BR112020024223A2 - Conjugados anticorpo fármaco anti-sez6 e métodos de uso - Google Patents

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David Liu
Julia Gavrilyuk
Alexander SCHAMMEL
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Abstract

“conjugados anticorpo fármaco anti-sez6 e métodos de uso. são fornecidos anticorpos anti-sez6 e conjugados anticorpo fármaco inovadores e métodos de uso de tais anticorpos anti-sez6 e conjugados anticorpo fármaco para tratar o câncer.

Description

“CONJUGADOS ANTICORPO FÁRMACO ANTI-SEZ6 E MÉTODOS DE USO”
1. REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[001] Este pedido reivindica o benefício sob 35 USC § 119(e) do Pedido Provisório No. US 62/678.061, depositado em 30 de maio de 2018, cujo conteúdo é incorporado neste documento em sua totalidade a título de referência.
2. REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequências que foi enviada eletronicamente em formato ASCII e é aqui incorporada por referência em sua totalidade. A dita cópia ASCII, criada em 30 de maio de 2019, tem o nome 381493- 703WO(167862)_SL.txt e tem 28.992 bytes de tamanho.
3. ANTECEDENTES DA TÉCNICA
[003] O presente pedido refere-se a um conjugado anticorpo fármaco anti- SEZ6 inovador, componentes do mesmo e composições que compreendem o mesmo para o tratamento, diagnóstico ou profilaxia de câncer e qualquer recorrência ou metástase do mesmo.
4. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[004] Diferenciação e proliferação de células-tronco e células progenitoras são processos normais em andamento que agem em conjunto para auxiliar o crescimento do tecido durante a organogênese, reparo celular e substituição celular. O sistema é rigidamente regulado para garantir que apenas os sinais apropriados sejam gerados com base nas necessidades do organismo. A proliferação e diferenciação celular normalmente ocorrem apenas quando necessárias para a substituição de células danificadas ou morrendo ou para o crescimento. No entanto, a interrupção desses processos pode ser desencadeada por muitos fatores, incluindo a sub ou superabundância de vários produtos químicos de sinalização, a presença de microambientes alterados, mutações genéticas ou uma combinação dos mesmos. A interrupção da proliferação e/ou diferenciação celular normal pode levar a vários distúrbios, incluindo doenças proliferativas, tais como o câncer.
[005] Os tratamentos terapêuticos convencionais para o câncer incluem quimioterapia, radioterapia e imunoterapia. Frequentemente, esses tratamentos são ineficazes e a ressecção cirúrgica pode não ser uma alternativa clínica viável. As limitações no padrão atual de tratamento são particularmente evidentes nos casos em que os pacientes são submetidos a tratamentos de primeira linha e, subsequentemente, recidivam. Em tais casos, tumores refratários, frequentemente agressivos e incuráveis, surgem frequentemente. As taxas de sobrevida geral para muitos tumores permaneceram praticamente inalteradas ao longo dos anos devido, pelo menos em parte, às falhas das terapias existentes para prevenir recidiva, recorrência do tumor e metástase. Permanece, portanto, uma grande necessidade de desenvolver terapias mais alvejadas e potentes para distúrbios proliferativos. A presente invenção aborda essa necessidade.
5. SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[006] Em um aspecto amplo, a presente invenção fornece um conjugado anticorpo fármaco, ou composições do mesmo, que se liga especificamente aos determinantes SEZ6 humanos. Em certas modalidades, o determinante SEZ6 é uma proteína SEZ6 expressa em células tumorais, enquanto em outras modalidades, o determinante SEZ6 é expresso em células iniciadoras de tumor. Em uma modalidade preferencial, o conjugado anticorpo fármaco SEZ6 compreenderá: Fórmula I
ADC1 em que Ab compreende um anticorpo anti-SEZ6 que tem uma cadeia pesada de SEQ ID NO: 3 e uma cadeia leve de SEQ ID NO: 4 e em que n é 2. Para os fins da presente divulgação, este conjugado anticorpo fármaco será denominado "hSEZ6-
1.ss1 ADC1", a menos que indicado de outra forma.
[007] Em modalidades selecionadas, a presente invenção compreende um anticorpo que compreende uma cadeia pesada de SEQ ID NO: 3 e uma cadeia leve de SEQ ID NO: 4. Em certos aspectos, a invenção compreende um ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada (SEQ ID NO: 3) ou cadeia leve (SEQ ID NO: 4) do anticorpo anti-SEZ6 da invenção ou um fragmento do mesmo. Em outras modalidades, a invenção compreende um vetor que compreende um ou mais dos ácidos nucleicos descritos acima ou uma célula hospedeira que compreende os ditos ácidos nucleicos ou vetores.
[008] Em ainda outra modalidade, a invenção compreende um ligante de fármaco caliqueamicina, ou um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável do mesmo, que compreende a estrutura estabelecida na Fórmula II.
Fórmula II
[009] Conforme estabelecido acima, a presente invenção fornece um conjugado anticorpo fármaco anti-SEZ6 em que o anticorpo é conjugado com uma ou mais cargas úteis de caliqueamicina não cliváveis de Fórmula II. Além disso, são fornecidas composições farmacêuticas que compreendem um ADC anti-SEZ6 conforme divulgado neste documento. Em certas modalidades, as composições compreenderão uma razão fármaco-anticorpo selecionada (DAR), em que a espécie de ADC predominante (por exemplo, compreendendo 2 ogivas de caliqueamicina) compreende mais do que cerca de 50%, mais do que cerca de 60%, mais do que cerca de 70%, mais do que cerca de 80%, mais do que cerca de 90% ou mais do que cerca de 95% das espécies presentes. De preferência, o carregamento de fármaco da espécie predominante será de 2.
[010] Outro aspecto da invenção é um método de tratamento de câncer que compreende a administração de um conjugado anticorpo-fármaco ou uma composição farmacêutica, tal como as descritas neste documento, a um sujeito em necessidade do mesmo. Em certas modalidades, o sujeito sofrerá de câncer de pulmão e, em modalidades selecionadas, câncer de pulmão de pequenas células (SCLC).
[011] Em outras modalidades, o ADC divulgado compreenderá uma margem de segurança (derivada conforme descrito neste documento) maior do que 6. Em outras modalidades, a margem de segurança será maior do que 7 e ainda em outras modalidades, a margem de segurança será maior do que 8 ou maior do que 9. Em ainda outras modalidades, a margem de segurança será de cerca de 10.
[012] Em ainda outra modalidade, a invenção compreende um método de redução de células iniciadoras de tumor em uma população de células tumorais, em que o método compreende colocar uma população de células iniciadoras de tumor em contato (por exemplo, in vitro ou in vivo) com um conjugado anticorpo fármaco, conforme descrito neste documento, em que a frequência das células iniciadoras do tumor é reduzida.
[013] Em um aspecto, a invenção compreende um método de entrega de uma citotoxina a uma célula, que compreende colocar a célula em contato com o conjugado anticorpo-fármaco divulgado.
[014] Em outro aspecto, a presente invenção também fornece kits ou dispositivos e métodos associados que são úteis no tratamento de câncer de pulmão.
Para este fim, a presente invenção fornece preferencialmente um artigo de fabricação útil para o tratamento do câncer de pulmão que compreende um receptáculo que contém o ADC SEZ6 e materiais de instrução para usar o ADC para tratar o câncer de pulmão (por exemplo, câncer de pulmão de células pequenas) ou fornecer um regime de dosagem para o mesmo. Em outras modalidades, os kits divulgados compreenderão instruções, rótulos, bulas, leitores ou semelhantes, indicando que o kit ou dispositivo é usado para o tratamento de câncer de pulmão ou fornecerão um regime de dosagem para o mesmo.
[015] O anterior é um sumário e, portanto, contém, por necessidade, simplificações, generalizações e omissões de detalhes; consequentemente, os versados na técnica observarão que o sumário é apenas ilustrativo e não se destina a ser de forma alguma limitante. Outros aspectos, atributos e vantagens dos métodos, composições e/ou dispositivos e/ou outra matéria descrita neste documento se tornarão evidentes nos ensinamentos estabelecidos neste documento. O sumário é fornecido para apresentar uma seleção de conceitos em uma forma simplificada que são descritos mais detalhadamente abaixo na Descrição Detalhada.
6. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[016] A Figura 1 é uma representação esquemática de hSEZ6-1.ss1 ADC1;
[017] A Figura 2 fornece curvas de aglutinação que demonstram que um anticorpo SEZ6 que compreende a mutação S60N tem um perfil de afinidade que é substancialmente o mesmo que um anticorpo SEZ6 sem a mutação S60N;
[018] A Figura 3 demonstra que os ADCs de SEZ6 divulgados exterminam efetivamente as células que expressam hSEZ6 de uma maneira dependente da dose, embora não esgotando células de controle naïve que não expressam hSEZ6;
[019] As Figuras 4A e 4B representam a capacidade dos ADCs SEZ6 divulgados para retardar o crescimento de tumor de câncer de pulmão de células pequenas em camundongos imunocomprometidos implantados com SCLC LU 95
(Figura 4A) e SCLC LU 149 (Figura 4B); e
[020] As Figuras 5A a 5D demonstram que os tumores SCLC são particularmente suscetíveis ao tratamento com ADCs que compreende um fármaco ligante de caliqueamicina não clivável em que as Figuras 5A e 5B mostram, respectivamente, os níveis de expressão relativa de SEZ6 e um antígeno de controle positivo em várias linhas de células tumorais, a Figura 5C mostra que uma toxina PBD extermina uniformemente diferentes tipos de células de câncer e a Figura 5D mostra que a caliqueamicina é particularmente ativa no extermínio de células SCLC.
7. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[021] São divulgadas neste documento modalidades ilustrativas não limitativas da invenção que exemplificam os princípios da mesma. Quaisquer títulos de seção usados neste documento são apenas para fins organizacionais e não devem ser interpretados como limitando a matéria descrita. Para os fins da presente divulgação, todos os números de acesso de sequência de identificação podem ser encontrados no banco de dados NCBI Sequência de Referência (RefSeq) e/ou banco de dados de sequência de arquivo NCBI GenBank® a menos que indicado de outra maneira.
[022] A presente invenção fornece ADCs anti-SEZ6 inovadores e componentes dos mesmos (incluindo o anticorpo hSEZ6-1.ss1 e o ligante de fármaco caliqueamicina de Fórmula II) que compreendem um agente de alvejamento de anticorpo anti-SEZ6 sítio-específico e carga útil citotóxica de caliqueamicina. Conforme discutido em mais detalhes abaixo e estabelecido nos Exemplos anexos, o ADC anti-SEZ6 divulgado é particularmente eficaz na supressão do crescimento do tumor quando comparado com outros ADCs anti-SEZ6.
[023] A capacidade de reduzir ou eliminar efetivamente o tumor e/ou células- tronco de câncer através do uso do ADC SEZ6 divulgado neste documento é devido à relativa falta de toxicidade fora do sítio que permite uma dosagem aumentada. Isso,
por sua vez, fornece níveis mais elevados de caliqueamicina no sítio do tumor do que outros ADCs de caliqueamicina e resulta em extermínio celular aumentado. Como mostrado nos Exemplos anexos, a concentração aumentada de toxina no sítio do tumor fornece supressão prolongada do tumor em camundongos imunocomprometidos. Assim, o ADC SEZ6 divulgado neste documento provavelmente exibirá um índice terapêutico favorável e pode ser usado no tratamento e/ou prevenção de distúrbios proliferativos selecionados, tais como câncer de pulmão de células pequenas ou progressão ou recorrência do mesmo. CÉLULAS-TRONCO DE CÂNCER SEZ6
[024] Postulou-se que o SCLC é de origem broncogênica, decorrente, em parte, das células neuroendócrinas pulmonares (Galluzzo e Bocchetta, 2011; PMID: 21504320). Qualquer que seja a fonte celular de origem para esses tumores, é evidente que eles apresentam um fenótipo endócrino pouco diferenciado, muitas vezes são altamente proliferativos e agressivos e frequentemente superexpressam proteínas neurais. A elevação resultante de marcadores de expressão neural nestes tumores que de outra forma podem ser principalmente restritos ao sistema nervoso ou mostrar expressão limitada durante o desenvolvimento, do qual SEZ6 pode ser um exemplo, pode, portanto, oferecer um alvo terapêutico único para tumores com o fenótipo neuroendócrino.
[025] A expressão de SEZ6 está associada a várias subpopulações de células tumorigênicas de uma maneira que as torna suscetíveis ao tratamento conforme estabelecido neste documento. A este respeito, a invenção fornece hSEZ6-1.ss1 ADC1 que pode ser particularmente útil para alvejar células tumorigênicas, facilitando assim o tratamento, controle e/ou prevenção do câncer. Seja por inibição ou eliminação das células tumorigênicas, modificação de seu potencial (por exemplo, por diferenciação induzida ou ruptura de nicho) ou de outra forma interferência da capacidade das células tumorigênicas de influenciar o ambiente do tumor ou outras células, a presente invenção permite um tratamento mais eficaz do câncer por meio da inibição de tumorigênese, manutenção do tumor e/ou metástase e recorrência. Será ainda observado que as mesmas características dos anticorpos divulgados os tornam particularmente eficazes no tratamento de tumores recorrentes que se mostraram resistentes ou refratários aos regimes de tratamento padrão.
[026] Métodos que podem ser usados para avaliar uma redução na frequência de células tumorigênicas incluem, mas não estão limitados a, análise citométrica ou imuno-histoquímica, preferencialmente por análise de diluição limitante in vitro ou in vivo (Dylla et al. 2008, PMID: PMC2413402 e Hoey et al. 2009, PMID: 19664991).
[027] A capacidade dos anticorpos da presente invenção de reduzir a frequência de células tumorigênicas pode, portanto, ser determinada com uso das técnicas e marcadores conhecidos na técnica. Em alguns casos, os ADCs anti-SEZ6 podem reduzir a frequência de células tumorigênicas em 10%, 15%, 20%, 25%, 30% ou mesmo em 35%. Em outras modalidades, a redução na frequência de células tumorigênicas pode ser da ordem de 40%, 45%, 50%, 55%, 60% ou 65%. Em certas modalidades, os compostos divulgados podem reduzir a frequência de células tumorigênicas em 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou mesmo 95%. Será observado que qualquer redução da frequência de células tumorigênicas provavelmente resultará em uma redução correspondente na tumorigenicidade, persistência, recorrência e agressividade da neoplasia.
ESTRUTURA DE ANTICORPO
[028] Anticorpos e variantes e derivados dos mesmos, incluindo nomenclatura aceita e sistemas de numeração, foram extensivamente descritos, por exemplo, em Abbas et al. (2010), Cellular and Molecular Immunology (6a Ed.), WB Saunders Company; ou Murphey et al. (2011), Janeway’s Immunobiology (8ª Ed.), Garland Science.
[029] Um "anticorpo" ou "anticorpo intacto" normalmente se refere a uma proteína tetramérica em forma de Y que compreende duas cadeias polipeptídicas pesadas (H) e duas leves (L) mantidas juntas por aglutinações dissulfeto covalentes e interações não covalentes. Cada cadeia leve é composta por um domínio variável (VL) e um domínio constante (CL). Cada cadeia pesada compreende um domínio variável (VH) e uma região constante, que no caso de anticorpos IgG, IgA e IgD, compreende três domínios denominados CH1, CH2 e CH3 (IgM e IgE têm um quarto domínio, CH4). Nas classes IgG, IgA e IgD, os domínios CH1 e CH2 são separados por uma região de dobradiça flexível, que é um segmento rico em prolina e cisteína de comprimento variável (de cerca de 10 a cerca de 60 aminoácidos em várias subclasses de IgG). Os domínios variáveis nas cadeias leve e pesada são unidos aos domínios constantes por uma região "J" de cerca de 12 ou mais aminoácidos e a cadeia pesada também tem uma região "D" de cerca de 10 aminoácidos adicionais. Cada classe de anticorpo compreende ainda ligações dissulfeto intercadeias e intracadeias formadas por resíduos de cisteína emparelhados.
[030] Tal como utilizado neste documento, o termo "anticorpo" inclui especificamente anticorpos monoclonais IgG1 humanizados que compreendem cadeias leves kappa (κ).
[031] Os domínios variáveis de anticorpos mostram uma variação considerável na composição de aminoácidos de um anticorpo para outro e são principalmente responsáveis pelo reconhecimento e aglutinação do antígeno. As regiões variáveis de cada par de cadeias leve/pesada formam o sítio de aglutinação do anticorpo, de modo que um anticorpo IgG intacto tenha dois sítios de aglutinação (isto é, é bivalente). Os domínios VH e VL compreendem três regiões de extrema variabilidade, que são denominadas regiões hipervariáveis ou, mais comumente, regiões determinantes de complementaridade (CDRs), enquadradas e separadas por quatro regiões menos variáveis conhecidas como regiões estruturais (FRs). A associação não covalente entre a região VH e VL forma o fragmento Fv (de "fragmento variável") que contém um dos dois sítios de aglutinação ao antígeno do anticorpo.
[032] Tal como utilizado neste documento, a atribuição de aminoácidos a cada domínio, região estrutural e CDR será de acordo com um dos esquemas fornecidos por Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest (5ª Ed.), US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, Publicação NIH no. 91-3242; Chothia et al., 1987, PMID: 3681981; Chothia et al., 1989, PMID: 2687698; MacCallum et al., 1996, PMID: 8876650; ou Dubel, Ed. (2007) Handbook of Therapeutic Antibodies, 3ª Ed., Wily-VCH Verlag GmbH e Co ou AbM (Oxford Molecular/MSI Pharmacopia), a menos que indicado de outra forma. Como é bem conhecido na técnica, a numeração dos resíduos da região variável é tipicamente conforme estabelecido em Chothia ou Kabat. Os resíduos de aminoácidos que compreendem CDRs, conforme definidos por Kabat, Chothia, MacCallum (também conhecido como Contact) e AbM, conforme obtidos a partir do banco de dados do site da web Abysis (infra.) são apresentados abaixo na Tabela 1. Observe que MacCallum usa o sistema de numeração Chothia. TABELA 1 Kabat Chothia MacCallum AbM VH CDR1 31 a 35 26 a 32 30 a 35 26 a 35 VH CDR2 50 a 65 52 a 56 47 a 58 50 a 58 VH CDR3 95 a 102 95 a 102 93 a 101 95 a 102 VL CDR1 24 a 34 24 a 34 30 a 36 24 a 34 VL CDR2 50 a 56 50 a 56 46 a 55 50 a 56 VL CDR3 89 a 97 89 a 97 89 a 96 89 a 97
[033] As regiões variáveis e CDRs em uma sequência de anticorpos podem ser identificadas de acordo com regras gerais que foram desenvolvidas na técnica (por exemplo, como estabelecido acima) ou alinhando as sequências contra um banco de dados de regiões variáveis conhecidas. Os métodos para identificar estas regiões são descritos em Kontermann e Dubel, eds., Antibody Engineering, Springer, New York,
NY, 2001 e Dinarello et al., Current Protocols in Immunology, John Wiley and Sons Inc., Hoboken, NJ, 2000. Bancos de dados exemplificativos de sequências de anticorpos são descritos e podem ser acessados através do site da web “Abysis” em www.bioinf.org.uk/abs (mantido por AC Martin no Departamento de Bioquímica & Biologia Molecular da University College London, Londres, Inglaterra) e do site da web VBASE2 em www.vbase2.org, conforme descrito em Retter et al., Nucl. Acids Res., 33 (edição do banco de dados): D671 a D674 (2005).
[034] Preferencialmente, as sequências são analisadas com uso do banco de dados Abysis, que integra dados de sequência de Kabat, IMGT e Protein Data Bank (PDB) com dados estruturais do PDB. Consultar o capítulo do livro do Dr. Andrew C. R. Martin Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. Em: Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel, S. e Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg, ISBN-13: 978-3540413547, também disponível no site da web bioinforg.uk/abs). O site da web do banco de dados Abysis inclui ainda regras gerais que foram desenvolvidas para identificar CDRs que podem ser usados de acordo com os ensinamentos deste documento. Salvo indicação em contrário, todos os CDRs estabelecidos neste documento são derivados de acordo com o site da web do banco de dados Abysis de acordo com Kabat et al.
[035] Para as posições de aminoácidos da região constante da cadeia pesada discutidas na invenção, a numeração está de acordo com o índice Eu primeiro descrito em Edelman et al., 1969, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63 (1): 78 a 85 que descreve a sequência de aminoácidos da proteína Eu do mieloma, que, segundo consta, foi a primeira IgG1 humana sequenciada. O índice Eu de Edelman também é estabelecido em Kabat et al., 1991 (supra.). Assim, os termos "índice Eu conforme estabelecido em Kabat" ou "índice Eu de Kabat" ou "índice Eu" ou "numeração Eu”, no contexto da cadeia pesada, referem-se ao sistema de numeração de resíduos com base no anticorpo IgG1 Eu humano de Edelman et al. conforme estabelecido em Kabat et al.,
1991 (supra.). O sistema de numeração utilizado para a sequência de aminoácidos da região constante de cadeia leve é estabelecido de forma semelhante em Kabat et al., (supra.).
[036] Os versados na técnica observarão que as sequências da região constante de cadeia pesada e leve do anticorpo hSEZ6-1.ss1 foram geneticamente modificadas como divulgado neste documento para fornecer cisteínas desemparelhadas. Essas regiões constantes são então operacionalmente associadas com as regiões variáveis de cadeia pesada e leve divulgadas com uso de técnicas de biologia molecular padrão para fornecer as cadeias de anticorpo de comprimento total que são incorporadas no hSEZ6-1.ss1 divulgado.
GERAÇÃO E PRODUÇÃO DE ANTICORPOS
[037] O anticorpo humanizado hSEZ6-1.ss1 é produzido conforme estabelecido nos Exemplos 1 e 2 em anexo e as sequências de aminoácidos resultantes da cadeia pesada de comprimento total e da cadeia leve de comprimento total são apresentadas imediatamente abaixo como SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4. Conforme discutido abaixo, a cadeia pesada do anticorpo humanizado compreende uma mutação S60N projetada para inativar um sítio de glicosilação e uma mutação C220S (numerada de acordo com o índice EU de Kabat) que fornece a cisteína livre na cadeia leve. Observe que, na cadeia pesada, as mutações S60N e C220S estão sublinhadas, enquanto a cisteína livre resultante na posição 214 está sublinhada na cadeia leve. A região variável de ambas as cadeias é representada em negrito.
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSSWINWVRQMPGKGLEWMG RIYPGEGDTNYNGNFEGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCTRGLVMDYW GQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL
SPG (SEQ ID NO: 3)
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVDYNGISYMHWYQQKPGQAPRLL IYAASNVQSGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSIEDPPTFGGGTKV EIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQ
ESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 4)
[038] Além disso, as sequências de ácidos nucleicos compatíveis que codificam as cadeias pesada e leve de comprimento total acima mencionadas são apresentadas imediatamente abaixo como SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6, respectivamente. SEQUÊNCIA DE ÁCIDOS NUCLEICOS DE CADEIA PESADA (COM ÍNTRONS) gaagtccaactcgtccaatccggtgccgaagtgaaaaagcctggggaatccctgaagatcagctgcaa gggatccggttactcgttcacctcctcctggattaactgggtccggcagatgcccggaaagggactggagtggatggg cagaatctatccgggcgaaggggacactaattacaacggaaacttcgagggccaggtcaccatttcggccgataag agcatctcaaccgcgtacttgcagtggtcaagcctgaaggcttccgacaccgccatgtactactgtactcgcggccttgt gatggactactggggacagggaactctcgtgaccgtgtcgtccgcctctaccaagggcccttccgtgttccctctggcc ccctcgagcaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgagccggtga cggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctact ccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcc cagcaacaccaaggtggacaagaaagttggtgagaggccagcacagggagggagggtgtctgctggaagccag gctcagcgctcctgcctggacgcatcccggctatgcagccccagtccagggcagcaaggcaggccccgtctgcctct tcacccggaggcctctgcccgccccactcatgctcagggagagggtcttctggctttttccccaggctctgggcaggca caggctaggtgcccctaacccaggccctgcacacaaaggggcaggtgctgggctcagacctgccaagagccatat ccgggaggaccctgcccctgacctaagcccaccccaaaggccaaactctccactccctcagctcggacaccttctct cctcccagattccagtaactcccaatcttctctctgcagagcccaaatctagtgacaaaactcacacatgcccaccgtg cccaggtaagccagcccaggcctcgccctccagctcaaggcgggacaggtgccctagagtagcctgcatccaggg acaggccccagccgggtgctgacacgtccacctccatctcttcctcagcacctgaactcctggggggaccgtcagtctt cctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtga gccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgc gggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaa ggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaaggtg ggacccgtggggtgcgagggccacatggacagaggccggctcggcccaccctctgccctgagagtgaccgctgta ccaacctctgtccctacagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgacca agaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgg gcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctca ccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactac acgcagaagagcctctccctgtctccgggt (SEQ ID NO: 5)
SEQUÊNCIA DE ÁCIDOS NUCLEICOS DE CADEIA LEVE gaaatcgtgttgacccagtcccccgctaccctgtcactgagccccggagaacgcgcgactctgtcctgcc gggcatcccagtccgtggactacaacggaatctcctacatgcactggtatcagcaaaagccaggccaagccccga gactgctcatctacgccgcctcgaacgtgcagagcggtattccggcgcggttctccggctcgggcagcggaaccgatt ttaccctcactatctcgtcacttgaacctgaggacttcgccgtgtactactgccagcagtccattgaggacccgcctacttt cggggggggaaccaaagtcgagatcaagcggactgtggctgcaccaagtgtcttcatcttcccgccatctgatgagc agttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtg gataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcct cagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagg gcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt (SEQ ID NO: 6)
[039] O componente de anticorpo SEZ6 da presente invenção foi modificado geneticamente para facilitar a conjugação eficiente da toxina caliqueamicina. A este respeito, as preparações de conjugado anticorpo fármaco (ADC) da invenção compreendem uma população relativamente homogênea de moléculas de ADC, tanto em termos da posição da citotoxina no anticorpo quanto da razão entre fármaco e anticorpo (DAR). Com base na presente divulgação, um versado na técnica pode prontamente fabricar o construto geneticamente modificado sítio-específico divulgado que compreende SEQ ID NOS: 3 e 4. Tal como utilizado neste documento, um "anticorpo sítio-específico" ou “construto sítio-específico" significa um anticorpo em que pelo menos um aminoácido na cadeia pesada ou leve é deletado, alterado ou substituído (de preferência por outro aminoácido) para fornecer pelo menos uma cisteína livre. Da mesma forma, um "conjugado sítio-específico" deve significar um ADC que compreende um anticorpo sítio-específico e pelo menos uma citotoxina conjugada com a cisteína livre ou desemparelhada (ou as cisteínas livres ou desemparelhadas). Na presente invenção, a cisteína na posição 220 da cadeia pesada (numeração Eu de Kabat) foi mutada para uma serina, interrompendo assim a ponte dissulfeto que se forma naturalmente com a cisteína terminal na posição 214 da região constante de cadeia leve kappa. Isto torna a cisteína na posição 214 uma cisteína livre ou desemparelhada, de acordo com os ensinamentos deste documento, que é então conjugada com o ligante de fármaco caliqueamicina divulgado.
[040] Tal como usado neste documento, os termos "cisteína livre" ou "cisteína desemparelhada" podem ser usados de forma intercambiável, a menos que ditado de outra forma pelo contexto e devem significar um constituinte de cisteína (ou contendo tiol) (por exemplo, um resíduo de cisteína) de um anticorpo, seja naturalmente presente ou especificamente incorporado em uma posição de resíduo selecionada com uso de técnicas de engenharia molecular, que não faz parte de uma aglutinação dissulfeto de ocorrência natural (ou "nativa") sob condições fisiológicas. Em modalidades selecionadas, a cisteína livre pode compreender uma cisteína de ocorrência natural cujo parceiro de ponte dissulfeto intracadeia ou intercadeia nativo foi substituído, eliminado ou de outra forma alterado para interromper a ponte dissulfeto de ocorrência natural sob condições fisiológicas, tornando assim a cisteína desemparelhada adequada para conjugação sítio-específica. Será observado que, antes da conjugação, cisteínas livres ou desemparelhadas podem estar presentes como um tiol (cisteína reduzida), como uma cisteína capeada (oxidada) ou como parte de uma aglutinação dissulfeto intra ou intermolecular não nativa (oxidada) com outro grupo cisteína ou tiol na mesma molécula ou em moléculas diferentes, dependendo do estado de oxidação do sistema. Conforme discutido em mais detalhes abaixo, a redução suave do construto de anticorpo modificado geneticamente de forma adequada fornecerá tióis disponíveis para conjugação sítio-específica. Consequentemente, em modalidades particularmente preferenciais, as cisteínas livres ou desemparelhadas serão sujeitas à redução seletiva e subsequente conjugação para fornecer composições DAR homogêneas. Não mais "livres" ou "desemparelhadas", tais posições de resíduos podem ser denominadas “sítios geneticamente modificados de conjugação", uma vez que estão covalentemente aglutinadas ao ligante de fármaco.
[041] Os anticorpos e fragmentos dos mesmos podem ser produzidos ou modificados com uso de material genético obtido a partir de células produtoras de anticorpos e tecnologia recombinante (consultar, por exemplo; Dubel and Reichert (Eds.) (2014) Handbook of Therapeutic Antibodies, 2a Edição, Wiley-Blackwell GmbH; Sambrook and Russell (Eds.) (2000) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3a Ed.), NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel et al. (2002) Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc.; e U.S.P.N. 7.709.611).
[042] Outro aspecto da invenção refere-se a moléculas de ácido nucleico que codificam o anticorpo da invenção. Os ácidos nucleicos podem estar presentes em células inteiras, em um lisado de célula ou em uma forma parcialmente purificada ou substancialmente pura. Um ácido nucleico é "isolado" ou se torna substancialmente puro quando separado de outros componentes celulares ou outros contaminantes, por exemplo, outras proteínas ou ácidos nucleicos celulares, por técnicas padrão, incluindo tratamento alcalino/SDS, bandas de CsCl, cromatografia em coluna, eletroforese em gel de agarose e outras bem conhecidas na técnica. Um ácido nucleico da invenção pode ser, por exemplo, DNA (por exemplo, DNA genômico, cDNA), RNA e variantes artificiais dos mesmos (por exemplo, ácidos nucleicos de peptídeo), seja de fita simples ou dupla ou RNA, RNA e pode ou não conter íntrons. Em modalidades selecionadas, o ácido nucleico é uma molécula de cDNA.
[043] Os ácidos nucleicos da invenção podem ser obtidos com uso de técnicas de biologia molecular padrão. Para anticorpos expressos por hibridomas (por exemplo, hibridomas preparados como descrito nos Exemplos abaixo), os cDNAs que codificam as cadeias leve e pesada do anticorpo podem ser obtidos por amplificação por PCR padrão ou técnicas de clonagem de cDNA. Para anticorpos obtidos de uma biblioteca de genes de imunoglobulina (por exemplo, com uso de técnicas de exibição de fago), as moléculas de ácido nucleico que codificam o anticorpo podem ser recuperadas da biblioteca.
[044] Os fragmentos de DNA que codificam os segmentos VH e VL podem ser ainda manipulados por técnicas de DNA recombinante padrão, por exemplo, para converter os genes da região variável em genes de cadeia de anticorpo de comprimento total, em genes de fragmento Fab ou em um gene scFv. Nessas manipulações, um fragmento de DNA que codifica VL ou VH está operacionalmente ligado a outro fragmento de DNA que codifica outra proteína, tal como uma região constante de anticorpo ou um ligante flexível. O termo "operacionalmente ligado", conforme usado neste contexto, significa que os dois fragmentos de DNA são unidos de modo que as sequências de aminoácidos codificadas pelos dois fragmentos de
DNA permaneçam in-frame.
[045] O DNA isolado que codifica a região VH pode ser convertido em um gene de cadeia pesada de comprimento total ligando operacionalmente o DNA que codifica VH a outra molécula de DNA que codifica regiões constantes de cadeia pesada (CH1, CH2 e CH3 no caso de IgG1). As sequências dos genes da região constante de cadeia pesada humana são conhecidas na técnica (consultar, por exemplo, Kabat, et al. (1991) (supra)) e os fragmentos de DNA que abrangem estas regiões podem ser obtidos por amplificação de PCR padrão.
[046] O DNA isolado que codifica a região VL pode ser convertido em um gene de cadeia leve de comprimento total ligando operacionalmente o DNA que codifica VL a outra molécula de DNA que codifica a região constante de cadeia leve, CL. As sequências de genes da região constante de cadeia leve humanos são conhecidas na técnica (consultar, por exemplo, Kabat, et al. (1991) (supra)) e fragmentos de DNA que abrangem estas regiões podem ser obtidos por amplificação de PCR padrão. A região constante de cadeia leve pode ser uma região constante kappa ou lambda, mas mais preferencialmente é uma região constante kappa.
[047] Em cada caso, os domínios VH ou VL podem ser operativamente ligados às suas respectivas regiões constantes (CH ou CL), em que as regiões constantes são regiões constantes sítio-específicas e fornecem um anticorpo sítio-específico. Em modalidades selecionadas, o anticorpo sítio-específico resultante compreenderá duas cisteínas desemparelhadas no domínio CL.
[048] Para a produção de alto rendimento a longo prazo de proteínas recombinantes, a expressão estável é preferencial. Consequentemente, as linhas de células que expressam de forma estável o anticorpo selecionado podem ser geneticamente modificadas com uso de técnicas padrão reconhecidas na técnica e fazem parte da invenção. Em vez de usar vetores de expressão que contêm origens virais de replicação, as células hospedeiras podem ser transformadas com DNA controlado por elementos de controle de expressão apropriados (por exemplo, sequências promotoras ou aprimoradoras, terminadores de transcrição, sítios de poliadenilação, etc.) e um marcador selecionável. Qualquer um dos sistemas de seleção bem conhecidos na técnica pode ser usado, incluindo o sistema de expressão do gene da glutamina sintetase (o sistema GS) que fornece uma abordagem eficiente para aprimorar a expressão sob condições selecionadas. O sistema GS é discutido no todo ou em parte em conexão com os documentos EP 0 216 846, EP 0 256 055, EP 0 323 997 e EP 0 338 841 e USPNs 5.591.639 e 5.879.936. Outro sistema de expressão compatível para o desenvolvimento de linhas de células estáveis é o Freedom™ CHO-S Kit (Life Technologies).
[049] Uma vez que um anticorpo da invenção foi produzido por expressão recombinante ou qualquer outra das técnicas divulgadas, ele pode ser purificado ou isolado por métodos conhecidos na técnica em que é identificado e separado e/ou recuperado de seu ambiente natural e separado de contaminantes que poderiam interferir no uso diagnóstico ou terapêutico do anticorpo ou ADC relacionado. Os anticorpos isolados incluem anticorpos in situ em células recombinantes.
[050] Estas preparações isoladas podem ser purificadas com uso de várias técnicas reconhecidas na técnica, tais como, por exemplo, cromatografia de troca iônica e de exclusão de tamanho, diálise, diafiltração e cromatografia de afinidade, particularmente cromatografia de afinidade de Proteína A ou Proteína G.
CONJUGADOS DE ANTICORPOS
[051] Conforme discutido acima, o anticorpo da invenção é conjugado com duas toxinas de caliqueamicina para formar um "conjugado anticorpo fármaco" (ADC) ou “conjugado de anticorpo". O termo "conjugado" é usado de maneira ampla e significa a associação covalente de uma caliqueamicina com o anticorpo da presente invenção. Neste documento, a associação é efetuada através de resíduos de cisteína na posição 214 das regiões constantes de cadeia leve.
[052] Será observado que os ADCs da presente invenção podem ser usados para entregar seletivamente ogivas de caliqueamicina predeterminadas para células tumorigênicas e/ou células que expressam SEZ6. Conforme estabelecido neste documento, os termos "fármaco" ou "ogiva" podem ser usados de forma intercambiável e significam uma molécula de caliqueamicina. Uma "carga útil" compreende a caliqueamicina em combinação com um composto ligante não clivável que fornece um complexo farmacêutico estável até que o ADC alcance o alvo. A Fórmula II (estabelecida acima) é uma carga útil exemplificativa com uma ogiva de caliqueamicina.
[053] Em modalidades preferenciais, o ADC divulgado irá direcionar a carga útil aglutinada (por exemplo, Fórmula II) para o sítio alvo em um estado relativamente não reativo e não tóxico antes de liberar e ativar a toxina de caliqueamicina. Esta liberação alvejada da ogiva é preferencialmente alcançada através de conjugação estável das cargas úteis e composição relativamente homogênea das preparações de ADC que minimizam o excesso de espécies tóxicas de ADC conjugadas. Acoplados a um ligante de fármaco não clivável particularmente estável que é projetado para liberar a ogiva após a entrega ao sítio de tumor, os conjugados da presente invenção podem reduzir substancialmente a toxicidade não específica indesejável. Isto fornece vantajosamente níveis relativamente elevados da citotoxina ativa no sítio de tumor, ao mesmo tempo que minimiza a exposição de células e tecidos não alvejados, fornecendo assim eficácia aprimorada.
[054] O conjugado da presente invenção pode ser representado, de modo geral, pela Fórmula III: Ab-[L-D]n em que: a) Ab compreende um anticorpo anti-SEZ6 que tem uma cadeia pesada de SEQ ID NO: 3 e uma cadeia leve de SEQ ID NO: 4;
b) [L-D] compreende o fármaco ligante de Fórmula II covalentemente anexado a Ab; e c) n é 2.
[055] Em algumas modalidades preferenciais, a presente invenção compreende a conjugação seletiva da carga útil de caliqueamicina com cisteínas livres com uso de agentes estabilizadores em combinação com agentes redutores suaves, conforme descrito neste documento. Tais condições de reação tendem a fornecer preparações mais homogêneas com menos conjugação não específica e contaminantes e, correspondentemente, menos toxicidade.
OGIVA DE CALIQUEAMICINA
[056] Conforme discutido neste documento, os anticorpos da invenção são conjugados com uma toxina de caliqueamicina. Ou seja, o ADC SEZ6 divulgado da invenção pode compreender a fórmula Ab-[LD]n (Fórmula III) ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma, em que D é caliqueamicina ou análogo da mesma em qualquer uma das estruturas moleculares fornecidas neste documento. Como é conhecido na técnica, as caliqueamicinas são uma classe de antibióticos antitumorais enediyne derivados da bactéria Micromonospora echinospora, incluindo caliqueamicina γ1I, caliqueamicina β1Br, caliqueamicina γ1Br, caliqueamicina α2I, caliqueamicina α3I, caliqueamicina β1i e caliqueamicina δ1i foram isoladas e caracterizadas. As estruturas de cada um dos análogos de caliqueamicina anteriores são bem conhecidas na técnica (por exemplo, consultar Lee et al., Journal of Antibiotics, julho de 1989, que é incorporado neste documento a título de referência em sua totalidade) e são compatíveis com os construtos ligantes de fármacos de caliqueamicina e conjugados anticorpo-fármaco divulgados neste documento.
[057] Em geral, caliqueamicina γ1 contém duas regiões estruturais distintas, cada uma desempenhando uma função específica na atividade biológica do composto. A maior das duas consiste em um resíduo de açúcar prolongado, que compreende quatro unidades de monossacarídeo e um anel de benzeno hexasubstituído; estes são unidos através de uma série altamente incomum de ligações glicosídicas, de tioéster e hidroxilamina. A segunda região estrutural, a aglicona (conhecida como caliqueamicinona), contém um núcleo bicíclico compacto e altamente funcionalizado, que aloja uma unidade enediyne tensionada dentro de um anel de ponte de 10 membros. Esta subunidade aglicona compreende ainda um trissulfeto alílico que, conforme descrito abaixo, funciona como um ativador para gerar a forma citotóxica da molécula.
[058] A título de exemplo, a estrutura para o trissulfeto de caliqueamicina γ1I é mostrada imediatamente abaixo na Fórmula IV: Fórmula IV
[059] Conforme usado neste documento, o termo "caliqueamicina" deve significar qualquer um dentre caliqueamicina γ1I, caliqueamicina β1Br, caliqueamicina γ1Br, caliqueamicina α2I, caliqueamicina α3I, caliqueamicina β1i e caliqueamicina δ1 em conjunto com derivativos de N-acetila, análogos de sulfeto e análogos dos mesmos. Consequentemente, conforme usado neste documento, o termo "caliqueamicina" será entendido como abrangendo qualquer caliqueamicina encontrada na natureza, bem como moléculas de caliqueamicina com uma porção química de dissulfeto que tem um ponto de anexação a outra molécula (por exemplo, um conjugado anticorpo fármaco) e análogos das mesmas. A título de exemplo, conforme usado neste documento, caliqueamicina γI deve ser entendida como compreendendo as seguintes moléculas: Fórmula V e Fórmula VI em que R1 é definido como abaixo.
[060] Será observado que qualquer um dos compostos acima mencionados é compatível com os ensinamentos deste documento e pode ser usado para fabricar os construtos ligantes de fármaco de caliqueamicina e conjugados anticorpo fármaco divulgados. Em certas modalidades, tal como mostrado na Fórmula II, o componente caliqueamicina dos conjugados anticorpo fármaco divulgados compreenderá N-acetil Caliqueamicina γ1I (N-Ac caliqueamicina).
[061] As caliqueamicinas alvejam ácidos nucleicos e causam a cisão da fita, exterminando assim a célula-alvo. Mais especificamente, descobriu-se que as caliqueamicinas se aglutinam ao sulco menor do DNA, onde então sofrem uma reação análoga à ciclização de Bergman para gerar uma espécie diradical. A respeito disso, a subunidade de tetrassacarídeo de arila serve para entregar o fármaco ao seu alvo, aglutinando-se firmemente ao sulco menor do DNA de dupla hélice, conforme demonstrado por Crothers et al. (1999). Quando um nucleófilo (por exemplo, glutationa) ataca o átomo de enxofre central do grupo trissulfeto, ele causa uma mudança significativa na geometria estrutural e impõe uma grande cepa no anel enediyne de 10 membros. Esta cepa é completamente aliviada pela enediyne passando por uma reação de cicloaromatização, gerando um dirradical 1,4- benzenoide altamente reativo e levando, eventualmente, à clivagem do DNA atraindo átomos de hidrogênio da cadeia principal do DNA de desoxirribose, o que resulta na cisão da fita. Nota-se que nos construtos análogos de dissulfeto de caliqueamicina da presente invenção, o nucleófilo cliva a aglutinação dissulfeto protegida para produzir o dirradical desejado.
[062] Mais particularmente, entende-se que D compreende expressamente qualquer membro da classe de caliqueamicina como conhecido na técnica em que a porção química terminal –-SSS-CH3 pode ser substituída por –SS- , em que o símbolo representa o ponto de anexação a um ligante.
[063] Assim, em certas modalidades, D tem a Fórmula V, Fórmula V em que R1 é hidrogênio, halogênio, alquila substituída ou não substituída, heteroalquila substituída ou não substituída, cicloalquila substituída ou não substituída, heterocicloalquila substituída ou não substituída, arila substituída ou não substituída, ou heteroarila substituída ou não substituída, -CF3, -CCl3, -CBr3, - CI3, -CN, -C(O)R1E, -OR1A, -NR1BR1C, -C(O)OR1A, -C(O)NR1BR1C, -SR1D, -SOn1R1B ou –SOv1NR1BR1C. Em certas modalidades selecionadas, R1 compreenderá H. Em outras modalidades selecionadas, R1 compreenderá -C(O)CH3.
[0101] R1A, R1B, R1C, R1D e R1E são independentemente hidrogênio, halogênio,–CF3, –CCl3, –CBr3, –CI3, –OH, –NH2, –COOH, –CONH2, –N(O)2, –SH, - S(O)3H, -S(O)4H, -S(O)2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, - NHS(O)2H, -NHC(O)H, -NHC(O)-OH, –NHOH, –OCF3, –OCCl3, –OCBr3, –OCI3, – OCHF2, –OCHCl2, –OCHBr2, –OCHI2, alquila substituída ou não substituída, heteroalquila substituída ou não substituída, cicloalquila substituída ou não substituída, heterocicloalquila substituída ou não substituída, arila substituída ou não substituída ou heteroarila substituída ou não substituída.
[064] Em algumas modalidades, os substituintes R1B e R1C aglutinados ao mesmo átomo de nitrogênio podem opcionalmente ser unidos para formar uma heterocicloalquila substituída ou não substituída ou uma heteroarila substituída ou não substituída. O símbolo n1 é independentemente um número inteiro de 0 a 4, o símbolo v1 é independentemente 1 ou 2 e o símbolo representa o ponto de anexação a um ligante.
[065] No que diz respeito à Fórmula V, será observado que o composto ilustrado compreende um análogo de dissulfeto de caliqueamicina (por exemplo, um análogo de N-acetil caliqueamicina, tal como mostrado na Fórmula II) preferencialmente ligado a um grupo protetor de dissulfeto (no ponto de anexação representado por ) que está covalentemente aglutinado ao restante do ligante. O grupo protetor de dissulfeto melhora a estabilidade da aglutinação dissulfeto na corrente sanguínea e permite a síntese eficaz dos construtos de ligante de caliqueamicina divulgados. Em certas modalidades, o grupo dissulfeto de caliqueamicina é preferencialmente protegido por um grupo arila ou alifático bifuncional de cadeia curta substituído ou não substituído ("grupo protetor de dissulfeto") que fornece estabilidade (por exemplo, estabilidade de plasma) até o ADC atingir a célula-alvo. Mais especificamente, a configuração do grupo protetor de dissulfeto fornece um grau de impedimento estérico para a aglutinação dissulfeto, reduzindo assim sua suscetibilidade à clivagem por meio de reações de troca tiol- dissulfeto. Nesta posição, o grupo protetor de dissulfeto liga covalentemente o grupo dissulfeto de caliqueamicina ao restante do ligante não clivável.
[066] Ao atingir o alvo (por exemplo, uma célula de câncer), o ligante será preferencialmente cortado ou degradado para liberar a caliqueamicina anexada à parte do ligante através do grupo protetor de dissulfeto. Em certas modalidades, uma vez que o ligante foi inicialmente clivado além do grupo protetor de dissulfeto (isto é, distal da caliqueamicina), o restante do ligante anexado à caliqueamicina será degradado sob condições fisiológicas até o ponto em que a ligação dissulfeto é cortada (de preferência intracelularmente) seguido pelo rearranjo e formação das espécies ativas de caliqueamicina birradical. É esta forma de ogiva de caliqueamicina que se aglutina ao sulco menor do DNA celular e induz os efeitos citotóxicos desejados (consultar Walker et al., Biochemistry 89: 4.608 a 4.612, 5/92 que é incorporado neste documento a título de referência a sua totalidade).
COMPOSTOS LIGANTES
[067] Conforme indicado acima, as cargas úteis compatíveis com a presente invenção compreendem uma ou mais ogivas e um ligante não clivável que associa as ogivas ao agente de alvejamento de anticorpos. Ligantes não cliváveis compatíveis se aglutinam covalentemente ao resíduo reativo no anticorpo (de preferência uma cisteína ou lisina) e caliqueamicina através da porção química de dissulfeto.
[068] Em modalidades particularmente preferenciais, o ligante compreenderá ligantes não cliváveis selecionados. Em certas modalidades, os ADCs compreenderão ligantes não cliváveis compatíveis que contêm polietilenoglicol ligado a amida ou espaçadores de alquila que liberam a carga útil de caliqueamicina durante a degradação lisossomal do ADC dentro da célula-alvo. Um ligante não clivável particularmente compatível usado na Fórmula II é mostrado imediatamente abaixo na Fórmula VII em que a linha ondulada indica o ponto de anexação ao grupo dissulfeto da caliqueamicina.
Fórmula VII A síntese da Fórmula II, incluindo o componente ligante, é mostrada no Exemplo 3 abaixo com as condições associadas.
CONJUGAÇÃO
[069] Vários métodos são conhecidos na técnica para conjugar um composto terapêutico com um resíduo de cisteína e serão evidentes para o versado na técnica. Sob condições básicas, os resíduos de cisteína serão desprotonados para gerar um tiolado nucleófilo que pode ser reagido com eletrófilos tais como maleimidas e iodoacetamidas. Geralmente, os reagentes para tais conjugações podem reagir diretamente com um tiol de cisteína para formar a proteína conjugada ou com um fármaco ligante para formar um intermediário de fármaco ligante. No caso de um ligante, várias rotas, empregando reações, condições e reagentes de química orgânica são conhecidas pelos versados na técnica, incluindo: (1) reação de um grupo cisteína da proteína da invenção com um reagente de ligante, para formar um intermediário de ligação de proteína, por meio de uma ligação covalente, seguido pela reação com um composto ativado; e (2) reação de um grupo nucleofílico de um composto com um reagente de ligante, para formar um intermediário ligante de fármaco, por meio de uma ligação covalente, seguida pela reação com um grupo cisteína de uma proteína da invenção.
[070] Antes da conjugação, os anticorpos podem se tornar reativos para a conjugação com reagentes de ligantes por tratamento com um agente redutor, tal como ditiotreitol (DTT) ou (tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP). Em outras modalidades, grupos nucleofílicos adicionais podem ser introduzidos em anticorpos através da reação de lisinas com reagentes, incluindo, mas não se limitando a, 2-iminotiolano (reagente de Traut), SATA, SATP ou SAT(PEG)4, resultando na conversão de uma amina em um tiol.
[071] Os reagentes de conjugação geralmente incluem maleimida, haloacetila, succinimidil-éster de iodoacetamida, isotiocianato, cloreto de sulfonila, 2,6- diclorotriazinila, éster pentafluorofenílico e fosforamidita, embora outros grupos funcionais também possam ser usados. Em certas modalidades, os métodos incluem, por exemplo, o uso de maleimidas, iodoacetimidas ou haloacetila/halogenetos de alquila, aziridina, derivados de acriloíla para reagir com o tiol de uma cisteína para produzir um tioéter que é reativo com um composto. A troca de dissulfeto de um tiol livre com um piridildissulfeto ativado também é útil para a produção de um conjugado (por exemplo, uso de ácido 5-tio-2-nitrobenzóico (TNB)). Preferencialmente, é usada uma maleimida.
[072] Conforme discutido acima, os anticorpos sítio-específicos ou anticorpos geneticamente modificados permitem preparações de conjugados que exibem estabilidade aprimorada e homogeneidade substancial devido, pelo menos em parte, ao fornecimento de sítio de cisteína livre geneticamente modificado (ou sítios de cisteína livre geneticamente modificados) e/ou aos procedimentos inovadores de conjugação estabelecidos neste documento. Ao contrário da metodologia de conjugação convencional que reduz total ou parcialmente cada uma das ligações dissulfeto de anticorpo intracadeia ou intercadeia para fornecer sítios de conjugação (e é totalmente compatível com a presente invenção), a presente invenção fornece adicionalmente a redução seletiva de certos sítios de cisteína livre preparados e anexação do ligante de fármaco aos mesmos.
[073] A este respeito, será observado que a especificidade de conjugação promovida pelos sítios geneticamente modificados e a redução seletiva permitem uma alta porcentagem de conjugação direcionada ao sítio nas posições desejadas. Significativamente, alguns desses sítios de conjugação, tais como aqueles presentes na região terminal da região constante de cadeia leve, são tipicamente difíceis de serem conjugados com eficácia, pois tendem a reagir de forma cruzada com outras cisteínas livres. No entanto, por meio de engenharia molecular e redução seletiva das cisteínas livres resultantes, podem ser obtidas taxas de conjugação eficientes que reduzem consideravelmente contaminantes de alta DAR indesejados e toxicidade não específica. Mais geralmente, os construtos geneticamente modificados e os métodos de conjugação inovadores divulgados que compreendem a redução seletiva fornecem preparações de ADC com farmacocinética e/ou farmacodinâmica melhorada e, potencialmente, um índice terapêutico melhorado.
[074] Em certas modalidades, os construtos sítio-específicos apresentam cisteína livre (ou cisteínas livres) que, quando reduzida, compreendem grupos tiol que são nucleofílicos e capazes de reagir para formar ligações covalentes com grupos eletrofílicos em porções químicas de ligante, tais como aquelas divulgadas acima. Conforme discutido acima, os anticorpos da presente invenção preferencialmente têm cisteínas intercadeias desemparelhadas redutíveis, isto é, cisteínas que fornecem tais grupos nucleofílicos. Assim, em certas modalidades, a reação de grupos sulfidrila livres das cisteínas livres reduzidas e dos grupos terminais maleimido ou haloacetamida de ligantes de fármaco compatíveis proporcionará a conjugação desejada. Em tais casos, as cisteínas livres dos anticorpos podem se tornar reativas para conjugação com reagentes de ligantes por tratamento com um agente redutor, tal como ditiotreitol (DTT) ou (tris(2-carboxietil) fosfina (TCEP). Cada cisteína livre apresentará, portanto, teoricamente, um tiol nucleófilo reativo. Embora tais reagentes sejam particularmente compatíveis com a presente invenção, será observado que a conjugação de anticorpos sítio-específicos pode ser alcançada com uso de várias reações, condições e reagentes geralmente conhecidos pelos versados na técnica.
[075] Além disso, verificou-se que as cisteínas livres de anticorpos geneticamente modificados podem ser seletivamente reduzidas para fornecer conjugação sítio-direcionada aprimorada e uma redução de contaminantes indesejados e potencialmente tóxicos. Mais especificamente, constatou-se que os "agentes estabilizadores", tais como arginina, modulam interações intra e intermoleculares em proteínas e podem ser usados, em conjunto com agentes redutores selecionados (de preferência relativamente suaves), para reduzir seletivamente as cisteínas livres e facilitar a conjugação sítio-específica conforme estabelecido neste documento. Conforme usado neste documento, os termos "redução seletiva" ou “reduzir seletivamente" podem ser usados de forma intercambiável e devem significar a redução de cisteína livre (ou cisteínas livres) sem interromper substancialmente as aglutinações dissulfeto nativas presentes no anticorpo geneticamente modificado. Em modalidades selecionadas, esta redução seletiva pode ser efetuada pelo uso de certos agentes redutores ou certas concentrações de agentes redutores. Em outras modalidades, a redução seletiva de um construto geneticamente modificado compreenderá o uso de agentes estabilizadores em combinação com agentes redutores (incluindo agentes redutores suaves). Será observado que o termo "conjugação seletiva" deve significar a conjugação de um anticorpo geneticamente modificado que foi seletivamente reduzido na presença de uma citotoxina conforme descrito neste documento. A este respeito, o uso de tais agentes estabilizadores (por exemplo, arginina) em combinação com agentes redutores selecionados pode melhorar notoriamente a eficiência da conjugação sítio-específica, conforme determinado pela extensão da conjugação nas cadeias pesadas e leves do anticorpo e distribuição de DAR da preparação.
Construtos de anticorpos compatíveis e técnicas e reagentes de conjugação seletiva são amplamente divulgados no documento WO2015/031698 que é incorporado neste documento especificamente em relação a essa metodologia e construtos.
[076] Embora sem desejar se ater a qualquer teoria particular, tais agentes estabilizadores podem atuar para modular o microambiente eletrostático e/ou modular mudanças conformacionais no sítio de conjugação desejado, permitindo assim que agentes redutores relativamente suaves (que não reduzem materialmente as aglutinações dissulfeto nativas intactas) facilitem a conjugação no sítio desejado (ou nos sítios desejados) de cisteína livre. Tais agentes (por exemplo, certos aminoácidos) são conhecidos por formar pontes de sal (por meio de ligações de hidrogênio e interações eletrostáticas) e podem modular as interações proteína-proteína de modo a conferir um efeito estabilizador que pode causar mudanças conformacionais favoráveis e/ou reduzir interações proteína-proteína desfavoráveis. Além disso, tais agentes podem atuar para inibir a formação de aglutinações intramoleculares (e intermoleculares) indesejáveis de cisteína-cisteína após a redução, facilitando assim a reação de conjugação desejada, em que a cisteína sítio-específica geneticamente modificada é aglutinada ao fármaco (de preferência através de um ligante). Uma vez que as condições de redução seletiva não proporcionam a redução significativa de aglutinações dissulfeto nativas intactas, a reação de conjugação subsequente é conduzida naturalmente para os relativamente poucos tióis reativos nas cisteínas livres (por exemplo, de preferência 2 tióis livres por anticorpo). Como aludido anteriormente, tais técnicas podem ser usadas para reduzir consideravelmente os níveis de conjugação não específica e correspondentes espécies de DAR indesejadas em preparações de conjugado fabricadas de acordo com a presente divulgação.
[077] Em modalidades selecionadas, os agentes estabilizadores compatíveis com a presente invenção geralmente compreenderão compostos com pelo menos uma porção química que tem um pKa básico. Em certas modalidades, a porção química compreenderá uma amina primária, enquanto em outras modalidades, a porção química de amina compreenderá uma amina secundária. Em ainda outras modalidades, a porção química de amina compreenderá uma amina terciária ou um grupo guanidínio. Em outras modalidades selecionadas, a porção química de amina compreenderá um aminoácido, enquanto em outras modalidades compatíveis, a porção química de amina compreenderá uma cadeia lateral de aminoácidos. Em ainda outras modalidades, a porção química de amina compreenderá um aminoácido proteinogênico. Em ainda outras modalidades, a porção química de amina compreende um aminoácido não proteinogênico. Em algumas modalidades, os agentes estabilizadores compatíveis podem compreender arginina, lisina, prolina e cisteína. Em certas modalidades preferenciais, o agente estabilizador compreenderá arginina. Além disso, os agentes estabilizadores compatíveis podem incluir guanidina e heterociclos contendo nitrogênio com pKa básico.
[078] Em certas modalidades, os agentes estabilizadores compatíveis compreendem compostos com pelo menos uma porção química de amina que tem um pKa maior do que cerca de 7,5, em outras modalidades, a porção química de amina em questão terá um pKa maior do que cerca de 8,0, em ainda outras modalidades, a porção química de amina terá um pKa maior do que cerca de 8,5 e, em ainda outras modalidades, o agente estabilizador compreenderá uma porção química de amina com um pKa maior do que cerca de 9,0. Outras modalidades compreenderão agentes estabilizadores em que a porção química de amina terá um pKa maior que cerca de 9,5, enquanto certas outras modalidades compreenderão agentes estabilizadores exibindo pelo menos uma porção química de amina tendo um pKa maior do que cerca de 10,0. Em ainda outras modalidades, o agente estabilizador compreenderá um composto tendo a porção química de amina com um pKa maior do que cerca de 10,5, em outras modalidades, o agente estabilizador compreenderá um composto tendo uma porção química de amina com um pKa maior do que cerca de
11,0, enquanto em ainda outras modalidades, o agente estabilizador compreenderá uma porção química de amina com um pKa maior do que cerca de 11,5. Em ainda outras modalidades, o agente estabilizador compreenderá um composto tendo uma porção química de amina com um pKa maior do que cerca de 12,0, enquanto em ainda outras modalidades, o agente estabilizador compreenderá uma porção química de amina com um pKa maior do que cerca de 12,5. Os versados na técnica entenderão que os pKas relevantes podem ser facilmente calculados ou determinados com uso de técnicas padrão e usados para determinar a aplicabilidade do uso de um composto selecionado como um agente estabilizador.
[079] Os agentes estabilizadores divulgados mostram ser particularmente eficazes no alvejamento da conjugação para cisteínas sítio-específicas livres quando combinados com certos agentes redutores. Para os fins da presente invenção, os agentes redutores compatíveis podem incluir qualquer composto que produza uma cisteína sítio-específica livre reduzida para conjugação sem interromper significativamente as aglutinações dissulfeto nativas do anticorpo geneticamente modificado. Sob tais condições, preferencialmente fornecidas pela combinação de agentes estabilizantes e redutores selecionados, o ligante de fármaco ativado é amplamente limitado à aglutinação ao sítio (ou sítios) de cisteína sítio-específica livre. Os agentes redutores relativamente suaves ou os agentes redutores usados em concentrações relativamente baixas para fornecer condições suaves são particularmente preferenciais. Conforme usado neste documento, os termos "agente redutor suave" ou "condições de redução suave" devem ser considerados como significando qualquer agente ou estado provocado por um agente redutor (opcionalmente na presença de agentes estabilizadores) que fornece tióis no sítio (ou sítios) de cisteína livre sem interromper substancialmente as aglutinações dissulfeto nativas presentes no anticorpo geneticamente modificado. Isto é, agentes redutores suaves ou condições (de preferência em combinação com um agente estabilizador)
são capazes de reduzir eficazmente a cisteína livre (ou as cisteínas livres) (fornecer um tiol) sem interromper significativamente as aglutinações dissulfeto nativas da proteína. As condições de redução desejadas podem ser fornecidas por uma série de compostos à base de sulfidrila que estabelecem o ambiente apropriado para a conjugação seletiva. Em modalidades, os agentes redutores suaves podem compreender compostos com um ou mais tióis livres, enquanto em algumas modalidades, os agentes redutores suaves compreenderão compostos com um único tiol livre. Exemplos não limitativos de agentes redutores compatíveis com as técnicas de redução seletiva da presente invenção compreendem glutationa, n-acetilcisteína, cisteína, 2-aminoetano-1-tiol e 2-hidroxietano-1-tiol.
[080] Será ainda observado que os anticorpos geneticamente modificados capazes de conjugação podem conter resíduos de cisteína livre que compreendem grupos sulfidrila que são bloqueados ou capeados quando o anticorpo é produzido ou armazenado. Essas tampas incluem pequenas moléculas, proteínas, peptídeos, íons e outros materiais que interagem com o grupo sulfidrila e evitam ou inibem a formação de conjugados. Em alguns casos, o anticorpo geneticamente modificado não conjugado pode compreender cisteínas livres que se aglutinam a outras cisteínas livres nos mesmos anticorpos ou em anticorpos diferentes. Conforme discutido neste documento, tal reatividade cruzada pode levar a vários contaminantes durante o procedimento de fabricação. Em algumas modalidades, os anticorpos geneticamente modificados podem requerer destapamento antes de uma reação de conjugação. Em modalidades específicas, os anticorpos deste documento são destampados e exibem um grupo sulfidrila livre capaz de conjugação. Em modalidades específicas, os anticorpos deste documento são submetidos a uma reação de destapamento que não perturba ou reorganiza as aglutinações dissulfeto de ocorrência natural. Será observado que, na maioria dos casos, as reações de destapamento ocorrerão durante as reações de redução normais (redução ou redução seletiva).
DISTRIBUIÇÃO E PURIFICAÇÃO DE DAR
[081] Em modalidades selecionadas, a metodologia de conjugação e purificação compatível com a presente invenção fornece vantajosamente a capacidade de gerar preparações de ADC relativamente homogêneas que compreendem uma distribuição estreita de DAR. A este respeito, os construtos divulgados (por exemplo, construtos sítio-específicos) e/ou a conjugação seletiva fornecem homogeneidade das espécies de ADC dentro de uma amostra em termos da razão estequiométrica entre o fármaco e o anticorpo geneticamente modificado e com respeito à localização da toxina. Conforme discutido brevemente acima, o termo “razão entre fármaco e anticorpo" ou "DAR" refere-se à razão molar entre fármaco e anticorpo em uma preparação de ADC. Em certas modalidades, uma preparação de conjugado pode ser substancialmente homogênea em relação à sua distribuição de DAR, o que significa que dentro da preparação de ADC há uma espécie predominante de ADC sítio-específico com um carregamento de fármaco particular (por exemplo, um carregamento de fármaco de 2) que também é uniforme em relação ao sítio de carregamento (isto é, nas cisteínas livres). Em certas outras modalidades da invenção, é possível alcançar a homogeneidade desejada através do uso de anticorpos sítio- específicos e/ou redução seletiva e conjugação. Em outras modalidades, a homogeneidade desejada pode ser alcançada por meio do uso de construtos sítio- específicos em combinação com redução seletiva. Em ainda outras modalidades, as preparações compatíveis podem ser purificadas com uso de técnicas de cromatografia analíticas ou preparativas para fornecer a homogeneidade desejada. Em cada uma dessas modalidades, a homogeneidade da amostra de ADC pode ser analisada com uso de várias técnicas conhecidas na técnica, incluindo, mas não se limitando a espectrometria de massa, HPLC (por exemplo, HPLC de exclusão de tamanho, RP- HPLC, HIC-HPLC, etc.) ou eletroforese capilar.
[082] No que diz respeito à purificação de preparações de ADC, será observado que métodos preparativos farmacêuticos padrão podem ser empregados para obter a pureza desejada. Conforme discutido neste documento, métodos de cromatografia líquida, tais como fase reversa (RP) e cromatografia de interação hidrofóbica (HIC), podem separar os compostos na mistura por valor de carregamento de fármaco. Em alguns casos, a cromatografia de troca iônica (IEC) ou de modo misto (MMC) também pode ser usada para isolar espécies com uma carga de fármaco específica.
[083] Em qualquer caso, os ADCs divulgados e as preparações dos mesmos podem compreender porções químicas de anticorpo e fármaco em várias razões estequiométricas molares dependendo da configuração do anticorpo e, pelo menos em parte, do método usado para efetuar a conjugação. Em certas modalidades preferenciais, o carregamento de fármaco por ADC pode compreender 2 ogivas de caliqueamicina.
[084] Apesar do nível relativamente elevado de homogeneidade fornecido pela presente invenção, as composições divulgadas compreendem, na verdade, uma mistura de conjugados com uma variedade de compostos de fármacos. Como tal, as composições de ADC divulgadas incluem misturas de conjugados em que a maioria dos anticorpos constituintes está covalentemente ligada a uma ou mais porções químicas de fármaco e (apesar da especificidade de conjugado relativa fornecida por construtos geneticamente modificados e redução seletiva) em que as porções químicas de fármaco podem ser anexadas ao anticorpo por vários grupos tiol. Isto é, após a conjugação, as composições da invenção compreenderão uma mistura de ADCs com diferentes cargas de fármaco em várias concentrações (juntamente com certos contaminantes da reação causados principalmente por reatividade cruzada de cisteína livre). No entanto, com uso de redução seletiva e purificação pós-fabricação, as composições de conjugado podem ser conduzidas ao ponto em que contêm amplamente uma única espécie de ADC desejada predominante (por exemplo, com um carregamento de fármaco de 2) com níveis relativamente baixos de outras espécies de ADC (por exemplo, com um carregamento de fármacos de 1, 4, 6, etc.). O valor de DAR médio representa a média ponderada do carregamento de fármaco para a composição como um todo (isto é, todas as espécies de ADC juntas). Os versados na técnica observarão que os valores ou especificações de DAR aceitáveis são frequentemente apresentados como uma média, uma faixa ou distribuição (isto é, uma DAR média de 2 +/- 0,5). Preferencialmente, as composições que compreendem uma DAR média medida dentro da faixa (isto é, 1,5 a 2,5) seriam usadas em um ambiente farmacêutico.
[085] Assim, em algumas modalidades, a presente invenção compreenderá composições que têm uma DAR média de 2 +/- 0,5. Em outras modalidades, a presente invenção compreenderá uma DAR média de 2 +/- 0,4 ou uma DAR de 2 +/- 0,3 ou uma DAR de 2 +/- 0,2. Em outras modalidades, as composições de conjugado de IgG1 compreenderão preferencialmente uma composição com níveis relativamente baixos (isto é, menos de 30%) de espécies de ADC não predominantes (por exemplo, ADCs com um carregamento de fármaco de 0, 1, 3, 4, 5, etc.). Em algumas modalidades, a composição de ADC compreenderá uma DAR média de 2 +/- 0,4 com níveis relativamente baixos (<30%) de espécies de ADC não predominantes. Em algumas modalidades, a composição de ADC compreenderá uma DAR média de 2 +/- 0,3 com níveis relativamente baixos (<30%) de espécies de ADC não predominantes. Em ainda outras modalidades, a espécie de ADC predominante (por exemplo, com um carregamento de fármaco de 2) estará presente em uma concentração maior que 50%, em uma concentração maior que 55%, em uma concentração maior que 60%, em uma concentração maior que 65%, em uma concentração maior que 70%, em uma concentração maior que 75%, em uma concentração maior que 80%, em uma concentração maior que 85%, em uma concentração maior que 90%, a uma concentração maior que 93%, a uma concentração maior que 95% ou mesmo a uma concentração maior que 97% quando medida em relação a todas as outras espécies de DAR presentes na composição.
[086] Conforme detalhado nos Exemplos abaixo, a distribuição de fármacos por anticorpo em preparações de ADC a partir de reações de conjugação pode ser caracterizada por meios convencionais, tais como espectrofotometria UV-Vis, HPLC de fase reversa, HIC, espectroscopia de massa, ELISA e eletroforese. A distribuição quantitativa de ADC em termos de fármacos por anticorpo também pode ser determinada.
PREPARAÇÕES FARMACÊUTICAS E USOS TERAPÊUTICOS
[087] Os anticorpos ou ADCs da invenção podem ser formulados de várias maneiras com uso de técnicas reconhecidas na técnica. Em algumas modalidades, as composições terapêuticas da invenção podem ser administradas puras ou com um mínimo de componentes adicionais, enquanto outras podem ser opcionalmente formuladas para conter carreadores farmaceuticamente aceitáveis adequados. Conforme usado neste documento, “carreadores farmaceuticamente aceitáveis” compreendem excipientes, veículos, adjuvantes e diluentes que são bem conhecidos na técnica.
DOSAGENS E REGIMES DE DOSAGEM
[088] O regime de dosagem particular, isto é, dose, tempo e repetição, dependerá do indivíduo em particular, bem como de considerações empíricas, tais como farmacocinética (por exemplo, meia-vida, taxa de depuração, etc.). A determinação da frequência de administração pode ser feita por pessoas versadas na técnica, tais como um médico assistente com base em considerações da afecção e gravidade da afecção sendo tratada, idade e estado geral de saúde do sujeito sendo tratado e semelhantes. A frequência de administração pode ser ajustada ao longo do curso da terapia com base na avaliação da eficácia da composição selecionada e do regime de dosagem. Essa avaliação pode ser feita com base em marcadores da doença, distúrbio ou afecção específica. Em modalidades em que o indivíduo tem câncer, esses incluem medições diretas do tamanho do tumor por meio de palpação ou observação visual; medição indireta do tamanho do tumor por raio x ou outras técnicas de imagem; uma melhoria avaliada por biópsia direta do tumor e exame microscópico de uma amostra do tumor; a medição de um marcador tumoral indireto ou um antígeno identificado de acordo com técnicas reconhecidas na técnica; redução do número de células proliferativas ou tumorigênicas, manutenção da redução dessas células neoplásicas; redução da proliferação de células neoplásicas; ou atraso no desenvolvimento de metástases.
INDICAÇÕES
[089] A invenção fornece o uso de um ADC da invenção para o tratamento de vários distúrbios neoplásicos. Em certas modalidades, as doenças a serem tratadas são afecções neoplásicas que compreendem tumores sólidos. Em modalidades selecionadas, o ADC da invenção será usado para tratar tumores ou células tumorigênicas que expressam um determinante SEZ6. Em certas outras modalidades, o ADC divulgado será usado para tratar um sujeito que sofre de câncer de pulmão de pequenas células (SCLC). De preferência, o "sujeito" ou "paciente" a ser tratado será humano, embora, conforme usados neste documento, os termos sejam expressamente considerados como compreendendo qualquer espécie de mamífero.
[090] Em modalidades selecionadas, o ADC pode ser administrado a pacientes com câncer de pulmão de células pequenas que exibem doença em estágio limitado ou doença em estágio extensivo. Em outras modalidades, o ADC divulgado será administrado a pacientes refratários (isto é, aqueles cuja doença se repete durante ou logo após a conclusão de um curso de terapia inicial); pacientes sensíveis (isto é, aqueles cuja recidiva é superior a 2 a 3 meses após a terapia primária); ou pacientes que exibem resistência a um agente à base de platina (por exemplo, carboplatina, cisplatina, oxaliplatina) e/ou um taxano (por exemplo, docetaxel,
paclitaxel, larotaxel ou cabazitaxel). Em certas modalidades preferenciais, o ADC SEZ6 da presente invenção pode ser administrado a pacientes da linha de frente. Em outras modalidades, o ADC SEZ6 da presente invenção pode ser administrado a pacientes de segunda linha. Em ainda outras modalidades, o ADC SEZ6 da presente invenção pode ser administrado a pacientes de terceira linha ou a pacientes de quarta linha.
ARTIGOS DE MANUFATURA
[091] A invenção inclui pacotes e kits farmacêuticos que compreendem um ou mais recipientes ou receptáculos, em que um recipiente pode compreender uma ou mais doses do ADC da invenção. Em certas modalidades, o pacote ou kit contém uma dosagem unitária, o que significa uma quantidade predeterminada de uma composição que compreende, por exemplo, o ADC da invenção, com ou sem um ou mais agentes adicionais e, opcionalmente, um ou mais agentes anticâncer.
[092] Quando os componentes do kit são fornecidos em uma ou mais soluções líquidas, aquosas ou não aquosas, embora tipicamente uma solução aquosa seja preferencial, com uma solução aquosa estéril sendo particularmente preferencial. A formulação no kit também pode ser fornecida como pó seco (ou pós secos) ou na forma liofilizada que pode ser reconstituída após a adição de um líquido apropriado. O líquido usado para reconstituição pode ser acondicionado em um recipiente separado. Tais líquidos podem compreender tampão estéril farmaceuticamente aceitável (ou tampões estéreis farmaceuticamente aceitáveis) ou outro diluente (ou outros diluentes), tais como água bacteriostática para injeção. Quando o kit compreende o ADC da invenção em combinação com agentes terapêuticos ou agentes adicionais, a solução pode ser pré-misturada, em uma combinação de equivalente molar ou com um componente em excesso do outro. Alternativamente, o ADC da invenção e qualquer agente anticâncer opcional ou outro agente podem ser mantidos separadamente em recipientes distintos antes da administração a um paciente.
[093] Em certas modalidades preferenciais, os kits acima mencionados, incorporando composições da invenção, compreenderão um rótulo, marcador, bula, código de barras e/ou leitor indicando que o conteúdo do kit pode ser usado para o tratamento de câncer. Em outras modalidades preferenciais, o kit pode compreender um rótulo, marcador, bula, código de barras e/ou leitor indicando que o conteúdo do kit pode ser administrado de acordo com uma certa dosagem ou regime de dosagem para tratar um sujeito que sofre de câncer. Em outros aspectos particularmente preferenciais, o rótulo, marcador, bula, código de barras e/ou leitor indica que o conteúdo do kit pode ser usado para o tratamento de câncer de pulmão de células pequenas ou um regime de dosagem para o tratamento do mesmo.
[094] Recipientes ou receptáculos adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, sacos de infusão (sacos iv), etc. Os recipientes podem ser formados de uma variedade de materiais, tais como vidro ou plásticos farmaceuticamente compatíveis. Em certas modalidades, o receptáculo pode (ou os receptáculos podem) compreender uma porta de acesso estéril. Por exemplo, o recipiente pode ser um saco de solução intravenosa ou um frasco com uma rolha que pode ser perfurada por uma agulha de injeção hipodérmica.
[095] Em algumas modalidades, o kit pode conter um meio pelo qual administrar o ADC e quaisquer componentes opcionais a um paciente, por exemplo, uma ou mais agulhas ou seringas (pré-preenchidas ou vazias), ou outro aparelho semelhante, a partir do qual a formulação pode ser injetada ou introduzida no sujeito ou aplicada a uma área doente do corpo. Os kits da invenção também incluirão tipicamente um meio para acondicionar os frascos, ou semelhantes, e outros componentes em confinamento fechado para venda comercial, tais como, por exemplo, recipientes de plástico moldado por sopro nos quais os frascos desejados e outros aparelhos são colocados e retidos.
DIVERSOS
[096] A menos que definido de outra forma neste documento, os termos científicos e técnicos usados em conexão com a invenção devem ter os significados que são comumente entendidos por aqueles versados na técnica. Além disso, a menos que exigido de outra forma pelo contexto, os termos singulares devem incluir pluralidades e os termos plurais devem incluir o singular. Além disso, as faixas fornecidas no relatório descritivo e nas reivindicações anexas incluem ambos os pontos finais e todos os pontos entre os pontos finais. Portanto, uma faixa de 2,0 a 3,0 inclui 2,0, 3,0 e todos os pontos entre 2,0 e 3,0.
[097] Geralmente, as técnicas de cultura de células e tecidos, biologia molecular, imunologia, microbiologia, genética e química descritas neste documento são aquelas bem conhecidas e comumente utilizadas na técnica. A nomenclatura usada neste documento, em associação com tais técnicas, também é comumente usada na técnica. Os métodos e técnicas da invenção são geralmente realizados de acordo com métodos convencionais bem conhecidos na técnica e conforme descrito em várias referências que são citadas ao longo do presente relatório descritivo, a menos que indicado de outra forma.
REFERÊNCIAS
[098] A divulgação completa de todas as patentes, pedidos de patentes e publicações e material disponível eletronicamente (incluindo, por exemplo, registros de sequência de nucleotídeos em, por exemplo, GenBank e RefSeq, e registros de sequência de aminoácidos em, por exemplo, SwissProt, PIR, PRF, PDB, e traduções de regiões de codificação anotadas no GenBank e RefSeq) citados neste documento são incorporados a título de referência, independentemente de a frase "incorporado a título de referência" ser ou não usada em relação à referência particular. A descrição detalhada anterior e os exemplos a seguir foram dados apenas para fins de clareza de compreensão. Nenhuma limitação desnecessária deve ser entendida a partir dos mesmos. A invenção não se limita aos detalhes exatos mostrados e descritos. Variações óbvias a um versado na técnica estão incluídas na invenção definida pelas reivindicações. Quaisquer títulos de seção usados neste documento são apenas para fins organizacionais e não devem ser interpretados como limitando a matéria descrita.
8. EXEMPLOS
[099] A invenção, descrita de modo geral acima, será compreendida mais facilmente por referência aos exemplos a seguir, que são fornecidos a título de ilustração e não se destinam a ser limitantes da presente invenção. Os exemplos não pretendem representar que os experimentos abaixo são todos ou os únicos experimentos realizados. A menos que indicado de outra forma, as partes são partes em peso, o peso molecular é o peso molecular ponderal médio, a temperatura está em graus centígrados e a pressão é atmosférica ou próxima da atmosférica.
SUMÁRIO DE LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[0100] A TABELA 2 fornece um sumário das sequências de aminoácidos e de ácidos nucleicos incluídas neste documento. TABELA 2
SEQ Descrição
ID NO Precursor de isoforma 1 homóloga da proteína 6 de 1 apreensão (NP_849191) Precursor de isoforma 2 homóloga da proteína 6 de 2 apreensão (NP_001092105) sequência de proteínas de cadeia pesada de hSEZ6- 3
1.ss1 4 sequência de proteínas de cadeia leve de hSEZ6-1.ss1 Sequência de ácidos nucleicos que codifica sequência 5 de proteínas de cadeia pesada de hSEZ6-1.ss1 que inclui íntrons Sequência de ácidos nucleicos que codifica sequência 6 de proteínas de cadeia leve de hSEZ6-1.ss1 EXEMPLO 1: GERAÇÃO DE UM ANTICORPO SEZ6
[0101] Os anticorpos SEZ6 murinos foram produzidos de acordo com os ensinamentos deste documento através da inoculação com SEZ6-Fc humano. A este respeito, três cepas de camundongos foram usadas para gerar moduladores de anticorpos monoclonais murinos de alta afinidade que podem ser usados para se associar e/ou inibir a ação de SEZ6 humano (por exemplo, NP_849191: Precursor de isoforma 1 homóloga da proteína 6 de apreensão; NP_001092105: Precursor de isoforma 2 homóloga da proteína 6 de apreensão) para a prevenção e/ou tratamento de vários distúrbios proliferativos. Especificamente, as cepas de camundongos Balb/c, CD-1 e FVB foram imunizadas com SEZ6-Fc recombinante humano e usadas para produzir Hibridomas.
[0102] O antígeno SEZ6-Fc foi purificado a partir do sobrenadante de células CHO-S sobrexpressando um construto SEZ6-Fc. 10 μg de imunogênio SEZ6-Fc foram usados para a primeira imunização, seguido por 5 μg e 2,5 μg de imunogênio SEZ6- Fc para as três imunizações e cinco imunizações subsequentes, respectivamente. Todas as imunizações foram realizadas com o imunogênio emulsionado com um volume igual de TITERMAX® Gold (CytRx Corporation) ou adjuvante de alúmen. Os anticorpos murinos foram gerados imunizando seis camundongos fêmeas (dois de cada um de: Balb/c, CD-1, FVB) através da rota da almofada da pata para todas as injeções.
[0103] Os ensaios de ELISA em fase sólida foram usados para triagem de soros de camundongo para anticorpos IgG de camundongo específicos para SEZ6 humano. Um sinal positivo acima do fundo foi indicativo de anticorpos específicos para
SEZ6. Resumidamente, placas de 96 poços (VWR International, Cat. # 610744) foram revestidas com SEZ6-His recombinante a 0,5 µg/ml em tampão de revestimento ELISA durante a noite. Após a lavagem com PBS contendo 0,02% (v/v) de Tween 20, os poços foram bloqueados com 3% (p/v) de BSA em PBS, 200 μl/poço por 1 hora à temperatura ambiente (RT). O soro de camundongo foi titulado (1:100, 1:200, 1:400 e 1:800) e adicionado às placas revestidas com SEZ6 a 50 μl/poço e incubado à RT por 1 hora. As placas são lavadas e então incubadas com 50 μl/poço de IgG de cabra anti- camundongo marcado com HRP diluído em 1:10.000 em 3% de BSA-PBS ou 2% de FCS em PBS por 1 hora à RT. Novamente as placas foram lavadas e 40 μl/poço de uma solução de substrato TMB (Thermo Scientific 34028) foram adicionados por 15 minutos à RT. Após o desenvolvimento, um volume igual de 2N de H2SO4 foi adicionado para interromper o desenvolvimento do substrato e as placas foram analisadas por espectrofotômetro em OD 450.
[0104] Os camundongos imunizados soropositivos foram sacrificados e os linfonodos de drenagem (poplíteos e inguinais e ilíacos mediais se aumentados) foram dissecados e usados como fonte para células produtoras de anticorpos. Uma única suspensão de células B (228,9x106 células) foi fundida com células de mieloma P3x63Ag8.653 não secretoras (ATCC #CRL-1580) a uma razão de 1:1 por eletrofusão. A eletrofusão foi realizada com uso do BTX Hybrimmune™ System, (BTX Harvard Apparatus) de acordo com as instruções do fabricante. Após o procedimento de fusão, as células foram ressuspensas em meio de seleção de hibridoma suplementado com Azaserine (Sigma #A9666), meio DMEM de alta glicose com piruvato de sódio (Cellgro cat#15-017-CM) que contém 15% de soro Fetal Clone I (Hyclone), 10% de BM Condimed (Roche Applied Sciences), 4 mM de L-glutamina, 100 UI de Penicilina-Estreptomicina e 50 μM de 2-mercaptoetanol e então chapeado em três frascos T225 em 90 ml de meio de seleção por frasco. Os frascos foram então colocados em uma incubadora umidificada a 37 °C que contém 5% de CO2 e 95% de ar por 6 a 7 dias.
[0105] Após seis a sete dias de crescimento, a biblioteca que consiste nas células cultivadas a granel no T225s foi chapeada a 1 célula por poço em placas de fundo U de 96 poços Falcon com uso do classificador de células Aria I. Os hibridomas selecionados foram então cultivados em 200 µl de meio de cultura que contém 15% de soro Fetal Clone I (Hyclone), 10% de BM-Condimed (Roche Applied Sciences), 1mM de piruvato de sódio, 4 mM de L-glutamina, 100 UI de Penicilina-Estreptomicina, 50 μM de 2-mercaptoetanol e 100 μM de hipoxantina. Quaisquer células restantes da biblioteca de hibridoma não utilizadas foram congeladas para futuros testes de biblioteca. Após dez a onze dias de crescimento, os sobrenadantes de cada poço das células chapeadas foram testados quanto a anticorpos reativos para SEZ6 por ensaios ELISA e FACS.
[0106] Para a triagem por ELISA, placas de 96 poços foram revestidas com SEZ6-Fc a 0,3 μg/ml em PBS durante a noite a 4 °C. As placas foram lavadas e bloqueadas com 3% de BSA em PBS/Tween durante uma hora a 37 °C e usadas imediatamente ou mantidas a 4 °C. Os sobrenadantes de hibridoma não diluídos foram incubados nas placas durante uma hora à RT. As placas foram lavadas e sondadas com IgG de cabra anti-camundongo marcado com HRP diluído em 1:10.000 em 3% de BSA-PBS durante uma hora à RT. As placas foram então incubadas com solução de substrato conforme descrito acima e lidas em OD 450. Os poços contendo imunoglobulina que se aglutina preferencialmente a SEZ6 humana, conforme determinado por um sinal acima do fundo, foram transferidos e expandidos.
[0107] Os poços de hibridoma positivos de crescimento selecionados que secretam imunoglobulina murina também foram triados quanto à especificidade de SEZ6 humana e reatividade cruzada de SEZ6 de cinomolgos, rato e murino com uso de um ensaio baseado em citometria de fluxo com 293 células geneticamente modificadas para sobrexpressar o antígeno específico de espécie selecionada.
[0108] Para os ensaios de citometria de fluxo, 50x104 células h293 transduzidas respectivamente com SEZ6 humano, de cinomolgos, rato ou murino foram incubadas durante 30 minutos com 25 a 100 µl de sobrenadante de hibridoma. As células foram lavadas com PBS, 2% de FCS, duas vezes e depois incubadas com 50 µl de um fragmento Fc de IgG de cabra anti-camundongo específico secundário conjugado com DyLight 649 diluído em 1:200 em PBS/2% FCS. Após 15 minutos de incubação, as células foram lavadas duas vezes com PBS, 2% de FCS, e ressuspensas no mesmo tampão com DAPI e analisadas por citometria de fluxo com uso de um FACSCanto II de acordo com as instruções do fabricante. Os poços que contêm imunoglobulina que se aglutinam preferencialmente às células SEZ6+ GFP+ foram transferidos e expandidos. Os hibridomas clonais específicos de hSEZ6 resultantes foram criopreservados em meio de congelamento CS-10 (Biolife Solutions) e armazenados em nitrogênio líquido. Os anticorpos que se aglutinam a células SEZ6 humanas, de cinomolgos, rato ou murinas foram observados como reativos cruzados.
[0109] A análise ELISA e de citometria de fluxo confirmou que o anticorpo purificado da maioria ou de todos esses hibridomas se aglutinaram a SEZ6 de uma maneira dependente da concentração. Os poços contendo imunoglobulina que se aglutinam às células SEZ6 GFP foram transferidos e expandidos. Os hibridomas clonais resultantes foram criopreservados em meio de congelamento CS-10 (Biolife Solutions) e armazenados em nitrogênio líquido.
[0110] Uma fusão foi realizada e semeada em 48 placas (4.608 poços com aproximadamente 40% de eficiência de clonagem). A triagem inicial rendeu sessenta e três anticorpos murinos que se associaram com SEZ6 humano. Uma segunda triagem foi subsequentemente realizada e rendeu 134 anticorpos que se associaram com SEZ6 humano. EXEMPLO 2: FABRICAÇÃO DE UM ANTICORPO SEZ6 HUMANIZADO SÍTIO-ESPECÍFICO
[0111] Um anticorpo do Exemplo 1 foi escolhido para posterior processamento e humanização. O RNA do hibridoma que expressa o anticorpo selecionado foi isolado, amplificado e sequenciado com uso de técnicas padrão reconhecidas na técnica. A partir das informações de sequência de nucleotídeos, foram obtidos os dados relativos aos segmentos gênicos V, D e J das cadeias pesada e leve dos anticorpos murinos em questão. As sequências V-(D)-J foram alinhadas com as sequências da linha germinal de Ig de camundongo e as regiões estruturais variáveis humanas aceitadoras foram selecionadas com base em sua maior homologia de sequência para a sequência estrutural de camundongo em questão e sua estrutura canônica para enxerto de CDR. O arranjo genético resultante para as regiões variáveis humanizadas do anticorpo é mostrado na Tabela 3A imediatamente abaixo. TABELA 3A
[0112] As regiões variáveis modificadas geneticamente foram então usadas para gerar um anticorpo sítio-específico IgG1/kappa anti-SEZ6 humano que compreende uma região constante de cadeia leve (LC) kappa nativa e uma região constante de cadeia pesada (HC) mutada para fornecer uma cisteína desemparelhada. A este respeito, a cisteína 220 (C220) na região de dobradiça superior da HC foi substituída por serina (C220S) para fornecer o anticorpo hSEZ6-
1.ss1. Quando montados, a HC e a LC formam um anticorpo que compreende duas cisteínas livres nas extremidades c-terminais das regiões constantes de cadeia leve (por exemplo, C214) que são adequadas para a conjugação com um agente terapêutico. A menos que indicado de outra forma, toda a numeração dos resíduos da região constante está de acordo com o esquema de numeração Eu, conforme estabelecido em Kabat et al.
[0113] Para gerar os construtos sítio-específicos, um ácido nucleico VH foi clonado em um vetor de expressão que contém uma região constante de HC de
C220S mutado. Os vetores resultantes que codificam a HC de C220S mutante foram cotransfectados em células CHO-S com um vetor que codifica a região variável de cadeia leve selecionada operacionalmente associada com uma LC de IgG1 kappa de tipo selvagem e expressa com uso de um sistema de expressão transiente de mamífero.
[0114] Além da mutação C220S para fornecer as cisteínas livres na região constante, duas modificações adicionais foram feitas na cadeia pesada. Primeiro, a lisina C-terminal foi deletada para reduzir a heterogeneidade na expressão. Em segundo lugar, uma mutação conservadora foi feita na região variável de cadeia pesada para melhorar a estabilidade molecular e facilitar a produção de anticorpos. Mais especificamente, uma mutação conservadora foi incorporada ao CDR2 de cadeia pesada (conforme definido por Kabat) para eliminar um sítio de glicosilação canônico. A glicosilação neste sítio pode potencialmente transmitir heterogeneidade na proteína expressa, o que pode resultar em uma redução na afinidade de aglutinação. Consequentemente, uma substituição de serina por asparagina na posição Kabat 60 (S60N) foi incorporada à cadeia pesada para eliminar o sítio de glicosilação. O anticorpo humanizado resultante com essas mutações foi denominado hSEZ6-1.ss1. Conforme discutido em mais detalhes abaixo, a equivalência substancial de hSEZ6-
1.ss1 com o anticorpo humanizado parental e anticorpo de origem murina foi confirmada quanto à afinidade.
[0115] O arranjo genético resultante para as regiões variáveis humanizadas do anticorpo mutado é mostrado na Tabela 3B imediatamente abaixo. TABELA 3B
[0116] A sequência de aminoácidos de cadeia pesada do anticorpo sítio- específico hSEZ6-1.ss1 de comprimento total é SEQ ID NO: 3, tendo o sítio de mutação de região variável S60N e o sítio de mutação de região constante C220S. A sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada é mostrada abaixo como SEQ ID NO: 7, tendo a mutação S60N sublinhada.
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSSWINWVRQMPGKGLEWMG RIYPGEGDTNYNGNFEGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCTRGLVMDYW
GQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 7) A sequência de aminoácidos da cadeia leve do anticorpo sítio-específico hSEZ6-1.ss1 de comprimento total é SEQ ID NO: 4, tendo o resíduo de conjugação de toxina em C214. A sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve é mostrada abaixo como SEQ ID NO: 8
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVDYNGISYMHWYQQKPGQAPRLL IYAASNVQSGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSIEDPPTFGGGTKV
EIK (SEQ ID NO: 8) EXEMPLO 3: PREPARAÇÃO DE LIGANTE DE FÁRMACO DE HSEZ6-1.SS1
[0117] Um composto de ligante de fármaco de acordo com a Fórmula II
O H O O N N O O O O O
OO OCH3
O HO NH O O H H O N S N S H H O O O O O O N O H
I OH HO S O OCH3
O
OH H3CO O OCH3 N OH OCH3 O Fórmula II foi sintetizado conforme estabelecido imediatamente abaixo.
ETAPA 1. [34-(2,5-DIOXO-2,5-DI-HIDRO-1H-PIRROL-1-IL)-4,32-DIOXO- 7,10,13,16,19,22,25,28-OCTAOXA-3,31-DIAZATETRATRIACONTAN-1- IL]CARBAMATO DE TERC-BUTILA 3-(2,5-Dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-N-{27-[(2,5-dioxopirrolidin-1-il)oxi]-27- oxo-3,6,9,12,15,18,21,24-octaoxaheptacosan-1-il}propanamida (434 mg) foi dissolvida em N,N-dimetilformamida (5 ml) e tratada com (2-aminoetil)carbamato de terc-butila (108,1 mg). Após 6 horas, a mistura reacional foi concentrada, e o resíduo purificado através de cromatografia em sílica-gel eluída com 0% de CH3OH/CH2Cl2 a 10% de CH3OH/CH2Cl2 para resultar no composto titulado (154,2 mg). LC/MS (método analítico A): Rt = 1,65 min, m/z 735,46 [M+H]+.
ETAPA 2. N-(2-AMINOETIL)-31-(2,5-DIOXO-2,5-DI-HIDRO-1H-PIRROL-1- IL)-29-OXO-4,7,10,13,16,19,22,25-OCTAOXA-28-AZA-HENTRIACONTAN-1-AMIDA
[0118] A amina protegida com terc-butoxicarbonila (Etapa 1, 154,2 mg) foi dissolvida em N,N-dimetilformamida (5 ml), foi adicionado ácido trifluoroacético (500 µl) ao longo de 30 segundos e a mistura resultante foi agitada durante 30 minutos. Após a conclusão da reação, a mistura de reação foi concentrada e usada sem purificação adicional. LC/MS (método analítico A): Rt = 1,29 min, m/z 635,39 [M+H]+.
OO OCH3
HO NH H S S S H O O O OH O O HS O N O H
I OH HO S O OCH3 O NEt3, CH3CN
OH H3CO O OCH3 N OH OCH3 O
OO OCH3
HO NH
H HO2C S
S H O O O O O N O H
I OH HO S O OCH3
O
OH H3CO O OCH3 N OH OCH3 O ETAPA 3. ÁCIDO 4-{[(2E)-2-{(1R,4Z,8S)-8-({(2R,3R,4S,5S,6R)-3- ({(2S,4S,5S)-5-[ACETIL(ETIL)AMINO]-4-METOXIOXAN-2-IL}OXI)-5- [({(2S,4S,5S,6R)-5-[(4-{[(2S,3R,4R,5S,6S)-3,5-DI-HIDROXI-4-METOXI-6- METILOXAN-2-IL]OXI}-3-IODO-5,6-DIMETOXI-2-METILBENZOIL)SULFANIL]-4- HIDROXI-6-METILOXAN-2-IL}OXI)AMINO]-4-HIDROXI-6-METILOXAN-2-IL}OXI)-1- HIDROXI-10-[(METOXICARBONIL)AMINO]-11-OXOBICICLO[7.3.1]TRIDECA-4,9- DIENO-2,6-DI-IN-13-ILIDENO}ETIL]DISSULFANIL}-4-METILPENTANÓICO N-acetil caliqueamicina γ 1 (0,2 g, 0,142 mmol, 1 eq) foi dissolvida em acetonitrila (30 ml), e a solução resultante foi resfriada a -15 °C. Ácido 4-mercapto-4-
metilpentanóico (0,420 ml, 2,837 mmol, 20 eq) foi dissolvido em acetonitrila (10 ml) e adicionado lentamente à solução resfriada de N-acetil caliqueamicina γ 1. Trietilamina (0,377 ml, 2,837 mmol, 20 eq) foi adicionada à mistura de reação e, em seguida, a mistura de reação foi deixada aquecer até a temperatura ambiente ao longo de 3 a 18 horas. Após a conclusão da reação, a mistura foi concentrada, e o resíduo foi carregado a seco em sílica gel para purificação por cromatografia flash eluída com 2 a 20% de metanol/diclorometano para resultar no composto titulado. O composto titulado foi precipitado a partir de éter dietílico frio. LC/MS (método analítico A): Rt = 1,92 min, m/z 1.478,64 [M+H]+.
ETAPA 4. S-[(2R,3S,4S,6S)-6-({[(2R,3S,4S,5R,6R)-5-({(2S,4S,5S)-5- [ACETIL(ETIL)AMINO]-4-METOXIOXAN-2-IL}OXI)-6-{[(2S,5Z,9R,13E)-13-[43-(2,5- DIOXO-2,5-DI-HIDRO-1H-PIRROL-1-IL)-5,5-DIMETIL-8,13,41-TRIOXO- 16,19,22,25,28,31,34,37-OCTAOXA-3,4-DITIA-9,12,40-TRIAZATRITETRACONTAN- 1-ILIDENO]-9-HIDROXI-12-[(METOXICARBONIL)AMINO]-11- OXOBICICLO[7.3.1]TRIDECA-1(12),5-DIENO-3,7-DI-IN-2-IL]OXI}-4-HIDROXI-2-
METILOXAN-3-IL]AMINO}OXI)-4-HIDROXI-2-METILOXAN-3-IL]4- {[(2S,3R,4R,5S,6S)-3,5-DI-HIDROXI-4-METOXI-6-METILOXAN-2-IL]OXI}-3-IODO- 5,6-DIMETOXI-2-METILBENZENO-1-CARBOTIOATO
[0119] Ácido N-acetil caliqueamicina (Etapa 3, 100 mg, 0,068 mmol, 1 eq) foi dissolvido em N,N-dimetilformamida (3,4 ml) e resfriado a 0 °C. N,N-Di- isopropiletilamina (176 µl, 1,01 mmol, 15 eq) e (1-ciano-2-etoxi-2- oxoetilidenaminooxi)dimetilamino-morfolino-carbênio hexafluorofosfato (COMU, 43 mg, 0,1 mmol, 1,5 eq) foram então sequencialmente adicionados. Após 2 minutos, a N-(2-aminoetil)-31-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-29-oxo- 4,7,10,13,16,19,22,25-octaoxa-28-aza-hentriacontan-1-amida (Etapa 2, 51,4 mg, 0,08 mmol, 1,2 eq) foi adicionada em N,N- dimetilformamida (200 µl). Após 1 hora, a mistura de reação foi concentrada e o resíduo foi purificado por HPLC preparativa (método pA) para resultar no composto titulado (16,8 mg, rendimento de 12%). LC/MS (método analítico B ou C): Rt = 8,18 min. HRMS calculado [M+H]+ = 2.094,7049, Observado [M+H]+ = 2.094,6902. RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ 9,03 (s, 1H), 8,01 (t, J = 5,5 Hz, 1H), 7,86 (s, 2H), 7,01 (s, 3H), 6,80 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 6,30 – 6,18 (m, 1H), 6,13 (dd, J = 9,5, 7,1 Hz, 1H), 6,09 – 5,99 (m, 2H), 5,56 (d, J = 4,0 Hz, 1H), 5,45 (s, 1H), 5,43 – 5,37 (m, 2H), 5,12 (dd, J = 13,4, 5,1 Hz, 2H), 4,94 (d, J = 9,9 Hz, 1H), 4,63 – 4,47 (m, 2H), 4,27–4,13 (m, 2H), 4,11 (s, 1H), 4,08 – 3,97 (m, 1H), 3,91 (dd, J = 10,8, 6,1 Hz, 1H), 3,81 (s, 3H), 3,78 – 3,81 (m, 1H), 3,77 (s, 3H), 3,73 – 3,63 (m, 1H), 3,63 – 3,55 (m, 7H), 3,55 – 3,46 (m, 30H), 3,41 (s, 3H), 3,25 (d, J = 2,3 Hz, 3H), 3,15 (q, J = 5,8 Hz, 2H), 3,07 (s, 5H), 2,93 (d, J = 17,7 Hz, 1H), 2,47 – 2,38 (m, 1H), 2,36 – 2,26 (m, 7H), 2,15 – 2,06 (m, 2H), 2,01 (d, J = 2,7 Hz, 3H), 1,87 (d, J = 12,3 Hz, 1H), 1,80 – 1,62 (m, 3H), 1,26 (dd, J = 6,1, 3,3 Hz, 4H), 1,24 – 1,19 (m, 2H), 1,19 – 1,12 (m, 7H), 1,09 (t, J = 7,1 Hz, 2H), 0,95 (t, J = 6,9 Hz, 1H). Informações gerais sobre métodos analíticos e preparativos de HPLC. MÉTODO ANALÍTICO A:
MS: Waters® Acuity® Ultra SQ Detector ESI, Faixa de varredura de 120 a
2.040 Da. Coluna: Waters Acuity UPLC® BEH C18, 1,7 µm, 2,1 x 50 mm Temperatura da coluna: 50 oC Taxa de fluxo: 0,6 ml/min Fase móvel A: 0,1% de ácido fórmico em água. Fase móvel B: 0,1% de ácido fórmico em acetonitrila. Gradiente: Tempo, minutos % de A % de B 0 95 5 0,25 95 5 2 0 100 2,5 0 100 3 95 5 4 95 5 MÉTODO ANALÍTICO B: MS: Waters® Acuity® Ultra SQ Detector ESI, Faixa de varredura de 120 a
2.040 Da, Coluna: Waters Acuity UPLC® BEH C18, 1,7 µm, 2,1 x 50 mm Temperatura da coluna: 60 oC Taxa de fluxo: 0,4 ml/min Fase móvel A: 0,1% de ácido fórmico em água. Fase móvel B: 0,1% de ácido fórmico em acetonitrila. Gradiente: Tempo, minutos % de A % de B 0 95 5
Tempo, minutos % de A % de B
2 95 5
3 80 20
13 20 80
14 20 80
14,10 5 95
15 5 95
15,10 95 5
20 95 5
MÉTODO ANALÍTICO C: HRMS: AB Sciex 5600 Plus Triple Time-of-Flight (TOF®), faixa de varredura de 250 a 2.500 Da Coluna: Waters Acuity UPLC® BEH C18, 1,7 µm, 2,1 x 50 mm Temperatura da coluna: 60 oC Taxa de fluxo: 0,4 ml/min Fase móvel A: 0,1% de ácido fórmico em água.
Fase móvel B: 0,1% de ácido fórmico em acetonitrila.
Gradiente:
Tempo, minutos % de A % de B
0 95 5
2 95 5
3 80 20
13 20 80
14 20 80
14,10 5 95
15 5 95
Tempo, minutos % de A % de B 15,10 95 5 20 95 5
MÉTODO ANALÍTICO D Coluna: EMD Millipore Chromolith® Flash RP-18 endcapped de 25-2 mm. Temperatura da coluna: 40 °C Comprimento de onda: 220 nm Taxa de fluxo: 1,5 ml/minuto Fase móvel A: H2O (4 l com 1,5 ml de ácido trifluoroacético) Fase móvel B: acetonitrila (4 l com 0,75 ml de ácido trifluoroacético) Gradiente: Tempo, minutos % de A % de B 0 95 5 0,01 95 5 0,70 5 95 1,15 5 95 1,16 95 5 1,60 95 5
MÉTODO ANALÍTICO E Coluna: Halo C18 2,1 × 30 mm, 2,7 µm Detecção: matriz de diodos e ionização por eletropulverização positiva/negativa Taxa de fluxo: 1,0 ml/minuto Fase móvel A: 0,0375% de ácido trifluoroacético em água Fase móvel B: 0,018% de ácido trifluoroacético em acetonitrila
Gradiente: Tempo, minutos % de A % de B 0 90 10 2,00 20 80 2,48 20 80 2,50 90 10 3,00 90 10
MÉTODO ANALÍTICO F Coluna: Venusil XBP-C18, 2,1 x 50 mm, 5 µm Detecção: matriz de diodos e ionização por eletropulverização positiva/negativa Taxa de fluxo: 0,8 ml/minuto Fase móvel A: 0,0375% de ácido trifluoroacético em água Fase móvel B: 0,018% de ácido trifluoroacético em acetonitrila Gradiente: Tempo, minutos % de A % de B 0 99 1 3,40 10 90 3,85 0 100 3,86 99 1 4,51 99 1 MÉTODO pA DE HPLC PREPARATIVA: Coluna: Waters XBridge™ prep C18 5 µm OBD, 19 x 100 mm Temperatura da coluna: ambiente Taxa de fluxo: 15 ml/min
Fase móvel A: 0,1% de ácido fórmico em água.
Fase móvel B: 0,1% de ácido fórmico em acetonitrila.
Gradiente:
Tempo, min % de A % de B
0 95 5
5 95 5
8 80 20
50 20 80
52,59 20 80
52,92 5 95
55,87 5 95
56,20 95 5
60 95 5
MÉTODO pB DE HPLC PREPARATIVA: Coluna: Phenomenex Luna® C18(2), 250 × 50 mm id, 10 µm Comprimentos de onda: 220 e 254 nm Taxa de fluxo: 80 ml/minuto Fase móvel A: 0,01 M de NH4HCO3 em H2O.
Fase móvel B: acetonitrila Gradiente: 30 a 50% de fase móvel B ao longo de 20 minutos
MÉTODO pC DE HPLC PREPARATIVA
Coluna: Phenomenex Luna® C18(2), 250 × 50 mm id, 10 µm Comprimentos de onda: 220 e 254 nm Taxa de fluxo: 80 ml/minuto Fase móvel A: 0,075% v/v de ácido trifluoroacético em água Fase móvel B: acetonitrila
Gradiente: 10 a 40% de fase móvel B ao longo de 20 minutos MÉTODO pD DE HLC PREPARATIVA Coluna: Phenomenex Luna® C18(2), 250 × 50 mm id, 10 µm Comprimentos de onda: 220 e 254 nm Taxa de fluxo: 80 ml/minuto Fase móvel A: 0,09% v/v de ácido trifluoroacético em água Fase móvel B: acetonitrila Gradiente: 15 a 43% de fase móvel B ao longo de 20 minutos EXEMPLO 4: PREPARAÇÃO DE CONJUGADOS ANTICORPO FÁRMACO HSEZ6-1.SS1
[0120] Os ADCs anti-hSEZ6-1.SS1 foram preparados de acordo com os ensinamentos deste documento para testes in vitro e in vivo adicionais.
[0121] A este respeito, hSEZ6-1.SS1 do Exemplo 2 foi conjugado com um ligante de fármaco caliqueamicina não clivável (Fórmula II preparada como no Exemplo 3) por meio de uma porção química de maleimido terminal com um grupo sulfidrila livre para criar o ADC SEZ6 divulgado que é denominado hSEZ6-1.ss1 ADC1 neste documento. Além disso, três ADCs SEZ6 de controle foram fabricados pela conjugação de hSEZ6-1.ss1 com as mesmas cargas úteis de caliqueamicina, mas compreendendo ligantes cliváveis (ADC2, ADC3 e ADC4). Finalmente, os ADCs de controle foram produzidos compreendendo hSEZ6-1.ss1 sem a mutação S60N.
[0122] O ADC SEZ6 (hSEZ6-1.ss1) humanizado sítio-específico foi conjugado com uso de um processo de redução parcial modificado. O produto desejado é um ADC que é conjugado ao máximo na cisteína desemparelhada (C214) em cada região constante de LC e que minimiza ADCs com um carregamento de fármaco que é maior do que 2, enquanto maximiza ADCs com um carregamento de fármaco de 2. A fim de melhorar ainda mais a especificidade da conjugação, os anticorpos foram seletivamente reduzidos com uso de um processo que compreende um agente estabilizador (por exemplo, L-arginina) e um agente redutor suave (por exemplo, glutationa) antes da conjugação com o fármaco ligante, seguida por uma etapa de diafiltração e formulação.
[0123] Mais especificamente, uma preparação de cada anticorpo foi parcialmente reduzida em um tampão contendo 1M de L-arginina/5mM de EDTA com uma concentração predeterminada de glutationa reduzida (GSH), pH 8,0 por um mínimo de 20 horas à temperatura ambiente. Todas as preparações tiveram então tampão trocado por um tampão Tris 20 mM/EDTA 3,2 mM, pH 7,0 com uso de uma membrana de 30 kDa (Millipore Amicon Ultra) para remover o tampão de redução. As preparações parcialmente reduzidas resultantes foram então conjugadas com o respectivo ligante de fármaco caliqueamicina através de um grupo maleimida por um mínimo de 60 minutos à temperatura ambiente. O pH foi então ajustado para 6,0 com a adição de 0,5 M de ácido acético. As preparações dos ADCs tiveram tampão trocado por tampão de diafiltração por diafiltração com uso de uma membrana de 30 kDa. O ADC SEZ6 diafiltrado foi então formulado com sacarose e polissorbato-20 para a concentração final alvo.
[0124] A formulação resultante foi então analisada quanto à concentração de proteína (medindo UV), agregação (SEC), razão fármaco-anticorpo (DAR) por HPLC de fase reversa (RP-HPLC) e atividade (citotoxicidade in vitro). Em seguida, foi congelada e armazenada até o uso.
[0125] Uma representação esquemática de hSEZ6-1.ss1 ADC1 é apresentada na Figura 1 em anexo.
[0126] EXEMPLO 5: CARACTERÍSTICAS IN VITRO DO ANTICORPO HSEZ6-1.SS1
[0127] Os experimentos foram realizados para testar se a mutação S60N afetou a interação entre o mAb hSEZ6-1.ss1 e o antígeno SEZ6. A este respeito, a aglutinação do antígeno SEZ6-his solúvel com anticorpos SEZ6 imobilizados na superfície e ADCs SEZ6, com e sem a mutação S60N, foram medidas em um Biacore T200 (chip de captura anti-humano).
[0128] Mais especificamente, 5 µg/ml de IgG fluíram por 12 segundos a 5 µl/min, rendendo 115 a 124 UR de resposta de imobilização. 22, 66 e 200 nM de hSEZ6-his foram injetados por 90 segundos a 30 µl/min, seguido por 300 segundos de dissociação. As superfícies foram regeneradas por fluxo de 2M de cloreto de magnésio (30 µl/min, 30 segundos) no final de cada ciclo. Os sensorgramas foram duplamente referidos (injeção de tampão e célula de fluxo de controle) e são estabelecidos na Figura 2, em que o anticorpo com a mutação é rotulado como hSEZ6-1.ss1 e o anticorpo de origem, sem a mutação, é rotulado como hSEZ6-1.ss1 parental.
[0129] Além disso, as medições de afinidade foram feitas com uso de um Biacore T200 para determinar as características de aglutinação de hSEZ6-1.ss1 compreendendo S60N. A este respeito, os construtos Fab do anticorpo hSEZ6-1.ss1, com e sem a mutação S60N, foram fabricados e purificados. A aglutinação dos construtos Fab com o ligante SEZ6-His humano imobilizado na superfície solúvel foi então comparada em um Biacore T200 (chip de captura anti-His). Mais especificamente, 2 µg/ml de SEZ6-His humano fluíram através do chip por 12 segundos a 5 µl/min, rendendo uma resposta de imobilização de 45 a 66 UR. As injeções de Fab de 22, 66 e 200 nM ocorreram por 90 segundos a 30 µl/min, seguidas por uma segunda dissociação de 400 a 450. As superfícies foram regeneradas por fluxo de 10 mM de glicina, pH 1,5 por 60 segundos a 30 ul/min. Os sensorgramas foram duplamente referidos (injeção de tampão e célula de fluxo de controle). Os resultados são mostrados na Tabela 4 imediatamente abaixo.
TABELA 4 hSEZ Rma ka kd 6-His Analito x (1/Ms) (1/s) KD (UR) (nM) Fab de Tipo 1,1E+ 0,00 5,8 35,2 Selvage 06 6 m Fab 1,3E+ 0,00 MutA 4,8 4,0 06 6 (S60N)
[0130] Uma análise da Figura 2 mostra que a mutação S60N e remoção do sítio de glicosilação na região variável de cadeia pesada não alteram materialmente as propriedades de aglutinação dos anticorpos hSEZ6-1.ss1 quando comparados com o anticorpo parental sem a mutação. Da mesma forma, as medições de afinidade mostradas na Tabela 4 demonstram que a mutação introduzida não impacta adversamente na aglutinação do anticorpo usado no ADC divulgado. Como tal, a posição potencialmente desestabilizadora pode ser modificada sem comprometer a eficácia farmacêutica da molécula. EXEMPLO 6: ADCS HSEZ6 EXTERMINAM EFETIVAMENTE CÉLULAS QUE EXPRESSAM HSEZ6 IN VITRO
[0131] Para determinar se os ADCs anti-SEZ6 da invenção podem mediar eficientemente a entrega de agentes citotóxicos conjugados a células vivas, um ensaio de extermínio celular in vitro foi realizado com uso dos ADCs anti-SEZ6 produzidos no Exemplo 4 acima.
[0132] Suspensões celulares únicas de células HEK293T que sobrexpressam hSEZ6 ou células HEK293T naïve foram chapeadas a 500 células por poço em placas de cultura de tecidos BD (BD Biosciences). Um dia depois, várias concentrações de ADC purificado conjugado com caliqueamicina foram adicionadas às culturas. As células foram incubadas por 96 horas. Após a incubação, as células viáveis foram enumeradas com uso de CellTiter-Glo® (Promega) de acordo com as instruções do fabricante. As contagens de luminescência bruta com uso de culturas que contêm células não tratadas foram definidas como valores de referência de 100% e todas as outras contagens foram calculadas como uma porcentagem do valor de referência.
[0133] A Figura 3 mostra que todas as células que expressam hSEZ6 tratadas eram muito mais sensíveis aos ADCs anti-SEZ6 em comparação com as células HET293T naïve, demonstrando a especificidade dos ADCs para o antígeno SEZ6.
[0134] Os resultados acima demonstram a capacidade dos ADCs anti-SEZ6 de mediar especificamente a internalização e entrega de cargas úteis citotóxicas diretamente conjugadas para células que expressam SEZ6. EXEMPLO 7: FARMACOCINÉTICA DE ADC EM CAMUNDONGOS
IMUNOCOMPROMETIDOS
[0135] A farmacocinética (PK) de hSEZ6-1.ss1 ADC1, hSEZ6-1.ss1 ADC2 e hSEZ6-1.ss1 ADC3 foi avaliada em camundongos NOD SCID. Os camundongos (n = 4 fêmeas por grupo) foram randomizados em grupos de tratamento com peso corporal médio igual e, em seguida, tratados com a mesma quantidade de ADCs por meio de uma única injeção intravenosa (volume de 100 µl). Cada um dos ADCs foi coadministrado com 10 mg/kg de anticorpo HuIgG1 não conjugado a fim de saturar a depuração mediada por FcγR e fornecer exposição adequada ao ADC. Amostras de soro foram coletadas em 5 minutos, 4, 24, 72, 120, 168, 216 e 336 horas após cada dose, e as concentrações de anticorpos totais (TAb) e ADC foram avaliadas por imunoensaio MSD. Os parâmetros farmacocinéticos, incluindo concentrações máximas (Cmax), exposição (área sob a curva ou AUC) avaliada do tempo = 0 a 14 dias após a dosagem) e meia-vida, foram avaliados com uso de métodos de análise não compartimentais.
[0136] A farmacocinética sérica de ADC e TAb diminuiu bi-exponencialmente para todos os ADCs e as concentrações de pico (Cmax) foram observadas 5 minutos após a dose. Não houve diferença significativa na exposição a ADC (AUC 0 a 14 dias) entre os ADCs SEZ6 testados. A meia-vida sérica terminal do ADC foi semelhante entre os ADCs. A estabilidade do ADC foi medida pela razão de exposições de TAb e ADC e foi semelhante para os compostos testados, variando de 1,4 a 1,6. Em conjunto, estes dados demonstram que a farmacocinética de hSEZ6-1.ss1 ADC1, hSEZ6-1.ss1 ADC2 e hSEZ6-1.ss1 ADC3 são comparáveis em camundongos NOD SCID. EXEMPLO 8: CONJUGADOS ANTICORPO FÁRMACO HSEZ6-1.SS1
SUPRIMEM O CRESCIMENTO DE TUMOR IN VIVO
[0137] Os experimentos in vivo foram realizados para confirmar a capacidade de extermínio celular do hSEZ6-1.ss1 ADC1, hSEZ6-1.ss1 ADC2 e hSEZ6-1.ss1 ADC3 demonstrada no Exemplo 6. Para este fim, ADCs alvejados a SEZ6 sítio- específicos preparados como estabelecido nos Exemplos anteriores foram testados para efeitos terapêuticos in vivo em camundongos NOD SCID imunocomprometidos com tumores subcutâneos de câncer de pulmão de células pequenas (SCLC) de xenoenxerto derivado de paciente (PDX) tendo expressão endógena da proteína de superfície celular SEZ6. Conjugados anti-SEZ6 hSEZ6-1.ss1 ADC1, hSEZ6-1.ss1 ADC2 e hSEZ6-1.ss1 ADC3 foram testados em dois modelos diferentes de SCLC.
[0138] Linhas SCLC-PDX, LU95 e LU149 foram, cada uma, injetadas como um inoculo de células dissociadas sob a pele perto da região de almofada de gordura mamária e medidas semanalmente com compassos de calibre (volume elipsoide = a × b2/2, em que a é o diâmetro maior, e b é o diâmetro menor de uma elipse). Depois que os tumores cresceram até um tamanho médio de 130 a 200 mm3 (faixa de 100 a 300 mm3), os camundongos foram randomizados em grupos de tratamento (n = 5 camundongos por grupo) com médias de volume de tumor iguais. Os camundongos (5 por grupo) foram tratados com doses únicas idênticas de veículo (5% de glicose em água estéril) ou de preparações de ADC de HuIgG1 ou SEZ6 por meio de uma injeção intraperitoneal (volume de 100 µl). SEZ6-ADC foi coadministrado com 10 mg/kg de anticorpo HuIgG1 nu, a fim de linearizar a farmacocinética.
[0139] Efeitos terapêuticos avaliados pelo volume semanal do tumor (com compassos como acima) e medições de peso. Os critérios de ponto final para camundongos individuais ou grupos de tratamento incluíram avaliação de saúde (qualquer sinal de doença), perda de peso (mais de 20% de perda de peso desde o início do estudo) e carga tumoral (volumes de tumor > 1.000 mm3). A eficácia foi monitorada por medições semanais do volume do tumor (mm3) até os grupos atingirem uma média de aproximadamente 800 a 1.000 mm3. Os volumes do tumor foram calculados como uma média com o erro padrão da média para todos os camundongos no grupo de tratamento e foram representados em função do tempo (dias) desde o tratamento inicial. Os resultados dos tratamentos estão representados nas Figuras 4A e 4B, em que os volumes médios de tumor com erro padrão da média (SEM) em 5 camundongos por grupo de tratamento são mostrados.
[0140] ADCs de aglutinação a SEZ6 conjugados com caliqueamicina (hSEZ6-
1.ss1 ADC1, hSEZ6-1.ss1 ADC2 e hSEZ6-1.ss1 ADC3) foram avaliados em camundongos com SCLC PDX-LU95 (Figura 4A) ou PDX-LU149 (Figura 4B). O ligante não clivável ADC1 teve eficácia semelhante ou maior em comparação com o ligante clivável ADC2, enquanto o ligante clivável ADC3 teve maior eficácia em comparação com ADC1 a 2 mg/kg. Em qualquer evento, hSEZ6-1.ss1 ADC1 e hSEZ6-
1.ss1 ADC3 podem alcançar respostas duráveis por 50 dias ou mais no SCLC PDX. A resposta foi específica para SEZ6-ADC, pois não houve resposta observada após o tratamento com ADCs de não aglutinação (HuIgG1) conjugados com os mesmos ligantes de fármaco de caliqueamicina (dados não mostrados).
[0141] Tais resultados demonstram que hSEZ6-1.ss1 ADC1, fabricado conforme estabelecido neste documento, tem o potencial de ser farmaceuticamente eficaz no retardo do crescimento de células de câncer de pulmão de pequenas células. EXEMPLO 9: HSEZ6-1.SS1 ADC1 EXIBE UMA MARGEM DE SEGURANÇA
ROBUSTA
[0142] Uma análise foi conduzida para determinar a margem de segurança fornecida por hSEZ6-1.ss1 ADC1.
[0143] A este respeito, hSEZ6-1.ss1 ADC1, hSEZ6-1.ss1 ADC2 e hSEZ6-
1.ss1 ADC3 compreendem um mAb alvejado idêntico (hSEZ6-1.ss1) e ogiva (N-acetil gama caliqueamicina), com diferenças na anexação de fármaco ligante. hSEZ6-1.ss1 ADC1 é único no sentido de que compreende um ligante não clivável em comparação com outros fármacos ligantes à base de dipeptídeo suscetíveis à catepsina B. Os ADCs SEZ6 foram avaliados em quatro modelos de PDX de camundongo SEZ6 SCLC de alta expressão discretos (LU64, LU86, LU95 e LU149) e em um estudo exploratório de toxicidade de dose repetida em macacos cinomolgo.
[0144] Um modelo PK/PD semimecanístico com base no crescimento do tumor não tratado e dados de resposta do tumor tratado com ADC SEZ6 em camundongos foi usado para prever as concentrações estáticas do tumor (TSC) que correspondem a uma concentração de ADC resultando na estase do tumor em pacientes. Subsequentemente, a PK humana foi simulada com base nos dados de PK de macaco cinomolgo. As previsões de PK humana foram então usadas para estimar a dose necessária para alcançar uma concentração plasmática mínima no intervalo de dosagem em pacientes que é equivalente à TSC. As margens de segurança foram estimadas comparando as exposições de ADC na dose máxima tolerada (MTD) em macacos cinomolgos com a exposição na dose humana eficaz prevista. Esta análise foi repetida para cada modelo de PDX de pulmão avaliado (LU64, LU86, LU95 e LU149).
[0145] A Tabela 5 fornece a margem de segurança prevista para cada um dos ADCs SEZ6. Com base nessa análise, hSEZ6-1.ss1 ADC1 foi previsto para ser mais tolerável do que os outros ADCs SEZ6 (hSEZ6-1.ss1 ADC2, hSEZ6-1.ss1 ADC3) conjugados com a mesma carga útil, mas com ligantes cliváveis. Esta análise previu uma margem de segurança de aproximadamente 10 para hSEZ6-1.ss1 ADC1 que é consideravelmente maior do que os dois construtos com ligantes cliváveis. TABELA 5 Composto Margem de segurança estimada hSEZ6-1.ss1 ADC1 10 hSEZ6-1.ss1 ADC2 0,3 hSEZ6-1.ss1 ADC3 5,5
[0146] A margem de segurança mais alta prevista em humanos com base em dados obtidos em macacos cinomolgos e a flexibilidade de dosagem correspondente indica que hSEZ6-1.ss1 ADC1 é um forte candidato terapêutico. EXEMPLO 10: HSEZ6-1.SS1 ADC1 É PARTICULARMENTE ATIVO EM
SCLC
[0147] Para demonstrar ainda mais a eficácia potencial do ADC divulgado, ensaios específicos de toxinas foram conduzidos com uso de várias linhas de células de xenoenxerto de tumor. Inicialmente, as linhas de célula SCLC, BR, CR, GA, NSCLC e PA PDX foram interrogadas por meio de análise de microarranjo para determinar o respectivo nível de expressão do antígeno SEZ6 (Figura 5A) e CD46, um antígeno de controle positivo conhecido (Figura 5B). A análise de microarranjo foi conduzida com uso do ensaio Affymetrix ClariomD em amostras de RNA purificado derivadas de PDX humano. Uma análise das Figuras 5A e 5B mostra que, enquanto a expressão de SEZ6 é regulada de forma crescente em tumores SCLC em comparação com outros tipos de tumor, o CD46 de controle de antígeno positivo exibiu consistentemente altos níveis de expressão de mRNA através do painel de xenoenxertos derivados de paciente (PDX). Consequentemente, o antígeno CD46 foi usado como um alvo ADC substituto para avaliar o impacto do ligante de fármaco de caliqueamicina inovador divulgado (Fórmula II) em vários tipos de tumor.
[0148] A este respeito, N149, um anticorpo CD46 humanizado (USPN
10.017.565 B2) foi conjugado com o ligante de fármaco de caliqueamicina estabelecido neste documento ou com um controle de ligante de fármaco pirrolobenzodiazepina (PBD). Os ADCs foram gerados substancialmente como estabelecido no Exemplo 4 acima. Após a preparação, os CD46 ADCs foram congelados e armazenados até o uso.
[0149] As células PDX foram inoculadas no flanco de camundongos NOD- SCID. Quando os tumores atingiram entre 100 e 300 mm3, as preparações de ADC de PBD foram introduzidas como uma dose única de 1,6 mg/kg (Figura 5C), enquanto as preparações de ADC de caliqueamicina foram administradas como uma dose única de 8 mg/kg para todos os tipos de tumor diferentes do SCLC PDX (Figura 5D). Para o SCLC PDX, a preparação de ADC de caliqueamicina foi administrada como uma dose de 2 mg/kg ou 4 mg/kg (Figura 5D). Os tumores foram então monitorados para mudanças em comparação com a preparação de ADC sem alvejamento com a mesma ogiva. O tempo delta para a progressão do tumor (dTTP) foi calculado subtraindo o tempo de progressão para ADC não alvejado do tempo de progressão para o agente de alvejamento. A progressão do tumor foi definida como o tempo em que a medição observada cresce novamente, pelo menos, 100 mm3 maior do que o volume nadir de pós-tratamento. Cada ponto de dados nas Figuras 5C e 5D representa uma linha de células PDX individual do respectivo tipo de tumor.
[0150] Como mostrado na Figura 5C, as preparações de ADC de PBD forneceram uma resposta de tumor relativamente uniforme, independentemente do tipo de tumor PDX. Em particular, a suscetibilidade do SCLC PDX ao extermínio pela toxina PBD foi amplamente equivalente à das outras linhas de células tumorais. Em nítido contraste, as linhas de células SCLC PDX se mostraram muito mais suscetíveis ao extermínio pelos ADCs de caliqueamicina do que as outras linhas de células PDX (Figura 5D). Mais especificamente, após uma dose única de 8 mg/kg de ADC de caliqueamicina, a maioria dos xenoenxertos derivados de paciente de tumores BR, CR, GA e NSCLC exibiu resposta de mínima a nenhuma. Houve uma mistura de respostas em tumores pancreáticos, mas mesmo os tumores pancreáticos mostraram respostas mínimas (<25 dias de dTTP) na maioria das linhas de células testadas. Por outro lado, as doses mais baixas de 2 mg/kg (círculos pretos) ou 4 mg/kg (círculos brancos) do ADC de caliqueamicina reduziram consistentemente o crescimento do tumor SCLC substancialmente mais do que as doses mais altas do ADC de caliqueamicina alcançadas em outros tumores PDX. Além disso, a maioria dos tumores de SCLC exibiu atrasos de crescimento de mais de 40 dias em comparação com um anticorpo não alvejado portando a mesma ogiva (dados não mostrados).
[0151] Esses dados sugerem que os tumores SCLC são mais sensíveis a uma ogiva de caliqueamicina do que outras ogivas que danificam o DNA. Este resultado foi inesperado, pois a expectativa era que a ogiva de caliqueamicina forneceria resultados semelhantes aos observados com a ogiva PBD.
MODALIDADES
1. Um anticorpo isolado que se liga especificamente a SEZ6 humana, em que o anticorpo compreende uma sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 3 e uma sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 4.
2. O anticorpo da modalidade 1, em que o anticorpo é conjugado com uma carga útil de caliqueamicina.
3. O anticorpo da modalidade 2, em que a carga útil de caliqueamicina compreende caliqueamicina N-Ac.
4. O anticorpo da modalidade 3, em que a carga útil de caliqueamicina compreende a Fórmula II.
5. Um método de tratamento de câncer de pulmão de células pequenas que compreende a administração de um anticorpo de qualquer uma das modalidades 1 a 4 a um sujeito em necessidade do mesmo.
6. Um kit que compreende um ou mais recipientes que contêm um anticorpo de qualquer uma das modalidades 1 a 4.
7. O kit da modalidade 6, que compreende ainda um rótulo ou bula associado a um ou mais recipientes que indica que o anticorpo é para o tratamento de um sujeito com câncer de pulmão de células pequenas.
8. Uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo de qualquer uma das modalidades 1 a 4.
9. Um kit que compreende um ou mais recipientes que contêm uma composição farmacêutica da modalidade 8.
10. O kit da modalidade 9 que compreende ainda um rótulo ou bula associado a um ou mais recipientes que indica que a composição farmacêutica é para o tratamento de um sujeito com câncer de pulmão de células pequenas.
11. Um ácido nucleico que codifica todo ou parte de um anticorpo de qualquer uma das modalidades 1 a 4.
12. Um vetor que compreende o ácido nucleico da modalidade 11.
13. Uma célula hospedeira que compreende o ácido nucleico da reivindicação 11 ou o vetor das modalidades 12.
14. Um ADC SEZ6 da estrutura:
ADC1 em que Ab compreende um anticorpo anti-SEZ6 que tem uma sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 3 e uma sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 4 e em que n é 2.
15. Um método de tratamento de câncer de pulmão de células pequenas que compreende a administração de um ADC SEZ6 da modalidade 14 a um sujeito em necessidade do mesmo.
16. Um kit que compreende um ou mais recipientes que contêm o ADC SEZ6 da modalidade 14.
17. O kit da modalidade 16 que compreende ainda um rótulo ou bula associado a um ou mais recipientes que indica que o ADC SEZ6 é para o tratamento de um sujeito com câncer de pulmão de células pequenas.
18. Uma composição farmacêutica que compreende o ADC SEZ6 da modalidade 14.
19. A composição farmacêutica da modalidade 18, em que o ADC SEZ6 da reivindicação 14 é a espécie de ADC predominante.
20. A composição farmacêutica da modalidade 19, em que a espécie de ADC predominante compreende mais do que cerca de 70% das espécies de ADC presentes na composição.
21. A composição farmacêutica da modalidade 19, em que a espécie de ADC predominante compreende mais do que cerca de 80% das espécies de ADC presentes na composição.
22. A composição farmacêutica da modalidade 19, em que a espécie de ADC predominante compreende mais do que cerca de 90% das espécies de ADC presentes na composição.
23. Um kit que compreende um ou mais recipientes que contêm qualquer uma das composições farmacêuticas das modalidades 18 a 22.
24. O kit da modalidade 23 que compreende ainda um rótulo ou bula associado a um ou mais recipientes que indica que a composição farmacêutica é para o tratamento de um sujeito com câncer de pulmão de células pequenas.
25. Um método de tratamento de câncer de pulmão de células pequenas que compreende a administração de qualquer uma das composições farmacêuticas das modalidades 18 a 22.
26. Um método de redução de células iniciadoras de tumor em uma população de células tumorais, em que o método compreende colocar uma população de células tumorais que compreende células iniciadoras de tumor e células tumorais que não sejam células iniciadoras de tumor em contato com um ADC SEZ6 da modalidade 14, em que a frequência de células iniciadoras de tumor é reduzida.
27. O método da modalidade 26, em que o contato é realizado in vivo.
28. O método da modalidade 26, em que o contato é realizado in vitro.
29. Um método de entrega de uma citotoxina a uma célula que compreende colocar a célula em contato com um ADC SEZ6 da modalidade 14.
30. Um método de produção de um ADC da modalidade 14 que compreende a etapa de conjugar um anticorpo hSEZ6-1.ss1 que tem uma sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 3 e uma sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 4 com um ligante de fármaco que compreende a Fórmula II.
31. O método da modalidade 30, que compreende ainda a etapa de liofilização do ADC.
32. Um método de tratamento de câncer de pulmão de células pequenas em um sujeito em necessidade do mesmo que compreende a administração de um ADC SEZ6 com uma margem de segurança maior que 6, em que o ADC SEZ6 compreende a estrutura: ADC1 em que Ab compreende um anticorpo anti-SEZ6 que tem uma sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 3 e uma sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 4 e em que n é 2.
33. O método da modalidade 32, em que a margem de segurança é de cerca de 10.
34. Um ligante de fármaco de caliqueamicina, ou um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável do mesmo que compreende a estrutura:
Fórmula II.
[0152] Aqueles versados na técnica observarão ainda que a presente invenção pode ser concretizada em outras formas específicas sem se afastar do espírito ou atributos centrais da mesma. Uma vez que a descrição anterior da presente invenção divulga apenas modalidades exemplificativas da mesma, deve ser entendido que outras variações são contempladas como estando dentro do escopo da presente invenção. Consequentemente, a presente invenção não está limitada às modalidades particulares que foram descritas em detalhes neste documento. Em vez disso, deve ser feita referência às reivindicações anexas como indicativas do escopo e do conteúdo da invenção.

Claims (20)

REIVINDICAÇÕES
1. Anticorpo isolado que se aglutina especificamente a SEZ6 humana, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo compreende uma sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 3 e uma sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 4.
2. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo é conjugado com uma carga útil de caliqueamicina.
3. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a carga útil de caliqueamicina compreende caliqueamicina N-Ac.
4. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que a carga útil de caliqueamicina compreende a Fórmula II.
5. Ácido nucleico CARACTERIZADO pelo fato de que codifica a totalidade ou parte de um anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4.
6. Vetor CARACTERIZADO pelo fato de que compreende o ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 5.
7. Célula hospedeira CARACTERIZADA pelo fato de que compreende o ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 5 ou o vetor, de acordo com a reivindicação 6.
8. ADC SEZ6 CARACTERIZADO pelo fato de que apresenta a estrutura: ADC1 em que Ab compreende um anticorpo anti-SEZ6 que tem uma sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 3 e uma sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 4 e em que n é 2.
9. Método de tratamento de câncer de pulmão de células pequenas CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a administração de um ADC SEZ6, de acordo com a reivindicação 8, a um sujeito em necessidade do mesmo.
10. Composição farmacêutica CARACTERIZADA pelo fato de que compreende o ADC SEZ6, de acordo com a reivindicação 8.
11. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADA pelo fato de que o ADC SEZ6, de acordo com a reivindicação 8, é a espécie de ADC predominante.
12. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADA pelo fato de que a espécie predominante de ADC compreende mais do que cerca de 70% das espécies de ADC presentes na composição.
13. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADA pelo fato de que a espécie predominante de ADC compreende mais do que cerca de 80% das espécies de ADC presentes na composição.
14. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADA pelo fato de que a espécie predominante de ADC compreende mais do que cerca de 90% das espécies de ADC presentes na composição.
15. Método de tratamento de câncer de pulmão de células pequenas, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a administração de qualquer uma das composições farmacêuticas, de acordo com as reivindicações 8 a 14.
16. Método de produção de um ADC, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a etapa de conjugar um anticorpo hSEZ6-1.ss1 que tem uma sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 3 e uma sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 4 com um ligante de fármaco que compreende a Fórmula II.
17. Método, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda a etapa de liofilização do ADC.
18. Método de tratamento de câncer de pulmão de células pequenas em um sujeito em necessidade do mesmo, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a administração de um ADC SEZ6 com uma margem de segurança maior que 6, em que o ADC SEZ6 compreende a estrutura: ADC1 em que Ab compreende um anticorpo anti-SEZ6 que tem uma sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 3 e uma sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 4 e em que n é 2.
19. Método, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato de que a margem de segurança é de cerca de 10.
20. Ligante de fármaco de caliqueamicina, ou um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável do mesmo, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a estrutura:
Fórmula II.
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