JP2023505708A

JP2023505708A - 抗クローディン抗体薬物複合体及びその医薬用途

Info

Publication number: JP2023505708A
Application number: JP2022535591A
Authority: JP
Inventors: 陽楊; 建烟許; 維康陶
Original assignee: Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2019-12-12
Filing date: 2020-12-11
Publication date: 2023-02-10
Also published as: MX2022006893A; CA3162754A1; EP4074345A4; CN118403182A; WO2021115426A1; AU2020402006A1; EP4074345A1; CN114650845A; US20230054458A1; KR20220113728A; CN114650845B; BR112022011032A2; TW202128227A

Abstract

抗クローディン抗体薬物複合体及びその医薬用途である。具体的に、一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体に関し、ただし、Pcは、抗Claudin18.2抗体又はその抗原結合断片であり、L、Y及びnは、明細書に定義された通りである。JPEG2023505708000060.jpg4248

Description

本願は、2019年12月12日に提出された中国特許出願（出願番号CN201911273041.7）及び2020年09月30日に提出された中国特許出願（出願番号CN202011060513.3）の優先権を主張する。

本開示は抗クローディン抗体薬物複合体、特に、抗Claudin18.2抗体-エキサテカン類似体複合体、その調製方法、抗体薬物複合体を含む薬物組成物及びそのClaudin18.2媒介の疾患又は病状を治療する薬物の調製に用いられる用途に関し、特に抗がん剤の調製に用いられる用途に関する。

ここでの記載は、必ずしも従来技術を構成するものではなく、本開示に関連する背景情報のみを提供する。

クローディン18（Claudin-18、CLDN18）は、ヒトにおいてClaudin18遺伝子によってコードされたタンパク質の一つであり、細胞タイトジャンクションタンパク質ファミリーに属し、層細胞間の分子流動を制御することができる。Claudinタンパク質構造には、4つの膜貫通領域と2つの細胞外ループが含まれ、そのN末端とC末端が細胞質内にある。Claudin-18は、それぞれClaudin18.1とClaudin18.2との2つのスプライス変異体を有し、2つの配列同士は、第1の細胞外ループのみにおいて8個のアミノ酸の差異を有する。Claudin18.1とClaudin18.2の発現分布は異なっており、Claudin18.1は、正常な肺の細胞において選択的に発現しているが、Claudin18.2は、正常な細胞における発現がひどく制限されているものの、複数種の腫瘍（胃がん、肺がん及び膵臓がんなど）においてアロステリック活性化と過剰発現が頻繁である。Claudin18.2は、胃がんと他のがんの種類の潜在的な治療標的と考えられており、この標的の発見も、胃がんの治療に新たな選択を提供している。

抗体-薬物複合体（antibody drug conjugate、ADC）は、モノクローナル抗体又は抗体断片を、安定した化学リンカー化合物により生物活性を有する細胞毒素に連結しており、抗体による正常細胞と腫瘍細胞の表面抗原への結合特異性及び細胞毒性物質の高効率が活用されるとともに、前者の治療効果が比較的に低いや、後者の毒性・副作用が大きすぎるといった欠陥が避けられる。すなわち、従来の化学療法薬と比べて、抗体-薬物複合体は、腫瘍細胞とより正確に結合し、正常細胞への影響を低減させることができる。

現在、Claudin18.2を標的とする抗体及びADC薬物についての特許、例えば、WO2020200196A1、WO2016166122とWO2016165762が報告されている。しかしながら、Claudin18.2に関する腫瘍の治療により良く用いられるように、より効果的且つより安全的な抗Claudin18.2抗体-薬物複合体の開発はまだ必要とされている。

本開示は、抗Claudin18.2抗体のADC及びその用途に関し、抗Claudin18.2抗体又は抗原結合断片と細胞毒性物質であるエキサテカン類似体とを複合したADC薬物を提供する。

従って、本開示は、一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩を提供することを目的とする：

ただし、
Yは、-O-（CR^aR^b）_m-CR¹R²-C（O）-、-O-CR¹R²-（CR^aR^b）_m-、-O-CR¹R²-、-NH-（CR^aR^b）_m-CR¹R²-C（O）-及び-S-（CR^aR^b）_m-CR¹R²-C（O）-から選ばれ、
R^aとR^bは、相同又は相異であり、それぞれ独立的に水素原子、重水素原子、ハロゲン、アルキル基、ハロゲン化アルキル基、重水素化アルキル基、アルコキシ基、ヒドロキシ基、アミノ基、シアノ基、ニトロ基、ヒドロキシアルキル基、シクロアルキル基及びヘテロシクリル基から選ばれ、又は、R^aとR^bは、それらに接続された炭素原子とともに、シクロアルキル基又はヘテロシクリル基を形成し、
R¹は、ハロゲン、ハロゲン化アルキル基、重水素化アルキル基、シクロアルキル基、シクロアルキルアルキル基、アルコキシアルキル基、ヘテロシクリル基、アリール基及びヘテロアリール基から選ばれ、R²は、水素原子、ハロゲン、ハロゲン化アルキル基、重水素化アルキル基、シクロアルキル基、シクロアルキルアルキル基、アルコキシアルキル基、ヘテロシクリル基、アリール基及びヘテロアリール基から選ばれ、又は、R¹とR²は、それらに接続された炭素原子とともに、シクロアルキル基又はヘテロシクリル基を形成し、
又は、R^aとR²は、それらに接続された炭素原子とともに、シクロアルキル基又はヘテロシクリル基を形成し、
mは、0～4の整数であり、
nは1～10で、nは小数又は整数であり、
Lは、リンカーユニットであり、
Pcは、抗Claudin18.2抗体又はその抗原結合断片である。

本開示のいくつかの実施形態では、上記の何れか一項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩において、前記抗Claudin18.2抗体又はその抗原結合断片は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含み、そのうち、
i）前記重鎖可変領域は、SEQ ID NO：3配列で表される重鎖可変領域のHCDR1、HCDR2及びHCDR3と同じ配列を有するHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、前記軽鎖可変領域は、SEQ ID NO：4配列で表される軽鎖可変領域のLCDR1、LCDR2及びLCDR3と同じ配列を有するLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、又は
ii）前記重鎖可変領域は、SEQ ID NO：5配列で表される重鎖可変領域のHCDR1、HCDR2及びHCDR3と同じ配列を有するHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、前記軽鎖可変領域は、SEQ ID NO：6配列で表される軽鎖可変領域のLCDR1、LCDR2及びLCDR3と同じ配列を有するLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含む。

本開示のいくつかの実施形態では、上記の何れか一項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩において、前記抗Claudin18.2抗体又はその抗原結合断片は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含み、そのうち、
iii）前記重鎖可変領域は、配列がそれぞれSEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10及びSEQ ID NO：11で表されるHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、前記軽鎖可変領域は、配列がそれぞれSEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13及びSEQ ID NO：14で表されるLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、又は
iv）前記重鎖可変領域は、配列がそれぞれSEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16及びSEQ ID NO：17で表されるHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、前記軽鎖可変領域は、配列がそれぞれSEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19及びSEQ ID NO：20で表されるLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含む。

本開示のいくつかの実施形態では、上記の何れか一項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩において、前記抗Claudin18.2抗体は、マウス抗体、キメラ抗体又はヒト化抗体である。

本開示のいくつかの実施形態では、上記の何れか一項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩において、前記抗Claudin18.2抗体又はその抗原結合断片は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含み、そのうち、
（1）前記重鎖可変領域は、アミノ酸配列がSEQ ID NO：3で表され又はそれと少なくとも90%の同一性を有し、及び前記軽鎖可変領域は、アミノ酸配列がSEQ ID NO：4で表され又はそれと少なくとも90%の同一性を有し、
（2）前記重鎖可変領域は、アミノ酸配列がSEQ ID NO：24で表され又はそれと少なくとも90%の同一性を有し、及び前記軽鎖可変領域は、アミノ酸配列がSEQ ID NO：21で表され又はそれと少なくとも90%の同一性を有し、
（3）前記重鎖可変領域は、アミノ酸配列がSEQ ID NO：5で表され又はそれと少なくとも90%の同一性を有し、及び前記軽鎖可変領域は、アミノ酸配列がSEQ ID NO：6で表され又はそれと少なくとも90%の同一性を有し、又は
（4）前記重鎖可変領域は、アミノ酸配列がSEQ ID NO：31で表され又はそれと少なくとも90%の同一性を有し、及び前記軽鎖可変領域は、アミノ酸配列がSEQ ID NO：28で表され又はそれと少なくとも90%の同一性を有する。

本開示のいくつかの実施形態では、上記の何れか一項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩において、前記抗Claudin18.2抗体は、ヒト化抗体であり、前記ヒト化抗体は、ヒト抗体由来のフレームワーク領域又はそのフレームワーク領域変異体を含み、前記フレームワーク領域変異体は、ヒト抗体の軽鎖フレームワーク領域及び/又は重鎖フレームワーク領域にそれぞれ多くとも10個（例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10）のアミノ酸を有する復帰変異であり、
好ましくは、前記フレームワーク領域変異体は、以下の（a）又は（b）から選ばれる変異を含み、すなわち、
（a）前記軽鎖可変領域は、任意に22S、85I及び87Hから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸復帰変異を含み、及び/又は前記重鎖可変領域は、任意に48I、82T及び69Mから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸復帰変異を含み、又は
（b）前記軽鎖可変領域は、任意に4L又は22Sから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸復帰変異を含み、及び/又は前記重鎖可変領域は、任意に38K、40R、48I、66K、67A、69L、71L及び73Kから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸復帰変異を含み、
好ましくは、前記フレームワーク領域変異体は、以下から選ばれる変異を含み、すなわち、
（a-1）前記軽鎖可変領域は、22S、85I及び87Hのアミノ酸復帰変異を含み、及び前記重鎖可変領域は、48I及び82Tのアミノ酸復帰変異を含み、又は
（b-1）前記軽鎖可変領域は、4Lから選ばれるアミノ酸復帰変異を含む。

本開示のいくつかの実施形態では、上記の何れか一項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩において、前記抗Claudin18.2抗体又はその抗原結合断片は、以下に示す重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含み、すなわち、
（vii）前記重鎖可変領域は、配列がSEQ ID NO：3で表され、及び前記軽鎖可変領域は、配列がSEQ ID NO：4で表され、
（viii）前記重鎖可変領域は、配列がSEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26又はSEQ ID NO：27で表され、及び前記軽鎖可変領域は、配列がSEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22又はSEQ ID NO：23で表され、
（ix）前記重鎖可変領域は、配列がSEQ ID NO：5で表され、及び前記軽鎖可変領域は、配列がSEQ ID NO：6で表され、又は
（x）前記重鎖可変領域は、配列がSEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33又はSEQ ID NO：34で表され、及び前記軽鎖可変領域は、配列がSEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29又はSEQ ID NO：30で表され、
好ましくは、前記抗Claudin18.2抗体又はその抗原結合断片は、以下に示す重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含み、すなわち、
（xi）前記重鎖可変領域は、配列がSEQ ID NO：31で表され、及び前記軽鎖可変領域は、配列がSEQ ID NO：29で表され、又は
（xii）前記重鎖可変領域は、配列がSEQ ID NO：26で表され、及び前記軽鎖可変領域は、配列がSEQ ID NO：23で表される。

本開示のいくつかの実施形態では、上記の何れか一項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩において、前記抗Claudin18.2抗体又はその抗原結合断片は、抗体重鎖定常領域と軽鎖定常領域を含み、好ましくは、前記重鎖定常領域は、ヒトIgG1、IgG2、IgG3及びIgG4定常領域及びその通常変異体から選ばれ、前記軽鎖定常領域は、ヒト抗体κとλ鎖定常領域及びその通常変異体から選ばれ、より好ましくは、前記抗体は、配列がSEQ ID NO：7で表される重鎖定常領域と、配列がSEQ ID NO：8で表される軽鎖定常領域とを含み、最も好ましくは、前記抗体は、SEQ ID NO：35又はSEQ ID NO：42で表されるアミノ酸配列を有する重鎖と少なくも90%の同一性を有する重鎖と、SEQ ID NO：36又はSEQ ID NO：39で表されるアミノ酸配列を有する軽鎖と少なくも90%の同一性を有する軽鎖とを含み、又は
SEQ ID NO：37又はSEQ ID NO：49で表されるアミノ酸配列を有する重鎖と少なくも90%の同一性を有する重鎖と、SEQ ID NO：38又はSEQ ID NO：46で表されるアミノ酸配列を有する軽鎖と少なくも90%の同一性を有する軽鎖とを含む。

本開示のいくつかの実施形態では、上記の何れか一項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩において、前記抗Claudin18.2抗体又はその抗原結合断片は、
（c）配列がSEQ ID NO：35で表される重鎖と配列がSEQ ID NO：36で表される軽鎖、
（d）配列がSEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44又はSEQ ID NO：45で表される重鎖と配列がSEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40又はSEQ ID NO：41で表される軽鎖、
（e）配列がSEQ ID NO：37で表される重鎖と配列がSEQ ID NO：38で表される軽鎖、又は
（f）配列がSEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51又はSEQ ID NO：52で表される重鎖と配列がSEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47又はSEQ ID NO：48で表される軽鎖を含む。

本開示のいくつかの実施形態では、上記の何れか一項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩において、前記抗Claudin18.2抗体は、
アミノ酸配列がSEQ ID NO：44で表される重鎖と配列がSEQ ID NO：41で表される軽鎖とを含むh1901-11、又は
アミノ酸配列がSEQ ID NO：49で表される重鎖と配列がSEQ ID NO：47で表される軽鎖とを含むh1902-5から選ばれる。

本開示のいくつかの実施形態では、前記抗原結合断片は、Fab、Fab'、F（ab'）2、単鎖抗体（scFv）、二量化のV領域（二重抗体）及びジスルフィド結合安定化のV領域（dsFv）から選ばれる。

本開示のいくつかの実施形態では、上記の何れか一項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩において、nは、1～10の間の整数又は小数であってもよく、nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10の平均値であってもよい。nは、2～8の小数又は整数であり、好ましくは、3～8の小数又は整数であり、より好ましくは、5～9の小数又は整数であり、又は好ましくは、2～7の小数又は整数である。いくつかの実施形態では、nは、3.5～4.5の小数又は整数である。

本開示のいくつかの実施形態では、上記の何れか一項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩において、
ただし、
Yは、-O-（CR^aR^b）_m-CR¹R²-C（O）-であり、
R^aとR^bは、相同又は相異であり、それぞれ独立的に水素原子、重水素原子、ハロゲン又はアルキル基から選ばれ、
R¹は、ハロゲン化アルキル基又はC_3-6シクロアルキル基であり、
R²は、水素原子、ハロゲン化アルキル基又はC_3-6シクロアルキル基から選ばれ、
又は、R¹とR²は、それらに接続された炭素原子とともに、C_3-6シクロアルキル基を形成し、
mは、0又は1である。

本開示のいくつかの実施形態では、上記の何れか一項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩において、Yは、

から選ばれ、
ただし、YのO端は、リンカーユニットLに接続されている。

本開示のいくつかの実施形態では、提供された一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩又は溶媒和物において、リンカーユニット-L-は、-L¹-L²-L³-L⁴-である。

いくつかの実施形態では、L¹は、-（スクシンイミド-3-イル-N）-W-C（O）-、-CH₂-C（O）-NR³-W-C（O）-又は-C（O）-W-C（O）-から選ばれ、ただし、Wは、C_1-8アルキル基、C_1-8アルキル基-C_3-6シクロアルキル基又は1～8個の鎖原子の直鎖ヘテロアルキル基から選ばれ、前記ヘテロアルキル基は、N、O又はSから選ばれる1～3個のヘテロ原子を含み、前記C_1-8アルキル基、C_1-8アルキル基-C_3-6シクロアルキル基又は1～8個の鎖原子の直鎖ヘテロアルキル基は、それぞれ独立的に、任意にハロゲン、ヒドロキシ基、シアノ基、アミノ基、アルキル基、クロロアルキル基、重水素化アルキル基、アルコキシ基及びシクロアルキル基から選ばれる1つ又は複数の置換基でさらに置換される。

いくつかの実施形態では、L²は、-NR⁴（CH₂CH₂O）p¹CH₂CH₂C（O）-、-NR⁴（CH₂CH₂O）p¹CH₂C（O）-、-S（CH₂）p¹C（O）-又は化学結合から選ばれ、ただし、p¹は1～20の整数である。
いくつかの実施形態では、L³は、2～7個のアミノ酸からなるペプチド残基であり、そのうち、前記アミノ酸は、フェニルアラニン、グリシン、バリン、リジン、シトルリン、セリン、グルタミン酸及びアスパラギン酸におけるアミノ酸で形成されたアミノ酸残基から選ばれ、且つ任意にハロゲン、ヒドロキシ基、シアノ基、アミノ基、アルキル基、クロロアルキル基、重水素化アルキル基、アルコキシ基及びシクロアルキル基から選ばれる1つ又は複数の置換基でさらに置換される。

いくつかの実施形態では、L⁴は、-NR⁵（CR⁶R⁷）_t-、-C（O）NR⁵-、-C（O）NR⁵（CH₂）_t-及び化学結合から選ばれ、ただし、tは1～6の整数である。

いくつかの実施形態では、R³、R⁴及びR⁵は、相同又は相異であり、それぞれ独立的に水素原子、アルキル基、ハロゲン化アルキル基、重水素化アルキル基及びヒドロキシアルキル基から選ばれる。

いくつかの実施形態では、R⁶とR⁷は、相同又は相異であり、それぞれ独立的に水素原子、ハロゲン、アルキル基、ハロゲン化アルキル基、重水素化アルキル基及びヒドロキシアルキル基から選ばれる。

本開示のいくつかの実施形態では、上記の何れか一項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩又は溶媒和物において、リンカーユニット-L-は、-L¹-L²-L³-L⁴-であり、
L¹は、-（スクシンイミド-3-イル-N）-W-C（O）-、-CH₂-C（O）-NR³-W-C（O）-又は-C（O）-W-C（O）-から選ばれ、ただし、Wは、C_1-8アルキル基、C_1-8アルキル基-シクロアルキル基又は1～8個の原子の直鎖ヘテロアルキル基から選ばれ、前記ヘテロアルキル基は、N、O又はSから選ばれる1～3個のヘテロ原子を含み、前記C_1-8アルキル基、シクロアルキル基及び直鎖ヘテロアルキル基は、それぞれ独立的に、任意にハロゲン、ヒドロキシ基、シアノ基、アミノ基、アルキル基、クロロアルキル基、重水素化アルキル基、アルコキシ基及びシクロアルキル基から選ばれる1つ又は複数の置換基でさらに置換され、
L²は、-NR⁴（CH₂CH₂O）p¹CH₂CH₂C（O）-、-NR⁴（CH₂CH₂O）p¹CH₂C（O）-、-S（CH₂）p¹C（O）-又は化学結合から選ばれ、ただし、p¹は1～20の整数であり、
L³は、2～7個のアミノ酸からなるペプチド残基であり、そのうち、前記アミノ酸は、フェニルアラニン、グリシン、バリン、リジン、シトルリン、セリン、グルタミン酸及びアスパラギン酸におけるアミノ酸で形成されたアミノ酸残基から選ばれ、且つ任意にハロゲン、ヒドロキシ基、シアノ基、アミノ基、アルキル基、クロロアルキル基、重水素化アルキル基、アルコキシ基及びシクロアルキル基から選ばれる1つ又は複数の置換基でさらに置換され、
L⁴は、-NR⁵（CR⁶R⁷）_t-、-C（O）NR⁵-、-C（O）NR⁵（CH₂）_t-又は化学結合から選ばれ、ただし、tは1～6の整数であり、
R³、R⁴及びR⁵は、相同又は相異であり、それぞれ独立的に水素原子、アルキル基、ハロゲン化アルキル基、重水素化アルキル基及びヒドロキシアルキル基から選ばれ、
R⁶とR⁷は、相同又は相異であり、それぞれ独立的に水素原子、ハロゲン、アルキル基、ハロゲン化アルキル基、重水素化アルキル基及びヒドロキシアルキル基から選ばれる。

本開示のいくつかの実施形態では、上記の何れか一項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩において、リンカーユニット-L-は、-L¹-L²-L³-L⁴-であり、
L¹は

であり、s¹は2～8の整数であり、
L²は、化学結合であり、
L³はテトラペプチド残基であり、好ましくは、L³はGGFGのテトラペプチド残基（SEQ ID No：55）であり、
L⁴は、-NR⁵（CR⁶R⁷）t-であり、R⁵、R⁶又はR⁷は、相同又は相異であり、それぞれ独立的に水素原子又はアルキル基であり、tは1又は2であり、
ただし、前記L¹末端は、Pcに接続され、L⁴末端は、Yに接続されている。

本開示のいくつかの実施形態では、上記の何れか一項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩において、-L-は、

である。

本開示のいくつかの実施形態では、上記の何れか一項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩において、-L-Y-は、任意に

から選ばれる。

本開示のいくつかの実施形態では、上記の何れか一項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩は、一般式（Pc-L_a-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩であり、

ただし、
W、L²、L³、R⁵、R⁶、R⁷は、前記リンカーユニット-L-に定義された通りであり、
Pc、n、R¹、R²、mは、一般式（Pc-L-Y-D）に定義された通りである。

本開示のいくつかの実施形態では、上記の何れか一項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩は、一般式（Pc-L_b-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩であり、

ただし、
s¹は、2～8の整数であり、
Pc、R¹、R²、R⁵～R⁷、m及びnは、一般式（Pc-L_a-Y-D）に定義された通りである。

本開示のいくつかの実施形態では、上記の何れか一項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩において、前記リガンド-薬物複合体は、

から選ばれ、
ただし、Pcとnは、一般式（Pc-L-Y-D）に定義された通りである。

本開示のいくつかの実施形態では、提供された一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩において、前記リガンド-薬物複合体は、

から選ばれ、
ただし、nは、一般式（Pc-L-Y-D）に定義された通りであり、抗体h1902-5、h1901-11は、上記に定義された通りである。

本開示は、一般式（Pc-L_a-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩を調製する方法をさらに提供し、それは、

Pc’を一般式（L_a-Y-D）で表される化合物とカップリング反応し、一般式（Pc-L_a-Y-D）で表される化合物を得るステップを含み、
ただし、
Pcは、上記のような抗Claudin18.2抗体又はその抗原結合断片であり、Pc’は、Pcを還元して得たものであり、
W、L²、L³、R¹、R²、R⁵～R⁷、m及びnは、一般式（Pc-L_a-Y-D）に定義された通りである。

本開示は、一般式（Pc-L‘-D）で表される抗体薬物複合体を調製する方法をさらに提供し、それは、

Pcを還元した後、一般式（L’-D）とカップリング反応し、化合物を得るステップを含み、ただし、
Pcは、上記のような抗Claudin18.2抗体又はその抗原結合断片であり、
nは、一般式（Pc-L-Y-D）に定義された通りである。

別の態様において、本開示は、上記の何れか一項に記載のリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩と、1種又は複数種の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体とを含む薬物組成物を提供する。

別の態様において、本開示は、上記の何れか一項に記載のリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩、又はそれを含む薬物組成物の薬物としての用途を提供する。いくつかの実施形態において、前記薬物は、Claudin18.2媒介の疾患又は病状の治療に用いられ、前記Claudin18.2媒介の疾患又は病状は、Claudin18.2高発現がんが好ましい。いくつかの実施形態において、前記薬物は、がんの治療に用いられる。いくつかの実施形態において、前記がんは、頭頸部扁平上皮がん、頭頸部がん、脳がん、神経膠腫、多形性膠芽腫、神経芽細胞腫、中枢神経系がん、神経内分泌腫瘍、咽頭がん、鼻咽頭がん、食道がん、甲状腺がん、悪性胸膜中皮腫、肺がん、乳がん、肝がん、肝胆がん、膵臓がん、胃がん、消化管がん、腸がん、結腸がん、結腸直腸がん、腎がん、明細胞腎細胞がん、卵巣がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、膀胱がん、前立腺がん、精巣がん、皮膚がん、黒色腫、白血病、リンパ腫、骨がん、軟骨肉腫、骨髄腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、クルッケンベルグ腫瘍、骨髄増殖性腫瘍、扁平上皮がん、ユーイング肉腫、全身性軽鎖アミロイドーシス及びメルケル細胞がんが好ましく、より好ましくは、前記リンパ腫は、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、縦隔原発大細胞型B細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、T細胞/組織球に富む大細胞型B細胞リンパ腫及びリンパ形質細胞性リンパ腫から選ばれ、前記肺がんは、非小細胞肺がんと小細胞肺がんから選ばれ、前記白血病は、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、リンパ性白血病、リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病及び骨髄細胞白血病から選ばれる。

別の態様において、本開示は、上記の何れか一項に記載のリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩、又はそれを含む薬物組成物の、Claudin18.2媒介の疾患又は病状を治療するための薬物の調製における用途を提供する。そのうち、前記Claudin18.2媒介の疾患又は病状は、Claudin18.2高発現がんである。いくつかの実施形態において、前記疾患は、頭頸部扁平上皮がん、頭頸部がん、脳がん、神経膠腫、多形性膠芽腫、神経芽細胞腫、中枢神経系がん、神経内分泌腫瘍、咽頭がん、鼻咽頭がん、食道がん、甲状腺がん、悪性胸膜中皮腫、肺がん、乳がん、肝がん、肝胆がん、膵臓がん、胃がん、消化管がん、腸がん、結腸がん、結腸直腸がん、腎がん、明細胞腎細胞がん、卵巣がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、膀胱がん、前立腺がん、精巣がん、皮膚がん、黒色腫、白血病、リンパ腫、骨がん、軟骨肉腫、骨髄腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、クルッケンベルグ腫瘍、骨髄増殖性腫瘍、扁平上皮がん、ユーイング肉腫、全身性軽鎖アミロイドーシス及びメルケル細胞がんが好ましく、より好ましくは、前記リンパ腫は、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、縦隔原発大細胞型B細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、T細胞/組織球に富む大細胞型B細胞リンパ腫及びリンパ形質細胞性リンパ腫から選ばれ、前記肺がんは、非小細胞肺がんと小細胞肺がんから選ばれ、前記白血病は、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、リンパ性白血病、リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病及び骨髄細胞白血病から選ばれる。

別の態様において、本開示は、上記の何れか一項に記載のリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩、又はそれを含む薬物組成物の、腫瘍を治療又は予防するための薬物の調製における用途を提供し、前記腫瘍とがんは、頭頸部扁平上皮がん、頭頸部がん、脳がん、神経膠腫、多形性膠芽腫、神経芽細胞腫、中枢神経系がん、神経内分泌腫瘍、咽頭がん、鼻咽頭がん、食道がん、甲状腺がん、悪性胸膜中皮腫、肺がん、乳がん、肝がん、肝胆がん、膵臓がん、胃がん、消化管がん、腸がん、結腸がん、結腸直腸がん、腎がん、明細胞腎細胞がん、卵巣がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、膀胱がん、前立腺がん、精巣がん、皮膚がん、黒色腫、白血病、リンパ腫、骨がん、軟骨肉腫、骨髄腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、クルッケンベルグ腫瘍、骨髄増殖性腫瘍、扁平上皮がん、ユーイング肉腫、全身性軽鎖アミロイドーシス及びメルケル細胞がんが好ましく、より好ましくは、前記リンパ腫は、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、縦隔原発大細胞型B細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、T細胞/組織球に富む大細胞型B細胞リンパ腫及びリンパ形質細胞性リンパ腫から選ばれ、前記肺がんは、非小細胞肺がんと小細胞肺がんから選ばれ、前記白血病は、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、リンパ性白血病、リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病及び骨髄細胞白血病から選ばれる。

別の態様において、本開示はさらに、腫瘍を治療及び/又は予防するための方法に関し、当該方法は、それを必要とする被験者に治療有効量又は予防有効量の上記の何れか一項に記載のリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩、又はそれを含む薬物組成物を投与することを含み、好ましくは、前記腫瘍は、Claudin18.2高発現に関するがんである。

別の態様において、本開示はさらに、がんを治療又は予防するための方法に関し、当該方法は、それを必要とする被験者に治療有効量又は予防有効量の上記の何れか一項に記載のリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩、又はそれを含む薬物組成物を投与することを含み、前記腫瘍とがんは、頭頸部扁平上皮がん、頭頸部がん、脳がん、神経膠腫、多形性膠芽腫、神経芽細胞腫、中枢神経系がん、神経内分泌腫瘍、咽頭がん、鼻咽頭がん、食道がん、甲状腺がん、悪性胸膜中皮腫、肺がん、乳がん、肝がん、肝胆がん、膵臓がん、胃がん、消化管がん、腸がん、結腸がん、結腸直腸がん、腎がん、明細胞腎細胞がん、卵巣がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、膀胱がん、前立腺がん、精巣がん、皮膚がん、黒色腫、白血病、リンパ腫、骨がん、軟骨肉腫、骨髄腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、クルッケンベルグ腫瘍、骨髄増殖性腫瘍、扁平上皮がん、ユーイング肉腫、全身性軽鎖アミロイドーシス及びメルケル細胞がんが好ましく、より好ましくは、前記リンパ腫は、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、縦隔原発大細胞型B細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、T細胞/組織球に富む大細胞型B細胞リンパ腫及びリンパ形質細胞性リンパ腫から選ばれ、前記肺がんは、非小細胞肺がんと小細胞肺がんから選ばれ、前記白血病は、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、リンパ性白血病、リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病及び骨髄細胞白血病から選ばれる。

活性化合物（例えば、本開示に記載のリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩）を、任意の適切な経路による投与に適する形態に作成することができ、活性化合物は、単位用量の形態、又は被験者が単剤で自己投与できるような形態を採用するであることが好ましい。本開示の単位用量の形態は、トローチ、カプセル、カシェ剤、瓶詰めの薬液、ドラッグパウダー、顆粒剤、錠剤、坐剤、再生粉末又は液体製剤であってもよい。

本開示に係る治療法に使用される活性化合物又は組成物の投与量は、一般的に、疾患の重症度、被験者の体重及び活性化合物の効能によって変化する。しかし、一般的な目安として、好適な単位用量は0.1 mg～1000 mgであってもよい。

本開示に係る薬物組成物は、活性化合物の他に、1種又は複数種の添加物が含まれてもよく、前記添加物は、充填剤、希釈剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤又は賦形剤などの成分から選ばれる。投与の方法によって、組成物は0.1～99重量%の活性化合物を含んでもよい。

本開示によるClaudin18.2抗体及び抗体薬物複合体は、細胞表面抗原との良好な親和力、良好な細胞エンドサイトーシス効率及び強い腫瘍阻害効率を有するとともに、より広い薬物応用用途を有し、臨床的な薬物応用に適する。

ヒト化抗体の細胞レベルでのヒトClaudin18.2との結合のFACS検出結果である。ヒト化抗体のNUGC4細胞エンドサイトーシス実験である。 Claudin18.2発現レベルが異なるNUGC4細胞における抗体のADCC効果検出である。図3Aは、野生型NUGC4細胞（Claudin18.2低発現）における抗体のADCC効果検出であり、図3Bは、Claudin18.2中等度発現NUGC4細胞における抗体のADCC効果検出であり、図3Cは、Claudin18.2高発現NUGC4細胞における抗体のADCC効果検出である。本開示のＡＤＣ－１の腫瘍阻害実験結果である。本開示のADC-2の腫瘍阻害実験結果である。

一、用語
別途に制限のない限り、本願に使用される全ての技術と科学用語の全ては、当業者により一般的に理解されているものと一致している。本願中の記載と類似又は同等の任意の方法と材料により本開示を実施又は試験してもよいが、本願には、好ましい方法と材料が記載されている。本開示を記載及び特許請求する時には、以下の定義に従って下記の用語を使用する。

本開示において商品名が使用される時には、当該商品名の製品の製剤、当該商品名の製品の非特許薬及び活性薬物部分を含むことが意図されている。

逆の説明の無い限り、明細書及び特許請求の範囲に使用される用語は、下記の意味を有する。

用語「薬物」とは、体の生理学的機能及び病理学的状態を変更又は究明することができ、疾患の予防、診断及び治療に適用可能な化学物質である。薬物は、細胞毒性薬物を含む。薬物と毒物の間には厳しい限界がなく、毒物とは、小さい用量だけで体に毒性作用を及ぼし、人体の健康を害する化学物質であり、任意の薬物も用量が大きすぎると、毒性反応が発生され得る。細胞毒性薬物とは、細胞の機能を阻害又は防止し、及び/又は細胞の死亡や破壊を引き起こす物質である。細胞毒性薬物は、原則的に、十分な濃度で腫瘍細胞を死滅させることができるが、特異性が欠けているため、腫瘍細胞を殺傷すると同時に、正常な細胞のアポトーシスも招き、重篤な副作用を引き起こすことになってしまう。細胞毒性薬物は、細菌、真菌、植物や動物由来の小分子毒素又は酵素活性毒素のような毒素、放射性同位体（例えば、At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²及びLuの放射性同位体）、毒素薬物、化学療法薬、抗生物質及び核酸分解酵素を含む。

用語「リンカーユニット」「リンカー」又は「接続断片」とは、一端がリガンド（例えば、抗体又はその抗原結合断片）に接続され、他端が薬物に接続された化学構造断片又は結合であり、他のリンカーに接続された後、薬物に接続されてもよい。

リンカーは、1種又は複数種のリンカー要素を含んでもよい。例示的なリンカー要素は、6-マレイミドカプロイル（「MC」）、マレイミドプロピオニル（「MP」）、バリン-シトルリン（「val-cit」又は「vc」）、アラニン-フェニルアラニン（「ala-phe」）、p-アミノベンジルオキシカルボニル（「PAB」）、N-スクシンイジル4-（2-ピリジルチオ）ペンタノエート（「SPP」）、N-スクシンイミジル4-（N-マレイミドメチル）シクロヘキサン-1-カルボン酸エステル（「SMCC」、本願には、「MCC」とも称する）及びN-スクシンイミジル（4-ヨード-アセチル）アミノベンゾエート（「SIAB」）を含む。リンカーは、伸長体、スペーサー及びアミノ酸単位を含んでもよく、例えばUS2005-0238649A1に記載されたような、本分野で知られている方法により合成することができる。リンカーは、細胞で薬物を放出しやすくする「切断可能リンカー」であってもよい。例えば、酸不安定性リンカー（例えば、ヒドラゾン）、プロテアーゼ感受性（例えば、ペプチターゼ感受性）リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー、又はジスルフィド含有リンカー（Chariら, Cancer Research 52：127-131（1992）、米国特許No. 5, 208, 020）を使用してもよい。

略語
リンカーユニットは、下記を含むが、これらに限定されない：
下記の構造であるMC＝6-マレイミドカプロイル：

Val-Cit又は「vc」＝バリン-シトルリン（プロテアーゼ切断可能リンカーにおける例示的なジペプチド）、
シトルリン＝2-アミノ-5-ウレイドペンタン酸、
PAB＝p-アミノベンジルオキシカルボニル（「自己犠牲」リンカー要素の例）、
Me-Val-Cit＝N-メチル-バリン-シトルリン（ただし、カテプシンBにより切断されないように、リンカーペプチド結合は修飾されている）、
MC（PEG）6-OH＝マレイミドカプロイル-ポリエチレングリコール（抗体システインに付着可能）、
SPP＝N-スクシンイミジル4-（2-ピリジルチオ）ペンタノエート、
SPDP＝N-スクシンイミジル3-（2-ピリジルジチオ）プロピオネート、
SMCC＝スクシンイミジル-4-（N-マレイミドメチル）シクロヘキサン-1-カルボン酸エステル、及び
IT＝イミノチオラン。

用語「リガンド-薬物複合体」とは、リガンドが接続ユニットにより生物活性を有する薬物に接続されたものである。本開示における「リガンド-薬物複合体」は、抗体-薬物複合体（antibody drug conjugate、ADC）が好ましく、モノクローナル抗体又は抗体断片を、接続ユニットにより生物活性を有する毒性薬物に接続するものである。抗体は、直接的に、又はリンカーを介して薬物に複合されてもよい。それぞれの抗体の平均薬物モジュール数（平均薬物荷重又は薬物負荷量であり、n値で表されてよい）は、その範囲として、例えば、それぞれの抗体が約0個～約20個の薬物モジュールに複合されてもよく、いくつかの実施形態では、それぞれの抗体が1個～約10個の薬物モジュールに複合され、いくつかの実施形態では、それぞれの抗体が1個～約8個の薬物モジュールに複合される。

用語「平均薬物荷重」又は「薬物負荷量」とは、リガンド-薬物複合体分子におけるそれぞれのリガンドに負荷された細胞毒性薬物の平均数量であり、薬物量と抗体量との比率で表されてよく、薬物負荷量の範囲としては、それぞれのリガンド（Pc）が0～12個、好ましくは、1～10個の細胞毒性薬物に接続されてもよい。本開示の実施形態において、薬物負荷量は、nで表され、DAR（Drug-antibody Ratio）値と称されてもよく、nは、0～12の非ゼロ整数又は小数であってもよく、好ましくは、1～10の整数又は小数であり、さらに好ましくは2～8であり、整数であってもよく、小数であってもよく、最も好ましくは3～8であり、整数であってもよく、小数であってもよい。例示的には、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10の平均値である。UV/可視分光法、質量分析、ELISA試験及びHPLCのような通常の方法で、カップリング反応後のそれぞれのADC分子の薬物平均数量を特徴づけることができる。

本開示に用いられるアミノ酸の3文字コードと1文字コードは、J.biol.chem, 243, p3558（1968）に記載された通りである。

クローディン18（CLD18）分子（Genbank登録番号：スプライス変異体1（CLD18A1）：NP_057453、NM016369及びスプライス変異体2（CLD18A2又はClaudin18.2）：NM_001002026、NP_001002026）は、内在性膜貫通タンパク質であり、上皮と内皮との密着結合に位置する。密着結合には、オクルディン（occludin）とクローディンは、最も主要な膜貫通タンパク質成分である。クローディンの強い細胞間接着特性のために、溶質の傍細胞転送を防止・制御し、膜脂質とタンパク質の側方向拡散を制限することで細胞極性を維持する一次バリアが生成される。密着結合になったタンパク質は、上皮の組織構造に関与している。報告によると、これらのタンパク質は、構造が良好な上皮では抗体に接近することがほぼできないが、腫瘍細胞では暴露することになる。

用語「抗体」とは、免疫グロブリンであり、2つの重鎖と2つの軽鎖が鎖間ジスルフィド結合により接続されてなるテトラペプチド鎖構造である。免疫グロブリンは、免疫グロブリン重鎖定常領域のアミノ酸組成と配列順序によって、5種類に分けられ、又はIgM、IgD、IgG、IgA及びIgEという免疫グロブリンのアイソタイプと称されてもよく、その対応する重鎖は、それぞれμ鎖、δ鎖、γ鎖、α鎖及びε鎖である。同一種類のIgは、そのヒンジ領域のアミノ酸組成及び重鎖ジスルフィド結合の数と位置の差によって、異なるサブクラスにさらに分けることができ、例えば、IgGは、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4に分けられてもよい。軽鎖は、定常領域によって、κ鎖又はλ鎖に分けられる。5種類のIgにおけるそれぞれは、κ鎖又はλ鎖を有してもよい。

全長抗体重鎖及び軽鎖は、N末端に近い約110個のアミノ酸の配列の変化が大きくて、可変領域（Fv領域）となり、C末端に近い残りのアミノ酸配列が比較的に安定的で、定常領域となる。可変領域は、3つの高変領域（HVR）と、4つの配列が比較的に保存的な骨格領域（FR）とを含む。3つの高変領域は、抗体の特異性を決定し、相補性決定領域（CDR）とも称される。それぞれの軽鎖可変領域（LCVR）及び重鎖可変領域（HCVR）は、3つのCDR領域と、4つのFR領域とからなり、アミノ基末端からカルボキシ基末端へ、FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順に配列されている。軽鎖の3つのCDR領域とは、LCDR1、LCDR2及びLCDR3であり、重鎖の3つのCDR領域とは、HCDR1、HCDR2及びHCDR3である。

用語「完全ヒト化抗体」「完全ヒト抗体」又は「全ヒト抗体」は、「全ヒトモノクローナル抗体」とも称され、その抗体の可変領域と定常領域は何れもヒト由来のものである。モノクローナル抗体の発展は、それぞれ、マウスモノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体及び全ヒトモノクローナル抗体という4つの段階を経た。全ヒト抗体の調製に関連する技術は、主に、ヒトハイブリドーマ技術、EBVによるBリンパ球の形質転換技術、ファージディスプレイ技術（phage display）、トランスジェニックマウス抗体調製技術（transgenic mouse）及び単一B細胞抗体調製技術などがある。

用語「抗原結合断片」とは、抗原と結合する能力を保つ抗体の1つ又は複数の断片である。全長抗体の断片により抗体の抗原結合機能を果たすことができることが示されている。「抗原結合断片」に含まれた結合断片は、Fab、Fab'、F（ab'）2、単鎖抗体（scFv）、二量化のV領域（二重抗体）、ジスルフィド結合安定化のV領域（dsFv）及びCDRを含むペプチドの抗原結合断片から選ばれ、例としては、（i）VL、VH、CL及びCH1ドメインからなる1価断片であるFab断片、（ii）ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋により接続された2つのFab断片を含む2価断片であるF（ab'）₂断片、（iii）VHとCH1ドメインからなるFd断片、（iv）抗体の単アームのVHとVLドメインからなるFv断片、（v）VHドメインからなる単一ドメイン又はdAb断片（Wardら, （1989）Nature341：544-546）、及び（vi）分離した相補性決定領域（CDR）又は（vii）合成されたリンカーにより任意に接続された2つ以上の分離したCDRの組合せを含む。また、Fv断片の2つのドメインであるVL及びVHは、分離した遺伝子でコードされるが、組換え法で、合成されたリンカーでそれらを接続することにより、その中のVL及びVH領域のためにペアリングして1価分子を形成する単一のタンパク質鎖（単鎖Fv（scFv）と称され、例えば、Birdら（1988）Science242：423-426、及びHustonら（1988）Proc. Natl. Acad. Sci USA85：5879-5883を参照）を生成することができる。このような単鎖抗体も、用語である抗体の「抗原結合断片」に含まれようとしている。当業者に知られている通常の技術により、このような抗体断片が得られ、また、完全な抗体と同様に、機能性によって断片が選別される。抗原結合部分は、組換えDNA技術により、又は、完全な免疫グロブリンを酵素的又は化学的に切断することで生成することができる。抗体は、例えば、IgG（例えば、IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4サブタイプ）、IgA1、IgA2、IgD、IgE又はIgM抗体のような異なるアイソタイプの抗体であってもよい。

通常、Fabは、プロテアーゼであるパパイン（例えば、H鎖を切断する224位のアミノ酸残基）でIgG抗体分子を処理することにより得られた断片における、約50, 000の分子量を有して抗原結合活性を有する抗体断片であり、そのうち、H鎖N末端側の部分とL鎖は、ジスルフィド結合により一緒に結合される。

通常、F（ab'）2は、酵素であるペプシンでIgGヒンジ領域におけるジスルフィド結合の下方部分を消化することにより得られ、その分子量が約100, 000で、抗原結合活性を有し、ヒンジにて接続された2つのFab領域を含む抗体断片である。

通常、Fab'は、上記F（ab'）2のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することで得られた、分子量が約50,000で抗原結合活性を有する抗体断片である。

また、Fab'断片をコードするDNAを、原核生物発現ベクター又は真核生物発現ベクターに挿入し、ベクターを原核生物又は真核生物に導入することにより、Fab'を発現して前記Fab'を産生することができる。

用語「単鎖抗体」、「単鎖Fv」又は「scFv」とは、リンカーにより接続された抗体重鎖可変ドメイン（又はVH）と抗体軽鎖可変ドメイン（又はVL）を含む分子である。このようなscFv分子は、NH₂-VL-リンカー-VH-COOH又はNH₂-VH-リンカー-VL-COOHという一般的な構造を有してもよい。好適な従来技術のリンカーは、反復のGGGGSアミノ酸配列又はその変異体からなり、例えば、1～4個の反復変異体（Holligerら（1993）, Proc. Natl. Acad. Sci. USA90：6444-6448）が用いられる。本開示に用いられる他のリンカーは、Alfthanら（1995）, Protein Eng. 8：725-731、Choiら（2001）, Eur. J. Immuno l. 31：94-106、Huら（1996）, Cancer Res. 56：3055-3061、Kipriyanovら（1999）, J. Mol. Biol. 293：41-56及びRooversら（2001）, Cancer Immunol. に記載されている。

用語「CDR」とは、抗体の可変ドメインにおいて主に抗原結合を促進する6つの高変領域の一つである。通常、それぞれの重鎖可変領域には、3つのCDR（HCDR1、HCDR2、HCDR3）があり、それぞれの軽鎖可変領域には、3つのCDR（LCDR1、LCDR2、LCDR3）がある。各種の周知方案のうちの何れか1種により、CDRのアミノ酸配列の境界を決定することができる。前記6つのCDRの最も常用の定義の一つは、Kabat E. A. ら, （1991）Sequences of proteins of immunological interest. NIH Publication 91-3242）によって提供されている。本願に使用されるように、CDRのKabatによる定義は、軽鎖可変ドメインのCDR1、CDR2、CDR3、及び重鎖可変ドメインのCDR2とCDR3のみに応用される。さらに、「Chothia」番号付け規則、「ABM」番号付け規則、「contact」番号付け規則（Martin, ACR. Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains[J]. 2001）及びImMunoGenTics（IMGT）番号付け規則（Lefranc M.P., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77（2003）などが含まれる。

用語「抗体フレームワーク」とは、可変ドメインVL又はVHの一部であり、当該可変ドメインの抗原結合ループ（CDR）の足場として用いられる。実質的に、それは、CDRを有しない可変ドメインである。

用語「エピトープ」又は「抗原決定基」とは、抗原上の免疫グロブリン又は抗体によって結合された部位である。エピトープは、通常、独特な空間配座で少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14又は15個の連続又は不連続のアミノ酸を含む。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular B iology, 第66巻, G. E. Morris, Ed. （1996）を参照する。

用語「特異的結合」、「選択的結合」、「選択的に結合」及び「特異的に結合」とは、抗体による予め決定された抗原上のエピトープへの結合である。通常、抗体は、約10^-7 M未満、例えば、約10^-8 M、10^-9 M若しくは10^-10 M未満又はそれ以下の親和力（KD）で結合される。

用語「KD」とは、抗体ー抗原が互いに作用する解離平衡定数である。通常、本開示の抗体（又は抗原結合断片）は、約10^-7 M未満、例えば、約10^-8 M又は10^-9 M未満の解離平衡定数（KD）でClaudin18.2（又はそのエピトープ）と結合し、例えば、本開示において、抗体と細胞表面抗原の親和力は、FACS法でKD値を測定する。

用語「核酸分子」とは、DNA分子又はRNA分子である。核酸分子は、単鎖又は二本鎖であってもよいが、二本鎖DNAが好ましい。核酸を別の核酸配列と共に機能的関係に置く場合に、核酸は「効果的に接続」である。例えば、プロモーター又はエンハンサーがコード配列の転写に影響を与えると、プロモーター又はエンハンサーは、前記コード配列に効果的に接続されている。

アミノ酸配列の「同一性」とは、アミノ酸配列のアライメント過程において、配列同一性のパーセンテージが最も大きく達成されるように、必要な時にギャップを導入し、且つ、任意の保存的置換も配列同一性の一部とは見なされずに、第1配列における第2配列中のアミノ酸残基と同様のアミノ酸残基のパーセンテージである。アミノ酸の配列同一性のパーセンテージを測定するために、アラインメントは、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2又はMegalign（DNASTAR）ソフトウェアなどの公的に取得可能なコンピュータソフトウェアなどの、本分野の技術的範囲における複数の方式により実現することができる。当業者は、比較される配列の全長で最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントの測定に適用されるパラメータを決定することができる。

用語「発現ベクター」とは、それに接続された別の核酸を輸送可能な核酸分子である。一実施形態において、ベクターは「プラスミド」であり、他のDNAセグメントをそれに接続可能な環状二本鎖DNA環を指す。別の実施形態において、ベクターは、他のDNAセグメントをウイルスゲノムに接続可能なウイルスベクターである。本願に開示されたベクターは、それらを導入した宿主細胞において自己複製することができ（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム性哺乳動物ベクター）、又は、宿主細胞に導入された後、宿主細胞のゲノムに整合されることで、宿主ゲノムと共に複製することができる（例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター）。

従来の技術においてよく知られている抗体及び抗原結合断片を産生・精製する方法は、例えば、冷泉港の抗体実験技術マニュアルの5～8章及び15章の通りである。抗原結合断片は同様に、通常の方法により調製することができる。発明に記載の抗体又は抗原結合断片は、遺伝子工学的方法により、非ヒトのCDR領域に1つ又は複数のヒトFR領域が加えられる。ヒトFR生殖細胞系配列は、IMGTヒト抗体可変領域生殖細胞系遺伝子データベースとMOEソフトウェアをアラインメントすることにより、ImMunoGeneTics（IMGT）のホームページであるhttp://imgt.cines.frから取得し、又は免疫グロブリン雑誌Lefranc, G., The Immunoglobulin FactsBook, Academic Press, 2001ISBN012441351から取得することができる。

用語「宿主細胞」とは、発現ベクターが既に導入された細胞である。宿主細胞は、細菌、微生物、植物又は動物の細胞を含んでもよい。形質転換しやすい細菌は、大腸菌（Escherichia coli）やサルモネラ菌（Salmonella）の菌株などの腸内細菌科（enterobacteriaceae）のメンバー、枯草菌（Bacillus subtilis）などのバシラス科（Bacillaceae）、肺炎球菌（Pneumococcus）、連鎖球菌（Streptococcus）及びインフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）を含む。好適な微生物は、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）及びピキア酵母（Pichia pastoris）を含む。好適な動物宿主細胞系は、CHO（チャイニーズハムスター卵巣細胞系）及びNS0細胞を含む。

本開示の工学的な抗体又は抗原結合断片は、通常の方法により調製・精製することができる。例えば、重鎖及び軽鎖をコードするcDNA配列は、クローンして発現ベクターに組換えることができる。組換えた免疫グロブリン発現ベクターは、宿主細胞を安定してトランスフェクションすることができる。さらに好ましい従来技術の一つとして、哺乳動物発現系は、特にFc領域のN末端部位において、抗体のグリコシル化を引き起こすことになる。陽性クローンは、バイオリアクターの培地において培養を拡大することで、抗体を産生する。抗体を分泌した培養液は、通常の技術により精製することができる。例えば、A又はG Sepharose FFカラムで精製する。非特異的に結合した成分を洗い流す。そして、pH勾配法により結合した抗体を溶離し、SDS-PAGEで抗体断片を検出し、収集する。抗体は、通常の方法によりろ過濃縮することができる。可溶性の混合物及び多量体は、分子ふるい、イオン交換などの通常の方法により除去してもよい。得られた生成物は、直ちに例えば、-70℃で冷凍し、又は凍結乾燥しなければならない。

用語「ペプチド」とは、アミノ酸とタンパク質との間に介在する化合物断片であり、2つ以上のアミノ酸分子がペプチド結合により互いに接続されてなり、タンパク質の構造・機能的断片である。

用語「糖」とは、C、H、Oの3つの元素からなる生体高分子であり、単糖、二糖と多糖などに分けられてもよい。

用語「アルキル基」とは、飽和脂肪族炭化水素基であり、1～20個の炭素原子を含む直鎖又は分岐鎖基であり、1～12個の炭素原子を含むアルキル基が好ましく、1～10個の炭素原子を含むアルキル基がさらに好ましく、1～6個の炭素原子を含む（1個、2個、3個、4個、5個又は6個の炭素原子を含む）アルキル基が最も好ましい。非限定的な例は、メチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、イソブチル基、tert-ブチル基、sec-ブチル基、n-ペンチル基、1,1-ジメチルプロピル基、1,2-ジメチルプロピル基、2,2-ジメチルプロピル基、1-エチルプロピル基、2-メチルブチル基、3-メチルブチル基、n-ヘキシル基、1-エチル-2-メチルプロピル基、1,1,2-トリメチルプロピル基、1,1-ジメチルブチル基、1,2-ジメチルブチル基、2,2-ジメチルブチル基、1,3-ジメチルブチル基、2-エチルブチル基、2-メチルペンチル基、3-メチルペンチル基、4-メチルペンチル基、2,3-ジメチルブチル基、n-ヘプチル基、2-メチルヘキシル基、3-メチルヘキシル基、4-メチルヘキシル基、5-メチルヘキシル基、2,3-ジメチルペンチル基、2,4-ジメチルペンチル基、2,2-ジメチルペンチル基、3,3-ジメチルペンチル基、2-エチルペンチル基、3-エチルペンチル基、n-オクチル基、2,3-ジメチルヘキシル基、2,4-ジメチルヘキシル基、2,5-ジメチルヘキシル基、2,2-ジメチルヘキシル基、3,3-ジメチルヘキシル基、4,4-ジメチルヘキシル基、2-エチルヘキシル基、3-エチルヘキシル基、4-エチルヘキシル基、2-メチル-2-エチルペンチル基、2-メチル-3-エチルペンチル基、n-ノニル基、2-メチル-2-エチルヘキシル基、2-メチル-3-エチルヘキシル基、2,2-ジエチルペンチル基、n-デシル基、3,3-ジエチルヘキシル基、2,2-ジエチルヘキシル基、及びその様々な分岐鎖異性体などを含む。より好ましくは、1～6個の炭素原子を含む低級アルキル基であり、その非限定的な実施例は、メチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、イソブチル基、tert-ブチル基、sec-ブチル基、n-ペンチル基、1,1-ジメチルプロピル基、1,2-ジメチルプロピル基、2,2-ジメチルプロピル基、1-エチルプロピル基、2-メチルブチル基、3-メチルブチル基、n-ヘキシル基、1-エチル-2-メチルプロピル基、1,1,2-トリメチルプロピル基、1,1-ジメチルブチル基、1,2-ジメチルブチル基、2,2-ジメチルブチル基、1,3-ジメチルブチル基、2-エチルブチル基、2-メチルペンチル基、3-メチルペンチル基、4-メチルペンチル基、2,3-ジメチルブチル基などを含む。アルキル基は、置換されても、置換されなくてもよく、置換される場合に、置換基は任意の利用可能な接続部位で置換されてもよく、前記置換基は、独立的に、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルアミノ基、ハロゲン、メルカプト基、ヒドロキシ基、ニトロ基、シアノ基、シクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、シクロアルコキシ基、ヘテロシクロアルコキシ基、シクロアルキルチオ基、ヘテロシクロアルキルチオ基及びオキソ基から選ばれる1つ又は複数の基であることが好ましい。

用語「ヘテロアルキル基」とは、N、O又はSから選ばれる1つ又は複数のヘテロ原子を含むアルキル基であり、そのうち、アルキル基は、上記に定義された通りである。

用語「アルキレン基」とは、アルカン母体の同じ炭素原子又は2つの異なる炭素原子から2つの水素原子を除去して誘導される2つの残基を有する飽和の直鎖又は分岐鎖の脂肪族炭化水素基であり、1～20個の炭素原子を含む直鎖又は分岐鎖基であり、好ましくは1～12個の炭素原子を含み、さらに好ましくは1～6個の炭素原子を含む（1個、2個、3個、4個、5個又は6個の炭素原子を含む）アルキレン基である。アルキレン基の非限定的な実例は、メチレン（-CH₂-）、1,1-エチリデン（-CH（CH₃）-）、1,2-エチリデン（-CH₂CH₂）-、1,1-プロピリデン（-CH（CH₂CH₃）-）、1,2-プロピリデン（-CH₂CH（CH₃）-）、1,3-プロピリデン（-CH₂CH₂CH₂-）、1,4-ブチリデン（-CH₂CH₂CH₂CH₂-）及び1,5-ブチリデン（-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-）などを含むが、これらに限定されない。アルキレン基は、置換されても、置換されなくてもよく、置換される場合に、置換基は任意の利用可能な接続部位で置換されてもよく、前記置換基は、独立的に、任意にアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルアミノ基、ハロゲン、メルカプト基、ヒドロキシ基、ニトロ基、シアノ基、シクロアルキル基、ヘテロシクリル基、アリール基、ヘテロアリール基、シクロアルコキシ基、ヘテロシクロアルコキシ基、シクロアルキルチオ基、ヘテロシクロアルキルチオ基及びオキソ基から選ばれる1つ又は複数の置換基で置換されることが好ましい。

用語「アルコキシ基」とは、-O-（アルキル基）及び-O-（非置換のシクロアルキル基）であり、そのうち、アルキル基又はシクロアルキル基の定義は、上記の通りである。アルコキシ基の非限定的な例は、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基、シクロプロポキシ基、シクロブトキシ基、シクロペンチルオキシ基、シクロヘキシルオキシ基を含む。アルコキシ基は、任意に置換されても、置換されなくてもよく、置換される場合に、置換基は、独立的に、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルアミノ基、ハロゲン、メルカプト基、ヒドロキシ基、ニトロ基、シアノ基、シクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、シクロアルコキシ基、ヘテロシクロアルコキシ基、シクロアルキルチオ基及びヘテロシクロアルキルチオ基から選ばれる1つ又は複数の基であることが好ましい。

用語「シクロアルキル基」とは、飽和又は部分的に不飽和の単環又は多環式の環状炭化水素置換基であり、シクロアルキル基環は、3～20個の炭素原子を含み、3～12個の炭素原子を含むことが好ましく、3～10個の炭素原子を含むことがさらに好ましく、3～8個の炭素原子を含む（3個、4個、5個、6個、7個又は8個の炭素原子を含む）ことが最も好ましい。単環式シクロアルキル基の非限定的な例は、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロペンテニル基、シクロヘキシル基、シクロヘキセニル基、シクロヘキサジエニル基、シクロヘプチル基、シクロヘプタトリエニル基及びシクロオクチル基などを含み、多環式シクロアルキル基は、スピロ環、縮合環及び架橋環のシクロアルキル基を含む。

用語「ヘテロシクリル基」とは、飽和又は部分的に不飽和の単環又は多環式の環状炭化水素置換基であり、3～20個の環原子を含み、そのうち、1つ又は複数の環原子は、窒素、酸素又はS（O）_m（ただし、mは、整数である0、1又は2である）から選ばれるヘテロ原子であるが、-O-O-、-O-S-又は-S-S-の環部分を含まず、残りの環原子は炭素である。3～12個の環原子を含み、その中の1～4個がヘテロ原子（1個、2個、3個又は4個のヘテロ原子）であることが好ましく、シクロアルキル基環が3～10個の環原子を含む（3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個又は10個の環原子を含む）ことがさらに好ましい。単環式ヘテロシクリル基の非限定的な例は、ピロリジニル基、ピペリジニル基、ピペラジニル基、モルホリニル基、チオモルホリニル基、ホモピペラジニル基などを含む。多環式ヘテロシクリル基は、スピロ環、縮合環及び架橋環のヘテロシクリル基を含む。

用語「スピロヘテロシクリル基」とは、5～20員の単環の間が1つの原子（スピロ原子と称する）を共有する多環式ヘテロシクリル基であり、そのうち、1つ又は複数の環原子は窒素、酸素又はS（O）_m（ただし、mは、0～2の整数である）から選ばれ、残りの環原子は炭素である。それは1つ又は複数の二重結合を含んでもよいが、完全に共役したπ電子系を有する環は1つもない。6～14員が好ましく、7～10員がより好ましい。スピロヘテロシクリル基は、環と環の間の共有するスピロ原子の数によって、モノスピロヘテロシクリル基、ビススピロヘテロシクリル基又はポリスピロヘテロシクリル基に分けられ、好ましくは、モノスピロヘテロシクリル基とビススピロヘテロシクリル基である。より好ましくは、4員/4員、4員/5員、4員/6員、5員/5員又は5員/6員のモノスピロヘテロシクリル基である。スピロヘテロシクリル基の非限定的な例は、

を含む。

用語「縮合ヘテロシクリル基」とは、5～20員で、系内の各環が系内の他の環と、隣接する1対の原子を共有する多環式ヘテロシクリル基であり、1つ又は複数の環は、1つ又は複数の二重結合を含んでもよいが、完全に共役したπ電子系を有する環は1つもなく、そのうち、1つ又は複数の環原子は、窒素、酸素、又はS（O）_m（ただし、mは、整数である0、1又は2である）から選ばれるヘテロ原子であり、残りの環原子は炭素である。6～14員が好ましく、7～10員（7員、8員、9員又は10員）がより好ましい。構成環の数によって、二環式、三環式、四環式又は多環式の縮合ヘテロシクリル基に分けられてもよく、好ましくは、二環式又は三環式であり、より好ましくは、5員/5員又は5員/6員の二環式縮合ヘテロシクリル基である。縮合ヘテロシクリル基の非限定的な例は、

を含む。

用語「架橋ヘテロシクリル基」とは、5～14員で、任意の2つの環が2つの直接的に接続されていない原子を共有する多環式ヘテロシクリル基であり、1つ又は複数の二重結合を含んでもよいが、完全に共役したπ電子系を有する環は1つもなく、そのうち、1つ又は複数の環原子は窒素、酸素、又はS（O）_m（ただし、mは、整数である0、1又は2である）から選ばれるヘテロ原子であり、残りの環原子は炭素である。6～14員が好ましく、7～10員（7員、8員、9員又は10員）がより好ましい。構成環の数によって、二環式、三環式、四環式又は多環式の架橋ヘテロシクリル基に分けられてもよく、好ましくは、二環式、三環式又は四環式であり、より好ましくは、二環式又は三環式である。架橋ヘテロシクリル基の非限定的な例は、

を含む。

前記ヘテロシクリル基環は、アリール基、ヘテロアリール基又はシクロアルキル基環に縮合してもよく、そのうち、母体構造に接続された環はヘテロシクリル基であり、その非限定的な例は、

などを含む。

ヘテロシクリル基は、任意に置換されても、置換されなくてもよく、置換される場合に、置換基は、独立的に、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルアミノ基、ハロゲン、メルカプト基、ヒドロキシ基、ニトロ基、シアノ基、シクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、シクロアルコキシ基、ヘテロシクロアルコキシ基、シクロアルキルチオ基、ヘテロシクロアルキルチオ基及びオキソ基から選ばれる1つ又は複数の基であることが好ましい。

用語「アリール基」とは、共役したπ電子系を有する6～14員の全炭素単環又は縮合多環（すなわち、隣接する炭素原子対を共有する環）基であり、好ましくは、6～10員（6員、7員、8員、9員又は10員）であり、例えば、フェニル基とナフチル基であり、好ましくは、フェニル基である。前記アリール基環は、ヘテロアリール基、ヘテロシクリル基又はシクロアルキル基環に縮合してもよく、そのうち、母体構造に接続された環はアリール基環であり、その非限定的な例は、

を含む。

アリール基は、置換されても、置換されなくてもよく、置換される場合に、置換基は、独立的に、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルアミノ基、ハロゲン、メルカプト基、ヒドロキシ基、ニトロ基、シアノ基、シクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、シクロアルコキシ基、ヘテロシクロアルコキシ基、シクロアルキルチオ基及びヘテロシクロアルキルチオ基から選ばれる1つ又は複数の基であることが好ましい。

用語「ヘテロアリール基」とは、1～4個のヘテロ原子（1個、2個、3個又は4個のヘテロ原子）、5～14個の環原子を含むヘテロ芳香族系であり、そのうち、ヘテロ原子は、酸素、硫黄及び窒素から選ばれる。ヘテロアリール基は、5～10員（5員、6員、7員、8員、9員又は10員のヘテロアリール基）が好ましく、5員又は6員がより好ましく、例えば、フラニル基、チエニル基、ピリジニル基、ピロリル基、N-アルキルピロリル基、ピリミジニル基、ピラジニル基、イミダゾリル基及びテトラゾリル基などである。前記ヘテロアリール基環は、アリール基、ヘテロシクリル基又はシクロアルキル基環に縮合してもよく、そのうち、母体構造に接続された環はへテロアリール基環であり、その非限定的な例は、

を含む。

ヘテロアリール基は、任意に置換されても、置換されなくてもよく、置換される場合に、置換基は、独立的に、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルアミノ基、ハロゲン、メルカプト基、ヒドロキシ基、ニトロ基、シアノ基、シクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、シクロアルコキシ基、ヘテロシクロアルコキシ基、シクロアルキルチオ基及びヘテロシクロアルキルチオ基から選ばれる1つ又は複数の基であることが好ましい。

用語「アミノ保護基」とは、分子の他の部位が反応する時に、アミノ基が変化されないように、除去され易い基でアミノ基を保護するものである。非限定的な実施例は、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル基、t-ブトキシカルボニル基、アセチル基、ベンジル基、アリル基及びp-メトキシベンジル基などを含む。これらの基は、任意にハロゲン、アルコキシ基又はニトロ基から選ばれる1～3個の置換基（1個、2個又は3個の置換基）で置換されてもよい。前記アミノ保護基は、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル基が好ましい。

用語「ハロゲン化アルキル基」とは、アルキル基上の水素が1つ又は複数のハロゲンで置換されたものであり、そのうち、アルキル基は、上記に定義された通りである。

用語「重水素化アルキル基」とは、アルキル基上の水素が1つ又は複数の重水素原子で置換されたものであり、そのうち、アルキル基は、上記に定義された通りである。

用語「ヒドロキシアルキル基」とは、アルキル基上の水素が1つ又は複数のヒドロキシ基で置換されたものであり、そのうち、アルキル基は、上記に定義された通りである。

用語「ヒドロキシ基」とは、-OH基である。

用語「ハロゲン」とは、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素である。

用語「アミノ基」とは、-NH₂である。

用語「ニトロ基」とは、-NO₂である。

用語「シアノ基」とは、-CNである。

用語「アミド基」とは、-C（O）N（アルキル基）又は（シクロアルキル基）であり、そのうち、アルキル基、シクロアルキル基は、上記に定義された通りである。

「任意」又は「任意に」とは、その後に説明される事象又は状況が発生されてもよいが、必ずしもそうとは限らないことを意味し、当該表現は、この事象又は状況が発生される場合と発生されない場合とを含む。例えば、「任意にアルキル基で置換されるヘテロシクリル基」とは、アルキル基が存在してもよいが、必ずしもそうとは限らないことを意味し、当該表現は、ヘテロシクリル基がアルキル基で置換される場合と、ヘテロシクリル基がアルキル基で置換されない場合とを含む。

「置換される」とは、基における1つ又は複数の水素原子、好ましくは多くとも5つ、より好ましくは、1つ、2つ又は3つの水素原子が、互いに独立的に置換基で置換される。置換基は、それらの化学的に可能な部位にしか位置せず、当業者は、あまり工夫せずに（実験又は理論により）可能又は不可能な置換を決定することができる。例えば、遊離水素を有するアミノ基又はヒドロキシ基が不飽和（例えば、オレフィン）結合を有する炭素原子に結合した場合は、不安定になる可能性がある。

用語「薬物組成物」は、1種又は複数種の本願に記載の化合物又はその生理学的/薬学的に利用可能な塩若しくはプロドラッグと他の化学成分の混合物、及び生理学的/薬学的に利用可能な担体と賦形剤などの他の成分を含むことを示す。薬物組成物は、生体への投与を促進し、活性成分の吸収に寄与してさらに生物活性を発揮するためのものである。

用語「薬学的に許容される塩」又は「薬学的に利用可能な塩」とは、本開示に係るリガンド-薬物複合体の塩、又は本開示に記載の活性化合物の塩であり、このような塩は、被験者に用いられる場合、安全性と有效性を有するとともに、所望の生物活性を有し、本開示のリガンド-薬物複合体は、少なくとも1つのアミノ基を含むため、酸と一緒に塩を形成することができ、薬学的に利用可能な塩の非限定的な例は、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、クエン酸塩、酢酸塩、コハク酸塩、アスコルビン酸塩、シュウ酸塩、硝酸塩、ソルビン酸塩、リン酸水素塩、リン酸二水素塩、サリチル酸塩、クエン酸水素塩、酒石酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩及びp-トルエンスルホン酸塩を含む。

本開示の一実施形態において、細胞毒性薬物は、接続ユニットにより抗体のメルカプト基に複合されている。
（1）接続試薬とモノクローナル抗体とのモル比を制御することと、
（2）反応時間と温度を制御することと、
（3）異なる反応試薬を選択することと、
を含む非限定的な方法でリガンド細胞毒性薬物複合体の負荷量を制御することができる。
一般的な薬物組成物の調製は、中国薬典に示されている。

用語「薬学的に許容される担体」とは、本開示の薬物に用いられるものとして、薬物の被験者への入り方と体内での分布を変更し、薬物の放出速度を制御し、薬物を標的器官に輸送することができる系である。薬物担体の放出と標的系により、薬物の分解と損失を低減し、副作用を低下させ、生体利用率を向上させることができる。例えば、担体としての高分子界面活性剤は、その独特な両親媒性構造のため、自己集合して様々な凝集体を形成することができ、好ましい例としては、例えば、ミセル、マイクロエマルション、ゲル、液晶、ベシクルなどである。これらの凝集体は、薬物分子を封入する能力を有するとともに、膜に対して良好な透過性を有し、良い薬物担体とすることができる。

用語「賦形剤」とは、薬物組成物における活性化合物以外の添加物であり、補助材料と称されてもよい。例えば、錠剤中の結合剤、充填剤、崩壊剤、潤滑剤、半固体製剤軟膏剤やクリーム剤中の基質部分、液体製剤中の防腐剤、酸化防止剤、矯味薬、芳香剤、共溶媒、乳化剤、溶解補助剤、浸透圧調整剤、着色剤などは、いずれも賦形剤と称されてもよい。

用語「希釈剤」は、充填剤とも称され、その主な用途は、錠剤の重量と体積を増加させることである。希釈剤を加えることにより、一定の体積の大きさが確保されるだけでなく、主成分の用量偏差が低減され、薬物の圧縮成形性などが改善される。錠剤の薬物が油性成分を含む場合、「乾燥」状態を保持し、錠剤の作成に寄与するために、吸収剤を加入して油性物を吸収する必要がある。例えば、澱粉、乳糖、カルシウムの無機塩、微結晶セルロースなどである。

薬物組成物は、滅菌注射用水溶液の形態であってもよい。使用される許容可能な溶媒と溶剤には、水、リンゲル液及び等張塩化ナトリウム溶液があってもよい。滅菌注射用製剤は、その活性成分が油相に溶解された滅菌注射用水中油型マイクロエマルジョンであってもよい。例えば、活性成分を大豆油とレシチンとの混合物に溶解する。次に、油溶液を水とグリセリンとの混合物に加入し、処理してマイクロエマルジョンを形成する。局所で大量に注射することにより、注射液又はマイクロエマルジョンを被験者の血流に注入することができる。又は、本開示に係る化合物の一定のサイクル濃度を維持できる方法で、溶液及びマイクロエマルジョンを投与することが好ましい。このような一定の濃度を維持するために、連続静脈投与装置を使用することができる。このような装置の例としては、Deltec CADD-PLUS. TM. 5400型の静脈注射ポンプである。

薬物組成物は、筋肉内及び皮下投与に使用される滅菌注射水又は油性懸濁液の形態であってもよい。当該懸濁液は、既知の技術に従って、上記のような適切な分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤を用いて調製することができる。滅菌注射用製剤は、無毒の胃腸外に許容可能な希釈剤又は溶剤において調製された滅菌注射溶液又は懸濁液、例えば、1,3-ブタンジオールにおいて調製された溶液であってもよい。また、滅菌固定油を溶剤又は懸濁媒体として都合よく用いることができる。このために、合成されたモノグリセリド又はジグリセリドを含む任意の配合用固定油を用いることができる。また、油酸などの脂肪酸は、注射剤を調製ことができる。

二、合成方法
合成の目的を達成するために、以下の合成技術案を採用する。
一般式（Pc-L_a-Y-D）で表される化合物の調製方法であって、それは、

Pcを還元した後、一般式（L_a-Y-D）とカップリング反応し、一般式（Pc-L_a-Y-D）で表される化合物を得るステップを含み、還元剤としては、TCEPが好ましく、特に、還元抗体上のジスルフィド結合が好ましく、
ただし、Pc、W、L²、L³、R¹、R²、R⁵～R⁷、m及びnは、一般式（Pc-L_a-Y-D）に定義された通りである。

以上の明細書には、本開示の1つ又は複数の実施形態の詳細が提出されている。本開示は、本願の記載と類似又は同様の任意の方法と材料により実施又は試験することができるが、以下、好ましい方法と材料を説明する。明細書と特許請求の範囲により、本開示の他の特徴、目的及び利点は明らかになる。明細書と特許請求の範囲において、文脈で特に明記しない限り、単数形は複数の指示対象を含む。別途に定義の無い限り、本願に用いられる技術と科学用語の全ては、当業者により理解されている一般的な意味をもっている。明細書に引用される特許と出版物の全ては、引用により組み込まれている。以下の実施例は、本開示の好ましい実施形態をより全面的に説明するために提出される。これらの実施例は、何れかの方式で、本開示の範囲を限定するものと考えるべきではなく、本開示の範囲は、特許請求の範囲により限定される。

一、抗体の調製
実施例1-1：claudin18.2高発現細胞株の構築
pCDH-hClaudin18.2レンチウイルス発現ベクタープラスミドとpVSV-G、pCMV-dR8.91レンチウイルス系パッケージングベクター用Lipofectamine 3000トランスフェクション試薬を、ウィルスパッケージング細胞293Tにトランスフェクションし、ウィルスを含有する培地上清を収集し、ろ過して超高速で遠心分離し、濃縮されたウィルスでヒト胃印環細胞がん細胞株NUGC4を感染させ、puromycinで2～3週間選別してから、FACSシングルセルソーティングを行った。
腫瘍IHC評価点数に基づき、Claudin18.2発現レベルを区別した。腫瘍IHC評価点数が3点である腫瘍Claudin18.2発現レベルに相当する細胞は、高発現細胞であり、腫瘍IHC評価点数が2点である腫瘍Claudin18.2発現レベルに相当する細胞は、中等度発現細胞である。FACSによりレンチウイルスに感染したNUGC4細胞表面のClaudin18.2発現を検出することによって、Claudin18.2発現量が高いNUGC4/hClaudin18.2モノクローナル細胞株を選び出した。同時に、FACSにより野生型NUGC4細胞表面のClaudin18.2発現を検出することによって、Claudin18.2発現量が中等度であるNUGC4クローナル細胞株を選び出したが、野生型NUGC4は、Claudin18.2低発現量細胞であった。
選び出されたモノクローナル細胞株を拡大培養し、冷蔵庫に凍結保存して後続の実験に備えた。

Claudin18.2 配列Genbank：NP_001002026：（SEQ ID NO：1）
MAVTACQGLGFVVSLIGIAGIIAATCMDQWSTQDLYNNPVTAVFNYQGLWRSCVRESSGFTECRGYFTLLGLPAMLQAVRALMIVGIVLGAIGLLVSIFALKCIRIGSMEDSAKANMTLTSGIMFIVSGLCAIAGVSVFANMLVTNFWMSTANMYTGMGGMVQTVQTRYTFGAALFVGWVAGGLTLIGGVMMCIACRGLAPEETNYKAVSYHASGHSVAYKPGGFKASTGFGSNTKNKKIYDGGARTEDEVQSYPSKHDYV；

Claudin18.2 DNA配列：（SEQ ID NO：2）
1 AGAATTGCGC TGTCCACTTG TCGTGTGGCT CTGTGTCGAC ACTGTGCGCC ACCATGGCCG
61 TGACTGCCTG TCAGGGCTTG GGGTTCGTGG TTTCACTGAT TGGGATTGCG GGCATCATTG
121 CTGCCACCTG CATGGACCAG TGGAGCACCC AAGACTTGTA CAACAACCCC GTAACAGCTG
181 TTTTCAACTA CCAGGGGCTG TGGCGCTCCT GTGTCCGAGA GAGCTCTGGC TTCACCGAGT
241 GCCGGGGCTA CTTCACCCTG CTGGGGCTGC CAGCCATGCT GCAGGCAGTG CGAGCCCTGA
301 TGATCGTAGG CATCGTCCTG GGTGCCATTG GCCTCCTGGT ATCCATCTTT GCCCTGAAAT
361 GCATCCGCAT TGGCAGCATG GAGGACTCTG CCAAAGCCAA CATGACACTG ACCTCCGGGA
421 TCATGTTCAT TGTCTCAGGT CTTTGTGCAA TTGCTGGAGT GTCTGTGTTT GCCAACATGC
481 TGGTGACTAA CTTCTGGATG TCCACAGCTA ACATGTACAC CGGCATGGGT GGGATGGTGC
541 AGACTGTTCA GACCAGGTAC ACATTTGGTG CGGCTCTGTT CGTGGGCTGG GTCGCTGGAG
601 GCCTCACACT AATTGGGGGT GTGATGATGT GCATCGCCTG CCGGGGCCTG GCACCAGAAG
661 AAACCAACTA CAAAGCCGTT TCTTATCATG CCTCAGGCCA CAGTGTTGCC TACAAGCCTG
721 GAGGCTTCAA GGCCAGCACT GGCTTTGGGT CCAACACCAA AAACAAGAAG ATATACGATG
781 GAGGTGCCCG CACAGAGGAC GAGGTACAAT CTTATCCTTC CAAGCACGAC TATGTGTAAT
841 GCTCTAAGAC CTCTCAGCAC GGGCGGAAGA AACTCCCGGA GAGCTCACCC AAAAAACAAG
901 GAGATCCCAT CTAGATTTCT TCTTGCTTTT GACTCACAGC TGGAAGTTAG AAAAGCCTCG
961 ATTTCATCTT TGGAGAGGCC AAATGGTCTT AGCCTCAGTC TCTGTCTCTA AATATTCCAC
1021 CATAAAACAG CTGAGTTATT TATGAATTAG AGGCTATAGC TCACATTTTC AATCCTCTAT
1081 TTCTTTTTTT AAATATAACT TTCTACTCTG ATGAGAGAAT GTGGTTTTAA TCTCTCTCTC
1141 ACATTTTGAT GATTTAGACA GACTCCCCCT CTTCCTCCTA GTCAATAAAC CCATTGATGA
1201 TCTATTTCCC AGCTTATCCC CAAGAAAACT TTTGAAAGGA AAGAGTAGAC CCAAAGATGT
1261 TATTTTCTGC TGTTTGAATT TTGTCTCCCC ACCCCCAACT TGGCTAGTAA TAAACACTTA
1321 CTGAAGAAGA AGCAATAAGA GAAAGATATT TGTAATCTCT CCAGCCCATG ATCTCGGTTT
1381 TCTTACACTG TGATCTTAAA AGTTACCAAA CCAAAGTCAT TTTCAGTTTG AGGCAACCAA
1441 ACCTTTCTAC TGCTGTTGAC ATCTTCTTAT TACAGCAACA CCATTCTAGG AGTTTCCTGA
1501 GCTCTCCACT GGAGTCCTCT TTCTGTCGCG GGTCAGAAAT TGTCCCTAGA TGAATGAGAA
1561 AATTATTTTT TTTAATTTAA GTCCTAAATA TAGTTAAAAT AAATAATGTT TTAGTAAAAT
1621 GATACACTAT CTCTGTGAAA TAGCCTCACC CCTACATGTG GATAGAAGGA AATGAAAAAA
1681 TAATTGCTTT GACATTGTCT ATATGGTACT TTGTAAAGTC ATGCTTAAGT ACAAATTCCA
1741 TGAAAAGCTC ACTGATCCTA ATTCTTTCCC TTTGAGGTCT CTATGGCTCT GATTGTACAT
1801 GATAGTAAGT GTAAGCCATG TAAAAAGTAA ATAATGTCTG GGCACAGTGG CTCACGCCTG
1861 TAATCCTAGC ACTTTGGGAG GCTGAGGAGG AAGGATCACT TGAGCCCAGA AGTTCGAGAC
1921 TAGCCTGGGC AACATGGAGA AGCCCTGTCT CTACAAAATA CAGAGAGAAA AAATCAGCCA
1981 GTCATGGTGG CCTACACCTG TAGTCCCAGC ATTCCGGGAG GCTGAGGTGG GAGGATCACT
2041 TGAGCCCAGG GAGGTTGGGG CTGCAGTGAG CCATGATCAC ACCACTGCAC TCCAGCCAGG
2101 TGACATAGCG AGATCCTGTC TAAAAAAATA AAAAATAAAT AATGGAACAC AGCAAGTCCT
2161 AGGAAGTAGG TTAAAACTAA TTCTTTAAAA AAAAAAAAAA GTTGAGCCTG AATTAAATGT
2221 AATGTTTCCA AGTGACAGGT ATCCACATTT GCATGGTTAC AAGCCACTGC CAGTTAGCAG
2281 TAGCACTTTC CTGGCACTGT GGTCGGTTTT GTTTTGTTTT GCTTTGTTTA GAGACGGGGT
2341 CTCACTTTCC AGGCTGGCCT CAAACTCCTG CACTCAAGCA ATTCTTCTAC CCTGGCCTCC
2401 CAAGTAGCTG GAATTACAGG TGTGCGCCAT CACAACTAGC TGGTGGTCAG TTTTGTTACT
2461 CTGAGAGCTG TTCACTTCTC TGAATTCACC TAGAGTGGTT GGACCATCAG ATGTTTGGGC
2521 AAAACTGAAA GCTCTTTGCA ACCACACACC TTCCCTGAGC TTACATCACT GCCCTTTTGA
2581 GCAGAAAGTC TAAATTCCTT CCAAGACAGT AGAATTCCAT CCCAGTACCA AAGCCAGATA
2641 GGCCCCCTAG GAAACTGAGG TAAGAGCAGT CTCTAAAAAC TACCCACAGC AGCATTGGTG
2701 CAGGGGAACT TGGCCATTAG GTTATTATTT GAGAGGAAAG TCCTCACATC AATAGTACAT
2761 ATGAAAGTGA CCTCCAAGGG GATTGGTGAA TACTCATAAG GATCTTCAGG CTGAACAGAC
2821 TATGTCTGGG GAAAGAACGG ATTATGCCCC ATTAAATAAC AAGTTGTGTT CAAGAGTCAG
2881 AGCAGTGAGC TCAGAGGCCC TTCTCACTGA GACAGCAACA TTTAAACCAA ACCAGAGGAA
2941 GTATTTGTGG AACTCACTGC CTCAGTTTGG GTAAAGGATG AGCAGACAAG TCAACTAAAG
3001 AAAAAAGAAA AGCAAGGAGG AGGGTTGAGC AATCTAGAGC ATGGAGTTTG TTAAGTGCTC
3061 TCTGGATTTG AGTTGAAGAG CATCCATTTG AGTTGAAGGC CACAGGGCAC AATGAGCTCT
3121 CCCTTCTACC ACCAGAAAGT CCCTGGTCAG GTCTCAGGTA GTGCGGTGTG GCTCAGCTGG
3181 GTTTTTAATT AGCGCATTCT CTATCCAACA TTTAATTGTT TGAAAGCCTC CATATAGTTA
3241 GATTGTGCTT TGTAATTTTG TTGTTGTTGC TCTATCTTAT TGTATATGCA TTGAGTATTA
3301 ACCTGAATGT TTTGTTACTT AAATATTAAA AACACTGTTA TCCTACAGTT。

実施例1-2：抗ヒトclaudin18.2モノクローナル抗体の産生
1 免疫
抗ヒトClaudin18.2モノクローナル抗体は、免疫マウスにより産生された。実験用SJL白いマウスは、雌で、6～8週齢（北京維通利華実験動物技術有限公司、動物生産ライセンス番号：SCXK（京）2012-0001）であった。飼育環境：SPF級。マウスを購入した後、実験室環境で1週間飼育し、12/12時間で明/暗周期を調節し、温度が20～25℃、湿度が40～60%であった。環境に馴化したマウスは、以下の方案で免疫した。免疫抗原は、huClaudin18.2-HEK293細胞（ヒトClaudin18.2プラスミドをトランスフェクションしたHEK-293安定トランスフェクション細胞株）であった。
免疫方案：細胞を初回免疫する前に、TiterMax^(R) Gold Adjuvant（Sigma Cat No. T2684）を0.1 mL/匹で、マウスの腹膜内（IP）に注射し、30分間後に、各マウスの腹膜内（IP）に、0.1 mLの生理食塩水で1×10⁸/mLの濃度に希釈した細胞液を注射した。細胞を均一に吹き散らした後、0、14、28、42、56日目に接種した。21、35、49、63日目に採血し、ELISA方法でマウスの血清中抗体価を決定した。4～5回目の免疫後に、血清中抗体価が高くて安定する傾向があるマウスを選択して脾細胞の融合を行った。脾細胞融合の3日前に、追加免疫を行い、腹膜内（IP）に1×10⁷の細胞を注射した。

2 脾細胞の融合
最適化されたPEG媒介の融合工程により、脾リンパ球と骨髄腫細胞Sp2/0細胞（ATCC^(R) CRL-8287^TM）を融合してハイブリドーマ細胞を得た。融合により得られたハイブリドーマ細胞は、0.5～1×10⁶/mLの密度で、完全培地（20%のFBS、1×HAT、1×OPIを含むIMDM培地）で再懸濁し、100 μL/ウェルで96ウェルプレートに播種し、37℃、5%のCO₂で3～4日間インキュベートした後、HAT完全培地を100 μL/ウェルで補充し、針先のようなクローンになるまで3～4日間培養し続けた。上清を除去し、200 μL/ウェルのHT完全培地（20%のFBS、1×HT、1×OPIを含むIMDM培地）を加え、37℃、5%のCO₂で3日間インキュベートした後、ELISA検出を行った。

3 ハイブリドーマ細胞の選別
ハイブリドーマ細胞成長の密度によって、結合ELISA方法で、ハイブリドーマ培養上清を検出した。huClaudin18.2-HEK293細胞との結合能力が強く、且つHEK293細胞との結合がない細胞を選択して適時に増幅して凍結保存し、単細胞クローンが得られるまで2～3回サブクローニングした。
細胞をサブクローニングするたびに、細胞結合実験で検出する必要もあった。以上の実験により選別してハイブリドーマクローナルを得て、無血清細胞培養法で抗体をさらに調製し、精製例に従って抗体を精製し、検出例での使用に備えた。

実施例1～3：マウス抗体のヒト化
体外活性が高いモノクローナルハイブリドーマ細胞株mAb1901、mAb1902を選び出し、その中のモノクローナル抗体配列をクローニングし、ヒト化、組換え発現及び活性評価を行った。
ハイブリドーマから配列をクローニングするプロセスは、以下の通りである。対数増殖期のハイブリドーマ細胞を収集し、Trizol（Invitrogen, 15596-018）でRNAを抽出し（試薬キットの取扱書での工程に従う）、逆転写した（PrimeScript^TM Reverse Transcriptase, Takara, cat # 2680A）。逆転写で得られたcDNAを、mouse Ig-Primer Set（Novagen, TB326 Rev.B 0503）でPCR増幅した後、シークエンシング社に送ってシークエンシングした。得られたハイブリドーマ細胞DNA配列に対応するアミノ酸配列は、SEQ ID NO：3～6で表される通りである。

mAb1901マウス重鎖可変領域（SEQ ID NO：3）
EVQLMESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSDYGIHWVRQAPEMGLEWIAYISRGSSTIYYADTVKGRFTMSRDNAKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARGGYDTRNAMDYWGQGTSVTVSS；

mAb1901マウス軽鎖可変領域（SEQ ID NO：4）
DIVMTQSPSSLSVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRASGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAIYHCQNDLYYPLTFGAGTKLELK；

mAb1902マウス重鎖可変領域（SEQ ID NO：5）
EVQLQESGAELVKPGASVKLSCKASGYIFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGMIHPNSGSTNYNEKFKGKATLTLDKSSSTAYMQLSSLPSEDSAVYYCARLKTGNSFDYWGQGTTLTVSS；

mAb1902マウス軽鎖可変領域（SEQ ID NO：6）
DIVLTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAIYYCQNAYTYPFTFGSGTKLEIK；

上記マウス重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、それぞれ、後述するヒトIgG1抗体の重鎖定常領域とヒトκ軽鎖定常領域に接続されてキメラ抗体であるch1901とch1902を形成した。
定常領域は、以下の配列から選ばれる。

ヒトIgG1抗体の重鎖定常領域：（SEQ ID NO：7）
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK；

ヒトκ軽鎖定常領域：（SEQ ID NO：8）
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC。

マウスモノクローナル抗体のヒト化は、本分野の多くの文献に開示された方法に従って行われた。つまり、親（マウス抗体）定常ドメインの代わりに、ヒト定常ドメインを用い、マウス抗体とヒト抗体の相同性に基づき、ヒト生殖細胞系配列を選択し、CDR移植を行った。本発明は、活性が良い候補分子を選択してヒト化し、その結果は、以下の通りである。

1、マウス抗体のCDR領域
表1中、VH/VL CDRのアミノ酸残基は、Kabat番号付けシステムによって決定されて注釈されている。
マウス抗体のCDR配列は、表1に示す通りである。

2、ヒト生殖細胞系FR領域配列の選択
得られたマウス抗体VH/VL CDRの典型的な構造を基にして、重・軽鎖可変領域配列を抗体Germlineデータベースと比較し、相同性が高いヒト生殖細胞系テンプレートを得た。その中で、ヒト生殖細胞系軽鎖フレームワーク領域は、ヒトκ軽鎖遺伝子から由来する。

2.1 mAb1901のヒト化改変及び復帰変異の設計
適切なヒト抗体生殖細胞系を選択し、mAb1901マウス抗体をヒト化改変し、マウス抗体mAb1901のCDR領域を、選択されたヒト化テンプレートに移植し、ヒト化可変領域を替え、さらにIgG定常領域と組換え、完全な抗体を形成した。同時に、ヒト化抗体のV領域におけるFR領域を復帰変異し、例示的な復帰変異形態及び組合せは、以下の通りである。

上記の表中、重鎖可変領域は、SEQ ID NO：7で表されるヒトIgG1重鎖定常領域に接続されて、全長抗体の重鎖を形成するのに対応して、軽鎖可変領域は、SEQ ID NO：8で表されるヒトκ軽鎖定常領域に接続されて、全長抗体の軽鎖を形成する。他の実施形態において、重鎖可変領域と軽鎖可変領域は、他の重鎖定常領域と軽鎖定常領域にそれぞれ接続されて、全長抗体を形成してもよい。

2.2 mAb1902のヒト化改変及び復帰変異の設計
適切なヒト抗体生殖細胞系を選択し、mAb1902マウス抗体をヒト化改変し、マウス抗体mAb1902のCDR領域を、選択されたヒト化テンプレートに移植し、ヒト化可変領域を替え、さらにIgG定常領域と組換え、完全な抗体を形成した。同時に、ヒト化抗体のV領域におけるFR領域を復帰変異し、例示的な復帰変異形態及び組合せは、以下の通りである。

上記の表中、重鎖可変領域は、SEQ ID NO：7で表されるヒトIgG1重鎖定常領域に接続されて、全長抗体の重鎖を形成するのに対応して、軽鎖可変領域は、SEQ ID NO：8で表されるヒトκ軽鎖定常領域に接続されて、全長抗体の軽鎖を形成する。

キメラ抗体ch1901
ch1901重鎖：（SEQ ID NO：35）
EVQLMESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSDYGIHWVRQAPEMGLEWIAYISRGSSTIYYADTVKGRFTMSRDNAKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARGGYDTRNAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK；
ch1901軽鎖（SEQ ID NO：36）
DIVMTQSPSSLSVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRASGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAIYHCQNDLYYPLTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC；

キメラ抗体ch1902
ch1902重鎖（SEQ ID NO：37）
EVQLQESGAELVKPGASVKLSCKASGYIFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGMIHPNSGSTNYNEKFKGKATLTLDKSSSTAYMQLSSLPSEDSAVYYCARLKTGNSFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK；
ch1902軽鎖（SEQ ID NO：38）
DIVLTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAIYYCQNAYTYPFTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC。

表6には、mAb1901のヒト化抗体が示されている。

表8には、mAb1902のヒト化抗体が示されている。

mAb1902のヒト化抗体の軽重鎖配列は、下記の表9に示す通りである。

本開示の陽性対照抗体は、IMAB-362（WO2016166122による）である

通常の遺伝子クローン、組換え発現の方法で、上記抗体をそれぞれクローニングし、発現し、精製した。

二、化合物の調製

本開示の実施例における具体的な条件が明示されていない実験方法は、通常、一般的な条件、又は原料や商品のメーカに勧められた条件に従う。具体的な供給源が明示されていない試薬は、市販の一般的な試薬である。

化合物の構造は、核磁気共鳴（NMR）又は質量分析（MS）によって決定された。NMRの測定は、Bruker AVANCE-400核磁気装置が利用され、測定溶剤が重水素化ジメチルスルホキシド（DMSO-d6）、重水素化クロロホルム（CDCl₃）、重水素化メタノール（CD₃OD）であり、内部標準がテトラメチルシラン（TMS）であり、化学シフトが10^-6（ppm）単位で示された。

MSの測定は、FINNIGAN LCQAd（ESI）質量分析計（メーカ：Thermo、型番：Finnigan LCQ advantage MAX）が利用された。
UPLCの測定は、Waters Acquity UPLC SQD液体クロマトグラフ質量分析計が利用された。
HPLCの測定は、アジレント1200DAD高速液体クロマトグラフ（Sunfire C18 150×4.6 mmカラム）及びWaters 2695-2996高速液体クロマトグラフ（Gimini C18 150×4.6 mmカラム）が利用された。
UV-HPLCの測定は、Thermo nanodrop 2000紫外線分光光度計が利用された。

増殖阻害率及びIC₅₀値の測定は、PHERA starFSマイクロプレートリーダー（独BMG社）が利用された。

薄層クロマトグラフィー用シリカゲルプレートとしては、煙台黄海HSGF254又は青島GF254シリカゲルプレートが利用され、薄層クロマトグラフィー（TLC）用のシリカゲルプレートの仕様は、0.15 mm～0.2 mmであり、薄層クロマトグラフィーによる生成物の分離精製用のシリカゲルプレートの仕様は、0.4 mm～0.5 mmである。

カラムクロマトグラフィーは、一般的に、煙台黄海200～300メッシュのシリカゲルを担体として利用した。

本開示に係る既知の出発原料は、本分野の既知の方法を採用して又はそれに従って合成してもよく、又はABCR GmbH & Co.KG、Acros Organnics、Aldrich Chemical Company、韶遠化学科技（Accela ChemBio Inc）、達瑞化学品などの会社から購入してもよい。

実施例では、特に断りのない限り、反応は、いずれもアルゴン雰囲気又は窒素雰囲気において行われた。
アルゴン雰囲気又は窒素雰囲気は、反応フラスコに容量が約1 Lのアルゴン又は窒素バルーンが接続されていることを指す。

水素雰囲気は、反応フラスコに容量が約1 Lの水素バルーンが接続されていることを指す。

加圧水素化反応は、Parr 3916EKX型水素化装置及び清藍QL-500型水素発生器又はHC2-SS型水素化装置が利用された。
水素化反応は、通常、真空排気して水素を充填する操作を3回繰り返してから行われた。

マイクロ波反応は、CEM Discover-S 908860型マイクロ波反応器が利用された。

実施例では特に断りのない限り、反応中の溶液は、水溶液を指す。
実施例では特に断りのない限り、反応の温度は、室温である。
室温は、最適の反応温度であり、温度範囲が20℃～30℃である。

実施例中のpH＝6.5のPBS緩衝液の調製：8.5 gのKH₂PO₄、8.56 gのK₂HPO₄.3H₂O、5.85 gのNaCl、1.5 gのEDTAを取ってフラスコに入れ、2 Lに定容し、超音波でそれを完全に溶解させ、振り混ぜた後に得た。

化合物の精製に利用されたカラムクロマトグラフィーの溶離剤の系及び薄層クロマトグラフィーの展開溶媒の系は、A：ジクロロメタンとイソプロピルアルコール系、B：ジクロロメタンとメタノール系、及びC：石油エーテルと酢酸エチル系を含み、溶剤の体積比は、化合物の極性によって調整してもよく、少量のトリエチルアミンと酸性又は塩基性試薬などを加えて調整してもよい。

本開示の化合物の一部は、Q-TOF LC/MSによって特徴付けられている。Q-TOF LC/MSは、アジレント6530精密質量数四重極-飛行時間型質量分析計及びアジレント1290-Infinity超高速液体クロマトグラフ（アジレント Poroshell 300SB-C8 5 μm、2.1×75 mmカラム）が利用された。

本開示の抗体薬物複合体のY-D薬物部分については、PCT/CN2019/107873が参照されるが、関連する化合物の合成及び試験は本特許に引用されている。その中の非限定的な実施例の合成は、以下のように引用されている。

実施例1
N-（（1S,9S）-9-エチル-5-フルオロ-9-ヒドロキシ-4-メチル-10,13-ジオキソ-2,3,9,10,13,15-ヘキサヒドロ-1H,12H-ベンゾ[de]ピラノ[3',4':6,7]インドリジノ[1,2-b]キノリン-1-イル）-1-ヒドロキシシクロプロパン-1-ホルムアミド 1

メシル酸エキサテカン1b（2.0 mg、3.76 μmol、特許出願「EP0737686A1」に開示された方法で調製された）に1 mLのN, N-ジメチルホルムアミドを加え、氷水浴で0～5℃に冷却し、1滴のトリエチルアミンを滴下し、反応液が清澄になるまで撹拌した。反応液に1-ヒドロキシシクロプロピルギ酸1a（1.4 mg、3.7 μmol、「Tetrahedron Letters, 25（12）, 1269-72, 1984」に開示された公知の方法で調製された）及び4-（4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル）-4-メチルモルホリニウムクロリド（3.8 mg、13.7 μmol）を順に加え、加入終了後、0～5℃で2時間攪拌反応させた。反応液に水5 mLを加えて反応をクエンチし、反応液を酢酸エチル（8 mL×3）で抽出し、有機相を合わせ、飽和塩化ナトリウム溶液（5 mL×2）で洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、ろ液を減圧濃縮し、得られた残留物を薄層クロマトグラフィーにより展開溶媒系Bで精製し、表題生成物1（1.6 mg、収率82.1%）を得た。
MS m/z (ESI): 520.2 [M+1]
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 7.90-7.84 (m, 1H), 7.80-7.68(m, 1H), 5.80-5.70 (m, 1H), 5.62-5.54(m, 2H), 5.44-5.32 (m, 2H), 5.28-5.10(m, 2H), 3.40-3.15 (m, 3H), 2.44 (s, 3H), 2.23(t, 1H), 2.06-1.75 (m, 2H), 1.68-1.56 (m, 1H), 1.22-1.18 (m, 2H), 1.04-0.98 (m, 2H), 0.89 (t, 3H)。

実施例2
（S）-2-シクロプロピル-N-（（1S,9S）-9-エチル-5-フルオロ-9-ヒドロキシ-4-メチル-10,13-ジオキソ-2,3,9,10,13,15-ヘキサヒドロ-1H,12H-ベンゾ[de]ピラノ[3',4':6,7]インドリジノ[1,2-b]キノリン-1-イル）-2-ヒドロキシアセトアミド 2-A
（R）-2-シクロプロピル-N-（（1S,9S）-9-エチル-5-フルオロ-9-ヒドロキシ-4-メチル-10,13-ジオキソ-2,3,9,10,13,15-ヘキサヒドロ-1H,12H-ベンゾ[de]ピラノ[3',4':6,7]インドリジノ[1,2-b]キノリン-1-イル）-2-ヒドロキシアセトアミド 2-B

1b（4 mg、7.53 μmol）に2 mLのエタノール及び0.4 mLのN,N-ジメチルホルムアミドを加え、アルゴンで3回置換し、氷水浴で0～5℃に冷却し、0.3 mLのN-メチルモルホリンを滴下し、反応液が清澄になるまで撹拌した。反応液に2-シクロプロピル-2-ヒドロキシ酢酸2a（2.3 mg、19.8 μmol、特許出願「WO2013106717」に開示された方法で調製された）、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（3 mg、22.4 μmol）及び1-（3-ジメチルアミノプロピル）-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（4.3 mg、22.4 μmol）を順に加え、加入終了後、0～5℃で1時間攪拌反応させた。氷水浴を撤去し、30℃に加熱し、2時間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、得られた粗製品である化合物2を高速液体クロマトグラフィーで精製し（分離条件：カラム：XBridge Prep C18 OBD 5 μm 19×250 mm、移動相：A-水（10 mmol NH₄OAc）、B-アセトニトリル、勾配溶離、流速：18 mL/min）、その対応する成分を収集し、減圧濃縮して、表題生成物（2-A：1.5 mg、2-B：1.5 mg）を得た。
MS m/z (ESI): 534.0 [M+1]。
単一配置の化合物2-B（比較的短い保持時間）
UPLC分析：保持時間：1.06分間、純度：88%（カラム：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7 μm 2.1×50 mm、移動相：A-水（5 mmol NH₄OAc）、B-アセトニトリル）。
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ 8.37 (d, 1H), 7.76 (d, 1H), 7.30 (s, 1H), 6.51 (s, 1H), 5.58-5.56 (m, 1H), 5.48 (d, 1H), 5.41 (s, 2H), 5.32-5.29 (m, 2H), 3.60 (t, 1H), 3.19-3.13 (m, 1H), 2.38 (s, 3H), 2.20-2.14 (m, 1H), 1.98 (q, 2H), 1.87-1.83 (m, 1H), 1.50-1.40 (m, 1H), 1.34-1.28 (m, 1H), 0.86 (t, 3H), 0.50-0.39 (m, 4H)。
単一配置の化合物2-A（比較的長い保持時間）
UPLC分析：保持時間：1.10分間、純度：86%（カラム：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7 μm 2.1×50 mm、移動相：A-水（5 mmol NH₄OAc）、B-アセトニトリル）。
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ 8.35 (d, 1H), 7.78 (d, 1H), 7.31 (s, 1H), 6.52 (s, 1H), 5.58-5.53 (m, 1H), 5.42 (s, 2H), 5.37 (d, 1H), 5.32 (t, 1H), 3.62 (t, 1H), 3.20-3.15 (m, 2H), 2.40 (s, 3H), 2.25-2.16 (m, 1H), 1.98 (q, 2H), 1.87-1.82 (m, 1H), 1.50-1.40 (m, 1H), 1.21-1.14 (m, 1H), 0.87 (t, 3H), 0.47-0.35 (m, 4H)。

実施例3
（S）-N-（（1S,9S）-9-エチル-5-フルオロ-9-ヒドロキシ-4-メチル-10,13-ジオキソ-2,3,9,10,13,15-ヘキサヒドロ-1H,12H-ベンゾ[de]ピラノ[3',4':6,7]インドリジノ[1,2-b]キノリン-1-イル）-3,3,3-トリフルオロ-2-ヒドロキシプロパンアミド 3-A
（R）-N-（（1S,9S）-9-エチル-5-フルオロ-9-ヒドロキシ-4-メチル-10,13-ジオキソ-2,3,9,10,13,15-ヘキサヒドロ-1H,12H-ベンゾ[de]ピラノ[3',4':6,7]インドリジノ[1,2-b]キノリン-1-イル）-3,3,3-トリフルオロ-2-ヒドロキシプロパンアミド 3-B

1b（5.0 mg、9.41 μmol）に2 mLのエタノール及び0.4 mLのN,N-ジメチルホルムアミドを加え、氷水浴で0～5℃に冷却し、0.3 mLのN-メチルモルホリンを滴下し、反応液が清澄になるまで撹拌した。反応液に3,3,3-トリフルオロ-2-ヒドロキシプロピオン酸3a（4.1 mg、28.4 μmol、供給元：Alfa）、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（3.8 mg、28.1 μmol）及び1-（3-ジメチルアミノプロピル）-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（5.4 mg、28.2 μmol）を順に加え、加入終了後、0～5℃で10分間攪拌反応させた。氷水浴を撤去し、30℃に加熱し、8時間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、得られた粗製品である化合物3を高速液体クロマトグラフィーで精製し（分離条件：カラム：XBridge Prep C18 OBD 5 μm 19×250 mm、移動相：A-水（10 mmol NH₄OAc）、B-アセトニトリル、勾配溶離、流速：18 mL/min）、その対応する成分を収集し、減圧濃縮して、表題生成物（3-A:1.5 mg、3-B:1.5 mg）を得た。
MS m/z (ESI): 561.9 [M+1]。
単一配置の化合物（比較的短い保持時間）
UPLC分析：保持時間：1.11分間、純度：88%（カラム：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7 μm 2.1×50 mm、移動相：A-水（5 mmol NH₄OAc）、B-アセトニトリル）。
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ 8.94 (d, 1H), 7.80 (d, 1H), 7.32 (s, 1H), 7.20 (d, 1H), 6.53 (s, 1H), 5.61-5.55 (m, 1H), 5.45-5.23 (m, 3H), 5.15-5.06 (m, 1H), 4.66-4.57 (m, 1H), 3.18-3.12 (m, 1H), 2.40 (s, 3H), 2.26-2.20 (m, 1H), 2.16-2.08 (m, 1H), 2.02-1.94 (m, 1H), 1.89-1.82 (m, 1H), 1.50-1.40 (m, 1H), 0.87 (t, 3H)。
単一配置の化合物（比較的長い保持時間）
UPLC分析：保持時間：1.19分間、純度：90%（カラム：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7 μm 2.1×50 mm、移動相：A-水（5 mmol NH₄OAc）、B-アセトニトリル）。
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ 8.97 (d, 1H), 7.80 (d, 1H), 7.31 (s, 1H), 7.16 (d, 1H), 6.53 (s, 1H), 5.63-5.55 (m, 1H), 5.45-5.20 (m, 3H), 5.16-5.07 (m, 1H), 4.66-4.57 (m, 1H), 3.18-3.12 (m, 1H), 2.40 (s, 3H), 2.22-2.14 (m, 1H), 2.04-1.95 (m, 2H), 1.89-1.82 (m, 1H), 1.50-1.40 (m, 1H), 0.87 (t, 3H)。

実施例4
N-（（1S,9S）-9-エチル-5-フルオロ-9-ヒドロキシ-4-メチル-10,13-ジオキソ-2,3,9,10,13,15-ヘキサヒドロ-1H,12H-ベンゾ[de]ピラノ[3',4':6,7]インドリジノ[1,2-b]キノリン-1-イル）-1-ヒドロキシシクロペンタン-1-ホルムアミド 4

1b（3.0 mg、5.64 μmol）に1 mLのN,N-ジメチルホルムアミドを加え、氷水浴で0～5℃に冷却し、1滴のトリエチルアミンを滴下し、反応液が清澄になるまで攪拌した。反応液に1-ヒドロキシ-シクロペンタンギ酸4a（2.2 mg、16.9 μmol、特許出願「WO2013106717」に開示された方法で調製された）及び4-（4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル）-4-メチルモルホリニウムクロリド（4.7 mg、16.9 μmol）を順に加え、加入終了後、0～5℃で1時間攪拌反応させた。反応液に水5 mLを加えて反応をクエンチし、反応液を酢酸エチル（10 mL×3）で抽出し、有機相を合わせ、飽和塩化ナトリウム溶液（5 mL×2）で洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、ろ液を減圧濃縮し、得られた残留物を薄層クロマトグラフィーにより展開溶媒系Bで精製し、表題生成物4（2.5 mg、収率80.9%）を得た。
MS m/z (ESI): 548.0 [M+1]。
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 7.73-7.62 (m, 2H), 5.75-5.62 (m, 1H), 5.46-5.32 (m, 2H), 5.26-5.10 (m, 1H), 3.30-3.10 (m, 1H), 2.43 (s, 3H), 2.28-2.20 (m, 2H), 2.08-1.84 (m, 8H), 1.69-1.58 (m, 2H), 1.04-1.00 (m, 2H), 0.89 (t, 3H)。

実施例5
N-（（1S,9S）-9-エチル-5-フルオロ-9-ヒドロキシ-4-メチル-10,13-ジオキソ-2,3,9,10,13,15-ヘキサヒドロ-1H,12H-ベンゾ[de]ピラノ[3',4':6,7]インドリジノ[1,2-b]キノリン-1-イル）-1-（ヒドロキシメチル）シクロプロパン-1-ホルムアミド 5

1b（2.0 mg、3.76 μmol）に1 mLのN,N-ジメチルホルムアミドを加え、氷水浴で0～5℃に冷却し、1滴のトリエチルアミンを滴下し、反応液が清澄になるまで攪拌した。反応液に1-（ヒドロキシメチル）-シクロペンタンギ酸5a（0.87 mg、7.5 μmol、特許出願「WO201396771」に開示された方法で調製された）及び4-（4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル）-4-メチルモルホリニウムクロリド（2 mg、7.24 μmol）を順に加え、加入終了後、0～5℃で2時間攪拌反応させた。反応液に水5 mLを加えて反応をクエンチし、反応液を酢酸エチル（8 mL×3）で抽出し、有機相を合わせ、飽和塩化ナトリウム溶液（5 mL×2）で洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、ろ液を減圧濃縮し、得られた残留物を薄層クロマトグラフィーにより展開溶媒系Bで精製し、表題生成物5（1.0 mg、収率50%）を得た。
MS m/z (ESI): 533.9 [M+1]。
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 8.07 (s, 1H), 7.23-7.18 (m, 2H), 6.71-6.64 (m, 1H), 6.55-6.51 (m, 1H), 5.36-5.27 (m, 2H), 4.67-4.61 (m, 2H), 3.53-3.48 (m, 1H), 3.30-3.22 (m, 2H), 3.18-3.13 (m, 1H), 2.71-2.61 (m, 2H), 2.35-2.28 (m, 1H), 2.04-1.91 (m, 4H), 1.53-1.40 (m, 3H), 0.91-0.75 (m, 4H)。

実施例6
N-（（1S,9S）-9-エチル-5-フルオロ-9-ヒドロキシ-4-メチル-10,13-ジオキソ-2,3,9,10,13,15-ヘキサヒドロ-1H,12H-ベンゾ[de]ピラノ[3',4':6,7]インドリジノ[1,2-b]キノリン-1-イル）-1-（ヒドロキシメチル）シクロブタン-1-ホルムアミド 6

1b（3.0 mg、5.64 μmol）に1 mLのN,N-ジメチルホルムアミドを加え、氷水浴で0～5℃に冷却し、1滴のトリエチルアミンを滴下し、反応液が清澄になるまで攪拌した。反応液に1-（ヒドロキシメチル）シクロブタン-1-ギ酸6a（2.2 mg、16.9 μmol、「Journal of the American Chemical Society, 2014, vol.136, #22, p.8138-8142」という文献に開示された公知の方法で調製された）及び4-（4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル）-4-メチルモルホリニウムクロリド（4.7 mg、16.9 μmol）を順に加え、加入終了後、0～5℃で1時間攪拌反応させた。反応液に水5 mLを加えて反応をクエンチし、反応液を酢酸エチル（10 mL×3）で抽出し、有機相を合わせ、飽和塩化ナトリウム溶液（5 mL×2）で洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、ろ液を減圧濃縮し、得られた残留物を薄層クロマトグラフィーにより展開溶媒系Bで精製し、表題生成物6（2.1 mg、収率67.9%）を得た。
MS m/z (ESI): 548.0 [M+1]。
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ 7.85-7.62 (m, 1H), 6.88 (br，1H), 5.87-5.48 (m，2H), 5.47-5.33 (m，1H), 5.31-5.06 (m，1H), 4.25-3.91 (m, 2H), 3.25 (br, 1H), 2.60-2.32 (m, 3H), 2.23 (t, 1H), 2.15-1.95 (m, 3H), 1.70-1.56 (m, 2H), 1.41-1.17 (m, 9H), 1.03 (s, 1H), 0.95-0.80 (m, 2H)。

実施例7
N-（（1S,9S）-9-エチル-5-フルオロ-9-ヒドロキシ-4-メチル-10,13-ジオキソ-2,3,9,10,13,15-ヘキサヒドロ-1H,12H-ベンゾ[de]ピラノ[3',4':6,7]インドリジノ[1,2-b]キノリン-1-イル）-1-ヒドロキシシクロブタン-1-ホルムアミド 7

1b（3.0 mg、5.64 μmol）に2 mLのエタノール及び0.4 mLのN,N-ジメチルホルムアミドを加え、氷水浴で0～5℃に冷却し、0.3 mLのN-メチルモルホリンを滴下し、反応液が清澄になるまで撹拌した。反応液に1-ヒドロキシシクロブタンギ酸7a（2.0 mg、17.22 μmol、供給元：薬石）、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（2.3 mg、17.0 μmol）及び1-（3-ジメチルアミノプロピル）-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（3.2 mg、16.7 μmol）を順に加え、加入終了後、0～5℃で10分間攪拌反応させた。氷水浴を撤去し、室温で2時間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、得られた残留物を薄層クロマトグラフィーにより展開溶媒系Bで精製し、表題生成物7（2.5 mg、収率83.1%）を得た。
MS m/z (ESI): 534.0 [M+1]。
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ 8.28 (d, 1H), 7.75 (d, 1H), 7.29 (s, 1H), 6.51 (s, 1H), 6.12 (s, 1H), 5.59-5.51 (m, 1H), 5.41 (s, 2H), 5.20-5.01 (m, 2H), 3.27-3.17 (m, 1H), 3.15-3.05 (m, 1H), 2.71-2.63 (m, 1H), 2.37 (s, 3H), 2.12-2.05 (m, 1H), 2.03-1.94 (m, 2H), 1.92-1.78 (m, 4H), 1.50-1.42 (m, 1H), 0.90-0.83 (m, 4H)。

実施例8
1-（（（S）-7-ベンジル-20-（2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロリル-1-イル）-3,6,9,12,15-ペンタオキソ-2,5,8,11,14-ペンタアザイコシル）オキシ）-N-（（1S,9S）-9-エチル-5-フルオロ-9-ヒドロキシ-4-メチル-10,13-ジオキソ-2,3,9,10,13,15-ヘキサヒドロ-1H,12H-ベンゾ[de]ピラノ[3',4':6,7]インドリジノ[1,2-b]キノリン-1-イル）シクロプロパン-1-ホルムアミド 8

ステップ1
1-（（2-（（（（9H-フルオレン-9-イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）アセトアミド）メトキシ）シクロプロパン-1-カルボン酸ベンジル 8c
1-ヒドロキシシクロプロパン-1-カルボン酸ベンジル8a（104 mg、0.54 mmol、特許出願「US2005/20645」に開示された方法で調製された）及び（2-（（（（9H-フルオレン-9-イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）アセトアミド）メチル酢酸エステル8b（100 mg、0.27 mmol、特許出願「CN105829346A」に開示された方法で調製された）を反応フラスコに加え、5 mLのテトラヒドロフランを加え、アルゴンで3回置換し、氷水浴で0～5℃に降温し、カリウムtert-ブトキシド（61 mg、0.54 mmol）を加え、氷水浴を撤去し、室温まで昇温して10分間撹拌し、氷水20 mLを加え、酢酸エチル（5 mL×2）及びクロロホルム（5 mL×5）で抽出し、有機相を合わせて濃縮した。得られた残留物を3 mLの1,4-ジオキサンに溶解し、水0.6 mLを加え、炭酸水素ナトリウム（27 mg、0.32 mmol）及びクロロギ酸-9-フルオレニルメチル（70 mg、0.27 mmol）を加え、室温で1時間撹拌した。水20 mLを加え、酢酸エチル（8 mL×3）で抽出し、有機相を飽和塩化ナトリウム溶液（20 mL）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、ろ液を減圧濃縮し、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより展開溶媒系Bで精製し、表題生成物8c（100 mg、収率73.6%）を得た。
MS m/z (ESI): 501.0 [M+1]。

ステップ2
1-（（2-（（（（9H-フルオレン-9-イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）アセトアミド）メトキシ）シクロプロパン-1-カルボン酸 8d
8c（50 mg、0.10 mmol）をテトラヒドロフランと酢酸エチルの混合溶媒（V：V＝2：1）3 mLに溶解し、パラジウム炭素（25 mg、含有量10%）を加え、水素で3回置換し、室温で1時間撹拌反応させた。反応液を珪藻土でろ過し、ろ過ケーキをテトラヒドロフランですすぎ、ろ液を濃縮して、表題生成物8d（41 mg、収率：100%）を得た。
MS m/z (ESI): 411.0 [M+1]。

ステップ3
（9H-フルオレン-9-イル）メチル（2-（（（1-（（（1S,9S）-9-エチル-5-フルオロ-9-ヒドロキシ-4-メチル-10,13-ジオキソ-2,3,9,10,13,15-ヘキサヒドロ-1H,12H-ベンゾ[de]ピラノ[3',4':6,7]インドリジノ[1,2-b]キノリン-1-イル）アミノカルボニル）シクロプロポキシ）メチル）アミノ）-2-オキソエチル）カルバメート 8e
1b（7 mg、0.013 mmol）を反応フラスコに加え、1 mLのN,N-ジメチルホルムアミドを加え、アルゴンで3回置換し、氷水浴で0～5℃に降温し、1滴のトリエチルアミンを滴下し、8d（7 mg、0.017 mmol）の0.5 mLのN,N-ジメチルホルムアミド溶液を加え、4-（4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル）-4-メチルモルホリニウムクロリド（7 mg、0.026 mmol）を加え、氷浴で35分間撹拌反応させた。水10 mLを加え、酢酸エチル（5 mL×3）で抽出し、有機相を飽和塩化ナトリウム溶液（10 mL）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、ろ液を減圧濃縮し、得られた残留物を薄層クロマトグラフィーにより展開溶媒系Bで精製し、表題生成物8e（8.5 mg、収率78.0%）を得た。
MS m/z (ESI): 828.0 [M+1]。

ステップ4
1-（（2-アミノアセトアミド）メトキシ）-N-（（1S,9S）-9-エチル-5-フルオロ-9-ヒドロキシ-4-メチル-10,13-ジオキソ-2,3,9,10,13,15-ヘキサヒドロ-1H,12H-ベンゾ[de]ピラノ[3',4':6,7]インドリジノ[1,2-b]キノリン-1-イル）シクロプロパン-1-ホルムアミド 8f
8e（4 mg、4.84 μmol）を0.2 mLのジクロロメタンに溶解し、0.1 mLのジエチルアミンを加え、室温で2時間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、2 mLのトルエンを加えて減圧濃縮し、この操作を2回繰り返し、3 mLのn-ヘキサンを加えてパルプ化し、上層のn-ヘキサンを注ぎ出し、この操作を3回繰り返し、減圧濃縮して、粗製品である表題生成物8f（2.9 mg）を得て、生成物を精製せずにそのまま次の反応に使用した。
MS m/z (ESI): 606.0 [M+1]。

ステップ5
1-（（（S）-7-ベンジル-20-（2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロリル-1-イル）-3,6,9,12,15-ペンタオキソ-2,5,8,11,14-ペンタアザイコシル）-オキシ）-N-（（1S,9S）-9-エチル-5-フルオロ-9-ヒドロキシ-4-メチル-10,13-ジオキソ-2,3,9,10,13,15-ヘキサヒドロ-1H,12H-ベンゾ[de]ピラノ[3',4':6,7]インドリジノ[1,2-b]キノリン-1-イル）シクロプロパン-1-ホルムアミド 8
粗製品8f（2.9 mg、4.84 μmol）を0.5 mLのN,N-ジメチルホルムアミドに溶解し、アルゴンで3回置換し、氷水浴で0～5℃に降温し、（S）-2-（-2-（-2-（6-（-2,5-ジオキソ-1H-ピロリル-1-イル）ヘキサンアミノ）アセトアミノ）アセトアミノ）-3-フェニルプロピオン酸8g（2.7 mg、5.80 μmol、特許出願「EP2907824」に開示された方法で調製された）の0.3 mLのN,N-ジメチルホルムアミド溶液を加え、4-（4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル）-4-メチルモルホリニウムクロリド（2.7 mg、9.67 μmol）を加え、氷浴で30分間反応させ、氷浴を撤去し、室温まで昇温し、15分間撹拌した。反応液を高速液体クロマトグラフィーで精製し（分離条件：カラム：XBridge Prep C18 OBD 5 μm 19×250 mm、移動相：A-水（10 mmol NH₄OAc）、B-アセトニトリル、勾配溶離、流速：18 mL/min）、その対応する成分を収集し、減圧濃縮して、表題生成物8（2 mg、収率39.0%）を得た。
MS m/z (ESI): 1060.0 [M+1]。
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ 9.01 (d, 1H), 8.77 (t, 1H), 8.21 (t, 1H), 8.08-7.92 (m, 2H), 7.73 (d, 1H), 7.28 (s, 1H), 7.24-7.07 (m, 4H), 6.98 (s, 1H), 6.50 (s, 1H), 5.61 (q, 1H), 5.40 (s, 2H), 5.32 (t, 1H), 5.12 (q, 2H), 4.62 (t, 1H), 4.52 (t, 1H), 4.40-4.32 (m, 1H), 3.73-3.47 (m, 8H), 3.16-3.04 (m, 2H), 2.89 (dd, 1H), 2.69-2.55 (m, 2H), 2.37-2.23 (m, 4H), 2.12-1.93 (m, 4H), 1.90-1.74 (m, 2H), 1.52-1.38 (m, 4H), 1.33-1.11 (m, 5H), 0.91-0.81 (m, 4H)。

実施例9
N-（（2R,10S）-10-ベンジル-2-シクロプロピル-1-（（（1S,9S）-9-エチル-5-フルオロ-9-ヒドロキシ-4-メチル-10,13-ジオキソ-2,3,9,10,13,15-ヘキサヒドロ-1H,12H-ベンゾ[de]ピラノ[3',4':6,7]インドリジノ[1,2-b]キノリン-1-イル）アミノ）-1,6,9,12,15-ペンタオキソ-3-オキサ-5,8,11,14-テトラアザヘキサデカン-16-イル）-6-（2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル）カプロアミド 9-A
N-（（2R,10S）-10-ベンジル-2-シクロプロピル-1-（（（1S,9S）-9-エチル-5-フルオロ-9-ヒドロキシ-4-メチル-10,13-ジオキソ-2,3,9,10,13,15-ヘキサヒドロ-1H,12H-ベンゾ[de]ピラノ[3',4':6,7]インドリジノ[1,2-b]キノリン-1-イル）アミノ）-1,6,9,12,15-ペンタオキソ-3-オキサ-5,8,11,14-テトラアザヘキサデカン-16-イル）-6-（2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル）カプロアミド 9-B

ステップ1
2-シクロプロピル-2-ヒドロキシ酢酸ベンジル 9a
2a（1.3 g、11.2 mmol、特許出願「WO2013/106717」に開示された方法で調製された）を50 mLのアセトニトリルに溶解し、炭酸カリウム（6.18 g、44.8 mmol）、臭化ベンジル（1.33 mL、11.2 mmol）及びテトラブチルヨウ化アンモニウム（413 mg、1.1 mmol）を順に加えた。反応液を室温で48時間撹拌し、珪藻土でろ過し、ろ過ケーキを酢酸エチル（10 mL）ですすぎ、ろ液を合わせ、減圧濃縮し、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより展開溶媒系Cで精製し、表題生成物9a（2 g、収率86.9%）を得た。

ステップ2
10-シクロプロピル-1-（9H-フルオレン-9-イル）-3,6-ジオキソ-2,9-ジオキサ-4,7-ジアザウンデカン-11-酸ベンジル 9b
9a（120.9 mg、0.586 mmol）及び8b（180 mg、0.489 mmol）を反応フラスコに加え、4 mLのテトラヒドロフランを加え、アルゴンで3回置換し、氷水浴で0～5℃に降温し、カリウムtert-ブトキシド（109 mg、0.98 mmol）を加え、氷水浴を撤去し、室温まで昇温し、40分間撹拌し、氷水10 mLを加え、酢酸エチル（20 mL×2）及びクロロホルム（10 mL×5）で抽出し、有機相を合わせて濃縮した。得られた残留物を4 mLのジオキサンに溶解し、水2 mLを加え、炭酸水素ナトリウム（49.2 mg、0.586 mmol）及びクロロギ酸-9-フルオレニルメチル（126 mg、0.49 mmol）を加え、室温で2時間撹拌した。水20 mLを加え、酢酸エチル（10 mL×3）で抽出し、有機相を飽和塩化ナトリウム溶液（20 mL）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、ろ液を減圧濃縮した。得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより展開溶媒系Cで精製し、表題生成物9b（48 mg、収率19%）を得た。
MS m/z (ESI): 515.0 [M+1]。

ステップ3
10-シクロプロピル-1-（9H-フルオレン-9-イル）-3,6-ジオキソ-2,9-ジオキサ-4,7-ジアザウンデカン-11-酸 9c
9b（20 mg、0.038 mmol）をテトラヒドロフランと酢酸エチルの混合溶媒（V：V＝2：1）4.5 mLに溶解し、パラジウム炭素（12 mg、含有量10%、乾燥型）を加え、水素で3回置換し、室温で1時間撹拌反応させた。反応液を珪藻土でろ過し、ろ過ケーキを酢酸エチルですすぎ、ろ液を濃縮して、粗製品である表題生成物9c（13 mg）を得て、生成物を精製せずにそのまま次の反応に使用した。
MS m/z (ESI): 424.9 [M+1]。

ステップ4
（9H-フルオレン-9-イル）メチル（2-（（1-シクロプロピル-2-（（（1S,9S）-9-エチル-5-フルオロ-9-ヒドロキシ-4-メチル-10,13-ジオキソ-2,3,9,10,13,15-ヘキサヒドロ-1H,12H-ベンゾ[de]ピラノ[3',4':6,7]インドリジノ[1,2-b]キノリン-1-イル）アミノ）-2-オキソエトキシ）メチル）アミノ）-2-オキソエチル）カルバメート 9d
1b（10 mg、18.8 μmol）を反応フラスコに加え、1 mLのN,N-ジメチルホルムアミドを加え、アルゴンで3回置換し、氷水浴で0～5℃に降温し、1滴のトリエチルアミンを滴下し、粗製品9c（13 mg、30.6 μmol）を加え、4-（4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル）-4-メチルモルホリニウムクロリド（16.9 mg、61.2 μmol）を加え、氷浴で40分間撹拌反応させた。水10 mLを加え、酢酸エチル（10 mL×3）で抽出し、有機相を合わせた。有機相を飽和塩化ナトリウム溶液（10 mL×2）で洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、ろ液を減圧濃縮した。得られた残留物を薄層クロマトグラフィーにより展開溶媒系Bで精製し、表題生成物9d（19 mg、収率73.6%）を得た。
MS m/z (ESI): 842.1[M+1]。

ステップ5
2-（（2-アミノアセトアミド）メトキシ）-2-シクロプロピル-N-（（1S,9S）-9-エチル-5-フルオロ-9-ヒドロキシ-4-メチル-10,13-ジオキソ-2,3,9,10,13,15-ヘキサヒドロ-1H,12H-ベンゾ[de]ピラノ[3',4':6,7]インドリジノ[1,2-b]キノリン-1-イル）アセトアミド 9e
9d（19 mg、22.6 μmol）を2 mLのジクロロメタンに溶解し、1 mLのジエチルアミンを加え、室温で2時間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、1 mLのトルエンを加えて減圧濃縮し、この操作を2回繰り返した。残留物に3 mLのn-ヘキサンを加えてパルプ化し、放置後に上清液を注ぎ出し、固体を保留した。固体残留物を減圧濃縮し、オイルポンプにより乾燥させて粗製品である表題生成物9e（17 mg）を得て、生成物を精製せずにそのまま次の反応に使用した。
MS m/z (ESI): 638.0[M+18]。

ステップ6
N-（（2R,10S）-10-ベンジル-2-シクロプロピル-1-（（（1S,9S）-9-エチル-5-フルオロ-9-ヒドロキシ-4-メチル-10,13-ジオキソ-2,3,9,10,13,15-ヘキサヒドロ-1H,12H-ベンゾ[de]ピラノ[3',4':6,7]インドリジノ[1,2-b]キノリン-1-イル）アミノ）-1,6,9,12,15-ペンタオキソ-3-オキサ-5,8,11,14-テトラアザヘキサデカン-16-イル）-6-（2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル）カプロアミド 9-A
N-（（2R,10S）-10-ベンジル-2-シクロプロピル-1-（（（1S,9S）-9-エチル-5-フルオロ-9-ヒドロキシ-4-メチル-10,13-ジオキソ-2,3,9,10,13,15-ヘキサヒドロ-1H,12H-ベンゾ[de]ピラノ[3',4':6,7]インドリジノ[1,2-b]キノリン-1-イル）アミノ）-1,6,9,12,15-ペンタオキソ-3-オキサ-5,8,11,14-テトラアザヘキサデカン-16-イル）-6-（2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル）カプロアミド 9-B
粗製品9e（13.9 mg、22.4 μmol）を0.6 mLのN,N-ジメチルホルムアミドに溶解し、アルゴンで3回置換し、氷水浴で0～5℃に降温し、8g（21.2 mg、44.8 μmol）の0.3 mLのN, N-ジメチルホルムアミドを加え、4-（4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル）-4-メチルモルホリニウムクロリド（18.5 mg、67.3 μmol）を加え、氷浴で10分間撹拌反応させ、氷浴を撤去し、室温まで昇温し、1時間撹拌して反応させて化合物9を生成した。反応液を高速液体クロマトグラフィーで精製し（分離条件：カラム：XBridge Prep C18 OBD 5 μm 19×250 mm、移動相：A-水（10 mmol NH₄OAc）、B-アセトニトリル、勾配溶離、流速：18 mL/min）、その対応する成分を収集し、減圧濃縮して、表題生成物（9-A：2.4 mg、9-B：1.7 mg）を得た。
MS m/z (ESI): 1074.4 [M+1]。
単一配置の化合物9-A（比較的短い保持時間）：
UPLC分析：保持時間：1.14分間、純度：85%（カラム：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7 μm 2.1×50 mm、移動相：A-水（5 mmol NH₄OAc）、B-アセトニトリル）。
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ 8.60 (t, 1H), 8.51-8.49 (d, 1H), 8.32-8.24 (m, 1H), 8.13-8.02 (m, 2H), 8.02-7.96 (m, 1H), 7.82-7.75 (m, 1H), 7.31 (s, 1H), 7.26-7.15 (m, 4H), 6.99 (s, 1H), 6.55-6.48 (m, 1H), 5.65-5.54 (m, 1H), 5.41 (s, 2H), 5.35-5.15 (m, 3H), 4.74-4.62 (m, 1H), 4.54-4.40 (m, 2H), 3.76-3.64 (m，4H), 3.62-3.48 (m, 2H), 3.20-3.07 (m, 2H), 3.04-2.94 (m, 1H), 2.80-2.62 (m, 1H), 2.45-2.30 (m, 3H), 2.25-2.15 (m, 2H), 2.15-2.04 (m, 2H), 1.93-1.78 (m, 2H), 1.52-1.39 (m, 3H), 1.34-1.12 (m, 5H), 0.87 (t, 3H), 0.64-0.38 (m, 4H)。
単一配置の化合物9-B（比較的長い保持時間）：
UPLC分析：保持時間：1.16分間、純度：89%（カラム：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7 μm 2.1×50 mm、移動相：A-水（5 mmol NH₄OAc）、B-アセトニトリル）。
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ 8.68-8.60 (m, 1H), 8.58-8.50 (m, 1H), 8.32-8.24 (m, 1H), 8.13-8.02 (m, 2H), 8.02-7.94 (m, 1H), 7.82-7.75 (m, 1H), 7.31 (s, 1H), 7.26-7.13 (m, 3H), 6.99 (s, 1H), 6.55-6.48 (m, 1H), 5.60-5.50 (m, 1H), 5.41 (s, 2H), 5.35-5.15 (m, 2H), 4.78-4.68 (m, 1H), 4.60-4.40 (m, 2H), 3.76-3.58 (m, 4H), 3.58-3.48 (m, 1H), 3.20-3.10 (m, 2H), 3.08-2.97 (m, 2H), 2.80-2.72 (m, 2H), 2.45-2.30 (m, 3H), 2.25-2.13 (m, 2H), 2.13-2.04 (m, 2H), 2.03-1.94 (m, 2H), 1.91-1.78 (m, 2H), 1.52-1.39 (m, 3H), 1.34-1.12 (m, 4H), 0.91-0.79 (m, 3H), 0.53-0.34 (m, 4H)。

三、抗Claudin18.2抗体ADC複合体の調製
ADC原液薬物の薬物負荷量の分析
一、UV-HPLC方法
本開示の一部のADC実施例のDAR値nの算出方法は、UV-HPLCを採用したが、具体的には、以下の通りである。
1、測定の方法：コハク酸ナトリウム緩衝液が入ったキュベットを、参照吸収セル及び試料測定吸収セルにそれぞれ置き、溶媒ブランクを差し引いた後、試験用溶液が入ったキュベットを試料測定吸収セルに入れ、280 nm及び370 nmでの吸光度を測定した。
2、結果の算出：紫外線分光光度法（使用機器：Thermo nanodrop 2000紫外線分光光度計）により、ADC原液負荷量を測定したが、その原理は、ある波長でのADC原液の全吸光値が、薬物とモノクローナル抗体の当該波長での吸光値の累積に等しいことであり、即ち、
（1）A₂₈₀ _nm＝ε_mab-280bC_mab+ε_Drug-280bC_Drug
ε_Drug-280：薬物の280 nmでの平均モル吸光係数は5100であり、
C_Drug：薬物の濃度、
ε_mab-280：モノクローナル抗体原液の280 nmでの平均モル吸着係数は214600であり、
C_mab：モノクローナル抗体原液の濃度、
b：光路長は1 cmである。
同様に、試料の370 nmでの全吸光値方程式を得ることができ、即ち、
（2）A₃₇₀ _nm＝ε_mab-370bC_mab+ε_Drug-370bC_Drug
ε_Drug-370：薬物の370 nmでの平均モル吸光係数は19000であり、
C_Drug：薬物の濃度、
ε_mab-370：モノクローナル抗体原液の370 nmでの吸光係数は0であり、
C_mab：モノクローナル抗体原液の濃度、
b：光路長は1 cmである。
（1）と（2）の2つの方程式により、モノクローナル抗体及び薬物の2つの検出波長での吸光係数と濃度データと合わせて、薬物の負荷量を算出することができる。
薬物負荷量＝C_Drug/C_mab。

二、RP-HPLC方法
本開示の一部のADC実施例のDAR値の算出方法は、RP-HPLC（逆相高速液体クロマトグラフィー）を採用したが、具体的には、以下の通りである。
1、測定の方法：
裸の抗体（非結合抗体）と試験用ADC試料（濃度は1 mg/mL）に4 μLのDDT（sigma）を加えて還元し、37℃で1時間水浴した後、取り出して内チューブに入れた。Agilent 1200高效液体クロマトグラフで検出し、カラムとしてAgilent PLRP-S 1000A 8 μm 4.6×250 mmを選択し、カラムの温度：80℃、DAD検出器の波長：280 nm、流速：1 mL/min、注入量：40 μLであり、その後、試料と裸の抗体とのスペクトル比較により、軽重鎖の位置を区別し、そして検出試料のスペクトルに対して積分を行い、DAR値nを算出した。
2、溶液の調製
1）0.25 MのDTT溶液：
調製例：5.78 mgのDTTを取り、精製水150 μLを加えて十分に溶解した後、0.25 MのDTT溶液を取得し、-20℃で保存した。
2）移動相A（0.1%のTFA水溶液）：
調製例：メスシリンダーで精製水1000 mLを量り取り、1 mLのTFA（sigma）を加え、十分に均一に混合した後に使用し、2～8℃で14日間保存した。
3）移動相B（0.1%のTFAアセトニトリル溶液）：
調製例：メスシリンダーでアセトニトリル1000 mLを量り取り、1 mLのTFAを加え、十分に均一に混合した後に使用し、2～8℃で14日間保存した。
3、データの分析
試料と裸の抗体とのスペクトル比較により、軽鎖と重鎖の位置を区別し、そして検出試料のスペクトルに対して積分を行い、DAR値（n）を算出した。
計算公式は、以下の通りである。

LCピーク面積の総和＝LCピーク面積+LC+1ピーク面積
HCピーク面積の総和＝HCピーク面積+HC+1ピーク面積+HC+2ピーク面積+HC+3ピーク面積
LC DAR＝Σ（接続薬物数×ピーク面積パーセンテージ）/ LCピーク面積の総和
HC DAR＝Σ（接続薬物数×ピーク面積パーセンテージ）/ HCピーク面積の総和
DAR=LC DAR+HC DAR。

Claudin18.2抗体-薬物複合体の調製の実施例
実施例3-1、3-2：ADC-1、ADC-2

37℃の条件で、抗体h1902-5を含むPBS緩衝液（pH＝6.5の0.05 MのPBS緩衝水溶液、10.0 mg/mL、320.0 mL、21.62 μmol）にトリ（2-カルボキシエチル）ホスフィン（TCEP）水溶液（10 mM、11.03 mL、110.3 μmol）を加え、水浴発振器に置き、37℃で3時間発振反応させて、反応を停止させた。反応液を水浴で25℃に降温した。
化合物9-A（350 mg、303 μmol）を13.2 mLのアセトニトリルと6.6 mLのDMSOに溶解し、25℃に降温した上記反応液に加え、水浴発振器に置き、25℃で3時間発振反応させて、反応を停止させた。
得られた反応液を、順に5 LのPBS緩衝液（50 mM、pH＝6.5、4%のアセトニトリル、2%のDMSO）と5 Lのコハク酸緩衝液（10 mM、pH＝5.3）で限外ろ過膜精製を行い、小分子を除去し、ショ糖を60 mg/mLまで加え、ツィーン-20を0.2 mg/mLまで加え、最後に、一般式の抗体薬物複合体h1902-5-9-Aの例示的な生成物ADC-1（10 mM、pH＝5.3のコハク酸、10 mg/mL、2.626 g）を調製して得た。収率：81.81%。
UV-HPLCにより平均値を算出する：n＝6.8。
上記方法により、抗体h1902-5に代えて、h1901-11を用いて化合物9-Aと合わせて一般式の抗体薬物複合体h1901-11-9-Aの例示的な生成物ADC-2を調製して得て、DAR値n＝7.1であった。

実施例3-3 ADC-3
37℃の条件で、抗体h1901-11のPBS緩衝水溶液（pH＝6.5の0.05 MのPBS緩衝水溶液、10.0 mg/mL、1 mL、67.5 nmol）に、調製されたトリ（2-カルボキシエチル）ホスフィン（TCEP）の水溶液（10 mM、10.1 μL、101 nmol）を加え、水浴発振器に置き、37℃で3時間発振反応させて、反応を停止させた。反応液を水浴で25℃に降温した。
化合物9-A（0.58 mg、540 nmol）を34 μLのDMSOに溶解し、上記反応液に加え、水浴発振器に置き、25℃で3時間発振反応させて、反応を停止させた。反応液をSephadex G25ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：pHが6.5である0.05 MのPBS緩衝水溶液、0.001 MのEDTA含有）、抗体薬物複合体h1901-11-9-Aの例示的な生成物ADC-3のPBS緩衝液（0.72 mg/mL、11.2 mL）を得て、4℃で貯蔵した。RP-HPLCにより平均値を算出する：n＝2.51。

実施例3-4 ADC-4
37℃の条件で、抗体h1901-11のPBS緩衝水溶液（pH＝6.5の0.05 MのPBS緩衝水溶液、10.0 mg/mL、1 mL、67.5 nmol）に、調製されたトリ（2-カルボキシエチル）ホスフィン（TCEP）の水溶液（10 mM、16.9 μL、169 nmol）を加え、水浴発振器に置き、37℃で3時間発振反応させて、反応を停止させた。反応液を水浴で25℃に降温した。
化合物9-A（0.73 mg、680 nmol）を43 μLのDMSOに溶解し、上記反応液に加え、水浴発振器に置き、25℃で3時間発振反応させて、反応を停止させた。反応液をSephadex G25ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：pHが6.5である0.05 MのPBS緩衝水溶液、0.001 MのEDTA含有）、抗体薬物複合体h1901-11-9-Aの例示的な生成物ADC-4のPBS緩衝液（0.62 mg/mL、12.5 mL）を得て、4℃で貯蔵した。RP-HPLCにより平均値を算出する：n＝4.06。

実施例3-5 ADC-5
37℃の条件で、抗体h1901-11のPBS緩衝水溶液（pH＝6.5の0.05 MのPBS緩衝水溶液、10.0 mg/mL、1 mL、67.5 nmol）に、調製されたトリ（2-カルボキシエチル）ホスフィン（TCEP）の水溶液（10 mM、35.8 μL、358 nmol）を加え、水浴発振器に置き、37℃で3時間発振反応させて、反応を停止させた。反応液を水浴で25℃に降温した。
化合物9-A（1.09 mg、1015 nmol）を64 μLのDMSOに溶解し、上記反応液に加え、水浴発振器に置き、25℃で3時間発振反応させて、反応を停止させた。反応液をSephadex G25ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：pHが6.5である0.05 MのPBS緩衝水溶液、0.001 MのEDTA含有）、抗体薬物複合体h1901-11-9-Aの例示的な生成物ADC-5のPBS緩衝液（0.54 mg/mL、12.5 mL）を得て、4℃で貯蔵した。RP-HPLCにより平均値を算出する：n＝6.8。

実施例3-6 ADC-6
37℃の条件で、抗体h1902-5のPBS緩衝水溶液（pH＝6.5の0.05 MのPBS緩衝水溶液、10.0 mg/mL、1.08 mL、72.9 nmol）に、調製されたトリ（2-カルボキシエチル）ホスフィン（TCEP）の水溶液（10 mM、10.9 μL、109 nmol）を加え、水浴発振器に置き、37℃で3時間発振反応させて、反応を停止させた。反応液を水浴で25℃に降温した。
化合物9-A（0.63 mg、587 nmol）を40 μLのDMSOに溶解し、上記反応液に加え、水浴発振器に置き、25℃で3時間発振反応させて、反応を停止させた。反応液をSephadex G25ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：pHが6.5である0.05 MのPBS緩衝水溶液、0.001 MのEDTA含有）、h1902-5-9-Aの例示的な生成物ADC-6のPBS緩衝液（0.7 mg/mL、13.0 mL）を得て、4℃で貯蔵した。RP-HPLCにより平均値を算出する：n＝2.69。

実施例3-7 ADC-7
37℃の条件で、抗体h1902-5のPBS緩衝水溶液（pH＝6.5の0.05 MのPBS緩衝水溶液、10.0 mg/mL、1.08 mL、72.9 nmol）に、調製されたトリ（2-カルボキシエチル）ホスフィン（TCEP）の水溶液（10 mM、18.3 μL、183 nmol）を加え、水浴発振器に置き、37℃で3時間発振反応させて、反応を停止させた。反応液を水浴で25℃に降温した。
化合物9-A（0.79 mg、736 nmol）を50 μLのDMSOに溶解し、上記反応液に加え、水浴発振器に置き、25℃で3時間発振反応させて、反応を停止させた。反応液をSephadex G25ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：pHが6.5である0.05 MのPBS緩衝水溶液、0.001 MのEDTA含有）、h1902-5-9-Aの例示的な生成物ADC-7のPBS緩衝液（0.6 mg/mL、14.0 mL）を得て、4℃で貯蔵した。RP-HPLCにより平均値を算出する：n＝4.25。

実施例3-8 ADC-8
37℃の条件で、抗体h1902-5のPBS緩衝水溶液（pH＝6.5の0.05 MのPBS緩衝水溶液、10.0 mg/mL、1.08 mL、72.9 nmol）に、調製されたトリ（2-カルボキシエチル）ホスフィン（TCEP）の水溶液（10 mM、38.7 μL、387 nmol）を加え、水浴発振器に置き、37℃で3時間発振反応させて、反応を停止させた。反応液を水浴で25℃に降温した。
化合物9-A（1.18 mg、1099 nmol）を70 μLのDMSOに溶解し、上記反応液に加え、水浴発振器に置き、25℃で3時間発振反応させて、反応を停止させた。反応液をSephadex G25ゲルカラムで脱塩精製し（溶離相：pHが6.5である0.05 MのPBS緩衝水溶液、0.001 MのEDTA含有）、h1902-5-9-Aの例示的な生成物ADC-8のPBS緩衝液（0.56 mg/mL、14.2 mL）を得て、4℃で貯蔵した。RP-HPLCにより平均値を算出する：n＝7.01。

実施例3-9 ADC-9
12℃の条件で、抗体h1902-5を含むヒスチジン-醋酸-Tris/EDTA緩衝液（pH7.2の10 mMのヒスチジン-醋酸-Tris及び2.5 mMのEDTAの緩衝液、20.6 g/L、6.49 L、0.91 mmol）に、調製されたTCEPヒスチジン緩衝液（10 mMのヒスチジン緩衝液、1.717 mM、1.16 L 1.99 mmol）を加え、恒温水浴釜に置き、12℃で2時間撹拌反応させて、反応を停止させ、中間体I溶液を得た。
化合物9-A（4.72 g、4.39 mmol）を0.38 LのDMSOに溶解し、化合物9-AのDMSO溶液を生成した。上記中間体I溶液に0.38 LのDMSOを加えておいてから、上記化合物9-AのDMSO溶液を加え、恒温水浴釜に置き、12℃で1時間撹拌反応させて、反応を停止させた。
上記反応液をCapto S Impact陽イオンクロマトグラフィーカラムにより精製し、それぞれ9つのカラム体積の10%（v/v）のDMSOを含む0.05 Mの醋酸緩衝液（pH＝5.0）と6つのカラム体積の0.05 Mの醋酸緩衝液（pH＝5.0）で洗浄してから、0.05 Mの醋酸、0.30 Mの塩化ナトリウム緩衝液（pH＝5.5）で溶離し、反応液における遊離毒素と残留溶媒を除去した。22℃で、陽イオン溶離液に対して7倍体積と同体積の限外ろ過を行い（限外ろ過膜パッケージは、30 KDのポリセルロース膜パッケージを採用した）、h1902-5-9-Aの例示的な生成物ADC-9を得た。RP-HPLCにより平均値を算出する：n＝4.1。

本実施例から得られた薬物負荷量は、非限定的な実施例であり、当業者は、反応条件と試薬の調整により、異なるDAR値（1～10で、好ましくは1～8、より好ましくは2～8、2～7である）の複合体を得た。

生物学的評価
試験例1：細胞Cellレベル ELISA結合実験
Cell based ELISA実験は、Claudin18.2抗体の結合特性の検出に用いられる。Claudin18.2を安定トランスフェクションして発現したNUGC4細胞を、96ウェル細胞プレートに培養し、90%の密度まで成長した場合、4%のパラホルムアルデヒドを加えて細胞を1時間固定し、PBST緩衝液（pH7.4のPBSに0.05%のTween-20が含まれる）でプレートを3回洗浄した後、PBSで希釈された5%の脱脂乳（光明脱脂粉乳）封止液を200 μL/ウェルで加え、37℃のインキュベータで2.5時間インキュベートし、又は4℃で一晩（16～18時間）放置して封止した。封止完了後に、封止液を捨て、PBST緩衝液でプレートを3回洗浄した後、50 μL/ウェル用試料希釈液（pH7.4のPBSに1%のrミルクが含まれる）で希釈された異なる濃度の試験すべき抗体を加え、37℃のインキュベータで2時間インキュベートした。インキュベートが完了した後、PBSTでプレートを5回洗浄し、100 μL/ウェル用試料希釈液で希釈されたHRPで標識したヒツジ抗ヒト二次抗体（Jackson Immuno Research, 109-035-003）を加え、37℃で1時間インキュベートした。PBSTでプレートを6回洗浄した後、50 μL/ウェルのTMB発色基質（KPL, 52-00-03）を加え、室温で10～15分間インキュベートし、50 μL/ウェルの1 MのH₂SO₄を加えて反応を停止させ、MD Versa Max Tmマイクロプレートリーダーで450 nmでの吸収量を読み取り、Claudin18.2抗体のClaudin18.2への結合EC₅₀値を算出した。

試験例2：抗体の細胞レベルでの結合実験
Claudin18.2を安定トランスフェクションして発現したNUGC4細胞をFACS緩衝液（2%のウシ胎児血清（Gibco, 10099141）pH7.4のPBS（Sigma, P4417-100TAB））で1×10⁶/mLの細胞懸濁液に調製し、100 μL/ウェルで96ウェル円底プレート（Corning, 3795）に加えた。上清を遠心分離して除去した後、50 μL/ウェル用FACS緩衝液で希釈された異なる濃度の試験すべきClaudin18.2抗体を加え、4℃の冷蔵庫に置いて遮光で1時間インキュベートした。FACS緩衝液300 gで3回遠心分離して洗浄した後、作業濃度のAlexa Fluor 488ヒツジ抗ヒトIgG（H+L）（invitrogen, A-11013）を加え、4℃の冷蔵庫に置いて遮光で40分間インキュベートした。FACS緩衝液300 gで3回遠心分離して洗浄した後、BD FACS CantoIIフローサイトメータで幾何平均蛍光強度を検出し、Claudin18.2抗体のClaudin18.2を安定トランスフェクションして発現したNUGC4細胞への結合EC₅₀値を算出し、その結果は、図1に示されている。

試験例3：抗体エンドサイトーシス実験
DyLight 488 NHS Ester（thermofisher, 46403）が予め標識された試験すべきClaudin18.2抗体を、5 μg/mLの最終濃度で1×10⁶/mLのClaudin18.2を安定トランスフェクションして発現したNUGC4細胞に加え、氷上に置いて遮光で1時間インキュベートし、予冷したFACS緩衝液（pH7.4のPBS、2%のウシ胎児血清）で3回遠心分離して洗浄し、上清を除去した後、予熱した完全培地に加え、37℃で5%のCO₂細胞培養器に置いた。それぞれ0、0.5、1、2、4時間後に、細胞を取り出し、氷上に置いて遮光で保存した。試料を全部収集した後、300 gを低温遠心分離して上清を除去し、溶離緩衝液（pH1.7の0.05 Mのグリシン、0.1 Mの塩化ナトリウム）を加えた後、室温で7分間インキュベートし、FACS緩衝液300 gで1回遠心分離して洗浄し、BD FACS CantoIIフローサイトメータで幾何平均蛍光強度を検出し、Claudin18.2抗体のClaudin18.2を安定トランスフェクションして発現したNUGC4細胞へのエンドサイトーシス効率を算出した。その結果（図2を参照）により、ヒト化抗体が良い細胞エンドサイトーシス効率を有することが示されている。

試験例4：フローサイトメトリーに基づく抗体の親和力の測定
実験当日、HEK293/hClaudin18.2細胞をU底96ウェルプレートに収集し、ウェル毎に1～2×10⁵個の細胞を入れた。初期濃度5 μg/mL、2×勾配希釈（12個の濃度点）のヒトClaudin18.2抗体を加え、4℃で1時間インキュベートし、陽性対照をIMAB362とするとともに、抗体が加えられていない陰性対照を設置した。抗体を遠心分離して除去してから、100 μL/ウェルのFITC抗ヒトIgG Fc抗体（200×）を加え、4℃で遮光で30分間インキュベートし、PBS+2%のFBSで2回洗浄した後、フローサイトメータによる検出に備えた。BD FACS CantoIIを起動し、予熱が完了した後、BD FACSDivaソフトウェアをオープンし、新しい実験を確立し、HEK293/hClaudin18.2陰性対照試料を検出し、FSC及びSSC電圧を適切な数値に調整して保存した。Quantum^TM FITC-5 MESF Kitの取扱書によって、ブランク試料B及び検量線1をそれぞれ検出し、FITC電圧を適切な数値に調整して保存した。保存された電圧で、U底96ウェルプレートにおける試料を検出し、データを記録した。Flowjoソフトウェアで実験データを解析してGeo平均値を取得し、Quantum^TM FITC-5 MESF Kitの取扱書によってMESF-Geo Mean検量線をフィッティングし、FITC抗ヒトIgG Fc抗体の濃度蛍光値によって、HEK293/hClaudin18.2細胞と結合したヒトClaudin18.2抗体のモル濃度及び遊離抗体濃度を算出し、Scatchardプロット法で抗体のBmaxと解離定数KDを算出した。その結果は、表13に示されている。

試験例5：抗体のADCC効果の評価
各種のNUGC4細胞（高/中等度/低発現Claudin18.2）を消化し、1000 rpmで遠心分離した後、再懸濁して計数した。細胞を3×10⁵細胞/mLの密度で、10%のFBS（ニュージーランド超低IgGウシ胎児血清, Gibco, 1921005PJ）が加えられたフェノールレッドフリーRPMI 1640（Gibco, 11835-030）に再懸濁した。96ウェルプレート（Corning, 3903）において、ウェル毎に25 μLの細胞（7500個/ウェル）を加えた。抗体を上記フェノールレッドフリー培地において希釈し、3×の抗体希釈液に調製し、細胞プレートに25 μL/ウェルの抗体を加えた。37℃、5%のCO₂培養器において0.5時間インキュベートした。
エフェクター細胞（FcrR3A-V158-NFAT-RE-Jurkat細胞）を収集し、1000 rpmで遠心分離した後、再懸濁して計数した。細胞を3×10⁶細胞/mLの密度で、10%のFBS（ニュージーランド超低IgGウシ胎児血清）が加えられたフェノールレッドフリーRPMI 1640に再懸濁し、実験プレートにおいて、ウェル毎に25 μLの細胞（7.5×10⁴個の細胞/ウェル）を加えた。37℃、5%のCO₂培養器において6時間インキュベートした。
実験プレートの各ウェルに75 μL/ウェルのBright-Glo（Promega, E2610）を加え、マイクロプレートリーダー（PerkinElmer, VITOR3）で化学発光（luminescence）を検出した。
その結果（表14と図3A～図3Cを参照）により、Claudin18.2発現レベルが低（図3A）-中等度（図3B）-高（図3C）のように異なるNUGC4細胞において、抗体h1901-11とh1902-5は、いずれも非常に強いADCC活性を示すことが示されている。

試験例6：化合物による腫瘍細胞の体外増殖への阻害試験
一、試験の目的
本実験の目的は、本開示の薬物化合物の、U87MG細胞（グリオーマ細胞, 中科院細胞バンク, Catalog # TCHu138）及びSK-BR-3腫瘍細胞（ヒト乳がん細胞, ATCC, 製品番号：HTB-30）の体外増殖への阻害活性を検出することである。異なる濃度の化合物で細胞を体外処理し、6日間培養した後、CTG（CellTiter-Glo^(R) Luminescent Cell Viability Assay, Promega, 製品番号：G7573）試薬で細胞の増殖を検出し、IC₅₀値によって当該化合物の体外活性を評価した。

二、実験の方法
以下、U87MG細胞の体外増殖への阻害の試験方法を例として、本開示の化合物の腫瘍細胞への体外増殖阻害活性の試験方法を例示的に説明する。本方法は、同様に、他の腫瘍細胞への体外増殖阻害活性の試験に適用されるが、それらに限定されない。
1、細胞の培養：U87MG及びSK-BR-3細胞を、それぞれ10%のFBSのEMEM培地（GE, 製品番号：SH30024.01）及び10%のFBSを含むMcCoy's 5A培地（Gibco, 製品番号16600-108）で培養した。
2、細胞の準備：対数増殖期のU87MG及びSK-BR-3細胞を取り、PBS（リン酸塩緩衝液, 上海源培生物科技股▲ふん▼有限会社）で1回洗浄した後、2～3 mLのトリプシン（0.25%のTrypsin-EDTA（1x）, Gibico, Life Technologies社）を加えて2～3分間消化し、細胞が完全に消化された後、10～15 mLの細胞培養液を加え、消化された細胞を溶離し、1000 rpmで5分間遠心分離し、上清を捨てから、10～20 mLの細胞培養液を加えて細胞を再懸濁し、単細胞懸濁液に調製した。
3、細胞のプレートへの播種：U87MG及びSK-BR-3単細胞懸濁液を均一に混合し、細胞培養液で生細胞密度を2.75×10³ cells/mLと8.25×10³ cells/mLにそれぞれ調整し、密度が調整された細胞懸濁液を均一に混合し、180 μL/ウェルで96ウェル細胞培養プレートに加えた。96ウェルプレートの外周ウェルには、200 μL培地のみを加えた。培養プレートを培養器において24時間（37℃、5%のCO₂）培養した。
4、化合物の準備：DMSO（ジメチルスルホキシド, 上海泰坦科技股▲ふん▼有限公司）で化合物を溶解し、初期濃度が10 mMの貯蔵液に調製した。
小分子化合物は、初期濃度が500 nMであり、配合方法が以下の通りである。
96ウェルU底配合プレートの第1列に、異なる試験すべき試料30 μLをそれぞれ加え、試料濃度を100 μMとし、第2～11列の各ウェルに20 μLのDMSOを加えた。第1列の試料10 μLを取って第2列の20 μLのDMSOに加え、均一に混合し、10 μLを取って第3列に加え、このように、第10列まで類推した。配合プレートにおける薬を、ウェル毎に5 μLを取り、95 μLのEMEM培地に加え、均一に混合して使用に備えた。
ADCは、初期濃度が10 nM又は500 nMであり、配合方法が以下の通りである。
96ウェルプレートの第1列に、異なる試験すべき試料100 μLをそれぞれ加え、試料濃度を100 nM又は5 μMとし、第2～11列の各ウェルに100 μLのPBSを加えた。第1列の試料50 μLを取って第2列の100 μLのPBSに加え、均一に混合し、50 μLを取って第3列に加え、このように、第10列まで類推して3倍希釈した。
5、試料添加の操作：培養プレートに、調製された異なる濃度の試験すべき試料20 μLを加え、それぞれの試料を2つの平行ウェルに加えた。培養プレートを培養器において6日間（37℃、5%のCO₂）インキュベートした。
6、発色操作：96ウェル細胞培養プレートを取り出し、ウェル毎に90 μLのCTG溶液を加え、室温で10分間インキュベートした。
7、プレートの読み取り操作：96ウェル細胞培養プレートを取り出し、マイクロプレートリーダー（BMG labtech, PHERAstar FS）に置いて、マイクロプレートリーダーで化学発光を測定した。

三、データの分析
Microsoft Excel、Graphpad Prismで5対のデータを処理して分析した。実験例の結果は、下表を参照する。

試験例7：ADC分子の細胞活性実験
本実験は、CellTiter-Glo Luminescence Cell Viability Assayにより、ADC分子の体外でのヒト胃がん細胞株への殺傷作用を検出した。1日目に、NUGC4-claudin18.2低発現、NUGC4-claudin18.2中等度発現、及びNUGC4-claudin18.2高発現細胞を収集し、密度を2.5×10⁴/mLに調整し、90 μL/ウェルで96ウェル白色透明底板に加え、各ウェルには約2500個の細胞がある。37℃、5%のCO₂培養器で一晩培養した。2日目に、U底96ウェルプレートで試料を希釈し、初期濃度5 μM、4×勾配希釈、9つの濃度点であり、細胞プレートに希釈された試料を10 μL/ウェルで加えた。37℃、5%のCO₂で6日間培養した。8日目に、細胞培養プレートを取り出し、50 μL/ウェルのCell Titer-Glo Reagentを加え、室温で2～3分間放置し、PHERAstar FSプレートリーダーで蛍光値を読み取った。GraphPad Prismソフトウェアでデータの分析を行った。その結果は、表16に示されている。

体内活性の生物学的評価
試験例8：ADC分子の体内薬効の評価
Balb/cヌードは、右リブ部皮下にヒト胃がん細胞NUGC4（Claudin18.2中等度発現）細胞（5×10⁶の50%のmatrigelマトリゲル/匹を含む）を接種し、0日目に群分け、8 匹/群で、合計で5群であった。平均腫瘍体積は、約84.41 mm³であった。
ADCを腹腔内に注射し、合計で3回投与し、1匹に体重に応じて10 g/0.1 mL注射し、それぞれ、0日目、4日目、11日目に投与した。
群分け当日から、ADCを腹腔内に注射し、合計で4回投与し、5日おきに投与し、1匹に体重に応じて10 g/0.1 mL注射した。
腫瘍の体積と体重を週2回計測し、データを記録した。
Excel 2003統計ソフトウェアを用いて、平均値をavgで算出し、SD値をSTDEVで算出し、SEM値をSTDEV/SQRTで算出し、群間差異P値をTTESTで算出した。
腫瘍体積（V）の計算公式：V＝1/2×L_長×L_短 ²
相対体積（RTV）＝VT/V0
腫瘍阻害率（%）＝（CRTV-TRTV）/CRTV（%）
ただし、V0、VTは、それぞれ実験開始時（初回投与当日が0日目）及び計測計数時の腫瘍体積である。CRTV、TRTVは、それぞれ、実験終了時のブランク対照群及び実験群の相対腫瘍体積である。その結果は、表17と図4、図5に示されている。

Claims

一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩であって、

ただし、
Yは、-O-（CR^aR^b）_m-CR¹R²-C（O）-、-O-CR¹R²-（CR^aR^b）_m-、-O-CR¹R²-、-NH-（CR^aR^b）_m-CR¹R²-C（O）-及び-S-（CR^aR^b）_m-CR¹R²-C（O）-から選ばれ、
R^aとR^bは、相同又は相異であり、それぞれ独立的に水素原子、重水素原子、ハロゲン、アルキル基、ハロゲン化アルキル基、重水素化アルキル基、アルコキシ基、ヒドロキシ基、アミノ基、シアノ基、ニトロ基、ヒドロキシアルキル基、シクロアルキル基及びヘテロシクリル基から選ばれ、又は、R^aとR^bは、それらに接続された炭素原子とともに、シクロアルキル基又はヘテロシクリル基を形成し、
R¹は、ハロゲン、ハロゲン化アルキル基、重水素化アルキル基、シクロアルキル基、シクロアルキルアルキル基、アルコキシアルキル基、ヘテロシクリル基、アリール基及びヘテロアリール基から選ばれ、R²は、水素原子、ハロゲン、ハロゲン化アルキル基、重水素化アルキル基、シクロアルキル基、シクロアルキルアルキル基、アルコキシアルキル基、ヘテロシクリル基、アリール基及びヘテロアリール基から選ばれ、又は、R¹とR²は、それらに接続された炭素原子とともに、シクロアルキル基又はヘテロシクリル基を形成し、
又は、R^aとR²は、それらに接続された炭素原子とともに、シクロアルキル基又はヘテロシクリル基を形成し、
mは、0～4の整数であり、
nは1～10で、nは小数又は整数であり、
Lは、リンカーユニットであり、
Pcは、抗Claudin18.2抗体又はその抗原結合断片である、
一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
前記抗Claudin18.2抗体又はその抗原結合断片は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含み、そのうち、
i）前記重鎖可変領域は、SEQ ID NO：3配列で表される重鎖可変領域のHCDR1、HCDR2及びHCDR3と同じ配列を有するHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、前記軽鎖可変領域は、SEQ ID NO：4配列で表される軽鎖可変領域のLCDR1、LCDR2及びLCDR3と同じ配列を有するLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、又は
ii）前記重鎖可変領域は、SEQ ID NO：5配列で表される重鎖可変領域のHCDR1、HCDR2及びHCDR3と同じ配列を有するHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、前記軽鎖可変領域は、SEQ ID NO：6配列で表される軽鎖可変領域のLCDR1、LCDR2及びLCDR3と同じ配列を有するLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含む、
請求項1に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
前記抗Claudin18.2抗体又はその抗原結合断片は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含み、そのうち、
iii）前記重鎖可変領域は、配列がそれぞれSEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10及びSEQ ID NO：11で表されるHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、前記軽鎖可変領域は、配列がそれぞれSEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13及びSEQ ID NO：14で表されるLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、又は
iv）前記重鎖可変領域は、配列がそれぞれSEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16及びSEQ ID NO：17で表されるHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、前記軽鎖可変領域は、配列がそれぞれSEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19及びSEQ ID NO：20で表されるLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含む、
請求項1又は2に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
前記抗Claudin18.2抗体は、マウス抗体、キメラ抗体又はヒト化抗体である、請求項1～3の何れか一項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
前記抗Claudin18.2抗体又はその抗原結合断片は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含み、そのうち、
（1）前記重鎖可変領域は、アミノ酸配列がSEQ ID NO：3で表され又はそれと少なくとも90%の同一性を有し、及び前記軽鎖可変領域は、アミノ酸配列がSEQ ID NO：4で表され又はそれと少なくとも90%の同一性を有し、
（2）前記重鎖可変領域は、アミノ酸配列がSEQ ID NO：24で表され又はそれと少なくとも90%の同一性を有し、及び前記軽鎖可変領域は、アミノ酸配列がSEQ ID NO：21で表され又はそれと少なくとも90%の同一性を有し、
（3）前記重鎖可変領域は、アミノ酸配列がSEQ ID NO：5で表され又はそれと少なくとも90%の同一性を有し、及び前記軽鎖可変領域は、アミノ酸配列がSEQ ID NO：6で表され又はそれと少なくとも90%の同一性を有し、又は
（4）前記重鎖可変領域は、アミノ酸配列がSEQ ID NO：31で表され又はそれと少なくとも90%の同一性を有し、及び前記軽鎖可変領域は、アミノ酸配列がSEQ ID NO：28で表され又はそれと少なくとも90%の同一性を有する、
請求項1～4の何れか一項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
前記抗Claudin18.2抗体は、ヒト化抗体であり、前記ヒト化抗体は、ヒト抗体由来のフレームワーク領域又はそのフレームワーク領域変異体を含み、前記フレームワーク領域変異体は、ヒト抗体の軽鎖フレームワーク領域及び/又は重鎖フレームワーク領域にそれぞれ多くとも10個のアミノ酸を有する復帰変異であり、
好ましくは、前記フレームワーク領域変異体は、以下の（a）又は（b）から選ばれる変異を含み、すなわち、
（a）前記軽鎖可変領域は、任意に22S、85I及び87Hから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸復帰変異を含み、及び/又は前記重鎖可変領域は、任意に48I、82T及び69Mから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸復帰変異を含み、又は
（b）前記軽鎖可変領域は、任意に4L及び22Sから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸復帰変異を含み、及び/又は前記重鎖可変領域は、任意に38K、40R、48I、66K、67A、69L、71L及び73Kから選ばれる1つ又は複数のアミノ酸復帰変異を含み、
好ましくは、前記フレームワーク領域変異体は、以下から選ばれる変異を含み、すなわち、
（a-1）前記軽鎖可変領域は、22S、85I及び87Hのアミノ酸復帰変異を含み、及び前記重鎖可変領域は、48I及び82Tのアミノ酸復帰変異を含み、又は
（b-1）前記軽鎖可変領域は、4Lのアミノ酸復帰変異を含む、
請求項1～5の何れか一項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
前記抗Claudin18.2抗体又はその抗原結合断片は、以下に示す重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含み、
（vii）前記重鎖可変領域は、配列がSEQ ID NO：3で表され、及び前記軽鎖可変領域は、配列がSEQ ID NO：4で表され、
（viii）前記重鎖可変領域は、配列がSEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26又はSEQ ID NO：27で表され、及び前記軽鎖可変領域は、配列がSEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22又はSEQ ID NO：23で表され、
（ix）前記重鎖可変領域は、配列がSEQ ID NO：5で表され、及び前記軽鎖可変領域は、配列がSEQ ID NO：6で表され、又は
（x）前記重鎖可変領域は、配列がSEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33又はSEQ ID NO：34で表され、及び前記軽鎖可変領域は、配列がSEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29又はSEQ ID NO：30で表され、
好ましくは、前記抗Claudin18.2抗体又はその抗原結合断片は、以下に示す重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含み、すなわち、
（xi）前記重鎖可変領域は、配列がSEQ ID NO：31で表され、及び前記軽鎖可変領域は、配列がSEQ ID NO：29で表され、又は
（xii）前記重鎖可変領域は、配列がSEQ ID NO：26で表され、及び前記軽鎖可変領域は、配列がSEQ ID NO：23で表される、
請求項1～6の何れか一項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
前記抗Claudin18.2抗体又はその抗原結合断片は、抗体重鎖定常領域と軽鎖定常領域を含み、
好ましくは、前記重鎖定常領域は、ヒトIgG1、IgG2、IgG3及びIgG4定常領域及びその通常変異体から選ばれ、前記軽鎖定常領域は、ヒト抗体κとλ鎖定常領域及びその通常変異体から選ばれ、
より好ましくは、前記抗Claudin18.2抗体又はその抗原結合断片は、配列がSEQ ID NO：7で表される重鎖定常領域と、配列がSEQ ID NO：8で表される軽鎖定常領域とを含み、
最も好ましくは、前記抗Claudin18.2抗体又はその抗原結合断片は、SEQ ID NO：35又はSEQ ID NO：42で表される重鎖と少なくも90%の配列同一性を有する重鎖と、SEQ ID NO：36又はSEQ ID NO：39で表される軽鎖と少なくも90%の配列同一性を有する軽鎖とを含み、又は
SEQ ID NO：37又はSEQ ID NO：49で表される重鎖と少なくも90%の配列同一性を有する重鎖と、SEQ ID NO：38又はSEQ ID NO：46で表される軽鎖と少なくも90%の配列同一性を有する軽鎖とを含む、
請求項1～7の何れか一項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
前記抗Claudin18.2抗体又はその抗原結合断片は、
（c）配列がSEQ ID NO：35で表される重鎖と配列がSEQ ID NO：36で表される軽鎖、
（d）配列がSEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44又はSEQ ID NO：45で表される重鎖と配列がSEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40又はSEQ ID NO：41で表される軽鎖、
（e）配列がSEQ ID NO：37で表される重鎖と配列がSEQ ID NO：38で表される軽鎖、又は
（f）配列がSEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51又はSEQ ID NO：52で表される重鎖と配列がSEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47又はSEQ ID NO：48で表される軽鎖を含む、
請求項1～8の何れか一項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
前記抗Claudin18.2抗体は、
アミノ酸配列がSEQ ID NO：44で表される重鎖とSEQ ID NO：41で表される軽鎖とを含むh1901-11、又は
アミノ酸配列がSEQ ID NO：49で表される重鎖とSEQ ID NO：47で表される軽鎖とを含むh1902-5から選ばれる、
請求項1～9の何れか一項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
nは、2～8の小数又は整数であり、好ましくは、3.5～4.5の小数又は整数である、請求項1～10の何れか一項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
Yは、-O-（CR^aR^b）_m-CR¹R²-C（O）-であり、
R^aとR^bは、相同又は相異であり、それぞれ独立的に水素原子、重水素原子、ハロゲン又はアルキル基から選ばれ、
R¹は、ハロゲン化アルキル基又はC_3-6シクロアルキル基であり、
R²は、水素原子、ハロゲン化アルキル基又はC_3-6シクロアルキル基から選ばれ、
又は、R¹とR²は、それらに接続された炭素原子とともに、C_3-6シクロアルキル基を形成し、
mは、0又は1である、
請求項1～11の何れか一項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
Yは、

から選ばれ、
ただし、YのO端は、リンカーユニットLに接続されている、
請求項1～12の何れか一項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
リンカーユニット-L-は、-L¹-L²-L³-L⁴-であり、
L¹は、-（スクシンイミド-3-イル-N）-W-C（O）-、-CH₂-C（O）-NR³-W-C（O）-又は-C（O）-W-C（O）-から選ばれ、ただし、Wは、C_1-8アルキル基、C_1-8アルキル基-C_3-6シクロアルキル基及び1～8個の鎖原子の直鎖ヘテロアルキル基から選ばれ、前記ヘテロアルキル基は、N、O及びSから選ばれる1～3個のヘテロ原子を含み、前記C_1-8アルキル基、C_1-8アルキル基-C_3-6シクロアルキル基又は1～8個の鎖原子の直鎖ヘテロアルキル基は、それぞれ独立的に、任意にハロゲン、ヒドロキシ基、シアノ基、アミノ基、アルキル基、クロロアルキル基、重水素化アルキル基、アルコキシ基及びシクロアルキル基から選ばれる1つ又は複数の置換基でさらに置換され、
L²は、-NR⁴（CH₂CH₂O）p¹CH₂CH₂C（O）-、-NR⁴（CH₂CH₂O）p¹CH₂C（O）-、-S（CH₂）p¹C（O）-又は化学結合から選ばれ、ただし、p¹は1～20の整数であり、
L³は、2～7個のアミノ酸からなるペプチド残基であり、そのうち、前記アミノ酸は、フェニルアラニン、グリシン、バリン、リジン、シトルリン、セリン、グルタミン酸及びアスパラギン酸におけるアミノ酸で形成されたアミノ酸残基から選ばれ、且つ任意にハロゲン、ヒドロキシ基、シアノ基、アミノ基、アルキル基、クロロアルキル基、重水素化アルキル基、アルコキシ基及びシクロアルキル基から選ばれる1つ又は複数の置換基でさらに置換され、
L⁴は、-NR⁵（CR⁶R⁷）_t-、-C（O）NR⁵-、-C（O）NR⁵（CH₂）_t-及び化学結合から選ばれ、ただし、tは1～6の整数であり、
R³、R⁴及びR⁵は、相同又は相異であり、それぞれ独立的に水素原子、アルキル基、ハロゲン化アルキル基、重水素化アルキル基及びヒドロキシアルキル基から選ばれ、
R⁶とR⁷は、相同又は相異であり、それぞれ独立的に水素原子、ハロゲン、アルキル基、ハロゲン化アルキル基、重水素化アルキル基及びヒドロキシアルキル基から選ばれる、
請求項1～13の何れか一項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
リンカーユニット-L-は、-L¹-L²-L³-L⁴-であり、
L¹は

であり、s¹は2～8の整数であり、
L²は、化学結合であり、
L³はテトラペプチド残基であり、好ましくは、GGFGのテトラペプチド残基であり、
L⁴は、-NR⁵（CR⁶R⁷）t-であり、R⁵、R⁶又はR⁷は、相同又は相異であり、それぞれ独立的に水素原子又はアルキル基であり、tは1又は2であり、
ただし、L¹末端はPcに接続され、L⁴末端はYに接続されている、
請求項1～14の何れか一項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
-L-は、

である、
請求項1～15の何れか一項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
-L-Y-は、任意に

から選ばれる、
請求項1～16の何れか一項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
一般式（Pc-L_a-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩であり、

ただし、
W、L²、L³、R⁵、R⁶、R⁷は、請求項14に定義された通りであり、
Pc、n、R¹、R²、mは、請求項1に定義された通りである、
請求項1～17の何れか一項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
一般式（Pc-L_b-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩であり、

ただし、
s¹は、2～8の整数であり、
Pc、R¹、R²、R⁵～R⁷、m及びnは、請求項18に定義された通りである、
請求項1～18の何れか一項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
前記リガンド-薬物複合体は、

から選ばれ、
ただし、Pcとnは、請求項1に定義された通りである、
請求項1～19の何れか一項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
前記リガンド-薬物複合体は、

から選ばれ、
ただし、nは、請求項1に定義された通りであり、抗体h1902-5、h1901-11は、請求項10に定義された通りである、
請求項1～20の何れか一項に記載の一般式（Pc-L-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩。
一般式（Pc-L_a-Y-D）で表されるリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩を調製する方法であって、

Pc’を一般式（L_a-Y-D）で表される化合物とカップリング反応し、一般式（Pc-L_a-Y-D）で表される化合物を得るステップを含み、
ただし、
Pcは、抗Claudin18.2抗体又はその抗原結合断片であり、Pc’は、Pcを還元して得たものであり、
W、L²、L³、R¹、R²、R⁵～R⁷、m及びnは、請求項18に定義された通りである、
方法。
請求項1～21の何れか一項に記載のリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩と、1種又は複数種の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体とを含む、薬物組成物。
請求項1～21の何れか一項に記載のリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩、又は請求項23に記載の薬物組成物の、Claudin18.2媒介の疾患又は病状を治療するための薬物の調製における用途。
前記Claudin18.2媒介の疾患又は病状は、Claudin18.2高発現がんである、請求項24に記載の用途。
請求項1～21の何れか一項に記載のリガンド-薬物複合体又はその薬学的に許容される塩、又は請求項23に記載の薬物組成物の、腫瘍とがんを治療及び/又は予防する薬物の調製における用途であって、
前記腫瘍とがんは、頭頸部扁平上皮がん、頭頸部がん、脳がん、神経膠腫、多形性膠芽腫、神経芽細胞腫、中枢神経系がん、神経内分泌腫瘍、咽頭がん、鼻咽頭がん、食道がん、甲状腺がん、悪性胸膜中皮腫、肺がん、乳がん、肝がん、肝胆がん、膵臓がん、胃がん、消化管がん、腸がん、結腸がん、結腸直腸がん、腎がん、明細胞腎細胞がん、卵巣がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、膀胱がん、前立腺がん、精巣がん、皮膚がん、黒色腫、白血病、リンパ腫、骨がん、軟骨肉腫、骨髄腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、クルッケンベルグ腫瘍、骨髄増殖性腫瘍、扁平上皮がん、ユーイング肉腫、全身性軽鎖アミロイドーシス及びメルケル細胞がんが好ましく、より好ましくは、前記リンパ腫は、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、縦隔原発大細胞型B細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、T細胞/組織球に富む大細胞型B細胞リンパ腫及びリンパ形質細胞性リンパ腫から選ばれ、前記肺がんは、非小細胞肺がんと小細胞肺がんから選ばれ、前記白血病は、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、リンパ性白血病、リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病及び骨髄細胞白血病から選ばれる、
用途。