CN105051215A

CN105051215A - 治疗胰腺癌的方法

Info

Publication number: CN105051215A
Application number: CN201480016155.2A
Authority: CN
Inventors: 蒂莫西·查尔斯·霍伊; 张春; A·M·卡保恩
Original assignee: Oncomed Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Oncomed Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2014-03-13
Publication date: 2015-11-11
Also published as: WO2014151606A3; JP2016520289A; CA2900969A1; MX2015011386A; EP2971146A4; WO2014151606A2; EP2971146A2; IL240688A0; US20160030561A1; WO2014151606A4; KR20150130466A; HK1211322A1; AU2014233736A1

Abstract

提供了治疗胰腺癌的新方法。在一个实施方式中，所述方法包括确定胰腺癌细胞中的NOTCH？mRNA表达水平。在另一个实施方式中，所述方法还包括向有需要的受试对象施用治疗有效量的NOTCH拮抗剂。

Description

治疗胰腺癌的方法

对相关申请的交叉引用

本申请要求于2013年3月15日递交的美国临时申请第61/794,788号的优先权，将该临时申请通过援引完整地并入本文中。

技术领域

本发明的领域总体涉及治疗胰腺癌的方法。在一个实施方式中，所述方法包括确定胰腺癌细胞中的NOTCH基因表达水平。在另一个实施方式中，所述方法还包括向有需要的受试对象施用治疗有效剂量的NOTCH拮抗剂。

背景技术

NOTCH信号传导途径是胚胎模式形成、胚后期组织维持和干细胞生物学的若干种关键调控因子之一。失调的NOTCH信号传导与多种人类癌症相关，在这些癌症中其能够改变肿瘤细胞的发育命运以将这些细胞保持在未分化的增殖状态(BrennanandBrown,2003,BreastCancerRes.5:69)。因此，致癌作用可以通过篡夺控制正常发育和凭借干细胞群的组织修复的体内稳态机制而进行(Beachy等，2004,Nature432:324)。

Notch受体是单次跨膜受体，在大胞外结构域中含有许多串联的表皮生长因子(EGF)样重复和三个富含半胱氨酸的Notch/LIN-12重复(Wharton等，1985，Cell43：567；Kidd等，1986，Mol.Cell.Biol.6：3094；Artavanis等的综述，1999，Science284：770)。已经鉴定出4种哺乳动物Notch蛋白(Notch1、Notch2、Notch3和Notch4)，这些受体中的突变总是导致发育异常和人类病变，所述发育异常和人类病变包括以下详细说明的几种癌(Gridley，1997，Mol.CellNeurosci.9：103；Joutel&Tournier-Lasserve，1998，Semin.CellDev.Biol.9：619-25)。

异常Notch信号传导涉及许多人类恶性肿瘤，例如，T细胞急性淋巴母细胞白血病、乳腺癌、宫颈癌、肾细胞癌、头颈鳞状上皮细胞癌。异常Notch信号传导还与胰腺癌的发展有关。参见例如Mazur等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.107(30):13438-43(2010),Wang等，CancerRes.69(6):2400-7(2009),Doucas等，J.Surg.Oncol.97(1):63-8(2008),Yao和Qian,Med.Oncol.27(3):1017-22(2010)；和Gungor等，CancerRes.71(14):5009-19(2011)。

胰腺癌是引起癌症死亡的第四大原因，存活期中位数为6个月，5年存活率不幸地为3％～5％，而且这一数字在过去25年一直保持相对不变(Iovanna等，Front.Oncol.2012；2:6)。即使对于被诊断为患有局部病的患者，五年存活率也仅有15％。胰腺癌的致死特性源于其快速扩散至淋巴系统和远端器官的倾向。在诊断时隐匿性转移或临床转移的存在和有效化疗的缺乏共同促成了胰腺癌患者的高死亡率。

胰腺癌是固有抗药性最高的肿瘤之一，对化疗剂的抗性是胰腺癌治疗失败的主要原因。吉西他滨是晚期胰腺癌患者的标准化疗剂(Burris等，Eur.J.Cancer1997,33:S18-22)。最近显示，与吉西他滨相比，联用5-FU、依立替康和奥沙利铂的多重化疗方案(FOLFIRINOX)几乎使总体存活率翻倍，代价是可控但增加的毒性，这将其应用限制在了良好表现状态的患者。此外，总体存活时间小于12个月(Conroy等，N.Engl.J.Med.2011,364:1817-25)。因此，需要设计新的靶向治疗策略，其能够克服抗药性并改善被诊断为患有胰腺癌的患者的临床结果。

发明内容

在一方面，本发明提供为了用NOTCH抑制剂进行治疗而选择胰腺癌患者的方法，所述方法包括：(a)确定来自所述患者的肿瘤细胞中的一种或多种生物标志物的表达水平，其中，所述一种或多种生物标志物包含NOTCH3，和(b)基于所述一种或多种生物标志物的表达水平选择患者。

在另一方面，本发明提供确定被诊断为患有胰腺癌的患者是否可能对基于NOTCH抑制剂的疗法产生响应的方法，所述方法包括：确定来自所述患者的肿瘤细胞中的一种或多种生物标志物的表达水平，其中，所述一种或多种生物标志物包含NOTCH3，并且所述一种或多种生物标志物的表达水平表明患者可能对疗法产生响应。

在另一方面，本发明提供确定是否应当向被诊断为患有胰腺癌的患者施用NOTCH抑制剂的方法，所述方法包括：确定来自所述患者的肿瘤细胞中的一种或多种生物标志物的表达水平，其中，所述一种或多种生物标志物包含NOTCH3，并且所述一种或多种生物标志物的表达水平预示所述患者对NOTCH抑制剂治疗具有有利的响应。

在另一方面，本发明提供确定被诊断为患有胰腺癌的患者是否应当继续用NOTCH抑制剂进行治疗的方法，所述方法包括：确定来自所述患者的肿瘤细胞中的一种或多种生物标志物的表达水平，其中，所述一种或多种生物标志物包含NOTCH3，并且所述一种或多种生物标志物的表达水平表明患者可能对疗法产生响应。

在另一方面，本发明提供确定被诊断为患有胰腺癌的患者是否应当继续用NOTCH抑制剂进行治疗的方法，所述方法包括：确定来自所述患者的肿瘤细胞中的一种或多种生物标志物的表达水平，其中，所述一种或多种生物标志物包含NOTCH3，并且所述一种或多种生物标志物的表达水平预示所述患者对所述NOTCH抑制剂治疗具有有利的响应。

在另一方面，本发明提供确定NOTCH抑制剂在治疗患者的胰腺癌中的治疗功效的方法，所述方法包括：确定来自所述患者的肿瘤细胞中的一种或多种生物标志物的表达水平，其中，所述一种或多种生物标志物包含NOTCH3，并且所述一种或多种生物标志物的表达水平表明所述NOTCH抑制剂的治疗功效。

在另一方面，本发明提供治疗患者的胰腺癌的方法，所述方法包括：(a)确定来自所述患者的肿瘤细胞中的一种或多种生物标志物的表达水平，其中，所述一种或多种生物标志物包含NOTCH3；和(b)向所述患者施用治疗有效量的NOTCH抑制剂。

在另一方面，本发明提供为了用NOTCH抑制剂进行治疗而将胰腺癌患者群体分阶(stratify)的方法，所述方法包括：(a)确定来自所述患者的肿瘤细胞中的一种或多种生物标志物的表达水平，其中，所述一种或多种生物标志物包含NOTCH3，和(b)基于所述肿瘤细胞中的所述一种或多种生物标志物的表达水平将所述患者群体分阶。

在某些实施方式中，NOTCH3的表达水平经确定高于NOTCH3的参照表达水平。在某些实施方式中，每种生物标志物经确定都以高于该生物标志物的参照水平的水平表达。

在某些实施方式中，一种或多种生物标志物的表达水平通过确定生物标志物mRNA或生物标志物蛋白的水平来确定。在某些实施方式中，NOTCH3的表达水平通过确定肿瘤细胞中的NOTCH3mRNA水平来确定。在某些实施方式中，NOTCH3mRNA水平通过定量聚合酶链式反应来确定。在某些实施方式中，NOTCH3mRNA水平使用以下(a)、(b)和/或(c)来确定：(a)核苷酸序列选自由SEQIDNO:35、SEQIDNO:38和SEQIDNO:41组成的组的正向引物；(b)核苷酸序列选自由SEQIDNO:36、SEQIDNO:39和SEQIDNO:42组成的组的反向引物；和/或(c)包含寡核苷酸的探针，所述寡核苷酸的核苷酸序列选自由SEQIDNO:37、SEQIDNO:40和SEQIDNO:43组成的组。在某些实施方式中，NOTCH3mRNA水平使用以下(a)、(b)或(c)来确定：(a)序列为SEQIDNO:35的正向引物，序列为SEQIDNO:36的反向引物，和包含序列为SEQIDNO:37的寡核苷酸的探针；(b)序列为SEQIDNO:38的正向引物，序列为SEQIDNO:39的反向引物，和包含序列为SEQIDNO:40的寡核苷酸的探针；或(c)序列为SEQIDNO:41的正向引物，序列为SEQIDNO:42的反向引物，和包含序列为SEQIDNO:43的寡核苷酸的探针。在某些实施方式中，NOTCH3mRNA水平通过阵列杂交来确定。在某些实施方式中，NOTCH3的表达水平通过确定肿瘤细胞所表达的NOTCH3蛋白水平来确定。

在某些实施方式中，一种或多种生物标志物由NOTCH3构成。在某些实施方式中，一种或多种生物标志物还包括MAML2，并且MAML2的表达水平经确定高于MAML2的参照表达水平。在某些实施方式中，一种或多种生物标志物由NOTCH3和MAML2构成。在某些实施方式中，MAML2的表达水平通过确定肿瘤细胞中的MAML2mRNA水平来确定。在某些实施方式中，MAML2的表达水平通过确定肿瘤细胞所表达的MAML2蛋白水平来确定。

在另一方面，本发明提供治疗患者的胰腺癌的方法，所述方法包括：向所述患者施用治疗有效量的NOTCH抑制剂，其中，来自所述患者的至少一些胰腺肿瘤细胞：表达一种或多种生物标志物中的每一种且表达水平高于所述生物标志物的参照水平，且/或已被预先确定为表达一种或多种生物标志物中的每一个且表达水平高于所述生物标志物的参照水平；其中，所述一种或多种生物标志物包含NOTCH3。在某些实施方式中，NOTCH3的表达水平以NOTCH3mRNA水平来确定。在某些实施方式中，NOTCH3的表达水平以NOTCH3蛋白水平来确定。在某些实施方式中，一种或多种生物标志物由NOTCH3构成。在某些实施方式中，一种或多种生物标志物还包括MAML2，并且MAML2的表达水平高于MAML2的参照表达水平。在某些实施方式中，一种或多种生物标志物由NOTCH3和MAML2构成。

在本文所述的方法的某些实施方式中，生物标志物的参照水平是预定值。在某些实施方式中，生物标志物的参照水平是该生物标志物在对照样品中的表达水平。在某些实施方式中，NOTCH3的参照表达水平是胰腺癌或胰腺癌亚类中的NOTCH3表达的第25、30、40、50、60、70、75或80百分位数(percentile)。在某些实施方式中，NOTCH3的参照表达水平是胰腺癌中的NOTCH3表达的第75百分位数。在某些实施方式中，NOTCH3的参照表达水平是胰腺癌中的NOTCH3表达的第50百分位数。在某些实施方式中，NOTCH3的参照表达水平是胰腺癌中的NOTCH3表达的第25百分位数。在某些实施方式中，NOTCH3的参照表达水平是胰腺腺癌、转移胰腺肿瘤、肝脏和/或淋巴结转移胰腺肿瘤或抗化疗胰腺癌中的NOTCH3表达的第75百分位数。在某些实施方式中，NOTCH3的参照表达水平是胰腺腺癌、转移胰腺肿瘤、肝脏和/或淋巴结转移胰腺肿瘤或抗化疗胰腺癌中的NOTCH3表达的第50百分位数。在某些实施方式中，NOTCH3的参照表达水平是胰腺腺癌、转移胰腺肿瘤、肝脏和/或淋巴结转移胰腺肿瘤或抗化疗胰腺癌中的NOTCH3表达的第25百分位数。

在某些实施方式中，本文描述的方法还包括从所述患者获得身体样品。在某些实施方式中，NOTCH3的表达水平是来自患者的身体样品中的水平。在某些实施方式中，样品是全血、血浆、血清或组织。在某些实施方式中，样品是胰腺肿瘤样品。在某些实施方式中，样品是来自已转移至肝脏的胰腺肿瘤的样品。在某些实施方式中，样品是福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)的组织。

在本文所述的方法的某些实施方式中，患者是人，或所述患者群体是人群体。

在本文所述的方法的某些实施方式中，胰腺癌是腺癌。在某些实施方式中，胰腺癌是抗化疗的。

在某些实施方式中，本文描述的方法包括向所述患者施用NOTCH抑制剂。在某些实施方式中，NOTCH抑制剂是γ分泌酶抑制剂。在某些实施方式中，NOTCH抑制剂是抗NOTCH抗体。

在某些实施方式中，抗NOTCH抗体特异性地结合人NOTCH2或人NOTCH3。在某些实施方式中，抗NOTCH抗体特异性地结合人NOTCH2和NOTCH3。在某些实施方式中，抗NOTCH抗体特异性地结合人NOTCH2的EGF重复10。在某些实施方式中，抗NOTCH抗体特异性地结合人NOTCH3的EGF重复9。在某些实施方式中，抗NOTCH抗体包含与人NOTCH3的EGF重复9和人NOTCH2的EGF重复10都结合的抗原结合位点。

在某些实施方式中，NOTCH抑制剂是人NOTCH2和/或NOTCH3的拮抗剂。在某些实施方式中，NOTCH抑制剂抑制配体与人NOTCH2和/或NOTCH3的结合。在某些实施方式中，NOTCH抑制剂抑制人NOTCH2和/或NOTCH3的信号传导。

在某些实施方式中，抗NOTCH抗体由以PTA-9547保藏在ATCC的多核苷酸所编码。

在某些实施方式中，抗NOTCH抗体特异性地结合人NOTCH2和/或NOTCH3，其中，所述抗体包含：(a)包含SSSGMS(SEQIDNO:3)的重链CDR1，包含VIASSGSNTYYADSVKG(SEQIDNO:4)的重链CDR2，和包含SIFYTT(SEQIDNO:9)的重链CDR3；和(b)包含RASQSVRSNYLA(SEQIDNO:6)的轻链CDR1，包含GASSRAT(SEQIDNO:7)的轻链CDR2，和包含QQYSNFPI(SEQIDNO:8)的轻链CDR3。在某些实施方式中，抗NOTCH抗体特异性地结合人NOTCH2和/或NOTCH3，其中，所述抗体包含：(a)包含SSSGMS(SEQIDNO:3)的重链CDR1，包含VIASSGSNTYYADSVKG(SEQIDNO:4)的重链CDR2，和包含GIFFAI(SEQIDNO:5)的重链CDR3；和(b)包含RASQSVRSNYLA(SEQIDNO:6)的轻链CDR1，包含GASSRAT(SEQIDNO:7)的轻链CDR2，和包含QQYSNFPI(SEQIDNO:8)的轻链CDR3。

在某些实施方式中，抗NOTCH抗体特异性地结合人NOTCH2和/或NOTCH3，其中，所述抗体包含：(a)与SEQIDNO:17、SEQIDNO:18或SEQIDNO:26具有至少约90％序列同一性的重链可变区；和(b)与SEQIDNO:29或SEQIDNO:27具有至少约90％序列同一性的轻链可变区。在某些实施方式中，抗NOTCH抗体包含：(a)与SEQIDNO:17具有至少约95％序列同一性的重链可变区；和(b)与SEQIDNO:29具有至少约95％序列同一性的轻链可变区。在某些实施方式中，抗NOTCH抗体包含：(a)与SEQIDNO:18具有至少约95％序列同一性的重链可变区；和(b)与SEQIDNO:29具有至少约95％序列同一性的轻链可变区。在某些实施方式中，抗NOTCH抗体包含：(a)包含SEQIDNO:18的重链可变区；和(b)包含SEQIDNO:29的轻链可变区。在某些实施方式中，抗NOTCH抗体包含：(a)包含SEQIDNO:17的重链可变区；和(b)包含SEQIDNO:29的轻链可变区。

在某些实施方式中，抗NOTCH抗体与选自由以下抗体组成的组的抗体竞争对人NOTCH2和/或NOTCH3的特异性结合：(a)包含含有SEQIDNO:17或SEQIDNO:18的重链可变区和含有SEQIDNO:29的轻链可变区的抗体；(b)包含含有SSSGMS(SEQIDNO:3)的重链CDR1、含有VIASSGSNTYYADSVKG(SEQIDNO:4)的重链CDR2和含有SIFYTT(SEQIDNO:9)的重链CDR3以及含有RASQSVRSNYLA(SEQIDNO:6)的轻链CDR1、含有GASSRAT(SEQIDNO:7)的轻链CDR2和含有QQYSNFPI(SEQIDNO:8)的轻链CDR3的抗体；和(c)由以PTA-9547保藏在ATCC的多核苷酸编码的抗体。

在某些实施方式中，抗NOTCH抗体是单克隆抗体。在某些实施方式中，抗NOTCH抗体是嵌合抗体、人源化抗体、人抗体或抗体片段。

在某些实施方式中，本文描述的方法还包括施用第二治疗剂。在某些实施方式中，第二治疗剂是化疗剂。在某些实施方式中，第二治疗剂是核苷类似物或有丝分裂抑制剂。在某些实施方式中，第二治疗剂是吉西他滨、紫杉醇、白蛋白结合的紫杉醇或其组合。

在另一方面，本发明提供包含分离的多核苷酸的诊断用组合物，所述多核苷酸包含选自由SEQIDNO:35～43组成的组的序列。在某些实施方式中，所述诊断用组合物包含：(a)序列为SEQIDNO:35的多核苷酸，序列为SEQIDNO:36的多核苷酸，和序列为SEQIDNO:37的多核苷酸；(b)序列为SEQIDNO:38的多核苷酸，序列为SEQIDNO:39的多核苷酸，和序列为SEQIDNO:40的多核苷酸；或(c)序列为SEQIDNO:41的多核苷酸，序列为SEQIDNO:42的多核苷酸，和序列为SEQIDNO:43的多核苷酸。

在另一方面，本发明提供检测样品中的NOTCH3mRNA的方法，所述方法包括使所述样品接触包含选自由SEQIDNO:35～43组成的组的序列的多核苷酸。在某些实施方式中，所述方法包括使样品接触：(a)序列为SEQIDNO:35的正向引物，序列为SEQIDNO:36的反向引物，和包含序列为SEQIDNO:37的寡核苷酸的探针；(b)序列为SEQIDNO:38的正向引物，序列为SEQIDNO:39的反向引物，和包含序列为SEQIDNO:40的寡核苷酸的探针；或(c)序列为SEQIDNO:41的正向引物，序列为SEQIDNO:42的反向引物，和包含序列为SEQIDNO:43的寡核苷酸的探针。

在另一方面，本发明提供用于检测样品中的NOTCH3mRNA的试剂盒，所述试剂盒包含：包含选自由SEQIDNO:35～43组成的组的序列的多核苷酸。在某些实施方式中，所述试剂盒包含：(a)序列为SEQIDNO:35的多核苷酸，序列为SEQIDNO:36的多核苷酸，和序列为SEQIDNO:37的多核苷酸；(b)序列为SEQIDNO:38的多核苷酸，序列为SEQIDNO:39的多核苷酸，和序列为SEQIDNO:40的多核苷酸；或(c)序列为SEQIDNO:41的多核苷酸，序列为SEQIDNO:42的多核苷酸，和序列为SEQIDNO:43的多核苷酸。

在另一方面，本发明提供引物，其序列选自由SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39、SEQIDNO:41和SEQIDNO:42组成的组。

在另一方面，本发明提供包含寡核苷酸的探针，所述寡核苷酸的序列选自由SEQIDNO:37、SEQIDNO:40和SEQIDNO:43组成的组。

附图说明

图1.作为单一试剂或与化疗剂联用的OMP-59R5在PN8胰腺肿瘤细胞(图1A)、PN17胰腺肿瘤细胞(图1B)、PN11胰腺肿瘤细胞(图1C)、UM-PE13乳腺肿瘤细胞(图1D)、UM-T1乳腺肿瘤细胞(图1E)、OMP-Lu40肺肿瘤细胞(图1F)和OMP-Lu53肺肿瘤细胞(图1G)中的活性。

图2.NOTCH3基因表达与OMP-59R5肿瘤抑制作用的相关性。(图2A)与吉西他滨联用的OMP-59R5抗体对胰腺肿瘤的抑制程度与胰腺肿瘤细胞中的NOTCH3基因表达水平显著相关。(图2B)对OMP-59R5抗体与吉西他滨的联合治疗有响应(R)和无响应(NR)的胰腺肿瘤中的NOTCH3基因表达分布。NOTCH3基因表达分布以箱形图示出，其描绘了样品的最小值、下四分位数、中位数、上四分位数和样品最大值。

图3.对OMP-59R5抗体与吉西他滨的联合治疗有响应和无响应的胰腺肿瘤中的NOTCH3基因表达，通过RNAseq确定。NOTCH3基因表达以RPKM(每1百万个匹配的读出序列中每1千碱基的转录本上的读出序列数)测量。

图4.胰腺肿瘤中对OMP-59R5抗体与吉西他滨的联合治疗的预计响应概率，基于NOTCH3基因表达作为预测指标。

图5.胰腺肿瘤中对OMP-59R5抗体与吉西他滨的联合治疗的预计响应概率，基于NOTCH3和MAML2基因表达作为预测指标。

图6.胰腺肿瘤中的NOTCH3表达。(图6A)胰腺肿瘤中的NOTCH3基因和蛋白表达。(图6B)对OMP-59R5抗体与吉西他滨的联合治疗有响应(R)和无响应(NR)的胰腺肿瘤中的NOTCH3蛋白表达分布。NOTCH3蛋白表达分布以箱形图示出，其描绘了样品的最小值、下四分位数、中位数、上四分位数和样品最大值。

图7.胰腺癌转移组织中的NOTCH3基因表达。NOTCH3基因表达通过RT-PCR来测量。NOTCH3基因表达分布以箱形图示出，其描绘了样品的最小值、下四分位数、中位数、上四分位数和样品最大值，用特定肿瘤类型的样品进行观察。垂直的虚线表示在所有转移胰腺肿瘤样品上观察到的NOTCH3表达值的第10、第25、第50、第75和第90百分位数。

图8.肝和淋巴结胰腺癌转移组织以及异种移植肿瘤中的NOTCH3基因表达。NOTCH3基因表达通过RT-PCR来测量。NOTCH3基因表达分布以箱形图示出，其描绘了样品的最小值、下四分位数、中位数、上四分位数和样品最大值，用特定肿瘤类型的样品进行观察。垂直的虚线表示在淋巴结和肝转移胰腺肿瘤样品中观察到的NOTCH3表达值的第10、第25、第50、第75和第90百分位数。

图9.在胰腺肿瘤中，OMP-59R5在与吉西他滨和ABRAXANE^TM(结合蛋白的紫杉醇)联用时具有活性。

具体实施方式

本发明总体涉及使用NOTCH抑制剂治疗胰腺癌的方法。本发明提供了为了用NOTCH抑制剂进行治疗而将胰腺癌患者群体分阶的方法，为了用NOTCH抑制剂进行治疗而选择胰腺癌患者的方法，确定被诊断为患有胰腺癌的患者是否可能对基于NOTCH抑制剂的疗法产生响应的方法，确定是否应当向被诊断为患有胰腺癌的患者施用NOTCH抑制剂的方法，确定被诊断为患有胰腺癌的患者是否应当继续用NOTCH抑制剂进行治疗的方法，和确定NOTCH抑制剂在治疗患者的胰腺癌中的治疗功效的方法。在一些实施方式中，所述方法包括确定来自患者的肿瘤细胞中的NOTCH3基因表达水平。在一些实施方式中，本文提供的方法还包括确定来自患者的肿瘤细胞中的MAML2基因表达水平。在一些实施方式中，本文提供的方法包括施用NOTCH抑制剂。在一些实施方式中，NOTCH抑制剂是与一种或多种人NOTCH受体特异性结合的抗体。在一些实施方式中，抗体与化疗剂联合施用。在一些实施方式中，化疗剂是核苷类似物或有丝分裂抑制剂。

1.定义

为了便于理解本发明，下文定义了多种术语和短语。

"NOTCH"是膜结合的转录因子，其调控许多细胞进程，尤其是在发育方面。在响应于配体结合时，其细胞内结构域(ICD)通过两种蛋白酶释放。所释放的细胞内结构域进入细胞核并与DNA结合的蛋白相互作用，从而激活转录。NOTCH及相关蛋的细胞外结构域白包含最多36个EGF样结构域，其后是三个notch(DSL)结构域。细胞内结构域(ICD)包含6个锚蛋白重复和羧基末端延伸(其包含PEST结构域)。NOTCH1和NOTCH2的ICD额外包含反式激活结构域(TAD)。"NOTCH"涵盖了NOTCH受体家族的所有成员。对NOTCH信号传导途径及受该途径影响的病况的描述可见于例如WO98/20142和WO00/36089。

哺乳动物中的NOTCH家族有四个成员：NOTCH1(TAN1)、NOTCH2、NOTCH3和NOTCH4/Int-4。人NOTCH蛋白的示例性序列包括但不限于：由Genbank登录号NM_017617.3描述的mRNA序列编码的人NOTCH1，其氨基酸序列如Genbank登录号NP_060087所述；由Genbank登录号NM_024408描述的mRNA序列编码的人NOTCH2，其氨基酸序列如Genbank登录号NP_077719所述；由Genbank登录号NM_000435.2描述的mRNA序列编码的人NOTCH3，其氨基酸序列如Genbank登录号NP_000426所述；和由Genbank登录号NM_004557描述的mRNA序列编码的人NOTCH4，其氨基酸序列如Genbank登录号NP_004548所述。

本文所用的“NOTCH抑制剂”、“NOTCH拮抗剂”、“抗NOTCH治疗剂”或“抗NOTCH剂”包括部分或全部阻断、抑制或中和Notch途径的生物活性的任何化合物。示例性的NOTCH抑制化合物包括但不限于：γ分泌酶抑制剂，例如III-31-C、N-[N-(3,5-二氟苯乙酰基)-L-丙氨酰基]S-苯基甘氨酸叔丁酯)(DAPT)、化合物E、D-螺旋肽294、异香豆素、BOC-Lys(Cbz)Ile-Leu-环氧化物和(Z-LL)2-酮(参见Kornilova等，J.Biol.Chem.2003,278:16479-16473)；和以下文献中所述的化合物：WO01/90084、WO02/30912、WO01/70677、WO03/013506、WO02/36555、WO03/093252、WO03/093264、WO03/093251、WO03/093253、WO2004/039800、WO2004/039370、WO2005/030731、WO2005/014553、WO2004/089911、WO02/081435、WO02/081433、WO03/018543、WO2004/031137、WO2004/031139、WO2004/031138、WO2004/101538、WO2004/101539和WO02/47671以及美国专利临时申请第2003/0114496号。具体的γ分泌酶抑制剂化合物还在美国专利6,984,663和7,304,094中有所描述。具体的抗体NOTCH抑制剂在本文以及WO2010/005566和WO2010/005567(将其通过引用全部并入本文)中有所描述。NOTCH抑制剂还包括NOTCH配体拮抗剂。

“NOTCH抑制剂”、“NOTCH拮抗剂”、“抗NOTCH治疗剂”或“抗NOTCH剂”还涵盖与NOTCH受体结合的抗体。使用术语“抗体”指通过至少一个位于免疫球蛋白分子的可变区内的抗原识别位点来识别和特异性结合诸如蛋白、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质或上述的组合等靶标的免疫球蛋白分子。本文所用的术语“抗体”包括：完整的多克隆抗体、完整的单克隆抗体、抗体片段(例如Fab、Fab'、F(ab')₂和Fv片段)、单链Fv(scFv)突变形式、从至少两个完整抗体产生的诸如双特异性抗体等多特异性抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、包含抗体的抗原决定部分的融合蛋白，和任何其它包含抗原识别位点的经修饰的免疫球蛋白分子，只要所述抗体显示出所需的生物活性即可。抗体可以是五个主要类别免疫球蛋白中的任一种：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，或其亚类(同型)(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)，基于其重链恒定结构域的同一性，分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白具有不同的众所周知的亚基结构和三维构象。抗体可以是裸抗体或与诸如毒素、放射性同位素等其它分子偶联。

抗体的“可变区”是指抗体轻链的可变区和/或抗体重链的可变区。重链和轻链的可变区各自由通过三个也称为高变区的互补决定区(CDR)连接的四个框架区(FR)组成。每条链中的CDR通过FR彼此靠近地保持在一起，并且与来自另一条链的CDR一起促成了抗体的抗原结合位点的形成。存在至少两种确定CDR的技术：(1)基于跨物种序列变异性的方法(即，Kabat等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，(第5版，1991，NationalInstitutesofHealth，BethesdaMd.))；和(2)基于抗原-抗体复合物的晶体学研究的方法(Al-lazikani等，1997，J.Molec.Biol.273：927-948)。另外，本领域有时使用这两种方法的组合来确定CDR。

术语“抗体片段”表示完整抗体的一部分，和表示完整抗体的抗原性决定可变区。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')₂和Fv片段、线性抗体、单链抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。

“单克隆抗体”是指涉及高度特异性识别和结合单抗原决定簇(或表位)的同源性抗体群。这与通常包括针对不同抗原决定簇的不同抗体的多克隆抗体相反。术语“单克隆抗体”包括完整的全长单克隆抗体以及抗体片段(例如，Fab、Fab'、F(ab')₂、Fv)、单链Fv(scFv)突变形式、包含抗体部分的融合蛋白和任何其它包含抗原识别位点的经修饰的免疫球蛋白分子。另外，“单克隆抗体”是指以包括但不限于通过杂交瘤、噬菌体筛选、重组表达和转基因动物在内的多种方式制得的此类抗体。

术语“人源化抗体”是指非人类(例如鼠类)抗体的形式，其为含有最小限度的非人类(例如鼠类)序列的特异性免疫球蛋白链、嵌合免疫球蛋白或其片段。通常而言，人源化抗体是其中来自互补决定区(CDR)的残基被来自非人类物种(例如小鼠、大鼠、兔、仓鼠)的具有所需特异性、亲和力和结合力的CDR的残基置换的人类免疫球蛋白(Jones等，1986,Nature,321:522-525；Riechmann等，1988,Nature,332:323-327；Verhoeyen等，1988,Science,239:1534-1536)。在某些情况下，人类免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被来自非人类物种的抗体中的具有所需特异性、亲和力和结合力的相应残基置换。通过对Fv框架区中的和/或在已置换的非人残基中的其他残基进行替换，可以进一步修饰人源化抗体，从而精炼和优化抗体的特异性、亲和力和/或结合力。通常，人源化抗体基本上会包含至少一个且通常两个或三个可变区域中的全部，在该可变区中，CDR区中的全部或基本上全部都对应于非人免疫球蛋白，而FR区中的全部或基本上全部都属于人免疫球蛋白共有序列。人源化抗体还可以包含免疫球蛋白恒定区或恒定区域(Fc)的至少一部分，通常为人免疫球蛋白的相应部分。用于产生人源化抗体的方法的实例描述于美国专利第5,225,539号。

术语“人抗体”是指由人类产生的抗体或通过使用本领域已知的任何技术制备的具有与由人类产生的抗体相对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的该定义包括完整或全长抗体、其片段、和/或包含至少一个人类重链和/或轻链多肽的抗体，例如，包含鼠类轻链和人类重链多肽的抗体。

术语“嵌合抗体”是指其中免疫球蛋白分子的氨基酸序列源自两种以上物种的抗体。通常，轻链和重链的可变区都对应于源自一种哺乳动物物种(例如小鼠、大鼠、兔等)的具有所需特异性、亲和性和/或结合力的抗体可变区，而恒定区与源自另一物种(通常是人类)的抗体中的序列具有同源性，从而避免引发该物种中的免疫应答。

术语“表位”或“抗原决定簇”在本文中可互换使用，指的是特定抗体所能够识别并特异性地结合的抗原的部分。当抗原是多肽时，表位可以由连续氨基酸构成，也可以由借助蛋白的三级结构折叠而并置的不连续氨基酸构成。由连续氨基酸构成的表位通常在蛋白变性时得以保留，然而通过三级结构折叠形成的表位通常在蛋白变性时丢失。表位通常包含独特空间构象中的至少3个且更常见为至少5个或8～10个氨基酸。

多肽或其他试剂(例如抗体或可溶性受体)与蛋白“特异性地结合”的意思是，与替代性物质(包括不相关蛋白)相比，该多肽或其他试剂与该蛋白的反应或联结更频繁、更快速、持续时间更长、亲和力更高或具有上述效果的某种组合。在某些实施方式中，“特异性地结合”意思是，例如，试剂(例如抗体或可溶性受体)与蛋白结合的K_D为约0.1mM以下，但更常见为小于约1μM。在某些实施方式中，“特异性地结合”是指，试剂(例如抗体或可溶性受体)与蛋白结合的K_D有些时候为至少约0.1μM或更小，至少约0.01μM或更小，另外一些时候为至少约1nM或更小。由于不同物种中同源蛋白之间的序列同一性，特异性结合可以包括在超过一个物种中识别特定蛋白(例如Notch受体)的试剂(例如抗体或可溶性受体)。类似地，由于其序列的特定区中的不同旁系同源物(例如不同的人Notch蛋白)之间的同源性，特异性结合可以包括识别超过一种旁系同源物(例如多于一种人NOTCH蛋白)的试剂(例如抗体或可溶性受体)。应该理解，在特定实施方式中，与第一靶标特异性结合的试剂(例如抗体或可溶性受体)可以与第二靶标特异性结合或不特异性结合。这样，“特异性结合”并非必须(但可以包括)排他性结合，即，与单一靶标结合。因此，在某些实施方式中，试剂(例如抗体或可溶性受体)可以与超过一个靶标(例如，多种不同的人NOTCH蛋白，例如NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3和/或NOTCH4)特异性结合。在某些实施方式中，抗体上的相同抗原结合位点可以结合抗体的多种靶标。例如，在某些情况下，抗体可以包含两个相同的抗原结合位点，其中每一个都特异性结合两种以上人类卷曲受体(例如，人NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3和/或NOTCH4)。在某些替代性实施方式中，抗体可以是双特异性的，并且包含至少两种具有不同的特异性的抗原结合位点。借助于非限制性实例，双特异性抗体可以包含一个识别位于一种NOTCH受体(例如人NOTCH2)上的表位的抗原结合位点，和还包含识别位于第二NOTCH受体(例如人NOTCH3)上的不同表位的第二抗原结合位点。通常而言，但不是必然地，“结合”是指“特异性结合”。

术语“癌症”或“癌的”指代或描述哺乳动物的生理病况，其中的细胞群的特征为失调的细胞生长。术语“癌症”应理解为涵盖NOTCH依赖性癌症。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。

“肿瘤”和“赘生物”是指任何由过度的细胞生长或增殖导致的组织团块，其可以是良性的(非癌的)或恶性的(癌的)，包括癌前病变。

本文所用的“转移”是指癌从起始位置扩散或转移到身体的其它区域的过程，并且在新位置发展出类似的癌病变。“转移”或“转移性”细胞是失去与相邻细胞的粘合接触并且经由血液或淋巴液从疾病的原发位置迁移从而入侵邻近的身体结构的细胞。

术语“癌干细胞”、“肿瘤干细胞”或“实体瘤干细胞”在本文中可互换使用，并且指来自具有以下性质的实体瘤的一群细胞：(1)具有广泛的增殖能力；2)能够进行不对称细胞分裂从而产生一种以上的增殖或发育潜能减少的分化子代；和(3)能够进行对称分裂以用于自我更新或自我维持。当连续移植到免疫受损的小鼠时，与不能形成肿瘤的大多数肿瘤细胞相比，“癌干细胞”、“肿瘤干细胞”或“实体瘤干细胞”的这些性质使这些癌干细胞具有形成可触知的肿瘤的能力。癌干细胞以无序方式进行自我更新而不是分化，从而形成具有异常细胞类型的肿瘤，当发生突变时所述异常细胞类型可以随时间而改变。

术语“癌细胞”、“肿瘤细胞”和语法等效概念是指源自肿瘤或癌前病变的全部细胞群体，包括构成肿瘤细胞群体块的非致瘤性细胞和致瘤性干细胞(癌干细胞)。当仅指缺乏更新和分化能力的那些肿瘤细胞时，本文所用的术语“肿瘤细胞”将用术语“非致瘤性”来修饰，以使其与癌干细胞区分开。

术语“致瘤性”是指实体瘤干细胞的功能特征，包括自我更新(产生额外的致瘤性癌干细胞)的性质和增殖以产生所有其它肿瘤细胞(产生分化的、并因此是非致瘤性的肿瘤细胞)的性质，这允许实体瘤干细胞形成肿瘤。与非致瘤性肿瘤细胞(其在连续移植后不能形成肿瘤)相比，这些自我更新并增殖产生所有其他肿瘤细胞的性质使癌干细胞在连续移植到免疫受损的小鼠中后能够形成可触知的肿瘤。已观察到，在从实体瘤获得肿瘤细胞后首次移植到免疫受损小鼠中时非致瘤性肿瘤细胞可以形成肿瘤，但这些非致瘤性肿瘤细胞在连续移植后并不产生肿瘤。

术语“受试者”是指任何动物(例如，哺乳动物)，包括但不限于人、非人灵长类、啮齿类等，其将是特定治疗的接受者。通常，述及人受试者时，术语“受试者”和“患者”在本文中可以互换使用。在本文中用于获得定量或定性数据的“正常”受试对象或来自“正常”受试对象的样品是已被或将被医师评估为不具有胰腺癌的受试对象。

“对照样品”是指来自对照细胞的单独样品。对照细胞可以是无疾病的，或可以是胰腺癌细胞。对照细胞可以来自同一受试对象或另一受试对象。对照细胞可以来自同一组织或另一组织。对照细胞可以来自永生化的细胞系。

本文使用术语“预后”来指对癌症可导致的死亡或进展的可能性的预测，包括肿瘤疾病(例如胰腺癌)的复发、转移性扩展和药物抗性。本文所用的术语“预测”是指作出受试对象的后果具有显著提高或下降的可能性(有利的预后或不利的预后)的决定。其还可以包括NOTCH抑制剂可以是治疗有效的或未发现其具有治疗性的可能性。该术语还用于指以下情况的可能性：患者对药物或药物组产生有利或不利的响应以及这些响应的程度；或患者在手术除去原发性肿瘤和/或化学治疗后会存活一定时间且癌症不会复发。本发明的预测性方法可在临床上用于通过为任何具体患者选择最恰当的治疗模式而作出治疗决定。因此，在预测患者是否可能有利地响应于基于NOTCH的治疗方案(例如抗NOTCH抗体治疗、使用给定药物或药物组合(例如γ分泌酶抑制剂或其他NOTCH抑制剂)的化学治疗)时，或在预测用NOTCH抑制剂进行治疗方案后和/或终止化学治疗或其他治疗模式后患者是否可能长期存活时，本发明的预测性方法是有价值的工具。

术语“治疗有效量”是指试剂(例如抗体、可溶性受体、多肽、多核苷酸、有机小分子或其他药剂)的对“治疗”受试对象或哺乳动物的疾病或病症有效的量。对于癌症的情况，治疗有效量的试剂可以：减少癌细胞数量，减小肿瘤尺寸，抑制或终止癌细胞向周边器官的浸润(包括例如癌扩散至软组织和骨中)，抑制或终止肿瘤转移，抑制或终止肿瘤生长，在一定程度上减轻一种或多种癌症相关症状、降低发病率和死亡率，提高生活质量，降低肿瘤的致瘤性、成瘤频率或成瘤能力，减少癌干细胞在肿瘤中的数量或比例，使致瘤性细胞分化为非致瘤性细胞，或这些效果的组合。只要试剂会阻止生长和/或杀死已存在的癌细胞，就可以称之为抑制细胞生长的和/或细胞毒性的。

本文所用的术语“抑制肿瘤生长”是指能够抑制肿瘤细胞生长的任何机理。在某些实施方式中，通过使肿瘤细胞的增殖变慢来抑制肿瘤细胞生长。在某些实施方式中，通过使肿瘤细胞的增殖停止来抑制肿瘤细胞生长。在某些实施方式中，通过杀死肿瘤细胞来抑制肿瘤细胞生长。在某些实施方式中，通过诱导肿瘤细胞凋亡来抑制肿瘤细胞生长。在某些实施方式中，通过诱导肿瘤细胞分化来抑制肿瘤细胞生长。在某些实施方式中，通过剥夺肿瘤细胞的营养来抑制肿瘤细胞生长。在某些实施方式中，通过防止肿瘤细胞迁移来抑制肿瘤细胞生长。在某些实施方式中，通过防止肿瘤细胞侵袭来抑制肿瘤细胞生长。

本文所用的术语“分阶(stratifying)”是指根据特定的疾病状态或状况的特征将受试对象分成不同的类别或阶层。例如，对患有胰腺癌的受试对象群体进行分阶包括基于肿瘤细胞中的NOTCH3基因表达水平和/或基于疾病的严重性(例如恶化前、恶化、转移等)来划分受试对象。

术语“治疗”或“处理”或“要治疗”或“缓解”或“要缓解”是指1)治愈、减慢、减轻诊断的病理性病况或疾病的症状和/或使诊断的病理性病况或疾病的进展停止的治疗措施；和2)防止和/或减缓靶向的病理性病况或疾病的发展的预防性或防备性措施。因此，需要治疗的受试对象包括已经患有疾病的受试对象；有倾向患疾病的受试对象和要预防疾病的受试对象。在某些实施方式中，如果患者显示出以下情况的一种或多种，则根据本发明的方法成功地“治疗”了受试对象：癌细胞数量减少或完全不存在；肿瘤尺寸减少；癌细胞向外围器官的浸润(包括例如癌扩散到软组织和骨)受到抑制或不存在；肿瘤转移受到抑制或不存在；肿瘤生长受到抑制或不存在；一种或多种与特定癌相关的症状减轻；发病率和致死率降低；生活质量改善；肿瘤的致瘤性、成瘤频率或成瘤能力降低；癌干细胞在肿瘤中的数量或比例减少；致瘤性细胞分化为非致瘤性状态；或这些效果的组合。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可互换使用，指任何长度的氨基酸聚合物。该聚合物可以是直链的或支化的，其可以包含经修饰的氨基酸，并且可以被非氨基酸插入。该术语还涵盖已天然修饰或人工修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、酰化、磷酸化或任何其他操纵或修饰，例如与标记组分偶联。该定义还包括例如包含一个或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域中已知的其他修饰的多肽。应理解的是，由于本发明的多肽基于抗体，因此在某些实施方式中，所述多肽可以作为单链或相互联结的链存在。

本文所用的术语“活检”或“活检组织”是指从受试对象取出的组织或流体的样品，用于确定所述样品是否包含癌组织。在一些实施方式中，获取活检组织或流体是因为受试对象疑似患有癌症。随后检查该活检组织或流体以确定癌症是否存在。

除非上下文另有明确规定，本文和权利要求中所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包含复数形式。

应当理解的是，每当在本文用措辞“包含”来描述实施方式时，还提供以“由……组成”和/或“基本上由……组成”描述的其它类似实施方式。

本文在短语中使用的术语“和/或”(例如“A和/或B”)意在包括：A和B二者；A或B；A；和B。类似地，在短语中使用的术语“和/或”(例如“A、B和/或C”)意在涵盖以下实施方式中的每一种：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。

2.NOTCH3评估方法

如下文详细示出的，人胰腺肿瘤对抗NOTCH2/3抗体OMP-59R5的敏感性与增加的NOTCH3表达显著相关。令人惊奇的是，尽管NOTCH3mRNA和蛋白表达均与人胰腺肿瘤中的OMP-59R5敏感性相关，但是，相比于NOTCH3蛋白表达与治疗敏感性之间的相关性，NOTCH3mRNA表达与治疗敏感性之间的相关性增加。这些数据与来自人乳腺肿瘤和结肠肿瘤的表达数据惊人地相反，后者显示，在NOTCH2或NOTCH3表达与肿瘤对OMP-59R5治疗的敏感性之间没有显著相关性。类似地，在人胰腺肿瘤中，未观察到OMP-59R5敏感性与NOTCH2表达之间存在相关性。

通过选择其肿瘤细胞以升高或增加的NOTCH3表达、NOTCH3过表达或预定水平以上的NOTCH3表达为特征的胰腺癌患者进行OMP-59R5疗法，可以利用增加或升高的NOTCH3表达(例如NOTCH3过表达)与胰腺癌中对OMP-59R5治疗的敏感性(治疗功效)之间的关联来改进治疗胰腺癌的方法。在一些情况下，术语“升高的NOTCH3表达”、“增加的NOTCH3表达”和“NOTCH3过表达”在本文中可以互换使用。还可以通过以下方法来提高治疗功效：不选择其肿瘤细胞以正常或减少的NOTCH3表达或低于预定水平的NOTCH3表达为特征的胰腺癌患者进行OMP-59R5疗法。在某些实施方式中，预定的NOTCH3表达水平可以是对照样品(例如对照细胞)中的表达水平。在某些实施方式中，预定的NOTCH3表达水平可以是胰腺癌中的NOTCH3的中位数表达水平，或者是胰腺癌中的NOTCH3表达水平的第95、90、80、75、70、50、40、30、25或10百分位数。

在某些实施方式中，在患者的胰腺肿瘤中，至少一些肿瘤细胞表现出升高的NOTCH3表达水平。在一个实施方式中，升高的NOTCH3表达水平是等于或高于胰腺癌中的NOTCH3中位数表达水平的水平。在另一实施方式中，升高的NOTCH3表达水平是等于或高于胰腺癌中的NOTCH3基因表达水平的第95、90、80、75、70、50、40、30、25或10百分位数的水平。在某些实施方式中，胰腺癌中的NOTCH3中位数表达水平是胰腺腺癌、转移胰腺癌、肝脏和/或淋巴结转移胰腺癌、抗化疗胰腺癌或晚期、难治性或复发性胰腺癌中的NOTCH3中位数表达水平。在某些实施方式中，胰腺癌中的NOTCH3表达水平的第95、90、80、75、70、50、40、30、25或10百分位数是胰腺腺癌、转移胰腺癌、肝脏和/或淋巴结转移胰腺癌、抗化疗胰腺癌或晚期、难治性或复发性胰腺癌中的NOTCH3表达水平的第95、90、80、75、70、50、40、30、25或10百分位数。

在某些实施方式中，升高的NOTCH3表达水平是等于或高于预定标准水平或参照水平或对照水平的水平。在一些情况下，术语“预定标准”、“参照水平”和“对照水平”在本文中可以互换使用。在一个实施方式中，预定标准表示在对照样品(例如，包含胰腺细胞的样品，且该样品不包含胰腺肿瘤或胰腺癌细胞)中测得的NOTCH3表达水平。在另一实施方式中，预定标准表示在包含胰腺肿瘤细胞(例如，腺癌、转移性肿瘤细胞和肝脏和/或淋巴结转移肿瘤细胞)的样品中测得的NOTCH3表达水平。在又一实施方式中，预定标准表示在包含胰腺肿瘤细胞的样品中测得的NOTCH3表达水平，其中，所述胰腺肿瘤细胞对NOTCH抑制剂(例如OMP-59R5)治疗无响应。在又一实施方式中，预定标准表示在包含胰腺肿瘤细胞的样品中测得的NOTCH3表达水平，其中，所述胰腺肿瘤细胞对NOTCH抑制剂(例如OMP-59R5)治疗有响应。在另一实施方式中，预定标准是分离的细胞系中的NOTCH3表达水平。所述细胞系可源自胰腺癌样品。所述细胞系还可以经重组操作而表达NOTCH3。在某些实施方式中，NOTCH3表达的预定标准或参照水平是胰腺癌中(例如，胰腺腺癌、转移胰腺肿瘤、肝脏和/或淋巴结转移胰腺肿瘤、抗化疗胰腺癌或晚期、难治性或复发性胰腺癌中)的NOTCH3基因表达水平的第95、90、80、75、70、50、40、30、25或10百分位数。

在某些实施方式中，当患者的至少一些胰腺肿瘤细胞以升高的水平表达NOTCH3时，选择该患者以进行NOTCH抑制剂(例如OMP-59R5)治疗或对该患者进行NOTCH抑制剂(例如OMP-59R5)治疗。在某些实施方式中，患者的至少一些胰腺肿瘤细胞以等于或高于参照水平的水平表达NOTCH3。在某些实施方式中，患者的至少一些胰腺肿瘤细胞以等于或高于胰腺癌中的NOTCH3中位数表达水平的水平表达NOTCH3。在某些实施方式中，患者的至少一些胰腺肿瘤细胞以等于或高于胰腺癌中的NOTCH3基因表达的第95、90、80、75、70、50、40、30、25或10百分位数的水平表达NOTCH3。在某些实施方式中，患者的至少一些胰腺肿瘤细胞以等于或高于胰腺癌中的NOTCH3基因表达的第25百分位数的水平表达NOTCH3。在某些实施方式中，患者的至少一些胰腺肿瘤细胞还以等于或高于参照水平或等于或高于胰腺癌中的MAML2中位数表达水平的水平表达MAML2。在一个实施方式中，选择患者以进行OMP-59R5治疗或对患者进行OMP-59R5治疗。在另一实施方式中，选择患者以进行抗体治疗或对患者进行抗体治疗，所述抗体包含OMP-59R5的6个CDR和/或可变区。

在某些实施方式中，当患者的至少一些胰腺肿瘤细胞所包含的NOTCH3mRNA水平等于或高于(1)参照水平、(2)胰腺癌中的NOTCH3mRNA中位数水平、和/或(3)胰腺癌中的NOTCH3mRNA水平的第95、90、80、75、70、50、40、30、25或10百分位数时，选择该患者以进行NOTCH抑制剂(例如OMP-59R5)治疗或对该患者进行NOTCH抑制剂(例如OMP-59R5)治疗。在特定实施方式中，患者的至少一些胰腺肿瘤细胞包含等于或高于胰腺癌中(例如，肝和/或淋巴结转移胰腺癌中)的NOTCH3mRNA水平的第25百分位数的NOTCH3mRNA水平。在某些实施方式中，患者的至少一些胰腺肿瘤细胞还包含等于或高于参照水平或等于或高于胰腺癌中的MAML2mRNA中位数水平的MAML2mRNA。在一个实施方式中，选择患者以进行OMP-59R5治疗或对患者进行OMP-59R5治疗。在另一实施方式中，选择患者以进行抗体治疗或对患者进行抗体治疗，所述抗体包含OMP-59R5的6个CDR和/或可变区。

在某些实施方式中，当患者的至少一些胰腺肿瘤细胞所包含的NOTCH3蛋白水平等于或高于(1)参照水平、(2)胰腺癌中的NOTCH3蛋白中位数水平、和/或(3)胰腺癌中的NOTCH3蛋白水平的第95、90、80、75、70、50、40、30、25或10百分位数时，选择该患者以进行NOTCH抑制剂(例如OMP-59R5)治疗或对该患者进行NOTCH抑制剂(例如OMP-59R5)治疗。在特定实施方式中，患者的至少一些胰腺肿瘤细胞包含等于或高于胰腺癌中(例如，肝脏和/或淋巴结转移胰腺癌中)的NOTCH3蛋白水平的第25百分位数的NOTCH3蛋白水平。在某些实施方式中，患者的至少一些胰腺肿瘤细胞还包含等于或高于参照水平或等于或高于胰腺癌中的MAML2蛋白中位数水平的MAML2蛋白。在一个实施方式中，选择患者以进行OMP-59R5治疗或对患者进行OMP-59R5治疗。在另一实施方式中，选择患者以进行抗体治疗或对患者进行抗体治疗，所述抗体包含OMP-59R5的6个CDR和/或可变区。

检测NOTCH3水平或其他所关注的基因/基因产物(例如MAML2)的表达水平的方法包括能够在核酸或蛋白水平上确定NOTCH3表达水平的任何方法。此类方法在本领域是熟知的，并且包括但不限于蛋白质印迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫沉淀、免疫荧光、流式细胞术、免疫组化(IHC)、核酸杂交技术、核酸逆转录方法、核酸扩增方法(例如PCR或qRT-PCR)、RNA酶保护、微阵列、基因表达系列分析(SAGE)、高通量质谱(MS)、全转录组鸟枪法测序(WTSS)、大规模平行签名测序(MPSS)、原位杂交和RNA印迹。

胰腺癌中的NOTCH3的中位数或百分位数表达水平可以在任何时候相对于测量患者的胰腺肿瘤细胞中的NOTCH3表达来确定。在某些实施方式中，NOTCH3的多个表达水平同时测量。在另一实施方式中，胰腺癌中的NOTCH3的中位数或百分位数表达水平在测量患者的样品中的NOTCH3表达水平之前确定。

在一个实施方式中，在身体样品中测量NOTCH3表达。此处所用的短语“身体样品”是指可以检出其中的NOTCH3表达水平的任何样品，包括细胞、组织或体液。此类身体样品的实例包括但不限于血液、淋巴液、尿、妇科液(gynecologicalfluid)、活检、羊水和涂片。身体样品可以通过多种技术从患者获得。收集各种身体样品的方法是本领域公知的。在某些实施方式中，身体样品是胰腺肿瘤样品。在某些实施方式中，身体样品可以是固定的样品，例如，福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)样品，或冷冻样品。

在特定实施方式中，NOTCH3的表达水平在mRNA水平上检测。确定mRNA表达的各种方法包括但不限于定量实时PCR(qRT-PCR)、微阵列分析、基因表达系列分析(SAGE)等。在某些实施方式中，胰腺肿瘤细胞中的mRNA水平使用定量实时PCR(qRT-PCR)或微阵列分析来确定。许多表达检测方法使用分离的RNA。可以使用任何不针对mRNA的分离进行选择的RNA分离技术来从身体样品中纯化RNA(参见例如Ausubel编,1999,CurrentProtocolsinMolecularBiology(JohnWiley&Sons,NewYork))。另外，可以使用本领域技术人员公知的技术容易地处理大量组织样品，例如Chomczynski的一步RNA分离法(美国专利第4,843,155号)。

术语“探针”是指能够选择性地与特别指定的靶标生物分子(例如，NOTCH3的核苷酸转录本)结合的任何分子。探针可由本领域技术人员使用已知的技术合成，或源自合适的生物学制品。可以将探针特别设计成带有可检测标记。可用作探针的分子的实例包括但不限于RNA、DNA、蛋白质(包括肽)、抗体和有机分子。

来自胰腺肿瘤细胞的NOTCH3mRNA可以在杂交或扩增测定中检测，所述测定包括但不限于mRNA测序法、DNA或RNA印迹分析、聚合酶链式反应分析和探针阵列。用于检测mRNA水平的一个方法包括使分离的mRNA接触能够与被检测基因所编码的mRNA杂交的核酸分子(探针)。所述核酸探针可以为例如全长cDNA或其一部分，例如长度为至少7、15、30、50、100、250或500个核苷酸的寡核苷酸，并且足以在严格条件下与编码NOTCH3的mRNA或基因组DNA特异性地杂交。mRNA与探针的杂交表明所关注的基因正在表达。

在一个实施方式中，将mRNA固定在固相表面上并与探针接触，例如，通过使分离的mRNA在琼脂糖凝胶上电泳，并将该mRNA从凝胶转移到例如硝酸纤维素等膜上。在替代性实施方式中，将探针固定在固相表面上并使mRNA与探针接触，例如与Affymetrix基因芯片阵列(SantaClara,Calif.)中的探针接触。可以容易地对已知的mRNA检测法进行修改以用于检测胰腺肿瘤细胞中的NOTCH3mRNA。

用于检测样品中的NOTCH3mRNA水平的替代性方法包括核酸扩增过程，例如通过RT-PCR(Mullis于1987年在美国专利第4,683,202号中提出的实验实施方式)、连接酶链式反应(Barany,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:189193)、自维持序列复制(Guatelli,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:18741878)、转录扩增系统(Kwoh,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:11731177)、Q-β复制酶(Lizardi,1988,Bio/Technology,6:1197)、滚动环复制(Lizardi,美国专利5,854,033)或任何其他核酸扩增方法来进行的扩增过程；然后使用本领域技术人员公知的技术检测所扩增的分子。如果核酸分子以非常低的量存在，则这些检测方案对于检测这些核酸分子而言特别有用。在本发明的特定方面，通过定量发荧光RT-PCR(即System)来评估NOTCH3mRNA水平。此类方法通常使用寡核苷酸引物对，该引物对位于NOTCH3基因内的内含子两侧。设计对已知序列具有特异性的寡核苷酸引物的方法是本领域已知的。

在一个实施方式中，本发明提供适合于用定量RT-PCR确定样品中的NOTCH3mRNA水平的引物组。在一个实施方式中，引物组包含三种分离的多核苷酸，包括序列SEQIDNO:35、36和37。在一个实施方式中，引物组包含三种分离的多核苷酸，包括序列SEQIDNO:38、39和40。在一个实施方式中，引物组包含三种分离的多核苷酸，包括序列SEQIDNO:41、42和43。在另一方面，本发明提供检测样品中的NOTCH3mRNA的存在方法，所述方法包括使所述样品接触包含SEQIDNO:35～43中的序列的至少一种分离的多核苷酸。本文提供的引物组可用于按照标准qRT-PCR程序对样品中的NOTCH3mRNA水平进行定量。

在本发明的一个实施方式中，使用微阵列来确定生物样品中的NOTCH3mRNA水平。由于其可再现性，微阵列特别适合于该目的。DNA微阵列提供一种同时测量大量基因或针对所关注的分子的不同部位的大量寡核苷酸探针的表达水平的方法。每个阵列都由连接至固相载体的呈可再现模式的捕获探针组成。使经标记的RNA或DNA在阵列上与互补探针杂交，然后通过例如激光扫描来检测。确定阵列上各探针的杂交强度，并将其转化成代表相对基因表达水平的定量值。参见美国专利第6,040,138、5,800,992和6,020,135、6,033,860以及6,344,316，通过援引将它们并入本文。高密度寡核苷酸阵列对于确定样品中的大量RNA的基因表达谱而言特别有用。

使用机械合成方法合成这些阵列的技术描述于例如美国专利第5,384,261号中，通过援引将其全文并入本文中。虽然优选平面阵列表面，但可以在几乎任何形状的表面或甚至多重表面上制造阵列。阵列可以是位于珠、凝胶、聚合物表面、纤维(例如光纤)、玻璃或任何其他合适的基底上的肽或核酸，参见美国专利第5,770,358、5,789,162、5,708,153、6,040,193和5,800,992号，在此通过援引将其每一篇都全部并入本文。可以以考虑诊断学或全包式(all-inclusive)装置的其他操作的方式来组装阵列。参见例如美国专利第5,856,174和5,922,591号，通过援引将其并入本文。

检测肿瘤细胞中NOTCH3蛋白水平的方法可以包括检测生物样品中NOTCH3蛋白的存在的任何方法。此类方法是本领域公知的，并且包括但不限于蛋白质印迹、狭缝印迹、ELISA、免疫沉淀、免疫荧光、流式细胞术、免疫细胞化学、免疫组化(IHC)和质谱。此类免疫测定方法可以手动进行或以自动化方式进行。结合NOTCH3的任何区域的抗体可用于本文所述的检测方法中。在一个实施方式中，使用IHC确定肿瘤样品中的NOTCH3蛋白水平。

用于检测抗体结合的技术是本领域公知的。与NOTCH3蛋白结合的抗体可以使用化学试剂来检测，所述化学试剂产生可检测信号，该信号对应于抗体结合水平，并因而对应于NOTCH3蛋白的水平。在一个实施方式中，使用与带标记的聚合物偶联的二抗来检测抗体结合。带标记的聚合物的实例包括但不限于聚合物-酶偶联物。这些复合物中的酶通常用于催化抗原-抗体结合部位处的色素原沉积，由此产生与所关注的突变的表达水平对应的细胞染色。特别关注的酶包括辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP)。可以使用市售的抗体检测系统来实施本发明的方法，例如DakoEnvision+系统(DakoNorthAmerica,Inc.,Carpinteria,Calif.)和Mach3系统(BiocareMedical,WalnutCreek,Calif.)。

抗体结合检测可以通过将抗体与可检测物质偶联来促进。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性材料。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的实例包括抗生蛋白链菌素/生物素以及抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹酰氯或藻红蛋白；发光材料的实例包括鲁米诺；生物发光材料的实例包括萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白；合适的放射性材料的实例包括¹²⁵I、¹³¹I、³⁵S或³H。

在一个实施方式中，NOTCH3蛋白的水平使用特异性结合NOTCH3的试剂来确定。任何展示出对NOTCH3的特异性结合的分子实体都可以用来确定样品中的NOTCH3蛋白的水平。特异性结合剂包括但不限于抗体、抗体模拟物和多核苷酸(例如适体)。本领域技术人员理解，通过用于检测NOTCH3蛋白的特定测定来确定所需的特异性程度。例如，在涉及基于多肽尺寸来分离多肽的方法(例如蛋白质印迹)中，可以使用既与全长NOTCH3又与NOTCH3ICD特异性结合的试剂。

在一个实施方式中，NOTCH3蛋白的水平使用对NOTCH3有特异性的抗体来确定。在另一实施方式中，该抗体是单克隆抗体。NOTCH3特异性抗体可以根据本领域技术人员已知的任何方法产生。参见例如Tagami等,2008Mol.Cell.Biol.28(1):165-176。NOTCH3特异性抗体还可以获自商购来源。参见例如R&DSystems,抗人NOTCH3多克隆抗体,目录号BAF1559。抗NOTCH3抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体、人源化抗体、人抗体、嵌合抗体或其抗原结合片段。在又一实施方式中，该抗体与固定且包埋的组织样品中的NOTCH3特异性结合。该组织样品可以是福尔马林固定的组织样品。该组织样品可以是石蜡包埋的组织样品。

3.NOTCH抑制剂

本发明的方法的另一方面是NOTCH抑制剂(例如抗NOTCH抗体)在治疗NOTCH3表达水平已得到确定的胰腺癌患者中的应用。在某些实施方式中，NOTCH抑制剂是抗NOTCH抗体。在某些实施方式中，抗NOTCH抗体特异性地结合一种或多种人NOTCH受体的EGF10结构域(或EGF10结构域的等效物)。在某些实施方式中，抗NOTCH抗体特异性地结合人NOTCH2的EGF10和/或人NOTCH3的EGF9。EGF9是人NOTCH3内的EGF，其等同于其他人NOTCH受体NOTCH1、NOTCH2和NOTCH4中的EGF10。在一些实施方式中，抗NOTCH抗体特异性地结合NOTCH2的EGF10。在一些实施方式中，抗NOTCH抗体特异性地结合NOTCH2的EGF10和NOTCH3的EGF9。在一些实施方式中，抗NOTCH抗体特异性地结合NOTCH3的EGF9。在其他实施方式中，抗NOTCH抗体结合NOTCH2EGF10内的序列HKGAL(SEQIDNO:1)的至少一部分。在一些实施方式中，抗NOTCH抗体结合NOTCH3EGF9内的序列HEDAI(SEQIDNO:2)的至少一部分。结合NOTCH2和NOTCH3的示例性抗体描述于美国专利8,226,943中，通过援引将其整体并入本文中。

在某些实施方式中，可用于本发明的方法中的抗NOTCH抗体抑制配体与人NOTCH2和/或NOTCH3的结合。在一些实施方式中，抗NOTCH抗体抑制配体与人NOTCH2的结合。在一些实施方式中，抗NOTCH抗体抑制配体与NOTCH2和NOTCH3的结合。在其他实施方式中，抗NOTCH抗体抑制配体与NOTCH3的结合。在某些实施方式中，配体是DLL4、JAG1或JAG2。在其他实施方式中，抗NOTCH抗体抑制人NOTCH2和/或NOTCH3的信号传导。在一些实施方式中，抗NOTCH抗体抑制人NOTCH2的信号传导。在一些实施方式中，抗NOTCH抗体抑制NOTCH2和NOTCH3的信号传导。在其他实施方式中，抗NOTCH抗体抑制NOTCH3的信号传导。在一些实施方式中，NOTCH2和/或NOTCH3的信号传导由DLL4、JAG1或JAG2诱导。

在某些实施方式中，可用于本发明的方法中的抗NOTCH抗体特异性地结合人NOTCH2和/或NOTCH3，其中，所述抗体包含：(a)包含SSSGMS(SEQIDNO:3)的重链CDR1，包含VIASSGSNTYYADSVKG(SEQIDNO:4)的重链CDR2，和/或包含SIFYTT(SEQIDNO:9)的重链CDR3；和/或(b)包含RASQSVRSNYLA(SEQIDNO:6)的轻链CDR1，包含GASSRAT(SEQIDNO:7)的轻链CDR2，和/或包含QQYSNFPI(SEQIDNO:8)的轻链CDR3。在一些实施方式中，抗体包含：(a)包含SSSGMS(SEQIDNO:3)的重链CDR1或其包含1、2、3或4个保守性氨基酸替换的变体，包含VIASSGSNTYYADSVKG(SEQIDNO:4)的重链CDR2或其包含1、2、3或4个保守性氨基酸替换的变体，和/或包含SIFYTT(SEQIDNO:9)的重链CDR3或其包含1、2、3或4个保守性氨基酸替换的变体；和/或(b)包含RASQSVRSNYLA(SEQIDNO:6)的轻链CDR1或其包含1、2、3或4个保守性氨基酸替换的变体，包含GASSRAT(SEQIDNO:7)的轻链CDR2或其包含1、2、3或4个保守性氨基酸替换的变体，和/或包含QQYSNFPI(SEQIDNO:8)的轻链CDR3或其包含1、2、3或4个保守性氨基酸替换的变体。

在某些实施方式中，可用于本发明的方法中的抗NOTCH抗体特异性地结合人NOTCH2和/或NOTCH3，其中，所述抗体包含：(a)包含SSSGMS(SEQIDNO:3)的重链CDR1，包含VIASSGSNTYYADSVKG(SEQIDNO:4)的重链CDR2，和/或包含GIFFAI(SEQIDNO:5)的重链CDR3；和/或(b)包含RASQSVRSNYLA(SEQIDNO:6)的轻链CDR1，包含GASSRAT(SEQIDNO:7)的轻链CDR2，和/或包含QQYSNFPI(SEQIDNO:8)的轻链CDR3。在某些实施方式中，抗体特异性地结合NOTCH2。在一些实施方式中，抗体包含：(a)包含SSSGMS(SEQIDNO:3)的重链CDR1或其包含1、2、3或4个保守性氨基酸替换的变体，包含VIASSGSNTYYADSVKG(SEQIDNO:4)的重链CDR2或其包含1、2、3或4个保守性氨基酸替换的变体，和/或包含GIFFAI(SEQIDNO:5)的重链CDR3或其包含1、2、3或4个保守性氨基酸替换的变体；和/或(b)包含RASQSVRSNYLA(SEQIDNO:6)的轻链CDR1或其包含1、2、3或4个保守性氨基酸替换的变体，包含GASSRAT(SEQIDNO:7)的轻链CDR2或其包含1、2、3或4个保守性氨基酸替换的变体，和/或包含QQYSNFPI(SEQIDNO:8)的轻链CDR3或其包含1、2、3或4个保守性氨基酸替换的变体。

在某些实施方式中，可用于本发明的方法中的抗NOTCH抗体特异性地结合人NOTCH2和/或NOTCH3，其中，所述抗体包含：(a)包含SSSGMS(SEQIDNO:3)的重链CDR1，包含VIASSGSNTYYADSVKG(SEQIDNO:4)的重链CDR2，和/或包含(G/S)(I/S)F(F/Y)(A/P)(I/T/S/N)(SEQIDNO:10)的重链CDR3；和/或(b)包含RASQSVRSNYLA(SEQIDNO:6)的轻链CDR1，包含GASSRAT(SEQIDNO:7)的轻链CDR2，和/或包含QQYSNFPI(SEQIDNO:8)的轻链CDR3。在一些实施方式中，抗体包含含有SIFYPT(SEQIDNO:11)的重链CDR3。在一些实施方式中，抗体包含含有SSSFFAS(SEQIDNO:12)的重链CDR3。在其他实施方式中，抗体包含含有SSFYAS(SEQIDNO:13)的重链CDR3。在某些实施方式中，抗体包含含有SSFFAT(SEQIDNO:14)的重链CDR3。在一些实施方式中，抗体包含含有SIFYPS(SEQIDNO:15)的重链CDR3。在其他实施方式中，抗体包含含有SSFFAN(SEQIDNO:16)的重链CDR3。

在某些实施方式中，可用于本发明的方法中的抗NOTCH抗体包含：(a)与SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25或SEQIDNO:26具有至少约80％序列同一性的重链可变区(具有或不具有信号序列)；和/或(b)与SEQIDNO:29、SEQIDNO:27或SEQIDNO:28具有至少约80％序列同一性的轻链可变区(具有或不具有信号序列)。在某些实施方式中，抗NOTCH抗体特异性地结合人NOTCH2和/或NOTCH3。在一些实施方式中，抗NOTCH抗体特异性地结合人NOTCH2。在一些实施方式中，抗NOTCH抗体结合NOTCH2和NOTCH3。在其他实施方式中，抗NOTCH抗体结合NOTCH3。在某些实施方式中，抗NOTCH抗体包含与SEQIDNO:18或SEQIDNO:17具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或约100％序列同一性的重链可变区。在某些实施方式中，抗NOTCH抗体包含与SEQIDNO:29具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或约100％序列同一性的轻链可变区。

在某些实施方式中，可用于本发明的方法中的抗NOTCH抗体包含：(a)与SEQIDNO:30、SEQIDNO:31或SEQIDNO:32具有至少约80％序列同一性的重链(具有或不具有信号序列)；和/或(b)与SEQIDNO:33或SEQIDNO:34具有至少约80％序列同一性的轻链(具有或不具有信号序列)。在某些实施方式中，抗NOTCH抗体包含：与SEQIDNO:19具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或约100％序列同一性的重链，和与SEQIDNO:28具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或约100％序列同一性的轻链。在某些实施方式中，抗NOTCH抗体包含：与SEQIDNO:30具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或约100％序列同一性的重链，和与SEQIDNO:28具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或约100％序列同一性的轻链。

在某些实施方式中，可用于本发明的方法中的抗NOTCH抗体包含：(a)与SEQIDNO:17具有至少约80％序列同一性的重链可变区；和(b)与SEQIDNO:29具有至少约80％序列同一性的轻链可变区。在某些实施方式中，抗NOTCH抗体包含：与SEQIDNO:17具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或约100％序列同一性的重链可变区，和与SEQIDNO:29具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或约100％序列同一性的轻链可变区。

在某些实施方式中，可用于本发明的方法中的抗NOTCH抗体包含59R1IgG2抗体、由59R1IgG2抗体构成或基本由59R1IgG2抗体构成，所述59R1IgG2抗体包含分别由SEQIDNO:31和33表示的重链和轻链(具有或不具有信号序列)，或者由依照布达佩斯条约的条款于2008年10月15日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)(美国弗吉尼亚州马纳萨斯市大学路10801)并被指定保藏号PTA-9547的DNA编码。

在某些实施方式中，可用于本发明的方法中的抗NOTCH抗体包含59R5IgG2抗体、由59R5IgG2抗体构成或基本由59R5IgG2抗体构成，所述59R5IgG2抗体包含分别由SEQIDNO:30和33表示的重链和轻链(具有或不具有信号序列)，或者由于2009年7月6日保藏在ATCC并被指定保藏号PTA-10170的DNA编码。在某些实施方式中，可用于本发明的方法中的抗NOTCH抗体包含59R5IgG2抗体的重链和轻链(具有或不具有信号序列)。在某些实施方式中，可用于本发明的方法中的抗NOTCH抗体是59R5IgG2抗体。59R5IgG2抗体在本文中还称为OMP-59R5。关于OMP-59R5抗体的其他信息可见于例如美国专利8,226,943中，通过援引将其整体并入本文中。在美国专利8,226,943中，OMP-59R5抗体通常称为“59R5”或“59R5IgG2抗体”。

在某些实施方式中，可用于本发明的方法中的抗NOTCH抗体与包含含有SEQIDNO:18的重链可变区和含有SEQIDNO:29的轻链可变区的抗体竞争与人NOTCH2和/或NOTCH3的特异性结合。在某些实施方式中，抗体与59R1IgG2抗体在特异性结合中竞争，所述59R1IgG2抗体包含分别由SEQIDNO:31和33表示的重链和轻链(具有或不具有信号序列)，或者由于2008年10月15日保藏在ATCC并被指定保藏号PTA-9547的DNA编码。在一些实施方式中，抗体竞争与人NOTCH2的结合。在一些实施方式中，抗体竞争与人NOTCH2和NOTCH3的结合。在其他实施方式中，抗体竞争与人NOTCH3的结合。

在某些实施方式中，可用于本发明的方法中的抗NOTCH抗体与包含含有SEQIDNO:17的重链可变区和含有SEQIDNO:29的轻链可变区的抗体竞争与人NOTCH2和/或NOTCH3的特异性结合。在一些实施方式中，抗体与59R5IgG2抗体在特异性结合中竞争，所述59R5IgG2抗体包含分别由SEQIDNO:30和33表示的重链和轻链，或者由于2009年7月6日保藏在ATCC并被指定保藏号PTA-10170的DNA编码。在一些实施方式中，抗体竞争与人NOTCH2的结合。在一些实施方式中，抗体竞争与人NOTCH2和NOTCH3的结合。在其他实施方式中，抗体竞争与人NOTCH3的结合。

在某些实施方式中，可用于本发明的方法中的抗NOTCH抗体是IgG1抗体或IgG2抗体。在某些实施方式中，抗体是单克隆抗体。在某些实施方式中，抗体是人抗体或人源化抗体。在某些实施方式中，抗体是抗体片段。

在某些实施方式中，可用于本发明的方法中的抗NOTCH抗体所结合的表位与59R1或59R5抗体的表位相同或有重叠。

可用于本发明的方法中的抗NOTCH抗体的其他实例在美国专利8,226,943中公开，通过援引将其整体并入本文中。

在某些实施方式中，可用于本发明的方法中的抗NOTCH抗体是特异性地识别人NOTCH受体的双特异性抗体。双特异性抗体是能够特异性地识别并结合至少两种不同的表位的抗体。在一个实施方式中，双特异性抗NOTCH抗体特异性地识别同一人NOTCH受体内的不同表位。在另一个实施方式中，双特异性抗NOTCH抗体特异性地识别人NOTCH受体内的不同表位或不同的人NOTCH受体上的不同表位。

或者，在某些替代性实施方式中，可用于本发明的方法中的抗NOTCH抗体不是双特异性抗体。

在某些实施方式中，可用于本发明的方法中的抗NOTCH抗体是单特异性抗体。例如，在某些实施方式中，抗体所包含的一个或多个抗原结合位点结合或能够结合相同的一种或多种人NOTCH受体。在某些实施方式中，单特异性抗NOTCH抗体的抗原结合位点结合或能够结合一种、两种、三种或四种人NOTCH受体。

本发明的方法的另一方面是NOTCH抑制剂(例如抗NOTCH抗体)在治疗胰腺癌中的应用。在某些实施方式中，NOTCH抑制剂是γ分泌酶的抑制剂。由于γ-分泌酶抑制剂也能够防止NOTCH受体激活，因此已测试了数种形式的γ-分泌酶抑制剂的抗肿瘤效应。首先，最初的γ-分泌酶抑制剂IL-X(cbz-IL-CHO)在Ras转化的成纤维细胞中显示出具有NOTCH1依赖性抗成瘤活性。据报道，在来自小鼠的黑素瘤和卡波西肉瘤的细胞系和/或异种移植物中，三肽γ-分泌酶抑制剂(z-Leu-leu-Nle-CHO)抑制肿瘤生长(CurryCL等，Oncogene24:6333-44(2005))。用二肽γ-分泌酶抑制剂N-[N-(3,5-二氟苯乙酰基)-L-丙氨酰基]S-苯基甘氨酸叔丁基酯(DAPT)进行的治疗也在T-ALL动物模型中导致髓母细胞瘤生长的显著减少并诱导G0-G1细胞周期阻滞和凋亡(O'NeilJ.等,Blood107:781–5(2006))。另一种γ-分泌酶抑制剂二苯并氮已经显示出在Apc-/-(min)小鼠的肠道腺瘤中抑制上皮细胞增殖并诱导杯形细胞分化(vanEsJH,等,Nature435:959–63(2005))。近来，由三肽γ-分泌酶抑制剂或NOTCH3特异性小干扰RNA造成的NOTCH3功能性失活在过表达NOTCH3的肿瘤细胞系中导致细胞增殖受抑制并诱导凋亡，但在具有最小量的NOTCH3表达的细胞系中却非如此(ParkJT等，CancerRes.,66:6312-8(2006))。此外，针对复发性或难治性T-ALL患者和晚期乳腺癌的NOTCH抑制剂MK0752(由Merck,WhitehouseStation,NJ开发)的I期临床试验已经启动。

4.治疗方法

如上文所述，NOTCH抑制剂(例如OMP-59R5)可用于治疗其肿瘤细胞已确定具有增加的NOTCH3表达(例如NOTCH3mRNA表达)水平的患者的胰腺癌，所述增加的水平为例如：等于或高于胰腺癌中的NOTCH3的中位数表达水平的水平，等于或高于胰腺癌中的NOTCH3表达的第95、90、80、75、70、50、40、30、25或10百分位数的水平，或等于或高于对照样品的NOTCH3表达水平的水平。在某些实施方式中，还已确定肿瘤细胞具有增加的MAML2表达(例如，MAML2mRNA表达)水平，例如，等于或高于胰腺癌中的MAML2的中位数表达水平的水平，或等于或高于对照样品的MAML2表达水平的水平。在某些实施方式中，NOTCH抑制剂(例如OMP-59R5)可用于抑制肿瘤生长、诱导分化和/或减小肿瘤体积。此外，本发明提供一种降低受试对象中的胰腺肿瘤的致瘤性的方法，所述方法包括向已确定其肿瘤细胞表达本文所述的增加水平的NOTCH3的患者施用治疗有效量的NOTCH抑制剂(例如OMP-59R5)。在某些实施方式中，肿瘤包含癌干细胞。在某些实施方式中，通过施用NOTCH抑制剂(例如OMP-59R5)来降低癌干细胞在肿瘤中的比例。

在一个实施方式中，NOTCH抑制剂(例如OMP-59R5)可用于治疗胰腺癌，且该胰腺癌的肿瘤细胞的特征在于其NOTCH3表达水平等于或高于对照样品或细胞中的NOTCH3表达水平。在一个实施方式中，NOTCH抑制剂(例如OMP-59R5)可用于治疗胰腺癌，且该胰腺癌的肿瘤细胞的特征在于其NOTCH3基因表达水平等于或高于胰腺癌的NOTCH3中位数表达水平。在某些实施方式中，所治疗的胰腺癌的肿瘤细胞的特征在于其NOTCH3表达水平等于或高于胰腺癌中的NOTCH3表达的第95、90、80、75、70、50、40、30、25或10百分位数。在某些实施方式中，胰腺癌中的NOTCH3中位数表达水平是胰腺腺癌、转移胰腺癌、或者肝脏和/或淋巴结转移胰腺癌中的NOTCH3中位数表达水平。在某些实施方式中，胰腺癌中的NOTCH3表达的第95、90、80、75、70、50、40、30、25或10百分位数是胰腺腺癌、转移胰腺癌、或者肝脏和/或淋巴结转移胰腺癌中的NOTCH3表达的第95、90、80、75、70、50、40、30、25或10百分位数。在某些实施方式中，NOTCH3表达水平使用qRT-PCR来确定。在某些实施方式中，NOTCH3表达水平使用本文所述的探针来确定，例如，包含选自由SEQIDNO:35～43组成的组的核苷酸序列的多核苷酸。

在一个实施方式中，NOTCH抑制剂(例如OMP-59R5)可用于治疗胰腺癌，且该胰腺癌的至少一些肿瘤细胞表现出等于或高于对照细胞中的MAML2表达水平的MAML2表达水平。在一个实施方式中，NOTCH抑制剂(例如OMP-59R5)可用于治疗胰腺癌，且该胰腺癌的至少一些肿瘤细胞表现出等于或高于胰腺癌中的MAML2中位数表达水平的MAML2表达水平。在某些实施方式中，所治疗的胰腺癌的至少一些肿瘤细胞表现出等于或高于胰腺癌中的MAML2表达的第95、90、80、75、70、50、40、30、25或10百分位数的MAML2表达水平。在某些实施方式中，胰腺癌中的MAML2中位数表达水平是胰腺腺癌、转移胰腺癌、或者肝脏和/或淋巴结转移胰腺癌中的MAML2中位数表达水平。在某些实施方式中，胰腺癌中的MAML2表达的第95、90、80、75、70、50、40、30、25或10百分位数是胰腺腺癌、转移胰腺癌、或者肝脏和/或淋巴结转移胰腺癌中的MAML2表达的第95、90、80、75、70、50、40、30、25或10百分位数。在某些实施方式中，MAML2表达水平使用qRT-PCR来确定。

在某些实施方式中，用NOTCH抑制剂(例如OMP-59R5)治疗的胰腺癌是外分泌胰腺肿瘤。在某些实施方式中，所治疗的胰腺癌是腺泡细胞癌、腺癌、腺鳞状癌、巨细胞瘤、导管内乳头粘液腺瘤(IPMN)、粘液囊腺癌、胰腺母细胞瘤、浆液囊腺癌或实体假乳头瘤。在某些实施方式中，所治疗的胰腺癌是腺癌。在某些实施方式中，所治疗的胰腺癌是神经内分泌肿瘤。在某些实施方式中，胰腺神经内分泌肿瘤是胃泌素瘤、胰高血糖素瘤、胰岛素瘤、无功能胰岛细胞瘤、舒血管肠肽瘤(VIPoma)或生长抑素瘤。在某些实施方式中，所治疗的胰腺癌不是神经内分泌肿瘤。

在某些实施方式中，用NOTCH抑制剂(例如OMP-59R5)治疗的胰腺癌是可切除的肿瘤、局部晚期的癌或转移性胰腺癌。在某些实施方式中，根据AJCCTNM系统所确定，胰腺癌为第1、2、3或4级癌。

在一个实施方式中，NOTCH抑制剂(例如OMP-59R5)特别可用于治疗已经经历一些形式的治疗的胰腺癌患者。在另一实施方式中，NOTCH抑制剂(例如OMP-59R5)用于治疗之前用癌症疗法治疗失败的胰腺癌患者。失败的癌症疗法可包括但不限于化疗、辅助疗法、新辅助疗法和它们的组合。在一个实施方式中，NOTCH抑制剂(例如OMP-59R5)用于治疗具有化疗抗性的肿瘤。在另一实施方式中，NOTCH抑制剂(例如OMP-59R5)用于治疗具有化疗抗性的胰腺癌。

在一个实施方式中，治疗方法包括首先测试含有来自患者的胰腺癌细胞的生物样品，从而确定这些细胞是否表达等于或高于预定标准(例如等于或高于胰腺癌中NOTCH3的中位数表达水平)的NOTCH3基因。然后，对于其样品中展现出升高的NOTCH3表达水平的患者，使用干扰NOTCH受体活性的NOTCH抑制剂(例如OMP-59R5)来进行治疗。施用剂量将取决于所治疗的具体病况、施用途径和本领域公知的临床考量因素。剂量可以逐渐增加直到检测到有益效果，例如肿瘤生长减缓。NOTCH抑制剂(例如OMP-59R5)然后可以以单剂量方案或多剂量方案提供，并且可以单独给药，或与其他治疗剂联合给药。

对具有增加的NOTCH3表达的胰腺癌的治疗与任何施用途径和剂型都相容。根据所治疗的具体病况，某些剂型倾向于比其他剂型更方便或更有效。例如，NOTCH抑制剂可以胃肠外、局部、口服、经口、内部、鼻内、直肠、阴道、舌部和透皮施用。具体的剂型包括片剂、丸剂、胶囊、粉末、气溶胶、栓剂、皮肤贴片、胃肠外和口服液体(包括悬浮液、溶液和乳液)。也可以使用持释剂型。所有剂型都可以使用本领域的标准方法来制备(参见例如Remington'sPharmaceuticalSciences,第16版,Easton,Pa.(1980))。

在某些实施方式中，NOTCH抑制剂(例如OMP-59R5)的施用可以是通过静脉内注射来施用或静脉内施用。在一些实施方式中，施用为静脉内输注。在某些实施方式中，NOTCH抑制剂(例如OMP-59R5)的施用可以通过非静脉内途径。

NOTCH抑制剂(例如OMP-59R5)治疗剂的合适剂量取决于疾病的严重性和进程、疾病的响应性、施用抗体或NOTCH抑制剂是为了治疗目的还是预防目的、之前的治疗、患者临床史等等，所有这些都由治疗医师来裁度。抗体或其他NOTCH抑制剂的施用可以是一次，或者可以在一系列治疗上进行，所述一系列治疗持续数天至数月，或直至实现治愈或疾病状态的减少(例如，肿瘤尺寸的减小)为止。从对药物在患者体内的药物积累的测量中可以计算出最佳定量给药计划，并且该计划会根据单个抗体或其他NOTCH抑制剂的相对效力而有所不同。施用医师能够容易地确定最佳剂量、定量给药方法和重复率。通常，抗NOTCH抗体(例如OMP-59R5)剂量为0.01μg～100mg/千克体重，并且可每天、每周、每月或每年给药一次或多次。治疗医师能够根据抗体或试剂在体液或组织中的测得的停留时间和浓度来估算定量给药的重复率。

如本领域技术人员已知的，所用的剂量将视所要实现的临床目标而变化。在一些实施方式中，抗NOTCH抗体(例如OMP-59R5)的每剂量为约0.25mg/kg～约15mg/kg。在一些实施方式中，每个剂量为约0.25mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、11mg/kg、12mg/kg、13mg/kg、14mg/kg、15mg/kg、16mg/kg、17mg/kg、18mg/kg、19mg/kg或20mg/kg。在某些实施方式中，每个剂量为约0.5mg/kg。在某些实施方式中，每个剂量为约1mg/kg。在某些实施方式中，每个剂量为约2.5mg/kg。在某些实施方式中，每个剂量为约5mg/kg。在某些实施方式中，每个剂量为约7.5mg/kg。在某些实施方式中，每个剂量为约10mg/kg。在某些实施方式中，每个剂量为约12.5mg/kg。在某些实施方式中，每个剂量为约15mg/kg。

在某些实施方式中，使用间歇式定量给药方案向患者施用本文描述的方法中所用的NOTCH抑制剂(例如OMP-59R5)，该方案在某些情况下可以减少与施用所述NOTCH抑制剂(例如OMP-59R5)相关的副作用和/或毒性。本文所用的“间歇式定量给药”是指使用超过每周1次的定量给药间隔的定量给药方案，例如每2周定量给药一次、每3周1次、每4周1次等等。在一些实施方式中，治疗人患者的胰腺癌的方法包括按照间歇式定量给药方案向患者施用有效剂量的NOTCH抑制剂(例如OMP-59R5)。在一些实施方式中，治疗人患者的胰腺癌的方法包括按照间歇式定量给药方案向患者施用有效剂量的NOTCH抑制剂(例如OMP-59R5)，并且增加所述NOTCH抑制剂(例如OMP-59R5)的治疗指数。在一些实施方式中，间歇式定量给药方案包括向患者施用起始剂量的NOTCH抑制剂(例如OMP-59R5)，并且约每2周1次施用后续剂量的NOTCH抑制剂(例如OMP-59R5)。在一些实施方式中，间歇式定量给药方案包括向患者施用起始剂量的NOTCH抑制剂(例如OMP-59R5)，并且约每3周1次施用后续剂量的NOTCH抑制剂(例如OMP-59R5)。在一些实施方式中，间歇式定量给药方案包括向患者施用起始剂量的NOTCH抑制剂(例如OMP-59R5)，并且约每4周1次施用后续剂量的NOTCH抑制剂(例如OMP-59R5)。

在一些替代性实施方式中，用于所述方法中的抗NOTCH抗体是OMP-59R5，或包含OMP-59R5的6个CDR和/或可变区的抗体，并且约每2～3周向受试对象静脉内施用约2.5mg/kg～约7.5mg/kg(例如约2.5mg/kg、约5mg/kg或约7.5mg/kg)的剂量的所述抗体。

在某些实施方式中，除了施用NOTCH抑制剂(例如OMP-59R5)之外，所述方法或治疗还包括施用至少一种额外的治疗剂或疗法。额外的治疗剂或疗法可以在施用抗NOTCH治疗剂之前、同时和/或之后施用。在一些实施方式中，至少一种额外的治疗剂或疗法包括1种、2种、3种或更多种额外的治疗剂或疗法。

使用至少两种治疗剂的联合疗法常常使用通过不同的作用机制起作用的试剂，但这不是必须的。施用具有不同作用机制的试剂的联合疗法可以产生加成或协同效应。联合疗法可以允许使用与单一疗法相比更低剂量的每种试剂，由此减少毒副作用。联合疗法可以降低发展出抗性癌细胞的可能性。

应该意识到的是，NOTCH抑制剂(例如OMP-59R5)与额外的治疗剂或疗法的组合可以以任意顺序施用或同时施用。在一些实施方式中，将向之前已经历第二治疗剂或疗法治疗的患者施用NOTCH抑制剂(例如OMP-59R5)。在某些实施方式中，NOTCH抑制剂(例如OMP-59R5)和第二治疗剂或疗法会基本上同时或同步施用。例如，可以向正在经历第二治疗剂(例如化疗)治疗进程的受试对象施用NOTCH抑制剂(例如OMP-59R5)。在某些实施方式中，在用第二治疗剂治疗1年内施用NOTCH抑制剂(例如OMP-59R5)。在某些替代实施方式中，在用第二治疗剂进行任何治疗10、8、6、4或2个月内施用NOTCH抑制剂(例如OMP-59R5)。在某些其他实施方式中，在用第二治疗剂进行任何治疗4周、3周、2周或1周内施用NOTCH抑制剂(例如OMP-59R5)。在一些实施方式中，在用第二治疗剂进行任何治疗5天、4天、3天、2天或1天内施用NOTCH抑制剂(例如OMP-59R5)。还应该意识到的是，两种(或更多种)试剂或治疗可以在大约数小时或数分钟内(即基本上同时)施用于受试对象。

如本领域技术人员已知的，所用的剂量将视所要实现的临床目标而变化。在一些实施方式中，抗NOTCH抗体(例如OMP-59R5)的每个剂量为约0.25mg/kg～约15mg/kg。在一些实施方式中，每个剂量为约0.25mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、11mg/kg、12mg/kg、13mg/kg、14mg/kg、15mg/kg、16mg/kg、17mg/kg、18mg/kg、19mg/kg或20mg/kg。在某些实施方式中，每个剂量为约0.5mg/kg。在某些实施方式中，每个剂量为约1mg/kg。在某些实施方式中，每个剂量为约2.5mg/kg。在某些实施方式中，每个剂量为约5mg/kg。在某些实施方式中，每个剂量为约7.5mg/kg。在某些实施方式中，每个剂量为约10mg/kg。在某些实施方式中，每个剂量为约12.5mg/kg。在某些实施方式中，每个剂量为约15mg/kg。

在某些实施方式中，本文所述的治疗胰腺癌的方法包括联合施用NOTCH抑制剂(例如OMP-59R5)与一种或多种化疗剂。因此，在一些实施方式中，所述方法或治疗包括联合施用NOTCH抑制剂(例如OMP-59R5)和化疗剂或多种不同的化疗剂的混合物。在某些实施方式中，本文所述的方法包括向胰腺癌患者联合施用治疗有效量的OMP-59R5抗体和吉西他滨与ABRAXANE^TM(蛋白结合的紫杉醇)。用NOTCH抑制剂(例如OMP-59R5)进行的治疗可以出现在施用化疗剂之前、同时或之后。联合施用可以包括：以单一药物制剂方式或使用独立的多个制剂的共施用，或以任何顺序但通常在使所有活性试剂能够同时发挥其生物学活性的时期内进行的连续施用。可以使用制造商的操作说明所述的或技术熟练的从业者凭经验确定的此类化疗剂的制备和定量给药计划。此类化疗剂的制备和定量给药计划还在ChemotherapyServiceM.C.Perry编,Williams&Wilkins,Baltimore,Md.(1992)中有所描述。

可用于本发明的化疗剂包括但不限于：烷基化剂，例如噻替派和环磷酰胺；烷基磺酸盐，例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶，例如苯佐替派、卡波醌、美妥替哌和乌瑞替哌；乙烯亚胺类和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺、三乙烯蜜胺、三乙烯磷酰胺、三乙烯硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺(trimethylolomelamine)；氮芥类，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯代磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥、异环磷酰胺、氮芥、盐酸氧化氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼氮芥、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲类，例如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；抗生素，例如阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素、重氮丝氨酸、博莱霉素、放线菌素C、加利车霉素、卡拉比星(carabicin)、洋红霉素、嗜癌霉素、色霉素、放线菌素D、柔红霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链脲菌素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢药，例如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，例如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物例如安西他滨、阿扎胞苷、6-阿扎尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、5-FU；雄激素类，例如卡鲁睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺药(anti-adrenals)，例如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，例如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基酮戊酸；安吖啶；贝达布昔(bestrabucil)；比生群；依达曲沙；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌；依氟鸟氨酸(elfornithine)；依利醋铵；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；硝氨丙吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基肼；丙卡巴肼；PSK；丙亚胺；西佐非兰；锗螺胺；替奴佐酸；三亚胺醌；2,2′,2″-三氯三乙胺；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；加赛妥辛(gacytosine)；阿糖胞苷(Ara-C)；紫杉烷类，例如紫杉醇和多西他赛；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；铂类似物，例如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺维本；诺消灵；替尼泊苷；道诺霉素；氨喋呤；希罗达；伊班膦酸盐；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸；视黄酸；埃斯波霉素；卡培他滨；以及上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。化疗剂还包括用于调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，例如抗雌激素剂，包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、芳香酶抑制性4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、易维特(keoxifene)、LY117018、奥那司酮和托瑞米芬(Fareston)；以及抗雄激素剂，例如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。

在一些实施方式中，所述化疗剂是拓扑异构酶抑制剂。拓扑异构酶抑制剂是干扰拓扑异构酶(例如拓扑异构酶I或II)的作用的化疗剂。拓扑异构酶抑制剂包括但不限于盐酸多柔比星、柠檬酸柔红霉素、盐酸米托蒽醌、放射菌素D、依托泊苷、盐酸托泊替康、替尼泊苷和伊立替康，以及这些中任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。

在一些实施方式中，所述化疗剂是抗代谢药。抗代谢药是结构与正常生化反应所需的代谢物类似的化学物质，但是其区别足以干扰细胞的一种或多种正常功能，例如细胞分裂。抗代谢药包括但不限于：吉西他滨、氟尿嘧啶、卡培他滨、甲氨蝶呤钠、雷替曲塞(ralitrexed)、培美曲塞、喃氟啶、胞嘧啶阿拉伯糖苷、硫鸟嘌呤、5-氮胞苷、6-巯基嘌呤、硫唑嘌呤、6-硫鸟嘌呤、喷司他丁、磷酸氟达拉滨和克拉屈滨，以及这些中任何一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在某些实施方式中，本文所述的方法包括向胰腺癌患者联合施用治疗有效量的OMP-59R5抗体和抗代谢药。在某些实施方式中，抗代谢药是核苷类似物。在某些实施方式中，本文所述的方法包括向胰腺癌患者联合施用治疗有效量的OMP-59R5抗体和吉西他滨。

在一些实施方式中，所述化疗剂是抗有丝分裂剂，包括但不限于结合微管蛋白的试剂。在一些实施方式中，所述试剂是紫杉烷。在一些实施方式中，所述试剂是紫杉醇或多西他赛，或紫杉醇或多西他赛的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在一些替代实施方式中，抗有丝分裂剂包括长春花生物碱，例如长春新碱、长春碱、长春瑞滨或长春地辛，或其药学上可接受的盐、酸或衍生物。在某些实施方式中，本文所述的方法包括向胰腺癌患者联合施用治疗有效量的OMP-59R5抗体和抗有丝分裂剂。在某些实施方式中，抗有丝分裂剂是紫杉烷。在某些实施方式中，本文所述的方法包括向胰腺癌患者联合施用治疗有效量的OMP-59R5抗体和ABRAXANE^TM(蛋白结合的紫杉醇)。

在某些实施方式中，治疗包括联合施用NOTCH抑制剂(例如OMP-59R5)和放射疗法。用NOTCH抑制剂(例如OMP-59R5)进行的治疗可以在施用放射疗法之前、同时或之后发生。此类放射疗法的剂量方案可由熟练的医学从业者来确定。在一些实施方式中，在放射治疗之后施用NOTCH抑制剂(例如OMP-59R5)。在一些实施方式中，与放射疗法一起施用NOTCH抑制剂(例如OMP-59R5)。

在一些实施方式中，第二治疗剂包括抗体。因此，治疗可以包括联合施用抗NOTCH抗体(例如OMP-59R5)或其他NOTCH抑制剂与针对另外的肿瘤相关抗原的其他抗体(包括包括但不限于结合EGFR、ErbB2、DLL4或NF-κB的抗体)。示例性的抗DLL4抗体描述于例如美国专利第7,750,124号中。另外的抗DLL4抗体描述于例如国际专利公开WO2008/091222和WO2008/0793326以及美国专利申请公开第2008/0014196、2008/0175847、2008/0181899和2008/0107648中。联合施用可以包括：以单一药物制剂方式或使用独立的多个制剂的共施用，或以任何顺序但通常在使所有活性试剂能够同时发挥其生物学活性的时期内进行的连续使用。

此外，用NOTCH抑制剂(例如OMP-59R5)进行的治疗可以包括与一种或多种细胞因子(例如，淋巴因子、白细胞介素、肿瘤坏死因子和/或生长因子)的联合治疗，或可以伴随有手术摘除肿瘤、癌细胞或治疗医师认为必需的其他任何疗法。

5.抗体及其制备

可以用本领域已知的任何合适的方法产生可用于本发明的方法中的其他抗体。多克隆抗体可以用任何已知方法制备。通过多次皮下注射或腹膜内注射相关抗原(纯化的肽片段、全长重组蛋白、融合蛋白等)来使动物(例如兔、大鼠、小鼠、驴等)免疫，从而产生多克隆抗体，其中，所述抗原可选地偶联至钥孔血蓝蛋白(KLM)、血清白蛋白等，稀释在无菌盐水中，并与佐剂(例如完全或不完全弗氏佐剂)组合以形成稳定的乳液。随后从由此免疫化的动物的血液、腹水等中回收多克隆抗体。使所收集的血液凝结，随后倾析出血清，离心至澄清，并测定抗体滴度。多克隆抗体可以按照本领域中的标准方法(包括亲和色谱、离子交换色谱、凝胶电泳和透析等)从血清或腹水中纯化。

单克隆抗体可以使用杂交瘤方法制备，例如Kohler和Milstein(1975)Nature256:495中描述的杂交瘤方法。使用杂交瘤法按上文所述使小鼠、仓鼠或其他适合的宿主动物免疫，以引发淋巴细胞产生特异性结合免疫抗原的抗体。淋巴细胞也可以在体外免疫化。免疫化之后，分离淋巴细胞，并使用例如聚乙二醇使其与适合的骨髓瘤细胞系融合，从而形成能够随后从未融合的淋巴细胞和骨髓瘤细胞中筛选出的杂交瘤细胞。产生特异性地针对选定抗原的单克隆抗体(这通过免疫沉淀、免疫印迹或体外结合测定(例如放射免疫测定(RIA)；酶联免疫吸附测定(ELISA))来确定)的杂交瘤可以随后用标准方法在体外培养物中扩大培养(Goding,MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,AcademicPress,1986)或作为动物中的腹水肿瘤在体内扩大培养。随后，如上文针对多克隆抗体所述的，可以从培养基或腹水液体中纯化出单克隆抗体。

作为另一选择，单克隆抗体也可以使用如美国专利第4,816,567号中描述的重组DNA方法制造。通过例如使用特异性扩增编码抗体重链和轻链的寡核苷酸引物的RT-PCR，将编码单克隆抗体的多核苷酸从成熟B细胞或杂交瘤细胞中分离出，并使用常规程序确定其序列。随后将编码重链和轻链的分离的多核苷酸克隆至适合的表达载体中，当将该表达载体转染到宿主细胞(例如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中华仓鼠卵巢(CHO)细胞或不另外产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞)中时，所述宿主细胞产生单克隆抗体。另外，所需物种的重组单克隆抗体或其片段可以按已描述的方法从表达所需物种的CDR的噬菌体展示文库中分离出(McCafferty等,Nature,348:552-554(1990)；Clackson等,Nature,352:624-628(1991)；Marks等,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991))。

可以使用重组DNA技术以多种不同的方式进一步修饰编码单克隆抗体的多核苷酸，以产生替代性抗体。在一些实施方式中，例如小鼠单克隆抗体的轻链和重链的恒定区可以：1)被替换成例如人抗体的对应区域以产生嵌合抗体，或2)被替换成非免疫球蛋白多肽以产生融合抗体。在一些实施方式中，恒定区被截短或除去，以产生单克隆抗体的所需抗体片段。可以使用定点诱变或高密度诱变来优化单克隆抗体的特异性和亲和力等。

在一些实施方式中，可用于本发明的方法中的单克隆抗体是人源化抗体。在某些实施方式中，在施用给人受试对象时，治疗上使用此类抗体来减少抗原性和HAMA(人抗小鼠抗体)响应。可以使用本领域中已知的各种技术来制造人源化抗体。在某些实施方式中，可用于本发明的方法中的抗体是人抗体。

可以使用本领域中已知的各种技术来直接制造人抗体。可以制造体外免疫化的或从产生针对靶抗原的抗体的免疫化个体分离出的永生化人B淋巴细胞(参见例如Cole等，MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR.Liss,第77页(1985)；Boemer等，1991,J.Immunol.,147(1):86-95；和美国专利第5,750,373号)。另外，人抗体可以从噬菌体文库中选择，其中该噬菌体文库表达人抗体，如例如以下文献中所述：Vaughan等,1996,Nat.Biotech.,14:309-314；Sheets等,1998,Proc.Nat'l.Acad.Sci.,95:6157-6162；Hoogenboom和Winter,1991,J.Mol.Biol.,227:381；Marks等,1991,J.Mol.Biol.,222:581。用于产生和使用抗体噬菌体文库的技术还描述于美国专利5,969,108、6,172,197、5,885,793、6,521,404、6,544,731、6,555,313、6,582,915、6,593,081、6,300,064、6,653,068、6,706,484和7,264,963以及Rothe等，2007,J.Mol.Bio.,doi:10.1016/j.jmb.2007.12.018(将其每个都通过援引整体并入本文)。亲和力成熟策略和链改组策略(Marks等，1992,Bio/Technology10:779-783；将其通过援引完整并入本文)在本领域是已知的，可以用于产生高亲和力的人抗体。

还可以在含有人免疫球蛋白基因座的转基因小鼠中制造人源化抗体，所述小鼠在免疫化时能够在不产生内源免疫球蛋白的情况下产生全部人抗体。在美国专利第5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425和5,661,016号中描述了该方法。

在某些实施方式中，可用于本发明的方法中的抗体是特异性地识别人NOTCH受体的双特异性抗体。双特异性抗体是能够特异性地识别并结合至少两种不同的表位的抗体。所述不同的表位可位于同一分子(例如，同一人NOTCH受体)内或位于不同的分子上。双特异性抗体可以是完整抗体或抗体片段。

或者，在某些替代性实施方式中，可用于本发明中的抗体不是双特异性抗体。

在某些实施方式中，可用于本发明中的抗体是单特异性的。例如，在某些实施方式中，抗体所包含的一个或多个抗原结合位点结合或能够结合相同的人NOTCH受体。在某些实施方式中，单特异性抗体的抗原结合位点结合或能够结合一种、两种、三种或四种人NOTCH受体。

在某些实施方式中，可用于本发明的方法中的抗体是抗体片段。抗体片段能够表现出相对于完整抗体而言增加的肿瘤穿透性。用来产生抗体片段的各种技术是已知的。传统上，通过对完整抗体进行蛋白水解消化来得到这些片段(例如Morimoto等，1993,JournalofBiochemicalandBiophysicalMethods24:107-117；Brennan等，1985,Science,229:81)。在某些实施方式中，通过重组手段来制造抗体片段。Fab、Fv和scFv抗体片段都可以在大肠杆菌或其他宿主细胞中表达并分泌，从而使得可以大量地制造这些片段。还可以从上文讨论的抗体噬菌体文库中分离出此类抗体片段。抗体片段还可以是例如美国专利第5,641,870号中所描述的线形抗体，并且可以是单特异性或双特异性的。可用于本发明的方法中的单链抗体可以按照例如美国专利4,946,778中的描述来制备。此外，可以调整方法来构建Fab表达文库(Huse等，Science246:1275-1281(1989))，以使得可以快速且有效地鉴定出具有所需的针对NOTCH受体的特异性的单克隆Fab片段。抗体片段可以通过本领域中的技术来产生，包括但不限于：(a)通过抗体分子的胃蛋白酶降解生成的F(ab')2片段；(b)通过还原F(ab')2片段的二硫桥产生的Fab片段；(c)通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子产生的Fab片段；和(d)Fv片段。对技术人员而言，制造抗体片段的其他技术将是显而易见的。

还可能理想的是，特别是对于抗体片段的情况，修饰抗体以提高其血清半衰期。这可以通过例如下述方式来实现：通过使抗体片段中的适当区域突变，或通过将表位整合至肽标签中并随后将该标签融合至抗体片段的任一末端或中部(例如通过DNA合成或肽合成)，从而将救助受体(salvagereceptor)结合表位整合到抗体片段中。

在某些实施方式中，可用于本发明的方法中的抗体是异源偶联抗体(heteroconjugateantibody)。异源偶联抗体由两种共价接合的抗体构成。例如，已提出此类抗体能够将免疫细胞靶向不需要的细胞(美国专利4,676,980)。认为这些抗体可以使用合成蛋白化学中已知的方法体外制备，包括涉及交联剂的方法。例如，可以使用二硫键交换反应或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。用于此目的的适合的试剂的实例包括亚氨基硫醇化物(iminothiolate)和甲基-4-巯基环丁酰亚胺。

在本领域中已知恒定Fc区介导数种效应子功能。例如，补体的C1组分与抗体的结合激活补体系统。补体的激活在细胞病原体的调理作用和裂解中是重要的。补体的激活也刺激了炎症反应并且也可参与自身免疫过敏症。此外，抗体或可溶性受体可通过Fc区结合细胞，其中，抗体Fc区上的Fc受体位点结合至细胞上的Fc受体(FcR)。存在许多对于不同类别的抗体有特异性的Fc受体，包括IgG(γ受体)、IgE(ε受体)、IgA(α受体)和IgM(μ受体)。抗体与细胞表面上的Fc受体的结合触发了许多重要且多样的生物反应，包括抗体包被的颗粒的吞噬和破坏、免疫复合物的清除、杀伤细胞对抗体包被的靶细胞的裂解(称作抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用或ADCC)、炎症介质的释放、胎盘转移和免疫球蛋白生成的控制。

在某些实施方式中，可用于本发明的方法中的NOTCH拮抗剂多肽(抗体和包含Fc的可溶性受体)提供了改变的效应子功能，这进而影响了所施用的多肽的生物学特征。例如，恒定区结构域的(通过点突变或其他方法造成的)缺失或失活可以减少循环中的经修饰抗体与Fc受体的结合，从而提高肿瘤定位。在其他情况下可以是，恒定区修饰调节补体结合，因此降低血清半衰期并减少所偶联的细胞毒素的非特异性联结。可以使用对恒定区的其他修饰来消除二硫键或多糖部分，这使得能因抗原特异性或抗体柔性的提高而增强定位。类似地，使用完全在技术人员知识范围内的公知生物化学或分子工程技术，可以容易地做出对恒定区的修饰。

在某些实施方式中，可用于本发明的方法中的包含Fc区的NOTCH拮抗剂多肽(抗体和含Fc的可溶性受体)不具有一个或多个效应子功能。例如，在一些实施方式中，所述多肽不具有抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性和/或不具有补体依赖的细胞毒性(CDC)活性。在某些实施方案中，所述多肽不结合Fc受体和/或补体因子。在某些实施方式中，抗体不具有效应子功能。

本发明还涉及包含与细胞毒剂偶联的NOTCH拮抗剂多肽(例如抗NOTCH抗体)的免疫偶联物的应用。细胞毒剂包括化疗剂、生长抑制剂、毒素(例如，源于细菌、真菌、植物或动物的具有酶活性的毒素或其片段)、放射性同位素(即放射偶联物)等。可用于产生此类免疫偶联物的化疗剂包括例如氨甲喋呤、阿霉素、多柔比星、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、正定霉素或其他嵌入试剂。可以使用的具有酶活性的毒素及其片段包括白喉A链、白候毒素的非结合性活性片段、外毒素A链、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲菌素、油桐蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻风树毒素、巴豆毒素、肥皂草抑制剂、白树毒素、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素和单端孢霉烯族毒素。多种放射性核素可用于产生放射偶联抗体，包括²¹²Bi、¹³¹I、¹³¹In、⁹⁰Y和¹⁸⁶Re。抗体和细胞毒剂的偶联物是使用多种双功能蛋白偶合剂制成的，例如N-琥珀酰亚胺-3-(2-硫代吡啶)丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(例如盐酸己二亚氨酸二甲酯)、活性酯(例如辛二酸二琥珀酰亚氨酯)、醛(例如戊二醛)、双叠氮化合物(例如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(例如双(对重氮基苯甲酰基)乙二胺)、二异氰酸酯(例如2,4-二异氰酸甲苯酯)和双活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。还可以使用抗体和一种或多种小分子毒素(例如卡奇霉素、美登醇、单端孢霉烯和CC1065)及这些毒素的具有毒素活性的衍生物的偶联物。

偶联抗体由两种共价接合的抗体构成。例如，已提出此类抗体能够将免疫细胞靶向不需要的细胞(美国专利4,676,980)。认为这些抗体可以使用合成蛋白化学中已知的方法体外制备，包括涉及交联剂的方法。例如，可以使用二硫键交换反应或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。用于此目的的适合的试剂的实例包括亚氨基硫醇化物和甲基-4-巯基环丁酰亚胺。

不论获得了如何有用的量，可以以多种偶联形式(即，免疫偶联物)或未偶联形式中的任何一种形式来使用可用于本发明的方法中的NOTCH拮抗剂多肽(抗体和可溶性受体)。作为另一选择，多肽可以以未偶联形式或“裸”形式使用。在某些实施方式中，以未偶联形式来使用本发明的多肽，从而控制受试对象的天然防御机制(包括补体依赖的细胞毒作用(CDC)和抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC))来清除恶性细胞。在一些实施方式中，使用多种公知的螯合剂中的任一种，或通过直接加标签，可以使多肽与放射性同位素偶联，例如⁹⁰Y、¹²⁵I、¹³¹I、¹²³I、¹¹¹In、¹⁰⁵Rh、¹⁵³Sm、⁶⁷Cu、⁶⁷Ga、¹⁶⁶Ho、¹⁷⁷Lu、¹⁸⁶Re和¹⁸⁸Re。在其他实施方式中，组合物可以包含与药物、前药或生物应答调节剂(例如氨甲喋呤、阿霉素和淋巴因子(例如干扰素))偶联的NOTCH拮抗剂多肽。另外的实施方式包括与特定生物毒素(例如蓖麻蛋白或白喉毒素)偶联的NOTCH拮抗剂多肽的应用。在另外一些实施方式中，NOTCH拮抗剂多肽可以与其他具有免疫学活性的配体(例如抗体或其片段)复合，其中，所得的分子结合赘生性细胞和效应细胞(例如T细胞)。选用何种偶联或未偶联的NOTCH拮抗剂多肽将取决于神经内分泌肿瘤的类型和阶段、对辅助治疗的使用(例如，化疗或外部辐射)和患者的状况。应认识到的是，鉴于本文的教导，本领域的技术人员可以容易地作出这种选择。

可以进一步修饰多肽和类似物以包含通常不属于蛋白的一部分的额外化学部分。这些衍生出的部分可以改进蛋白的溶解性、生物学半衰期或吸收。这些部分还可以减少或消除蛋白的任何所需的副作用等。关于这些部分的概述可见于Remington'sPharmaceuticalSciences(第20版)，MackPublishingCompany,Easton,PA,2000。

最适合于衍生化的化学部分包括水溶性聚合物。水溶性聚合物是合乎需要的，因为与其连接的蛋白在水性环境(例如生理环境)中不沉淀。在一些实施方式中，所述聚合物对于制备治疗用产品或组合物而言是药学上可接受的。基于以下考虑，本领域技术人员能够选择所需的聚合物：例如，考虑聚合物/蛋白偶联物是否将用于治疗，如果是，则考虑所需的剂量、循环时间、对蛋白分解的抗性，并考虑其他方面。所述衍生化的有效性可以通过以下方法来查明：以所需形式施用衍生物(即，通过渗透泵，或通过注射或输注，或进一步配制成用于口服、肺部或其他递送途径)，并确定其有效性。适合的水溶性聚合物包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、右旋糖酐、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚(1,3-二氧戊环)、聚(1,3,6-三噁烷)、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)、右旋糖酐、聚(n-乙烯基吡咯烷酮)-聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛因其在水中的稳定性而在制造时可以具有优势。

可以通过本领域已知的任何合适的方法产生可用于本发明的方法中的分离的多肽(例如抗体和可溶性受体)。这些方法从直接蛋白合成方法，到构建编码分离的多肽序列的DNA序列并在合适的转化宿主中表达这些序列。在一些实施方式中，使用重组技术通过分离或合成编码野生型目的蛋白的DNA序列来构建DNA序列。可选的是，可以通过位点特异性诱变来对该序列进行诱变从而提供其功能类似物。参见例如Zoeller等,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA81:5662-5066(1984)和美国专利4,588,585。

在一些实施方式中，编码目的多肽的DNA序列将通过使用寡核苷酸合成仪的化学合成来构建。可以基于所需多肽的氨基酸序列和选择在会产生重组目的多肽的宿主细胞中偏好的那些密码子来设计这些寡核苷酸。可以应用标准方法来合成编码分离的目的多肽的分离的多核苷酸序列。例如，可以使用完整氨基酸序列来构建回译基因。另外，可以合成含有编码特定分离的多肽的核苷酸序列的DNA寡聚物。例如，可以合成几种编码所需多肽的一部分的小寡核苷酸并然后连接。各寡核苷酸通常含有5’或3’延伸序列以用于互补组装。

一旦进行了组装(通过合成、定点诱变或其他方法)，则将编码特定的分离的目的多肽的多核苷酸序列插入表达载体并可操作地连接至适合在所需宿主中表达所述蛋白的表达控制序列。可以通过核苷酸测序、限制性酶切定位和在合适宿主中表达生物活性多肽来确认正确的组装。如本领域中众所周知的，为了在宿主中获得转染基因的高表达水平，必须将该基因可操作地连接至在所选表达宿主中具有功能的转录和翻译表达控制序列。

在某些实施方式中，使用重组表达载体来扩增和表达NOTCH拮抗剂多肽(例如抗体或可溶性受体)。重组表达载体是可复制的DNA构建体，其具有编码目的多肽链的合成的或cDNA来源的DNA片段，所述DNA片段与源自哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因的合适的转录或翻译调控元件可操作地连接。转录单元通常包括以下组件的组装体：(1)在基因表达中具有调控作用的遗传元件，例如，转录启动子或增强子，(2)转录为mRNA并且翻译成蛋白的结构序列或编码序列，和(3)合适的转录和翻译起始序列和终止序列，这些在下文有详细描述。此类调控元件可以包括用于控制转录的操纵基因序列。在宿主中进行复制的能力通常由复制起点赋予，并且可以另外引入便于识别转化体的选择基因。当DNA区域在功能上相互相关时，这些DNA区域是“可操作地连接”的。例如，如果信号肽(分泌前导序列)的DNA表达为参与多肽分泌的前体，则该DNA与该多肽的DNA可操作地连接；如果启动子控制编码序列的转录，则启动子与该编码序列可操作地连接；或如果核糖体结合位点位于允许翻译的位置，则该核糖体结合位点与编码序列可操作地连接。意在在酵母表达体系中使用的结构元件包括能够使宿主细胞将翻译的蛋白分泌到胞外的前导序列。作为另一选择，当表达不具有前导序列或转运序列的重组蛋白时，其可以包括N端甲硫氨酸残基。可以随后可选地从表达的重组蛋白中切下该残基以提供最终产物。

表达控制序列和表达载体的选择将取决于对宿主的选择。可以采用多种表达宿主/载体组合。对于真核宿主有用的表达载体包括例如包含来自SV40、牛乳头状瘤病毒、腺病毒和巨细胞病毒的表达控制序列的载体。对于细菌宿主有用的表达载体包括已知的细菌质粒，例如包括pCR1、pBR322、pMB9及其衍生物等在内的来自大肠杆菌的质粒，以及诸如M13和丝状单链DNA噬菌体等更广宿主范围的质粒。

用于表达NOTCH拮抗剂多肽(例如抗体或可溶性受体)的合适的宿主细胞包括处于适当启动子控制下的原核生物、酵母、昆虫或高级真核细胞。原核生物包括革兰氏阴性生物体或革兰氏阳性生物体，例如大肠杆菌或芽孢杆菌。高级真核细胞包括如下所述的哺乳动物来源的已建立的细胞系。还可以使用无细胞翻译体系。用于细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主的适合的克隆和表达载体见Pouwels等的描述(CloningVectors:ALaboratoryManual,Elsevier,N.Y.,1985)，通过援引将其中的相关公开内容并入本文中。关于蛋白制造(包括抗体制造)方法的其他信息可见于美国专利公开2008/0187954、美国专利6,413,746和6,660,501以及国际专利公开WO04009823，将其每个都通过援引完整并入本文。

还有利地使用各种哺乳动物或昆虫细胞培养系统来表达重组多肽。可以在哺乳动物细胞中表达重组蛋白，因为所述蛋白通常正确地折叠、合适地修饰并具有完全功能。合适的哺乳动物宿主细胞系的实例包括Gluzman描述的猴肾细胞系COS-7(Cell23:175,1981)以及能够表达合适的载体的其他细胞系，包括例如L细胞、C127、3T3、中华仓鼠卵巢(CHO)、HeLa和BHK细胞系。哺乳动物表达载体可以包含非转录元件(例如与待表达的基因连接的复制起点、合适的启动子和增强子，以及其它5’或3’侧翼非转录序列)以及5’或3’非翻译序列(例如必需的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点以及转录终止序列)。用于在昆虫细胞中产生异源蛋白的杆状病毒系统见综述Luckow和Summers,Bio/Technology,6:47(1988)。

可以根据任何合适的方法对由经转化宿主产生的蛋白进行纯化。这些标准方法包括色谱(例如离子交换色谱、亲和色谱和尺寸排阻柱色谱)、离心、差别溶解度法或通过用于蛋白纯化的任何其它标准技术。诸如六聚组氨酸、麦芽糖结合域、流感病毒衣壳序列和谷胱甘肽-S-转移酶等亲和标签可以与蛋白连接，从而允许通过合适的亲和柱容易地进行纯化。还可使用诸如蛋白水解、核磁共振和X射线晶体学等技术对分离的蛋白进行物理表征。

例如，可以首先使用商购的蛋白浓缩过滤器(例如Amicon或MilliporePellicon超滤装置)浓缩来自将重组蛋白分泌到培养基中的表达系统的上清液。浓缩步骤后，可将浓缩物施加到合适的纯化基质。作为另一选择，可以使用阴离子交换树脂，例如具有悬挂的二乙氨基乙基(DEAE)基团的基质或基底。所述基质可以是丙烯酰胺、琼脂糖、葡聚糖、纤维素或蛋白纯化中常用的其它种类。作为另一选择，可以使用阳离子交换步骤。合适的阳离子交换器包括各种含有磺丙基或羧甲基的不溶性基质。最后，可以使用一个或多个反相高效液相色谱(RP-HPLC)步骤来进一步纯化NOTCH拮抗剂多肽(例如抗体或可溶性受体)，所述RP-HPLC步骤采用疏水性RP-HPLC介质，例如具有悬挂甲基或其它脂肪族基团的硅胶。还可以以各种组合使用上述纯化步骤中的一些或全部，从而提供均一的重组蛋白。

细菌培养物中产生的重组蛋白可通过例如以下方式分离：从细胞团块中进行初步提取，然后是一次或多次浓缩、盐析、水性离子交换或尺寸排阻色谱步骤。对于最后的纯化步骤可以使用高效液相色谱(HPLC)。可以通过任何常规方法破碎用于表达重组蛋白的微生物细胞，包括冻融循环、超声处理、机械破碎或使用细胞裂解剂。

本领域已知的用于纯化NOTCH拮抗剂多肽(例如抗体或可溶性受体)的方法还包括例如美国专利公布2008/0312425、2008/0177048和2009/0187005中描述的那些，将其各自通过引用整体并入本文中。

6.药物组合物

可以用本领域中已知的任何适合的方法将NOTCH拮抗剂多肽(例如抗NOTCH抗体)配制成药物组合物。在某些实施方式中，所述药物组合物包含药学上可接受的载质。所述药物组合物用于抑制神经内分泌肿瘤的生长和治疗人患者的神经内分泌肿瘤。

在某些实施方式中，通过将纯化的NOTCH拮抗剂(例如抗NOTCH抗体)与药学上可接受的载质(例如，载剂、赋形剂)合并，制备了用于储存和使用的制剂(Remington,TheScienceandPracticeofPharmacy(第20版),MackPublishing,2000)。适合的药学上可接受的载质包括但不限于：无毒缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；盐，例如氯化钠；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；氯化苄烷铵；氯化苄乙氧铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量多肽(例如，小于约10个氨基酸残基)；蛋白，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；碳水化合物，例如单糖、二糖、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖类，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反离子，例如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白络合物)；和非离子表面活性剂，例如TWEEN或聚乙二醇(PEG)。

在某些实施方式中，所述药物组合物是冷冻的。在某些替代性实施方式中，所述药物组合物是冻干的。

可以以用于局部治疗或全身治疗的多种方式来施用本发明的药物组合物。施用可以是：局部施用(例如，至粘膜，包括阴道和直肠递送)，例如经皮贴、软膏、洗剂、乳膏、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉末；肺部施用(例如，通过吸入或吹入粉末或气雾剂，包括使用喷雾器；气管内、鼻内、表皮和经皮)；口服施用；或胃肠外施用，包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌肉内注射或输注；或颅内施用(例如，鞘内或脑室内)。

治疗性制剂可以是单位剂型。此类制剂包括：片剂、丸剂、胶囊、粉末、颗粒、水或非水性介质中的溶液或悬浮液或者栓剂，以用于口服施用、胃肠外施用、直肠施用或吸入式施用。在诸如片剂等固体组合物中，主要活性成分与药物载剂混合。常规的成片剂成分包括玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或树胶和其他稀释剂(例如水)，从而形成包含本发明的化合物或无毒的其药物可接受的盐的均质混合物的固体预制组合物。随后将该固体预制组合物细分为上述类型的单位剂型。新型组合物的片剂、丸剂等可以经涂覆或以其他方式复合而提供具有延长作用的优点的剂型。例如，该片剂或丸剂可以包含经外部组分包被的内部组合物。此外，这两种组分可被由肠溶层分离，该肠溶层用来抵抗崩解并允许内部组分完整地通过胃或延迟释放。可将多种材料用于此类肠溶层或涂层，所述材料包括多种聚合物酸和聚合物酸与诸如虫胶、鲸蜡醇和乙酸纤维素酯等材料的混合物。

还可以将NOTCH拮抗剂(例如抗NOTCH抗体)封装在微胶囊中。通过例如凝聚技术或通过界面聚合来制备此类微胶囊，例如，分别为，在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳剂、纳米粒和纳米胶囊)或在粗乳剂(如Remington,TheScienceandPracticeofPharmacy第20版，MackPublishing(2000)中所述)中的羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。

在某些实施方式中，药物制剂包含与脂质体复合的NOTCH拮抗剂(例如抗NOTCH抗体)(Epstein等，1985,Proc.Natl.Acad.SciUSA82:3688；Hwang等，1980,Proc.Natl.Acad.SciUSA77:4030；和美国专利第4,485,045和4,544,545号)。美国专利第5,013,556号中公开了具有增强的循环时间的脂质体。一些脂质体可以用含有磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生化的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的液体组合物通过逆相蒸发来产生。将脂质体挤压通过具有确定孔径的滤器，从而产生具有所需直径的脂质体。

此外，可以制备持续释放型制剂。持续释放型制剂的适合实例包括含有抗体的固体疏水聚合物的半透性基质，该基质为定形物形式(例如，膜或微胶囊)。持续释放型基质的实例包括聚酯、诸如聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)或聚乙烯醇等水凝胶、聚交酯(美国专利第3,773,919号)、L-谷氨酸和7-乙基-L-谷氨酰胺的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、诸如LUPRONDEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)等可降解的乳酸-乙醇酸共聚物、蔗糖乙酸酯异丁酸酯和聚D-(-)-3-羟基丁酸。

7.试剂盒

还提供了用于实施本发明方法的试剂盒。“试剂盒”是指包含至少一种用于特异性地检测样品(例如细胞、细胞系、肿瘤或组织)中的NOTCH3基因表达水平的试剂(例如核酸探针等)的任何制品(例如包装物或容器)。试剂盒可以作为用来实施本发明的方法的套件来促销、分售或销售。另外，试剂盒可以含有描述该试剂盒并且包含其使用说明资料的药品说明书。

在一个实施方式中，提供了用于实施本发明方法的试剂盒。此类试剂盒与手动筛选和自动化筛选都兼容。对于qRT-PCR测定而言，试剂盒至少包含用于检测NOTCH3基因表达的本文公开的探针。所述试剂盒还可以包含用于RNA提取、逆转录和/或PCR扩增的试剂。在某些实施方式中，本发明的试剂盒包含至少一种寡核苷酸，所述寡核苷酸包含选自由SEQIDNO:35～43组成的组的核苷酸序列。

试剂盒中可以包括阳性和/或阴性对照来验证按照本发明使用的试剂的活性和正确使用。对照可以包括：已知对NOTCH3mRNA的存在呈阳性或阴性的样品，例如RNA制备物、福尔马林固定的组织等。对照的设计和使用是标准的，并且完全在本领域技术人员的常规能力范围内。

还应意识到的是，本发明方法中的任何步骤或所有步骤都可以由人实施或以自动化方式进行。因此，身体样品的制备、样品的冷冻或固定、RNA提取和/或检测NOTCH3转录本水平的步骤可以是自动化的。

实施例

应理解的是，本文描述的实施例和实施方式仅出于说明性目的，本领域技术人员据此可以想到多种修改或改变，且这些修改和改变也包含在本申请的主旨和范围内。

实施例1

使用作为单一试剂和与化疗剂组合的OMP-59R5抗NOTCH2/3受体抗体在体内防止肿瘤生长

将20,000个OMP-PN8肿瘤细胞注射至NOD-SCID小鼠内。使肿瘤生长22天，直至它们达到125mm³的平均体积。将带有肿瘤的小鼠随机分为4组，并用对照抗体、OMP-59R5(抗NOTCH2/3)、吉西他滨、或OMP-59R5与吉西他滨的组合进行治疗。每隔一周以40mg/kg的剂量施用抗体。吉西他滨以每周20mg/kg的剂量施用。在所指示的治疗后天数测量肿瘤体积。作为单一试剂或与吉西他滨组合的OMP-59R5强烈地抑制了OMP-PN8肿瘤的生长(图1A)。

抗NOTCH2/3OMP-59R5抗体的抑制OMP-PN17胰腺肿瘤体内生长的能力使用基本相同的方法来确定。如图1B所示，作为单一试剂或与吉西他滨组合的OMP-59R5强烈地抑制了OMP-PN17肿瘤的生长。

将50,000个OMP-PN11肿瘤细胞注射至NOD-SCID小鼠内。使肿瘤生长21天，直至它们达到120mm³的平均体积。将带有肿瘤的小鼠随机分为4组，并用对照抗体、OMP-59R5(抗NOTCH2/3)、吉西他滨、或OMP-59R5与吉西他滨的组合进行治疗。每隔一周以40mg/kg的剂量施用抗体。吉西他滨以每周20mg/kg的剂量施用。在所指示的治疗后天数测量肿瘤体积。如图1C所示，作为单一试剂或与吉西他滨组合的OMP-59R5均对OMP-PN11肿瘤的生长没有效果。

将20,000个UM-PE13乳腺(NOTCH3高表达)肿瘤细胞注射至NOD-SCID小鼠内。使肿瘤生长37天，直至它们达到140mm³的平均体积。将带有肿瘤的小鼠随机分为4组，并用对照抗体、OMP-59R5、紫杉醇、或OMP-59R5与紫杉醇的组合进行治疗。每周以20mg/kg的剂量施用抗体。紫杉醇以每周10mg/kg的剂量施用。在所指示的治疗后天数测量肿瘤体积。如图1D所示，作为单一试剂或与紫杉醇组合的OMP-59R5强烈地抑制了UM-PE13肿瘤的生长。

将20,000个UM-T1乳腺(NOTCH3高表达)肿瘤细胞注射至NOD-SCID小鼠内。使肿瘤生长28天，直至它们达到120mm³的平均体积。将带有肿瘤的小鼠随机分为4组，并用对照抗体、OMP-59R5抗NOTCH2/3抗体、紫杉醇、或OMP-59R5与紫杉醇的组合进行治疗。每周以20mg/kg的剂量施用抗体。紫杉醇以每周10mg/kg的剂量施用。在所指示的治疗后天数测量肿瘤体积。如图1E所示，作为单一试剂或与紫杉醇组合的OMP-59R5对UM-T1肿瘤的生长没有效果。

将50,000个OMP-Lu40肺(NOTCH3低表达)肿瘤细胞注射至NOD-SCID小鼠内。使肿瘤生长33天，直至它们达到140mm³的平均体积。将带有肿瘤的小鼠随机分为4组，并用对照抗体、OMP-59R5抗NOTCH2/3抗体、紫杉醇、或OMP-59R5与紫杉醇的组合进行治疗。每周以20mg/kg的剂量施用抗体。紫杉醇以每周10mg/kg的剂量施用。在所指示的治疗后天数测量肿瘤体积。如图1F所示，与紫杉醇组合的OMP-59R5强烈地抑制了OMP-Lu40肿瘤的生长。

将50,000个OMP-Lu53肺(NOTCH3高表达)肿瘤细胞注射至NOD-SCID小鼠内。使肿瘤生长33天，直至它们达到120mm³的平均体积。将带有肿瘤的小鼠随机分为4组，并用对照抗体、OMP-59R5抗NOTCH2/3抗体、紫杉醇、或OMP-59R5与紫杉醇的组合进行治疗。每隔一周以40mg/kg的剂量施用抗体。紫杉醇以每周10mg/kg的剂量施用。在所指示的治疗后天数测量肿瘤体积。如图1G所示，与紫杉醇组合的OMP-59R5对OMP-Lu53肿瘤的生长没有效果。

实施例2

与吉西他滨组合的OMP-59R5的肿瘤生长抑制作用与胰腺肿瘤中的NOTCH3基因表达水平显著相关，但在乳腺肿瘤或肺肿瘤中却非如此。

使用标准微阵列技术，在实施例1所述的体内异种移植测定中的胰腺肿瘤、乳腺肿瘤和肺肿瘤中确定了NOTCH2和NOTCH3基因表达水平。根据制造商的操作说明，使用U133plus2阵列获得了表达数据。结果示于下表1至3中。这些表还包含了关于在实施例1所述的体内异种移植测定中特定肿瘤对与化疗剂联合的OMP-59R5抗NOTCH2/3抗体治疗的响应性的数据。对这些表中示出的NOTCH2和NOTCH3基因表达水平的分析是基于500的截断阈值。不过，当截断阈值在300～1000之间变化时，来自这些分析的总体结论始终是相同的。在乳腺肿瘤和肺肿瘤样品中，未观察到NOTCH3表达与体内治疗功效之间存在相关性：在NOTCH3基因高度表达的14个乳腺或肺肿瘤中，仅有5个有响应性。此外，在乳腺、肺或胰腺肿瘤样品中，未观察到NOTCH2表达与体内功效之间存在相关性。令人惊奇的是，在胰腺肿瘤中，在高水平的NOTCH3基因表达与OMP-59R5/吉西他滨治疗的体内功效之间存在非常强的相关性：在NOTCH3基因高度表达的10个胰腺肿瘤中，9个都对OMP-59R5和吉西他滨的治疗具有体内响应性。

表1.胰腺肿瘤中的NOTCH2和NOTCH3基因表达水平。

表2.乳腺肿瘤中的NOTCH2和NOTCH3基因表达水平。

表3.肺肿瘤中的NOTCH2和NOTCH3基因表达水平。NSCLC-非小细胞肺癌；SCLC-小细胞肺癌。

对胰腺肿瘤中高水平的NOTCH3基因表达与OMP-59R5/吉西他滨联合治疗的体内功效之间的这种令人惊奇的相关性进行了进一步分析。使用标准多重转录本测序(例如RNASeq)，在PN11、PN13、PN23、PN04、PN08、PN16、PN17、PN21和PN25胰腺肿瘤细胞中确定了NOTCH基因表达水平。根据制造商的操作说明，使用HiSeq^TM2000测序系统进行RNASeq。图2A显示，在人胰腺异种移植物模型中，增加的NOTCH3基因表达与OMP-59R5/吉西他滨联合治疗的体内肿瘤抑制作用显著相关(0.823；p<0.021)。图3进一步显示，在响应性胰腺肿瘤中检测到的NOTCH3基因表达显著高于在非响应性胰腺肿瘤中检测到的表达水平。

图2B显示了在对OMP-59R5抗NOTCH2/3抗体-吉西他滨联合治疗有响应的人胰腺肿瘤(R＝响应者；与吉西他滨单独治疗相比时p值<0.05)和经发现对OMP-59R5抗NOTCH2/3抗体-吉西他滨联合治疗无响应的异种移植物(NR＝无响应者；与吉西他滨单独治疗相比时p值>0.05)中检测到的NOTCH3基因表达的分布。非响应性胰腺肿瘤中的NOTCH3基因表达水平分布显示出与响应性胰腺肿瘤中的NOTCH基因表达水平分布的明显分离。

基于通过RNASeq在胰腺癌中检测出的NOTCH3基因表达水平，使用逻辑回归(标准统计学模型)来预测特定胰腺癌对OMP-59R5与化疗剂(例如吉西他滨)的联合治疗的体内响应性(AlanAgresti:AnIntroductiontoCategoricalDataAnalysis,JohnWileyandSons,Inc.(1996))。分析结果示于图4中。NOTCH3基因表达数据组的阳性预测值(PPV)、阴性预测值(NPV)、灵敏度(SENS)和特异性(SPEC)分别为83％、75％、83％和75％。

通过在统计学分析中加入来自胰腺癌的MAML2基因表达数据，进一步提高了预测胰腺癌对OMP-59R5与吉西他滨的联合治疗的体内响应性的预测准确性。对NOTCH3和MAML2基因表达数据组实施逻辑回归所得到的结果示于图5中。NOTCH3和MAML2基因表达数据组的阳性预测值(PPV)、阴性预测值(NPV)、灵敏度(SENS)和特异性(SPEC)为100％。使用通过标准RNASeq法获得的基因表达数据对实验进行了交叉验证。

实施例3

胰腺肿瘤样品中的NOTCH3蛋白表达

进行了NOTCH3蛋白质印迹分析以确定人胰腺肿瘤中的NOTCH3蛋白表达(图6A)。该分析中所用的抗NOTCH3抗体(细胞信号传导#5276)检测到了全长NOTCH3(FL约250kDa)以及NOTCH3的跨膜和细胞内区域(TM为约98kDa)。

图6B显示了在实施例1所述的异种移植物测定中的对OMP-59R5与吉西他滨的联合治疗有响应的人胰腺肿瘤(R＝响应者；与吉西他滨单独治疗相比时p值<0.05)和经发现对OMP-59R5与吉西他滨的联合治疗无响应的异种移植物(NR＝无响应者；与吉西他滨单独治疗相比时p值>0.05)中检测到的NOTCH3蛋白表达的分布。响应者与无响应者之间的NOTCH3蛋白表达分布上的分离度不如NOTCH3基因表达分布上的分离度明显。对胰腺癌中的NOTCH3蛋白表达数据进行了逻辑回归，以预测特定胰腺癌对OMP-59R5与吉西他滨的联合治疗的敏感性。在预测对OMP-59R5+吉西他滨治疗的响应方面，NOTCH3蛋白表达数据产生了与上述NOTCH3基因表达数据的表现相似的表现。

实施例4

用qRT-PCR测量的转移胰腺肿瘤样品中的NOTCH3基因表达

用标准的定量qRT-PCR在转移胰腺肿瘤样品中确定了NOTCH3基因表达。使用NOTCH3RefSeqmRNA序列NM_000435.2设计了测定探针。NOTCH3_A7检测到了两种潜在的转录本中的一种，而NOTCH3_A1检测到了Ensembl数据库所预测的全部两种转录本。使用人新鲜冷冻(FF)人组织样品的和福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)的人组织样品检验了探针和qRT-PCR测定。

表3.在NOTCH3qRT-PCR测定中使用的探针的核苷酸序列。

采集了约100份来自一线胰腺癌患者的福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)转移肿瘤组织，以确定该组中的NOTCH3表达水平和分布(图7)。使用标准的定量RT-PCR操作规程，用NOTCH3_A7引物/探针组确定了NOTCH3基因表达。进行了ANOVA统计学分析以确定NOTCH3水平是否与包括样品年龄、性别、患者年龄等在内的因素相关。除了肝脏转移部位显示出显著性和更宽的NOTCH3基因表达分布外，未发现NOTCH3水平与任何这些因素相关。图7显示了所检验的所有转移肿瘤样品的NOTCH3基因表达的第10、第25、第50、第75和第90百分位数。

对来自作为采集来源的人肝脏和淋巴结转移胰腺癌组织以及来自异种移植物测定中所用的原发性人胰腺肿瘤的NOTCH3基因表达进行了归一化，以对数据进行比较。在每个数据组中，减去数据平均值，并除以标准偏差。灰色(浅色)点表示实施例1中所述的异种移植物测定中的对OMP-59R5与吉西他滨的联合治疗无响应的人胰腺肿瘤，黑色(深色)点表示在异种移植物测定中有响应的人胰腺肿瘤(图8)。响应性肿瘤显示出的NOTCH3基因表达水平高于非响应性肿瘤，这表明NOTCH3基因表达可用于预测胰腺肿瘤对例如OMP-59R5与化疗剂的联合治疗的体内响应性。图8还显示了所检验的人肝脏和淋巴结转移胰腺癌组织的NOTCH3基因表达的第10、第25、第50、第75和第90百分位数。

实施例6

与吉西他滨和ABRAXANE^TM联用的OMP-59R5抗NOTCH2/3抗体抑制胰腺肿瘤的体外生长

将20,000个OMP-PN8(NOTCH3高表达)肿瘤细胞注射至NOD-SCID小鼠内。使肿瘤生长26天，直至它们达到110mm³的平均体积。将带有肿瘤的小鼠随机分为3组(每组n＝9只小鼠)，并用对照抗体、吉西他滨+ABRAXANE^TM(白蛋白结合的紫杉醇)、或OMP-59R5抗NOTCH2/3抗体与吉西他滨+ABRAXANE^TM的组合进行治疗。每隔一周以40mg/kg的剂量施用OMP-59R5。每周以10mg/kg的剂量施用吉西他滨，且每周以30mg/kg的剂量施用ABRAXANE^TM。在所指示的治疗后天数测量肿瘤体积。与吉西他滨+ABRAXANE^TM联用的OMP-59R5强烈地抑制了OMP-PN8肿瘤的生长，并且比仅用吉西他滨+ABRAXANE^TM时活性更高(图9)。上部图和下部图显示了从同一实验中获得的具有不同的比例尺的数据。下部图仅显示了从活性治疗组获得的数据，而不是从对照治疗动物获得的数据。结果表明，NOTCH3表达水平可用于预测胰腺肿瘤对OMP-59R5抗体与多种化疗剂的联合治疗的体内响应性。

出于所有目的将本文中所引用的所有出版物、专利、专利申请、互联网网站和登录号/数据库序列(包括多核苷酸和多肽序列)都通过援引完整地并入本文中，其程度如同具体地单独表明将各个单独的出版物、专利、专利申请、互联网网站和登录号/数据库序列都这样并入本文中。

序列

SEQIDNO:1

HKGAL

SEQIDNO:1

HEDAI

SEQIDNO:3:59R1重链CDR1

SSSGMS

SEQIDNO:4:59R1重链CDR2

VIASSGSNTYYADSVKG

SEQIDNO:5:59R1重链CDR3

GIFFAI

SEQIDNO:6:59R1轻链CDR1

RASQSVRSNYLA

SEQIDNO:7:59R1轻链CDR2

GASSRAT

SEQIDNO:8:59R1轻链CDR3

QQYSNFPI

SEQIDNO:9:59R5重链CDR3

SIFYTT

SEQIDNO:10(重链CDR3共有序列):

(G/S)(I/S)F(F/Y)(A/P)(I/T/S/N)

SEQIDNO:11(替代性重链CDR3)

SIFYPT

SEQIDNO:12(替代性重链CDR3)

SSFFAS

SEQIDNO:13(替代性重链CDR3)

SSFYAS

SEQIDNO:14(替代性重链CDR3)

SSFFAT

SEQIDNO:15(替代性重链CDR3)

SIFYPS

SEQIDNO:16(替代性重链CDR3)

SSFFAN

SEQIDNO:17:59R5重链可变区

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSSGMSWVRQAPGKGLEWVSVIASSGSNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSIFYTTWGQGTLVTVSSAST

SEQIDNO:18:59R1IgG抗体的59R1重链VH

QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSSGMSWVRQAPGKGLEWVSVIASSGSNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGIFFAIWGQGTLVTVSSA

SEQIDNO:19:59R1重链VH+哺乳动物信号序列(下划线)

MKHLWFFLLLVAAPRWVLSQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSSGMSWVRQAPGKGLEWVSVIASSGSNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGIFFAIWGQGTLVTVSSA

SEQIDNO:20:变体59R1重链可变区

QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSSGMSWVRQAPGKGLEWVSVIASSGSNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSIFYPTWGQGTLVTVSSA

SEQIDNO:21:变体59R1重链可变区

QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSSGMSWVRQAPGKGLEWVSVIASSGSNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSSFFASWGQGTLVTVSSA

SEQIDNO:22:变体59R1重链可变区

QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSSGMSWVRQAPGKGLEWVSVIASSGSNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSSFYASWGQGTLVTVSSA

SEQIDNO:23:变体59R1重链可变区

QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSSGMSWVRQAPGKGLEWVSVIASSGSNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSSFFATWGQGTLVTVSSA

SEQIDNO:24:变体59R1重链可变区

QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSSGMSWVRQAPGKGLEWVSVIASSGSNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSIFYPSWGQGTLVTVSSA

SEQIDNO:25:变体59R1重链可变区

QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSSGMSWVRQAPGKGLEWVSVIASSGSNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSSFFANWGQGTLVTVSSA

SEQIDNO:26:59RGV抗体(59R1的种系变体)的59R1重链VH

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSSGMSWVRQAPGKGLEWVSVIASSGSNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGIFFAIWGQGTLVTVSSA

SEQIDNO:27:59RGV抗体(59R1的种系变体)的59R1轻链VL

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRRASQSVRSNYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYSNFPITFGQGTKVEIKR

SEQIDNO:28:59R1轻链VL+哺乳动物信号序列(下划线)

MVLQTQVFISLLLWISGAYGDIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRSNYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYSNFPITFGQGTKVEIKR

SEQIDNO:29:59R1IgG抗体的59R1轻链VL

DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRSNYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYSNFPITFGQGTKVEIKR

SEQIDNO:30:59R5重链

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSSGMSWVRQAPGKGLEWVSVIASSGSNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSIFYTTWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQIDNO:31:抗NOTCH2/359R1IgG2重链的预测蛋白序列+信号序列，信号序列如下划线所示

MKHLWFFLLLVAAPRWVLSQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSSGMSWVRQAPGKGLEWVSVIASSGSNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGIFFAIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQIDNO:32:抗NOTCH2/359RGV(59R1的种系变体)的重链的预测蛋白序列+信号序列，信号序列如下划线所示

MKHLWFFLLLVAAPRWVLSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSSGMSWVRQAPGKGLEWVSVIASSGSNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGIFFAIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQIDNO:33:抗NOTCH2/359R1轻链的预测蛋白序列+信号序列，信号序列如下划线所示

MVLQTQVFISLLLWISGAYGDIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRSNYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYSNFPITFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQIDNO:34:抗NOTCH2/359RGV抗体(59R1的种系变体)的轻链的预测蛋白序列+信号序列，信号序列如下划线所示

MVLQTQVFISLLLWISGAYGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRRASQSVRSNYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYSNFPITFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQIDNO:35

AGGCAGAGTGGCGACCTC

SEQIDNO:36

CGTCCACGTTCACTTCACAATTC

SEQIDNO:37

AACCCAGGAAGACAGGCACAGTCGT

SEQIDNO:38

CTGGGTTTGAGGGTCAGAAT

SEQIDNO:39

GGGCACTGGCAGTTATAGGT

SEQIDNO:40

TGACGCCATCCACGCATGTC

SEQIDNO:41

TGCAGGATAGCAAGGAGGAGAC

SEQIDNO:42

GCAGCTTGGCAGCCTCATAG

SEQIDNO:43

CTCGCGGGCGGCCAGGAATAGGG

PCT/RO/134表

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种为了用NOTCH抑制剂进行治疗而选择胰腺癌患者的方法，所述方法包括：

(a)确定来自所述患者的肿瘤细胞中的一种或多种生物标志物的表达水平，其中，所述一种或多种生物标志物包含NOTCH3，和

(b)基于所述一种或多种生物标志物的表达水平选择患者。

2.一种确定被诊断为患有胰腺癌的患者是否可能对基于NOTCH抑制剂的疗法产生响应或者是否应当继续用NOTCH抑制剂进行治疗的方法，所述方法包括：确定来自所述患者的肿瘤细胞中的一种或多种生物标志物的表达水平，其中，所述一种或多种生物标志物包含NOTCH3，并且所述一种或多种生物标志物的表达水平表明患者可能对疗法产生响应。

3.一种治疗患者的胰腺癌的方法，所述方法包括：

(a)确定来自所述患者的肿瘤细胞中的一种或多种生物标志物的表达水平，其中，所述一种或多种生物标志物包含NOTCH3；和

(b)向所述患者施用治疗有效量的NOTCH抑制剂。

4.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，每种生物标志物经确定都以高于该生物标志物的参照水平的水平表达。

5.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，一种或多种生物标志物的表达水平通过确定生物标志物mRNA或生物标志物蛋白的水平来确定。

6.如权利要求5所述的方法，其中，所述生物标志物mRNA水平通过定量聚合酶链式反应或通过阵列杂交来确定。

7.如权利要求6所述的方法，其中，所述生物标志物是NOTCH3且所述mRNA水平使用以下(a)、(b)和/或(c)来确定：

(a)核苷酸序列选自由SEQIDNO:35、SEQIDNO:38和SEQIDNO:41组成的组的正向引物；

(b)核苷酸序列选自由SEQIDNO:36、SEQIDNO:39和SEQIDNO:42组成的组的反向引物；和/或

(c)包含寡核苷酸的探针，所述寡核苷酸的核苷酸序列选自由SEQIDNO:37、SEQIDNO:40和SEQIDNO:43组成的组。

8.如权利要求7所述的方法，其中，所述NOTCH3mRNA水平使用以下(a)、(b)或(c)来确定：

(a)序列为SEQIDNO:35的正向引物，序列为SEQIDNO:36的反向引物，和包含序列为SEQIDNO:37的寡核苷酸的探针；

(b)序列为SEQIDNO:38的正向引物，序列为SEQIDNO:39的反向引物，和包含序列为SEQIDNO:40的寡核苷酸的探针；或

(c)序列为SEQIDNO:41的正向引物，序列为SEQIDNO:42的反向引物，和包含序列为SEQIDNO:43的寡核苷酸的探针。

9.如权利要求1～8中任一项所述的方法，其中，所述一种或多种生物标志物还包括MAML2，并且MAML2的表达水平经确定高于MAML2表达的参照水平。

10.如权利要求1～9中任一项所述的方法，其中，生物标志物的参照水平是预定值或者该生物标志物在对照样品中的表达水平。

11.如权利要求1～10中任一项所述的方法，其中，NOTCH3的参照表达水平是胰腺癌或胰腺癌亚类中的NOTCH3表达的第25、第30、第40、第50、第60、第70、第75或第80百分位数。

12.如权利要求1～11中任一项所述的方法，所述方法还包括从所述患者获得样品。

13.如权利要求12所述的方法，其中，所述样品是全血、血浆、血清或组织。

14.如权利要求12或13所述的方法，其中，所述样品是胰腺肿瘤样品。

15.如权利要求12～14中任一项所述的方法，其中，所述样品是福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)的组织。

16.如权利要求1、2或4～15中任一项所述的方法，所述方法还包括向所述患者施用NOTCH抑制剂。

17.如权利要求1～16中任一项所述的方法，其中，所述NOTCH抑制剂是γ分泌酶抑制剂或抗NOTCH抗体。

18.如权利要求17所述的方法，其中，所述抗NOTCH抗体特异性地结合人NOTCH2和/或人NOTCH3。

19.如权利要求18所述的方法，其中，所述抗NOTCH抗体由以PTA-9547保藏在ATCC的多核苷酸所编码。

20.如权利要求17所述的方法，其中，所述抗NOTCH抗体特异性地结合人NOTCH2和/或人NOTCH3，其中，所述抗体包含：

(a)包含SSSGMS(SEQIDNO:3)的重链CDR1，包含VIASSGSNTYYADSVKG(SEQIDNO:4)的重链CDR2，和包含SIFYTT(SEQIDNO:9)或GIFFAI(SEQIDNO:5)的重链CDR3；以及包含RASQSVRSNYLA(SEQIDNO:6)的轻链CDR1，包含GASSRAT(SEQIDNO:7)的轻链CDR2，和包含QQYSNFPI(SEQIDNO:8)的轻链CDR3；

(b)与SEQIDNO:17、SEQIDNO:18或SEQIDNO:26具有至少约90％序列同一性的重链可变区；以及与SEQIDNO:29或SEQIDNO:27具有至少约90％序列同一性的轻链可变区。

21.如权利要求17所述的方法，其中，所述抗NOTCH抗体与选自由以下抗体组成的组的抗体竞争对人NOTCH2和/或人NOTCH3的特异性结合：

(a)包含含有SEQIDNO:17或SEQIDNO:18的重链可变区和含有SEQIDNO:29的轻链可变区的抗体；

(b)包含含有SSSGMS(SEQIDNO:3)的重链CDR1、含有VIASSGSNTYYADSVKG(SEQIDNO:4)的重链CDR2和含有SIFYTT(SEQIDNO:9)的重链CDR3以及含有RASQSVRSNYLA(SEQIDNO:6)的轻链CDR1、含有GASSRAT(SEQIDNO:7)的轻链CDR2和含有QQYSNFPI(SEQIDNO:8)的轻链CDR3的抗体；和

(c)由以PTA-9547保藏在ATCC的多核苷酸所编码的抗体。

22.如权利要求17～21中任一项所述的方法，其中，所述抗NOTCH抗体是嵌合抗体、人源化抗体、人抗体或抗体片段。

23.如权利要求3或16～22中任一项所述的方法，所述方法还包括施用第二治疗剂；可选地，其中所述第二治疗剂是化疗剂、核苷类似物或有丝分裂抑制剂。

24.一种包含分离的多核苷酸的诊断用组合物，所述多核苷酸包含选自由SEQIDNO:35～43组成的组的序列。

25.如权利要求24所述的诊断用组合物，所述诊断用组合物包含：

(a)序列为SEQIDNO:35的多核苷酸，序列为SEQIDNO:36的多核苷酸，和序列为SEQIDNO:37的多核苷酸；

(b)序列为SEQIDNO:38的多核苷酸，序列为SEQIDNO:39的多核苷酸，和序列为SEQIDNO:40的多核苷酸；或

(c)序列为SEQIDNO:41的多核苷酸，序列为SEQIDNO:42的多核苷酸，和序列为SEQIDNO:43的多核苷酸。

26.一种检测样品中的NOTCH3mRNA的方法，所述方法包括使所述样品接触包含选自由SEQIDNO:35～43组成的组的序列的多核苷酸。

27.如权利要求26所述的方法，所述方法包括使所述样品接触：

28.一种用于检测样品中的NOTCH3mRNA的试剂盒，所述试剂盒包含：包含选自由SEQIDNO:35～43组成的组的序列的多核苷酸。

29.如权利要求28所述的试剂盒，所述试剂盒包含：

30.一种引物，其序列选自由SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39、SEQIDNO:41和SEQIDNO:42组成的组。

31.一种包含寡核苷酸的探针，所述寡核苷酸的序列选自由SEQIDNO:37、SEQIDNO:40和SEQIDNO:43组成的组。

Claims

1.一种为了用NOTCH抑制剂进行治疗而选择胰腺癌患者的方法，所述方法包括：(a)确定来自所述患者的肿瘤细胞中的一种或多种生物标志物的表达水平，其中，所述一种或多种生物标志物包含NOTCH3，和(b)基于所述一种或多种生物标志物的表达水平选择患者。

2.一种确定被诊断为患有胰腺癌的患者是否可能对基于NOTCH抑制剂的疗法产生响应的方法，所述方法包括：确定来自所述患者的肿瘤细胞中的一种或多种生物标志物的表达水平，其中，所述一种或多种生物标志物包含NOTCH3，并且所述一种或多种生物标志物的表达水平表明患者可能对疗法产生响应。

3.一种确定是否应当向被诊断为患有胰腺癌的患者施用NOTCH抑制剂的方法，所述方法包括：确定来自所述患者的肿瘤细胞中的一种或多种生物标志物的表达水平，其中，所述一种或多种生物标志物包含NOTCH3，并且所述一种或多种生物标志物的表达水平预示所述患者对NOTCH抑制剂治疗具有有利的响应。

4.一种确定被诊断为患有胰腺癌的患者是否应当继续用NOTCH抑制剂进行治疗的方法，所述方法包括：确定来自所述患者的肿瘤细胞中的一种或多种生物标志物的表达水平，其中，所述一种或多种生物标志物包含NOTCH3，并且所述一种或多种生物标志物的表达水平表明患者可能对疗法产生响应。

5.一种确定被诊断为患有胰腺癌的患者是否应当继续用NOTCH抑制剂进行治疗的方法，所述方法包括：确定来自所述患者的肿瘤细胞中的一种或多种生物标志物的表达水平，其中，所述一种或多种生物标志物包含NOTCH3，并且所述一种或多种生物标志物的表达水平预示所述患者对所述NOTCH抑制剂治疗具有有利的响应。

6.一种确定NOTCH抑制剂在治疗患者的胰腺癌中的治疗功效的方法，所述方法包括：确定来自所述患者的肿瘤细胞中的一种或多种生物标志物的表达水平，其中，所述一种或多种生物标志物包含NOTCH3，并且所述一种或多种生物标志物的表达水平表明所述NOTCH抑制剂的治疗功效。

7.一种治疗患者的胰腺癌的方法，所述方法包括：

(b)向所述患者施用治疗有效量的NOTCH抑制剂。

8.一种为了用NOTCH抑制剂进行治疗而将胰腺癌患者群体分阶的方法，所述方法包括：

(b)基于所述肿瘤细胞中的所述一种或多种生物标志物的表达水平将所述患者群体分阶。

9.如权利要求1～8中任一项所述的方法，其中，NOTCH3的表达水平经确定高于NOTCH3表达的参照水平。

10.如权利要求1～9中任一项所述的方法，其中，每种生物标志物经确定都以高于该生物标志物的参照水平的水平表达。

11.如权利要求1～10中任一项所述的方法，其中，一种或多种生物标志物的表达水平通过确定生物标志物mRNA或生物标志物蛋白的水平来确定。

12.如权利要求1～11中任一项所述的方法，其中，NOTCH3的表达水平通过确定肿瘤细胞中的NOTCH3mRNA水平来确定。

13.如权利要求12所述的方法，其中，所述NOTCH3mRNA水平通过定量聚合酶链式反应来确定。

14.如权利要求13所述的方法，其中，所述NOTCH3mRNA水平使用以下(a)、(b)和/或(c)来确定：(a)核苷酸序列选自由SEQIDNO:35、SEQIDNO:38和SEQIDNO:41组成的组的正向引物；(b)核苷酸序列选自由SEQIDNO:36、SEQIDNO:39和SEQIDNO:42组成的组的反向引物；和/或(c)包含寡核苷酸的探针，所述寡核苷酸的核苷酸序列选自由SEQIDNO:37、SEQIDNO:40和SEQIDNO:43组成的组。

15.如权利要求14所述的方法，其中，所述NOTCH3mRNA水平使用以下(a)、(b)或(c)来确定：

16.如权利要求12所述的方法，其中，所述NOTCH3mRNA水平通过阵列杂交来确定。

17.如权利要求1～11中任一项所述的方法，其中，NOTCH3的表达水平通过确定肿瘤细胞所表达的NOTCH3蛋白水平来确定。

18.如权利要求1～17中任一项所述的方法，其中，所述一种或多种生物标志物由NOTCH3构成。

19.如权利要求1～17中任一项所述的方法，其中，所述一种或多种生物标志物还包括MAML2，并且MAML2的表达水平经确定高于MAML2表达的参照水平。

20.如权利要求19所述的方法，其中，所述一种或多种生物标志物由NOTCH3和MAML2构成。

21.如权利要求19或20所述的方法，其中，所述MAML2的表达水平通过确定肿瘤细胞中的MAML2mRNA水平来确定。

22.如权利要求19或20所述的方法，其中，所述MAML2的表达水平通过确定肿瘤细胞所表达的MAML2蛋白水平来确定。

23.一种治疗患者的胰腺癌的方法，所述方法包括：向所述患者施用治疗有效量的NOTCH抑制剂，其中，来自所述患者的至少一些胰腺肿瘤细胞表达一种或多种生物标志物中的每一种的水平高于所述生物标志物的参照水平，和/或已被预先确定为表达一种或多种生物标志物中的每一种的水平高于所述生物标志物的参照水平；其中，所述一种或多种生物标志物包含NOTCH3。

24.如权利要求23所述的方法，其中，NOTCH3的表达水平被确定为NOTCH3mRNA水平。

25.如权利要求23所述的方法，其中，NOTCH3的表达水平被确定为NOTCH3蛋白水平。

26.如权利要求23～25中任一项所述的方法，其中，所述一种或多种生物标志物由NOTCH3构成。

27.如权利要求23～25中任一项所述的方法，其中，所述一种或多种生物标志物还包括MAML2，并且MAML2的表达水平高于MAML2表达的参照水平。

28.如权利要求27所述的方法，其中，所述一种或多种生物标志物由NOTCH3和MAML2构成。

29.如权利要求1～28中任一项所述的方法，其中，生物标志物的参照水平是预定值。

30.如权利要求1～29中任一项所述的方法，其中，生物标志物的参照水平是该生物标志物在对照样品中的表达水平。

31.如权利要求1～29中任一项所述的方法，其中，NOTCH3表达的参照水平是胰腺癌或胰腺癌亚类中的NOTCH3表达的第25、第30、第40、第50、第60、第70、第75或第80百分位数。

32.如权利要求1～29中任一项所述的方法，其中，NOTCH3表达的参照水平是胰腺癌中的NOTCH3表达的第75百分位数。

33.如权利要求1～29中任一项所述的方法，其中，NOTCH3表达的参照水平是胰腺癌中的NOTCH3表达的第50百分位数。

34.如权利要求1～29中任一项所述的方法，其中，NOTCH3表达的参照水平是胰腺癌中的NOTCH3表达的第25百分位数。

35.如权利要求1～29中任一项所述的方法，其中，NOTCH3表达的参照水平是胰腺腺癌、转移胰腺肿瘤、肝脏和/或淋巴结转移胰腺肿瘤或抗化疗胰腺癌中的NOTCH3表达的第75百分位数。

36.如权利要求1～29中任一项所述的方法，其中，NOTCH3表达的参照水平是胰腺腺癌、转移胰腺肿瘤、肝脏和/或淋巴结转移胰腺肿瘤或抗化疗胰腺癌中的NOTCH3表达的第50百分位数。

37.如权利要求1～29中任一项所述的方法，其中，NOTCH3表达的参照水平是胰腺腺癌、转移胰腺肿瘤、肝脏和/或淋巴结转移胰腺肿瘤或抗化疗胰腺癌中的NOTCH3表达的第25百分位数。

38.如权利要求1～22或29～37中任一项所述的方法，所述方法还包括从所述患者获得身体样品。

39.如权利要求1～38中任一项所述的方法，其中，NOTCH3的表达水平是来自患者的身体样品中的水平。

40.如权利要求38或39所述的方法，其中，所述样品是全血、血浆、血清或组织。

41.如权利要求38、39或40所述的方法，其中，所述样品是胰腺肿瘤样品。

42.如权利要求41所述的方法，其中，所述样品是来自已转移至肝脏的胰腺肿瘤的样品。

43.如权利要求38～42中任一项所述的方法，其中，所述样品是福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)的组织。

44.如权利要求1～43中任一项所述的方法，其中，所述患者是人，或所述患者群体是人群体。

45.如权利要求1～44中任一项所述的方法，其中，所述胰腺癌是腺癌。

46.如权利要求1～45中任一项所述的方法，其中，所述胰腺癌是抗化疗的。

47.如权利要求1～6、8～22或29～46中任一项所述的方法，所述方法还包括向所述患者施用NOTCH抑制剂。

48.如权利要求1～47中任一项所述的方法，其中，所述NOTCH抑制剂是γ分泌酶抑制剂。

49.如权利要求1～47中任一项所述的方法，其中，所述NOTCH抑制剂是抗NOTCH抗体。

50.如权利要求49所述的方法，其中，所述抗NOTCH抗体是单克隆抗体。

51.如权利要求49或50所述的方法，其中，所述抗NOTCH抗体特异性地结合人NOTCH2或人NOTCH3。

52.如权利要求51所述的方法，其中，所述抗NOTCH抗体特异性地结合人NOTCH2和人NOTCH3。

53.如权利要求49或50所述的方法，其中，所述抗NOTCH抗体特异性地结合人NOTCH2的EGF重复10。

54.如权利要求49或50所述的方法，其中，所述抗NOTCH抗体特异性地结合人NOTCH3的EGF重复9。

55.如权利要求52所述的方法，其中，所述抗NOTCH抗体包含与人NOTCH3的EGF重复9和人NOTCH2的EGF重复10都结合的抗原结合位点。

56.如权利要求1～55中任一项所述的方法，其中，所述NOTCH抑制剂是人NOTCH2和/或人NOTCH3的拮抗剂。

57.如权利要求1～56中任一项所述的方法，其中，所述NOTCH抑制剂抑制配体与人NOTCH2和/或人NOTCH3的结合。

58.如权利要求1～57中任一项所述的方法，其中，所述NOTCH抑制剂抑制人NOTCH2和/或人NOTCH3的信号传导。

59.如权利要求52所述的方法，其中，所述抗NOTCH抗体由以PTA-9547保藏在ATCC的多核苷酸所编码。

60.如权利要求49或50所述的方法，其中，所述抗NOTCH抗体特异性地结合人NOTCH2和/或人NOTCH3，其中，所述抗体包含：

(a)包含SSSGMS(SEQIDNO:3)的重链CDR1，包含VIASSGSNTYYADSVKG(SEQIDNO:4)的重链CDR2，和包含SIFYTT(SEQIDNO:9)的重链CDR3；和

(b)包含RASQSVRSNYLA(SEQIDNO:6)的轻链CDR1，包含GASSRAT(SEQIDNO:7)的轻链CDR2，和包含QQYSNFPI(SEQIDNO:8)的轻链CDR3。

61.如权利要求49或50所述的方法，其中，所述抗NOTCH抗体特异性地结合人NOTCH2和/或人NOTCH3，其中，所述抗体包含：

(a)包含SSSGMS(SEQIDNO:3)的重链CDR1，包含VIASSGSNTYYADSVKG(SEQIDNO:4)的重链CDR2，和包含GIFFAI(SEQIDNO:5)的重链CDR3；和

62.如权利要求49或50所述的方法，抗NOTCH抗体特异性地结合人NOTCH2和/或人NOTCH3，其中，所述抗体包含：

(a)与SEQIDNO:17、SEQIDNO:18或SEQIDNO:26具有至少约90％序列同一性的重链可变区；和

(b)与SEQIDNO:29或SEQIDNO:27具有至少约90％序列同一性的轻链可变区。

63.如权利要求49或50所述的方法，其中，所述抗NOTCH抗体包含：

(a)与SEQIDNO:17具有至少约95％序列同一性的重链可变区；和

(b)与SEQIDNO:29具有至少约95％序列同一性的轻链可变区。

64.如权利要求49或50所述的方法，其中，所述抗NOTCH抗体包含：

(a)与SEQIDNO:18具有至少约95％序列同一性的重链可变区；和

(b)与SEQIDNO:29具有至少约95％序列同一性的轻链可变区。

65.如权利要求49或50所述的方法，其中，所述抗NOTCH抗体包含：

(a)包含SEQIDNO:18的重链可变区；和

(b)包含SEQIDNO:29的轻链可变区。

66.如权利要求49或50所述的方法，其中，所述抗NOTCH抗体包含：

(a)包含SEQIDNO:17的重链可变区；和

(b)包含SEQIDNO:29的轻链可变区。

67.如权利要求49或50所述的方法，其中，所述抗NOTCH抗体与选自由以下抗体组成的组的抗体竞争对人NOTCH2和/或人NOTCH3的特异性结合：

(c)由以PTA-9547保藏在ATCC的多核苷酸所编码的抗体。

68.如权利要求49～67中任一项所述的方法，其中，所述抗NOTCH抗体是嵌合抗体、人源化抗体、人抗体或抗体片段。

69.如权利要求7、23～28或47～68中任一项所述的方法，所述方法还包括施用第二治疗剂。

70.如权利要求69所述的方法，其中，所述第二治疗剂是化疗剂。

71.如权利要求70所述的方法，其中，所述第二治疗剂是核苷类似物或有丝分裂抑制剂。

72.如权利要求69所述的方法，其中，所述第二治疗剂是吉西他滨、紫杉醇、白蛋白结合的紫杉醇或其组合。

73.一种包含分离的多核苷酸的诊断用组合物，所述多核苷酸包含选自由SEQIDNO:35～43组成的组的序列。

74.如权利要求73所述的诊断用组合物，所述诊断用组合物包含：

75.一种检测样品中的NOTCH3mRNA的方法，所述方法包括使所述样品接触包含选自由SEQIDNO:35～43组成的组的序列的多核苷酸。

76.如权利要求75所述的方法，所述方法包括使所述样品接触：

77.一种用于检测样品中的NOTCH3mRNA的试剂盒，所述试剂盒包含：包含选自由SEQIDNO:35～43组成的组的序列的多核苷酸。

78.如权利要求77所述的试剂盒，所述试剂盒包含：

79.一种引物，其序列选自由SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39、SEQIDNO:41和SEQIDNO:42组成的组。

80.一种包含寡核苷酸的探针，所述寡核苷酸的序列选自由SEQIDNO:37、SEQIDNO:40和SEQIDNO:43组成的组。