CN102268087A

CN102268087A - 针对狂犬病病毒核蛋白保守线性表位肽的单抗的制备方法

Info

Publication number: CN102268087A
Application number: CN201110176872XA
Authority: CN
Inventors: 吕新军; 马学军; 唐青
Original assignee: National Institute for Viral Disease Control and Prevention Chinese Center for Disease Control and Prevention
Current assignee: National Institute for Viral Disease Control and Prevention Chinese Center for Disease Control and Prevention
Priority date: 2011-06-28
Filing date: 2011-06-28
Publication date: 2011-12-07

Abstract

本发明一种针对狂犬病病毒核蛋白保守线性表位肽的单抗的制备方法，属于免疫球蛋白技术领域。所述方法包括：制备免疫原、用免疫原对Balb/c小鼠进行注射免疫和杂交瘤细胞株的筛选步骤。本发明具有首次采用多血清型狂犬病病毒核蛋白保守线性表位肽作为免疫原制备特异性单克隆抗体，所得的单抗不仅可以经过FITC标记用于FAT，也可以经过HRP标记应用于直接快速免疫组化法以及双抗夹心ELISA法检测组织标本内的狂犬病病毒；同时本发明的方法不需要特殊的设备，在现有狂犬病流行较严重的国家的现有条件下的普通实验室水平均可进行操作的优点。

Description

针对狂犬病病毒核蛋白保守线性表位肽的单抗的制备方法

技术领域：

本发明属于免疫球蛋白技术领域，具体涉及一种针对狂犬病病毒核蛋白保守线性表位肽的单抗的制备方法。

背景技术：

敏感高效的荧光标记抗狂犬病病毒核蛋白单克隆抗体诊断试剂是检测狂犬病病毒的荧光抗体试验(fluorescent antibody test，FAT)成功的关键因素(WHO Technical ReportSeries 931，WHO Expert Consultation On Rabies)。一般采用狂犬病病毒全病毒或表达的狂犬病病毒核蛋白作为免疫原制备抗狂犬病病毒核蛋白单克隆抗体，单抗的筛选和鉴定工作量较大，但是相对选择空间较大。

狂犬病主要危及亚非发展中和不发达国家农村地区民众，因此这些国家对狂犬病实验室诊断技术和产品的需求也最迫切。但目前WHO推荐的抗狂犬病病毒核蛋白单克隆抗体诊断试剂由FFujirebio Diagnostics Inc.和Millipore公司提供，价格较昂贵，并且来源有限，适合发展中国家普遍实验室条件的狂犬病诊断技术和来源方便的诊断试剂产品是在这些国家提高狂犬病实验室诊断率的重要因素之一，狂犬病流行较严重的国家有必要依据其普遍的实验室水平开发可以方便获取的抗狂犬病病毒核蛋白单克隆抗体，以确保在既有条件下可以正常开展必需的狂犬病实验室诊断。

发明内容：

Lv XJ等已经证实狂犬病病毒核蛋白152到164位氨基酸区段KISGQNTGNYKTN是各血清型狂犬病病毒核蛋白保守线性表位肽(吕新军，马学军.新型抗狂犬病病毒核蛋白抗体进行RFFIT检测效果评估.国际检验医学杂志，2011，32：721-722.)，在此基础上采用经典杂交瘤细胞技术制备针对该线性表位肽的单克隆抗体株，有可能获得与多个血清型狂犬病病毒反应的抗狂犬病病毒核蛋白单克隆抗体作为诊断试剂。采用合成肽制备抗狂犬病病毒核蛋白单克隆抗体，由于免疫原所含抗原决定簇较少，单抗筛选和鉴定工作相对简单，理论上获得的单抗株数量也较有限。本发明尝试采用多血清型狂犬病病毒核蛋白保守线性表位肽作为免疫原制备特异性单克隆抗体，并初步用于狂犬病实验室诊断，是开发抗狂犬病病毒核蛋白单克隆抗体诊断试剂的一种新尝试。

为了解决目前诊断试剂价格昂贵，不适合发展中国家普遍实验条件的问题，同时为了在合成肽制备抗狂犬病病毒核蛋白单克隆抗体(单抗)时能够获得大量的单抗，本发明提供了一种针对狂犬病病毒核蛋白保守线性表位肽的单抗的制备方法。

本发明的技术方案如下：

一种针对狂犬病病毒核蛋白保守线性表位肽的单抗的制备方法，包括下述步骤：

(1)、多肽的制备：在狂犬病病毒核蛋白第152到164位氨基酸区段的N端加C，得到多肽CKISGQNTGNYKTN；

(2)、免疫原的制备：将多肽与已活化的KLH进行耦联，得到免疫原；

(3)、初次免疫：取免疫原与弗氏完全佐剂充分乳化，对Balb/c小鼠腹部多点皮下注射免疫；

(4)、第一次强化免疫：初次免疫3周后，取免疫原与弗氏不完全佐剂充分乳化，对Balb/c小鼠腹部多点皮下注射免疫；

(5)、第二次强化免疫：初次免疫5周后，取免疫原与弗氏不完全佐剂充分乳化，对Balb/c小鼠腹部多点皮下注射免疫；

(6)、杂交瘤细胞株的筛选：取小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞融合，对融合后细胞采用间接ELISA和IFA双重筛选，选择阳性的克隆进行亚克隆，得到产生所述针对狂犬病病毒核蛋白保守线性表位肽的单抗的杂交瘤细胞株。

上述技术方案中所述的制备方法，其中，所述制备方法还包括针对狂犬病病毒核蛋白保守线性表位肽的单抗的纯化和标记步骤，具体所述纯化和标记步骤为：将获得的杂交瘤细胞株腹腔接种Balb/c小鼠，对腹水用DEAE-Sephadex A-50进行柱层析，然后采用FITC(fluorescein isothiocyanate，异硫氰酸荧光素)进行标记。

上述技术方案中所述的制备方法，其中，所述步骤(2)中的KLH活化过程为：将KLH与交联剂SMCC混合，室温旋转反应30min，使KLH充分活化，用多肽偶联缓冲液平衡的SephadexG-25柱层析除去游离成分，得到活化的KLH。

上述技术方案中所述的制备方法，其中，所述免疫原是将多肽加入已活化的KLH中室温下旋转反应2小时，耦联好的产物即为免疫原。

本发明具有以下有益效果：

本发明首次采用多血清型狂犬病病毒核蛋白保守线性表位肽作为免疫原制备特异性单克隆抗体，所得的单抗不仅可以经过FITC标记用于FAT，也可以经过HRP标记应用于直接快速免疫组化法(direct rapid immunohistochemical test，dRIT)以及双抗夹心ELISA法(sandwich ELISAnamed WELYSSA)检测组织标本内的狂犬病病毒；同时本发明的方法不需要特殊的设备，在现有狂犬病流行较严重的国家的现有条件下的普通实验室水平均可进行操作。

附图说明：

1、图1为杂交瘤细胞培养上清IFA检测结果(200×)；

2、图2为阳性克隆接种Balb/c小鼠所得腹水1∶200稀释度IFA检测结果(200×)；

3、图3为SDS-PAGE检测纯化后抗体纯度；

4、图4为FITC标记抗多肽单克隆抗体进行狂犬病病毒感染犬脑组织FAT检测(200×)。

具体实施方式：

为使本发明的技术方案便于理解，以下结合说明书附图和具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1：

一、多肽合成及KLH耦联：

多肽合成由上海楚肽生物科技有限公司在ABI 433peptide synthesizer上合成，序列CKISGQNTGNYKTN(N端加C)合成总量10mg，5mg/管分装保存；

多肽耦联采用PIERCE公司ImjectMaleimide Activated Immunogen Conjugation Kitwith mcKLH and BSA Kit。具体方法为：首先，将KLH与交联剂SMCC混合，室温旋转反应30min，使KLH充分活化，用多肽偶联缓冲液平衡的SephadexG-25柱层析除去游离成分；然后，将多肽加入已活化的KLH中室温旋转反应2h，偶联好的产物作为免疫原免疫动物。

二、动物免疫：

采用上述免疫原以腹部多点皮下免疫方式免疫2只清洁级6w龄成年Balb/c小鼠，实验动物从市场购买或由中国医学科学院实验动物中心提供。开始免疫前经尾缘静脉采血0.2ml，分离血清，按照5μg/ml采用合成肽包被96孔板，以HRP标记羊抗鼠IgG二抗进行间接ELISA检测血清抗多肽抗体背景。

初次免疫采用完全弗氏佐剂混合免疫原，注射剂量600μg/只；初免后3w、5w分别进行第1次、第2次强化免疫，采用不完全弗氏佐剂混合免疫原，注射剂量400μg/只。初免后6w再次间接ELISA检测血清抗多肽抗体效价，要求效价高于1∶10000方可使用。

合成肽对Balb/c小鼠的免疫效果如表1所示，2只Balb/c小鼠免疫前血清检测显示血清背景低，适合进行目的抗原的免疫；3次免疫后血清的间接ELISA检测显示2只小鼠血清内抗多肽抗体效价分别为1∶27,000和1∶8,1000，选择血清内抗多肽抗体效价较高的小鼠进行后续的单克隆抗体制备。

表1间接ELISA检测免疫前后血清OD值结果

注：检测结果判断标准OD_阳/OD_阴＞2.1，且OD值＞0.1

三、单克隆抗体杂交瘤细胞的筛选

取抗血清效价达到要求的小鼠脾细胞，依据本领域技术人员常用的标准杂交瘤细胞技术(

G，Milstein C.1975.Continuous cultures of fused cells secreting antibody ofpredefined specificity.Nature.256：495-497.)将小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞融合，制备鼠源单克隆抗体。

对融合后的杂交瘤细胞培养上清采用HRP标记羊抗鼠IgG二抗进行间接ELISA，检测获得的杂交瘤细胞株上清中是否有抗多肽抗体；采用FITC标记羊抗鼠IgG二抗和感染狂犬病病毒CVS-11的BSR细胞进行间接免疫荧光试验(indirect fluorescent antibody，IFA)，检测获得的杂交瘤细胞株上清中是否有抗狂犬病病毒抗体。选择两种检测方法均为阳性的克隆进行两次亚克隆，保证抗体分泌的稳定性。在对融合后的杂交瘤细胞培养上清的ELISA检测阳性的克隆共16个，对这16个克隆进行IFA复核，其中有2个仍然阳性，编号为RVNP-mAb1和RVNP-mAb2，结果如图1所示，其中(a)RVNP-mAb1；(b)RVNP-mAb2；(c)Negative control。

将IFA检测也为阳性的上述2个杂交瘤细胞株腹腔接种Balb/c小鼠，收获腹水，以PBS液(pH 7.2，0.01M)将腹水以50倍递增进行系列稀释，即从1∶50、1∶100、1∶150、1∶200…稀释至1∶500，各稀释度均如上采用IFA检测腹水内单克隆抗体，在1∶200稀释度仍然有较强的阳性信号，并且RVNP-mAb1强于RVNP-mAb2，如图2所示，其中(a)RVNP-mAb1；(b)RVNP-mAb2；(c)Negative control，显示小鼠腹水内产生的单克隆抗体浓度较高，并且产生的单克隆抗体类型为IgG免疫球蛋白，可以大量制备上述单克隆抗体并用于抗体纯化。

四、单克隆抗体的纯化和标记

选取RVNP-mAb1单克隆抗体株腹腔接种10只Balb/c小鼠，收获的腹水共计50ml，采用Pharmacia公司DEAE-Sephadex A-50(二乙氨基—乙基-葡萄糖凝胶A-50)柱层析3次纯化IgG免疫球蛋白，10％SDS-PAGE检测抗体纯度获得单一条带，结果如图3所示，其中图3中1为蛋白Marker；2为纯化单克隆抗体；采用DU800核酸-蛋白分析仪进行纯化蛋白定量，获得纯化的RVNP-mAb1浓度为20mg/ml，共40ml；

将纯化的RVNP-mAb1采用Solarbio(SIGMA分装)异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate，FITC)标记纯化的IgG免疫球蛋白；采用Pharmacia公司Sephadex G-25(葡聚糖凝胶G-25)去除未标记抗体；所有步骤均采用Phamacia公司玻璃层析柱。详细操作步骤依据产品供应商提供的说明进行，获得的标记抗体浓度为16mg/ml，共35ml，采用BECKMAN公司DU800核酸-蛋白分析仪进行蛋白定量，计算抗体标记的得率为70％。

五、FITC标记抗合成肽单克隆抗体的应用效果检测

以WHO推荐的Millipore公司DFA 5100(Rabies Diagnostic Reagent)诊断试剂为参照，将上述FITC标记抗合成肽单克隆抗体RVNP-mAb1经50倍递增系列稀释，从1∶50、1∶100、1∶150、1∶200…稀释至1∶500，比较自主制备的FITC标记抗合成肽单克隆抗体在狂犬病实验室诊断中的应用效果，包括对感染狂犬病病毒的犬脑组织和感染狂犬病病毒CVS-11的BSR细胞进行FAT的检测效果，以及对200份血清样品进行RFFIT检测的效果。

各稀释度与感染CVS-11的BSR细胞的反应情况表明标记抗体在1∶200稀释度时仍然具有和DFA 5100工作浓度同等的荧光显色效果，以此稀释度对200份血清样品进行RFFIT检测，结果分析表明与使用DFA 5100进行RFFIT检测等效。以1∶200稀释度对5份感染狂犬病病毒并经DFA 5100检测显示弱阳性的的犬脑组织进行FAT检测，在同样的操作流程下显示同等检出效力，结果如图4所示，其中(a)-(e)为阳性犬脑组织；(f)为正常犬脑组织。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims

1.一种针对狂犬病病毒核蛋白保守线性表位肽的单抗的制备方法，包括下述步骤：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括针对狂犬病病毒核蛋白保守线性表位肽的单抗的纯化和标记步骤，所述纯化和标记步骤为：将步骤(6)获得的杂交瘤细胞株腹腔接种Balb/c小鼠，对腹水用DEAE-Sephadex A-50进行柱层析，然后采用FITC进行标记。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中的KLH活化过程为：将KLH与交联剂SMCC混合，室温旋转反应30min，使KLH充分活化，用多肽偶联缓冲液平衡的SephadexG-25柱层析除去游离成分，得到活化的KLH。

4.根据权利要求1～3中任一权利要求所述的制备方法，其特征在于，所述免疫原是将多肽加入已活化的KLH中室温下旋转反应2小时，耦联好的产物即为免疫原。