface of tumor cells of various origins, including neuroblastomas, melanomas, gliomas, retinoblastomas, melanomas, small cell lung cancer, osteosarcoma, rhabdomyosarcoma, Ewing's sarcoma.
  • CO2-positive tumors account for about 10% of the total number of oncological diseases, and for many of them, the extremely limited effectiveness of classical therapies is typical.
  • Unituxin is characterized by significant efficacy and increases by 20% the 5-year survival rate of patients with high-risk neuroblastoma in combination therapy compared with the survival rate of patients who received only chemotherapy.
  • Unituxin has a number of side effects. The main ones are: fever, pain, rash, fever, anemia, mainly caused by hyperactivation of the immune system and neurotoxicity. It was shown that the identified side effects are mainly due to the binding of antibodies to normal non-tumor cells, for example, with peripheral neurons expressing GD2 ganglioside on their surface. After binding to cells, the Fc region of full-length antibodies interacts with the effector cells of the immune system and proteins of the complement system, which leads to damage to peripheral neurons (Yuki N, et al.
  • Classic antibody molecules have several advantages over other therapeutic proteins. This is primarily a high specificity for the target and stability in aqueous solution, as well as a long circulation time in the bloodstream, due to binding to the FcRn receptor.
  • a disadvantage of classical antibody molecules is their large size (150 kDa), which makes it difficult for them to penetrate deep into solid tumors.
  • the Fc region of antibodies mediates the cytotoxic properties of antibodies when bound to a ligand on the surface of cells through the mechanisms of ADCC and CDC.
  • Fab fragments, scFv fragments, BiTE, etc. preparations based on antibody fragments (Fab fragments, scFv fragments, BiTE, etc.) are being developed, which possess other mechanisms of antitumor action and are used as in independent form (bispecific and multivalent antibody fragments), and as part of complex systems of antitumor therapy (targeted nanoparticles, CAR-T cells, immunotoxins, etc.).
  • C02-positive neoplasms are solid tumors characterized by a low antitumor efficacy of monoclonal antibodies, due to the large size of these molecules.
  • undesirable side effects of therapy are often due to the presence of Fc-mediated cytotoxicity. Therefore, due to the general increase in the prevalence of various types of oncological diseases in Russia and in the world, as well as the lack of effective and safe methods of treatment of 002-positive tumors, there is a significant need to create a new format medicine based on antibodies to GD2.
  • This invention has a number of properties necessary to solve the problem, and therefore expands the range of existing candidates for the treatment of 002-positive oncological diseases.
  • the present invention is the creation of a therapeutic agent based on antibodies to GD2 and the development of an effective and safe method of treating patients with cancer characterized by the presence of GD2 ganglioside on the surface of tumor cells. It is also an object of the present invention to expand the arsenal of means for suppressing the proliferation and induction of the death of C02-positive tumor cells.
  • each of these functional antibody fragments contains at least (a) one heavy chain variable domain containing H-CDR1 of SEQ ID NO: 1, H-CDR2 of SEQ ID NO: 2, and H-CDR3 with sequence SEQ ID NO: 3, and (b) one light chain variable domain containing L-CDR1 with sequence SEQ ID NO: 4, L-CDR2 with sequence SEQ ID NO: 5, and L-CDR3 with sequence SEQ ID NO : 6.
  • this multivalent construct is capable of binding two or more ganglioside GD2 molecules.
  • the conjugation of these functional antibody fragments can occur through the formation of covalent bonds between the thiol group of the unpaired C-terminal cysteine antibody fragment and the maleimide groups of the PEG molecule.
  • this multivalent construct is characterized in that it contains two, three or four functional fragments of antibodies, each of which contains one fragment of a heavy chain, containing a sequence homologous to at least 90% of the sequence SEQ ID NO: 7, and one fragment light chain containing a sequence homologous to at least 90% of the sequence SEQ ID NO: 8.
  • this multivalent construct is characterized in that it contains two, three or four functional fragments of antibodies, each of which contains one fragment of the heavy chain, containing the sequence of SEQ ID NO: 9, and one fragment of the light chain, containing the sequence of SEQ ID NO: ten.
  • this multivalent construct is characterized in that it contains two, three or four functional fragments of antibodies, each of which contains a sequence that is homologous to at least 90% of the sequence of SEQ ID NO: 1 1.
  • this multivalent construct is characterized in that it contains two, three or four functional fragments of antibodies, each of which contains a sequence homologous to at least 90% of the sequence of SEQ ID NO: 12.
  • this multivalent construct is characterized in that it contains two, three or four functional fragments of antibodies, each of which contains a sequence that is homologous to at least 90% of the sequence of SEQ ID NO: 13.
  • this multivalent construct is characterized in that it contains two, three or four functional fragments of antibodies, each of which contains a sequence that is homologous to at least 90% of the sequence of SEQ ID NO: 14.
  • this multivalent construct is characterized in that the polyethylene glycol molecule used for conjugation has a linear structure and a molecular weight of from 5 to 40 kDa. In other embodiments of the invention, this multivalent construct is characterized in that the polyethylene glycol molecule used for conjugation has a branched structure and a molecular weight of from 5 to 40 kDa.
  • This problem is also solved by creating a pharmaceutical composition for the treatment of cancer, containing the above options multivalent constructs in a therapeutically effective amount, as well as containing a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a pharmaceutical composition for the treatment of cancer containing the above options multivalent constructs in a therapeutically effective amount, as well as containing a pharmaceutically acceptable carrier.
  • described method of treating cancer including the introduction to the patient a therapeutically effective amount of the above pharmaceutical composition.
  • the oncological disease for which this pharmaceutical composition is applicable is neuroblastoma, retinoblastoma, melanoma, small cell lung cancer, osteosarcoma, rhabdomyosarcoma, glioma, Ewing sarcoma or any other 002-positive tumor, as well as any tumor, individual cell subpopulations of which express gangocellulose gangomas, or any other 002-positive tumor, as well as any tumor, individual cell subpopulations of which express a ganoma. .
  • cell subpopulations that express GD2 ganglioside may be cancer stem cells remaining in the body after undergoing a course of treatment for a C02-negative tumor (for example, a course of chemo- or radiotherapy).
  • a method for killing a cell in a subject, on the surface of which is a GD2 ganglioside comprising administering to this subject a therapeutically effective amount of the above-described pharmaceutical composition.
  • a new version of a therapeutic agent based on fragments of antibodies to GD2 has been created for the treatment of oncological diseases characterized by the presence of GD2 ganglioside on the surface of tumor cells;
  • the resulting therapeutic agent has a number of properties necessary for its effective and safe use: multivalency, relatively good stability and increased time in the bloodstream, as well as the absence of undesirable effector functions inherent in full-length antibodies;
  • Fig.1 The scheme for obtaining multimeric fragments of 002-specific antibodies.
  • 1 B production of scFv tetramers using PEG-Maleimide 4.
  • FIG. 3 A - chromatographic separation of pegylated scFv fragments of GD2-specific antibodies using PEG-maleimide2. B - Western blot analysis of the obtained fractions and the original sample after the pegylation reaction. 1-fraction of pegylated scFv dimers; 2 — fraction of pegylated scFv monomers; 3-scFv fraction; 4-total protein mixture after the reaction tahilramani.
  • Fig. 4 Evaluation of GD2 Ganglioside Binding of the Original and Modified ScFv Fragments of 002-Specific Antibodies Obtained Using PEG-Maleimide2. And direct enzyme immunoassay, ganglioside GD2 is sorbed on the substrate.
  • B flow cytofluorimetry. Staining of a C02-positive EL-4 cell line.
  • MFI is the average fluorescence intensity.
  • Fig. 7 Dynamics of the fall of intravenously administered fluorescently-labeled antibody fragments in the blood of Balb / c mice. And - the initial and modified scFv-fragments of CO2-specific antibodies. B - initial and modified Fab-fragments of CO2-specific antibodies.
  • Fig. 8 The dynamics of the incidence of intravenously administered fluorescently-labeled monomers of scFv-fragments of antibodies modified by PEG molecules of different molecular weights and shapes in the blood of Balb / c mice.
  • Y - denotes the branched structure of the PEG molecule.
  • subject is meant a human or other mammal.
  • GD2 is a ganglioside in the present description called disialoganglioside, expressed on the surface of neuroectodermal tumor cells with the following IUPAC formula: (2R, 4R, 5S, 6S) -2- [3 - [(2S, 3S, 4R, 6S) -6- [( 2S, 3R, 4R, 5S, 6R) -5 - [(2S, 3R ⁇ R, 5R, 6R) -3-acetamido-4,5-dihydroxy-6- (hydroxymethyl) oxan-2-yl] oxy-2 - [(2R, 3S, 4R, 5R, 6R) -4,5-dihydroxy-2- (hydroxymethyl) -6 - [(E) -3-hydroxy-2- (octadecanoylamino) octadec-4-enoxy] oxan- 3-yl] oxy-3-hydroxy-6- (hydroxymethyl) oxan-4-yl] oxy
  • antibody is equivalent to the term “immunoglobulin” and means a glycoprotein consisting of two heavy (H) chains and two light (L) chains linked by disulfide bonds.
  • Each heavy chain consists of a heavy chain variable region (VH) and a heavy chain constant region.
  • the constant region of the heavy chain consists of three domains - CH1, CH2 and CH3.
  • Each light chain consists of a light chain variable region (VL) and a light chain constant region.
  • the constant region of the light chain consists of one CL domain.
  • VH and VL regions can be further subdivided into hypervariable regions, referred to as complementarity determining regions (H-CDR and L-CDR), separated by more conservative regions, called framework regions (FR).
  • Each VH and VL region consists of three CDRs and four FRs located from the amino end to the carboxy end in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
  • the variable regions of the heavy and light chains contain a binding domain that interacts with the antigen (i.e., the antigen-binding portion of the antibody).
  • the Fc region of an immunoglobulin molecule consists of a dimer formed by the CH2 and CH3 domains of two heavy chains; The Fc region mediates antibody effector functions, that is, the interaction of an immunoglobulin molecule with host tissue or factors, including various cells of the immune system (for example, effector cells) and the first component (C1q) of the classical complement system.
  • the term "functional antibody fragment” as used herein means one or more antibody fragments that retain the ability to specifically bind to an antigen (eg, GD2 ganglioside).
  • functional fragments include (i) a Fab fragment, a monovalent fragment consisting of VL, VH, CL and CH1 domains; (i) a P (ab ') 2-fragment, a bivalent fragment comprising two Fab fragments linked by a disulfide bridge in the hinge region; (iii) an Fv fragment consisting of the VL and VH domains of one arm of an antibody; (iv) two domains of the Fv fragment, VL and VH, joined together by a synthetic linker into one protein chain, in which the VL and VH regions mate to form a monovalent construct (known as a single chain Fv fragment (scFv); see, for example, Bird et al., Science, 1988, 242: 423-426).
  • scFv single chain Fv fragment
  • the multivalent construct of the present invention may contain from two to several functional fragments of antibodies, each of which is able to specifically bind to the GD2 ganglioside; thus, it contains two or more antigen-binding sites.
  • Functional antibody fragments in a multivalent construct may include variable regions, as well as, sometimes, constant regions derived from immunoglobulin sequences that specifically bind GD2.
  • the functional fragments of the multivalent structure of the present invention do not have or have reduced effector functions. Multivalency, i.e. the ability to bind at once several antigen molecules provides the constructs of the present invention with high avidity (stability of interaction between the structure and the cell expressing antigens on the surface), which in turn provides improved functional properties of the structure.
  • Chimeric fragments mean antibody fragments that include the sequences of the variable region of the heavy and / or light chains from one species and the sequence of the constant region from another species.
  • Humanized fragments means antibody fragments that include sequences of fragments human antibodies, in which some CDR residues and possibly some remnants of the framework region (FR) are replaced by residues from similar sites from rodent antibodies.
  • functional antibody fragments according to the invention contain regions of heavy and / or light chains, including amino acid sequences homologous to the amino acid sequences described in Table 1 of the preferred antibody fragments, where these functional antibody fragments retain the desired functional properties according to the invention (binding to ganglioside GD2 and induction of cell death).
  • Homologous antibody fragments can be obtained by mutagenesis (for example, site-directed or PCR-mediated mutagenesis) of the respective nucleic acid molecules, followed by testing the encoded modified antibody fragment to preserve its functions in accordance with the functional analyzes described here.
  • the term “homology of two sequences” is equivalent to the term “percent identity of two sequences”.
  • the percentage of identity of two sequences is determined by the number of positions of identical amino acids in these two sequences, taking into account the number of spaces and the length of each gap, which must be entered for optimal matching of the two sequences by alignment.
  • the percent identity is equal to the number of identical amino acids in these positions, taking into account sequence alignment, divided by the total number of positions and multiplied by 100.
  • the percent identity of two amino acid sequences can be determined using the free NCBI Protein BLAST program (https: //blast.ncbi.nlm. nih.gov/).
  • pharmaceutically acceptable carrier refers to such carriers, solvents and / or excipients which, as inactive ingredients, as part of a medical report, are suitable for use in contact with human and animal tissues without undue toxicity, irritation , allergic reaction, etc. and meet a reasonable balance of benefits and risks.
  • “Inactive ingredients” are part of the drug or vaccine preparation to improve its solubility and / or stability, as well as to improve the pharmacokinetics and more efficient delivery to specific organs or tissues.
  • Inactive ingredients include a variety of substances known to experts in the field of pharmaceuticals, such as substances for controlling pH or osmotic pressure, antibacterial agents, antioxidants, surface active substances (for example, polysorbate 20 or 80), cryostabilizers, preservatives, solvents, thickeners, fillers, carriers (micro or nano-particles) and other substances.
  • substances for controlling pH or osmotic pressure such as substances for controlling pH or osmotic pressure, antibacterial agents, antioxidants, surface active substances (for example, polysorbate 20 or 80), cryostabilizers, preservatives, solvents, thickeners, fillers, carriers (micro or nano-particles) and other substances.
  • terapéuticaally effective amount means that amount of a pharmaceutical composition that, when ingested, will effectively induce the elimination of tumor cells expressing the GD2 ganglioside.
  • effective amount refers to a combination of the quantities of active ingredients, the reception of which leads to a preventive or therapeutic effect with sequential or simultaneous use. The exact amount required may vary from subject to subject, depending on the type of mammal, the age and general condition of the patient, the severity of the disease, the method of administering the drug, the combined treatment with other drugs, etc.
  • the pharmaceutical composition described in the present invention can be introduced into the patient's body in any amount and by any route of administration effective for the treatment and / or prevention of cancer.
  • Ganglioside GD2 is characterized by a low level of expression on some types of healthy cells of the body (mainly peripheral neurons, CNS neurons, melanocytes and bone marrow MSCs), and is practically absent in other healthy cells of the body.
  • healthy cells of the body mainly peripheral neurons, CNS neurons, melanocytes and bone marrow MSCs
  • Standard treatment methods for CO2-positive tumors have strong side effects and are ineffective.
  • monoclonal antibody to GD2 also has low efficacy and pronounced side effects, much of which are due to the presence of the Fc fragment in the antibody and the associated activation function of the complement system.
  • Another disadvantage is the relatively large size of the antibody (150 kDa), which makes it difficult to penetrate deep into the tumors.
  • the 002-binding antibody fragments without the Fc-domain had significant drawbacks: a shorter lifetime in the bloodstream and, sometimes, less effective induction of cell death compared to full-length antibodies.
  • a pegylation procedure was used - covalent conjugation with a polyethylene glycol (PEG) molecule. This method has been repeatedly successfully used for other protein molecules. This procedure did increase the duration of the presence of GD2-binding antibody fragments in the bloodstream, but the efficiency of induction of cell death of tumor cells was not always sufficient.
  • a PEG molecule as part of a multivalent construct improves the pharmacokinetic characteristics of the molecule by reducing hepatic clearance and reducing absorption by the reticuloendothelial system; in addition, tahilramani significantly increases the EPR effect (enhanced permeation and retention effect) - the property of the drug is mainly localized in the tumor when administered intravenously.
  • the drug accumulated as a result of passive targeted delivery in the tumor growth focus, will actively and selectively interact only with tumor cells overexpressing the ganglioside GD2.
  • the described multimerization using the PEG molecule improves both the pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of fragments of antibodies to GD2.
  • Fragments of 002-specific antibodies can be produced using recombinant expression vectors known in the art.
  • the choice of promoters and other regulatory elements may vary depending on the preferences of the specialist or on the expression of the host cell selected. Below for illustration are possible embodiments of the invention.
  • Recombinant antibody fragments can be obtained in at least three expression systems — in E. coli, Pichia Pastoris, and CHO cells. Based on the sequence of the variable domains of the light and heavy chains of the antibody 14G2a (Bolesta E et al., Cancer Res., 2005, Apr 15; 65 (8): 3410-8), the design of scFv and Fab fragments of CO2-specific antibodies was carried out . The scFv and Fab cDNAs optimized for maximum expression in the corresponding system were synthesized by Genscript. The amino acid sequences of the antibody fragments used in the preferred embodiments of the invention are shown in Table 1.
  • SEQ ID NO: 1 TFGAGTKLELKGGGSGGGSGGGSGGGSEVQLLQSGPELEKPSASVMISC
  • pET22b + / scFv and pET22b + / Fab were transformed into E. coli Rosetta2 (DE3) pLysS or HMS174 (DE3) pLysS strains, and the expression was induced by a standard protocol known to specialists for 4 hours at 25 ° C or 22 hours at 20 ° C.
  • the amount and localization of the protein was assessed using a BugBuster Protein extraction reagent (Novagen, USA) in accordance with the manufacturer's instructions.
  • E. coli cells precipitated from 0.5 l of culture were carefully resuspended in 5 ml of cold lysing buffer (50 mM NaHPPc, 300 mM NaCI, 10 mM imidazole, 0.5 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), pH 7.2, and additionally cooled for 15 min on ice. Then the suspension was treated with ultrasound until complete destruction of the cells. The resulting lysate was centrifuged at 10,000 g for 20 minutes at 4 ° C.
  • cold lysing buffer 50 mM NaHPPc, 300 mM NaCI, 10 mM imidazole, 0.5 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), pH 7.2
  • the precipitate containing cell debris was removed.
  • the transfer of the protein into the final buffer (phosphate buffer (PBS), supplemented with 0.02% NaN 3 ) was carried out by centrifugation on Amicon Ultra-4 filters with a pore diameter of 10 kDa.
  • the corresponding cDNA was inserted into the pPICZalphaB vector at the Xhol / Notl restriction sites.
  • the propeptide for secretion (alpha factor from Saccharomyces cerevisiae) was in the same reading frame with antibody fragments.
  • the protease action sites of Keh2 (EKRE) and Ste13 (EA EA) were provided. Cloning was performed in a standard E. coli XL1-blue strain, selection was carried out by plating on low-salt LB medium with 25 ⁇ g / ml zeocin.
  • Electroporation was used to transfect cells of the Pichia pastoris strains GS1 15 and smd1 168h according to the instructions for the EasySelect Pichia Expression Kit (Invitrogen). Transformants were sown on YPDS-arap medium with different concentrations of zeocin (500-2000 ⁇ g / ml), transformants grew by 4-5 days. The obtained colonies were seeded to obtain individual clones, which were sown on BMGH medium in 24-well plates and incubated at 30 ° C and 200 rpm for three days. The cells were then harvested by centrifugation at 1500 * d and room temperature, and sown on VMMN medium in 24-well plates. Then incubated at 30 ° C and 200 rpm for 4 days. 0.5% methanol was added every day. After incubation, the cells were separated by centrifugation at 5000 * d, the supernatants were left for analysis.
  • scFv and Fab fragments of CO2-specific antibodies were inserted into vectors for stable expression in DXB-11 CHO cells deficient in the dihydrofolate reductase gene (DHFR).
  • DHFR dihydrofolate reductase gene
  • the DNA light chain coding sequence was obtained by PCR; further, cloning by Xbal and Notl sites into the pcDNA3.3 expression vector with modified polylinker (Thermo Fisher Scientific) was used. Cloning of a portion of the heavy chain was carried out in the pOptiVec vector (Thermo Fisher Scientific) using Xbal and Nhel restriction sites.
  • scFv gene For the scFv gene, cloning by Xbal and Notl sites into the expression vector pcDNA3.3 was used. The resulting constructs were verified by sequencing. DNA preparations were purified by ion exchange chromatography and used to transfect DXB-1 cells 1. The introduction of expression constructs into cells was performed using electroporation on a Gene Pulser Xcell System device (BioRad), using a mixture of plasmids carrying the heavy and light chains of the antibody. 48 hours after the start of the transfection, the culture medium was changed to serum-free medium containing 200 ⁇ g / ⁇ l G418 and devoid of hypoxanthine and thymidine. Cultivation was continued for 19 days, during which regular cell measurement was performed.
  • BioRad Gene Pulser Xcell System device
  • the stable cell pool was cloned by limiting dilutions (1 cell per well of a 96 well plate). Low concentrations of methotrexate (25nM) were added to the medium for cloning the cells. After another 14 days, the positive for cell growth wells were analyzed using enzyme immunoassay (ELISA) for the secretion of antibody fragments. Maximum production colonies were scaled to 24 well plates and subjected to a second round of amplification using 100 nM methotrexate. Maximum productivity clones were further amplified at 250 and 500 nM methotrexate, and then re-cloned by the method of limiting dilutions, as described above.
  • ELISA enzyme immunoassay
  • the resulting final clones with maximum productivity values and good growth rates were scaled and then cultured in suspension culture to obtain preparative amounts of antibody fragments.
  • a column with Protein L agarose from the HiTrap Protein L reagent kit (GE Healthcare, USA) was used. After washing and activation of the column with binding buffer, a lysate of E. coli cells was applied to it. The column was washed from unbound proteins, then eluted with Fab fragments using elution buffer. Purified fragments were collected in a 15 ml tube containing 750 ⁇ l of neutralizing buffer. The neutralized solution of the Fab fragments was transferred to phosphate buffer (PBS) containing sodium azide (0.02%) by centrifugation through Amicon Ultra filters (maximum transmittance of 100 kDa) at 1000 g for 20 minutes.
  • PBS phosphate buffer
  • Amicon Ultra filters maximum transmittance of 100 kDa
  • the purity of the obtained Fab and scFv fragments by protein electrophoresis was> 95%.
  • the resulting preparations were converted to PBS, pH 7.4, and then sterilized by filtration through a 0.22 ⁇ m membrane.
  • the protein concentration was determined spectrophotometrically at a wavelength of 280 nm. Multimerization of scFv and Fab fragments of CO2-specific antibodies through pegylation Multimerization is one of the strategies to improve the pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of antibody fragments.
  • the larger molecular size of multimers on the basis of antibody fragments increases the half-life in serum, as well as a more rapid uptake by the tumor due to the EPR effect, which leads to their better accumulation in the tumor compared to the original IgG antibodies or monomers of the fragments.
  • multimerization contributes to the multivalence against the target antigen, which not only leads to higher affinity due to the avidity effect, but also can contribute to the improvement of functional properties and compensate for the lack of induction of secondary immune functions of ADCC and CDC.
  • the Fc fragment of full-length antibodies largely determines the side effects, and the immune mechanisms of ADCC and CDC have a limited positive therapeutic effect.
  • the creation of multimeric fragments of C02-specific antibodies for the treatment of cancer has significant potential.
  • chromatographic purification was performed using anion-exchange chromatography or gel filtration.
  • cation-exchange chromatography was performed on a TSK-GEL SP-5PW column using an Beckman System gold HPLC system, mobile phase: elution buffer (25 mM CH 3 COOH, pH 4.0), linear 0 mM gradient - 250 mM NaCl (for 90 min at room temperature, the flow rate was chosen 1 ml / min).
  • FIG. 3 shows the chromatograms of the separation of scFv fragments after pegylation using PEG-maleimide2 and the separation of modified fragments by gel filtration on a Superdex 200 10/30 GL column. Evaluation of the antigen-binding properties of pegylated fragments of GD2-specific antibodies.
  • the obtained pegylated mono- and multimers of antibody fragments were compared by the efficiency of binding to the GD2 ganglioside by standard methods that are known in the art, namely, by ELISA and flow cytofluorimetry.
  • C02-specific antibodies and their pegylated derivatives were carried out using several classical methods, namely using the MTT test, PI test, and also using the DNA dye 7-AAD.
  • MTT test MTT test
  • PI test PI test
  • DNA dye 7-AAD DNA dye 7-AAD
  • the mouse lymphoma line EL-4 was used, which is characterized by overexpression of the ganglioside GD2.
  • the MTT test was performed using a standard colorimetric procedure.
  • Cells of C02-positive tumor lines were incubated in 96-well plates with serial dilutions of fragments of CO2-specific antibodies for 72 h, then centrifuged (8 min, 300 d), the precipitate was suspended and 30 ⁇ l / well of MTT solution (5 mg / ml in PBS) were added. After precipitation of formazan crystals (2-4 h), it was dissolved by adding 100 ⁇ l of DMSO.
  • Optical absorption was measured on a Multiscan FC plate spectrophotometer (Thermo Scientific, USA) at a wavelength of 540 nm.
  • PI propidium iodide Staining with propidium iodide
  • EL-4 cells were precipitated, fixed with ice-cold 70% EH for 1 hour at 4 ° C, washed twice in PBS (300 d, 10 min, 4 ° C). Then the cells resuspend the dip and in the DNA staining solution (PBS containing 20 ⁇ g / ml PI and 10 ⁇ g / ml RNase). The measurements were carried out on an EPICS ELITE flow cytometer (Coulter, USA). At least 1 ⁇ 10 4 cells were recorded in each sample. On histograms, cells with fragmented DNA were differentiated from normal cells by a lower fluorescence intensity. The results were processed using the WinMDI program.
  • the permeability of the plasma membrane of cells was evaluated using 7-AAD fluorescent DNA dye. Before staining, cells were washed once in PBS and 0.5 ml of 7-AAD solution (2 ⁇ g / ml) was added to the precipitate. Cell fluorescence was recorded cytofluorimetrically. At least 1 ⁇ 10 4 cells were recorded in each sample. The results were processed using the WinMDI program.
  • FIG. Figure 5 shows the cytotoxic activity data of scFv fragments of 002-specific antibodies and their pegylated derivatives (monomers, dimers, and tetramers).
  • Fab fragments In the case of Fab fragments, the cytotoxic activity of unmodified proteins was higher compared to unmodified scFv fragments.
  • the monomers of Fab fragments reduced viability at the maximum selected concentrations by up to 50% compared with control cells, and dimerizing Fab fragments led to an increase in cytotoxic activity when viability dropped to 30% (Fig. 6).
  • dimerization of the fragments leads to an increase in the functional activity of the protein.
  • the initial Fab fragments and pegylated monomers enhance cell death by about 5 times, and the dimers of pegylated Fab fragments more than 10 times (Fig. 6).
  • the unbound dye was purified by gel filtration, the ratio of protein molecules to dye in the conjugate was approximately 1: 1.
  • the choice of this fluorescent dye was due to the long-wavelength emission maximum (662 nm), which avoids the contribution of the serum autofluorescence to the assessment the fluorescence intensity of antibody fragments in circulating blood.
  • Fluorescently labeled samples of antibody fragments (100-150 ⁇ l) were administered intravenously to mice in an amount of 150 ⁇ g / mouse (7.5 mg / kg). Control mice were injected with PBS. At certain time intervals, blood was sampled from the tail vein of mice for subsequent preparation of serum and measuring the fluorescence of the conjugate, which allows determining the number of antibody fragments in blood plasma.
  • Fig. 7 shows the results of experiments on the example of antibody fragments modified by PEG molecules with a molecular weight of 10,000 Da.
  • Pegylation leads to a significant increase in the circulation time of antibody fragments in the blood of mice, as in the case of monomers and multimers of antibody fragments.
  • Unmodified scFv and Fab fragments are removed quickly, already 30 minutes after the injection, less than 10% and 15% of the injected sample remain in the circulation, respectively, only 2.5 and 8% after the introduction after 2.5 hours, respectively.
  • the number of circulating antibody fragments is much higher. So, after 0.5 and 2.5 hours after the introduction of pegylated monomers of scFv fragments, more than 50% and 20% remain, and in the case of pegylated monomers of Fab fragments, 58% and 26% of the injected sample remain in the blood.
  • Multimerization leads to a significant increase in the circulation time of antibody fragments in the blood of mice, especially clearly this pattern is traced for pegylated tetramers of scFv fragments and pegylated dimers of Fab fragments.
  • multimerization due to pegylation leads to an increase in the half-life of antibody fragments from several minutes to several hours (Fig. 7).
  • an increase in the molecular weight of PEG and the use of branched ⁇ -shaped PEG molecules leads to an increase in the circulation time of antibody fragments in the blood (Fig. 8).
  • pegylation with linear PEG molecules leads to a decrease in protein excretion from circulation as compared to the initial fragments and is directly dependent on the molecular weight of the PEG molecules used.
  • Pegylation of antibody fragments with PEG molecules with a molecular mass of 40 kDa and a branched ⁇ -shaped form leads to a significantly increased circulation time of modified antibody fragments in the blood (Fig. 8). Even a week after the injection, more than 2% of the injected sample is scFv-n3r40 Y is in circulation. Assessment of the stability of pegylated fragments of CO2-specific antibodies in comparison with unmodified fragments.
  • pegylation increases the stability of recombinant proteins in solution (Lawrence PB, Price JL Curr Opin Chem Biol. 2016 34: 88-94).
  • a temperature stress test for the original and modified fragments of CO2-specific antibodies.
  • 4 variants of pegylated scFv antibody fragments differing in the molecular weight of PEG molecules (2 kDa, 10 kDa, 20 kDa, and 40 kDa) were used, as well as the original unmodified scFV fragments.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Изобретение относится биотехнологии и фармацевтике, а именно к созданию мультивалентной белковой конструкции нового формата на основе нескольких фрагментов антител, конъюгированных с молекулой полиэтиленгликоля, и имеющих сродство к ганглиозиду GD2. Такая конструкция может служить активным действующим веществом в фармацевтических композициях, предназначенных для лечения многих видов онкологических заболеваний, характеризующихся экспрессией ганглиозида GD2 на поверхности опухолевых клеток, таких как нейробластома, мелкоклеточный рак легкого, саркома, глиома, ретинобластома, меланома и другие. Описанный новый терапевтический агент обладает рядом преимуществ по сравнению с моноклональными антителами против ганглиозида GD2, такими как мультивалентность и отсутствие нежелательных эффекторных функций, и поэтому может обеспечить больший уровень эффективности и безопасности при использовании в клинической практике.

Description

ПОЛУЧЕНИЕ ПЕГИЛИРОВАННЫХ ФРАГМЕНТОВ С02-СПЕЦИФИЧНЫХ АНТИТЕЛ, ИНДУЦИРУЮЩИХ ПРЯМУЮ КЛЕТОЧНУЮ ГИБЕЛЬ GD2-n03HTHBHblX ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В ТЕРАПИИ GD2-n03HTHBHblX
ОПУХОЛЕЙ
Область техники
Данное изобретение относится к биотехнологии и медицине, в частности, к новым белковым конструкциям на основе фрагментов антител, специфически связывающих ганглиозид GD2, и применению этих конструкций для лечения онкологических заболеваний.
Уровень техники
В настоящее время во всем мире остро стоят задачи по разработке новых адресных, высокоэффективных и низкотоксичных методов терапии онкологических заболеваний. Одним из таких наиболее перспективных направлений является иммунотерапия с использованием препаратов на основе моноклональных антител, направленных на таргетные опухолевые молекулы. Мишенями для иммунотерапии рака могут служить не только белки, но и гликосфинголипиды, в частности ганглиозиды. Например, ганглиозид GD2 специфически представлен на поверхности клеток опухолей различного происхождения, включая нейробластомы, меланомы, глиомы, ретинобластомы, меланомы, мелкоклеточный рак легких, остеосаркомы, рабдомиосаркомы, саркомы Юинга. По некоторым данным, С02-позитивные опухоли составляют около 10% от общего числа онкологических заболеваний, и для многих из них характерна крайне ограниченная эффективность классических методов терапии.
Применение антител к GD2 дало существенный эффект, выраженный в супрессии роста и гибели опухолевых клеток в экспериментах как in vitro, так и in vivo. Несколько препаратов С02-специфичных моноклональных антител в настоящее время проходят клинические испытания, которые свидетельствуют в пользу перспективности иммунотерапии в лечении С02-позитивных опухолей (Horta ZP, et al., Immunotherapy, September 2016, Vol. 8, No. 9, Pages 1097-1 1 17). Один препарат, Unituxin (на основе антитела Dinutuximab), связывающий GD2, был одобрен для клинического применения в 2015 году (Ploessl С, et al., Ann Pharmacother, May 2016, 50: 416-422). Unituxin характеризуется значимой эффективностью действия и повышает на 20% 5-летнюю выживаемость пациентов с нейробластомой высокого риска в комбинированной терапии по сравнению с выживаемостью пациентов, получавших только химиотерапию. Однако Unituxin обладает рядом побочных эффектов. Основными из них являются: жар, боль, сыпь, лихорадка, анемия, в основном вызванные гиперактивацией иммунной системы и нейротоксичностью. Было показано, что выявленные побочные эффекты в основном обусловлены связыванием антител с нормальными неопухолевыми клетками, например, с периферическими нейронами, экспрессирующими на своей поверхности ганглиозид GD2. После связывания с клетками происходит взаимодействие Fc-региона полноразмерных антител с эффекторными клетками иммунной системы и белками системы комплемента, что приводит к повреждению периферических нейронов (Yuki N, et al. J Neurol Sci., 1997, 149(2):127-130). Поэтому, одной из возможных стратегий для уменьшения побочных эффектов является изменение структуры или формата антител для снижения или полной отмены функциональных свойств Fc-региона. Было показано, что Fc-опосредованные цитотоксические функции антител не являются критически необходимыми для обеспечения противоопухолевого эффекта в случае 002-позитивных опухолей. Например, внесение точечной мутации в С02-специфичные антитела ch14.18 подавляло способность активировать комплемент-зависимый механизм клеточной гибели (CDC); такая мутация не приводила к снижению противоопухолевых эффектов антител, но при этом снижала побочные эффекты исходных С02-специфичных ch14.18, проявляющиеся в аллодинии (LS Sorkin et al, Pain, 2010 Apr; 149(1 ): 135-142). В другой работе (Cochonneau D et al, Cancer Lett, 2013; 333(2): 194-204) с использованием OAc- 002-специфичных антител 8B6 авторы показали, что однократно введенная внутривенно доза этих антител в NOD/SCID мышей статистически достоверно ингибировала рост опухоли. Поскольку в NOD/SCID мышах в силу отсутствия эффекторных клеток и циркулирующих белков системы комплемента проявление механизмов ADCC и CDC невозможно, то, по-видимому, проявление противоопухолевых эффектов вызывается другими механизмами, например, прямым цитотоксическим действием моноклональных антител. Сильное прямое цитотоксическое действие 002-специфичных моноклональных антител, характерное для разных типов 002-позитивных раков, показано в нескольких работах (Doronin I.I., et al., ВМС Cancer. 2014, Apr 28;14:295; Horwacik I., et al. Apoptosis, 2015 May;20(5):679-88.) .
Классические молекулы антител обладают рядом преимуществ по сравнению с другими терапевтическими белками. Это в первую очередь высокая специфичность к мишени и стабильность в водном растворе, а также продолжительное время циркуляции в кровотоке, обусловленное связыванием с FcRn рецептором. Недостатком классических молекул антител можно считать их большой размер (150 кДа), который затрудняет их проникновение вглубь солидных опухолей. В общем случае Fc-регион антител опосредует цитотоксические свойства антител при связывании с лигандом на поверхности клеток за счет механизмов ADCC и CDC. Также разрабатываются препараты на основе фрагментов антител (Fab-фрагменты, scFv-фрагменты, BiTE и т.д.), которые обладают другими механизмами противоопухолевого действия и используются как в самостоятельном виде (биспецифические и мультивалентные фрагменты антител), так и в составе комплексных систем противоопухолевой терапии (таргетные наночастицы, CAR-T клетки, иммунотоксины и пр.).
Большинство С02-позитивных новообразований представляют собой солидные опухоли, для которых характерна невысокая противоопухолевая эффективность моноклональных антител, обусловленная большими размерами этих молекул. Кроме того, нежелательные побочные эффекты терапии зачастую обусловлены наличием Fc- опосредованной цитотоксичности. Поэтому, в связи с общим ростом распространенности различных типов онкологических заболеваний в России и в мире, а также отсутствием эффективных и безопасных методов терапии 002-позитивных опухолей имеется существенная потребность в создании лекарства нового формата на основе антител к GD2. Данное изобретение обладает рядом свойств, необходимых для решения поставленной задачи, и поэтому расширяет круг имеющихся кандидатов для лечения 002-позитивных онкологических заболеваний.
Сущность изобретения
Задачей настоящего изобретения является создание терапевтического агента на основе антител к GD2 и разработка нового эффективного и безопасного способа лечения пациентов с онкологическими заболеваниями, характеризующимися присутствием ганглиозида GD2 на поверхности клеток опухоли. Также задачей настоящего изобретения является расширение арсенала средств для подавления пролиферации и индукции гибели С02-позитивных опухолевых клеток.
Указанные задачи решаются путем создания нового терапевтического агента для лечения онкологических заболеваний, представляющего собой мультивалентную конструкцию, содержащую по меньшей мере два функциональных фрагмента антител, специфически связывающих ганглиозид GD2 и соединенных между собой при помощи ковалентной конъюгации с молекулой полиэтиленгликоля (ПЭГ). В предпочтительных вариантах изобретения каждый из этих функциональных фрагментов антител содержит по крайней мере (а) один вариабельный домен тяжёлой цепи, содержащий H-CDR1 с последовательностью SEQ ID NO: 1 , H-CDR2 с последовательностью SEQ ID NO:2, и Н- CDR3 с последовательностью SEQ ID NO:3, и (б) один вариабельный домен легкой цепи, содержащий L-CDR1 с последовательностью SEQ ID NO:4, L-CDR2 с последовательностью SEQ ID NO:5, и L-CDR3 с последовательностью SEQ ID NO:6. Таким образом, данная мультивалентная конструкция способна связывать две или более молекулы ганглиозида GD2. В некоторых вариантах изобретения конъюгация указанных функциональных фрагментов антител может происходить с помощью образования ковалентных связей между тиоловой группой неспаренного С-концевого цистеина фрагмента антитела и малеимидными группами молекулы ПЭГ.
В некоторых вариантах изобретения данная мультивалентная конструкция отличается тем, что содержит два, три или четыре функциональных фрагмента антител, каждый из которых содержит один фрагмент тяжёлой цепи, содержащий последовательность, гомологичную по меньшей мере на 90% последовательности SEQ ID NO:7, и один фрагмент легкой цепи, содержащий последовательность, гомологичную по меньшей мере на 90% последовательности SEQ ID NO:8.
В других вариантах изобретения данная мультивалентная конструкция отличается тем, что содержит два, три или четыре функциональных фрагмента антител, каждый из которых содержит один фрагмент тяжёлой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO:9, и один фрагмент легкой цепи, содержащий последовательность SEQ ID NO: 10.
В некоторых вариантах изобретения данная мультивалентная конструкция отличается тем, что содержит два, три или четыре функциональных фрагмента антител, каждый из которых содержит последовательность, гомологичную по меньшей мере на 90% последовательности SEQ ID NO: 1 1.
В некоторых вариантах изобретения данная мультивалентная конструкция отличается тем, что содержит два, три или четыре функциональных фрагмента антител, каждый из которых содержит последовательность, гомологичную по меньшей мере на 90% последовательности SEQ ID NO:12.
В некоторых вариантах изобретения данная мультивалентная конструкция отличается тем, что содержит два, три или четыре функциональных фрагмента антител, каждый из которых содержит последовательность, гомологичную по меньшей мере на 90% последовательности SEQ ID NO: 13.
В некоторых вариантах изобретения данная мультивалентная конструкция отличается тем, что содержит два, три или четыре функциональных фрагмента антител, каждый из которых содержит последовательность, гомологичную по меньшей мере на 90% последовательности SEQ ID NO: 14.
В некоторых вариантах изобретения данная мультивалентная конструкция отличается тем, что используемая для конъюгации молекула полиэтиленгликоля имеет линейную структуру и молекулярную массу от 5 до 40 кДа. В других вариантах изобретения данная мультивалентная конструкция отличается тем, что используемая для конъюгации молекула полиэтиленгликоля имеет разветвленную структуру и молекулярную массу от 5 до 40 кДа.
Указанная задача также решается путем создания фармацевтической композиции для лечения онкологических заболеваний, содержащей вышеописанные варианты мультивалентных конструкций в терапевтически эффективном количестве, а также содержащей фармацевтически приемлемый носитель. В частном случае реализации изобретения описан способ лечения онкологического заболевания, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества вышеописанной фармацевтической композиции. Онкологическим заболеванием, для лечения которого применима данная фармацевтическая композиция, является нейробластома, ретинобластома, меланома, мелкоклеточный рак легких, остеосаркома, рабдомиосаркома, глиома, саркома Юинга или любая другая 002-позитивная опухоль, а также любая опухоль, отдельные клеточные субпопуляции которой экспрессируют ганглиозид GD2. В частных случаях, клеточными субпопуляциями, которые экспрессируют ганглиозид GD2, могут являться раковые стволовые клетки, оставшиеся в организме после прохождения курса лечения С02-негативной опухоли (например, курса химио- или радиотерапии). В некоторых вариантах изобретения описан способ уничтожения клетки в организме субъекта, на поверхности которой находится ганглиозид GD2, включающий введение этому субъекту терапевтически эффективного количества вышеописанной фармацевтической композиции.
При осуществлении изобретения достигаются следующие технические результаты: создан новый вариант терапевтического агента на основе фрагментов антител к GD2 для лечения онкологических заболеваний, характеризующихся присутствием ганглиозида GD2 на поверхности клеток опухоли; полученный терапевтический агент обладает рядом свойств, необходимых для его эффективного и безопасного использования: мультивалентность, относительно хорошая стабильность и увеличенное время нахождения в кровотоке, а также отсутствие нежелательных эффекторных функций, присущих полноразмерным антителам;
- разработана фармацевтическая композиция на основе мультивалентной конструкции, содержащей фрагменты антител к GD2;
- разработан новый способ лечения онкологических заболеваний;
- разработан новый эффективный способ уничтожения клетки в организме субъекта, на поверхности которой находится ганглиозид GD2.
Краткое описание рисунков
Рис.1. Схема получения мультимерных фрагментов 002-специфичных антител.
1 А - получение димеров scFv-фрагментов с использованием ПЭГ-Малеимид2.
1 Б - получение димеров Fab-фрагментов с использованием ПЭГ-Малеимид2.
1 В - получение тетрамеров scFv-фрагментов с использованием ПЭГ-Малеимид4. Рис. 2. Электрофорез образцов scFv-фрагментов 002-специфичных антител после проведения реакции пегилирования с использованием ПЭГ-малеимид2 и ПЭГ- малеимид4. 1 - белковый состав после реакции конъюгирования scFv-фрагментов с ПЭГ- малеимид2; 2 - исходные scFv-фрагменты; 3 - белковый состав после реакции конъюгирования scFv-фрагментов с ПЭГ-малеимид4.
Рис. 3. А - хроматографическое разделение пегилированных scFv-фрагментов GD2- специфичных антител с использованием ПЭГ-малеимид2. Б - вестерн-блот анализ полученных фракций и исходного образца после реакции пегилирования. 1 -фракция димеров пегилированных scFv; 2 -фракция мономеров пегилированных scFv; 3 -фракция scFv; 4 -общая белковая смесь после реакции пегилирования.
Рис. 4. Оценка связывания с ганглиозидом GD2 исходных и модифицированных scFv- фрагментов 002-специфичных антител, полученных с использованием ПЭГ-малеимид2. А - прямой иммуноферментный анализ, на подложке сорбирован ганглиозид GD2. Б - проточная цитофлуориметрия. Окрашивание С02-позитивной клеточной линии EL-4. К_2Ат - контрольные клетки, окрашенные вторичными анти-видовыми антителами. MFI - средняя интенсивность флуоресценции. Рис. 5. Оценка клеточной гибели под действием scFv-фрагментов С02-специфичных антител, полученных с использованием ПЭГ-малеимид, ПЭГ-малеимид2 и ПЭГ- малеимид4. А - МТТ-тест, 72 ч инкубации, Б - Pl-тест и 7ААО-тест, 24 ч. инкубации. К - интактные клетки. Рис. 6. Оценка клеточной гибели под действием Fab-фрагментов С02-специфичных антител, полученных с использованием ПЭГ-малеимид и ПЭГ-малеимид2. А - МТТ-тест, 72 ч инкубации, Б - Pl-тест и 7ААО-тест, 24 ч. инкубации. К - интактные клетки.
Рис. 7. Динамика падения внутривенно введенных флуоресцентно-меченных фрагментов антител в крови мышей линии Balb/c. А - исходные и модифицированные scFv- фрагменты С02-специфичных антител. Б - исходные и модифицированные Fab- фрагменты С02-специфичных антител.
Рис. 8. Динамика падения внутривенно введенных флуоресцентно-меченных мономеров scFv-фрагментов антител, модифицированных молекулами ПЭГ различной молекулярной массы и формы в крови мышей линии Balb/c. Y - обозначает разветвленную структуру молекулы ПЭГ. Определения и термины
Для лучшего понимания настоящего изобретения ниже приведены некоторые термины, использованные в настоящем описании изобретения.
В описании данного изобретения термины «включает» и «включающий» интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».
Под «субъектом» следует понимать человека или другое млекопитающее.
Ганглиозидом GD2 в настоящем описании называется дисиалоганглиозид, экспрессированный на поверхности опухолевых клеток нейроэктодермального происхождения со следующей IUPAC формулой: (2R,4R,5S,6S)-2-[3-[(2S,3S,4R,6S)-6- [(2S,3R,4R,5S,6R)-5-[(2S,3R^R,5R,6R)-3-acetamido-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2- yl]oxy-2-[(2R,3S,4R,5R,6R)-4,5-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-[(E)-3-hydroxy-2- (octadecanoylamino)octadec-4-enoxy]oxan-3-yl]oxy-3-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy- 3-amino-6-carboxy-4-hydroxyoxan-2-yl]-2,3-dihydroxypropoxy]-5-amino-4-hydroxy-6-(1 ,2,3- trihydroxypropyl)oxane-2-carboxylic acid.
Термин «антитело» эквивалентен термину «иммуноглобулин» и означает гликопротеин, состоящий из двух тяжелых (Н) цепей и двух легких (L) цепи, соединенных дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (VH) и константной области тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов - СН1 , СН2 и СНЗ. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (VL) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена CL. VH и VL-области могут быть далее подразделены на гипервариабельные участки, именуемые областями, определяющими комплементарность (H-CDR и L-CDR), разделенные более консервативными областями, именуемыми каркасными областями (FR). Каждая VH и VL область состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от амино-конца до карбокси-конца в следующем порядке: FR1 , CDR1 , FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат домен связывания, который взаимодействует с антигеном (то есть, антигенсвязывающую часть антитела). Fc-регион молекулы иммуноглобулина состоит из димера, образованного СН2 и СНЗ доменами двух тяжелых цепей; Fc-регион опосредует эффекторные функции антитела, то есть взаимодействие молекулы иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включающими различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (C1q) классической системы комплемента. Термин «функциональный фрагмент антитела» в использованном здесь значении означает один или несколько фрагментов антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном (например, ганглиозидом GD2). Примеры функциональных фрагментов включают (i) Fab-фрагмент, одновалентный фрагмент, состоящий из VL, VH, CL и СН1 доменов; (и) Р(аЬ')2-фрагмент, двухвалентный фрагмент, включающий два Fab-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) Fv-фрагмент, состоящий из VL и VH доменов одного плеча антитела; (iv) два домена Fv-фрагмента, VL и VH, объединённых при помощи синтетического линкера в одну белковую цепь, в которой VL и VH области спариваются с образованием одновалентной конструкции (известна как одноцепочечный Fv-фрагмент (scFv); см., например, Bird et al., Science, 1988, 242:423-426). Указанные фрагменты антител получают обычными методами, известными специалистам в данной области. В предпочтительных вариантах настоящего изобретения функциональные фрагменты антител не обладают или обладают сниженными эффекторными функциями; в частности, функциональные фрагменты антител могут не содержать Fc-регион.
Мультивалентная конструкция по настоящему изобретению может содержать от двух до нескольких функциональных фрагментов антител, каждый из которых способен специфически связываться с ганглиозидом GD2; таким образом, она содержит два или несколько антиген-связывающих участков. Функциональные фрагменты антител в мультивалентной конструкции могут включать вариабельные области, а также, иногда, константные области, выделенные из последовательностей иммуноглобулинов, специфически связывающих GD2. Предпочтительно, но без обязательных ограничений, функциональные фрагменты в составе мультивалентной конструкции по настоящему изобретению не обладают или обладают сниженными эффекторными функциями. Мультивалентность, т.е. способность связывать сразу несколько молекул антигена, обеспечивает конструкции по настоящему изобретению высокую авидность (стабильность взаимодействия между конструкцией и клеткой, экспрессирующей антигены на поверхности), что в свою очередь обеспечивает улучшенные функциональные свойства конструкции.
Используемые функциональные фрагменты антител по настоящему изобретению могут представлять собой «химерные» или «гуманизированные» фрагменты антител. Химерные фрагменты означают фрагменты антител, которые включают последовательности вариабельной области тяжелой и/или легкой цепей из одного вида и последовательности константной области из другого вида. Гуманизированные фрагменты означают фрагменты антител, которые включают последовательности фрагментов человеческих антител, в которых некоторые остатки CDR и, возможно, некоторые остатки каркасной области (FR) заменены остатками аналогичных сайтов из антител грызунов.
В некоторых вариантах изобретения функциональные фрагменты антител согласно изобретению содержат области тяжелых и/или легких цепей, включающие в себя аминокислотные последовательности, гомологичные аминокислотным последовательностям, описанным в Таблице 1 предпочтительных фрагментов антител, где указанные функциональные фрагменты антител сохраняют нужные функциональные свойства согласно изобретению (связывание с ганглиозидом GD2 и индукция клеточной гибели). Гомологичные фрагменты антител могут быть получены путем мутагенеза (например, сайт-направленного или ПЦР-опосредуемого мутагенеза) соответствующих молекул нуклеиновых кислот с последующим тестированием кодируемого модифицированного фрагмента антител на сохранение его функций в соответствии с описанными здесь функциональными анализами.
Используемый здесь термин «процент гомологии двух последовательностей» эквивалентен термину «процент идентичности двух последовательностей». Процент идентичности двух последовательностей определяется числом положений идентичных аминокислот в этих двух последовательностях с учетом числа пробелов и длины каждого пробела, которые необходимо ввести для оптимального сопоставления двух последовательностей путем выравнивания. Процент идентичности равен числу идентичных аминокислот в данных положениях с учетом выравнивания последовательностей, разделенному на общее число положений и умноженному на 100. Процент идентичности двух аминокислотных последовательностей может быть определен с помощью бесплатной программы NCBI Protein BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/). Термин «фармацевтически приемлемый носитель, растворитель и/или наполнитель» относится к таким носителям, растворителям и/или наполнителям, которые, являясь неактивными ингредиентами, в рамках проведенного медицинского заключения, пригодны для использования в контакте с тканями человека и животных без излишней токсичности, раздражения, аллергической реакции и т.д. и отвечают разумному соотношению пользы и риска. «Неактивные ингредиенты» входят в состав лекарственного средства или вакцинного препарата для улучшения его растворимости и/или стабильности, а также для улучшения фармакокинетики и более эффективной доставки к специфическим органам или тканям. Неактивные ингредиенты включают в себя множество веществ, известных специалистам в области фармацевтики, таких как вещества для контроля рН или осмотического давления, антибактериальные агенты, антиоксиданты, поверхностно активные вещества (например, полисорбат 20 или 80), криостабилизаторы, консерванты, растворители, загустители, наполнители, носители (микро- или нано-частицы) и другие вещества.
Термин «терапевтически эффективное количество» подразумевает такое количество фармацевтической композиции, которое при попадании в организм субъекта будет эффективно индуцировать элиминацию клеток опухоли, экспрессирующих ганглиозид GD2. При применении в комбинированной терапии термин «эффективное количество» относится к комбинации количеств активных ингредиентов, прием которых ведет к превентивному или терапевтическому эффекту при последовательном или одновременном приеме. Точное требуемое количество может меняться от субъекта к субъекту в зависимости от вида млекопитающего, возраста и общего состояния пациента, тяжести заболевания, методики введения препарата, комбинированного лечения с другими препаратами и т.п. Фармацевтическая композиция, описанная в настоящем изобретении, может быть введена в организм пациента в любом количестве и любым путем введения, эффективным для лечения и/или профилактики онкологических заболеваний.
Подробное раскрытие изобретения
Создание оптимального терапевтического агента на основе антител к GD2.
Ганглиозид GD2 характеризуется низким уровнем экспрессии на некоторых типах здоровых клеток организма (в основном, это периферические нейроны, нейроны ЦНС, меланоциты и МСК костного мозга), и практически отсутствует на других здоровых клетках организма. При опухолевой трансформации количество GD2 возрастает в десятки и более раз, составляя до 10% от всех липидов и до 90% от ганглиозидов плазматической мембраны. Стандартные методы терапии С02-позитивных опухолей обладают сильными побочными эффектами и малоэффективны. Единственный доступный в клинике препарат для таргетной терапии, моноклональное антитело к GD2, также обладает невысокой эффективностью и ярко выраженными побочными эффектами, значительная часть которых обусловлена наличием у антитела Fc- фрагмента и ассоциированной с ним функции активации системы комплемента. Другим недостатком является относительно большой размер антитела (150 кДа), который затрудняет проникновение вглубь опухолей.
В качестве альтернативного подхода в настоящем изобретении предлагается использовать 002-связывающие фрагменты антител без Fc-домена для элиминации 002-позитивных опухолевых клеток. Ранее авторами было показано, что Fab-фрагменты С02-специфичных антител сохраняют способность индуцировать клеточную гибель в опухолевых клетках (Doronin II et al., Bull Exp Biol Med, 2013, Mar;154(5):658-63), несмотря на отсутствие Fc-ассо иированных эффекторных функций. Этот эффект может быть обусловлен блокированием или изменением сигнальных путей, опосредованных ганглиозидом GD2 (Horwacik I., et al. Apoptosis, 2015 May;20(5):679-88). Тем не менее, 002-связывающие фрагменты антител без Fc- домена имели существенные недостатки: более короткое время жизни в кровотоке и, иногда, менее эффективная индукция клеточной гибели по сравнению с полноразмерными антителами. Для увеличения продолжительности нахождения фрагментов антител в кровотоке была применена процедура пегилирования - ковалентная конъюгация с молекулой полиэтиленгликоля (ПЭГ). Этот метод был неоднократно успешно использован для других белковых молекул. Эта процедура действительно увеличивала продолжительность нахождения GD2- связывающих фрагментов антител в кровотоке, но при этом эффективность индукции клеточной гибели опухолевых клеток не всегда была достаточной. Неожиданно было обнаружено, что присоединение двух или более С02-связывающих фрагментов антител к одной молекуле ПЭГ повышает цитотоксические эффекты 002-связывающих фрагментов антител к клеткам опухоли. Такая мультивалентная конструкция также обладает достаточно длинным временем жизни в кровотоке, и, потенциально, сниженными побочными эффектами на нервные окончания по сравнению со стандартными антителами. Дело в том, что такая конструкция не будет индуцировать комплемент-зависимую цитотоксичность из-за отсутствия Fc-региона; при этом Fc- независимая цитотоксичность сильно зависит от концентрации GD2 на поверхности клетки, поэтому цитотоксичное действие мультивалентной конструкции будет более специфичным по отношению к опухолевым клеткам, где экспрессия GD2 отличается в сотни раз по сравнению с нормальными клетками (Svennerholm L, et al. Biochim Biophys Acta, 1994, 1214:1 15-123). Наличие молекулы ПЭГ в составе мультивалентной конструкции улучшает фармакокинетические характеристики молекулы за счет снижения печеночного клиренса и уменьшения поглощения ретикулоэндотелиальной системой; кроме того, пегилирование значительно повышает EPR-эффект (enhanced permeation and retention effect) - свойство препарата преимущественно локализоваться в опухоли при внутривенном введении. Препарат, накопленный в результате пассивной адресной доставки в очаге опухолевого роста, будет активно и избирательно взаимодействовать только с опухолевыми клетками, гиперэкспрессирующими ганглиозид GD2. Таким образом, описанная мультимеризация с использованием молекулы ПЭГ повышает как фармакокинетические, так и фармакодинамические свойства фрагментов антител к GD2.
Нижеследующие примеры приведены в целях раскрытия характеристик настоящего изобретения и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Способы получения фрагментов С02-специфичных антител
Фрагменты 002-специфичных антител могут быть произведены с использованием векторов для рекомбинантной экспрессии, известных специалистам. Выбор промоторов и других регуляторных элементов может варьироваться в зависимости от предпочтений специалиста или от выбранной для экспрессии клетки-хозяина. Далее для иллюстрации приведены возможные варианты воплощения изобретения.
Рекомбинантные фрагменты антител могут быть получены по меньшей мере в трех системах экспрессии - в клетках E.coli, Pichia Pastoris и СНО. На основании последовательностей вариабельных доменов легкой и тяжелой цепей антитела 14G2a (Bolesta Е et al., Cancer Res., 2005, Apr 15; 65(8):3410-8) был проведен дизайн конструкций scFv- и Fab-фрагментов С02-специфичных антител. кДНК scFv- и Fab-фрагментов, оптимизированные для максимальной экспрессии в соответствующей системе были синтезированы в компании Genscript. Аминокислотные последовательности фрагментов антител, используемые в предпочтительных вариантах изобретения, приведены в Таблице 1 .
Таблица 1. Аминокислотные последовательности вариабельной и константной областей и соответствующих CDR тяжелой и легкой цепей антител против GD2.
Figure imgf000014_0001
SNTKVDKRVEPKSC
EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRSSQSLVHRNGNTYLHWYLQKPGQSPK
лёгкая LLIHKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVP
SEQ ID NO:1 0 цепь_2 (VL- PLTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREA
CLhum) KVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYAC
EVTHQGLSSPVTKSFN RGEC
DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHRNGNTYLHWYLQKPGQSPK
LLIHKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPPL
ScFv 1 (VL-
SEQ ID NO:1 1 TFGAGTKLELKGGGSGGGSGGGSGGGSEVQLLQSGPELEKPSASVMISC
VH)
KASGSSFTGYNMNWVRQNIGKSLEWIGAIDPYYGGTSYNQKFKGRATLTV
DKSSSTAYMHLKSLTSEDSVYYCVSGMEYWGQGTSVTVSS
SEQ ID N0:12 EVQLLQSGPELEKPSASVMISCKASGSSFTGYNMNWVRQNIGKSLEWIGAI
DPYYGGTSYNQKFKGRATLTVDKSSSTAYMHLKSLTSEDSVYYCVSGMEY
ScFv 1 (VH-
WGQGTSVTVSSGGGSGGGSGGGSGGGSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASI VL)
SCRSSQSLVHRNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIHKVSNRFSGVPDRFSGSG
SGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPPLTFGAGTKLELK
SEQ ID N0:13 EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRSSQSLVHRNGNTYLHWYLQKPGQSPK
LLIHKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPPL
ScFv 2 (VL- TFGAGTKLELKGGGSGGGSGGGSGGGSEVQLLQSGPELEKPGASVM ISCK VH)
ASGSSFTGYNM NWV QN IGKSLEWIGAIDPYYGGTSYNQKFKG ATLTVDK
SSSTAYM H LKSLTSEDSAVYYCVSGM EYWGQGTSVTVSS
SEQ ID N0:14 EVQLLQSGPELEKPGASVMISCKASGSSFTGYNMNWVRQNIGKSLEWIGAI
DPYYGGTSYNQKFKGRATLTVDKSSSTAYMHLKSLTSEDSAVYYCVSGME
ScFv 2 (VH- YWGQGTSVTVSSGGGSGGGSGGGSGGGSEIVMTQSPATLSVSPGERATL VL)
SCRSSQSLVHRNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIHKVSNRFSGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPPLTFGAGTKLELK
Для экспрессии в E.coli scFv- и Fab-фрагментов С02-специфичных антител соответствующие кДНК были встроены в вектор рЕТ22Ь+ по рестриктным сайтам Ndel и Xhol. Идентичность конструкций ожидаемым была подтверждена секвенированием. Для экспрессии конструкции pET22b+/scFv и pET22b+/Fab трансформировали в штаммы Е. coli Rosetta2(DE3)pLysS или HMS174(DE3)pLysS, и проводили индукцию экспрессии по стандартному протоколу, известному специалистам, в течение 4 ч при 25°С или 22 ч при 20°С. Количество, а также локализацию белка оценивали при помощи BugBuster Protein extraction reagent (Novagen, USA) в соответствии с инструкцией производителя. Для выделения тотальной фракции белка клетки Е. coli, осажденные из 0.5 л культуры, тщательно ресуспендировали в 5 мл холодного лизирующего буфера (50 мМ ЫаНгРСч, 300 мМ NaCI, 10 мМ имидазол, 0.5 мМ фенилметилсульфонил фторид (PMSF), рН 7.2) и дополнительно охлаждали в течение 15 мин на льду. Затем суспензию обрабатывали ультразвуком до полного разрушения клеток. Полученный лизат центрифугировали при 10 000 g в течение 20 мин. при 4°С. Осадок, содержащий клеточный дебрис, удаляли. Перевод белка в конечный буфер (фосфатный буфер (PBS), дополненный 0.02% NaN3) осуществляли центрифугированием на фильтрах Amicon Ultra-4 с диаметром пор 10 кДа.
Для экспрессии в Pichia pastoris scFv- и Fab-фрагментов С02-специфичных антител соответствующие кДНК были встроены в вектор pPICZalphaB по сайтам рестрикции Xhol/Notl. При этом пропептид для секреции (альфа-фактор из Saccharomyces cerevisiae) находился в одной рамке считывания с фрагментами антител. Для отщепления альфа-фактора были предусмотрены сайты действия протеаз Кех2 (EKRE) и Ste13 (ЕА ЕА). Клонирование проводили в стандартном штамме Е. coli XL1 -blue, селекцию осуществляли при посеве на низко-солевую среду LB с 25 мкг/мл зеоцина. Методом электропорации трансфицировали клетки Pichia pastoris штаммов GS1 15 и smd1 168h согласно инструкции к EasySelect Pichia Expression Kit (Invitrogen). Трансформанты сеяли на среду YPDS-arap с разной концентрацией зеоцина (500-2000 мкг/мл), трансформанты вырастали на 4-5 сутки. Полученные колонии рассевали для получения отдельных клонов, которые высевали на среду BMGH в 24-луночные планшеты и инкубировали при 30°С и 200 об/мин трое суток. Затем клетки собирали центрифугированием при 1500*д и комнатной температуре, и высевали на среду ВММН в 24-луночные планшеты. После чего инкубировали при 30°С и 200 об/мин в течение 4 суток. Каждые сутки добавляли 0,5% метанола. После окончания инкубации клетки отделяли центрифугированием при 5000*д, супернатанты оставляли для анализа.
Для экспрессии в клетках линии СНО scFv- и Fab-фрагментов С02-специфичных антител соответствующие кДНК были встроены в векторы для стабильной экспрессии в клетках СНО линии DXB-11 , дефицитной по гену дигидрофолатредуктазы (DHFR). Для Fab-фрагмента получение кодирующей последовательности легкой цепи ДНК проводили методом ПЦР; далее использовали клонирование по сайтам Xbal и Notl в экспрессионный вектор pcDNA3.3 с измененным полилинкером (Thermo Fisher Scientific). Клонирование части тяжелой цепи осуществляли в вектор pOptiVec (Thermo Fisher Scientific) с использованием рестриктных сайтов Xbal и Nhel. Для гена scFv-фрагмента использовали клонирование по сайтам Xbal и Notl в экспрессионный вектор pcDNA3.3. Полученные конструкции проверяли секвенированием. Препараты ДНК очищали с помощью ионообменной хроматографии и использовали для трансфекции клеток DXB-1 1 . Введение экспрессионных конструкций в клетки осуществляли с помощью электропорации на приборе Gene Pulser Xcell System (BioRad), с использованием смеси плазмид, несущих тяжелую и легкую цепи антитела. Спустя 48 часов после начала трансфекции проводили смену среды культивирования на бессывороточную среду, содержащую 200 мкг/мкл G418 и лишенную гипоксантина и тимидина. Культивирование продолжали 19 дней, в течение которых проводили регулярное измерение клеточной плотности и жизнеспособности. После достижения устойчивых показателей роста (жизнеспособность выше 95% и время удвоения - не более 30 часов) стабильный клеточный пул клонировали лимитирующими разведениями (1 клетка на лунку 96 луночного планшета). В среду для клонирования клеток добавляли низкие концентрации метотрексата (25нМ). Спустя еще 14 дней позитивные по росту клеток лунки анализировали с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) на предмет секреции фрагментов антител. Колонии с максимальными значения продукции масштабировали до 24 луночных планшетов и подвергали второму раунду амплификации с использованием 100 нМ метотрексата. Клоны с максимальными значениями продуктивности дополнительно амплифицировали при 250 и 500 нМ метотрексата, после чего повторно клонировали методом лимитирующих разведений, как описано выше.
Полученные финальные клоны с максимальными значениями продуктивности и хорошими показателями роста масштабировали и далее культивировали в суспензионной культуре для получения препаративных количеств фрагментов антител.
Выделение и очистка фрагментов антител на примере экспрессии в E.coli
Для очистки scFv-фрагментов к полученным лизатам добавляли 50% суспензии Ni- ΝΤΑ-агарозы и инкубировали 1 ч при 4°С при легком перемешивании. Затем суспензию переносили в колонку и дважды промывали буфером, содержащим 50 мМ ЫаНгРСч, 300 мМ NaCI, 20 мМ имидазол (рН 7.2). Элюцию проводили буфером, содержащим 50 мМ NaH2P04, 300 мМ NaCI, 250 мМ имидазол (рН 7.2).
Для выделения и очистки Fab-фрагментов из клеточных лизатов использовали колонку с Protein L агарозой из набора реактивов HiTrap Protein L (GE Healthcare, США). После промывки и активации колонки связывающим буфером на нее наносили лизат клеток E.coli. Колонку промывали от несвязавшихся белков, затем элюировали Fab- фрагменты, используя элюирующий буфер. Очищенные фрагменты собирали в 15 мл пробирку, содержащую 750 мкл нейтрализующего буфера. Нейтрализованный раствор Fab-фрагментов переводили в фосфатный буфер (PBS), содержащий азид натрия (0.02%), центрифугированием через фильтры Amicon Ultra (максимальная пропускающая способность 100 кДа) при 1000 g в течение 20 мин.
Чистота полученных Fab- и scFv-фрагментов по белковому электрофорезу составила >95%. Полученные препараты были переведены в PBS, рН 7,4, и затем стерилизованы фильтрацией через мембрану с размером пор 0,22 мкм. Концентрацию белка определяли спектрофотометрически при длине волны 280 нм. Мультимеризация scFv- и Fab-фрагментов С02-специфичных антител через пегилирование Мультимеризация является одной из стратегий улучшения фармакокинетических и фармакодинамических свойств фрагментов антител. Больший молекулярный размер мультимеров на основе фрагментов антител способствует увеличению периода полужизни в сыворотке, а также более быстрому поглощению опухолью за счет EPR- эффекта, что приводит к их лучшему накоплению в опухоли по сравнению с исходными IgG антителами или мономерами фрагментов. Кроме того, мультимеризация, как правило, способствует мультивалентности против антигена-мишени, которая приводит не только к более высокой аффинности благодаря эффекту авидности, но также может способствовать улучшению функциональных свойств и компенсировать отсутствие индукции вторичных иммунных функций ADCC и CDC. В случае моноклональных антител к ганглиозиду GD2 Fc-фрагмент полноразмерных антител во многом определяет побочные эффекты, и иммунные механизмы ADCC и CDC имеют ограниченный положительный терапевтический эффект. В связи с этим, создание мультимерных фрагментов С02-специфичных антител для терапии онкологических заболеваний имеет значительный потенциал.
В то же время мультимеры фрагментов антител, полученные стандартными способами, такими как использование стерической агрегации, формирования цистеиновых мостиков или кроссшивающих реагентов, часто характеризуются крайне низкой стабильностью и проблемами с масштабированием, что ограничивает перспективы их использования.
Одной из стратегий увеличения времени полужизни терапевтических молекул в кровотоке является увеличение гидродинамического объема молекулы путем связывания с инертными полимерами, такими как полиэтиленгликоль или другими гидрофильными полимерами. Причем только полиэтиленгликоль (ПЭГ)-производные белков одобрены FDA и другими регуляторными ведомствами для использования в медицине. Действительно, слияние или конъюгация различных пептидных молекул с полимерами существенно повышает их время полужизни, что было подтверждено экспериментально и в клинической практике.
Для усиления терапевтического потенциала фрагментов С02-специфичных антител и улучшения их фармакокинетических свойств авторами было использовано сайт-направленное пегилирование, целью которого было не только увеличение времени циркуляции фрагментов в крови, но и усиление цитотоксических свойств за счет получения стабильных мультимеров фрагментов С02-специфичных антител. Для получения ди-, три- и тетрамеров фрагментов антител использовали стандартные реагенты ПЭГ-малеимид2 и ПЭГ-малеимид4 (JenKem Technology USA, https://www.jenkemusa.com). Использованные производные ПЭГ позволяют присоединять к одной молекуле ПЭГ несколько (от 1 до 4) молекул фрагментов. Схемы реакций пегилирования представлены на Рис.1.
Для проведения реакции пегилирования scFv- и Fab-фрагментов моноклональных антител к раствору фрагментов (2.5 мг/мл) в буфере для пегилирования (20 тМ фосфатный буфер, с добавлением 50 mM NaCI, 10 тМ EDTA, рН 7.5) добавляли
СТОКОВЫЙ раствор 15 mM ТСЕР до достижения конечной концентрации ТСЕР 0.1 тМ.
Инкубацию проводили при комнатной температуре в течение 90 мин при аккуратном перемешивании. От восстановителя избавлялись центрифугированием через фильтры
Amicon Ultra-4 (максимальная пропускающая способность 10 кДа), либо используя колонки для высаливания Zeba Desalting Columns (TermoFisher, США). Затем к раствору фрагментов антител добавляли соответствующие растворы малеимид-ПЭГ, в различных соотношениях. Инкубация длилась 16-18 ч при комнатной температуре с аккуратным перемешиванием на шейкере. На Рис. 2 представлены примеры пегилирования фрагментов С02-специфичных антител (в формате scFv) с использованием ПЭГ- малеимид2 и ПЭГ-малеимид4. Эффективность пегилирования оценивали с помощью
ПААГ-электрофореза. После подбора оптимальных условий проведения пегилирования выход реакций составлял не менее 90% (Рис. 1 ).
Для разделения полученных пегилированных фрагментов и получения чистых фракций, содержащих индивидуальные моно- и мультимеры фрагментов антител, проводили хроматографическую очистку с использованием анионообменной хроматографии или гель-фильтрации.
В одном из вариантов, для разделения полученных продуктов реакций пегилирования фрагментов антител проводили катионообменную хроматографию на колонке TSK-GEL SP-5PW с использованием ВЭЖХ-системы Beckman System gold, подвижная фаза: элюирующий буфер (25 мМ СН3СООН, рН 4.0), линейный градиент 0 тМ - 250 тМ NaCI (в течение 90 мин при комнатной температуре, скорость потока была выбрана 1 мл/мин).
Альтернативно, для разделения полученных продуктов реакций пегилирования использовали гель-фильтрацию (эксклюзионную хроматографию) - колонку Superdex 200 10/30 GL и элюент PBS, пропущенный через фильтр 0.22 мкм. Скорость потока была выбрана 0.6 мл/мин.
В качестве иллюстрации, на Рис. 3 представлены хроматограммы разделения scFv-фрагментов после проведения пегилирования с использованием ПЭГ-малеимид2 и разделения модифицированных фрагментов методом гель-фильтрации на колонке Superdex 200 10/30 GL. Оценка антиген-связывающих свойств пегилированных фрагментов GD2- специфичных антител.
После хроматографической очистки полученные пегилированные моно- и мультимеры фрагментов антител сравнивали по эффективности связывания с ганглиозидом GD2 стандартными методами, которые известны специалистам, а именно, методами ИФА и проточной цитофлуориметрии.
Оценка связывания различных фрагментов С02-специфичных антител показала, что пегилирование с сохранением мономерной формы фрагментов не приводит к уменьшению взаимодействия с ганглиозидом GD2 относительно непегилированных фрагментов, а пегилирование с образованием мультимерных фрагментов GD2- специфичных антител показывало значимое увеличение связывания с антигеном (почти в 2 раза по сравнению с scFv и MOHO-SCFV-ПЭГ), ЧТО подтверждалось как методом ИФА, так и окрашиванием полученными фрагментами и вторичными FITC-меченными анти-FLAG- антителами С02-позитивных опухолевых линий с последующей оценкой на проточном цитофлуориметре (Рис 4).
Оценка цитотоксических эффектов пегилированных фрагментов GD2- специфичных антител. Мультимеризация фрагментов антител приводила к усилению антиген- связывающей способности фрагментов антител и, потенциально, к увеличению цитотоксических свойств молекул. В то же время важными параметрами для проявления противоопухолевых эффектов терапевтических молекул является их размер и масса. Например, молекулы с массой более 150 кДа имеют ограниченный потенциал в клинике в силу неспособности проходить через стенки сосудов. В связи с этим, мультимеры фрагментов антител с молекулярной массой более 150 кДа не использовались в дальнейшей работе. Под данное ограничение не попадали и были проанализированы в последующих цитотоксических тестах моно-, ди- и TeTpa-scFv-ПЭГ, а также моно- и ди- Fab-ПЭГ.
Сравнительная оценка цитотоксических эффектов, индуцируемых фрагментами
С02-специфичных антител и их пегилированными производными, проводилась с использованием нескольких классических методов, а именно при помощи МТТ-теста, PI- теста, а также при помощи ДНК-красителя 7-AAD. В качестве клеточной модели исследования была использована линия мышиной лимфомы EL-4, которая характеризуется гиперэкспрессией ганглиозида GD2.
МТТ тест проводили с использованием стандартной колориметрической процедуры. Клетки С02-позитивных опухолевых линий инкубировали в 96-луночных планшетах с последовательными разведениями фрагментов С02-специфичных антител в течение 72 ч, затем центрифугировали (8 мин, 300 д), осадок суспендировали и добавляли по 30 мкл/лунка раствора МТТ (5 мг/мл в PBS). После выпадения кристаллов формазана (2-4 ч) его растворяли добавлением 100 мкл DMSO. Оптическое поглощение измеряли на спектрофотометре для планшетов Multiscan FC (Thermo Scientific, США) при длине волны 540 нм.
Окрашивание пропидиум иодидом (PI) проводили по методике, известной специалистам. Вкратце, после окончания инкубации с фрагментами антител и их пегилированными производными (10 мкг/мл в течение 24 ч), клетки EL-4 осаждали, фиксировали ледяным 70% Е Н в течение 1 ч при 4 °С, дважды отмывали в PBS (300 д, 10 мин, 4 °С). Затем клетки ресуспенд провал и в растворе для окрашивания ДНК (PBS, содержащий 20 мкг/мл PI и 10 мкг/мл РНКазы). Измерения проводили на проточном цитофлуориметре EPICS ELITE (Coulter, США). В каждом образце регистрировали не менее 1 χ 104 клеток. На гистограммах клетки с фрагментированной ДНК, дифференцировали от нормальных клеток по более низкой интенсивности флуоресценции. Обработку результатов проводили с использованием программы WinMDI.
Оценку проницаемости плазматической мембраны клеток проводили с помощью флуоресцентного ДНК-красителя 7-AAD. Перед окрашиванием клетки однократно отмывали в PBS и к осадку добавляли 0.5 мл раствора 7-AAD (2 мкг/мл). Флуоресценцию клеток регистрировали цитофлуориметрически. В каждом образце регистрировали не менее 1 χ 104 клеток. Обработку результатов проводили с использованием программы WinMDI.
На Рис. 5 представлены данные цитотоксической активности scFv-фрагментов 002-специфичных антител и их пегилированных производных (мономеров, димеров и тетрамеров).
В МТТ-тесте жизнеспособность клеток EL-4 под действием scFv-фрагментов, а также их мономерных пегилированных производных падала примерно до 75%, в то время как пегилированные димеры scFv-фрагментов снижали жизнеспособность опухолевых клеток примерно до 50%, а в случае тетрамеров scFv-фрагментов жизнеспособность клеток при максимальных концентрациях фрагментов снижалась ниже 40% (Рис. 5А). Методом проточной цитофлуориметрии в PI- и 7-ААО-тестах было также показано, что инкубация клеток с scFv-фрагментами и их пегилированными мономерами приводила к увеличению количества клеток с фрагментированной ДНК и клеток с нарушением целостности плазматической мембраны относительно интактных клеток уже через 24 часа (Рис. 5Б). Данная активность была сравнима для обоих типов белка, и количество мертвых клеток увеличивалось примерно в два раза относительно интактных клеток. В случае пегилированных димеров и тетрамеров scFv-фрагментов индукция клеточной гибели в PI- и 7ААО-тестах усиливалась значительно, и пул клеток с индуцированной клеточной гибелью увеличивался относительно контрольных клеток примерно в 4 и 7 раз, соответственно.
В случае Fab-фрагментов цитотоксическая активность немодифицированных белков была выше по сравнению с немодифицированными scFv-фрагментами. Мономеры Fab-фрагментов снижали жизнеспособность на максимальных выбранных концентрациях до 50% по сравнению с контрольными клетками, а димеризация Fab- фрагментов приводила к усилению цитотоксической активности, когда жизнеспособность падала до 30% (Рис. 6). В цитометрических тестах также было получено подтверждение того, что димеризация фрагментов приводит к увеличению функциональной активности белка. Так, исходные Fab-фрагменты и пегилированные мономеры усиливают клеточную гибель примерно в 5 раз, а димеры пегилированных Fab-фрагментов более чем в 10 раз (Рис. 6).
В целом, для scFv- и Fab-фрагментов С02-специфичных антител было показано, что сайт-направленное пегилирование с сохранением мономерной формы белка не снижает цитотоксической активности фрагментов антител, в то время как пегилирование, приводящее к образованию мультимерных фрагментов антител, усиливает цитотоксические свойства модифицированных белков.
Анализ времени циркуляции модифицированных фрагментов антител в крови мышей линии Balb/c.
Одной из основных целей пегилирования полученных рекомбинантных фрагментов С02-специфичных антител являлось увеличение времени циркуляции в крови, которое для немодифицированных фрагментов является коротким. Для подтверждения увеличения этого фармакокинетического параметра фрагментов антител за счет их модификации путем пегилирования было проведено сравнение времени нахождения флуоресцентномеченных модифицированных и исходных фрагментов антител в крови мышей линии Balb/c. Для этого была проведена пришивка флуоресцентного красителя Sulfo-Cyanine5 активированного эфира (Sulfo-Cy5) к исходным и пегилированным фрагментам антител. К раствору фрагментов антител добавляли краситель в молярном избытке 10: 1. После проведения реакции очистку от несвязанного красителя проводили методом гель-фильтрации, соотношение молекул белка к красителю в конъюгате составило примерно 1 :1. Выбор данного флуоресцентного красителя был обусловлен длинноволновым максимумом испускания (662 нм), который позволяет избежать вклада аутофлуоресценции сыворотки крови при оценке интенсивности флуоресценции фрагментов антител в циркулирующей крови. Флуоресцентно-меченные образцы фрагментов антител (100-150 мкл) вводились мышам внутривенно в количестве 150 мкг/мышь (7,5 мг/кг). Контрольным мышам вводился PBS. Через определенные временные интервалы из хвостовой вены мышей проводили отбор крови для последующего получения сыворотки и измерения флуоресценции конъюгата, которая позволяет определить количество фрагментов антител в плазме крови. Полученные сыворотки разводили в 10 раз PBS и проводили измерение интенсивности флуоресценции на планшетном флуориметре Glomax multi detection system (Promega, США) с возбуждением при 625 нм и испусканием при 660-720 нм. На Рис. 7 показаны результаты экспериментов на примере фрагментов антител, модифицированных молекулами ПЭГ с молекулярной массой 10 000 Да.
Пегилирование приводит к значительному увеличению времени циркуляции фрагментов антител в крови мышей, как в случае мономеров, так и мультимеров фрагментов антител. Немодифицированные scFv- и Fab-фрагменты выводятся быстро, уже через 30 мин после введения в циркуляции остается менее 10% и 15% от введенного образца, соответственно, через 2,5 ч после введения - только 5 и 8%, соответственно. На этих же временных интервалах в случае пегилированных образцов количество циркулирующих фрагментов антител значительно выше. Так, через 0,5 и 2,5 часа после введения пегилированных мономеров scFv-фрагментов остается более 50% и 20%, а в случае пегилированных мономеров Fab-фрагментов в крови сохраняется 58% и 26% от введенного образца. Мультимеризация приводит к значительному увеличению времени циркуляции фрагментов антител в крови мышей, особенно четко эта закономерность прослеживается для пегилированных тетрамеров scFv-фрагментов и пегилированных димеров Fab-фрагментов. Для данных модифицированных фрагментов GD2- специфичных антител мультимеризация за счет пегилирования приводит к увеличению времени полувыведения фрагментов антител с нескольких минут до нескольких часов (Рис. 7). Так же было показано, что увеличение молекулярной массы ПЭГ и использование молекул ПЭГ разветвленной Υ-образной формы (ПЭГ40 Y, https://www.jenkemusa.com/product/y-mal-40k) приводит к увеличению времени циркуляции фрагментов антител в крови (Рис. 8).
Из рисунка видно, что пегилирование линейными молекулами ПЭГ приводит к снижению выведения белка из циркуляции по сравнению с исходными фрагментами и находится в прямой зависимости от молекулярной массы использованных молекул ПЭГ. Пегилирование фрагментов антител молекулами ПЭГ с молекулярной массой 40 кДа и разветвленной Υ-образной формой приводит к значительно увеличенному времени циркуляции модифицированных фрагментов антител в крови (Рис. 8). Даже через неделю после введения более 2% от введенного образца scFv-n3r40 Y находится в циркуляции. Оценка стабильности пегилированных фрагментов С02-специфичных антител в сравнении с немодифицированными фрагментами. По литературным данным пегилирование увеличивает стабильность рекомбинантных белков в растворе (Lawrence РВ, Price JL Curr Opin Chem Biol. 2016 34:88-94). Для подтверждения этих данных в контексте фрагментов С02-специфичных антител мы провели температурный стресс-тест для исходных и модифицированных фрагментов С02-специфичных антител. В данном тесте использовались 4 варианта пегилированных scFv-фрагментов антител, различающихся молекулярной массой молекул ПЭГ (2 кДа, 10 кДа, 20 кДа и 40 кДа), а также исходные немодифицированные scFV-фрагменты. Все фрагменты в PBS в концентрации 1 мг/мл инкубировались в течение месяца при 37 °С. В определенные временные точки проводили центрифугирование образцов при 15 тыс. g в течение 20 мин с целью осаждения агрегировавшего белка. После центрифугирования определялась концентрация белков в надосадочной жидкости и с аликвотой образца проводился ИФА с целью сравнения антиген-связывающих свойств фрагментов до и после стресс-теста (Таблица 2).
Таблица 2. Оценка агрегации и антиген-связывающей способности фрагментов антител после длительной инкубации при 37 °С.
Figure imgf000024_0001
Как видно из Таблицы 2, пегилирование более высокомолекулярными молекулами приводит как к образованию меньшего количества агрегатов в растворе, так и к практически полному сохранению антиген-связывающей способности фрагментов антител. В случае исходных фрагментов антител или пегилированных молекулой ПЭГ 2 кДа наблюдается падение стабильности и антиген-связывающих свойств белка уже через неделю после начала стресс-теста.
Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1 . Мультивалентная конструкция, специфически связывающая ганглиозид GD2, содержащая два, три или четыре функциональных фрагмента антител, специфически связывающих ганглиозид GD2 и соединенных между собой при помощи ковалентной конъюгации с молекулой полиэтиленгликоля.
2. Мультивалентная конструкция по п.1 , характеризующаяся тем, что, каждый из фрагментов антител в конструкции содержит по крайней мере
(i) один вариабельный домен тяжёлой цепи, содержащий H-CDR1 с последовательностью SEQ ID NO:1 , H-CDR2 с последовательностью SEQ ID NO:2, и Н-
CDR3 с последовательностью SEQ ID NO:3, и
(ii) один вариабельный домен легкой цепи, содержащий L-CDR1 с последовательностью SEQ ID NO:4, L-CDR2 с последовательностью SEQ ID NO:5, и L- CDR3 с последовательностью SEQ ID NO:6.
3. Мультивалентная конструкция по п.1 , характеризующаяся тем, что содержит два, три или четыре функциональных фрагмента антител, каждый из которых содержит один фрагмент тяжёлой цепи, содержащий последовательность, гомологичную по меньшей мере на 90% последовательности SEQ ID NO:7, и один фрагмент легкой цепи, содержащий последовательность, гомологичную по меньшей мере на 90% последовательности SEQ ID NO:8.
4. Мультивалентная конструкция по п.1 , характеризующаяся тем, что содержит два, три или четыре функциональных фрагмента антител, каждый из которых содержит один фрагмент тяжёлой цепи, содержащий последовательность, гомологичную по меньшей мере на 90% последовательности SEQ ID NO:9, и один фрагмент легкой цепи, содержащий последовательность, гомологичную по меньшей мере на 90% последовательности SEQ ID NO: 10.
5. Мультивалентная конструкция по п.1 , характеризующаяся тем, что содержит два, три или четыре функциональных фрагмента антител, каждый из которых содержит последовательность, гомологичную по меньшей мере на 90% последовательности SEQ ID NO:1 1 .
6. Мультивалентная конструкция по п.1 , характеризующаяся тем, что содержит два, три или четыре функциональных фрагмента антител, каждый из которых содержит последовательность, гомологичную по меньшей мере на 90% последовательности SEQ ID NO:12.
7. Мультивалентная конструкция по п.1 , характеризующаяся тем, что содержит два, три или четыре функциональных фрагмента антител, каждый из которых содержит последовательность, гомологичную по меньшей мере на 90% последовательности SEQ ID NO:13.
8. Мультивалентная конструкция по п.1 , характеризующаяся тем, что содержит два, три или четыре функциональных фрагмента антител, каждый из которых содержит последовательность, гомологичную по меньшей мере на 90% последовательности SEQ ID NO:14.
9. Мультивалентная конструкция по п.1 , характеризующаяся тем, что используемая для конъюгации молекула полиэтиленгликоля имеет линейную структуру и молекулярную массу от 5 до 40 кДа.
10. Мультивалентная конструкция по п.1 , характеризующаяся тем, что используемая для конъюгации молекула полиэтиленгликоля имеет разветвленную структуру и молекулярную массу от 5 до 40 кДа.
1 1 . Фармацевтическая композиция для лечения онкологического заболевания, содержащая мультивалентную конструкцию по любому из п. п. 1 -10 в терапевтически эффективном количестве и фармацевтически приемлемый носитель, при этом онкологическое заболевание представляет собой 002-позитивную опухоль или опухоль, отдельные клеточные субпопуляции которой экспрессируют ганглиозид GD2.
12. Способ лечения онкологического заболевания, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по п. 1 1 , при этом онкологическое заболевание представляет собой 002-позитивную опухоль или опухоль, отдельные клеточные субпопуляции которой экспрессируют ганглиозид GD2.
13. Способ лечения по п. 12, в котором 002-позитивная опухоль представляет собой нейробластому, ретинобластому, меланому, мелкоклеточный рак легких, остеосаркому, рабдомиосаркому, глиому или саркому Юинга.
14. Способ уничтожения клетки в организме субъекта, на поверхности которой находится ганглиозид GD2, включающий введение этому субъекту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по п.1 1 .
PCT/RU2018/050076 2017-07-13 2018-07-09 Получение пегилированных фрагментов gd2-специфичных антител, индуцирующих прямую клеточную гибель gd2-позитивных опухолевых клеток, и их применение в терапии gd2-позитивных опухолей WO2019013674A1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2017116203A RU2663104C1 (ru) 2017-07-13 2017-07-13 Получение пегилированных фрагментов gd2-специфичных антител, индуцирующих прямую клеточную гибель gd2-позитивных опухолевых клеток, и их применение в терапии gd2-позитивных опухолей
RU2017116203 2017-07-13

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2019013674A1 true WO2019013674A1 (ru) 2019-01-17

Family

ID=63142582

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2018/050076 WO2019013674A1 (ru) 2017-07-13 2018-07-09 Получение пегилированных фрагментов gd2-специфичных антител, индуцирующих прямую клеточную гибель gd2-позитивных опухолевых клеток, и их применение в терапии gd2-позитивных опухолей

Country Status (2)

Country Link
RU (1) RU2663104C1 (ru)
WO (1) WO2019013674A1 (ru)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2708136C1 (ru) * 2019-04-15 2019-12-04 Общество с ограниченной ответственностью "Реал Таргет" Новые белковые конструкции для диагностики и терапии gd2-позитивных заболеваний

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4849509A (en) * 1987-02-20 1989-07-18 The Wistar Institute Monoclonal antibodies against melanoma-associated antigens and hybrid cell lines producing these antibodies
RU2203319C2 (ru) * 1993-08-02 2003-04-27 Мерк Патент-Гмбх Биспецифическая молекула антитела для лизиса опухолевых клеток, способ получения f(ab') 2 фрагмента биспецифической молекулы антитела, моноклональное антитело (варианты), фармацевтический препарат, фармацевтический набор для лизиса опухолевых клеток (варианты), способ лизиса опухолевых клеток ex vivo при аутогенной трансплантации костного мозга
US8835606B2 (en) * 2004-01-22 2014-09-16 Merck Patent Gmbh Anti-cancer antibodies with reduced complement fixation
WO2015075194A1 (en) * 2013-11-21 2015-05-28 Apeiron Biologics Ag Preparations and methods for treating a gd2 positive cancer

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4675287A (en) * 1984-07-26 1987-06-23 Scripps Clinic And Research Foundation Monoclonal antibody directed to human ganglioside GD2
US8198020B2 (en) * 2003-08-22 2012-06-12 Potentia Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for enhancing phagocytosis or phagocyte activity
FR2906808B1 (fr) * 2006-10-10 2012-10-05 Univ Nantes Utilisation d'anticorps monoclonaux specifiques de la forme o-acetylee du ganglioside gd2 dans le traitement de certains cancers

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4849509A (en) * 1987-02-20 1989-07-18 The Wistar Institute Monoclonal antibodies against melanoma-associated antigens and hybrid cell lines producing these antibodies
RU2203319C2 (ru) * 1993-08-02 2003-04-27 Мерк Патент-Гмбх Биспецифическая молекула антитела для лизиса опухолевых клеток, способ получения f(ab') 2 фрагмента биспецифической молекулы антитела, моноклональное антитело (варианты), фармацевтический препарат, фармацевтический набор для лизиса опухолевых клеток (варианты), способ лизиса опухолевых клеток ex vivo при аутогенной трансплантации костного мозга
US8835606B2 (en) * 2004-01-22 2014-09-16 Merck Patent Gmbh Anti-cancer antibodies with reduced complement fixation
WO2015075194A1 (en) * 2013-11-21 2015-05-28 Apeiron Biologics Ag Preparations and methods for treating a gd2 positive cancer

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DORONIN I.I.: "Protivoopukholevye effekty modifitsirovannykh fragmentov GD2-spetsifichnykh antitel", DISSERTATSIYA, M., 2015, pages 16 - 17 , 23 , 31-33 , 56 , 61 , 68-72 , 86-102, 131-14 *
KHOLODENKO I. V. ET AL.: "Protivoopukholevaya aktivnost GD2-spetsifichnykh antitel i ikh FAB-fragmentov v myshinoi modeli raka", IMMUNOLOGIIA, 2013 *

Also Published As

Publication number Publication date
RU2663104C1 (ru) 2018-08-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6827583B2 (ja) Ｄｌｌ３及びｃｄ３に結合する二重特異性抗体構築物
US9249217B2 (en) Bispecific EGFRvIII x CD3 antibody engaging molecules
JP6154895B2 (ja) ヒト二重特異性ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体結合分子
EP3971208A1 (en) Antibody against claudin 18a2 and use thereof
WO2015184941A1 (zh) 一种cd7纳米抗体、其编码序列及应用
JP6242484B2 (ja) 特定の改善されたヒト二重特異性ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体結合分子
EA030147B1 (ru) Биспецифические антигенсвязывающие молекулы, активирующие т-клетки
WO2021057822A1 (en) Anti-ror1 antibodies and preparation method and uses thereof
WO2017107914A1 (zh) 一种药物设计方法和获得的药物及其应用
WO2018009528A1 (en) Combination cancer immunotherapies with arginine depletion agents
JP6640181B2 (ja) 二重特異性抗原結合ポリペプチド
JP2020515624A (ja) Ｎｋ細胞活性化融合タンパク質、ｎｋ細胞およびそれらを含む医薬組成物
RU2663104C1 (ru) Получение пегилированных фрагментов gd2-специфичных антител, индуцирующих прямую клеточную гибель gd2-позитивных опухолевых клеток, и их применение в терапии gd2-позитивных опухолей
WO2022022709A1 (zh) 一种SIRPα-Fc融合蛋白
CN114316045A (zh) 抗pd-l1抗体及其用途
RU2708136C1 (ru) Новые белковые конструкции для диагностики и терапии gd2-позитивных заболеваний
RU2733430C1 (ru) Создание конъюгатов gd2-специфичных антител и фрагментов gd2-специфичных антител с препаратами
US20210101944A1 (en) Fusion protein containing trail and igg binding domain and the uses thereof
JP2018511306A (ja) 治療
JP2024517985A (ja) 抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体及びその癌の予防または治療用バイオマーカー
CA3169521A1 (en) Modified binding polypeptides for optimized drug conjugation
KR20200082345A (ko) 암배항원을 표적화하는 재조합 면역독소 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물
TW201900209A (zh) 包含T細胞接合抗體構築體之低pH值醫藥組成物

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 18831457

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 18831457

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1