DE2900546A1 - Spezifische bindungstest-verfahren - Google Patents

Description

HOFFMANN · 35ITLK Sl PARTNER 2900546

PAT JB N TAN WALTE ®

DR. ING. E. HOFFMANN (1930-1976) . DIPL.-l N G. W.EITLE · O P.. RER.NAT. K. HOFFMAN N · Dl PL.-I NG. W. LEHN

DIPL.-ING. K. FOCHSLE · DR. RER. NAT. B. HANSEN ARABiHLLASTRASSE 4 (STERNHAUS) · D-8000 MD NCH EN 81 · TELEfOH (OB?) J11087 · TELEX 05-29619 (PATH E)

31 572 m/wa

MILES LABORATORIES INC., ELKIIART, INDIANA / USA

Spezifische Bindungstest-Verfahren

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Standardisieren einas markierten Bestandteiles, welcher ein Konjugat aus einer ersten Markierungssubstanz und einer Bindungskornponente darstellt und der bei einem spezifischen Bindungstest verwendet wird. Die Erfindung betrifft ausserdem ein Verfahren zur Verwendung des standardisierten markierten Bestandteiles in spezifischen Bindungstest-Verfahren, d.h. zur Bestimmung der Allergen-Wirksamkeit und zur Bestimmung der Menge des Liganden, der in Körperflüssigkeiten vorliegt.

- 15 -

909835/0527

Überempfindliche Menschen erfahren einen "veränderten Zustand" , wenn sie in Kontakt mit den Antigenen aus einem Allergen kommen, was zur Bildung von Antikörpern gegen dieselben führt. Ein darauffolgender Kontakt mit einem jener Antigene oder einer strukturell ähnlichen Substanz kann bei einem allergisch reagierenden Menschen eine pathologische Reaktion hervorrufen, was auf die Anwesenheit derartiger Antikörper zurückzuführen ist. Wenn diese Menschen das in Frage kommende Antigen einatmen oder es durch die Nahrung aufnehmen, so ergeben sich als auffallende und übliche Manifestationen. Heuschnupf en, Asthma oder Nesselausschlag. Diese Antikörper sensibilisieren das Gewebo und können als Reagin Ig bezeichnet werden. Es gibt fünf Klassen von Antikörpern: IgE, IgG, IgA, IgM und IgD. IgE bildet die Klattse von Antikörpern, die besonders für atopische Allergien vereintwortlich ist.

In-vivo-diagnostische Testsauf Atopie, d.h. die Bestimmung der Anwesenheit von IgE, das als Reaktion auf Allergen gebildet wurde, werden im allgemeinen durch Injizierung kleiner Mengen des vermutlichen Allergens in die Haut des -empfindlichen Menschen durchgeführt; daraufhin wird die Injektionsstelle untersucht, ob sich auf der Haut derselben ein unxegelmässiges Pustel bzw. Quaddel bildet, welches von einer Erythämiezone \imgeben ist. Neben den in-vivo-Versuchen wurden auch in-vitro-diagnostische Tests entwickelt. Eine Art der in-vitro-diagnostisehen Verfahren umfasst analytische Verfahren, die im breiten Sinne als "spezifische Bindungsteste" klassifiziert werden können.

Im Hinblick auf in-vitro-diagnostische Tests auf Atopie umfassen die Verfahren zur Durchführung spezifischer Bindungstest den Nachweis eines Liganden in einer Körperflüssigkeit.

- 16 -

909 8 35/0527

Ein typisches Verfahren eines spezifischen Bindungstests besteht in der Bestimmung der IgE-Antikörper (Ligand) im Blutserum eines überempfindlichen Menschen. US-PS 3 720 betrifft einen diagnostischen in-vitro-Test. Dieses von der Anmelderin offenbarte Verfahren wird im allgemeinen als "RAST" (radioallergosorbent test) bezeichnet.

Um den Umfang der vorliegenden Erfindung zu erläutern, wird das RAST-Verfahren hier im Detail beschrieben. Der Test besteht aus einem ersten Schritt, bei dem ein Test-Allergen (Antigen) an ein unlösliches polymeres Substrat unter Bildung eines gebundenen Festphasen-Antigens gebunden wird. Der zweite Schritt umfasst das Inkontaktbringen des Festphasen-Antigens mit dem Serum eines atopischen Individuums (bei dem IgE-Antikörper vorliegen); dabei stellt IgE den im vorhergehenden angesprochenen Liganden dar. Das IgE haftet bzw. verbindet sich mit dem IgE-Rezeptorzentrum des Antigens unter Bildung eines Antigen-Liganden-Komplexes. Im dritten Schritt wird der Komplex mit einem markierten Bestandteil in Kontakt gebracht, wobei dieser markierte Bestandteil ein Konjugat aus einer Markierungssubstanz und einer Bindungskomponente (die in der Lage ist, eine Bindung mit dem Liganden einzugehen), d.h. radiomarkiertes Anti-IgE, darstellt.

Das im nachfolgenden näher beschriebene RAST-Reaktionsprodukt kann wie folgt dargestellt werden

- 17 -

909835/0527

2300546

spezifisches radiomarkiertes IgE Anti-IgE

Allergen (Antigen) auf einem unlöslichen Träger

Als Markierungssubstanzen lassen sich verschiedene Stoffe verwenden. Infolge der Gefährlichkeit und Schwierigkeit bei der Handhabung radioaktiver Materialien wurden zahlreiche neue Testsysteme, die als Systeme vom"RAST-Typ" bezeichnet werden können, entworfen, wobei keine radioaktiven Isotopen als Markierungssubstanz verwendet werden. Beispiele von Markierungssubstanzen umfassen freie Radikale, fluoreszierende Moleküle (z.B. Fluorescein-Isothiocyanat und Rhodamin-Farbstoffe), lumineszierende Moleküle, Bakteriophagen, Enzyme, Coenzyme und Enzyminhibitoren.

Antikörper setzen sich in der Regel aus vier Ketten zusammen, und zwar aus zwei sogenannten leichten und zwei schweren Ketten. In beiden Kettentypen besteht ein konstanter Bereich und ein variabler Bereich, d.h. die Aminosäuresequenz des Bereiches ist jeweils verhältnismässig konstant oder variabel. Die Aminosäuresequenz des variablen Bereichs richtet sich nach der Identität des Antigens, gegen welches derselbe gerichtet ist; der variable Bereich des Antikörper-Moleküls, der mit dem Antigen bindet, wird vom Antikörper-Bindungsfragment (Fab), welches durch Eapain-Abbau erhalten wird, umfasst. Der konstante Bereich variiert nicht in Abhängigkeit vom Antigen. gegen welches das Antikörper-Molekül gerichtet ist, sondern ist für eine bestimmte Antikörper-Klasse charakteristisch. Ein Teil des konstanten Bereiches der schweren Kette bildet das

- 18 -

909835/0527

andere Fragment (Fc), das beim Papain-Abbau freigesetzt wird.

Papain- \ konstanter

abbau Y-LLLLl Bereich

γ ι 1 variabler

leicht I I///////777777] < ' ' ' ^Bereich

i ι

j; i

^SCHWER ι '777////////// πι π inmn ιιππ ν/7771 ; ι ?

SCHiJER I TTTl 111111111Π111111111111111111ΓΤΤΆ

I !

leicht Γ VHTIIIIIIIIn ι

I I

Fab Fc

IgE bindet an das Antigen über den Antikörper-Fragment-(Fab) ■ Bereich des Antigen-Moleküls, wobei der Fc-Bereich freibleibt. Das radiomarkierte Anti-IgE bindet dann an das IgE über den Fc-Bereich von IgE.

Das RAST'-ReaKtionspjTodüKt/ uuä iiu voisnycncnusn a*üo-gG2Sicn~ net wurde, stellt ein Substrat dar, an das drei "Schichten" gebunden sind: (1) Festphasen-Antigen: (2) IgE, das sich spezifisch gegen das Antigen richtet und (3) radiomarkiertes

-

909835/0527

Anti-IgE, das spezifisch mit IgE reagiert. Die vom radiomarkierten Reaktionsprodukt herrührende radioaktive Strahlung ist ein Mass für die Menge des vorhandenen antigenspezifischen IgE im Testserum. Die Verwendung von RAST erlaubt, wie dies oben beschrieben wird, die Bestimmung des Vorliegens und zu einem begrenzten Masse - die Bestimmung der Menge des im Serum des Patienten vorliegenden IgE, welches in der Lage ist, mit dem an das Substrat gebundene Antigen zu reagieren. Dieser Test gibt zusammen mit Hauttests eine Indikation, ob der Patient gegenüber einem Antigen allergisch reagiert oder nicht.

Nach Diagnose einer Atopie wird üblicherweise zur Behandlung der allergischen Störung eine Immunisierung ("Desensibilisierung") des Individuums mit Hilfe einer Reihe von Injektionen von langsam zunehmenden Mengen an Allergenextrakten durchgeführt. Infolge der Gefahr des Auslösens eines anaphylaktischen Schocks müssen die verabreichten Mengen an Allergenextrakt sorgfältig kontrolliert werden.

Schwankungen in der Wirksamkeit des verabreichten Allergenextraktes, wie dies bei Messungen der Reaktivität auf der Haut der empfindlichen Menschen induziert wird, wurden beobachtet. Diese Schwankungen in der Wirksamkeit machen es wünschenswert, eine Verbesserung des Standardisierens von Allergenextrakten zu erreichen. Es wird angenommen, dass Schwierigkeiten beim Standardisieren von Allergenextrakten dadurch entstehen, dass Allergenextrake (z.B. Blütenstaub) im allgemeinen komplexe Gemische darstellen und es ist schwierig zu bestimmen, welche Bestandteile für das Auslösen einer allergenen Reaktion oder eines therapeutischen Effektes während der Therapie verantwortlich sind. Die Verfahren, um die

- 20 -

90983B/0B27

Wirksamkeit derselben auszudrücken, sind weitgehend indirekt und basieren entweder auf dem einfachen Verhältnis des rohen Ausgangsmaterials zum Volumen an Extraktionsflüssigkeit oder sie basieren auf dem Proteinstickstoffgehalt des Extraktes. Da offensichtlich die meisten Allergene proteinartiger Natur sind, wurde eine Bestimmung der Wirksamkeit durch Proteinstickstoff-Einheiten (PNU),definiert als 0,01 ug Phosphorwolframsäure-präzipitierbarem Stickstoff, weitgehend akzeptiert. Der PNU-Gehalt ist jedoch nicht notwendigerweise mit der biologischen Aktivität vergleichbar, da Allergenextrakte Proteine enthalten können, die nicht als Allergen wirksam sind. Ausserdem können spezifische Proteinallergene während der Extraktion oder während der Lagerung denaturiert werden, wodurch sich ein Verlust ihrer biologischen Aktivität ergibt, wohingegen sie bei der chemischen Bestimmung als Protein vorliegen und mitgerechnet werden.

Eine zweite Anwendung von Bindungstest-Verfahren, wie sie RAST darstellt, besteht in der Bestimmung der Wirksamkeit von Allergenen in dem Versuch, Allergene, die bei diagnostischen Hauttesten und in der in-vivo-Desensibilisierung Verwendung finden, zu standardisieren. Dieses Verfahren wird durchgeführt, indem die zweiten und dritten Schichten (nämlich IgE und markiertes Anti-IgE) konstant gehalten werden und im ersten Schritt zunehmende Mengen an löslichem Antigen zugegeben werden. Das Prinzip dieser Methode, das nachfolgend in der Zeichnung dargestellt wird, basiert auf einer Kompetition zwischen Antigenen der festen und flüssigen Phase an IgE-Rezeptorzentren im ersten Schritt von RAST. Mit der Zunahme der Menge an löslichem Antigen komplexiert eine kleinere Menge IgE mit dem Festphasen-Antigen, was auf eine zunehmende Komplexbildung zwischen dem Antigen der flüssigen

- 21 -

909835/0527

Phase und IgE zurückzuführen ist. Dies wiederum lässt die prozentuale Bindung des radiomarkierten Anti-IgE an das Festphasen-Antigen im dritten Schritt von PAST abnehmen. Diese Abnahme in Prozent Bindung von Anti-IgE an Festphasen-Antigen führt zu einer Abnahme der von der Festphase emittierten. Strahlung.

Festphasen-Antigen

IgE
(Reagin-Antikörper)

lösliches Antigen

Ausgehend von 100 % Bindung kann durch Sorgfaltj ge Titration die Menge an löslichem Antigen bestimmt werden, die erforderlich ist, um 50 % Inhibierung der Bindung zu erreichen. Durch Aiaftragen der Menge an erforderlichem, löslichen Antigen

- 22 -

909835/0527

gegen die gebildete Inhibierung (auf halblogarithhmischem Papier) kann eine annähernd lineare Beziehung aufgestellt werden. Insbesondere im Bereich von 30 bis 70 % Inhibierung ist der halblogarithmische Kurvenverlauf weitgehend linear. Der Endpunkt dieser Titrationen kann willkürlich bestimmt werden als die Menge an Allergenextrakt, die für 50 % Inhibierung erforderlich ist. Theoretisch würde der Vergleich einer Reihe von Allergenextrakten ausreichende Vergleichsdaten bringen, um eine Standardisierung der Extrakte durchzuführen (J. Allergy Clin. Immunol. 53 (1974), Seiten 158-169). Wie nachfolgend beschrieben wird, zeigt dieses Verfahren eine Reihe von Nachteilen.

Ein Nachteil liegt im Anti-IgE selbst. Das beim RAST schliesslich verwendete Reagenz, das radiomarkierte Anti-IgE, wird durch Radiomarkierung mit einem radioaktiven Jodidsalz hergestellt:- Auf diese Weise wird ein radiomarkiertes Anti-IgE mit einer Halbwertszeit gebildet, die kurz genug ist, um die notwendige Empfindlichkeit für eine Messung bei niedrigen Konzentrationen von IgE zu gewährleisten. Diese kurze Halbwertszeit bedeutet jedoch, dass sich das radiomarkierte Anti-IgE schnell verändert, wodurch dessen Verwendung als ein Standardreferenzreagenz über einen längeren Zeitraum hinweg nicht möglich ist. Darüber hinaus entstehen durch harte Jodierungsbedingungen und darauffolgende Strahlungsschäden während dem Radiomarkierungsverfahren Variationen in dem radiomarkierten Anti-IgE. Aufgrund dieser Variationen ist es nicht möglich, zwei Bestimmungen, die zu verschiedenen Zeiten durchgeführt wurden, direkt zu vergleichen, indem die gleiche Charge des radiomarkierten Anti-IgE verwendet wird oder indem zum gleichen Zeitpunkt verschiedene Chargen von radiomarkiertem Anti-IgE verwendet.werden. Durch Standardisierung

- 23 -

909835/0527

2300546

des radiomarkierten Anti-IgE gemäss der Erfindung werden diese Nachteile verhindert.

Eine Standardisierung durch RAST-Inhibierung ergibt andere Nachteile. RAST selbst stellt keine standardisierte Methode dar. In typischer Weise werden Radioimmunobestiiamungen durch Schaffung festgesetzten, gut definierten Referenzreagenzes, entweder eines Antigens oder eines Antikörpers standardisiert .Allergene stellen jedoch komplexe Mischungen dar, die sich nicht gut definieren lassen; ausserdem ist ihre Stabilität nicht eindeutig bekannt. Auf diese Weise kann jedoch durch dieses Verfahren RAST nur teilweise standardisiert werden. Es wurde jedoch vorgeschlagen (J. Allergy Clin. Immunol. 53 (1974), Seiten 158-169), dass Serum von atopischen Individuen als Referenzreagenz für die häufiger auftretenden Allergien verwendet werden könnte. Aber auch dies würde nur eine teilweise Standardisierung von RAST ergeben, da Serum ein komplexes Gemisch mit schlecht definierten Antikörperspezifitäten darstellt. Trotz der inhärenten Schwierigkeiten wurde eine bevorzugte Vervrendung atopischer Seren beim direkten RAST-Verfahren vorgeschlagen (Advances in Diagnosis of Allergy: RAST, Seiten 85-99, Symposium specialists (1975)).

Theoretisch könnte das im dritten Schritt von RAST verwendete radiomarkierte Anti-IgE dadurch standardisiert werden, indem die ersten und zweiten Schichten konstant gehalten werden und man das radiomarkierte Anti-IgE in der dritten Schicht vergleicht. Das standardisierte radiomarkierte Anti-IgE könnte dann dazu verwendet werden, das RAST-Verfahren selbst zu standardisieren. Eine Standardisierung von Anti-lgE-RAST mit standardisiertem radiomarkierten Anti-IgE wäre nützlich, indem ein Standardreagenz verwendet werden könnte, ungeachtet des in

- 24 -

909835/0527

29Q0546

der ersten Schicht vorliegenden Allergenextraktes. Da jedoch die Reagentien, die in den ersten zwei RAST-Schritten verwendet werden, komplexe Gemische von schlecht definierter Stabilität darstellen, ist es schwierig, diese Schritte von einem Experiment zum nächsten präzise zu reproduzieren. Da es auch Schwierigkeiten bereitet, die Aktivität von radiomarkierten Anti-IgE-Proben präzise zu definieren, könnte dieses Reagenz nicht ohne weiteres als Referenzstandard verwendet werden.

Wie bereits im vorhergehenden ausgeführt, stellt die Radioimmunobestimmung eine wichtiges Beispiel eines Bindungstestes unter Verwendung einer markierten Verbindung dar, wie z.B. die Radioallergosorbent-(RAST)-Verfahren. Alternative markierte Materialien, die ebenfalls vorgeschlagen wurden, sind freie Radikale, fluoreszierende Moleküle, lumineszierende Moleküle, Bakteriophagen, Enzyme, Coenzyme oder Enzyminhibitoren. Es bestehen ähnliche Schwierigkeiten zur Definition der Aktivität eines jeglichen markierten Materials, ungeachtet des Materials, gegen das es gerichtet ist, oder des Typs der verwendeten markierten Verbindung.

Ceska und Lundvkist beschreiben in "Immunochemistry", 2 (1972), Seiten 1021-1030 einen dreischichtigen Festphasen-Test für nicht-spezifisches IgE. Die erste Schicht besteht aus nichtmarkiertem Anti-IgE; die zweite Schicht ist das untersuchte IgE und die dritte Schicht besteht aus markiertem Anti-IgE. Dieses Verfahren kann nicht dazu verwendet werden, markierte Bestandteile zuü Verwendung in einem spezifischen Bindungstest zu standardisieren, da das Festphasen-Anti-IgE der ersten Schicht teilweise sterisch die darauffolgende Bindung des markierten Anti-IgE der dritten Schicht hindert. Eine sterische

- 25 -

909835/0527

2300546

Hinderung tritt dann ein, wenn das Festphasen*-Anti-IgE der ersten Schicht einige Moleküle IgE auf eine solche Weise bindet, dass diese zur Bindung des markierten Anti-IgE der dritten Schicht nicht verfügbar sind. Eine sterische Hinderung ist bei spezifischen Bindungstest-Verfahren unerwünscht. Die vorliegende Erfindung offenbart und beansprucht die Verwendung eines Standardisierungsverfahrens, welches ein Modellsystem von Anti-L(leicht)-Ketten-Antikörpern in einem dreischichtigen Festphasen-Testsystem einschliesst. Es besteht kein Hinweis bzw. keine Offenbarung durch die Autoren zur Verwendung eines Modellsystems von Anti-L-Ketten-Antikörpern zur Standardisierung eines markierten Bestand- · teiles, wie markiertem Anti-IgE.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Standardisierung eines markierten Bestandteiles in einem spezifischen Bindungs-Testverfahren zur Verfügung zu stellen. Ausserdem ist es Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Verwendung des standardisierten markierten Bestandteiles in spezifischen Bindungs-Testverfahren, z.B. zur Bestimmung der Allergenwirksamkeit und zur Bestimmung der Menge des in Körperflüssigkeiten vorliegenden Liganden zu schaffen.

Die vorstehende Aufgabe wird erfindungsgemass dadurch gelöst, dass eine Methode zur Standardisierung eines markierten Bestandteiles , welcher ein Konjugat aus einer ersten Markierungssubstanz und einer Bindungskomponente darstellt, wobei dieser markierte Bestandteil in der Lage ist, mit einem Liganden zu reagieren yegen eine Liganden-Referenzsubstanz zur Verwendung in einem spezifischen Bindungstest-Verfahren, zur Verfügung gestellt wird. Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte:

- 26 -

90983 5/052?

2900S46

(a) Inkubieren von Substraten, an welche Anti-L(leicht)-Ketten-Antikörper gebunden sind, mit variierenden Konzentrationen eines Liganden, der mit einer zweiten Markierungssubstanz markiert ist, wobei sowohl die Menge des im markierten Liganden vorliegenden Ligandenproteins, dargestellt durch die zweite Markierungssubstanz , und die dem markierten Ligandenprotein äquivalente Menge an LigandenrReferenzsubstanz, als Mass der vorliegenden Menge an markiertem Liganden bekannt sind, wobei die Inkubation solange durchgeführt wird, dass sich eine Reihe von Produkten bildet, welche Substrate mit anhaftenden bzw. gebundenen Anti-L-Ketten-Antikörpern darstellen, und wobei variierende Mengen an markiertem Liganden an diesen Anti-L-Ketten-Antikörpern hängen;

(b) Inkubation der Produkte von Schritt (a) mit dem markierten Bestandteil, wodurch der markierte Bestandteil an den markierten Liganden gebunden wird;

(c) Bestimmung der Produkte von Schritt (b) und Bestimmung der Menge an markiertem Liganden und markiertem Bestandteil;

(d) Bestimmung des Ligandenproteins, welches in den Produkten von Schritt (b) vorliegt, bezogen auf die Menge an vorliegendem markierten Liganden mit Hilfe des aus (a) bekannten Verhältnisses; und

(e) Bestimmung der Menge an vorliegendem Ligandenprotein in den Produkten von Schritt (b), ausgedrückt als Liganden-Referonzsubstanz, wodurch der markierte

- 27 -

909835/0527

Bestandteil in bezug auf den an diesen gebundenen Liganden standardisiert wird, zur Verwendung in einem spezifischen Bindungs-Testverfahren.

Ausserdem wird durch die vorliegende Erfindung eine Verbesserung des spezifischen Bindungs-Testverfahrens zur Verfügung gestellt, wobei letzteres die reversible, nicht-kovalente Bindung eines Liganden und eines markierten Bestandteiles umfasst, welcher ein Konjugat aus einer ersten Markierungssubstanz und einer Bindungskomponente darstellt, und welcher sich mit dem Liganden umsetzt, wodurch der Ligand ebenfalls an ein aktiviertes Substrat gebunden wird, dadurch gekennzeichnet, dass . zur Markierung des Liganden eine zweite Markierungssubstanz verwendet wird, wobei sich diese zweite Markierungssubstanz von der ersten Markierungssubstanz des markierten Bestandteiles unterscheidet, wodurch der markierte Ligand von dem markierten Bestandteil unterschieden werden kann, und der markierte Bestandteil gegen den markierten Liganden kalibriert wird in bezug auf eine geeignete Liganden-Referenzsubstanz.

Fig. 1 stellt eine Standardkurve (aufgetragen auf logit gegen log-Achsen) zur Bestimmung der IgE-Menge, ausgedrückt in World Health Organization-(WHO)-Einheiten;

1 25 Fig. 2 ist eine Kalibrierungskurve der Bindung von I-markiertem Anti-IgE an IgE auf Anti-L-Ketten-Scheiben;

Fig. 3 stellt grafisch eine Titration von atopischen Seren auf Allergen-Scheiben zur Bestiinnung der für den

- 28 -

909835/0527

Versuch erforderlichen Verdünnung des Serums dar; die Kapazität der Scheibe (/\) beträgt 170 x1O~³ ü IgE);

Fig. 4 -ist eine grafische Darstellung einer Titration von zwei verschiedenen Allergenextrakten durch spezifische Bindungstest-Inhibierung, unter Verwendung eine

und

eines atopischen Serums; (ΛΕ) = 170 χ 10 U IgE);

Fig. 5 stellt eine schematische Darstellung der Bestimmung der Allergenwirksamkeit gemäss der Erfindung dar.

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Standardisieren eines markierten Bestandteiles zur Verfügung. Gemäss der Erfindung wird ein markierter Bestandteil, wie z.B. Antilg, als international oder national anerkanntes Referenz-Ig standardisiert, ausgedrückt in internationalen oder nationalen Einheiten. Das standardisierte markierte Anti-Ig kann in spezifischen Bindungstests verwendet werden. Zum Beispiel kann standardisiertes, markiertes Anti-IgE in spezifischen Bindungs-Test verfahr en, wie in Radioallergosorbent-Verfahren (RAST) zur Standardisierung von Allergenextrakten (Antigenen) verwendet werden. Das standardisierte markierte Anti-Ig kann ebenfalls zur Bestimmung der Menge der in Körperflüssigkeiten vorliegenden Ig-Antikörpern, z.B. in atopischem Serum vorliegenden IgE-Antikörpern, verwendet werden.

Wie im vorangehenden erläutert, besitzen Antikörper-Moleküle am Ende des Moleküles ein Antigen-Bindungsvermögen, das als Antigen-Bindungsfragment (Fab) - bezeichnet wird; diese Eigenschaft ist spezifisch in bezug auf die Bindung spezifischer

- 29 -

909835/0527

2300546

Antigene. Am anderen Ende des Moleküles, das als Fc bezeichnet wird, werden keine Antigene gebunden.

Bei spezifischen Bindungs-Testverfahren, welche Radioisotope einschliessen, binden die IgE-Antikörper an das Antigen über den Fab-Bereich, wobei der Fc-Bereich frei bleibt. Während der zweiten Inkubation mit dem radiomarkierten Anti-IgE bindet das Anti-IgE an den freigebliebenen Fc-Bereich des IgE-Moleküls. Um in diesen Tests eine richtige Funktion zu gewährleisten, muss das markierte Anti-IgE auf eine Weise standardisiert werden, die weitgehend die Aktivität des markierten Anti-IgE im Test simuliert. Dieses "Simulierungs"-Erfor-' dernis bedeutet, dass aufgrund der Tatsache, dass die spezifische Bindungs-Testmethode,. z.B. RAST, oder Methoden, die andere Markierungssubstanzen, wie Enzyme, verwenden, sterisch verhältnismässig ungehindert sind, die Verfahren zum Standardisieren von markiertem Anti-IgE sterisch ebenfalls relativ ungehindert sein sollten.Das offenbarte und beanspruchte Standardisierungsverfahren unter Verwendung von Anti-L(leicht)-Ketten-Antikörpern, die an ein aktiviertes Substrat gebunden sind, erfüllt dieses Simulierungserfordernis.

Die erfindungsgemässe Methode ist in ihrem breitesten Aspeki-, auf die Standardisierung eines markierten Bestandteiles Un₅-O*^ die Verwendung des markierten Bestandteiles in spezifischen Bindungs-Testverfahren gerichtet. Wie oben erwähnt, können verschiedene markierte Substanzen in spezifischen Bindungs-Testverf ahren verwendet werden. Bevorzugte Ausführungen umfassen Radioisotope und Enzyme, Der markierte Bestandteil kann in sämtlichen dreischichtigen, spezifischen Bindungs-Testverfahren verwendet werden. Bevorzugte Ausführungen hinsichtlich der Verwendung umfassen die Standardisierung von Allergenextrakten und die Bestimmung oder den Nachweis eines Liganden

- 30 -

909835/0527

2300546

in einer Körperflüssigkeit. Diese Liganden umfassen Antikörper, z.B. Ig, und Proteine. Eine bevorzugte Ausführungsform stellt der Nachweis oder die Bestimmung von IgE in atopischem Serum dar.

Beim Standardisierungsverfahren gemäss einer bevorzugten Ausführungsform wird radiomarkiertes Anti-IgE gegen IgE standardisiert. IgE wird wiederum gegen einen IgE-Referenzstandard standardisiert. Der gemäss der bevorzugten Ausführungsform beschriebene IgE-Referenzstandard ist ein Standard-IgE-Referenzserum, welches von der World Health Organization (WHO) erhältlich ist und das als IgE (69/341) bezeichnet wird und 10.000 WHO-Einheiten pro ml enthält.

Das RAST-Verfahren, wie es im vorangehenden beschrieben und illustriert wird, stellt ein Beispiel eines dreischichtigen Pestphasen-Testverfahrens unter Verwendung von Radioisotopen dar. Um spezifische Bindungstest-Verfahren zu simulieren, z.B. das RAST-Verfahren, muss ein Verfahren zum Standardisieren des markierten Anti-IgE zur Verwendung in einem spezifischen Bindungstest-Verfahren die Bestimmungsmethode simulieren. Da das RAST-Verfahren sterisch verhältnismässig ungehindert ist, muss die Methode zum Standardisieren von Anti-IgE zur Verwendung in spezifischen Bindungstest-Verfahren sterisch ebenfalls verhältnismässig ungehindert sein. Das Standardisierungsverfahren gemäss der Erfindung verwendet eine dreischichtige Festphasen-Testmethode, in v/elcher die erste Schicht Anti-human-L(leicht)-Ketten-Antikörper, der an einen unlöslichen Träger gebunden ist, umfasst. Die zweite Schicht stellt markiertes IgE dar. Die dritte Schicht besteht aus markiertem Anti-IgE. Das markierte IgE ist von dem markierten Anti-IgE, das standardisiert wird, unterscheidbar. Das dreischichtige Produkt kann wie folgt dargestellt werden:

- 31

909835/0527

markiertes Anti-IgE markiertes IgE Anti-L(leicht)-Ketten-Ant ikörper

Das beanspruchte Verfahren zur Standardisierung von markiertem Anti-IgE und das ebenfalls beanspruchte Verfahren zur Bestimmung der Wirksamkeit eines Antigens wird nachfolgend beschrieben.

Verfahren zur Standardisierung von radiomarkiertem Anti-IgE

131 Wie nachfolgend unter (A) beschrieben, wurde IgE mit Na I radiomarkiert. Die emittierte Strahlung wurde gemessen. Die

131

Beziehung zwischen der von I radiomarkiertem IgE emittierten Strahlung und der Menge an vorliegendem IgE-Protein in dem radiomarkierten IgE wurde, wie nachfolgend beschrieben, durch eine Doppel-Antikörper-Methode nach Gleich et al (J. Lab. Clin. Invest., 77 (1971), Seiten 690-698) beschrieben unter Bezugnahme auf eine aufgestellte Standardkurve unter Verwendung des WHO-IgE-Referenzserums bestimmt, wobei die Konzentration des χ-adiomarkierten IgE-Proteins in WHO-Einheiten ausgedrückt ist.

Die Standardkurve wurde nach der Doppel-Antikörper-Methode

- 32 -

909836/052?

2300546

aufgestellt, wobei eine kompetitive Flüssigphase-Inhibierung

1 25

einer Reaktion zwischen I-radiomarkiertem IgE und nicht-markiertem Kaninchen-Anti-IgE mit zunehmenden Konzentrationen

131

an WHO-IgE-Referenzserum genutzt wurde. Das I-radiomarkierte IgE ersetzte in dem Inhibitionstest das WHO-Referenzserum. Die

131 125

Fähigkeit von 'I-radiomarkiertem IgE die Bindung von I-radiomarkiertem IgE an nicht-markiertes Kaninchen-Anti-IgE zu inhibieren, wurde, unter Bezugnahme auf eine Standardkurve, mit der Inhibitionsfähigkeit des WHO-IgE-Referenzserums in dem gleichen Test verglichen und die Konzentration von IgE in

I-radiomarkiertem IgE-Präparation aufgestellt.

Jod-125-radiomarkiertes IgE, das im Handel von Pharmacia, London, erhältlich ist, wurde mit nicht-markiertem Anti-IgE, das im Handel von Behring Werke AG, erhältlich ist, in Gegenwart zunehmender Mengen an WHO-IgE-Referenzserum umge-

1 25 setzt unter Bildung einer Reihe von I-radiomarkierten IgE-Anti-IgE-Komplexen. Da es erforderlich ist, diese Komplexe

1 25 von dem löslichen,.nicht-umgesetzten I-radiomarkierten IgE abzutrennen, wurden sie durch Zugabe von Esel-Anti-Kaninchen-Immunoglobulin-Serum, das im Handel von Wellcome Laboratories erhältlich ist, präzipitiert.

125

Die von I-radiomarkiertem IgE emittierte Strahlung, welches in der Reihe von Komplexen vorlag, wurde bestimmt und eine Standardkurve aufgestellt. Die Konzentration des in

131

der 1-IgE-Präparation enthaltenen IgE-Proteins wurde aus der Standardkurve, direkt in WHO-Einheiten bestimmt, wobei die

125 131

I-Werte um die Impulse korrigiert wurden,die von den I-Isotop

überlappen. Eine Standardkurve (aufgetragen in logit gegen log-Adisen) zur Bestimmung der Menge an IgE in WHO-Einheiten, wird in Fig. 1 dargestellt. Vor der Zugabe des WHO-IgE-Referenzserums

- 33 -

909835/0527

1 25 kann die Bindungsreaktion zwischen I-radiomarkiertem-IgE-Kaninchen-Anti-IgE als 100 % angenommen werden.

Gemäss Fig. 1 waren bei 50 % Inhibierung der Bindung etwas mehr als 10
geben worden.

mehr als 10 WHO-Einheiten IgE pro ml zu den Komplexen zuge-

WHO-Einheiten IgE/ml (22,4 u

131 On einer 1-IgE-Probe emittier-

Der oben beschriebene Doppel-Antikörper-Test ergab die folgenden Ergebnisse. Es wurde festgestellt dass eine I-radiomarkierte IgE-Präparation 224

IgE 0,01 ml"¹) enthielt. Die von einer ^IJ1I-IgE te Strahlung war äquivalent 450.000 cpm. Die Strahlung jeder' in der radiomarkierten Präparation enthaltenen IgE-Einheit wurde zu 20.000 cpm errechnet.

Es gibt alternative Methoden zur Doppel-Antikörper-Methode nach Gleich zur Bestimmung der IgE-Menge in WHO-Einheiten, wie z.B. die Methode von Ceska und Lundvkist (Immunochemistry, 2 (1972), Seiten 1021-1300).

Wie nachfolgend unter (B) beschrieben, wurde Anti-IgE mit

I radiomarkiert. Die von dem Anti-IgE emittierte Strahlung

131

unterschied sich von der von I-radiomarkiertem IgE emittierten Strahlung. Die Identität der radioaktiven Isotope ist nicht wesentlich, solange die Radioaktivität, unterscheidbar ist.

Aktivierte Substrate in Form von Scheiben bzw. Platten wurden in Kontakt mit Anti-Human-L(leicht)-Ketten-Antikörper, wie unter (D) beschrieben, gebracht. Diese Scheiben wurden

131

dann mit unterschiedlichen Konzentrationen an I-radiomarkiertem IgE etwa 3 Stunden lang bei 20°C inkubiert. Die überschüssiger

- 34 -

909835/0527

Reagentien wurden entfernt und die Scheiben 4 mal mit 1 %-igem Detergenz, z.B. "TWEEN", im Handel erhältlich von Sigma Chemical, St. Louis, Missouri, in physiologischer Kochsalzlösung (saline) gewaschen. Die Scheiben wurden dann 17 Stunden

125
lang mit I-radiomarkiertem Anti-IgE inkubiert, wobei ein Substrat gebildet wurde, welches das dreischichtige Pestphasen-Produkt, wie es in der voranstehenden Zeichnung dargestellt wird, gebunden hatte.

131 Nach dem Waschen wurde die Radioaktivität von 1-IgE und

I-Anti-IgE gleichzeitig in einem Gammazähler bestimmt.

131
Die Menge an IgE-Protein in dem I-radiomarkierten IgE, direkt ausgedrückt in WHO-IgE-Einheiten, im Ver-

131
hältnis zur I-Radioaktivität wurde zuvor bestimmt. Die I-Anti-IgE-Impulse,korrigiert · um ein überlappen

131

von I-Impulsen,

wurden gegen die IgE-Einheiten, die an den Scheiben gebunden waren, wie aus den I-Impulsen bestürmt, aufgetragen. Dies ergab die in Fig. 2 gezeigte Kalibrierungskurve, die das an die aktivierte Scheibe gebundene IgE in Beziehung zur anschliessenden Bindung von radiomarkiertem Anti-IgE gebracht werden kann. Somit ist das Verhältnis zwischen der durch radiomarkiertes Anti-IgE emittierten Strahlungsmenge, die an das radiomarkierte Anti-IgE gebundene IgE-Proteinmenge und die Menge an IgE-Protein in WHO-Einheiten bekannt. Nach der erfindungsgemässen Methode wird - wie oben beschrieben - das radiomarkierte Anti-IgE in WHO-Einheiten standardisiert, da das wirkliche Gewicht eines Liganden (z.B. IgE) aus der Menge des an diesen gebundenen markierten Bestandteils bestimmt werden kann.

Das standardisierte, radiomarkierte Anti-IgE kann in den

- 35

909835/0627

verschiedenen Modifikationen von spezifischen Bindungstest-Verfahren, wie sie eingangs beschrieben wurden, verwendet werden, um die Menge an IgE, die an ein aktiviertes Substrat gebunden ist, zu bestimmen, ungeachtet der verwendeten markierten Substanz. Die nachfolgend beschriebene spezifische Ausführungsform betrifft ein verbessertes spezifisches Bindungstest-Verfahren zur Messung der Wirksamkeit eines Allergenextraktes. Diese Wirksamkeit wird durch RAST-(Radioallergosorbent)-Inhibierung bestimmt.

Herstellung von Materialien zum Standardisieren von radiomarkiertem Anti-IgE

(A) 5§diomarkiertes_IgE

Gereinigtes IgE (welches weniger als 0,6 % IgG enthielt) wurde mittels Ionenaustausch-und Gelchromatografie aus IgE-

131

Myloma-Serum hergestellt. Das IgE wurde mit Na I radiomarkiert, das vom Radiochemical Centre, Amersham, Bucks, England, erhältlich ist. Die Radiomarkierung wurde durchgeführt, indem etwa 0,025 ml 0,5M Phosphatpuffer (pH = 7,5) zu 10ul

131 '

Na I in einem Glasfläschchen (vial) zugegeben wurden. Unmittelbar darauf wurden 5 ug IgE in 0,025 ml 0,05M Phosphatpuffer und 100 ug frisches Natrium-p-toluolsulfochloramin, welches als Chloramin-T erhältlich ist (Sigma Chemical) in 0,025 ml 0,05M Phosphatpuffer zugegeben. Nach jeder Zugabe wurde der Inhalt des Glasfläschchens vermischt. Sofort nach Zugabe von Toluolsulfochloramin wurde 0,1 ml Natriummetabisulfit-Lösung (2,4 g/ml) in 0,05M Phosphatpuffer zugegeben, um eine spätere Jodierung zu vermeiden. Die nicht-umgesetzten Reagentien wurden durch Passieren von Sephadex G50 entfernt. Der markierte IgE-Peak wu?:de gesammelt und mit 5 %-igem

- 36 -

9098 3 5/0 5 27

Humanserumalbumin in Phosphatpuff er- phys. Kochsalz-Lösung (PBS) auf 5 ml eingestellt und bei 2O°C gelagert (Biochem. J. 89 (1963) , Seiten 114-123).

Schaf-Anti-Human-IgE wurde durch Isolierung des 7S-Peaks über eine G200-Chromatografiesäule gereinigt. Das spezifische Anti-IgE wurde mit Glyzin/HCl-Puffer (pH =2,6) eluiert.

Ein Anteil von 1Oug dieser Anti-IgE-Präparation wurde mit

12 R
1 mCi Na I radiomarkiert, das vom Radiochemical Centre, Amersham, Bucks, England, erhältlich ist. Die Markierung erfolgte nach folgender Methode.

Das Markierungsverfahren wurde bei 4 C durchgeführt, wobei in einem Eisbad vorgekühlte Reagentien verwendet wurden. Ein Anteil von 100 ug gereinigtem Schaf-Anti-IgE in 100ul 0,1 M Phosphatpuffer (pH =7,0) wurde in ein Glasfläschchen gegeben

125
und dazu 1 mCi Na I zugegeben, worauf unmittelbar 50 ug Chloramin-T in 50ul 0,1M Phosphatpuffer (pH = 7,0) zugefügt wurden. Der Inhalt des Glasfläschchens wurde vermischt und die Reaktion 30 Minuten lang bei 4 C fortgesetzt, wobei zwischendurch wieder vermischt wurde« Das Jodierungsgemisch wurde durch Zugabe von 20ug Natriummetabisulfit in 5nl 0,1M Phosphatpuffer (pH 7,0) neutralisiert. Der Inhalt des Glasfläschchens wurde vermischt und das Reaktionsgemisch weitere 5 Minuten bei 4°C stehen gelassen. 5 ul einer 5 %-igen Rinderserumalbumin (BSA)-Lösung wurden zugegeben und der Inhalt des Glasfläschchens auf eine Sephadex-G50-Säule aufgetragen, wodurch die nicht-umgesetzten Reagentien abgetrennt wurden. Der

- 37 -

909835/052?

2S00546

radiomarkierte Protein-Peak wurde gesammelt und mit 5 % <BSA) in einer phosphatgepufferten physiologischen Kochsalzlösung <PBS) auf 5 ml eingestellt und bei -20°C gelagert.

Vor der jeweiligen Verwendung wurde die Anti-lgE-Präparation in PBS/ das 20 % normales Schafserum, 0,2 % Rinderserumalbumin und 1 % Detergenz enthielt, verdünnt, um eine Arbeitslösung zu erhalten, die 10 Impulse (counts)' pro Minute/ml ergab (Immunochem. 7 (1970), Seiten.885-898).

(C) Aktiviertes_Sübstrat

Papierseheiben (5 mm Durchmesser) wurden aus Filterpapier ausgestanzt und mit Cyanogenbromid wie folgt aktiviert.

Ein geeignetes Filterpapier ist im Handel von Whatman Biochemical erhältlich und wird als Whatman Nr. 54 bezeichnet. Die Substrate, die hier als "Scheiben" bezeichnet werden, wurden etwa 30 Minuten lang in destilliertes Wasser eingetaucht und eine wässrige 5 %-ige BrCN-Lösung zugegeben. Das Gemisch wurde in ein Wasserbad mit einer Temperatur von etwa 20⁰C gegeben und ca. 5 Min.lang gerührt. Während des Rührens wurde der pH im Bereich von 1O,5 bis 11,0 gehalten, indem tropfenweise 2M NaOH zugegeben wurde. Das Gemisch wurde dann in etwa 2 1 0,005M NaHCO--Lösung -von 4 C gegossen und weiter vermischt, Der Überstand wurde dekantiert und die Scheiben wiederholt mit O₇OOSM NaIICO ^ von $°C und dann mit 5Ό0 ml-Anteilen Aceton (4°C) gewaschen, an der Luft getrocknet und bei -2O°C gelagert .

- 38 -

9^09835/052?

ein aktiviertes_Substrat_2eko2Eelt_sind.

Antikörper bestehen aus Peptidketten, die als L(leicht)-Ketten und H(schwer)-Ketten bezeichnet werden. Die leichten Ketten besitzen ein Molekulargewicht von etwa 20.000; die schweren Ketten haben ein Molekulargewicht von etwa 50.000. Obwohl die leichten Ketten von gereinigten Antikörpern weitgehend heterogen sind, sind die leichten Ketten der Myelomaproteine (lymphoider Tumor im menschlichen Knochenmark) homogen. Patienten, die an Myeloma leiden, scheiden ein einheitliches, homogenes Protein, das als Bence-Jones-Protein bezeichnet wird und welches aus homogenen leichten Ketten besteht , aus.

Anti-Human-L-Ketten-Antikörper werden hergestellt und, wie nachfolgend beschrieben, an die aktivierten Substrate <jemäss (C) gekoppelt. Antikörper, die spezifisch auf das Bence-Jones-Protein sind, wurden von Dako, Dänemark, als eine Immunoglobulinfraktion von Kaninchen-Antiseren bezogen. Die Anti-Human-L-Ketten-Antikörper wurden an die gemäss (C) aktivierten Substrate gekoppelt, indem die Antikörper mit den Substraten etwa 1 Stunde lang bei etwa 5°C inkubiert wurden.

Die nicht-umgesetzten Gruppen wurden mit ß-lithanolamin-Lösung blockiert^ indem etwa 1 ml ß-iithanoiamin-Lösung (0,05M in 0,1M NaHCOgI -zugegebenen wurzle» Das -Gemisch wurde in einem mechanischen Schüttler -(100 Upm) 3 Standen lang -ges-chüttelt. Die Lösüüy wurde -en4_fea.nu uj*d die S^laeiben nacheinander mit einer 2,5 ml-I'ortion O, 1M NaHCO₃, drei 2,5 Tul-Portionen 0,1 M Acetatpuffer (pH 4^,0) und ;drei 7,5 ml-Portionen PBS ge-WB.schen. Die Anti—L-Ketten-St;heiben wurden unmittelbar nach

-3S-

909835/0 5 27

2800546

ihrer Herstellung verwendet.

Das Serum ist von der World Health Organization erhältlich. Das hier verwendete Referenzserum wurde als IgE (69/341) bezeichnet und enthielt 10.000 WHO-Einheiten (U) pro ml.

Verbessertes Verfahren eines spezifischen Bindungstestes

Herstellung von Materialien:

Ällergenextrakte aus zwei Chargen Dactylis glomerata-Pollen (Cocksfoot/Orchard) (F/75 und M/76) wurden von Manufacturing Division of Miles Laboratories, Bridgend, als gefrierge trocknete Präparationen bezogen aund bei -20 C gelagert.'

Der Blütenstaub- bzw. Pollen-Extrakt M/76 nach F wurde wie folgt an das in (C) aktivierte Substrat gekoppelt.

4 g gefriergetrockneter Blütenstaub-Extrakt wurde in 1 1 phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösung (pH 7,2) eingebracht. Der Allergenextrakt wurde wie folgt an die ak tivierten Papierscheiben gebunden. Etwa 100 gm aktivierte

- 40 -

- 4O -

Papierscheiben (etwa 50.000 Scheiben) wurden mit 4 g rekonstituiertem Pollen-Extrakt unter 20-stündigem mechanischen •Rühren inkubiert. Die nicht-umgesetzte Pollen-Extrakt-Lösung wurde durch Dekantieren entfernt. Die nicht-umgesetzten Gruppen wurden mit 1 1 O,05M ß-Äthanolamin innerhalb von 3 Stunden blockiert. Nach dem Blockieren wurden die Scheiben sukzessive mit 1 1 0,1M NaHCO₃, drei 1 !-Portionen von 0,1M Acetatpuffer (pH 4,2) und vier 1 1-Portionen PBS gewaschen. Die gewaschenen Scheiben wurden in 0,5 g-Anteile aufgeteilt und vor dem Lagern bei -20°C gefriergetrocknet.

(H) Ätopische_Seren

Es wurde eine Arbeitslösung des verwendeten Serums, das als IgE-Quelle dient, gewählt, welche die gewünschte IgE-Bindung bei der Bestimmung der Allergen-Wirksamkeit gewährleistet. Die Arbeitslösung wurde wie folgt bereitet.

Reihenverdünnungen von atopischen Seren wurden mit einer Reihe von aktivierten Substraten, an die ein Antigen gebunden war (hergestellt wie unter (G) beschrieben) inkubiert. Nach dem Waschen mit einer 1 %-igen Detergenzlösung in physiologischer Kochsalzlösung (saline) wurden die Scheiben mit verdünntem radiomarkierten Anti-IgE, welches wie im Standardisierungsverfahren beschrieben hergestellt wurde, inkubiert. Das gebildete Produkt stellte ein aktiviertes Substrat mit einem Antigen dar; IgE und radiomarkiertes Anti-IgE waren gebunden.

Es wurde eine parallele Inkubation mit Anti-L-Ketten-aktivierten Scheiben angesetzt. Es wurde nach dem beschriebenen früheren Verfahren, auf welches im folgenden eingegangen wird,

41 -

909835/0527

2904)546

gearbeitet, um eine Kalibrierungsktirve zu erhalten, in welcher die radioaktiven Impulse des radiomarkierten Anti-IgE gegen die an die Scheiben gebundenen IgE-Einheiten aufgetragen wurden, wie dies aus den radioaktiven Impulsen des radiomarkierten IgE bestimmt worden war. Die Anti-L-Ketten-akti-

131 vierten Scheiben, welche radiomarkiertes 1-IgE gebunden hatten (wie unter (D) beschrieben hergestellt) wurden mit radiomarkiertem Anti-IgE inkubiert. Nach dem Waschen wurde die von diesen Scheiben emittierte Strahlung in einem Gammazähler gemessen. Wie nachfolgend erläutert, wurde eine Dosis-Impuls-Kurve aufgestellt, um die Arbeitsverdunnung eines jeden Serums, das die gewünschte IgE-Bindung gewährleistete', zu ermitteln.

Es wurde eine Titration von drei Seren durchgeführt. Ein Serum bestand aus einem Pool von Seren von 30 bestimmten atopischen Patienten, die alle gegenüber Graspollen empfindlich waren. Das zweite und dritte Serum wurde von individuellen Patienten erhalten und mit M.D. und C.W., die beide gegen Graspollen empfindlich waren, bezeichnet.

Um in bezug auf die Inhibierung genaue Ergebnisse zu erhalten, muss die Konzentration des Patientenserums (IgE-Quelle) unterhalb der Konzentration liegen, die eine Sättigung des aktivierten Substrates bewirken würde. Um die Konzentration des zu verwendenden Serums zu bestimmen, wurden verschiedene atopische Seren mit aktivierten Substraten titriert. Es wurde eine Kurvenfamilie für die IgE-Bindung erhalten, wie dies in Ficj. 3 aufgezeigt wird. Die erforderliche Verdünnung wurde dadurch erhalten, dass die Konzentration bestimmt wurde, welche ein willkürlich bestimmtes Standardniveau der IgE-Bindung ergibt, welche als Kapazität des aktivierten

909835/05 27

Substrates bezeichnet wird (/^) . Der Wert ^ liegt im allgemeinen in der Grössenordnung von 50 bis 70 % der maximalen Bindung des Substrates; in der vorliegenden Erfindung wird £ als 170 x.10~³ U (WHO-Einheiten) IgE definiert, da festgestellt wurde, dass dies das optimale Niveau zur Durchführung der Versuche darstellte.

Verfahren zur Bestimmung der Allergen-Wirksanikeit

Die Bestimmung der Wirksamkeit des Dactylis-glomerata-Allergens wurde, wie nachfolgend beschrieben, durchgeführt. Die Allergenextrakte von (F) wurden in 1 ml Inkubationspuffer (1 % BSA) 1 % Detergenz in PBS rekonstituiert und in diesem Puffer eine Reihe von Verdünnungen hergestellt. Ein 100 nl~ Anteil des verdünnten Extraktes wurde mit 0,1 ml atopischem Serum 2 Stunden lang bei 20°C in flachen Schalen (trays) inkubiert. Die atopischen Seren wurden wie im vorangehenden beschrieben verdünnt, so dass die Serunikonzentration unterhalb der für die Sättigung der aktivierten Scheiben ex-forderlichen Konzentration lag. Ein Substrat-Antigen (Scheibe) , wie dies in (G) hergestellt worden war, wurde zu dem Serum-Allergen-Reaktionsgemisch gegeben und mit dem Gemisch v/eitere 3 Stunden lang inkubiert. Die flüssigen Reagentien wurden abgesaugt und das Substrat-Antigen--IgE-Produkt mit vier 1 ral-Portionen einer 1 %-igen Detergenz-Salin-Lösung gewaschen. Das standardisierte radiomarkierte Anti-IgE wurde dann zu dem Substrat-Antigcn-IgE-Produkt unter Bildung eines dreischichtigen Festphason-Produktes zugegeben. Die von dem radiomarkierten Anti-IgE emittertie Strahlung wurde bstimmt und die

- 43

909835/0527

290054S

entsprechenden Impulse auf das Gewicht der IgE-Bindung an das Anti-IgE unter Bezugnahme auf die Kalibrierungskurve in Fig. 2 umgerechnet.

Aktivierte Substrate wurden mit Anti-L-Ketten-Antikörpern, wie in (D) beschrieben, inkubiert. Die Scheiben wurden dann mit variierenden Konzentrationen an radiomarkiertem IgE 3 Stunden lang bei 20 C inkubiert. Die überschüssigen Reagentien wurden entfernt und die Scheiben 4 Stunden lang mit einer 1 %-igen Detergenzlösung in physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Die Scheiben wurden dann etwa 17 Stunden lang mit radiomarkiertem Anti-IgE (hergestellt wie in (B) beschrieben), inkubiert.

Wie im vorangehenden beschrieben, wurde aus der Bestimmung des radiomarkierten IgE, in Korrelation mit dem WHO-IgE-Referenzserum, eine Standardkurve konstruiert (Fig. 1). Diese Kurve diente dazu, die Konzentration des in dem radiomarkierten IgE vorliegenden IgE zu berechnen. Ausgehend von einer bekannten Konzentration an radiomarkiertem IgE wurde dann die exakte Menge der IgE-Bindung an Anti-L-Ketten-Scheiben aus der emittierten Strahlung berechnet. Da die Menge an ge-

125 bundenem IgE bekannt ist, können die I-Impulse des radioraarkierten Anti-IgE, welches durch nachfolgende Inkubation mit radiomarkiertem Anti-IgE gebunden wurde, mit der exakten Menge an vorliegendem radiomarkiertem IgE korreliert werden und es kann eine Kalibrierungskurve aufgestellt werden (Fig. 2).

Wie im vorhergehenden zum RAST-Verfahren beschrieben und erläutert j bedeutet in den spezifischen Bindungstest-Inhibierungstest-Verfahren, dass wenn die Menge an löslichem Antigen, das zu einem Festphasen-aktivierten Substrat-Antigen-IgE-Komplex

zugegeben wird, zunimmt, das Gewicht der IgE-Moleküle, welche an das Festphasen-Antigen gebunden sind, abnimmt, und die prozentuale Bindung von. Anti-IgE an Festphasen-Antigen (über das IgE) abnimmt. Allergenextrakte können dann hinsichtlich ihrer relativen Wirksamkeit verglichen werden, indem man. die Menge des für eine 50 %-ige Inhibierung erforderlichen Extraktes ermittelt und miteinander vergleicht.

In der erfindungsgemässen Methode, die oben beschrieben wird, wird die Scheibenkapazität für die IgE-Bindung mit ^ bezeichnet, die gebundenen IgE-Moleküle werden mit b bezeichnet, bei einer beliebigen gegebenen Allergenkonzentration, das Gewicht des IgE, das keine Bindung eingehen konnte, wird daher mit dem Ausdruck ^-b angegeben. Bei bestimmten Allergenkonzentrationen ist die IgE-Bindung an die Scheibe in Gegenwart des Allergenextraktes vollständig inhibiert. Fig. 4 zeigt, dass mit zunehmender Menge an zugegebenem Allergenextrakt die IgE-Menge, die keine Bindung eingeht (^-b) ebenfalls zunimmt.

Fig. 4 zeigt, dass die maximale Antikörper-Menge, die von einer Bindung ausgeschlossen ist, durch zunehmende Mengen an zugegebenem Allergenextrakt, in der Nähe von 170 χ 10 U IgE liegt. Die Titration eines bestimmten Serums unter Verwendung des standardisierten markierten Anti-IgE gemäss der Erfindung erlaubt es daher, die Allergen-Wirksamkeit in Form einer Bindungsinhibierung als IgE-Standardeinheiten, z.B. als U IgE, auszudr ücken.

909835/0527

Claims (1)

1. ΗΟΙΛΡΜΛ NN · JHlTIJi & PARTNE it OQfI Π K LK

   1'ATKKTANWAi-TK * ϋ U U 0 4

   »P.. ING. £. HOFFMANN (V:30-l?76) - DiPL-ING. W. EITLE · D R. REK. NAT.K. HOFPiAAN N · D I PL.-ING. W. IEH H

   DIPL.-JNG. K. FOCHSLC · DR. RF. R. HAT. B. HANSEN
   AKASEtLASTRASSK i (SIERNHWJS) · D-SOOUMONCHENSl · TELEFON (069) 911007 . TC I. E X 05-29619 (PATH E)

   31 572 m/wa

   MILES LABORATORIFJS INC., ELKIiART, INDIANA / USA

   Spezifische Bindu.ngstest-Verfahren

   PATENTANSPRÜCHE

   1.| Verfahren zum Standardisieren eines markierten Bestandteiles, welcher ein Konjugat aus einer ersten Markierungssubstanz und einer Bindungskomponente darstellt,
   und welcher mit einem Liganden reagiert, gegen eine
   Liganden-Referenzsubstanz zur Verwendung in einem spezifischen Bindungstest-Verfahren, das durch die folgenden Schritte gekennzeichnet ist:

   (a) Inkubieren von Substraten, welche Anti--L (leicht) Ketten-Antikörper gebunden haben, mit variierenden Konzentrationen eines Liganden, der mit eisier zweiten

   909835/0527

   _ ο —

   Markierungssubstanz markiert ist, wobei sowohl die Menge des im markierten Liganden vorliegenden Ligandenproteins, repräsentiert durch die zweite Markierungssubstanz, und die Menge der Liganden-Roferenzsubstanz, die dem markierten Ligandenprotein äquivalent ist, ausgedrückt durch die Menge des vorliegenden markierten Ligandnn, bekannt sind, wobei die Inkubation ausreichend lange durchgeführt wird,-bis sich eine Reihe von Produkten bildet,, welche Substrate mit gebundenen Anti-L(leicht)-Ketten-Antikörpern darstellen, sowie variierende Mengen an markiertem Liganden, welcher an die Anti-L(leicht)-Ketten-Antikörper gebunden ist;

   (b) Inkubieren der Produkte von Schritt (a) mit einem markierten Bestandteil, wodurch der markierte Bestandteil an den markierten Liganden gebunden wird;

   (c) Messen der Produkte von Schritt (b) und Bestimmung der Menge des markierten Liganden und des markierten Bestandteiles;

   (d) Bestimmung des in den Produkten von Schritt (b) vorliegenden Ligandenproteins_f basierend auf der Menge an vorliegendem markierten Liganden, mittels der aus (a) bekannten Beziehung; und

   (e) Bestimmung der in den Produkten von Schritt (b) vorliegenden Menge an Ligandenprotein, ausgedrückt durch die Liganden-Referenzsubstanz, wodurch der markierte Be-. standteil als ein an diese gebundener Ligand standardisiert wird, zur Verwendung in einem spezifischen Bindungstest-Verfahren.

   ~ 3 —

   909835/0527

   2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die ersten und zweiten Markierungssubstanzen Radioisotope, freie Radikale, fluoreszierende Moleküle, lumineszierende Moleküle, Bakteriophagen, Enzyme, Coenzyme und/oder Enzyminhibitoren darstellen.

   3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierungssubstanzen Radioisotope darstellen.

   4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichne t f dass markiertes Anti-Ig gegen Ig-Referenzserum standardisiert wird.

   5. Verfahren zum Standardisieren eines markierten Bestandteiles, welcher ein Konjugat aus einer ersten Markierungssubstanz und einer Bindungskomponente darstellt und welcher mit einem Liganden reagiert, gegen eine Liganden-Referenzsubstanz, zur Verv/endung in einem spezifischen Bindungs-test-Verfahren, das durch die folgenden Schritte gekennzeichnet ist:

   (a) Umsetzung eines Ligariden mit einer zweiten Markierungssubstanz, die sich von der ersten Markierungssubstanz unterscheidet, wobei diese Umsetzung ausreichend lange durchgeführt wird, um den Liganden zu markieren, wodurch der markierte Ligand von dem markierten Bestandteil unterschieden werden kann, und Abtrennen des nicht umgesetzten Liganden;

   (b) Bestimmung der Menge an Ligandenprotein, das in dem markierten Liganden vorliegt, repräsentiert durch die

   90983S/0SI7

   zweite Markierungssubstanz;

   (c) Bestimmung der Menge der Liganden-Referenzsubstanz, die äquivalent dem markierten Ligandenprotein ist, ausgedrückt als Menge des vorliegenden markierten Liganden;

   (d) Inkubation einer Reihe von aktivierten Substraten mit Anti-L(leicht)-Ketten-Antikörpern für ausreichend lange Zeit, um eine Reihe von Produkten zu bilden, welche Substrate mit gebundenen Antil-L(leicht)-Ketten-Antikörpern darstellen;

   (e) Inkubieren der Produkte von Schritt (d) mit
   variierenden Konzentrationen des markierten Liganden von Schritt (a) für ausreichend lange Zeit, um eine Reihe von Produkten zu bilden, welche Substrcite mit variierenden Mengen an anhaftenden bzw. gebundenen Anti-L(leicht)-Ketten-Antikörpern darstellen, sowie variierenden Mengen an markiertem Liganden, welcher an den Anti-L(leicht)-Ketten-Antikörpern haftet bzw. gebunden ist;

   (f) Inkubieren der Produkte von Schritt (e) mit dem markierten Bestandteil, wodurch der markierte Bestandteil an den markierten Liganden gebunden wird;

   (g) Messen der Produkte von Schritt (f) und Bestimmung der Menge an markiertem Liganden und markiertem Bestandteil;

   (h) Bestimmung des vorliegenden Ligandenproteins
   in den Produkten von Schritt (f), basierend auf der Menge an vorliegendem markierten Liganden, mittels der in (b)
   bestimmten Beziehung; und

   909835/0527

   (i) Bestimmung der Menge an vorliegendem Ligandenprotein in den Produkten von Schritt (f), ausgedrückt als Liganden-Referenzsubstanz, wodurch der markierte Bestandteil durch den -an ihn gebundenen Liganden standardisiert wird, zur Verwendung in einem spezifischen Bindungstest-Verfahren.

   Verfahren zum Standardisieren eines radiomarkierten Bestandteiles, welcher ein Konjugat aus einem ersten Radioisotop und Anti-IgE darstellt und welcher mit IgE reagiert, gegen eine IgE-Referenzsubstanz zur Verwendung in einem spezifischen Bindungstest-Verfahren, welches durch die folgenden Schritte gekennzeichnet ist:

   (a) Inkubieren von Substraten, welche Anti-L(leicht)-Ketten-Antikörper gebunden enthalten, mit variierenden Konzentrationen an IgE, welches mit einem zweiten Radioisotop markiert ist, wobei sowohl die in dem markierten IgE vorliegende Menge an IgE-Protein, repräsentiert durch die zweite Markierungssubstanz, und die Menge an IgE-Referenzsubstanz, die äquivalent dem markierten IgE-Protein ist, in Form der Menge an vorliegendem markierten IgE, bekannt sind, für eine zur Bildung einer Reihe von Produkten ausreichend lange Zeit, wobei diese Produkte Substrate mit variierenden Mengen an gebundenen Anti~L(leicht)-Ketten-Antikörpern darstellen, sowie variierenden Mengen an markiertem IgE, welches an den Anti-L(leicht)-Ketten-Antikörpern haftet bzw. gebunden ist;

   (b) Inkubieren der Produkte von Schritt (a) mit dem markierten Bestandteil, wodurch der markierte Bestandteil an das markierte IgE gebunden wird;

   909835/0627

   — ο —

   (c) Messen- der Produkte von Schritt (b) und Bestimmung der Menge an markiertem IgE und markiertem Bestandteil;

   (d) Bestimmung des in den Produkten von Schritt (b) vorliegenden IgE-Proteins, basierend auf der Menge an vorliegendem markierten IgE, mittels der aus (a) bekannten Beziehung; und

   (e) Bestimmung der Menge an vorliegendem IgE-Protein in den Produkten von Schritt (b), ausgedrückt als IgE-Referenζsubstanz, wodurch der markierte Bestandteil in Form des daran gebundenen IgE standardisiert wird, zur Verwendung in einem spezifischen Bindungstest-Verfahren.

   Verfahren zum Standardisieren eines radiomarkierten Bestandteiles _r welcher ein Konjugat aus einem ersten Radioisotop und Anti-IgE darstellt und der mit IgE reagiert, gegen eine IgE-Referenzsubstanz, zur Verwendung in einem spezifischen Bindungstest-Verfahren, welches durch die folgenden

   Schritte gekennzeichnet ist:

   (a) Umsetzung von IgE mit einem zweiten Radioisotop, das sich von dem ersten Radioisotop unterscheidet, für eine ausreichend lange Zeit, um das IgE zu radiomarkieren, wodurch das radiomarkierte IgE von dem radiomarkierten Anti-IgE unterschieden werden kann, und Abtrennen des nicht umgesetzten IgE;

   (b) Bestimmung der Menge an vorliegenden IgE-Protein in dem radiomarkierten IgE, repräsentiert durch die Radioaktivitätsimpulse;

   909835/0S27

   (c) Bestimmung der dem radiomarkierten IgE-Protein äquivalenten IgE-Referenzsubstanz als die Menge an vorliegendem radiomarkierten IgE;

   (d) Inkubieren einer Reihe von aktivierten Substraten mit Anti-L(leicht) -Ketten--Antikörpern für eine Zeit, die ausreichend ist, um eine Reihe von Produkten zu bilden, welche Substrate mit gebundenen Anti-L(leicht)-Ketten-Antikörpern darstellen;

   (e) Inkubieren der Produkte von Schritt (d) mit variierenden Konzentrationen an radiomarkiertem IgE von Schritt

   (a) für eine Zeit, die ausreichend ist, um eine Reihe von Produkten zu bilden, welche Substrate mit gebundenem bzw. anhaftendem Anti-L(leicht)-Ketten-Antikörpern darstellen, sowie variierende Mengen an radiomarkiertem IgE, welches an den Anti-L-Ketten-Antikörpern haftet bzw. gebunden ist, aufweisen;.

   (f) Inkubieren der Produkte von Schritt (e) mit radiomarkiertem Anti-IgE, wodurch das radiomarkierte Anti-IgE an das radiomarkierte IgE gebunden wird;

   (g) Messen der Radioaktivität der Produkte von Schritt (f) und Bestimmung der radioaktiven Impulse von jeweils IgE und Anti-IgE;

   (h) Bestimmung des in den Produkten von Schritt (f) vorliegenden lgtt-Proteins, basierend auf der Menge an vorliegendem radiomarkierten IgE, mittels der in (b) bestimmten Beziehung;

   90983B/0527

   — ο "~

   (i) Bestimmung der vorliegenden Menge an IgE-Protein in den Produkten von Schritt (f), ausgedrückt als IgE-Referenzsubstanz, wodurch das radiomarkierte Anti-IgE standardisiert wird als das an das radiomarkierte Anti-IgE gebundene IgE _r zur Verwendung in einem spezifischen Bindungstest-Verfahren .

   8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeich-

   125 net, dass das erste Radioisotop Na I darstellt.

   9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeich-

   131 net, dass das zweite Radioisotop Na I darstellt.

   10. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die IgE-Referenzsubstanz das Referenzserum der World Health Organization darstellt.

   11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (b) die Menge des in dem radiomarkierten IgE vorliegenden IgE-Proteins durch Doppelantikörper-kompetitive Inhibition des IgE-Referenzserums bestimmt wird.

   12. Spezifisches Bindungstest-Verfahren, welches die Bindung eines Liganden und eines markierten Bestandteiles umfasst, welcher ein Konjugat einer ersten Markierungssubstanz und einer Bindungskomponente darstellt, und wobei der Ligand ebenfalls an das aktivierte Substrat gebunden wird, dadurch, gekennzeichnet: , dass es Schritte zur Markierung des Liganden mit einer zweiten Markierungssubstanz, welche sich von der ersten Markierungssubstanz des markierten Bestandteiles unterscheidet, umfasst, wodurch

   - 9

   909836/062?

   der markierte Ligand von dem markierten Bestandteil unterschieden werden kann, und Kalibrierung des markierten Bestandteiles gegen den markierten Liganden unter Bezugnahme auf eine geeignete Liganden-Referenzsubstanz.

   13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch g e k e η η ζ e i c h net, dass die ersten und zweiten Markierungssubstanzen Radioisotope, freie Radikale, fluoreszierende Moleküle,
   lumineszierende Moleküle, Bakteriophagen, Enzyme, Coenzyme und/oder Enzyminhibitoren darstellen.

   14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeich net, dass die Markierungssubstanzen Radioisotope darstellen.

   15. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch g e k e η η ζ e i c h net, dass die Liganden IgE, IgG, IgA, IgM und IgD darstellen und die Bindungskompontenten jeweils Anti-IgE,
   Anti-IgG, Anti-IgA, Anti-IgM und Anti-IgD darstellen.

   16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeich net, dass der Ligand IgE darstellt.

   17. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeich net, dass die Bindungskomponente Anti-IgE darstellt.

   18. Spezifisches Bindungstest-Inhibitionsverfahren zur Bestimmung der Wirksamkeit eines Allergenextraktes, welches die
   Bindung von IgE und eines markierten Bestandteiles, welcher ein Konjugat aus einer ersten Markierungssubstanz und Anti-IgE ist, umfasst, und welches die Schritte zur Bildung eines akti.vierten Festphasen-Substrates, an welches

   - 10 ~

   9098357052?

   ein Produkt gebunden ist, das sich aus Allergen-IgE-markiertem Bestandteil zusammensetzt, vorsieht, wobei mit zunehmender Menge an zugegebenem löslichen Allergen die Menge an IgE, welches an das Festphasen-Allergen gebunden ist, abnimmt, welches durch die folgenden Schritte gekennzeichnet ist:

   (a) Bestimmen der Bindungskapazität des aktivierten Substrat-Allergens und Wählen einer Arbeitsverdünnung des IgE, die unterhalb der Konzentration liegt, die eine Sättigung des aktivierten Substrates herbeiführt;

   (b) Umsetzen von IgE mit einer zweiten Markierungssubstanz, die sich von der ersten Markierungssubstanz, die in dein markierten Bestandteil verwendet wird, unterscheidet, wobei die Umsetzung ausreichend lange durchgeführt wird, um das IgE zu markieren, wodurch das markierte IgE von dem markierten Bestandteil unterschieden werden kann;

   (c) Inkubieren der aktivierten Substrate mit Anti-L-Ketten-Antikörpern, dem markierten IgE und dem markierten Bestandteil unter Anwendung von Reaktionsbedingungen, die im wesentlichen gleich den Reaktionsbedingungen sind, wie sie zur Bildung von Allergen-IgE-markiertem Bestandteil angewandt werden;

   (d) Bestimmung der Mengen an markiertem IgE, das variierende Mengen des markierten Bestandteiles binden kann, ausgedrückt als Standard—IgE-Rcfcrcnz- bzv«.—Bezüge— substanz; und

   (e) Bestimmung des im -Allergen-IgE-markierter Bestandteil-Produktes vorliegenden IgE-Proteins unter Bezug auf

   - 11 -

   90 9 8 3 5/0527

   die in Schritt (d) ermittelte Beziehung, wodurch die IgE-Menge bestimint wird, welche durch das lösliche Allergen inhibiert wird.

   19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierungssubstanzen Radioisotope, freie Radikale, fluoreszierende Moleküle, lumineszierende Moleküle, Bakteriophagen, Enzyme, Coenzyme und/oder Enzyminhibitoren darstellen.

   20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierungssubstanzen Radioisotope darstellen.

   21. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeich-

   131
   net, dass IgE mit Na I markiert und Anti-IgE mit

   125"
   Na I markiert wird,

   22. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Standard-IgE-Referenzmaterial das IgE der World Health Organization darstellt.

   23. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die im markierten IgE vorliegende IgE-Proteinmenge durch Doppelantikörper-Kompetitionshemmung des IgE-Bezugsmaterials bestimmt wird.

   24. Spezifisches Bindungstest-Inhibitionsverfahren zur Bestimmung der Wirksamkeit eines Allergenextraktes, welches die Bindung von IgE und einem radiomarkierten Bestandteil, der ein Konjugat aus einem ersten Radioisotop und Anti-IgE ist, sowie Schritte zur Bildung eines aktivierten Festphasen-Substrates

   - 12 -

   909835/0 527

   an welchem ein Produkt Allergen-IgE-Anti-IgE haftet bzw. gebunden ist, umfasst, wobei mit zunehmender Menge an zugegebenem löslichen Allergen die Menge des an das Festphasen-Allergen gebundenen IgE abnimmt, dadurch gekennzeichnet , dass es die folgenden Schritte umfasst:

   (a) Bestimmung der Bindungskapazität von aktiviertem Substrat-Allergen und Wahl einer Arbeitsverdünnung des IgE, wobei diese unterhalb der Konzentration liegt, die zur Sättigung des aktivierten Substrates erforderlich ist;

   (b) Umsetzung von IgE mit einem Radioisotop, welches sich von dem ersten Radioisotop unterscheidet, wobei die Umsetzung ausreichend lange durchgeführt wird, um das IgE zu markieren, wodurch das radiomarkierte IgE von dem radiomarkierten Bestandteil unterschieden v/erden kann;

   (c) Inkubation der aktivierten Substrate mit Anti-L(leicht)-Ketten-Antikörpern, dem radiomarkierten IgE und dem radiomarkierten Bestandteil unter Reaktionsbedingungen, die im wesentlichen den Reaktionsbedingungen entsprechend, wie sie für die Bildung des Allergen-IgE-radiomarkierter Bestandteil gewählt werden;

   (d) Bestimmung der Mengen an radiomarkiertem IgE, welches variierende Mengen an radiomarkiertem Bestandteil bindet, ausgedrückt als Standard-IgE-Bezugssubstanz; und

   (e) Bestimmung der in dem radiomarkierten IgE vorliegenden IgE-Menge unter Bezug auf die in Schritt (d)

   - 13 -

   909835/052?

   ermittelte Beziehung, wodurch die IgE-Menge bestimmt wird, die durch das lösliche Allergen inhibiert wird.

   - 14 ~

   909835/0527