NO790252L - Spesifikke bindings-proevings teknikker - Google Patents

Description

Hypersensitive individer gjennomgår en "forandret tilstand" som et resultat av kontakt med antigener fra et allergen, som fører til dannelse av antistoffer. Etterfølgende kontakt med én av disse antigener eller en strukturelt lik substans kan fremkalle i et allergisk individ en patologisk reaksjon på grunn av nærvær av slike antistoffer. Når disse individer puster inn eller tar inn det fremkallende antigen omfatter et iøyenfal-lende og vanlig utslag høyfeber, astma eller elveblest. Disse antistoffer er vev-sensibiliserende og kan angis som reagin lg.

Det finnes fem klasser av antistoffer, IgE, IgG, IgA, IgM og IgD. IgE utgjør klassen av antistoffer av største betydning i atopisk allergi.

In vivo diagnostiske tester på atopi, dvs. å bestemme nærvær av IgE fremkalt som respons på allergener, utføres generelt ved å injisere små mengder av det mistenkte allergen inne i huden i det følsomme individ og undersøke injeksjonsområdet for dannelse på huden av en uregelmessig blemme omgitt av en yrethemasone. I tillegg til in vivo tester er det blitt utviklet in vitrodiag-nostiske tester. En type av in vitro diagnostisk tester innbefatter analytiske prosedyrer som bredt kan klassifiseres som "spesifik bindingsprøvning".

Spesifikke bindeprøvingsprosedyrer med referanse til in vitro diagnostiske tester på atopi, innbefatter påvisning av en ligand i en kroppsvæske. En typisk spesifik bindingsprøvnings-prosedyre er bestemmelsen av IgE antistoffer (ligand) i blod-serumet i hyperfølsomme individer. US patentskrift 3 720 760

angår en in vitro diagnostisk test hvilken teknikk vanligvis er angitt som "RAST" (radioallergosorbent test).

For å illustrere rammen for foreliggende oppfinnelse

vil rastteknikken bli beskrevet i detalj. Testen innbefatter et første trinn hvor et testallergen (antigen) festes til et uløse-

lig polymert substrat under dannelse av et bundet fast-fase antigen. I det andre trinn bringes fastfase-antigenet i kontakt med serum fra et atopisk individ (med tilstedeværende IgE antistoff) , hvor IgE er den tidligere angitte ligand. IgE bindes til IgE-reseptorplasser på antigenet under dannelse av et antigen-ligandkompleks. Det tredje trinn bringes komplekset i kontakt med en merket bestanddel som er et konjugat av en merkesubstans og en bindekomponent (som er i stand til å bindes til liganden), f.eks. radio-merket anti-IgE.

RAST-reaksjonsproduktet som ytterligere beskrives i det etterfølgende, kan illustreres som følger:

Allergen (antigen) på en uløselig bærer

Forskjellige merkesubstanser kan anvendes. På grunn av faren og vanskeligheten med håndtering av radioaktive materialer er mange nye prøvingssystemer, som kan betegnes som "RAST-type"-systemer, blitt utviklet som gjør bruk av andre materialer enn radioaktive isotoper som merkesubstans. Eksempler på merkesubstanser innbefatter fri radikaler, fluorescente molekyler (f.eks. fluoroscein isothiocyanat og rhodamin farver), luminescente molekyler, bakteriofager, enzymer, coenzymer og enzyminhibitorer.

Antistoffer er normalt sammensatt av fire kjeder, to lette kjeder og to tunge kjeder. I begge typer av kjeder er det en konstant region og variabel region, dvs. at aminosyresekven-sen i regionen er relativt konstant eller variabel. Aminosyre-sekvensen i den variable region avhenger av identiteten av antigenet mot hvilket det er rettet. Den variable region av antistoffmolekylet som binder antigenet er innbefattet innen antistoff bindingsfragmentet (Fab) erholdt ved papainoppslutning.

Den konstante region varierer ikke med hensyn til antigenet mot hvilket antistoffmolekylet er rettet, men er karakteristisk for en gitt antistoffklasse. Del av den konstante tungkjederegion det andre fragment (Fc) som frigis ved papainomslutning.

IgE bindes til antigenet via antistoff-fragment (Fab) regionen i antigenmolekylet og etterlater Fc regionen udekket. Det radiomerkede anti-IgE bindes deretter til IgE via Fc-regionen i IgE.

RAST reaksjonsproduktet, som vist i den tidligere illustrasjon, er substrat som har bundet dertil tre "lag": (1) fast fase antigen, (2) IgE spesifikt rettet mot antigenet, og (3) radiomerket anti-IgE som spesifikt reagerer med IgE. Den stråling som sendes ut av det radiomerkede reaksjonsprodukt er et mål på mengden av tilstedeværende antigenspesifikt IgE i test-serumet. Anvendelse av RAST-metoden som ovenfor beskrevet mulig-gjør bestemmelse av nærvær og, til en begrenset grad, mengden av IgE tilstedeværende i en pasients serum, som er istand til å

reagere med antigen bundet til substratet. Denne test i forbindelse med hudtesting gir en indikasjon på hvorvidt pasienten er allergisk overfor antigenet eller ikke.

Etter diagnosen av atopi er en vanlig metode for behandling av allergiske sykdommer å immunisere ("desensibilisering") individet med en rekke injeksjoner med gradvis økende mengder av allergenekstrakter. På grunn av faren for utløsning av anafylak-tisk sjokk, må mengdene av allergenekstrakt som administreres om-hyggelig, kontrolleres.

Variasjonen i styrken av det administrerte allergenekstrakt, som indikert ved måling av reaktiviteten i huden på følsomme individer er blitt observert. Denne variasjon i styrke indikerer ønskeligheten av å forbedre standardiseringen av allergene ekstrakter. Vanskeligheter med standardisering av allergenekstrakter antas å oppstå på grunn av at allergen (f.eks. pollen) ekstrakter vanligvis er komplekse blandinger, og det har vært vanskelig å bestemme hvilke bestanddeler som er ansvarlige for å fremkalle enten en allergisk reaksjon eller en terapeutisk effekt under behandling. Metoder for å utvikle styrken har i stor grad vært basert enten på et enkelt forhold mellom råkildematerialer og volum av ekstraksjonsvæske eller på ekstraktets proteinnitrogen. Da de fleste allergener synes å være proteinaktige av natur, har

en angivelse av styrken ved proteinnitrogenenheter (PNU), definert som 0,01 g fosforwolframsyre-utfellbart nitrogen, fått vid anvendelse. PNU-innholdet er imidlertid ikke nødvendigvis beslektet med biologisk aktivitet, da allergenekstrakter kan inneholde proteiner som ikke er allergenisk aktive. Ennvidere kan spesifike proteinallergener denatureres under ekstraksjonen eller lagring med tap av deres bioloigske aktivitet, men fremdeles fremstå som protein i en kjemisk bestemmelse.

En annen bruk av bindingsprøvningsteknikken slik som RAST-systemet, er ved måling av allergeners styrke i forsøk på å standardisere allergener for bruk ved diagnostisk hudtesting og for in vivo desensibilisering. Dette utføres ved å opprettholde det andre og tredje lag (dvs. IgE og merket anti-IgE) konstant,

og å tilsette økende mengder av løselig antigen i det første trinn. Prinsippet for denne teknikk som er illustrert i det etterfølgende, er basert på en konkurranse mellom fast- og væske-faseantigener for IgE-receptorplasser i det førset trinn i RAST-metoden. Ettersom mengden av løselig antigen økes, • vil en mindre mengde av IgE kompleksdanne med fast faseantigen på grunn av økningen i komplekser dannet mellom væskefaseantigen og IgE. Dette nedsetter i sin tur den prosentvise binding av radiomerket anti-IgE til fast fase antigen i det tredje trinn av rastmetoden. Denne minskning

i den prosentvise binding av anti-IgE til fast faseantigen frem-kaller en minskning i mengden av bestråling som sendes ut av den faste fase.

Ved å starte med 100 % binding kan ved forsiktig titre-ring mengden av løselig antigen som behøves for å oppnå en 50 %-ig inhibering av bindingen bestemmes. Ved å avmerke mengden av løselig antigen som kreves mot mengden av fremkalt inhibering på semilogpapir, kan et tilnærmet lineært forhold bestemmes. I området mellom 30 og 70 % inhibering er i særdeleshet semilogav-merkingene lineære. Sluttpunktet ved disse titreringer kan skjønnsmessig velges som mengden av allergenekstrakt som er nød-vendig for 50 % inhibering. Teoretisk vil en sammenligning av en serie av allergenekstrakter gi sammenligningsdata som er tilstrekkelig til å muliggjøre en standardisering av ekstrakten.

[Se J. Allergy Clin. Immunol. 53: 158 - 169 (1974)]. Som angitt i det etterfølgende lider denne metode av flere ulemper.

En ulempe ligger i anti-IgE i seg selv. Sluttreagenset som anvendes ved Rast-metoden det radiomerkede anti-IgE., dannes ved radiomerking med et radioaktivt 'jodsalt. Dette gir radio-merket anti-IgE med en halveringstid som er tilstrekkelig kort til å oppnå den nødvendige følsomhet for målingen av lave konsen trasjoner av IgE. Imidlertid betyr en kort halveringstid at det radiomerkede anti-IgE forandres hurtig hvilket forhindrer anvendelse av dette som et standard referansereagens over en rekke tidsperioder. I tillegg vil harske joderingsbetingelser og etterfølgende strålingsskader under radioanmerkningsprosessen gi vaiasjoner i det radiomerkede anti-IgE. På grunn av disse variasjoner er det ikke mulig å direkte sammenligne to prøvinger utført ved forskjellige tider ved anvendelse av samme sats av radiomerket anti-IgE eller på samme tid anvende forskjellige satser av radiomerket anti-IgE. Ved standardisering av radiomerket anti-IgE ifølge foreliggende oppfinnelse unngås disse ulemper.

Standardisering ved Rast-inhibering lider av andre ulemper. Rast-metoden er i seg selv ikke en standardisert teknikk. Radioimmunoprøvninger standardiseres typisk ved etsblering av et angitt, veldefinert referansereagens, enten et antigen eller antistoff. Imidlertid er allergener komplekse blandinger som ikke er veldefinerte, og deres stabilitet er ikke helt ut kjent.

I beste fall kan denne metode bare delvis standaridsere Rast. Imidlertid har det vært foreslått (Se J. Allergy Clin. Ummunol. 53: 158 - 169, 1974) at serum fra atopiske individer kan anvendes som et referansereagens for det mere vanlige allergi. Dette vil - også bare føre til en delvis standardisering av Rast-metoden fordi serum representerer en kompleks blanding med dårlig definerte antistoff spesifisiteter. Til tross for de iboende vanskeligheter har en rangering av atopisk sera for bruk i den direkte Rast-metode vært foreslått (Se Advances in Diagnosis of Allergy:

RAST s. 85 - 99 Symposium specialists [1975]).

Teoretisk kan radiomerket anti-IgE for det tredje trinn i Rast-metoden standardiseres ved å holde første og annet lag konstant og sammenligne radiomerket anti-IgE i det tredje lag. Det standardiserte radiomerkede anti-IgE ville da kunne anvendes for å standarisere Rast-testen i seg selv. Standardisering av anti-IgE Rast med standardisert radiomerket anti-IgE ville kunne være brukbar ved at et standard reagens vil kunne anvendes uten hensyn til tilstedeværende allergenekstrakt i det første lag. Da imidlertid reagensene som anvendes i de to'første trinn i Rast-metoden er komplekse blandinger med dårlig definert stabilitet, er disse trinn vanskelig nøyaktig å reprodusere fra et forsøk til neste.

Da det også er vanskelig å definere aktiviteten av prøvene av

det radiomerkede anti-IgE nøyaktig, vil dette reagens ikke lett kunne anvendes som en referansestandard.

Som tidligere angitt er et viktig eksempel vist på bindingsprøving ved anvendelse av en merket forbindelse radio-immunoprøvning slik som radioallergosorbent (RAST) teknikker.

Alternative merkede materialer som er foreslått er fri-radikaler, fluorescentmolekyler, luminescente molekyler, bakteriofager, enzymer, coenzymer eller enzyminhibitorer. Lignende vanskeligheter er tilstede når det gjelder å definere aktiviteten av ethvert merket materiale uten hensyn til materialet mot hvilket det er rettet eller typen av anvendt merket forbindelse.

Ceska og Lundkvist, Immunochemistry, 2: 1021 - 1030, 1972 beskrives en trelags fast faseprøvning på ikke-spesifikk IgE. Det første lag er umerket anti-IgE. det andre lag er det IgE som skal testes, og det tredje lag er merket anti-IgE. Denne metode kan ikke anvendes for å standardisere merkede bestanddeler for bruk i spesifike bindingsprøvingsteknikker på grunn av at fast fase anti-IgE i det første lag delvis terisk forhindrer den etter-følgende binding av merket anti-IgE i det tredje lag. Sterisk hindring fremstår når fast fase anti-IgE i første lag binder enkelte molekyler av IgE på en slik måte at de ikke er tilgjengelige for binding av merket anti-IgE i tredje lag. Sterisk hindring er uønsket i spesifik bindingsprøvningsteknikker. Foreliggende oppfinnelse angår bruk av en standardisert teknikk som innbefatter et modellsystem av anti-lettkjede antistoffer i et tre-lags fast faseprøvingssystem. Det er ikke tidligere beskrevet bruk av et modellsystem av anti-lettkjede antistoffer for standardisering av en merket bestanddel slik som merket anti-IgE.

Foreliggende oppfinnelse angår således en fremgangsmåte for standardisering av en merket bestanddé.1 som er et konjugat av en første merkesubstans og en bindekomponent for bruk i en spesifik bindingsprøvningsmetode. Oppfinnelsen er også rettet mot en fremgangsmåte for anvendelse av den standardiserte merkede bestanddel i spesifik bindingsprøvningsteknikker, f.eks. bestemmelse av allergenstyrke og bestemmelse av mengden av tilstedeværende ligand i kroppsvæsker. Oppfinnelsen omfatter således en fremgangsmåte for standardisering av en merket bestanddel, som er et konjugat av en første merkesubstans og en bindekomponent og som er istand til å reagere med en ligand, mot en ligand-referansesubstans for bruk i en spesifik bindingprøvningsmetode, hvilken fremgangsmåte er kjennetegnet ved følgende trinn: (a) inkubering av substrater med anti-lettkjede antistoff bundet dertil med varierende konsentrasjoner av det ligand som er merket med en andre merkesubstans, hvori både mengden av tilstedeværende ligand protein i den merkede ligand, representert ved den andre merkesubstans, og mengden av ligand-referansesubstans ekvivalent med det merkede ligand protein, uttrykt i mengden av tilstedeværende merket ligand, er kjent, i et tidsrom tilstrekkelig til å danne en serie av produkter som er substrater med anti-lettkjede antistoff bundet dertil, og variering^ av mengder av merket ligand bundet til anti-lettkjede antistoff, (b) inkubering av produktene fra trinn (a) med den merkede bestanddel hvorved den merkede bestanddel er bundet til den merkede ligand, (c) måling av produktene fra trinn (b), og bestemmelse av mengden

av merket ligand og merket bestanddel,

(d) bestemmelse av tilstedeværende ligandprotein i produktene

fra trinn (b), basert på mengden av merket tilstedeværende ligand, ved hjelp av forholdet kjent fra (a), og (e) bestemmelse i produktene fra trinn (b) av mengden av tilstedeværende ligand protein, uttrykt ved ligand referansesubstans, hvorved den merkede bestanddel er standardisert uttrykt ved liganden bundet dertil, for bruk i en spesifik bindings-prøvingsteknikk.

Oppfinnelsen.angår envidere en spesifik bindingsprøv-ningsmetode som innbefatter reversibel ikke-covalent binding av en ligand og en merket bestanddel som er et konjugat av en første merkesubstans og en bindekomponent og som er istand til å reagere med liganden, og hvori liganden også "ér bundet til et aktivert substrat, hvilken fremgangsmåte er kjennetegnet ved at liganden merkes med en andre merkesubstans som er forskjellig fra den før-ste merkesubstans i den merkede bestanddel, hvorved den merkede ligand kan skilles fra den merkede bestanddel, og at den merkede bestanddel kalibreres mot den merkede ligand, med referanse til en hensiktsmessig valgt ligand referansesubstans.

Fig. 1 er en standardkurve (nedtegnet på logit v log akser) for bestemmelsene av mengden av IgE, uttrykt i Verdens Helseorganisasjons enheter (WHO),

125 fig. 2 er en kalibreringskurve for binding av I merket anti-IgE til IgE på anti-lettkjedeskiver,

fig. 3 er en grafisk representasjon av titreringen av atopisk sera på allergenskiver for å bestemme serum arbeidsfortynning. Operasjonskapasitet for skiven (A) er 170 x 10 _3 U IgE),

fig.. 4 er en grafisk representasjon av titreringen av to forskjellige allergenekstrakter ved spesifik bindingsprøvnings-inhibering, under anvendelse av et atopisk serum. (A = 170 x

10~3 U IgE), og

fig. 5 er en skjematisk illustrasjon som viser bestemmelsen av allergenstyrken i henhold til foreliggende oppfinnelse.

Foreliggende oppfinnelse angår en metode for standardisering av en merket bestanddel. I henhold til oppfinnélsen standardiseres en merket bestanddel, slik som anti-Ig,- uttrykt ved en internasjonal eller nasjonalt anerkjent referanse lg, uttrykt som internasjonale eller nasjonale enheter. Standardisert merket anti-Ig kan anvendes i spesifike bindingsforsøk. Eksempelvis kan standardisert merket anti-IgE anvendes i speisifike bindingsfor-søksprosedyrer slik som i radioallergosorbent prosedyrer (RAST) for standardisering av allergenekstrakter (antigener). Standardisert merket anti-Ig kan også anvendes for bestemmelse av mengden av lg antistoffer tilstedeværende i kroppsvæsker, f.eks. IgE antistoffer tilstedeværende i atopisk serum.

Som tidligere diskutert inneholder antistoffmolekyler antigen-bindende egenskaper i mavemolekylet angitt som det antigen-bindende fragment (Fab) som er spesifikt med hensyn til binding av spesifike antigener. Den andre ende av molekylet angitt som Fc, binder ikke antigener.

I spesifik bindingsmetoder innbefatter radioisotoper, binder IgE -sntistoffer til antigen via Fab-delen, og etterlater Fc-delen udekket. Under den andre inkubering med radiomerket anti-IgE, bindes anti-IgE til den udekkede Fc-del av IgE-molekylet. For å funksjonere riktig i disse tester, må merket anti-IgE standardiseres på en måte som nær simulerer aktiviteten av merket anti-IgE i testen. Denne simulering vil si at, da den spesifike bindingsteknikk som Rast eller teknikker som anvender andre merkesubstanser slik som enzymer, er relativt sterisk uhindret, må prosedyrene som anvendes for å standardisere merket anti-IgE også være relativt sterisk uhindret. Den beskrevne standar-diseringsprosedyre som gjør bruk av anti-lettkjede antistoffer bundet til et aktivert substrat, oppfyller dette suppleringskrav.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen eri.dens videste betydning rettet mot standardisering av en merket bestanddel og anvendelse av den merkede bestanddel i spesifikke, bindingsteknikker. Som tidligere diskutert kan forskjellige merkede substanser anvendes i spesifikke bindingsteknikkker. Foretrukne utførelsesformer innbefatter radioisotoper og enzymer. Den merkede bestanddel kan anvendes i alle trelags spesifikke bindingsteknikker. Foretrukne utførelsesformer innbefatter standardisering av allergenekstrakter og bestemmelse av, eller påvirkning av, en ligand i en kroppsvæske. Slike ligander innbefatter antistoffer, f.eks. Ig og proteiner. En foretrukket utførelsesform er påvisningen av, eller bestemmelsen av, IgE i atopisk serum.

I standardiseringsprosedyren ved den foretrukne utførel-sesf orm standardiseres radiomerket anti-IgE mot IgE. IgE standardiseres i sin tur mot IgE-referansestandard. IgE-referansestandard beskrevet i den foretrukne utførelsesform er standard IgE- referanseserum, erholdt fra verdens helseorganisasjon (WHO) og betegnes som IgE (69/341), inneholdende 10 000 WHO-enheter pr. ml.

Rast, som beskrevet og illustrert tidligere, er et eksempel på en trelags fast faseteknikk som gjør bruk av radioisotoper. For å simulere spesifikke bindingsteknikker, f.eks. Rast-prosedy-ren, må en prosedyre for å standardisere det merkede anti-IgE for bruk i en spesifikk bindings prøvningsteknikk simulere forsøkets teknikk. Da Rast er relativt sterisk uhindret, må en metode for standardisering av anti-IgE for bruk i en spesifikk bindingsprøv-ningsteknikk også være relativt sterisk uhindret. Standardiseringsprosedyren ifølge oppfinnelsen utgjør bruk av en trelags fast faseteknikk. hvori det første lag er anti-humant lettkjede antistoff bundet til den uløselige bærer. Det andre lag er merket IgE. Det tredje lag er merket anti-IgE. Det merkede IgE er skillbart fra det merkede anti-IgE som er standardisert. Tre-lagsproduktet kan illustreres som vist i det etterfølgende:

Metoden for standardisering av merket anti-IgE og metoden for bestemmelse av styrken av et antigen er beskrevet i det etterfølgende.

131

Som beskrevet i A, ble IgE radiomerket med Na I.

131 Strålingen ble målt. Forholdet mellom stråling fra I radio-merket IgE og mengden av IgE protein tilstedeværende i radio-merket IgE ble bestemt som beskrevet nedenfor ved den doble antistoffmetode ifølge Gleich et al., [j. Lab. Clin. Invest. 77: 690 - 698 (1971)] etter referanse til en standardkurve konstruert ved anvendelse av WHO IgE referanseserum slik at konsentrasjonen av radiomerket IgE protein utvikles i WHO-enheter.

Standardkurven ble fastslått ved den doble antistoffmetode for anveridelse av konkurrerende inhibering i en væskefase

125

av en reaksjon mellom I radiomerket IgE og umerket kankn anti-131 IgE ved økende konsentrasjoner av WHO IgE referanseserum. I radiomerket IgE erstattet WHO referanseserumet i inhiberingsfor-søket.<131>I radiomerket IgE<1>s evne til å inhibere bindingen av 125

I radiomerket IgE til umerket kankn anti-IgE ble sammenlignet, ved referanse til standardkurven, med. WHO IgE referanseserums inhiberende evne ved det samme forsøk og konsentrasjonen av IgE

131

i I radiomerket IgE preparat ble fastslått.

Jod-125 radiomerket IgE, kommesielt tilgjengelig fra Pharmacia, London, ble omsatt med umerket anti-IgE, kommersielt tilgjengelig fra Behringwerke A.G. i nærvær av økende mengder

125

WHO IgE-referanseserum under dannelse av en serie av I-radio-merket IgE-anti-IgE-komplekser. Da det er nødvendig å separere disse komplekser fra løselig uomsatt<1>25I radiomerket IgE ble de

o

utfelt ved tilsetning av ape-anti-kanin-immunoglobulinserum kommersielt tilgjengelig fra Wellcome Laboratories.

Strålingen fra<125>I radiomerket IgE tilstedeværende i seriene av komplekser ble bestemt og en standardkurve konstruert.

121

Konsentrasjonen av IgE protein inneholdt i I IgE-preparatet ble bestemt fra standardkurven direkte i WHO-enheter, idet man korrigerte 125 I verdiene for slag overleppende fra<131>I isotop. En standardkurve (nedtegnet på logit v. log aksen) for bestemmelse av mengden av IgE ved WHO enheter er vist i fig. 1. Før tilsetning av WHO IgE referanseserum kan bindingsreaksjonen mellom 125

I radiomerket IgE kanin anti-IgE betraktes som 100 %. Ifølge fig. 1 er det ved 50 % injisering av bindingen blitt tilsatt betydelig mer enn IO<1>WHO-enheter IgE ml 1 til kompleksene.

Det ovenfor beskrevne doble antistofforsøk ga følgende 131

resultater. Et I radiomerket IgE preparat ble funnet å inneholde 224 WHO-enheter IgE ml"<1>(22.4y IgE 0,01 ml"<1>). Strålingen

131

fra en prøve av I IgE ble bestemt til å være lik 450 000 cpm. Responsen for hver enhet av IgE inneholdt i det radiomerkede preparat ble beregnet til å være 20 000 cpm. ,.

Alternativt til den doble antistoffmetode ifølge Gleich for bestemmelse av IgE mengde i WHO enheter kan anvendes, slik som metoden ifølge Ceska og Lundkvist (Immunochemistry, 2: 1021 - 1030, 1972).

125 Som beskrevet i B, hie anti-IgE radiomerket med I. Srrålingen fra anti-IgE var skillbar fra strålingen fra<1>31I radiomerket IgE. Identiteten av de radioaktive isotoper er ikke av betydning så lenge som radioaktiviteten er skillbar.

Aktiverte substrater i form av skiver ble bragt i kontakt med anti-humant lettkjede antistoffer som beskrevet i D. Skiveneble deretter inkubert med varierende konsentrasjoner av

<131>I radiomerket IgE i ca. 3 timer ved 20° C. Overskudd av reagens ble fjernet og skivene ble vasket fire ganger med 1 % tensid i fysiologisk saltvann, f.eks. "Tween", kommersielt tilgjengelig

fra Sigma Chemical, St. Louis, Missouri. Skivene ble deretter

125

inkubert i ca. 1-7 timer med I radiomerket anti-IgE under dannelse av et substrat som har festet dertil det trelags fastfase-produkt som er illustrert i den foregående tegning.

131

Etter vasking ble radioaktiviteten av I IgE og

125

I anti-IgE målt samtidig i en gammateller. Mengden av IgE

131

protein i I radiomerket IgE, uttrykt direkte i WHO IgE-enheter,

131

i forhold til den I radioaktivitet som ble utstrålt ble på forhånd bestemt.<125>I anti-IgE-tellinger, korrigert for en over-131

lapping av I-tellinger ble nedtegnet mot enhetene av IgE bun-131

det til skivene, som bestemt fra I tellingene. Dette ga en kalibreringskurve, vist i fig. 2, fra hvilken IgE bundet til en aktivert skive kan bringes i forbindelse med den etterfølgende binding av radiomerket anti-IgE. Derfor er forholdet mellom mengden av stråling fra radiomerket anti-IgE, mengden av IgE-protein bundet til radiomerket anti-IgE og mengden av IgE-protein, i WHO-enheter kjent. Ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen som ovenfor beskrevet, er radiomerket anti-IgE.standardisert uttrykt i WHO-enheter, da den virkelige vekt av en ligand (f.eks. IgE) kan bestemmes fra mengden av merket bestanddel bundet dertil.

Den standardiserte radiomerkede anti-IgE kan anvendes

i forskjellige modifikasjoner av spesifikk bindingsforsøk refe-rert til tidligere, for å bestemme mengden av IgE bundet til et aktivert substrat, uten hensyn til den merkede substans som anvendes. Den spesifikke utførelsesform som er beskrevet i det etterfølgende angår en forbedret spesifikk bindingsprøvnings-metode for måling av styrken av et allergenekstrakt. Styrken måles ved radioallergosorbentinhibering.

Fremstilling av materialer for standardisering av radiomerket Anti- IgE

A.. Radiomerket IgE

Renset IgE (inneholdende mindre enn 0,6 % IgG) ble fremstilt ved ionebytting og gelkromatografi fra IgE benmarg-131

svulstserum. IgE ble radiomerket med Na I, tilgjengelig fra Radiochemical Centre, Amersham, Bucks, England. Radiomerkingen ble utført ved tilsetning av ca. 0,025 ml 0,5 M fosfatbuffer

(pH = 7,5) til en 10 mikroliters porsjon av.Na^^I i en ampulle.

Umiddelbart deretter ble 5 mikrogram av IgE i 0,025 ml 0,05 M fosfatbuffer<p>g 100 mikrogram friskt natrium p-toluensulfokloramin, tilgjengelig som "Chloramine T" tilgjengelig fra Sigma Chemical, i 0,025 ml 0,05 M fosfatbuffer tilsatt. Etter hver tilsetning ble innholdet i ampullen blandet. Umiddelbart etter tilsetningen av toluensulfokloramin, ble en 0,1 ml porsjon av natriummetabisulfitløsning (2,4 g/ml) i 0,05 M fosfatbuffer tilsatt for å forhindre etterfølgende jodering. De uomsatte reagenser ble fjernet ved passasje gjennom Sephadex G50. Den merkede IgE-topp ble oppsamlet og justert til 5 ml med 5 % human serum albumin i fosfatbuffret saltvann (PBS) og lagret ved 20° C.

[Se Biochem. J. 89: 114 - 123 (1963]).

B. Radiomerket Anti-IgE

Saueantihumant IgE ble renset ved isolering av 7S toppen fra en G200 kromatografikolonne. Det spesifike anti-IgE ble eluert med en glycin/HCl-buffer (pH = 2,6).

En 10 g porsjon av dette anti-IgE preparat ble radio-125

merket med 1 mCi Na I, tilgjengelig fra Radiochemical Centre, Amersham, Bucks, England etter følgende metode.

Merkingen ble utført ved 4° C under anvendelse av reagenser som på forhånd var avkjølt i et isbad. En 100 yg porsjon av renset saue anti-IgE inneholdt i 100 yl 0,1 M fosfatbuffer (pH = 7,0) ble anbragt i en ampulle og til denne ble tilsatt

125

lmCi Na I etterfulgt umiddelbart av 50 yg kloramin T inneholdt 1 50 yl 0,1 M fosfatbuffer (pH = 7,0). Innholdet i ampullen ble blandet og reaksjonen ble fortsatt i 3 0 minutter under omrøring ved 4° C. Joderingsblandingen ble nøytralisert ved tilsetning av 2 0 yg natriummetabisulfit inneholdt i 5 yl 0,1 M fosfatbuffer

(pH = 7,0). Innholdet i ampullen ble blandet og reaksjonsblandingen fikk stå i ytterligere 5 minutter ved 4° C. 5 yl av 5 %-ig kvegserum albumin (BSA) løsning ble tilsatt, og innholdet i ampullen ble overført til en Sephadex G50 kolonne hvor uomsatte reagenser ble fraskilt. Den radiomerkede proteintopp ble oppsamlet og justert til 5 ml med 5 % (BSA) i fosfatbuffret saltvann-løsning (PBS) og lagret ved -20° C.

Før bruk ble anti-IgE preparatet fortynnet i PBS inneholdende 2 0 % normal saueserum, 0,2 % kvegserum albumin og 1 % tensid under dannelse av en arbeidsløsning som ga 10 g slag pr.

minutt pr. ml [Se Immunochem. 7: 885 - 898 (1970)].

C. Aktivert substrat

Papirskiver (5 mm diameter) ble utstanset fra filtrer-papir og aktivert med cyanogenbromid som følger. Egnede filtrer-papir er kommersielt tilgjengelige fra Whatman Biochemical, betegnet som Whatman nr. 54. Substratene, betegnet som "skiver" ble utbløtt i 30 minutter i destillert vann, og en vandig 5 %-ig BrCN løsning ble tilsatt. Blandingen ble anbragt i et vannbad

ved en temperatur på ca. 2 0° C og omrørt i ca. 5 minutter. Under omrøring ble pH opprettholdt innen området 10,5 - 11,0 ved dråpe-vis tilsetning av 2 M NaOH. Blandingen ble helt over i ca. 2

liter 0,005 M NaHC03løsning ved 4° C og ytterligere blandet.

Den overliggende væske ble dekantert fra og skivene vasket gjen-tatte ganger med 0,005M NaHCO^ ved 4° C. og ble deretter vasket med 500 ml<1>s porsjoner av aceton (4°.C) , ble lufttørket og lagret ved -20° C.

D. Anti-humane lettkjede antistoffer koblet til aktivert substrat

Antistoffer utgjøres av kjeder av peptider, angitt som lettkjeder og tungkjeder. Lette kjeder har en molekylvekt på ca. 20 000, tunge kjeder har en molekylvekt på ca. 50 000. Selv om lette kjeder av rensede antistoffer er sterkt heterogene, er lette kjeder av myeloma proteiner (lymfoid svulst fra menneskelig benmarg) homogene. Pasienter som lider av myelomas utskiller et jevnt, homogent protein kalt Bence-Jones protein som er homogene lette kjeder.

Antihumane lett kjede antistoffer ble fremstilt og koblet til de aktiverte substrater ifølge avsnitt C som beskrevet i det etterfølgende. Antistoffer som er spesifikke overfor Bence-Jones protein ble innkjøpt fra Dako, Danmark som en immunoglobulin-fraksjon av et kanin-antisera. De anti-humane lettkjede antistoffer ble koblet til de aktiverte substrater fra avsnitt C ved incubering av antistoffene med substratene i ca. 1 time ved 5° C.

De uomsatte grupper ble blokkert med 3-ethanolaminløs-ning ved tilsetning av ca. 1 ml (3-ethanolaminløsning (0,05 M i

0,1 M NaHCO^). Blandingen ble omrørt i en mekanisk ryster (100 omdr. pr. minutt) i 3 timer. Løsningen ble fjernet og skivene

ble suksessivt vasket med en 2,5 ml porsjon av 0,1 M NaHCO^,

tre 2,5 ml porsjoner av 0,1 M acetatbuffer (pH = 4,0) og tre 7,5 ml porsjoner av PBS. Anti-lettkjedeskivene ble anvendt direkte etter fremstilling av disse.

E. WHO IgE referanseserum

Serumet er tilgjengelig fra Verdens Helseorganisasjon. Referanseserumet som ble anvendt ble betegnet som IgE (69/341), inneholdende 10 000 WHO-enheter (U) pr. ml.

Forbedret spesifikk bindingsprøvningsmetode

Fremstilling av materialer

F. Antigen (allergen) ekstrakter

Allergene ekstrakter på to satser av Dactylis g/lomerata pollen, (Cocksfoot/Orchard) (F/75 og M/76) ble erholdt fra Manufacturing Division of Miles Laboratories, Bridgend, som fryse-tørrede preparater og ble lagret ved -2 0° C.

G. Substrat-antigen

Pollenekstrakt M/76 fra avsnitt F ble koblet til det

aktiverte substrat fra avsnitt C som følger.

En 4 g's porsjon av det frysetørrede pollenekstrakt ble rekonstituert til 1 liter med fosfatbuffret saltvann (pH = 7,2). Allergenekstraktet ble bundet til de aktiverte papirskiver som følger. Ca. 100 g aktivert papirskiver (ca. 50 000 skiver) ble incubert med 4 g rekonstituert pollenekstrakt med mekanisk omrø-ring i ca. 20 timer. Den uomsatte pollenekstraløsning ble fjernet ved dekantering. De uomsatte grupper ble blokkert med 1 liter 0,05 M 3-ethanolamin i 3 timer. Etter blokkering ble skivene suksessivt vasket med en 1 liters porsjon av 0,1 M NaHCO^, tre 1 liters porsjoner av 0,1 M acetatbuffer (pH = 4,2) og fire 1 liters porsjoner PBS. De vaskede skiver ble oppdelt i 0,5 g's porsjoner og frysetørret før lagring ved -20° C.

H. Atopisk sera

En arbeidsfortynning av serumet som skulle anvendes som en kilde for IgE ble valgt for å gi den ønskede IgE binding, for bruk i allergenstyrkebestemmelsen som følger. Seriefortynninger av atopisk.sera ble incubert med en serie av aktiverte substrater med antigen bundet dertil (fremstilt som beskrevet i G). Etter vasking med 1 % tensidløsning i fysiologisk saltvann, ble skivene inkubert med fortynnet radiomerket anti-IgE, fremstilt som beskrevet i standardiseringsprosedyren. Det dannede produkt var et aktivert substrat med antigen, IgE og radiomerket anti-IgE bundet.

En parallellinkubering ble satt igang med anti-lettkjede aktiverte skiver. Den tidligere beskrevne prosedyre, angitt i det etterfølgende, ble fulgt under dannelse av en kalibreringskurve i hvilken de radioaktive slag fra det radiomerkede anti-IgE ble nedtegnet mot enhetene av IgE bundet til skivene, som bestemt fra de radioaktive slag fra radiomerket IgE. De anti-lett kjede aktiverte skiver med radiomerket<131>I IgE bundet dertil (fremstilt som beskrevet i avsnitt D) ble inkubert med radiomerket anti-IgE. Etter vasking ble strålingen fra skivene tellet i en gammateller. Som nedenfor forklart ble en dose-responskurve fremstilt for å anvendes til å velge den arbeidsfortynning av hvert serum som ga denønskede IgE-biding.

Titreringen av 3 sera ble utført. Et serum besto av en ansamling av sera fra 30 definert atopiske pasienter, alle føl-somme overfor gresspollen. Den andre og tredje ble erholdt fra individuelle pasienter, betegnet M.D. og C.W., hvor begge var allergiske overfor gresspollen.

For å oppnå korrekte resultater når det gjelder inhibering, må konsentrasjonen av pasient serum (IgE kilde) være mindre enn den konsentrasjon som ville mette det aktiverte substrat.

For å bestemme den konsentrasjon av serum som kan anvendes', ble forskjellige atopisk sera titrert med aktiverte substrater. En gruppe av kurver for IgE bindingen ble erholdt, som vist i fig. 3. Den nødvendige fortynning ble erholdt ved bestemmelse av den konsentrasjon som ga et skjønnsmessig definert standard nivå av IgE binding, betegnet som den aktiverte substratkapasitet, A. Denne A er vanligvis i størrelsesordenen 5 0 til 70 % av den maksimale binding av substratet. Ved foreliggende oppfinnelse er A defi--3

nert som værende 170 x 10 U (WHO enheter) IgE fordi dette ble funnet å være det optimale nivå for fordelaktig utførelse av arbeidet.

Prosedyre for bestemmelse av allergenstyrke

Bestemmelsen-av styrken av Dactylis glomerta allergen ble utført som beskrevet i det følgende. Allergenekstrakter fra avsnitt F ble rekonstituert i 1 ml inkuberingsbuffer (1 % BSA), 1 % tensid i PBS og seriefortynnet i bufferen. En 100 mikroliters porsjon av det fortynnede ekstrakt ble inkubert med 0,1 ml's porsjon av atopisk serum i 2 timer ved 20° C i trau. Det atopiske serum var hensiktsmessig fortynnet som tidligere beskrevet, slik at serumkonsentrasjonen var under den konsentrasjon som var nød-vendig for metning av de aktiverte skiver. Et substrat antigen

(skive) som fremstilt i avsnitt G, ble tilsatt til serum-allergen reaksjonsblandingen, og inkubert med blandingen i ytterligere 3 timer. Væskereagens ble suget bort og substratet antigen-IgE produktet ble vasket med fire 1 ml's porsjoner av 1 % tensid-fysiologisk saltvann. Det standardiserte radiomerkede anti-IgE

ble deretter tilsatt til substratantigen-IgE-produktet under dannelse av et tre-lags fast faseprodukt. Strålingen fra radiomerket anti-IgE ble deretter målt, og slagene omdannet til vekten av IgE-binding til anti-IgE ved referanse til kalibreringskurven i

fig. 2.

Aktiverte substrater ble inkubert med anti-lettkjede-antistoffer som beskrevet i avsnitt D. Skivene ble deretter incubert med varierende konsentrasjoner av radiomerket IgE i ca.

3 timer ved 2 0° C. Overskudd av reagens ble fjernet og skivene

ble vasket 4 timer med 1 % tensid i fysiologisk saltvann. Skivene ble deretter incubert i ca. 17 timer med radiomerket anti-IgE (fremstilt som beskrevet i avsnitt B).

Som tidligere beskrevet ble det fra prøving av radio-merket IgE, korrigert med WHO IgE referanseserum, konstruert en standardkurve. (Se fig. 1). Denne kurve ble anvendt for å bereg-ne konsentrasjonen av IgE tilstedeværende i radiomerket IgE.

Ved anvendelse av en kjent konsentrasjon av radiomerket IgE, ble den nøyaktige mengde av IgE-binding til anti-lettkjede skiver deretter beregnet ut fra strålingen. Da mengden av bundet IgE er

125

kjent, kan I slagene av det radiomerkede anti-IgE bundet ved etterfølgende inkubering med radiomerket anti-IgE korrigeres med den eksakte mengde av radiomerket IgE tilstedeværende og en kali-brer ingskurve kan fremstilles. (Se fig. 2).

Som tidligere beskrevet med Rast-metoden vil i spesifike bindingsprøvnings-inhiberingtestmetoder , etter som mengden av løselig antigen tilsatt til et fastfase aktivert substrat-antigen-IgE-kompleks økes, vekten av IgE-molekyler bundet til , fast-fase antigen avta, og prosenten av binding av anti-IgE til fast fase antigen (via IgE) vil avta. Allergenekstrakter kan deretter sammenlignes med hensyn til en relativ styrke ved er-holdelse og sammenligning av mengden av ekstrakt som er nødvendig for 5 0 % inhibering.

Når i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, skivekapasi-teten for binding av IgE angis som A, og hvis de bundne IgE-molekyler angis som b, vil ved enhver konsentrasjon av allergen, vekten av IgE forhindres fra binding uttrykkes ved A-b.

Ved en viss konsentrasjon av allergen er bindingen av IgE til skiven fullstendig inhibert ved nærvær av allergenekstraktet. Fig. 4 viser at ettersom mengden av tilsatt allergenekstrakt øker, vil mengden av IgE forhindret fra binding (A-b) også øke.

Fig. 4 viser at den maksimale mengde av antistoff som

er forhindret fra binding, ved økende mengder av tilsatt allergen--3

ekstrakt er i nærheten av 170 x 10 U IgE. Titreringen av et gitt serum ved anvendelse av standardisert merket anti-IgE i henhold til foreliggende oppfinnelse, muliggjør således at man kan utttykke allergenstyrken, uttrykt ved inhibering av binding, som standardenheter av IgE, dvs. U IgE.

Claims (1)

1. Fremgangsmåte for standardisering av en merket bestanddel, som er et konjugat av en første merket substans og en binde-bestanddel, og som er i stand til å reagere med en ligand, mot en ligand referansesubstans for bruk i en spesifikk bindingsprøv-ningsmetode, karakterisert ved trinnene:

   (a) inkubering av substrater med anti-lettkjede antistoffer bundet dertil med varierende konsentrasjoner av en ligand som er merket med en andre merkesubstans, hvori både mengden av tilstedeværende ligandprotein i merket ligand, representert ved den andre merkesubstans, og mengden av ligand referansesubstans ekvivalent med merket ligand protein, uttrykt ved mengden av merket tilstedeværende ligand, er kjent, i en tid tilstrekkelig til at det dannes en serie av produkter som er substrater med anti-lettkjede antistoffer bundet dertil, og variering av mengder av merket ligand bundet til anti-lett-kjedeantistoffer,

   (b) inkubering av produktene fra trinn (a) med den merkede bestanddel hvorved den merkede bestanddel er bundet til den merkede ligand,

   (c) måling av produktene fra trinn (b) og bestemmelse av mengden av merket ligand og merket bestanddel,

   (d) bestemmelse av tilstedeværende ligand protein i produktene fra trinn (b), basert på mengden av tilstedeværende merket ligand, ved hjelp av forholdet kjent fra (a), og

   (e) bestemmelse i produktene fra trinn (b) av mengden av tilstedeværende ligand protein, uttrykt ved ligand referansesubstans, hvorved den merkede bestanddel er standardisert uttrykt ved ligand bundet dertil, for bruk i en spesifikk bindingsprøv-ningsteknikk.

   .2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at de første og andre merkede substanser er valgt fra gruppen bestående av radioisotoper, fri radikaler, fluorescensmolekyler, luminiscente molekyler, bakteriofager, enzymer, coenzymér og enzym-inhibitorer.

   3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at merkesubstansene er radioisotoper.

   4 ; Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at merket anti-Ig er standardisert mot lg referanseserum.

   5. Fremgangsmåte for standardisering av en merket bestanddel som er et conjugat av en første merket substans og en bindekomponent og som er i stand til å reagere med en ligand, mot en ligand referansesubstans for bruk i en spesifikk bindingsprøvnings-metode, karakterisert ved at den omfatter trinnene:

   (a) omsetning av en ligand med en andre merkesubstans som er forskjellig fra den første merkesubstans, i et tidsrom tilstrekkelig til å merke liganden, hvorved den merkede ligand kan skilles fra den merkede bestanddel, og separering derfra uomsatt ligand,

   (b) bestemmelse av mengden av tilstedeværende ligand protein i den merkede ligand representert ved den andre merkesubstans,

   (c) bestemmelse av mengden av ligand referansesubstans ekvivalent med'det merkede ligahdprotein, uttrykt ved mengden av tilstedeværende merket ligand,

   (d) in kibering av en serie av aktiverte substrater med anti-lett kjede antistoffer i et tidsrom tilstrekkelig til å danne en serie av produkter som er substrater med anti-lettkjede antistoffer bundet dertil,

   (e) inkubering av produktene fra trinn (d) med varierende konsentrasjoner av den merkede ligand fra trinn (a) i et tidsrom tilstrekkelig til å danne en serie av produkter som er substrater med varierende mengder av anti-lettkjede-antistoffer bundet dertil, og varierende mengder av merket ligand bundet til anti-lettkjedeantistoffene,

   (f) in>kubering av produktene fra trinn (e) med den merkede' bestanddel hvorved den merkede bestanddel er bundet til den merkede ligand,.

   (g) måling av produktene fra trinn (f), og bestemmelse av mengden av merket ligand og merket bestanddel,

   (h) bestemmelse av tilstedeværende ligandprotein i produktene fra trinn (f), basert på mengden av tilstedeværende merket ligand, ved hjelp av forholdet bestemt i (b), og

   (i) bestemmelse i produktene fra trinn (f) av mengden av tilstedeværende ligandprotein, uttrykt ved ligand referansesubstans, hvorved den merkede bestanddel er standardisert uttrykt ved ligand bundet dertil, for bruk i en spesifikk bindingsprøv-ningsteknikk.

   6. Fremgangsmåte for standardisering av en radiomerket bestanddel som er et conjugat"av en første radioisotop og anti-IgE og som er i stand til å reagere med IgE, mot IgE referansesubstans for anvendelse i en spesifikk bindingsprøvningsmetode, karakterisert ved at den omfatter trinnene:

   (a) inkubering av substrater med anti-lettkjede antistoffer bundet dertil med varierende konsentrasjoner av IgE som er merket med en andre radioisotop, hvori både mengden av IgE-protein tilstedeværende i det merkede IgE, representert ved den andre merkesubstans, og mengden av IgE-referansesubstans ekvivalent med merket IgE-protein, uttrykt ved mengden av merket tilstedeværende IgE er kjent, i et tidsrom tilstrekkelig til å danne en serie av produkter som er substrater med varierende mengde av anti-lettkjede-antistoffer bundet dertil, og varierende mengder av merket IgE bundet til de anti-lettk jede-antistof f er ,

   (b) inkubering av produktene fra trinn 8a) med den merkede bestanddel hvorved den merkede bestanddel bindes til den merkede IgE,

   (c) måling av produktene fra trinn (b), og bestemmelse av mengden av merket IgE og merket bestanddel,

   (d) bestemmelse av tilstedeværende IgE-protein i produktene fra trinnene (b), basert på mengden av tilstedeværende merket IgE, ved hjelp av forholdet kjent fra (a), og

   (e) bestemmelse i produktene fra trinn (b) av mengden av tilstedeværende IgE-protein, uttrykt ved IgE-referansesubstans, hvorved den merkede bestanddel er standardisert utttykt ved IgE bundet dertil, for bruk i en spesifikk bindingsprøvnings-teknikk.

   7. Fremgangsmåte forstandardisering av en radiomerket bestanddel som er et conjugat av en første radioisotop og anti-IgE og som er i stand til å reagere med IgE, mot IgE referansesubstans for bruk i en spesifikk bindingsprø vningsmetode, karakterisert ved at den omfatter trinnene:

   (a) omsetning av IgE med en andre radioisotop som er forskjellig fra den første radioisotop i et tidsrom tilstrekkelig til å radiomerke IgE, hvorved den radiomerkede IgE kan skilles fra radiomerket anti-IgE, og separering derfra uomsatt IgE (b.) bestemmelse av mengden av tilstedeværende IgE-protein i radiomerket IgE, representert ved den målte radioaktivitet, (c) bestemmelse av mengden av IgE-referansesubstans ekvivalent med radiomerket IgE-protein, uttrykt ved mengden av radio-merket tilstedeværende IgE,

   (d) inkubering av en serie av aktiverte substrater med anti-lettkjede antistoffer i et tidsrom tilstrekkelig til å danne en serie av produkter som er substrater med anti-lettkjede antistoffer bundet dertil,

   (e) inO-cubering av produktene fra trinn (d) med varierende konsentrasjoner av radiomerket IgE fra trinn (a) i et tidsrom tilstrekkelig til å danne en serie av produkter som er substrater med anti-lettkjede-antistoffer bundet dertil, og varierende mengder av radiomerket IgE bundet til de anti-lettkjede-antistoffer,

   (f) incubering av produktene fra trinn (e) med det radiomerkede anti-IgE, hvorved radiomerket anti-IgE bundet til radiomerket IgE,

   (g) måling av radioaktiviteten til produktene fra trinn (f) og bestemmelse av de radioaktive slag som skyldes henholdsvis IgE og anti-IgE,

   (h) bestemmelse av tilstedeværende IgE-protein i produktene fra trinn (f) basert på mengden av radiomerket tilstedeværende IgE, ved hjelp av forholdet bestemt i (b), og

   (i) bestemmelse i produktene fra trinn (f) av mengden av tilstedeværende IgE-protein, uttrykt ved IgE- referansesubstans, hvorved radiomerket anti-IgE er standardisert uttrykt ved IgE bundet til radiomerket anti-IgE, for bruk i en spesifikk bindingsprøvningsteknikk.

   8. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert

   125

   ved at den første radioisotop er Na I.

   9. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at den andre radioisotop er Na 131I.

   10. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at IgE-referansesubstansen er Verdens Helseorganisasjons.

   referanseserum.

   11. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at mengden av tilstedeværende IgE-protein i radiomerket IgE i trinn (b) bestemmes ved dobbel antistoff-konkurrerende inhibering av IgE-referanseserum.

   12. Spesifikk bindingsprøvningstest som innbefatter binding av en ligand og en merket bestanddel som er et conjugat av en første merkesubstans og en bindekomponent, og hvori liganden også er bundet til et aktivert substrat, karakterisert ved at liganden merkes med en andre merkesubstans som er forskjellig fra den første merkesubstans i den merkede - bestanddel, hvorved den merkede ligand som skilles fra den merkede bestanddel, og at den merkede bestanddel kalibreres mot den merkede ligand, med referanse til en egnet valgt ligand referansesubstans.

   13. Fremgangsmåte ifølge krav 12, karakterisert ved at den første og andre merkesubstans er valgt fra gruppen bestående av radioisotoper, fri radikaler, fluorescente molekyler, luminescente molekyler, bakteriofager, enzymer, coenzymer og enzym-inhibitorer.

   14. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert ved at merkesubstansen er radioisotoper.

   15. Fremgangamåte ifølge krav 12, karakterisert ved at liganden er valgt fra gruppen bestående av IgE, IgG, IgA, IgM og IgD, og at bindekomponenten er valgt fra gruppen bestående av anti-IgE, anti-IgG, anti-IgA,. anti-IgM og anti-IgD.

   16. Fremgangsmåte ifølge kray 15, karakterisert ved at liganden er IgE.

   17. Fremgangsmåte ifølge krav 15, karakterisert ved at bindekomponenten er anti-IgE.

   18. Spesifikk bindingsprøvnings-inhiberingsmetode for bestemmelse av styrken av et allergenekstrakt, hvilket innbefatter binding av IgE og en merket bestanddel som er et conjugat av en første merkesubstans og anti-IgE, ved hvilken fremgangsmåte det dannes et fastfase-aktivert substrat som har bundet dertil et produkt som er en allergen - IgE - merket bestanddel, slik at ettersom mengden av tilsatt løselig allergen økes, avtar mengden av IgE bundet til fastfase-allergen, karakterisert ved trinnene:

   (a) bestemmelse av bindingingskapasiteten for aktivert substrat-allergen og utvelgelse av en arbeidsfortynnelse av IgE som er mindre enn den konsentrasjon som er istand til å mette det aktiverte substrat,

   (b)' omsetning av IgE med en andre-merkesubstans-som er forskjellig fra den første merkesubstans anvendt i"den merkede bestanddel, i et tidsrom tilstrekkelig til å merke IgE, hvorved merket IgE kan skilles fra den merkede bestanddel,

   (c) inkubering av de aktiverte substrater med anti-lettkjede-antistof f er, merket IgE og den merkede bestanddel under reaksjonsbetingelser som er hovedsakelig de samme som de reaksjonsbetingelser som anvendes for å danne allergen - IgE - merket bestanddel,

   (d) bestemmelse av mengdene av merket IgE som er i stand til å bindes til forskjellige mengder av merket bestanddel, uttrykt ved en standard IgE-referansesubstans, og

   (e) bestemmelse av tilstedeværende IgE-protein i allergen - IgE - merket bestanddel ved referanse til forholdet bestemt i trinn (d), hvorved mengden av IgE inhibert av det lø selige allergen bestemmes.

   19. Fremgangsmåte ifølge krav 18, karakterisert ved at merkesubstansene er valgt fra. gruppen bestående av radioisotoper, frie radikaler, fluorescente molekyler, luminiscente molekyler, bakteriofager, enzymer, coenzymer og enzym-inhibitorer.

   20. Fremgangsmåte ifølge krav 19, karakterisert ved at merkesubstansene er radioisotoper.

   21. Fremgangsmåte ifølge krav 18, karakterisert ved at IgE er. merket med Na <131> I og anti-IgE er merket med Na <125> I.

   22. Fremgangsmåte ifølge krav 18, karakterisert ved at standard IgE-referansematerialet er Verdens Helseorganisasjons IgE.

   23. Fremgangsmåte ifølge krav 18, karakterisert ved at mengden av tilstedeværende IgE-protein i merket IgE betem-mes ved dobbelt antistoff-konkurrerende inhibering av IgE-referansematerialet.

   24. Spesifikk bindingsprøvningsinhiberingsmetode for bestemmelse av styrken av et allergenekstrakt som innbefatter binding av IgE og en radiomerket bestanddel som er et konjugat av en første radioisotop og anti-IgE, og ved hvilken det dannes et fast fase-aktivert substrat som har bundet dertil et produkt som er et allergen - IgE - anti-IgE, slik at etter som mengden av tilsatt løse-lig allergen økes, avtar mengden av IgE bundet til fast-fase-allergen, karakterisert ved at den omfatter trinnene:

   (a) bestemmelse av bindingskapasiteten til det aktiverte substrat-allergen og utvelgelse av en arbeidsfortynnelse av IgE som er mindre enn den konsentrasjon som er i stand til å mette det aktiverte substrat,

   (b) omsetning av IgE med en radioisotop som er forskjellig fra den første radioisotop, i et tidsrom tilstrekkelig til å merke IgE, hvorved radiomerket IgE kan skilles fra den radiomerkede bestanddel,

   (c) inkubering av det aktiverte substrat med anti-lettkjede antistoffer, radiomerket IgE og den radiomerkede bestanddel under reaksjonsbetingelser som er i hovedsaken de samme som de reaksjonsbetingelser som anvendes for å danne allergen - IgE - radiomerket bestanddel,

   (d) bestemmelse av mengdene av radiomerket IgE som er i stand til å binde til forskjellige mengder.av radiomerket bestanddel, uttrykt ved en standard IgE-referansesubstans, og

   (e) bestemmelse av mengden tilstedeværende IgE i radiomerket IgE ved referanse til forholdet bestemt i trinn (d), hvorved mengden av IgE inhibert av løselig allergen bestemmes.