CN102630229A - 使用刻缺蛋白3拮抗剂来治疗刻缺蛋白1拮抗剂抗性癌症的方法 - Google Patents

使用刻缺蛋白3拮抗剂来治疗刻缺蛋白1拮抗剂抗性癌症的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及单独或组合使用刻缺蛋白1和刻缺蛋白3拮抗剂来治疗一般地癌症和具体地白血病的方法。还提供了用于治疗和诊断刻缺蛋白有关的癌症的组合物和方法。

Description

使用刻缺蛋白3拮抗剂来治疗刻缺蛋白1拮抗剂抗性癌症的方法
相关申请
依据35USC 119(e)，本申请要求2009年9月30日提交的临时申请号61/247298的权益，通过提及而将其内容收入本文。
发明领域
本发明涉及单独或组合使用刻缺蛋白1和刻缺蛋白3拮抗剂来治疗一般地癌症和具体地白血病的方法。还提供了用于治疗和诊断刻缺蛋白有关的癌症的组合物和方法。
序列表
本申请含有序列表，其已经经由EFS-Web以ASCII格式提交，并且在此通过提及而完整收录。2010年9月3日创建的所述ASCII拷贝命名为P4371.txt，并且大小为65,600个字节。
发明背景
刻缺蛋白(Notch)受体家族是一类进化上保守的跨膜受体，其在像海胆和人一样多种多样的生物体中转送影响发育的信号。刻缺蛋白受体及其配体德尔塔蛋白（Delta）和锯齿蛋白（Serrate）（在哺乳动物中称为Jagged）是跨膜蛋白，具有含表皮生长因子(EGF)样重复的大的胞外域。刻缺蛋白侧向同系物(paralogue)的数目在物种间有所不同。例如，哺乳动物中有四种刻缺蛋白受体（刻缺蛋白1-刻缺蛋白4）、秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)中有两种（LIN-12和GLP-1），而黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)中有一种（刻缺蛋白）。刻缺蛋白受体在转运至细胞表面期间在位点S1（其在跨膜域的N端）处被弗林蛋白酶样蛋白酶蛋白水解加工，生成胞外刻缺蛋白(ECN)亚基和刻缺蛋白跨膜亚基(NTM)。这两个亚基仍然是非共价联合的，并且构成成熟的异二聚体细胞表面受体。
刻缺蛋白1ECN亚基含有36个N端EGF样重复，接着是三个串联重复的Lin 12/刻缺蛋白重复(LNR)模块，之后有S1位点。刻缺蛋白3 ECN具有相似的结构，但是具有34个EGF样重复。每个LNR模块含有三个二硫键和预测为配位钙离子的一组保守的酸性和极性残基。活化性配体的结合位点位于EGF重复区内。刻缺蛋白1和刻缺蛋白3NTM包含胞外区（其含有S2切割位点）、跨膜区段（其含有S3切割位点）、和大的胞内区（ICN或ICD），其包括RAM域、锚蛋白重复、反式激活域和羧基端PEST域。ECN和NTM亚基的稳定联合取决于异二聚化域(HD)，其包含ECN的羧基端末端（称作HD-N）和NTM的胞外氨基端末端（称作HD-C）。在配体诱导的活化前，刻缺蛋白通过负调节区(NRR)维持静止构象，所述负调节区(NRR)包含三个LNR和HD域。
刻缺蛋白配体对ECN亚基的结合启动经由受调节的膜内蛋白水解发生的两次连续蛋白水解切割。由金属蛋白酶(ADAM17)在位点S2处进行的第一次切割使刻缺蛋白跨膜亚基易受在接近质膜的内部小叶的位点S3处的第二次切割。位点S3切割（其由含有早老蛋白和呆蛋白且促进γ-分泌酶活性的多蛋白复合物催化）解放刻缺蛋白跨膜亚基的胞内部分，容许其移位至细胞核，并激活靶基因的转录。（关于刻缺蛋白的蛋白水解切割的综述，见例如Sisodia等,Nat.Rev.Neurosci.3:281-290,2002）。
已经在人中鉴定出锯齿蛋白和德尔塔蛋白样类的5种刻缺蛋白配体（锯齿蛋白1（Jagged1，又称作Serrate1）、锯齿蛋白2（Jagged2，又称作Serrate2）、德尔塔蛋白样1（Delta-like 1，又称作DLL1）、德尔塔蛋白样3（Delta-like 3，又称作DLL3）、和德尔塔蛋白样4（Delta-like 4，又称作DLL4））。每种配体是一种一次通过跨膜蛋白，具有对于结合刻缺蛋白至关重要的保守N端德尔塔蛋白、锯齿蛋白、LAG-2(DSL)基序。在DSL基序C端的一系列EGF样模块在跨膜区段之前。与刻缺蛋白受体不同，配体在C端具有70-215个氨基酸的短的胞质尾部。另外，已经报告了其它类型的配体（例如，DNER、NB3、和F3/接触蛋白）。（关于刻缺蛋白配体和配体介导的刻缺蛋白活化的综述，见例如D’Souza等,Oncogene 27:5148-5167,2008）。
刻缺蛋白途径在多种多样的发育和生理过程（包括那些影响蝇和脊椎动物中的神经发生的）期间发挥功能。一般而言，刻缺蛋白信号传导牵涉侧抑制、谱系决定、和细胞组间的边界建立。（见例如Bray,Mol.Cell Biol.7:678-679,2006）。已经显示了多种人疾病（包括癌症和神经变性性病症）源自编码刻缺蛋白受体或其配体的基因中的突变。（见例如Nam等,Curr.Opin.Chem.Biol.6:501-509,2002）。
在牵涉T细胞祖先的白血病中证明刻缺蛋白1作为癌蛋白的作用。在人急性成淋巴细胞性白血病(T-ALL)中第一次认识到此作用。（见例如Aster等,Annu.Rev.Pathol.Mech.Dis.3:587-613,2008）。T-ALL是一种优先折磨儿童和青少年的攻击性白血病。在T-ALL亚组中鉴定出一种复发性t(7;9)(q34;q34.3)染色体易位，其创建人刻缺蛋白1的截短的、组成性有活性的变体。在(7;9)易位外，后来在超过50%的所有人T-ALL中发现了人刻缺蛋白1中频繁的功能获得突变。（见Weng等,Science,306:269-271,2004）。那些突变在胞外HD域和胞内PEST域中发生。其它研究显示了刻缺蛋白1 ICN在骨髓细胞中的基于逆转录病毒的表达在接受移植的骨髓细胞的小鼠模型中引起T-ALL。（见Aster等,Mol.Cell Biol.20:7505-7515,2000）。
与刻缺蛋白1在牵涉T细胞祖先的白血病中的此作用一致，已经在小鼠模型中显示了刻缺蛋白1信号传导对于T细胞发育是至关重要的，而且刻缺蛋白1介导的信号以B细胞发育为代价促进T细胞发育。（见例如Wilson等,J.Exp.Med.194:1003-1012,2001）。已经描述了刻缺蛋白1在白血病中的别的作用。已经在人急性髓样白血病(AML)和谱系转换白血病中以低频率报告了刻缺蛋白1PEST域中的激活突变，提示了刻缺蛋白1中的激活突变可以在髓样和T谱系定型前的白血病干细胞中发生。（见Palomero等,Leukemia 20:1963-1966,2006）。
在T-ALL中频繁的刻缺蛋白1功能获得突变的发现前，观察到刻缺蛋白3ICN在胸腺中的强制表达在转基因小鼠中引起T细胞白血病/淋巴瘤。（见Bellavia等,EMBO J.19:3337-3348,2000）。还报告了刻缺蛋白3mRNA在所分析的所有30份T-ALL患者样品中表达，而它没有在正常的外周血T淋巴细胞和非T细胞白血病中检测出。（见Bellavia等,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA99:3788-3793,2002）。
刻缺蛋白1和刻缺蛋白3还与多种其它癌症有关。例如，在实体瘤中，已经在人宫颈、结肠、肺、胰腺、皮肤、和脑癌中观察到升高的刻缺蛋白1表达（见例如Leong等,Blood 107:2223-2233,2006），并且升高的刻缺蛋白1表达与乳腺癌中较差的后果相关联（见例如Parr等,Int.J.Mol.Med.14:779-786,2004;Reedk等,Cancer Res.65:8530-8537,2005）。已经在非小细胞肺肿瘤的子集中鉴定出染色体易位(15;19)，并且认为易位提高刻缺蛋白3转录。在卵巢癌中，发现了刻缺蛋白3基因扩增在约19%的肿瘤中发生，并且在超过一半的浆液状卵巢癌中找到刻缺蛋白3的过表达。活化的刻缺蛋白1和刻缺蛋白3在转基因小鼠中的过表达诱导小鼠乳腺肿瘤，并且刻缺蛋白3的过表达足以在小鼠模型中诱导脉络丛肿瘤形成，提示了刻缺蛋白3在某些脑肿瘤形成中的作用。（关于癌症中的刻缺蛋白3的综述，见Shih等Cancer Res.67:1879-1882,2007）。
已经描述了某些具有治疗功效的抗刻缺蛋白1拮抗性抗体。（见美国专利申请公开文本No.US 2009/0081238A1，通过提及而将其明确地完整收入本文）。例如，此类抗体结合刻缺蛋白1的负调节区(NRR)，阻断刻缺蛋白1信号传导，破坏血管发生和血管化，并且抑制非小细胞肺癌和结肠腺癌的小鼠异种移植物模型中的肿瘤生长。其中所描述的某些抗体结合刻缺蛋白1NRR的LNR-A和LNR-B（三个LIN12/刻缺蛋白重复的第一个和第二个）和HD-C。还已经描述了其它抗刻缺蛋白1抗体，其结合刻缺蛋白1的EGF重复区，而且阻断刻缺蛋白1活性，可能通过阻断配体结合来实现。（见国际公开文本No.WO 2008/091641）。
还已经描述了某些抗刻缺蛋白3拮抗性抗体。（见美国专利申请公开文本No.US 2008/0226621A1，通过提及而将其明确地完整收入本文）。此类抗体结合刻缺蛋白3的负调节区(NRR)，并且阻断刻缺蛋白3信号传导。其中所描述的某些抗体结合刻缺蛋白3NRR的LNR-A (三个LIN12/刻缺蛋白重复的第一个)和HD-C（或者在US 2008/0226621A1中称为第二二聚化域）。还已经描述了其它抗刻缺蛋白3抗体，其结合刻缺蛋白3的EGF样重复区，而且阻断刻缺蛋白3活性，可能通过阻断配体结合来实现。（见Li等,J.Biol.Chem.283:8046-8054,2008）。
已经提出了γ-分泌酶抑制剂(GSI)(其是抑制多种刻缺蛋白受体的泛刻缺蛋白抑制剂)用于治疗刻缺蛋白相关疾病，并且实际上已经在治疗T-ALL的临床试验中使用。（见Roy等,Curr.Opin.Genet.De v.17:52-59,2007;Deangelo等,J.Clin.Oncol.2006ASCO Annual Meeting Proceedings Part I 24:6586,2006）。然而，GSI引起体重减轻和肠杯形细胞化生，反映刻缺蛋白通过维持肠隐窝祖细胞的增殖及阻止分化成分泌细胞命运在决定细胞命运中发挥的作用。（见van Es等,Nature 435:959-963,2005）。虽然泛刻缺蛋白抑制的这些副作用在临床背景中可以是可管理的，但是靶向个别刻缺蛋白受体，并且因此最小化或降低这些副作用的抑制剂可以是有利的。
本领域中需要通过靶向刻缺蛋白受体来治疗癌症的其它治疗方法。本文中所描述的发明满足上文所描述的需要，并且提供了其它益处。
发明概述
本发明涉及单独或组合使用刻缺蛋白拮抗剂来治疗癌症。具体地，本发明部分涉及不同类T-ALL的表征。一类T-ALL对用GSI治疗敏感，而且也对用刻缺蛋白1特异性拮抗剂治疗敏感。比较而言，另一类T-ALL对用GSI治疗敏感，但对用刻缺蛋白1特异性拮抗剂治疗不敏感（即，有抗性）。如本文中所显示的，后一类T-ALL对用刻缺蛋白3特异性拮抗剂治疗部分敏感，而且对刻缺蛋白1特异性拮抗剂和刻缺蛋白3特异性拮抗剂的组合甚至更敏感。这些结果提示了刻缺蛋白1和刻缺蛋白3两者在白血病，特别是T细胞祖先白血病诸如T-ALL中的作用。
在一方面，提供了一种治疗不响应刻缺蛋白1特异性拮抗剂的GSI响应性癌症的方法，该方法包括对患有此类癌症的患者施用有效量的刻缺蛋白3特异性拮抗剂。在某些实施方案中，所述癌症是T细胞白血病。在某些实施方案中，所述T细胞白血病是成淋巴细胞性白血病。在某些实施方案中，所述T细胞白血病是T-ALL。在某些实施方案中，所述刻缺蛋白3特异性拮抗剂是抗刻缺蛋白3拮抗性抗体。在某些实施方案中，所述抗刻缺蛋白3拮抗性抗体是抗刻缺蛋白3NRR抗体。在某些实施方案中，所述抗刻缺蛋白3NRR抗体结合刻缺蛋白3NRR的LNR-A和HD-C域。在某些实施方案中，所述抗刻缺蛋白3NRR抗体包含抗体256A-4或256A-8的重和轻链可变区CDR。在某些实施方案中，所述抗刻缺蛋白3NRR抗体是抗体256A-4或256A-8的人源化形式。在某些实施方案中，所述抗刻缺蛋白3拮抗性抗体是结合刻缺蛋白3的一个或多个EGF样重复的抗刻缺蛋白3抗体。
在又一个实施方案中，所述方法进一步包括施用有效量的刻缺蛋白1特异性拮抗剂。在某些实施方案中，施用的刻缺蛋白1特异性拮抗剂是抗刻缺蛋白1拮抗性抗体。在某些实施方案中，所述抗刻缺蛋白1拮抗性抗体是抗刻缺蛋白1NRR抗体。在某些实施方案中，所述抗刻缺蛋白1NRR抗体结合刻缺蛋白1NRR的LNR-A、LNR-B、和HD-C域。在某些实施方案中，所述抗刻缺蛋白1NRR抗体选自抗体A、A-1、A-2、和A-3。在某些实施方案中，所述抗刻缺蛋白1NRR抗体包含抗体的重和轻链可变区CDR，所述抗体选自抗体A、A-1、A-2、和A-3。在某些实施方案中，所述抗刻缺蛋白1拮抗性抗体是结合刻缺蛋白1的一个或多个EGF样重复的抗刻缺蛋白1抗体。
在本发明的又一方面，提供了一种结合活化的刻缺蛋白3ICD的抗体。在某些实施方案中，所述抗体结合SEQ ID NO:4的肽。在某些实施方案中，所述抗体是多克隆的。在某些实施方案中，所述抗体是单克隆的。
在本发明的又一方面，提供了一种鉴定适合于用刻缺蛋白3拮抗剂治疗的癌症的方法，该方法包括使所述癌症的样品与权利要求15的抗体接触，并测定所述样品中是否存在显著升高的活化的刻缺蛋白3水平，其中显著升高的活化的刻缺蛋白3水平的存在指示所述癌症适合于用刻缺蛋白3拮抗剂治疗。在某些实施方案中，所述癌症是GSI响应性的。
本文中提供了本发明的上述及别的方面和实施方案。
附图简述
图1A-1D显示了人刻缺蛋白1(SEQ ID NO:1)和小鼠刻缺蛋白1(SEQ IDNO:2)的比对，其中标示了基序和其它特征。
图2显示了人刻缺蛋白3(SEQ ID NO:3)的序列。EGF重复区从氨基酸残基43延伸至1383；LNR模块从氨基酸残基1384延伸至1503，其中LNR-A从氨基酸残基1384延伸至1422；而二聚化域从氨基酸残基1504延伸至1640，其中HD-C从氨基酸残基1572延伸至1640。
图3A-3D显示了T-ALL细胞系P-12 Ichikawa对GSI(DAPT)和抗NRR1(α-N1)两者有抗性。
图4A-4D显示了T-ALL细胞系HPB-ALL对GSI(DAPT)和抗NRR1(α-N1)两者敏感，如通过相对于对照细胞，G0/G1的细胞积累和S/G2/M的细胞减少所证明的。
图5A-5D显示了T-ALL细胞系TALL-1对GSI敏感，但是对抗NRR1(α-N1)有抗性。
图6显示了细胞大小测量反映图3-5中鉴定的三类T-ALL。
图7显示了膜联蛋白V（凋亡标志物）和7-AAD（细胞死亡标志物）的染色反映图3-5中鉴定的三类T-ALL。
图8，左侧小图显示了Ki-67染色（细胞增殖标志物）反映图3-5中鉴定的三类T-ALL。相对于右移的峰，左移的峰指示更低的Ki-67染色和降低的增殖。图8，右侧小图显示了降低的Ki-67染色（即，降低的增殖）与膜联蛋白V/7-AAD双重阴性（即，非凋亡）细胞的数目反向相关。
图9A-9F显示了TALL-1细胞系对抗NRR3(α-N3)部分敏感，并且对抗NRR1(α-N1)和抗NRR3处理敏感。
图10A-10F显示了T-ALL细胞系CCRF-CEM对GSI、抗NRR1(α-N1)和抗NRR3(α-N3)两者有抗性。
图11A-11F显示了HPB-ALL细胞系对抗NRR1(α-N1)，而非抗NRR3(α-N3)敏感。
图12显示了使用识别活化的刻缺蛋白3ICD (α-刻缺蛋白3ICD)的抗体的免疫印迹，所述抗体检测经Jag 1刺激的MDA-MB-468细胞的核部分中活化的刻缺蛋白3ICD。
图13显示了TALL-1细胞系表达高水平的经切割的、活化的刻缺蛋白3（下部小图），其可以由DAPT，而非抗NRR1(α-N1)阻断，而HPB-ALL细胞系表达高水平的经切割的、活化的刻缺蛋白1，其可以由DAPT和抗NRR1(α-N1)阻断。
图14显示了图9A-9F中描绘的实验的结果的图。
发明详述
I.定义
为了解读本说明书，以下定义会适用，并且无论何时适合，以单数使用的术语还会包括复数，且反之亦然。在下文所列的任何定义与通过提及而收入本文中的任何文件冲突的情况中，应当以下文所列的定义为准。
除非另有明确指示或根据上下文指示，如本文中所使用的，术语“刻缺蛋白”指任何天然或变体（无论是天然的还是合成的）刻缺蛋白多肽（刻缺蛋白1-4）。术语“天然序列”明确涵盖天然存在的截短形式（例如，胞外域序列或跨膜亚基序列）、天然存在的变体形式（例如，可变剪接形式）和天然存在的等位变体。术语“野生型刻缺蛋白”一般指包含天然存在的、非突变的刻缺蛋白蛋白质的氨基酸序列的多肽。术语“野生型刻缺蛋白序列”一般指天然存在的、非突变的刻缺蛋白中找到的氨基酸序列。
除非另有明确指示或根据上下文指示，如本文中所使用的，术语“刻缺蛋白1”指任何天然或变体（无论是天然的还是合成的）刻缺蛋白1多肽。术语“天然序列”明确涵盖天然存在的截短形式（例如，胞外域序列或跨膜亚基序列）、天然存在的变体形式（例如可变剪接形式）和天然存在的等位变体。术语“野生型刻缺蛋白1”一般指包含天然存在的、非突变的刻缺蛋白1蛋白质的氨基酸序列的多肽。术语“野生型刻缺蛋白1序列”一般指天然存在的、非突变的刻缺蛋白1中找到的氨基酸序列。
除非另有明确指示或根据上下文指示，如本文中所使用的，术语“刻缺蛋白1配体”指任何天然或变体（无论是天然的还是合成的）刻缺蛋白1配体（例如，锯齿蛋白1、锯齿蛋白2、德尔塔蛋白样1、德尔塔蛋白样3、和/或德尔塔蛋白样4)多肽。术语“天然序列”明确涵盖天然存在的截短形式（例如，胞外域序列或跨膜亚基序列）、天然存在的变体形式（例如可变剪接形式）和天然存在的等位变体。术语“野生型刻缺蛋白1配体”一般指包含天然存在的、非突变的刻缺蛋白1配体的氨基酸序列的多肽。术语“野生型刻缺蛋白1配体序列”一般指天然存在的、非突变的刻缺蛋白1配体中找到的氨基酸序列。
除非另有明确指示或根据上下文指示，如本文中所使用的，术语“刻缺蛋白1NRR”指刻缺蛋白1中由3个LNR模块和自LNR模块的羧基端延伸至跨膜域的氨基酸序列组成的任何天然或变体（无论是天然的还是合成的）多肽区，所述序列包括HD域（HD-N和HD-C）。例示性的刻缺蛋白1NRR由人刻缺蛋白1氨基酸序列（SEQ ID NO:1，图1）的约氨基酸1446至约氨基酸1735的区域组成及由小鼠刻缺蛋白1氨基酸序列（SEQ ID NO:2，图1）的约氨基酸1446至约氨基酸1725的区域组成。术语“天然序列刻缺蛋白1NRR”明确涵盖刻缺蛋白1NRR的天然存在的截短形式、天然存在的变体形式（例如可变剪接形式）和天然存在的等位变体。术语“野生型刻缺蛋白1NRR”一般指天然存在的、非突变的刻缺蛋白1NRR。在一些实施方案中，刻缺蛋白1NRR包含在刻缺蛋白1，诸如例如在S1、S2和/或S3位点处加工的刻缺蛋白1、或未加工的刻缺蛋白1中。在一些实施方案中，刻缺蛋白1NRR含有两个或更多个非共价连接的刻缺蛋白1NRR氨基酸序列片段，例如，非共价连接的含有SEQ ID NO:1的氨基酸1446至1664的片段和含有SEQ ID NO:1的氨基酸1665至1735的片段。在另一个实施方案中，含有SEQ ID NO:2的氨基酸1446至1654的片段与含有SEQ ID NO:2的氨基酸1655至1725的片段非共价连接。
如本文中所使用的，术语“升高的刻缺蛋白1信号传导”指刻缺蛋白1信号传导的升高，其显著高于在基本上相同的条件下在对照中观察到的刻缺蛋白1信号传导水平。在某些实施方案中，刻缺蛋白1信号传导的升高比对照中观察到的水平高至少2倍、3倍、4倍、5倍、或10倍。
如本文中所使用的，术语“降低的刻缺蛋白1信号传导”指刻缺蛋白1信号传导的降低，其显著低于在基本上相同的条件下在对照中观察到的刻缺蛋白1信号传导水平。在某些实施方案中，刻缺蛋白1信号传导的降低比对照中观察到的水平低至少2倍、3倍、4倍、5倍、或10倍。
在某些实施方案中，使用合适的报告物测定法来评估刻缺蛋白1信号传导（即，升高或降低的刻缺蛋白1信号传导），例如如记载于美国专利申请公开文本No.US 2009/0081238A1的实施例5的。在某些实施方案中，使用体外活性测定法，诸如C2C12成肌细胞分化测定法或HUVEC细胞萌芽测定法来评估刻缺蛋白1信号传导，如分别记载于US 2009/0081238A1的实施例5和7的。在某些实施方案中，使用体内异种移植物模型，诸如记载于US 2009/0081238A1的实施例8中的Calu6和HM7模型来评估刻缺蛋白1信号传导。
术语“刻缺蛋白1激活突变”和“激活刻缺蛋白1信号传导的突变”指导致刻缺蛋白1信号传导与来自相应的刻缺蛋白1野生型氨基酸序列的刻缺蛋白1信号传导相比升高的，相对于刻缺蛋白1野生型氨基酸序列的一个或多个氨基酸的插入、一个或多个氨基酸的删除、或一个或多个氨基酸的替代，或者指导致含有突变体核酸序列的细胞中的刻缺蛋白1信号传导与含有相应的刻缺蛋白1野生型核酸序列的细胞中的刻缺蛋白1信号传导相比升高的相对于刻缺蛋白1野生型核酸序列的一个或多个核苷酸的插入、一个或多个核苷酸的删除、一个或多个核苷酸的易位、或一个或多个核苷酸的替代。来自含有激活突变的刻缺蛋白1受体的刻缺蛋白1信号传导可以是依赖配体的或不依赖配体的。
术语“抗刻缺蛋白1抗体”或“结合刻缺蛋白1的抗体”指能够以足够的亲和力结合刻缺蛋白1，从而抗体在靶向刻缺蛋白1中可用作诊断和/或治疗剂的抗体。优选地，抗刻缺蛋白1抗体对无关的非刻缺蛋白蛋白质的结合程度小于抗体对刻缺蛋白1的结合的约10%，如例如通过放射性免疫测定法(RIA)测量的。在某些实施方案中，结合刻缺蛋白1的抗体具有≤1μM、≤0.5μM、≤100nM、≤50nM、≤10nM、≤5nM、≤1nM、≤0.5nM、或≤0.1nM的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗刻缺蛋白1抗体结合刻缺蛋白1中在来自不同物种，例如啮齿类（小鼠、大鼠）和灵长类的刻缺蛋白1间保守的表位。
术语“抗刻缺蛋白1NRR抗体”或“结合刻缺蛋白1NRR的抗体”指能够以足够的亲和力结合刻缺蛋白1NRR，从而抗体在靶向刻缺蛋白1中可用作诊断和/或治疗剂的抗体。优选地，抗刻缺蛋白1NRR抗体对无关的非刻缺蛋白蛋白质的结合程度小于抗体对刻缺蛋白1NRR的结合的约10%，如例如通过放射性免疫测定法(RIA)测量的。在某些实施方案中，结合刻缺蛋白1NRR的抗体具有≤1μM、≤0.5μM、≤100nM、≤50nM、≤10nM、≤5nM、≤1nM、≤0.5nM、或≤0.1nM的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗刻缺蛋白1NRR抗体结合刻缺蛋白中在来自不同物种，例如啮齿类（小鼠、大鼠）和灵长类的刻缺蛋白间保守的表位。
术语“刻缺蛋白1特异性拮抗剂”指实现降低的刻缺蛋白1信号传导，如上文定义的，而且没有显著影响由另一种刻缺蛋白受体（哺乳动物中的刻缺蛋白2、3、或4）实现的信号传导的药剂。
“抗刻缺蛋白1拮抗性抗体”指实现如上文定义的降低的刻缺蛋白1信号传导的抗刻缺蛋白1抗体（包括抗刻缺蛋白1NRR抗体）。
除非另有指示，单独地或以任意组合提及“抗体A、A-1、A-2、和A-3”意指美国专利申请公开文本No.US 2009/0081238A1中称作抗体A、A-1、A-2、和A-3的噬菌体和重定格式的抗体的重和轻链可变区。
除非另有明确指示或根据上下文指示，如本文中所使用的，术语“刻缺蛋白3”指任何天然或变体（无论是天然的还是合成的）刻缺蛋白3多肽。术语“天然序列”明确涵盖天然存在的截短形式（例如，胞外域序列或跨膜亚基序列）、天然存在的变体形式（例如可变剪接形式）和天然存在的等位变体。术语“野生型刻缺蛋白3”一般指包含天然存在的、非突变的刻缺蛋白3蛋白质的氨基酸序列的多肽。术语“野生型刻缺蛋白3序列”一般指天然存在的、非突变的刻缺蛋白3中找到的氨基酸序列。
除非另有明确指示或根据上下文指示，如本文中所使用的，术语“刻缺蛋白3配体”指任何天然或变体（无论是天然的还是合成的）刻缺蛋白3配体（例如，锯齿蛋白1、锯齿蛋白2、德尔塔蛋白样1、德尔塔蛋白样3、和/或德尔塔蛋白样4)多肽。术语“天然序列”明确涵盖天然存在的截短形式（例如，胞外域序列或跨膜亚基序列）、天然存在的变体形式（例如可变剪接形式）和天然存在的等位变体。术语“野生型刻缺蛋白3配体”一般指包含天然存在的、非突变的刻缺蛋白3配体的氨基酸序列的多肽。术语“野生型刻缺蛋白3配体序列”一般指天然存在的、非突变的刻缺蛋白3配体中找到的氨基酸序列。
术语“活化的刻缺蛋白3ICD”指源自位点S3处的切割，并且能够移位至细胞核的刻缺蛋白3切割产物。在某些实施方案中，活化的刻缺蛋白3ICD由人刻缺蛋白3(SEQ ID NO:3)的氨基酸1662-2321组成。
除非另有明确指示或根据上下文指示，如本文中所使用的，术语“刻缺蛋白3NRR”指刻缺蛋白3中由3个LNR模块和自LNR模块的羧基端延伸至跨膜域的氨基酸序列组成的任何天然或变体（无论是天然的还是合成的）多肽区，所述序列包括HD域（HD-N和HD-C）。例示性的刻缺蛋白3NRR由人刻缺蛋白3氨基酸序列（SEQ ID NO:3，图2）的约氨基酸1384至约氨基酸1640的区域组成。术语“天然序列刻缺蛋白3NRR”明确涵盖刻缺蛋白3NRR的天然存在的截短形式、天然存在的变体形式（例如可变剪接形式）和天然存在的等位变体。术语“野生型刻缺蛋白3NRR”一般指天然存在的、非突变的刻缺蛋白3NRR。在一些实施方案中，刻缺蛋白3NRR包含在刻缺蛋白3，诸如例如在S1、S2和/或S3位点处加工的刻缺蛋白3、或未加工的刻缺蛋白3中。在一些实施方案中，刻缺蛋白3NRR含有两个或更多个非共价连接的刻缺蛋白3NRR氨基酸序列片段，例如，非共价连接的含有人刻缺蛋白3(SEQID NO:3)的氨基酸1384至1571的片段和含有人刻缺蛋白3(SEQ ID NO:3)的氨基酸1572至1640的片段。
如本文中所使用的，术语“升高的刻缺蛋白3信号传导”指刻缺蛋白3信号传导的升高，其显著高于在基本上相同的条件下在对照中观察到的刻缺蛋白3信号传导水平。在某些实施方案中，刻缺蛋白3信号传导的升高比对照中观察到的水平高至少2倍、3倍、4倍、5倍、或10倍。
如本文中所使用的，术语“降低的刻缺蛋白3信号传导”指刻缺蛋白3信号传导的降低，其显著低于在基本上相同的条件下在对照中观察到的刻缺蛋白3信号传导水平。在某些实施方案中，刻缺蛋白3信号传导的降低比对照中观察到的水平低至少2倍、3倍、4倍、5倍、或10倍。
在某些实施方案中，使用合适的报告物测定法来评估刻缺蛋白3信号传导（即，升高或降低的刻缺蛋白3信号传导），例如如记载于美国专利申请公开文本No.US 2008/0226621A1的实施例5的。在某些实施方案中，使用体外活性测定法，诸如记载于美国专利申请公开文本No.US 2008/0226621A1的实施例7中的凋亡、细胞迁移、侵入、和形态学测定法来评估刻缺蛋白3信号传导。在某些实施方案中，使用体内异种移植物模型，诸如记载于US2008/0226621A1的实施例11中的体内异种移植物模型来评估刻缺蛋白3信号传导。
术语“抗刻缺蛋白3抗体”或“结合刻缺蛋白1的抗体”指能够以足够的亲和力结合刻缺蛋白3，从而抗体在靶向刻缺蛋白3中可用作诊断和/或治疗剂的抗体。优选地，抗刻缺蛋白3抗体对无关的非刻缺蛋白蛋白质的结合程度小于抗体对刻缺蛋白3的结合的约10%，如例如通过放射性免疫测定法(RIA)测量的。在某些实施方案中，结合刻缺蛋白3的抗体具有≤1μM、≤0.5μM、≤100nM、≤50nM、≤10nM、≤5nM、≤1nM、≤0.5nM、或≤0.1nM的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗刻缺蛋白3抗体结合刻缺蛋白3中在来自不同物种，例如啮齿类（小鼠、大鼠）和灵长类的刻缺蛋白3间保守的表位。
术语“抗刻缺蛋白3NRR抗体”或“结合刻缺蛋白3NRR的抗体”指能够以足够的亲和力结合刻缺蛋白3NRR，从而抗体在靶向刻缺蛋白3中可用作诊断和/或治疗剂的抗体。优选地，抗刻缺蛋白3NRR抗体对无关的非刻缺蛋白蛋白质的结合程度小于抗体对刻缺蛋白3NRR的结合的约10%，如例如通过放射性免疫测定法(RIA)测量的。在某些实施方案中，结合刻缺蛋白3NRR的抗体具有≤1μM、≤0.5μM、≤100nM、≤50nM、≤10nM、≤5nM、≤1nM、≤0.5nM、或≤0.1nM的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗刻缺蛋白3NRR抗体结合刻缺蛋白3中在来自不同物种，例如啮齿类（小鼠、大鼠）和灵长类的刻缺蛋白3间保守的表位。
术语“刻缺蛋白3特异性拮抗剂”指实现降低的刻缺蛋白3信号传导，如上文定义的，而且没有显著影响由另一种刻缺蛋白受体（哺乳动物中的刻缺蛋白1、2、或4）实现的信号传导的药剂。
“抗刻缺蛋白3拮抗性抗体”指实现如上文定义的降低的刻缺蛋白3信号传导的抗刻缺蛋白3抗体（包括抗刻缺蛋白3NRR抗体）。
单独或组合提及“抗体256A-4和256A-8”意指美国专利申请公开文本No.2008/0226621A1中称作256A-4和256A-8的小鼠单克隆抗体。
术语“拮抗剂”指显著抑制（部分或完全）靶分子的生物学活性的药剂。
“结合活化的刻缺蛋白3ICD的抗体”指结合活化的刻缺蛋白3ICD，从而抗体可用于区分活化的刻缺蛋白3ICD与包含完整NTM的刻缺蛋白3的抗体。
本文中的术语“抗体”以最广义使用，并且明确覆盖单克隆抗体、多克隆抗体、自至少两种完整的抗体形成的多特异性抗体（例如双特异性抗体）、和抗体片段，只要它们展现出期望的生物学活性。
“分离的”抗体指已经鉴定且与/由其天然环境的一种成分分开和/或回收的。其天然环境的污染性成分指会干扰该抗体的研究、诊断或治疗用途的材料，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在一些实施方案中，将抗体纯化至(1)根据例如Lowry法的测定，以抗体重量计大于95%，且在一些实施方案中，以重量计大于99%，(2)足以通过使用例如转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE，使用例如考马斯蓝或银染色，达到同质。既然抗体天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离的抗体通常会通过至少一个纯化步骤来制备。
“天然抗体”指通常由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链构成的约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而二硫化物连接的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链间有变化。每条重链和轻链还具有间隔规律的链内二硫桥。每条重链在一端具有一个可变域(VH)，接着是多个恒定域。每条轻链在一端具有一个可变域(VL)，而另一端是一个恒定域。轻链的恒定域与重链的第一恒定域排列在一起，而轻链的可变域与重链的可变域排列在一起。认为特定的氨基酸残基在轻链和重链可变域之间形成界面。
抗体的“可变区”或“可变域”指抗体重或轻链的氨基端域。重链的可变域可以称为“VH”。轻链的可变域可以称为“VL”。这些域一般是抗体的最可变部分，并且含有抗原结合位点。
术语“可变的”指可变域中的某些部分在抗体间序列差异广泛且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的实情。然而，变异性并非均匀分布于抗体的整个可变域。它集中于轻链和重链可变域中称作高变区(HVR)的三个区段。可变域中更加高度保守的部分称作框架区(FR)。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR区，它们大多采取β-片层构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成β-片层结构一部分的三个HVR连接。每条链中的HVR通过FR区非常接近的保持在一起，并与另一条链的HVR一起促成抗体的抗原结合位点的形成（见Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,National Institute ofHealth,Bethesda,MD(1991)）。恒定域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应器功能，诸如抗体依赖性细胞的毒性中抗体的参与。
根据其恒定域的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗体（免疫球蛋白）的“轻链”可以归入两种截然不同的型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。
根据其重链恒定域的氨基酸序列，抗体（免疫球蛋白）可以归入不同的类。免疫球蛋白有五大类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的几种可以进一步分为亚类（同种型），例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。将与不同类的免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作α、δ、ε、γ和μ。不同类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构造是公知的，并且一般记载于例如Abbas等,Cellular and Mol.Immunology,第4版(W.B.Saunders,Co.,2000)。抗体可以是通过抗体与一种或多种其它蛋白质或肽的共价或非共价联合形成的较大融合分子的一部分。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用，指处于其基本上完整的形式的抗体，而不是如下文所定义的抗体片段。该术语特别指具有含有Fc区的重链的抗体。
出于本文中的目的，“裸抗体（裸露的抗体）”指没有与细胞毒性模块或放射性标记物偶联的抗体。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选地包含其抗原结合区。抗体片段的例子包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；及由抗体片段形成的多特异性抗体。
用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的各具有单一抗原结合位点的抗原结合片段，称作“Fab”片段，和一个残余的“Fc”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点，而且仍能够交联抗原的F(ab’)2片段。
“Fv”是含有完整抗原结合位点的最小抗体片段。在一个实施方案中，双链Fv种类由紧密、非共价联合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。在单链Fv(scFv)种类中，一个重链可变域和一个轻链可变域可以通过柔性肽接头共价相连，使得轻链和重链能在与双链Fv种类类似的“二聚体”结构中相联合。正是在此构造中，各可变域的三个HVR相互作用而在VH-VL二聚体表面上确定了抗原结合位点。六个HVR共同赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变域（或只包含对抗原特异的三个HVR的半个Fv）也具有识别和结合抗原的能力，只是亲和力低于完整结合位点。
Fab片段含有重和轻链可变域，而且还含有轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CH1)。Fab’片段由于重链CH1域的羧基端添加几个残基（包含来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸）而与Fab片段不同。Fab’-SH是本文中关于Fab’的名称，其中恒定域的半胱氨酸残基携带游离的硫醇基团。F(ab’)2抗体片段最初以其间具有铰链半胱氨酸的Fab’片段对生成。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL域，其中这些域存在于单一多肽链中。一般地，scFv多肽进一步包含VH和VL域间的多肽接头，其使scFv能够形成抗原结合期望的结构。关于scFv的综述，见例如,Pluckthün,于The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编,(Springer-Verlag,New York,1994),第269页-第315页。
术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的抗体片段，该片段在同一条多肽链（VH-VL）中包含相连的重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)。通过使用过短的接头使得同一条链上的两个域之间不能配对，迫使这些域与另一条链的互补域配对，并且产生两个抗原结合位点。双抗体可以是二价的或双特异性的。双抗体更为完整地记载于例如EP 404,097;WO 1993/01161;Hudson等,Nat.Med.9:129-134(2003);及Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。三抗体和四抗体也记载于Hudson等,Nat.Med.9:129-134(2003)。
如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体相同，除了可以以极小量存在的可能的突变（例如天然存在的突变）外。如此，修饰语“单克隆”指明抗体不是不同的抗体的混合物的特征。在某些实施方案中，此类单克隆抗体通常包括包含结合靶物的多肽序列的抗体，其中所述靶物结合多肽序列是通过包括从众多多肽序列中选择单一靶物结合多肽序列在内的过程获得的。例如，所述选择过程可以是从众多克隆（诸如杂交瘤克隆、噬菌体克隆、或重组DNA克隆的集合）选择独特克隆。应当理解的是，可以进一步改变选定的靶物结合序列，例如为了提高对靶物的亲和力、将靶物结合序列人源化、提高其在细胞培养物中的产量、降低其在体内的免疫原性、创建多特异性抗体等，而且包含改变后的靶物结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与典型地包含针对不同决定簇（表位）的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。在它们的特异性外，单克隆抗体制备物的优点在于它们通常未受到其它免疫球蛋白的污染。
修饰语“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生产抗体。例如，要依照本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来生成，包括例如杂交瘤法（例如Kohler和Milstein,Nature,256:495-97(1975);Hongo等,Hybridoma,14(3):253-260(1995),Harlow等,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,第2版,1988;Hammerling等,于:Monoclonal Antibodies and T-CellHybridomas,563-681,Elsevier,N.Y.,1981）、重组DNA法（参见例如美国专利No.4,816,567）、噬菌体展示技术（参见例如Clackson等,Nature 352:624-628(1991);Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1992);Sidhu等,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004);Lee等,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004);Fellouse,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004);及Lee等,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004)）、及用于在具有部分或整个人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物中生成人或人样抗体的技术（参见例如WO 1998/24893;WO 1996/34096;WO 1996/33735;WO 1991/10741;Jakobovits等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2551(1993);Jakobovits等,Nature362:255-258(1993);Bruggemann等,Year in Immuno.7:33(1993);美国专利No.5,545,807;5,545,806;5,569,825;5,625,126;5,633,425;及5,661,016;Marks等,Bio./Technology 10:779-783(1992);Lonberg等,Nature 368:856-859(1994);Morrison,Nature 368:812-813(1994);Fishwild等,Nature Biotechnol.14:845-851(1996);Neuberger,Nature Biotechnol.14:826(1996);及Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995)）。
单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性（见例如美国专利No.4,816,567及Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984)）。嵌合抗体包括P
Figure BDA00001701918600171
抗体，其中抗体的抗原结合区自通过例如用感兴趣的抗原免疫猕猴生成的抗体衍生。
非人（例如鼠）抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在一个实施方案中，人源化抗体指人免疫球蛋白（受体抗体）中的HVR残基用具有期望特异性、亲和力、和/或能力的非人物种（供体抗体）诸如小鼠、大鼠、家兔或非人灵长类动物的HVR残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的FR残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有找到的残基。可以进行这些修饰以进一步改进抗体的性能。一般而言，人源化抗体会包含至少一个、通常两个基本上整个如下的可变域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还会包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节，见例如Jones等,Nature 321:522-525(1986);Riechmann等,Nature 332:323-329(1988);及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。还可见例如Vaswani和Hamilton,Ann.Allergy,Asthma& Immunol.1:105-115(1998);Harris,Biochem.Soc.Transactions 23:1035-1038(1995);Hurle和Gross,Curr.Op.Biotech.5:428-433(1994)；及美国专利No.6,982,321和7,087,409。
“人抗体”指拥有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/或使用如本文所公开的用于生成人抗体的任何技术生成的抗体。人抗体的此定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。可以使用本领域中已知的各种技术来生成人抗体，包括噬菌体展示文库。Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381(1991);Marks等,J.Mol.Biol.,222:581(1991)。记载于Cole等,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,第77页(1985);Boerner等,J.Immunol.,147(1):86-95(1991)的方法也可用于制备人单克隆抗体。还见van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.,5:368-74(2001)。可以通过对转基因动物施用抗原来制备人抗体，所述转基因动物已经修饰为响应抗原性考验而生成此类抗体，但是其内源基因座已经丧失能力，例如经免疫的异源小鼠(xenomice)（关于XENOMOUSETM技术，见例如美国专利No.6,075,181和6,150,584）。关于经由人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体，还见例如Li等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)。
术语“高变区”、“HVR”或“HV”在用于本文时指抗体可变域中序列上高度可变和/或形成结构上定义的环的区域。通常，抗体包含六个HVR：三个在VH中（H1、H2、H3），三个在VL中（L1、L2、L3）。在天然抗体中，H3和L3展示这六个HVR的最大多样性，而且认为特别是H3在赋予抗体以精密特异性中发挥独特作用。见例如Xu等,Immunity 13:37-45(2000);Johnson和Wu,于Methods in Molecular Biology 248:1-25(Lo编,Human Press,Totowa,NJ,2003)。事实上，仅由重链组成的天然存在骆驼(camelid)抗体在缺乏轻链的情况中是有功能的且稳定的。见例如Hamers-Casterman等,Nature363:446-448(1993);Sheriff等,Nature Struct.Biol.3:733-736(1996)。
本文中使用且涵盖许多HVR的叙述。Kabat互补决定区(CDR)是以序列变异性为基础的，而且是最常用的(Kabat等,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD.(1991))。Chothia改为指结构环的位置(Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。AbM HVR代表Kabat HVR与Chothia结构环之间的折衷，而且得到Oxford Molecular的AbM抗体建模软件的使用。“接触”HVR是以对可获得的复合物晶体结构的分析为基础的。下文记录了这些HVR中每一个的残基。
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HVR可以包含如下“延伸的HVR”：VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)和89-97或89-96(L3)及VH中的26-35(H1)、50-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。对于这些定义中的每一个，可变域残基是依照Kabat等,见上文编号的。
“框架”或“FR”残基指除如本文中所定义的HVR残基外的那些可变域残基。
术语“如Kabat中的可变域残基编号方式”或“如Kabat中的氨基酸位置编号方式”及其变化形式指Kabat等，见上文中用于抗体重链可变域或轻链可变域编辑的编号系统。使用此编号系统，实际的线性氨基酸序列可以含有较少的或另外的氨基酸，对应于可变域FR或HVR的缩短或插入。例如，重链可变域可以包含H2残基52后的单一氨基酸插入（依照Kabat的残基52a）和重链FR残基82后的插入残基（例如依照Kabat的残基82a、82b和82c等）。给定抗体的Kabat残基编号方式可以通过将抗体序列与“标准”Kabat编号序列比对同源区来确定。
Kabat编号系统一般在提及可变域中的残基（大约是轻链残基1-107和重链残基1-113）时使用（例如Kabat等,见上文）。“EU编号系统”或“EU索引”一般在提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时使用（例如Kabat等,见上文中报告的EU索引）。“如Kabat中的EU索引”指人IgG1EU抗体的残基编号方式。除非本文中另有说明，提及抗体可变域中的残基编号指根据Kabat编号系统的残基编号方式。除非本文中另有说明，提及抗体恒定域中的残基编号指根据EU编号系统的残基编号方式（例如见美国专利申请公开文本US2008/0181888A1，EU编号方式的图）。
“亲和力成熟的”抗体指在抗体的一个或多个HVR中具有一处或多处改变、导致该抗体对抗原的亲和力与没有那些改变的亲本抗体相比有所改进的抗体。在一个实施方案，亲和力成熟的抗体具有纳摩尔或甚至皮摩尔量级的对靶抗原的亲和力。可以使用本领域已知的某些规程来生成亲和力成熟的抗体。例如，Marks等,Bio/Technology 10:779-783(1992)记载了通过VH和VL域改组进行的亲和力成熟。以下文献记载了HVR和/或框架残基的随机诱变：例如Barbas等,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 91:3809-3813(1994);Schier等,Gene169:147-155(1995);Yelton等,J.Immunol.155:1994-2004(1995);Jackson等,J.Immunol.154(7):3310-9(1995);及Hawkins等,J.Mol.Biol.226:889-896(1992)。
抗体“效应器功能”指那些可归于抗体Fc区（天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区）且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体（例如B细胞受体）下调；和B细胞激活。
“结合亲和力”一般指分子（例如，抗体）的单一结合位点与其结合配偶（例如，抗原）间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有指示，如本文中所使用的，“结合亲和力”指反映结合对成员（例如，抗体和抗原）间的1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其配偶Y的亲和力一般可以以解离常数(Kd)代表。可以通过本领域中已知的常见方法，包括那些在本文中描述的方法来测量亲和力。低亲和力抗体一般缓慢地结合抗原，而且趋于容易解离，而高亲和力抗体一般较快地结合抗原，而且趋于较长地保持结合。多种测量结合亲和力的方法是本领域中已知的，任何所述方法可以用于本发明的目的。下文中描述了用于测量结合亲和力的具体的说明性和例示性实施方案。
在一个实施方案中，通过用感兴趣抗体的Fab型式和其抗原实施的经放射性标记的抗原结合测定法(RIA)测量依照本发明的“Kd”或“Kd值”，如通过以下测定法所描述的。如下测量Fab针对抗原的溶液结合亲和力，即在存在未标记抗原的滴定系列的情况中用最小浓度的经(125I)标记的抗原平衡Fab，然后用经抗Fab抗体包被的板捕捉结合的抗原（见例如，Chen,等,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)）。为了建立测定法的条件，用50mM碳酸钠(pH 9.6)中的5μg/ml捕捉抗Fab抗体(Cappel Labs)将
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多孔板(ThermoScientific)包被过夜，随后用PBS中的2%(w/v)牛血清清蛋白于室温（约23°C）封闭2至5小时。在非吸附剂板(Nunc #269620)中，将100pM或26pM[125I]抗原与系列稀释的感兴趣Fab混合（例如，与评估抗VEGF抗体Fab-12一致，于Presta等,Cancer Res.57:4593-4599(1997)）。然后，将感兴趣的Fab温育过夜；然而，可以将温育继续更长的时段（例如，约65小时）以确保达到平衡。此后，将混合物转移至捕捉板以于室温温育（例如，1小时）。然后，取出溶液，并用PBS中的0.1%TWEEN-20TM将板清洗8次。在板已经干燥时，添加150μl/孔闪烁剂(MICROSCINT-20TM;Packard)，并在TOPCOUNTTM伽马计数器(Packard)上对板计数10分钟。选择给出小于或等于20%最大结合的每种Fab浓度来用于竞争性结合测定法。
依照另一个实施方案，于25°C以约10个响应单位(RU)用固定化的抗原CM5芯片使用
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或
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(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)通过使用表面等离振子共振测定法来测量Kd或Kd值。简言之，依照供应商的用法说明书用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5,BIACORE,Inc.)。用10mM乙酸钠pH 4.8将抗原稀释至5μg/ml（约0.2μM），之后以5μl/分钟的流速注射以获得约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应基团。为了进行动力学测量，于25°C以约25μl/分钟的流速注入在含0.05% TWEEN-20TM表面活性剂的PBS(PBST)中两倍连续稀释的Fab（0.78nM至500nM）。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型（
Figure BDA00001701918600213
评估软件3.2版）通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(Kd)以比率koff/kon计算。见例如Chen等,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果根据上文表面等离振子共振测定法，结合速率超过106M-1s-1，那么结合速率可使用荧光淬灭技术来测定，即根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(a stop-flowequipped spectrophometer)(Aviv Instruments)或8000系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯的测量，在存在浓度渐增的抗原的情况中，测量PBS,pH 7.2中的20nM抗抗原抗体（Fab形式）于25°C的荧光发射强度（激发=295nm；发射=340nm，16nm带通）的升高或降低。
依照本发明的“结合速率”或“kon”也可以使用
Figure BDA00001701918600214
或
Figure BDA00001701918600215
系统(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)来测定，如上文所描述的。
“病症”指任何会受益于用本发明的组合物或方法治疗的状况或疾病。这包括慢性和急性病症，包括那些使哺乳动物倾向于所讨论病症的病理状况。要在本文中治疗的病症的非限制性例子包括诸如癌症等状况。
术语“细胞增殖性病症”和“增殖性病症”指与一定程度的异常细胞增殖有关的病症。在一个实施方案中，细胞增殖性病症是癌症。
如本文中所使用的，“肿瘤”指所有新生物细胞生长和增殖，无论是恶性的或者是良性的，及所有癌前的和癌性的细胞和组织。术语“癌症”、“癌性”、“细胞增殖性病症”、“增殖性病症”、和“肿瘤”并不互相排斥，如本文中提及的。
术语“癌症”和“癌性”指向或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长/增殖不受调控的生理疾患。癌症的例子包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。此类癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌、肺的鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝瘤(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、胃癌、黑素瘤、及各种类型的头和颈癌。血管发生失调可导致可通过本发明的组合物和方法来治疗的许多病症。这些病症包括非新生物的和新生物的疾患。新生物疾患包括但不限于上文所描述的那些。非新生物病症包括但不限于不想要的或异常的肥大、关节炎、类风湿性关节炎(RA)、银屑病、银屑病斑块、结节病、动脉粥样硬化、动脉粥样硬化斑块、糖尿病性和其它增殖性视网膜病包括早产儿视网膜病、晶状体后纤维组织增生、新血管性青光眼(neovascularglaucoma)、年龄相关黄斑变性、糖尿病性黄斑水肿、角膜新血管形成、角膜移植片新血管形成、角膜移植片排斥、视网膜/脉络膜新血管形成、眼角的新血管形成（发红）、眼新血管疾病、血管再狭窄、动静脉畸形(AVM)、脑脊膜瘤、血管瘤、血管纤维瘤、甲状腺增生（包括格雷夫斯氏(Graves)病）、角膜和其它组织移植、慢性炎症、肺炎、急性肺损伤/ARDS、败血症、原发性肺动脉高压、恶性肺积液(malignant pulmonary effusion)、脑水肿（例如与急性中风/闭合性头部外伤/创伤有关的）、滑膜炎症(synovial inflammation)、RA中的血管翳形成、骨化性肌炎、肥大性骨形成、骨关节炎(OA)、顽固性腹水、多囊卵巢病、子宫内膜异位症、第三空间流体病(3rd spacing of fluid diseases)（胰腺炎、间隔综合征、烧伤、肠病）、子宫纤维瘤(uterine fibroids)、早产、慢性炎症诸如IBD（克罗恩氏(Crohn)病和溃疡性结肠炎）、肾同种异体移植物排斥、炎性肠病、肾病综合征、不想要的或异常的组织块生长（非癌性的）、血友病性关节、肥厚性瘢痕、毛发生长的抑制、奥-韦二氏(Osler-Weber)综合征、脓性肉芽肿晶状体后纤维组织增生、硬皮病、沙眼、血管粘连、滑膜炎、皮炎、先兆子痫、腹水、心包积液（诸如与心包炎有关的）和胸腔积液。
术语“白血病”指一种以造血组织、其它器官，且经常是血液中白细胞（白血球）数目异常增加为特征的急性或慢性疾病。白血病包括但不限于急性成淋巴细胞性白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)，包括T谱系成淋巴细胞性白血病(T-ALL)及其它成淋巴细胞性白血病；成人T细胞白血病/淋巴瘤；慢性髓样（髓性）白血病(CML)、急性髓样（髓性）白血病(AML)、和其它粒细胞性白血病；和谱系转换白血病。
术语“T细胞白血病”指以T谱系成淋巴细胞或T淋巴细胞数目异常增加为特征的白血病。
术语“T细胞祖先白血病”指以T谱系成淋巴细胞数目异常增加为特征的白血病。
“GSI响应性癌症”指响应γ-分泌酶抑制剂或者会响应γ-分泌酶抑制剂（若用其治疗的话）的癌症（诸如白血病）。
“响应”治疗剂的癌症是在癌症或肿瘤进展方面显示显著降低的癌症，包括但不限于(1)在某种程度上抑制肿瘤生长，包括减缓和完全生长阻滞；(2)癌或肿瘤细胞数目减少；(3)肿瘤尺寸缩小；(4)抑制（即降低、减缓或完全阻止）癌细胞渗入临近的周围器官和/或组织中；和/或(5)抑制（即降低、减缓或完全阻止）转移。
“不响应刻缺蛋白1特异性拮抗剂”的癌症指不响应用刻缺蛋白1特异性拮抗剂的治疗（在没有任何其它刻缺蛋白拮抗剂，即刻缺蛋白2、刻缺蛋白3或刻缺蛋白4拮抗剂的情况中），或者不会响应此类治疗（若给予的话）的癌症。
如本文中所使用的，“治疗/处理”指试图改变所治疗/处理个体或细胞的自然过程的临床干预，并且可以是为了预防或在临床病理学过程期间实施。治疗的期望效果包括预防疾病的发生或复发、缓解症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、减缓疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态、及免除或改善预后。在一些实施方案中，使用本发明的抗体来延迟疾病或病症的形成或减缓疾病或病症的进展。
“个体”、“受试者”或“患者”是脊椎动物。在某些实施方案中，脊椎动物是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于牲畜动物（诸如牛）、运动动物、宠物（诸如猫、犬、和马）、灵长类、小鼠和大鼠。在某些实施方案中，哺乳动物是人。
术语“药物配制剂”指处于如下的形式，从而容许活性成分的生物学活性有效，而且不含对于会接受配制剂施用的受试者具有不可接受的毒性的别的组分的制剂。此类配制剂可以是无菌的。
“有效量”指有效实现期望的治疗或预防结果所必需的，剂量和时段上的量。
II.本发明的实施方案
本发明部分涉及不同类T-ALL的表征。一类T-ALL对用GSI（其是一种泛刻缺蛋白抑制剂）治疗敏感，而且还对用刻缺蛋白1特异性拮抗剂治疗敏感，指示刻缺蛋白1特异性驱动此类T-ALL。另一类T-ALL对用GSI治疗敏感，但是对用刻缺蛋白1特异性拮抗剂治疗不敏感（即，有抗性），指示备选的或额外的刻缺蛋白受体可驱动此类T-ALL。如本文中所显示的，发明人已经发现了此后一类T-ALL对用刻缺蛋白3特异性拮抗剂治疗部分敏感，并且对刻缺蛋白1特异性拮抗剂和刻缺蛋白3特异性拮抗剂的组合甚至更敏感。这些结果提示了刻缺蛋白1和刻缺蛋白3两者在白血病，特别是T细胞和T细胞祖先白血病诸如T-ALL中的作用。
A.治疗方法
1.单独地或与刻缺蛋白1特异性拮抗剂组合地用刻缺蛋白3特异性拮抗剂治疗癌症
在本发明的多个方面，提供了治疗GSI响应性癌症的方法，该方法包括对患有此类癌症的患者施用有效量的刻缺蛋白3特异性拮抗剂。在某些实施方案中，GSI响应性癌症是白血病。在某些实施方案中，GSI响应性癌症不响应刻缺蛋白1特异性拮抗剂，例如，癌症具有显著升高的活化的刻缺蛋白3水平和/或癌症具有缺乏或降低的活化的刻缺蛋白1水平。在又一个实施方案中，所述方法进一步包括施用有效量的刻缺蛋白1特异性拮抗剂。下文描述了本发明的这些和其它方面。
在本发明的一个具体的方面，提供了治疗不响应刻缺蛋白1特异性拮抗剂的GSI响应性白血病的方法，该方法包括对患有此类白血病的患者施用有效量的刻缺蛋白3特异性拮抗剂。
可以通过多种方式来鉴定GSI响应性白血病。例如，可以用GSI治疗患有白血病的患者以测定白血病是否是GSI响应性的。此类GSI可以包括显著抑制刻缺蛋白受体的任何GSI。此类GSI包括但不限于N-[N-(3,5-二氟苯乙酰)-L-丙氨酰]-S-苯基甘氨酸叔丁酯(DAPT)；二苯并氮卓(dibenzazepine)；MK-0752(Merck)；三肽z-Leu-Leu-Nle-CHO(Curry等,Oncogene 24:6333-6344)；和cbz-IL-CHO(Weijzen等,Nat.Med.8:979-986,2002)。然而，注意到患有白血病的患者不需要已经用GSI治疗以测定白血病是否是GSI响应性的。可以采用其它方法。例如，可以在存在GSI，诸如上文所列的那些GSI之任一的情况中对自患者取出的白血病细胞评估细胞增殖或存活。在别的例子中，可以对自患者取出的白血病细胞检查通过一种或多种刻缺蛋白受体实现的刻缺蛋白信号传导的升高，这会预测细胞是GSI响应性的。例如，可以对细胞评估突变的、过表达的、或活化的刻缺蛋白受体的存在。可以使用与上文所描述的那些方法相似的方法来测定任何癌症是否是GSI响应性的。
可以通过多种方式将白血病（例如，GSI响应性白血病）可以鉴定为不响应刻缺蛋白1特异性拮抗剂的。例如，可以用刻缺蛋白1特异性拮抗剂治疗患有白血病的患者以测定白血病是否响应刻缺蛋白1特异性拮抗剂。在某些实施方案中，白血病不响应的刻缺蛋白1特异性拮抗剂是抗刻缺蛋白1拮抗性抗体。在一个此类实施方案中，抗刻缺蛋白1拮抗性抗体是结合刻缺蛋白1的胞外域，并且实现降低的刻缺蛋白1信号传导的抗体。在一个此类实施方案中，抗刻缺蛋白1拮抗性抗体是抗刻缺蛋白1NRR抗体。抗刻缺蛋白1NRR抗体包括但不限于美国申请公开文本No.US 2009/0081238A1（通过提及而将其明确地完整收入本文）中披露的任何抗刻缺蛋白1NRR抗体。此类抗体包括但不限于以≤0.1μM的亲和力结合刻缺蛋白1NRR的抗刻缺蛋白1NRR抗体；结合刻缺蛋白1NRR的LNR-A、LNR-B和HD-C的抗刻缺蛋白1NRR抗体；或上述的组合。例示性的抗刻缺蛋白1NRR抗体包括但不限于抗体A、A-1、A-2、和A-3，如记载于US 2009/0081238A1的，或包含选自抗体A、A-1、A-2、和A-3的抗体的重和轻链可变区CDR的抗体。在另一个此类实施方案中，抗刻缺蛋白1拮抗性抗体是结合刻缺蛋白1的一个或多个EGF样重复的抗刻缺蛋白1抗体。此类抗体的例子记载于国际公开文本No.WO2008/091641。在某些实施方案中，结合刻缺蛋白1的一个或多个EGF样重复的抗刻缺蛋白1抗体通过显著阻断配体对刻缺蛋白1的结合来实现降低的刻缺蛋白1信号传导。
然而，注意到患有白血病的患者不需要已经用刻缺蛋白1特异性拮抗剂治疗以测定白血病是否是不响应刻缺蛋白1特异性拮抗剂的。可以采用其它方法。例如，可以对自患者取出的白血病细胞评估缺乏或降低的刻缺蛋白1活化，或者在某些实施方案中，野生型刻缺蛋白1的存在，这会预测白血病是不响应刻缺蛋白1特异性拮抗剂的。例如，可以通过评估缺乏或降低的刻缺蛋白1靶基因，诸如Hey1和Hey2转录来对细胞评估缺乏或降低的刻缺蛋白1信号传导。在又一个例子中，可以通过检测缺乏或降低的活化形式的刻缺蛋白1水平来对细胞评估缺乏或降低的刻缺蛋白1信号传导，例如通过使用对活化的刻缺蛋白1特异性的抗体，诸如抗活性刻缺蛋白1Val1744（购自CellSignaling Technologies）来进行。在某些实施方案中，合适的比较细胞（阳性对照）可以是响应刻缺蛋白1特异性拮抗剂的白血病细胞，例如，其中的刻缺蛋白1途径被激活的白血病细胞。此类比较细胞可以包括例如如下的T-ALL细胞，其中已知刻缺蛋白1是过表达的、突变的（例如，具有刻缺蛋白1激活突变）或活化的（例如，组成性活化的），诸如HPB-ALL细胞。若与比较细胞相比，自患者取出的白血病细胞具有缺乏或显著降低的活化的刻缺蛋白1水平，则患者的白血病推测是不响应刻缺蛋白1特异性拮抗剂的。
也可以对白血病细胞评估刻缺蛋白3的活化，这指示刻缺蛋白3途径被激活，而且因此预测白血病是不响应刻缺蛋白1特异性拮抗剂的。在一个实施方案中，可以对白血病细胞检查过表达的、突变的或活化的刻缺蛋白3的存在。在某些实施方案中，用于评估刻缺蛋白3活化状态的合适的比较细胞（阴性对照）可以是响应刻缺蛋白1特异性拮抗剂的白血病细胞，例如，其中的刻缺蛋白1被活化的白血病细胞。此类比较细胞可以包括例如，如下的T-ALL细胞，其中已知刻缺蛋白1是过表达的、突变的或活化的，诸如HPB-ALL细胞。在此类细胞中，预期刻缺蛋白3不被显著活化。因此，若与比较细胞相比自患者取出的白血病细胞具有显著升高的活化的刻缺蛋白3水平，则患者的白血病推测是不响应刻缺蛋白1特异性拮抗剂的。在某些其它实施方案中，合适的比较细胞（阳性对照）可以是如下的白血病细胞，其中已知刻缺蛋白3是过表达的、突变的或活化的，诸如TALL-1细胞。在此类细胞中，预期刻缺蛋白3具有显著升高的活化的刻缺蛋白3水平。因此，若与比较细胞相比自患者取出的白血病细胞具有相当的活化的刻缺蛋白3水平，则患者的白血病推测是不响应刻缺蛋白1特异性拮抗剂的。可以使用与上文所描述的那些方法类似的方法来测定任何癌症是否是不响应刻缺蛋白1特异性拮抗剂的。
一种可用于评估刻缺蛋白3活化状态的工具是实施例中所描述的新的抗刻缺蛋白3ICD抗体，其结合活化的刻缺蛋白3ICD。
在某些实施方案中，施用的刻缺蛋白3特异性拮抗剂是抗刻缺蛋白3拮抗性抗体。在一个此类实施方案中，抗刻缺蛋白3拮抗性抗体是结合刻缺蛋白3的胞外域，并且实现降低的刻缺蛋白3信号传导的抗体。在一个此类实施方案中，抗刻缺蛋白3拮抗性抗体是抗刻缺蛋白3NRR抗体。抗刻缺蛋白3NRR抗体包括但不限于美国专利申请公开文本No.US 2008/0226621A1（通过提及而明确地将其完整收入本文）中披露的任何抗刻缺蛋白3NRR抗体。此类抗体包括但不限于结合刻缺蛋白3NRR的LNR-A和HD-C域的抗刻缺蛋白3NRR抗体。例示性的抗刻缺蛋白3NRR抗体是单克隆抗体256A-4和256A-8，如记载于US 2008/0226621A1的，及其人源化形式，以及包含抗体256A-4或256A-8的重和轻链可变区CDR的抗刻缺蛋白3NRR抗体。在另一个此类实施方案中，抗刻缺蛋白3拮抗性抗体是结合刻缺蛋白3的一个或多个EGF样重复的抗刻缺蛋白3抗体。此类抗体的例子记载于Li等,J.Biol.Chem.283:8046-8054,2008。在某些实施方案中，结合刻缺蛋白3的一个或多个EGF样重复的抗刻缺蛋白3抗体通过显著阻断配体对刻缺蛋白3的结合来实现降低的刻缺蛋白3信号传导。
在某些实施方案中，白血病是T细胞白血病。在某些此类实施方案中，T细胞白血病是T细胞祖先白血病。在某些此类实施方案中，T细胞祖先白血病是T-ALL。
在又一些实施方案中，提供了治疗不响应刻缺蛋白1特异性拮抗剂的GSI响应性癌症的方法，该方法包括对患有此类癌症的患者施用有效量的刻缺蛋白3特异性拮抗剂，并且进一步包括对此类患者施用有效量的刻缺蛋白-1特异性拮抗剂。在某些实施方案中，GSI响应性癌症是GSI响应性白血病。在某些实施方案中，要施用的刻缺蛋白1特异性拮抗剂是抗刻缺蛋白1拮抗性抗体。在一个此类实施方案中，抗刻缺蛋白1拮抗性抗体是结合刻缺蛋白1的胞外域，并且实现降低的刻缺蛋白1信号传导的抗体。在一个此类实施方案中，抗刻缺蛋白1拮抗性抗体是抗刻缺蛋白1NRR抗体。抗刻缺蛋白1NRR抗体包括但不限于美国申请公开文本No.US 2009/0081238A1（通过提及而将其明确收入本文）中披露的任何抗刻缺蛋白1NRR抗体。此类抗体包括但不限于以≤0.1μM的亲和力结合刻缺蛋白1NRR的抗刻缺蛋白1NRR抗体；结合刻缺蛋白1NRR的LNR-A、LNR-B和HD-C的抗刻缺蛋白1NRR抗体；或前述的组合。例示性的抗刻缺蛋白1NRR抗体包括但不限于抗体A、A-1、A-2、和A-3，如记载于US 2009/0081238A1的，或包含选自抗体A、A-1、A-2、和A-3的抗体的重和轻链可变区CDR的抗体。在另一个此类实施方案中，抗刻缺蛋白1拮抗性抗体是结合刻缺蛋白1的一个或多个EGF样重复的抗刻缺蛋白1抗体。此类抗体的例子记载于国际公开文本No.WO 2008/091641。在某些实施方案中，结合刻缺蛋白1的一个或多个EGF样重复的抗刻缺蛋白1抗体通过显著阻断配体对刻缺蛋白1的结合来实现降低的刻缺蛋白1信号传导。
2.用刻缺蛋白1特异性拮抗剂治疗白血病
本发明的别的方面部分基于鉴定一类响应GSI，而且也响应刻缺蛋白1特异性拮抗剂，但是不响应刻缺蛋白3特异性拮抗剂的T-ALL，指示刻缺蛋白1驱动T-ALL。在本发明的多个方面，提供了治疗GSI响应性癌症的方法，该方法包括对患有此类癌症的患者施用有效量的刻缺蛋白1特异性拮抗剂。在某些实施方案中，GSI响应性癌症是白血病。在某些实施方案中，GSI响应性癌症不响应刻缺蛋白3特异性拮抗剂，例如，癌症具有缺乏或降低的活化的刻缺蛋白3水平（例如，与响应刻缺蛋白3特异性拮抗剂的比较细胞相比）和/或具有显著升高的活化的刻缺蛋白1水平（例如，与不响应刻缺蛋白1特异性拮抗剂的比较细胞相比）。
在某些实施方案中，白血病属于一类以对GSI的敏感性和对刻缺蛋白1特异性拮抗剂的敏感性为特征的白血病。在一个实施方案中，白血病是T细胞白血病。在一个此类实施方案中，T细胞白血病是T细胞祖先白血病。在一个此类实施方案中，T细胞白血病是T-ALL。在另一个实施方案中，白血病以刻缺蛋白1激活突变为特征。
在某些实施方案中，刻缺蛋白1特异性拮抗剂是上文所提供的那些刻缺蛋白1特异性拮抗剂之任一。在又一些实施方案中，刻缺蛋白3特异性拮抗剂是上文所提供的那些刻缺蛋白3特异性拮抗剂之任一。
B.组合物和诊断方法
本发明进一步提供了结合活化的人刻缺蛋白3ICD的抗体。在一个实施方案中，抗体结合肽序列VMVARRKREHSTLW(SEQ ID NO:4)。在一个实施方案中，抗体是单克隆的。在一个实施方案中，抗体是多克隆的。上述实施方案可以单独或组合存在。
此类抗体可用于诊断方法，例如，鉴定适合于用刻缺蛋白3特异性拮抗剂治疗的患者群体，如上文所描述的。因而，在某些实施方案中，提供了鉴定适合于用刻缺蛋白3拮抗剂治疗的癌症的方法，该方法包括测定刻缺蛋白3在癌症中是否是活化的。在一个实施方案中，癌症是GSI响应性癌症。在另一个实施方案中，癌症是白血病。在另一个实施方案中，白血病是T细胞白血病。在一个此类实施方案中，T细胞白血病是T细胞祖先白血病。在一个此类实施方案中，T细胞白血病是T-ALL。
在又一些实施方案中，测定刻缺蛋白3在癌症中是否是活化的包括使癌症样品与结合活化的刻缺蛋白3ICD的抗体接触，并测定是否存在显著升高的活化的刻缺蛋白3水平（如通过活化的刻缺蛋白3ICD水平所反映的），其中显著升高的活化的刻缺蛋白3水平的存在指示癌症适合于用刻缺蛋白3拮抗剂治疗。为了测定样品中是否存在显著升高的活化的刻缺蛋白3水平，合适的比较物（阳性对照）可以是例如来自已知响应刻缺蛋白3拮抗剂的癌症的样品。若“测试”样品和“对照”样品含有相当的活化的刻缺蛋白3水平，则获得“测试”样品的癌症适合于用刻缺蛋白3拮抗剂治疗。另一种合适的比较物（阴性对照）可以是例如来自不响应刻缺蛋白3拮抗剂的癌症的样品。若与对照样品相比，“测试”样品含有显著升高活化的刻缺蛋白3水平，则获得“测试”样品的癌症适合于用刻缺蛋白3拮抗剂治疗。
在上述方法的某些实施方案中，刻缺蛋白3拮抗剂是刻缺蛋白3特异性拮抗剂。在某些实施方案中，刻缺蛋白3特异性拮抗剂是上文讨论的那些刻缺蛋白3特异性拮抗剂之任一。
实施例
A.T-ALL分为三类
先前的研究已经显示了T-ALL细胞系对GSI处理可以是敏感的或不敏感的。例如，某些T-ALL细胞系对GSI有抗性，尽管有激活性刻缺蛋白1突变的表达，这可能是由于激活非刻缺蛋白途径，例如，避开需要刻缺蛋白的途径所致。（见例如,Palomero等,Nat.Med.13:1203-1210,2007）。然而，在一项研究中，30种T-ALL细胞系中的5种是GSI敏感的，显示细胞周期响应GSI而停滞。（见Weng等,Science,306:269-271,2004）。下文报告的研究进一步探索T-ALL细胞系不仅对GSI，而且对刻缺蛋白1和刻缺蛋白3特异性拮抗剂的响应。
三类T-ALL基于其对GSI和刻缺蛋白1特异性拮抗剂的敏感性来表征。以下研究中使用的刻缺蛋白1特异性拮抗剂是抗刻缺蛋白1NRR抗体，即“抗体A-2”，其分离和表征在美国专利申请公开文本No.US 2009/0081238A1中讨论。为了方便，“抗体A-2”在本文中称为“抗NRR1”，并且在图中又称为“α-刻缺蛋白1”、“α刻缺蛋白1”、或“α-N1”。
图3-5呈现了三种代表性人T-ALL细胞系的分类。那些细胞系包括P-12Ichikawa细胞系、HPB-ALL细胞系、和TALL-1细胞系。将细胞在对照条件（单独的DMSO（DAPT的媒介物）或抗gD（同种型对照抗体））下；在存在γ-分泌酶抑制剂DAPT(5μM)的情况中；或在存在抗NRR1(5μg/ml)的情况中培养8天。依照标准的规程，将细胞固定，用碘化丙啶染色，并准备好进行FACS以分析细胞周期状态。通过检查给定处理是否引起G0/G1的细胞的百分比升高及相应的S/G2/M的细胞的百分比降低来评估生长敏感性。结果显示了P-12Ichikawa细胞对DAPT和抗NRR1两者有抗性（图3A-3D），在经DAPT处理的、经抗NRR1处理的、和对照（经DMSO和抗gD处理的）细胞间没有显著的细胞周期状态差异。HPB-ALL细胞对DAPT和抗NRR1两者敏感（图4A-4D），其中与对照细胞的约33-34%相比，经DAPT和抗NRR1处理的细胞分别显示约78%和76%的处于G0/G1的细胞。TALL-1细胞对DAPT敏感，但对抗NRR1有抗性（图5A-5D），其中与经抗NRR1处理的细胞的约55%和对照细胞的约53-54%相比，约87%的经DAPT处理的细胞处于G0/G1。注意到刻缺蛋白1在TALL-1细胞中不是突变的。进一步的研究揭示了第四种细胞系CCRF-CEM落入与P-12Ichikawa细胞相同的类别（即，对GSI和抗NRR1两者有抗性）。（未显示的数据和图10）。
如图6中所显示的，细胞大小测量反映这三类T-ALL。将P-12Ichikawa细胞系、HPB-ALL细胞系、和TALL-1细胞系在对照条件（单独的DMSO（DAPT的媒介物）或抗gD（同种型对照抗体））下；在存在γ-分泌酶抑制剂DAPT(5μM)的情况中；或在存在抗NRR1(5μg/ml)的情况中培养约1周。使用细胞计数器(Vi-Cell,Beckman Coulter)来测量细直径。与生长抑制研究一致，P-12 Ichikawa系对DAPT和抗NRR1两者有抗性，如通过经处理的和对照细胞间的相对一致的细胞直径指示的。HPB-ALL对DAPT和抗NRR1两者敏感，如分别通过用那些药剂处理的细胞显著更小的大小指示的。TALL-1对DAPT敏感，但是对抗NRR1有抗性，如通过用DAPT，而非用抗NRR1或对照药剂处理的细胞显著更小的大小指示的。这些结果与上文所描述的生长研究一致。
如图7中所显示的，凋亡测量也反映这三类T-ALL。如上文对图6所描述的那样处理P-12 Ichikawa细胞系、HPB-ALL细胞系、和TALL-1细胞系。通过FACS分析细胞，其中7-AAD（细胞死亡标志物）的染色在图7的x轴上，而膜联蛋白V（凋亡标志物）的染色在图7的y轴上。基于双重阳性群体中的细胞的百分比，用DAPT或抗NRR1的处理提高HPB-ALL细胞中的凋亡细胞死亡。比较而言，P-12 Ichikawa细胞对两种处理都有抗性，而TALL-1细胞对DAPT，而不对抗NRR1敏感。这些结果与上文所描述的生长研究和细胞直径测量一致。
如图8中所显示的，细胞增殖测定法的结果也反映了这三类T-ALL。如上文对图6所描述的那样处理测试P-12 Ichikawa细胞系、HPB-ALL细胞系、和TALL-1细胞系，。使用Ki-67染色来标记增殖通过FACS来分析细胞（左侧小图）。FACS峰向左移动指示较低的Ki-67染色和降低的增殖，并且相反，FACS峰向右移动指示较高的Ki-67染色和升高的增殖。基于此增殖测定法，HPB-ALL对DAPT和抗NRR1两者敏感，TALL-1对DAPT，而不对抗NRR1敏感，而P-12 Ichikawa细胞对这两者有抗性。再一次，这些结果与那些来自上文所描述的其它测定法及图8的右侧小图中显示的凋亡测量的结果一致。所述小图显示了膜联蛋白V/7-AAD双重阴性（非凋亡）细胞的细胞计数。低细胞计数（即，低数目的膜联蛋白V/7-AAD双重阴性（非凋亡）细胞）指示升高的凋亡，其继而与左手小图中降低的增殖相关联。
B.GSI响应性、抗NRR1抗性TALL-1细胞对抗NRR3是部分敏感的
如上文所描述的，三类T-ALL中的两种（以HPB-ALL和TALL-1代表）都对GSI敏感，但是差别在于前一种对抗NRR1敏感，而后一种不然。因为对GSI的敏感性提示一种或多种刻缺蛋白受体的作用，我们提问在刻缺蛋白1外或作为刻缺蛋白1的备选刻缺蛋白受体是否在后一类T-ALL对抗刻缺蛋白1NRR的抗性中发挥作用。为了解决此问题，如对图3-5所描述的，处理CCRF-CEM细胞、HPB-ALL细胞、和TALL-1细胞，只是还将刻缺蛋白3特异性拮抗剂以10μg/ml纳入处理子集中以测试生长是否依赖刻缺蛋白3信号传导。这些研究中使用的刻缺蛋白3特异性拮抗剂是小鼠抗人刻缺蛋白3单克隆抗体256A-4，其分离和表征在美国专利申请公开文本No.US 2008/0226621A1中讨论。为了方便，256A-4在本文中称为“抗NRR3”，并且在图中又称为“α-N3”。
结果指示了TALL-1的生长对抗NRR3部分敏感，并且对抗NRR1加抗NRR3甚至更敏感（见图9A-9F），提示了经由刻缺蛋白3及刻缺蛋白1的信号传导解释该系为何对DAPT，而不对抗NRR1敏感。具体地，与对照（经DMSO或α-gD处理的）细胞的约53-54%相比，几乎83%的TALL-1细胞在DAPT处理后为G0/G1。抗NRR3处理导致约61%的处于G0/G1的细胞，并且添加抗NRR1将此数字提高至约68%。比较而言，CCRF-CEM表现为对所有测试处理有抗性（图10A-10F），各显示约52-57%的处于G0/G1的细胞。HBP-ALL表现为对DAPT和抗NRR1处理两者（各显示约67%的处于G0/G1的细胞），而非抗NRR3处理（显示约37%的处于G0/G1的细胞）敏感（图11A-11F）。
图14中再次描绘了图9B-9F中的上述实验的结果。TALL-1细胞培养物以约5x105个细胞/ml开始，并且y轴是在指定条件下并且如对图9B-9F所描述的那样处理后的细胞数目/ml（以百万个细胞计）。图14显示了抗NRR1和抗NRR3各自独立导致较低的细胞计数。然而，抗NRR1和抗NRR3的组合在降低细胞计数方面具有更明显的效果，接近用DAPT看到的水平。
C.刻缺蛋白3在抗NRR3敏感性细胞中是活化的
为了调查三类T-ALL中刻缺蛋白3的活化状态，开发出新的抗刻缺蛋白3ICD抗体，其识别经切割的（即，活化的）刻缺蛋白3ICD。使用标准的规程，针对与刻缺蛋白3ICD的N端对应的肽来生成家兔多克隆抗体，预期所述刻缺蛋白3ICD源自位点S3处的γ-分泌酶切割。所使用的肽序列是：VMVARRKREHSTLW(SEQ ID NO:4)。将肽与BSA缀合以进行免疫。将多克隆抗体在蛋白A柱上纯化，然后用于免疫印迹，如图12中所显示的。为了测试抗体是否识别细胞核的、经切割的刻缺蛋白3ICD，使用基底（basal）乳腺癌细胞系MDA-MB-468。此系表达高水平的刻缺蛋白3。用固定化的Jag1(R&D Systems)（或Fc作为对照）处理细胞以诱导刻缺蛋白信号传导，并且在诱导后的指定时间时分离细胞质(C)和细胞核(N)级分。作为检查在没有Jag1诱导情况中存在的刻缺蛋白3ICD水平的对照，用DAPT(5μM)、DMSO（DAPT的媒介物）或蛋白酶体抑制剂MG132处理没有诱导的细胞以稳定化刻缺蛋白3ICD，如指示的。CREB和微管蛋白分别充当细胞核和细胞质蛋白的标志物。图12中的结果显示了抗刻缺蛋白3ICD抗体识别定位于细胞核并且由Jag1诱导的预期大小的条带。
然后，使用此新的抗刻缺蛋白3ICD抗体来调查刻缺蛋白3在三类T-ALL中的活化状态。如图13中所显示的，用抗刻缺蛋白1Val1744（即一种识别经切割的、活化的刻缺蛋白1ICD的商品化多克隆抗体(Cell SignalingTechnologies)）（上部小图），或者用抗刻缺蛋白3ICD抗体（α-N3 ICD Y935，下部小图）免疫印迹P12-Ichikawa、HPB-ALL、和TALL-1细胞的细胞核级分。使用表达刻缺蛋白1的3T3细胞(3T3-N1)和MDA-MB-468(MB468)细胞作为对照。与前图中所描述的生长抑制研究一致，TALL-1表达高水平的活化的刻缺蛋白3，而非活化的刻缺蛋白1（分别比较下部和上部小图中的TALL-1道）。此外，可以通过DAPT而非抗NRR1阻断TALL-1中活化的刻缺蛋白3生成（下部小图）。此外，如预期的，HPB-ALL细胞表达高水平的活化的刻缺蛋白1，其可以通过DAPT或抗NRR1抗体阻断（见上部小图中的HPB-ALL道）。关于对照，看到活化的刻缺蛋白1为用锯齿蛋白处理的3T3-N1细胞(+jag)中较亮的、上移的条带（上部小图）。另外，看到活化的刻缺蛋白3为在没有DAPT的情况中用抗刻缺蛋白3激动性抗体（A13，以256A-13记载于美国专利申请公开文本US 2008/0118520A1）处理的MDA-MB-468细胞中微弱的，但可检出的条带（下部小图）。
虽然为了清楚理解已经以例示和举例方式较为详细地描述了前述发明，但是说明书和实施例不应解释为限制本发明的范围。通过提及而明确地完整收录本文中所引用的所有专利和科学文献的公开内容。
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Claims (22)

1.一种治疗不响应刻缺蛋白1特异性拮抗剂的GSI响应性T细胞白血病的方法，该方法包括对患有此类白血病的患者施用有效量的刻缺蛋白3特异性拮抗剂。
2.权利要求1的方法，其中所述T细胞白血病是成淋巴细胞性白血病。
3.权利要求2的方法，其中所述T细胞白血病是T-ALL。
4.权利要求1的方法，其中所述刻缺蛋白3特异性拮抗剂是抗刻缺蛋白3拮抗性抗体。
5.权利要求4的方法，其中所述抗刻缺蛋白3拮抗性抗体是抗刻缺蛋白3NRR抗体。
6.权利要求5的方法，其中所述抗刻缺蛋白3NRR抗体结合刻缺蛋白3NRR的LNR-A和HD-C域。
7.权利要求5的方法，其中所述抗刻缺蛋白3NRR抗体是抗体256A-4或256A-8的人源化形式。
8.权利要求5的方法，其中所述抗刻缺蛋白3NRR抗体包含抗体256A-4或256A-8的重和轻链可变区CDR。
9.权利要求4的方法，其中所述抗刻缺蛋白3拮抗性抗体是结合刻缺蛋白3的一个或多个EGF样重复的抗刻缺蛋白3抗体。
10.权利要求1的方法，其进一步包括施用有效量的刻缺蛋白1特异性拮抗剂。
11.权利要求10的方法，其中所述刻缺蛋白1特异性拮抗剂是抗刻缺蛋白1拮抗性抗体。
12.权利要求11的方法，其中所述抗刻缺蛋白1拮抗性抗体是抗刻缺蛋白1NRR抗体。
13.权利要求12的方法，其中所述抗刻缺蛋白1NRR抗体结合刻缺蛋白1NRR的LNR-A、LNR-B、和HD-C域。
14.权利要求12的方法，其中所述抗刻缺蛋白1NRR抗体选自抗体A、A-1、A-2、和A-3。
15.权利要求12的方法，其中所述抗刻缺蛋白1NRR抗体包含选自抗体A、A-1、A-2、和A-3的抗体的重和轻链可变区CDR。
16.权利要求11的方法，其中所述抗刻缺蛋白1拮抗性抗体是结合刻缺蛋白1的一个或多个EGF样重复的抗刻缺蛋白1抗体。
17.一种结合活化的刻缺蛋白3ICD的抗体。
18.权利要求17的抗体，其中所述抗体结合SEQ ID NO:4的肽。
19.权利要求17的抗体，其中所述抗体是多克隆的。
20.权利要求17的抗体，其中所述抗体是单克隆的。
21.一种鉴定适合于用刻缺蛋白3拮抗剂治疗的癌症的方法，该方法包括使所述癌症的样品与权利要求17的抗体接触，并测定所述样品中是否存在显著升高的活化的刻缺蛋白3水平，其中显著升高的活化的刻缺蛋白3水平的存在指示所述癌症适合于用刻缺蛋白3拮抗剂治疗。
22.权利要求21的方法，其中所述癌症是GSI响应性的。
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