ES2908876T3

ES2908876T3 - Variantes de anticuerpos y usos de los mismos

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Publication number: ES2908876T3
Application number: ES12740092T
Authority: ES
Inventors: Paul Parren; Frank Beurskens; Jong Rob N De; Aran Frank Labrijn; Janine Schuurman
Original assignee: Genmab BV
Current assignee: Genmab BV
Priority date: 2011-07-06
Filing date: 2012-07-06
Publication date: 2022-05-04
Anticipated expiration: 2032-07-06
Also published as: SG10201605572TA; CA2840147A1; AU2019283809A1; US10759867B2; IN2014CN00807A; JP2014520788A; JP2024116396A; KR20140146040A; AU2022200869A1; ZA201309499B; US20210163619A1; JP6586442B2; JP6243330B2; AU2017272140B2; EP2729170A2; SI2729170T1; AU2012280222B2; AU2012280222A1; UA128600C2; CN106084039A

Abstract

Una composición que comprende una primera variante de un anticuerpo precursor, en donde la primera variante es un anticuerpo humano de longitud completa, y una segunda variante de un anticuerpo precursor, en donde la segunda variante es un anticuerpo humano de longitud completa, en donde la primera variante comprende un primer dominio Fc de una inmunoglobulina y una región de unión a antígeno, en donde la segunda variante comprende un segundo dominio Fc de una inmunoglobulina y una región de unión a antígeno, y en donde dicha primera variante y la segunda variante comprenden una mutación que corresponde a E430G en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana y dicha primera variante comprende una mutación que corresponde a K439E en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, y dicha segunda variante comprende una mutación que corresponde a S440K en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, en donde las posiciones de aminoácidos se numeran de acuerdo con el índice Eu y en donde la primera y la segunda variante comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 % de grado de identidad con los restos de aminoácidos 130 a 330 de la SEQ ID NO 1 o 5, en donde la primera y la segunda variantes pueden emparejarse entre sí; proporcionando una unión a C1q restaurada o aumentada, activación del complemento y/o CDC, para el par de variantes de anticuerpos específicos, en comparación con cada variante en solitario o con una mezcla del anticuerpo precursor o anticuerpos precursores.

Description

DESCRIPCIÓN

Variantes de anticuerpos y usos de los mismos

Campo de la invención

La presente invención se refiere a polipéptidos y anticuerpos relacionados que comprenden una variante del dominio Fc. Más particularmente, la presente invención se refiere a anticuerpos o polipéptidos que contienen el dominio Fc y que tienen una función efectora modificada como resultado de una o más modificaciones de aminoácidos en el dominio Fc.

Antecedentes de la invención

Las funciones efectoras mediadas por la región Fc de un anticuerpo permiten la destrucción de entidades extrañas, como la destrucción de patógenos y la eliminación y degradación de antígenos. La citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) y la fagocitosis mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCP) se inician por la unión de la región Fc a células portadoras del receptor de Fc (FcR), mientras que la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) se inicia por la unión de la región Fc a C1q, lo que inicia la ruta clásica de activación del complemento.

Cada anticuerpo IgG contiene dos sitios de unión para C1q, uno en cada región constante de la cadena pesada (Fc). Una sola molécula de IgG en solución, sin embargo, no activa el complemento, ya que la afinidad de la IgG monomérica por el C1q es bastante baja (Kd ~10-4 M) (Sledge et al., 1973 J. Biol. Chem. 248,2818-13; Hughes-Jones et al., 1979 Mol. Immunol. 16697-701). La asociación de IgG impulsada por el antígeno puede producir una unión mucho más intensa de la molécula de C1q multivalente (Kd ~10-8 M) y la activación del complemento (Burton et al., 1990 Mol. Immunol. 22, 161-206). Por el contrario, la IgM existe de forma natural en pentámeros o hexámeros unidos covalentemente y, al unirse a un antígeno expresado o inmovilizado en la célula, los pentámeros y hexámeros de IgM pueden desencadenar eficazmente la CDC. La unión al antígeno es un requisito para inducir un cambio conformacional en la IgM para exponer los sitios de unión a C1q (Feinstein et al., 1986, Immunology Today, 169-174).

Se ha sugerido que también la IgG puede lograr la activación del complemento mediante la formación de estructuras anulares hexaméricas, mediante la interacción de los dominios CH2/CH3 de la región Fc (Burton et al., 1990 Trends in Biochem. Sci. 15, 64-69). Las evidencias respaldan la existencias de dichas estructuras de IgG hexaméricas en cristales bidimensionales (Reidler et al., 1986 I Handbook of Experimental Immunology 4a edición (Weir, D. M. ed.), pp 17.1-17.5. Blackwell, Edimburgo, Pinteric et al., 1971 Immunochem. 8, 1041-5) y tridimensionales, así como para IgG1, IgG2a e IgG4 en Fc humana en solución (Kuznetsov et al., 2000 J Struct. Biol. 131, 108-115). También se ha observado la formación de un anillo hexamérico en la estructura cristalina del anticuerpo IgG1K b12 humano dirigido contra la gp120 del VIH-1 (1HZH en PDB) (Saphire et al., Science 10 de agosto de 2001; 293(5532),1155-9). En el anillo hexamérico de b12, seis sitios de unión de C1q accesibles se presentan en la superficie del hexámero, uno derivado de cada uno de los seis anticuerpos, mientras que los otros seis sitios de unión estaban orientados hacia abajo.

El C1q se parece a un ramo de tulipanes con seis cabezas globulares, que contiene las regiones de combinación de anticuerpos, atadas a seis tallos de colágeno [Perkins et al, 1985 Biochem J. 228, 13-26; Poon et al., 1983 J Mol Biol. 168, 563-77; Reid et al., 1983 Biochem Soc Trans 11, 1-12; Weiss et al., 1986 J. Mol. Biol. 189, 573-81]. Se ha descubierto que C1q encaja en la unidad hexamérica b12 de la estructura cristalina de 1HZH, de manera que cada una de las seis cabezas globulares estuviera en contacto con uno de los seis sitios de unión de C1q (Parren, FASEB Summer Research Conference, Snowmass, Co., 5-10 de julio de 2010; "Crystal Structure of an intact human IgG: implications for HIV-1 neutralization and effector Function", Tesis doctoral de Erica Ollmann Saphire, para el Scripps Research Institute, La Jolla, California. noviembre de 2000). Se observó que las mutaciones en aminoácidos seleccionados de las interfaces de Fc observadas entre anticuerpos de b12 relacionadas por simetría en la estructura cristalina disminuían la avidez de unión de C1q, indicando la contribución de estos aminoácidos a la interacción intermolecular Fc:Fc.

El documento US 2011/0123440 describe regiones Fc alteradas de anticuerpos y usos de las mismas. Las regiones Fc alteradas tienen una o más sustituciones de aminoácidos.

El documento US 2008/0089892 describe variantes de la región Fc del polipéptido y composiciones que comprenden estas variantes de la región Fc.

El documento US 2010/0184959 describe métodos para proporcionar una variante del polipéptido Fc con reconocimiento de un ligando Fc y/o una función efectora alterados.

El documento US 2010/015133 describe métodos para producir polipéptidos mediante la regulación de la asociación de polipéptidos.

El documento US 2010/105873 describe un enfoque integrado para generar terapias proteicas multidominio.

El documento US 6.737.056 describe variantes de polipéptidos con una función efectora alterada.

Se han realizado esfuerzos anteriormente para identificar variantes de Fc de anticuerpos con una función efectora mejorada u otras propiedades modificadas. Estos estudios se han centrado en, por ejemplo, intercambiar segmentos entre isotipos de IgG para generar moléculas de IgG quiméricas (Natsume et al., 2008 Cancer Res 68(10), 3863-72) o sustituciones de aminoácidos en la región bisagra (Dall'Acqua et al., 2006 J Immunol 177, 1129-1138) o bien en o cerca del sitio de unión a C1q en el dominio CH2, centrado alrededor de los restos D270, K322, P329 y P331 (Idusogie et al., 2001 J Immunol 166, 2571-2575; Michaelsen et al., 2009 Scand J Immunol 70, 553-564 y el documento WO 99/51642). Por ejemplo, Moore et al. (2010 mAbs 2(2), 181-189)) describe las pruebas con varias combinaciones de S267E, H268F, S324T, S239D, I332E, G236A e I332E para mejorar la función efectora vía CDC o ADCC. Otras mutaciones Fc que afectan a la unión con los receptores Fc (documentos WO 2006/105062, WO 00/42072, patente de los EE.UU. 6.737.056 y patente de los EE.UU. 7.083.784) o las propiedades físicas de los anticuerpos documento WO 2007/005612 A1) también se han sugerido.

El documento US 7.740 847B2 describe variantes de regiones Fc que comprenden al menos una sustitución de aminoácidos, tal como E430G divulgada como aumento de CDC y las mutaciones K439E y S440K divulgadas como disminución de CDC.

A pesar de estos y otros avances en la técnica, sin embargo, sigue siendo necesario desarrollar nuevas y mejores terapias basadas en anticuerpos.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona una composición que comprende una primera variante de un anticuerpo precursor, en donde la primera variante es un anticuerpo humano de longitud completa, y una segunda variante de un anticuerpo precursor, en donde la segunda variante es un anticuerpo humano de longitud completa, en donde la primera variante comprende un primer dominio Fc de una inmunoglobulina y una región de unión a antígeno, en donde la segunda variante comprende un segundo dominio Fc de una inmunoglobulina y una región de unión a antígeno, y en donde dicha primera variante y la segunda variante comprenden una mutación que corresponde a E430G en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana y dicha primera variante comprende una mutación que corresponde a K439E en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, y dicha segunda variante comprende una mutación que corresponde a S440K en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, en donde las posiciones de aminoácidos se numeran de acuerdo con el índice Eu y en donde la primera y la segunda variante comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 % de grado de identidad con los restos de aminoácidos 130 a 330 de la SEQ ID NO 1 o 5, en donde la primera y la segunda variantes pueden emparejarse entre sí; proporcionando una unión a C1q restaurada o aumentada, activación del complemento y/o CDC, para el par de variantes de anticuerpos específicos, en comparación con cada variante en solitario o con una mezcla del anticuerpo o anticuerpos precursores. En aspecto, denominado en el presente documento como "mutante mixto", la variante proporciona una función efectora aumentada cuando se utiliza junto con una segunda variante un polipéptido igual o diferente o anticuerpo que comprende una mutación en un resto de aminoácido diferente en dicho segmento, en comparación con una o más de la variante, segunda variante y el polipéptido o anticuerpo precursor en solitario.

De forma típica, la mutación es una sustitución de aminoácidos, tal como una mutación que intercambia un resto de aminoácidos precursor por uno que tenga un tamaño y/o propiedad fisicoquímica diferente que fomenta la formación de un nuevo enlace Fc:Fc intermolecular o aumentos en la fuerza de interacción de un par existente. Los ejemplos de restos de aminoácidos para la mutación de acuerdo con la presente divulgación se muestran en las Tablas 1 y 2A y B, junto con ejemplos de sustituciones de aminoácidos. Las ilustraciones no limitativas de diferentes aspectos de la divulgación se proporcionan en la Figura 1.

Estos y otros aspectos de la divulgación, especialmente diversos usos y aplicaciones terapéuticas de las variantes de anticuerpo, se describen con más detalle a continuación.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: (A) Representación esquemática de las moléculas de IgG en formación de hexámero. El círculo punteado ilustra dos pares de interacción Fc:Fc adyacentes de dos moléculas de IgG vecinas. La flecha del recuadro ilustra la dirección desde la que se observan las ilustraciones de B, C y D: las dos moléculas Fc vecinas están giradas 90° (en el plano del dibujo) y se observan desde los brazos Fab en la dirección de los dominios CH3. (B) Efecto observado de las mutaciones que aumentan la oligomerización en la CDC. Representación esquemática que ilustra los pares de interacción Fc:Fc con eficacia aumentada según los aspectos de mutante simple y mutante doble de la divulgación. (C) Efecto observado de las mutaciones inhibidoras de la oligomerización en la CDC. Representación esquemática que ilustra cómo pueden ser al menos dos mutaciones inhibidoras de la oligomerización que se compensan entre sí, bien combinadas en una sola molécula (aspecto de doble mutante), o separados en dos moléculas (aspecto de mutante mixto), para restaurar o aumentar la interacción Fc:Fc de acuerdo con los aspectos de doble mutante y mixtos de la divulgación. Los mutantes mixtos consiguen una activación de la función efectora específica que depende de la unión de ambos anticuerpos, que puede reconocer diferentes dianas. (D) Efecto teórico de las mutaciones inhibidoras de la unión de C1q en la CDC. Representación esquemática de las interacciones Fc:C1q, ilustrando que si las mutaciones inhiben la unión de C1q, no pueden combinarse o mezclarse para restablecer la actividad de CDC, porque C1q no puede compensar el defecto introducido en el anticuerpo.

Figura 2: Alineamiento de secuencia de los segmentos Fc de IgG1, IgG1f, IgG2, IgG3 e IgG4 humanas correspondientes a los restos P247 a K447 en la cadena pesada de IgG1, usando el programa informático Clustal 2.1, según la numeración del índice UE, tal como se establece en Kabat. Las secuencias mostradas representan los restos 130 a 330 de la región constante de la cadena pesada de la IgG1 humana (SEQ ID NO:1; N.° de registro UniProt P01857) y de la variante alotípica de IgG1m(f); los restos 126 a 326 de la región constante de la cadena pesada de IgG2 (SEQ ID NO:2; N.° de registro UniProt P01859);

y los restos 177 a 377 de la región constante de la cadena pesada de IgG3 (SEQ ID NO:2; N.° de registro UniProt P01860); y los restos 127 a 327 de la región constante de la cadena pesada de IgG4 (SEQ ID NO:4; N.° de registro UniProt P01861).

Figura 3A y B: Alineamiento de secuencia del anticuerpo dirigido contra EGFr, 2F8, en una cadena principal de IgG1 (SEQ ID NO:3), IgG4 (SEQ ID NO:5) e IgG3 (parcial) (SEQ ID NO:6). Se representa la numeración de los aminoácidos de acuerdo con Kabat y el índice UE (ambos descritos en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)).

Figura 4: Vista detallada de las interacciones K439/S440 entre Fc de moléculas adyacentes (Fc y Fc', respectivamente) en una disposición multimérica (por ejemplo, hexamérica), que ilustra la interacción entre las moléculas Fc y Fc' naturales no modificadas.

Figura 5: Vista detallada de las interacciones K439/S440 entre Fc de moléculas adyacentes (Fc y Fc', respectivamente) en una disposición multimérica (por ejemplo, hexamérica) que ilustra la interacción entre las moléculas Fc y Fc' variantes que comprenden las mutaciones K439E y S440K.

Figura 6: ELISA de unión a C1q con mutantes Fc:Fc 7D8. Los pocillos de una placa de microtitulación se recubrieron con series de concentración de los anticuerpos indicados que se incubaron con una concentración fija de C1q. La eficiencia de unión a C1q fue comparable a la del 7D8 natural para todos los mutantes recubiertos, salvo I253D. Se muestra un representante de al menos 3 experimentos.

Figura 7: CDC mediada por las variantes de 7D8 en células Raji positivas para CD20. Las células Raji se incubaron con los mutantes 7D8 (K439E, S440K, doble mutante k439e/S440K, mezcla K439E S440K) y una serie de concentraciones de C1q para estudiar la eficacia de CDC por medición de la lisis celular. Se muestra un gráfico representativo de experimentos repetidos.

Figura 8: CDC mediada por mutantes 7D8 (7D8-WT, K439E, S440K, doble mutante K439E/S440K, mezcla K439E S440K) en células Daudi positivos para CD20. Se estudió una serie de concentraciones de mutantes 7D8 para establecer su eficacia para inducir la CDC.

Figura 9: CDC mediada por mutantes del anticuerpo CD38 HuMAb 005 en células positivas para CD38. (A) Eficacia de CDC en células Daudi mediante una serie de concentraciones de los mutantes 005. (B) Eficacia de CDC en células Raji mediante una serie de concentraciones de los mutantes HuMAb 005. (C) Eficacia de CDC del mutante E345R de HuMAb 005 con un 20 % o 50 % de NHS en células Wien133. (D) Eficacia de CDC de los mutantes E345R de HuMAb 005 y 7D8 con 20% o 50% de NHS en células Raji. Se analizaron muestras de anticuerpos no purificados aisladas de transfecciones transitorias. Como control negativo, se utilizó el sobrenadante de las células transfectadas de forma simulada.

Figura 10: CDC mediante la variedad natural y mutantes E345R del anticuerpo CD38 HuMAb 005, (A) una anticuerpo CD20 HuMAb 7D8 (B) en un experimento de competición con un péptido de unión a Fc. La lisis celular se midió después de la CDC en células Daudi opsonizadas con anticuerpos e incubadas con una serie de concentraciones del péptido DCAWHLGELVWCT de unión a Fc (SEQ ID NO:7). Se usaron muestras de anticuerpos no purificados aisladas de transfecciones transitorias. Como control negativo, se utilizó el sobrenadante de las células transfectadas de forma simulada.

Figura 11: ADCC de células Daudi que expresan CD38 por el anticuerpo HuMAb 005 de CD38 natural y el mutante IgG1-005-E345R. Se muestra la ADCc de PBMC de un donante, representado como % de lisis.

Figura 12: Unión de IgG1-7D8 natural e IgG1-7D8-E345R mutante al FcRn humano, de macaco y de ratón, determinado por ELISA a pH 6.

Figura 13: Concentraciones plasmáticas de IgG1-7D8 natural y las variantes E354R, S440K y K322A después de inyección intravenosa en ratones SCID.

Figura 14A, B, C y D: CDC en células Wien133 positivas para CD20 y CD38.

Figura 15A y B: Evaluación de la eficacia in vivo de IgG1-7D8-E345R en un modelo de xenoinjerto subcutáneo con células Raji-luc n.° 2D1.

Figura 16A y B: Evaluación de la eficacia in vivo de IgG1-005-E345R en un modelo de xenoinjerto subcutáneo con células Raji-luc n.° 2D1.

Figura 17: ^cD^cen células Wien133 positivas para CD38 y negativas para EGFR mediante el anticuerpo biespecífico CD38/EGFR con la mutación E345R.

Figura 18A y B: CDC en células Wien133 positivas para CD20 y negativas para CD38 o en células Raji mediante el anticuerpo biespecífico CD20/CD38 con y sin la mutación E345R.

Figura 19: CDC en células A431 positivas para EGFR mediante el anticuerpo 2F8 de EGFR con la mutación E345R.

Figura 20A y B: CDC mediada por anticuerpos mutantes E345R.

Figura 21: Análisis de colocalización de anticuerpos TF (FITC) con el marcador lisosómico LAMP1 (APC).

Figura 22A-D: La introducción de E345R dio como resultado una mayor destrucción mediada por CDC en comparación con el rituximab natural, probado en diferentes líneas de linfocitos B.

Figura 22E: La introducción de E345R dio como resultado un aumento de la muerte máxima mediada por CDC en comparación con el rituximab natural, independientemente de los niveles de expresión de las proteínas reguladoras del complemento CD46 (A), CD55 (B) o CD59 (C) en diferentes líneas de linfocitos B con niveles de expresión de CD20 comparables

Figura 23: Cinética de CDC. Los anticuerpos E345R dan como resultado una lisis más rápida y más sustancial de las células diana por los CDC en comparación con los anticuerpos naturales.

Figura 24: Cinética de CDC. La introducción de la mutación E345R en el anticuerpo biespecífico CD38xCD20 da como resultado una lisis de las células diana mediada por CDC más rápida y sustancial.

Figura 25 A-B: Cinética de CDC. La introducción de la mutación E345R en el anticuerpo biespecífico CD38xEGFR (A) y CD20xEGFR (B) que se unen de forma monovalente a células Raji negativas para EGFR, da como resultado una lisis de las células diana mediada por CDC más rápida y sustancial.

Figura 26A-F: CDC en células Wien133 mediante una combinación de un anticuerpo natural y un anticuerpo mutante que contiene los mutantes de IgG1-b12 (A-C) E345R y Q386K o (D-F) E345^r, E430G y Q386K no se unen a células Wien133, y se usaron como anticuerpos de control negativo.

Figura 27: Eficacia de CDC para los anticuerpos de isotipo IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 que contienen la mutación E345R.

Figura 28: La introducción de la mutación E345R estabilizante de Fc-Fc en el anticuerpo 005 de CD38 natural da como resultado una mayor destrucción de linfocitos de LLC primarios en un ensayo CDC ex vivo (media ± error estándar de la media).

Descripción detallada de la invención

Como se describe en el presente documento, sorprendentemente, mutaciones en aminoácidos que no participan directamente en la unión Fc:C1q pueden, no obstante, aumentar la CDC de un anticuerpo, y también pueden mejorar otras funciones efectoras del anticuerpo mediadas por Fc. Esto respalda la hipótesis de que las moléculas de anticuerpos, como los anticuerpos IgG1, pueden formar estructuras oligoméricas que posteriormente se unen a C1q. Asimismo, aunque se ha descubierto que algunas mutaciones disminuyen la inducción de CDC, algunas combinaciones de dichas mutaciones en la misma o en diferentes moléculas de anticuerpos dan como resultado una inducción de CDC restaurada y mostraron una mayor especificidad para la oligomerización de los anticuerpos y, de este modo, fomentaron una inducción de CDC más específica. Las mutaciones particulares que aumentan la respuesta CDC también se caracterizaron por tener una mejor respuesta ADCC, avidez aumentada, mayor internalización y eficacia in vivo en un sistema de modelo de tumor en ratón como se muestra en los Ejemplos. Estos descubrimientos permiten novedosas terapias basadas en anticuerpos con mayor capacidad de inducción de CDC, una inducción de CDC más selectiva y/u otras funciones efectoras mejoradas.

Todas las variantes de anticuerpos de la divulgación comprenden una región de unión al antígeno y una región Fc completa o parcial que comprende al menos una mutación en el segmento correspondiente a los restos de aminoácidos P247 a K447 en la IgG1. Sin desear quedar limitado a teoría alguna, se cree que las mutaciones identificadas dan como resultado una inducción de CDC más eficaz y/o más específica según tres principios diferentes, representados esquemáticamente en la Figura 1, y que en el presente documento se denomina "mutante único", "doble mutante" y "mutantes mixtos".

Los efectos mejorados de C1q y/o CDC de las variantes de la divulgación son principalmente sólo detectables en ensayos que permiten la formación de oligómeros de anticuerpos, como en ensayos con células donde el antígeno no está fijado sino presente en una membrana de fluido. Asimismo, que estos efectos son el resultado de un oligómero de anticuerpo más estable y no de una modificación de un sitio de unión directa de C1q puede comprobarse según los principios mostrados en la Figura 1C.

Definiciones

La expresión "mutante simple", debe entenderse como una variante de la presente divulgación que tiene una función efectora aumentada en comparación con el polipéptido o anticuerpo precursor.

La expresión "doble mutante", debe entenderse como una variante que comprende al menos dos mutaciones en dicho segmento, y tiene una función efectora mejorada en comparación con una variante que comprende solo una de las dos mutaciones, el polipéptido o anticuerpo precursor o ambos.

La expresión "mutante mixto", debe entenderse como una variante que proporciona una función efectora aumentada cuando se utiliza junto con una segunda variante un polipéptido igual o diferente o anticuerpo que comprende una mutación en un resto de aminoácido diferente en dicho segmento, en comparación con una o más de la variante, segunda variante y el polipéptido o anticuerpo precursor en solitario.

La expresión "polipéptido que comprende un dominio Fc de una inmunoglobulina y una región de unión " se refiere, en el contexto de la presente divulgación, a un polipéptido que comprende un dominio Fc de una inmunoglobulina y una región de unión que puede unirse a cualquier molécula, tal como un polipéptido, por ejemplo, presente en una célula, bacteria o virión. El dominio Fc de una inmunoglobulina se define como el fragmento de un anticuerpo que se generaría de forma típica después de la digestión de un anticuerpo con papaína (algo que es conocido del experto en la técnica) que incluye las dos regiones CH2-CH3 de una inmunoglobulina y es una región de conexión, por ejemplo una región bisagra. El dominio constante de la cadena pesada de un anticuerpo define el isotipo de anticuerpo, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgE. El dominio Fc media las funciones efectoras de los anticuerpos con los receptores de la superficie celular denominados receptores de Fc y las proteínas del sistema del complemento. La región de unión puede ser una secuencia polipeptídica, tal como una proteína, ligando proteico, receptor, una región de unión a antígeno o una región de unión a ligando que puede unirse a una célula, bacteria, virión. Si la región de unión es, por ejemplo, un receptor, el "polipéptido que comprende un dominio Fc de una inmunoglobulina y una región de unión" se puede haber preparado como una proteína de fusión del dominio Fc de una inmunoglobulina y dicha región de unión. Si la región de unión es una región de unión a antígeno, el "polipéptido que comprende un dominio Fc de una inmunoglobulina y una región de unión" puede ser un anticuerpo, como un anticuerpo humano o un anticuerpo de cadena pesada solamente o una fusión ScFv-Fc. El polipéptido que comprende un dominio Fc de una inmunoglobulina y una región de unión puede comprender típicamente una región de conexión, por ejemplo, una región bisagra y dos regiones CH2-CH3 de la cadena pesada de una inmunoglobulina, así, el "polipéptido que comprende un dominio Fc de una inmunoglobulina y una región de unión" puede ser un "polipéptido que comprende al menos un dominio Fc de una inmunoglobulina y una región de unión". La expresión "dominio Fc de una inmunoglobulina" significa, en el contexto de la presente divulgación, que está presente una región de conexión, por ejemplo, una bisagra dependiendo del subtipo de anticuerpo, y la región CH2 y CH3 de una inmunoglobulina, por ejemplo una IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA1, IgGA2 o IgE humana.

La expresión "región CH2" o "dominio CH2", como se usa en el presente documento, pretende referirse a la región CH2 de una inmunoglobulina. De este modo, por ejemplo, la región CH2 de un anticuerpo de IgG1 humana corresponde a los aminoácidos 228-340 según el sistema de numeración de la UE. Sin embargo, la región CH2 también puede ser cualquiera de los otros subtipos descritos en el presente documento.

La expresión "región CH3" o "dominio CH3", como se usa en el presente documento, pretende referirse a la región CH3 de una inmunoglobulina. De este modo, por ejemplo, la región CH3 de un anticuerpo de IgG1 humana corresponde a los aminoácidos 341-447 según el sistema de numeración de la UE. Sin embargo, la región CH2 también puede ser cualquiera de los otros subtipos descritos en el presente documento.

El término "inmunoglobulina" se refiere a una clase de glicoproteínas estructuralmente relacionadas que consisten en dos pares de cadenas polipeptídicas, un par de cadenas ligeras (L) de bajo peso molecular y un par de cadenas pesadas (H), las cuatro potencialmente interconectadas por enlaces disulfuro. La estructura de las inmunoglobulinas se ha caracterizado bien. Véase, por ejemplo, Fundamental Immunology Cap. 7 (Paul, W., ed., 2a ed. Raven Press, N.Y. (1989)). En resumen, cada cadena pesada comprende de forma típica una región variable de la cadena pesada (abreviada en el presente documento como VH) y una región constante de la cadena pesada. La región constante de cadena pesada está compuesta normalmente de tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Las cadenas pesadas están interconectadas mediante enlaces disulfuro en la llamada "región bisagra". Cada cadena ligera comprende de forma típica una región variable de la cadena ligera (abreviada en el presente documento como VL) y una región constante de la cadena ligera. La región constante de la cadena ligera está compuesta normalmente de un dominio, CL. Las regiones VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad (o regiones hipervariables, que pueden ser hipervariables en secuencia y/o en forma de bucles definidos estructuralmente), también denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada VH y VL se compone de forma típica de tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino hasta el extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (véase también Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196, 901917 (1987)). Salvo que se indique lo contrario o que el contexto lo contradiga, los aminoácidos de las secuencias de la región constante se numeran según el índice UE (descrito en Kabat, E.A. et al., Sequences of proteins of immunological interest. 5a edición - US Department of Health and Human Services, publicación NIH N.° 91-3242, páginas 662, 680, 689 (1991)).

El término "anticuerpo" (Ab, por sus siglas en inglés) en el contexto de la presente divulgación se refiere a una molécula de inmunoglobulina, un fragmento de una molécula de inmunoglobulina o un derivado de cualquiera de los mismos, que tiene la capacidad de unirse específicamente a un antígeno en condiciones fisiológicas normales con una semivida de períodos de tiempo significativos, tal como al menos aproximadamente 30 minutos, al menos aproximadamente 45 minutos, al menos aproximadamente una hora, al menos aproximadamente dos horas, al menos aproximadamente cuatro horas, al menos aproximadamente ocho horas, al menos aproximadamente 12 horas, aproximadamente 24 horas o más, aproximadamente 48 horas o más, aproximadamente tres, cuatro, cinco, seis, siete o más días, etc., o cualquier otro período relevante definido funcionalmente (tal como un tiempo suficiente para inducir, promover, potenciar y/o modular una respuesta fisiológica asociada con la unión del anticuerpo al antígeno y/o un tiempo suficiente para que el anticuerpo reclute una actividad efectora). El anticuerpo de la presente divulgación comprende un dominio Fc de una inmunoglobulina y una región de unión a antígeno. Un anticuerpo contiene generalmente dos regiones CH2-CH3 y una región de conexión, por ejemplo una región bisagra, por ejemplo, al menos un dominio Fc. Así, el anticuerpo de la presente divulgación puede comprender una región Fc y una región de unión a antígeno. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de la molécula de inmunoglobulina contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes o "Fc" de los anticuerpos pueden mediar en la unión de la inmunoglobulina a tejidos o factores del hospedador, incluyendo varias células del sistema inmunitario (tal como las células efectoras) y componentes del sistema del complemento tal como C1q, el primer componente de la vía clásica de activación del complemento. Un anticuerpo también puede ser un anticuerpo multiespecífico, como un anticuerpo biespecífico o molécula similar. El término "anticuerpo biespecífico" se refiere a un anticuerpo que tiene especificidades para al menos dos epítopos diferentes, típicamente no solapantes. Dichos epítopos pueden estar en la misma diana o en dianas diferentes. Si los epítopos están en diferentes dianas, dichas dianas pueden estar en la misma célula o en diferentes células o tipos de células. Como se ha indicado anteriormente, salvo que se indique lo contrario o que el contexto lo contradiga claramente, en la presente memoria, el término anticuerpo incluye fragmentos de un anticuerpo que comprenden al menos una porción de una región de una región Fc y que conservan la capacidad de unirse específica con el antígeno. Dichos fragmentos se pueden proporcionar por cualquier técnica conocida, tales como técnicas de escisión enzimática, síntesis de péptidos u expresión recombinante. Se ha demostrado que la función de unión a antígeno de un anticuerpo se puede realizar mediante fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Entre los ejemplos de fragmentos de unión englobados en el término "Ab" o "anticuerpo" se incluyen, sin limitación, anticuerpos monovalentes (descritos en el documento WO2007059782 de Genmab); anticuerpos de cadena pesada, que consiste solamente en dos cadenas pesadas y que se encuentran de forma natural por ejemplo en camélidos (por ejemplo, Hamers-Casterman (1993) Nature 363:446); ThioMabs (Roche, WO2011069104), dominio diseñado mediante ingeniería genética de intercambio de cadena (SEED o Seed-body) que son moléculas de tipo anticuerpo asimétricas y biespecíficas (Merck, documento WO2007110205); Triomab (Fresenius, Lindhofer et al. (1995 J Immunol 155:219); FcAAdp (Regeneron, documento WO2010151792), Azymetric Scaffold (Zymeworks/Merck, documento WO2012/058768), mAb-Fv (Xencor, documento WO2011/028952), inmunoglobulina de doble dominio variable (Abbott, DVD-Ig, patente de Estados Unidos n.° 7612181; anticuerpos de doble cabeza y doble dominio (Unilever; Sanofi Aventis, documento WO20100226923), Di-diabody (ImClone/Eli Lilly), formatos de anticuerpo de tipo "botón en ojal" (Genentech, documento WO9850431); DuoBody (Genmab, documento WO 2011/131746); formatos de anticuerpo de direccionamiento electrostático (Amgen, documentos EP1870459 y WO 2009089004; Chugai, documento US201000155133; Oncomed, documento WO2010129304A2); IgG1 e IgG2 biespecíficos (Rinat Neurosciences Corporation, documento WO11143545), CrossMAbs (Roche, documento WO2011117329), L^uZ-Y (Genentech), Biclonic (Merus), anticuerpos de dominio de direccionamiento doble (GSK/Domantis), anticuerpos dos en uno que reconocen dos dianas (Genentech, NovImmune), Mabs reticulados (Karmanos Cancer Center), cuerpo CovX (CovX/Pfizer), biespecíficos de tipo IgG (ImClone/Eli Lilly, Shen, J., et al. J Immunol Methods, 2007. 318(1-2): p. 65-74) y cuerpo DIG y cuerpo PIG (Pharmabcine), , y moléculas de redireccionamiento de doble afinidad (Fc-DART o Ig-DART, de Macrogenics, documentos w O/2008/157379, WO/2010/080538, Zybodies (Zyngenia), enfoques de cadena ligera común (Crucell/ Merus, documento US7262028) o de cadena pesada común (KA Bodies de NovImmune), así como proteínas de fusión que comprenden una secuencia de polipéptido fusionada con un fragmento de anticuerpo que contiene un dominio Fc tales como las fusiones scFv, como BsAb de ZymoGenetics/BMS), HERCULES de Biogen Idec (US007951918), SCORPIONS de Emergent BioSolutions/Trubion, Ts2Ab (MedImmune/AZ (Dimasi, N., et al. J Mol Biol, 2009. 393(3): p. 672-92), fusión scFv de Novartis, fusión scFv de Changzhou Adam Biotech Inc (documento CN 102250246), TvAb de Roche (documentos WO 2012025525, WO 2012025530), mAb2 de f-Star (documento WO2008/003116) y fusiones scFv dobles. También debe entenderse que el término anticuerpo, salvo que se especifique otra cosa, también incluye anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales (como anticuerpos monoclonales humanos), mezclas de anticuerpos (policlonales recombinantes), por ejemplo, generadas por tecnologías explotadas por Symphogen y Merus (Oligoclonics), y polipéptidos análogos a anticuerpos, tales como anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados. Un anticuerpo generado puede poseer cualquier isotipo, potencialmente.

La expresión "anticuerpo de longitud completa", cuando se utiliza en la presente memoria, se refiere a un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo precursor o variante) que contiene todos los dominios constantes y variables de las cadenas pesadas y ligeras correspondientes a los que se encuentran normalmente en un anticuerpo natural de ese isotipo.

La expresión "anticuerpo humano", tal como se usa en el presente documento, pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la divulgación pueden incluir restos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones, inserciones o deleciones introducidas mediante mutagénesis aleatoria o específica del sitio in vitro o mediante mutación somática in vivo). Sin embargo, la expresión "anticuerpo humano", tal como se usa en el presente documento, no pretende incluir anticuerpos en los que las secuencias CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón, se han injertado en secuencias marco humanas.

Las expresiones "anticuerpo monoclonal", "Ab monoclonal", "composición de anticuerpo monoclonal", "mAb" o similares, se utilizan el presente documento para referirse a una preparación de moléculas de Ab de una sola composición molecular. Una composición de anticuerpo monoclonal muestra una especificidad y afinidad de unión única por un epítopo particular. En consecuencia, la expresión "anticuerpo monoclonal humano" se refiere a Abs que presentan una única especificidad de unión que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los mAb humanos pueden generarse mediante un hibridoma que incluye un linfocito B obtenido de un animal no humano transgénico o transcromosómico, tal como un ratón transgénico, que tiene un genoma que comprende una gama de transgenes de cadena pesada y una gama de transgenes de cadena ligera humanos, reordenados para producir un anticuerpo humano funcional y fusionado a una célula inmortalizada.

Tal como se usa en el presente documento, "isotipo" se refiere a la clase de inmunoglobulina (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA1, IgGA2, IgE o IgM o cualquiera de sus alotipos como IgGlm(za) e IgG1 m(f)) que está codificado por genes de la región constante de la cadena pesada. Asimismo, cada isotipo de cadena pesada se puede combinar con una cadena ligera kappa (k) o lambda (A).

La expresión "anticuerpo monovalente" significa en el contexto de la presente divulgación que una molécula de anticuerpo puede unirse solamente con uno de los dominios de unión del anticuerpo a un antígeno, por ejemplo, tiene una única interacción antígeno-anticuerpo y, por tanto, no es capaz de reticular el antígeno.

Tal como se usa en el presente documento, el término "diana" debe entenderse, en el contexto de la presente divulgación, como una molécula a la que se dirige la región de unión del polipéptido que comprende un dominio Fc y una región de unión, cuando se utiliza en el contexto de la unión de un anticuerpo, incluye cualquier antígeno dirigido contra el anticuerpo sensibilizado. Los términos "antígeno" y "diana" pueden utilizarse indistintamente en relación con un anticuerpo y tienen el mismo significado y finalidad con respecto a cualquier aspecto o realización de la presente divulgación.

Tal como se usa en el presente documento, el término "unión" la expresión "se une específicamente" en el contexto de la unión de un anticuerpo a un antígeno predeterminado normalmente es una unión con una afinidad correspondiente a una K^dde aproximadamente 10"6 M o menos, por ejemplo 10"7 M o menos, tal como aproximadamente 10"8 M o menos, tal como aproximadamente 10"9 M o menos, aproximadamente 10"10 M o menos, o aproximadamente 10"11 M o incluso menos cuando se determina mediante, por ejemplo, tecnología de resonancia de plasmón de superficie (SPR, por sus siglas en inglés) en un instrumento BIAcore 3000 que usa el antígeno como el ligando y el anticuerpo como el analito, y se une al antígeno predeterminado con una afinidad correspondiente a una K^dque es al menos diez veces menor, tal como al menos 100 veces menor, por ejemplo, al menos 1000 veces menor, tal como al menos 10.000 veces menor, por ejemplo, al menos 100.000 veces menor que su afinidad por unirse a un antígeno no específico (p. ej., BSA, caseína) distinto del antígeno predeterminado o un antígeno estrechamente relacionado. La cantidad con la que la afinidad es menor depende de la K^ddel anticuerpo, de modo que cuando la K^ddel anticuerpo es muy baja (es decir, el anticuerpo es muy específico), entonces, la cantidad con la que la afinidad por el antígeno es menor que la afinidad por un antígeno no específico puede ser de al menos 10.000 veces. El término "K^d"(M), tal como se usa en el presente documento, se refiere a la constante de disociación en equilibrio de una interacción anticuerpo-antígeno concreta.

Una "variante" o "variante de anticuerpo" o "variante de un anticuerpo precursor" de la presente divulgación es una molécula de anticuerpo o que comprende una o más mutaciones en comparación con un "anticuerpo precursor". De manera similar, una "variante" o "una variante de un polipéptido que comprende un dominio Fc de una inmunoglobulina y una región de unión" o "una variante de un polipéptido precursor que comprende un dominio Fc de una inmunoglobulina y una región de unión" de la presente divulgación es un "polipéptido que comprende un dominio Fc de una inmunoglobulina y una región de unión", que comprende una o más mutaciones en comparación con un "anticuerpo precursor que comprende un dominio Fc de una inmunoglobulina y una región de unión". Las diferentes expresiones se pueden utilizar indistintamente y tienen el mismo significado y finalidad con respecto a cualquier aspecto o realización de la presente divulgación. Los ejemplos de formatos de anticuerpos precursores incluyen, sin limitación, un anticuerpo natural, un anticuerpo de longitud completa o un fragmento de anticuerpo que contenga Fc, un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo humano o cualquier combinación de los mismos. Los ejemplos de mutaciones incluyen deleciones de aminoácidos, inserciones y sustituciones de aminoácidos en la secuencia del aminoácido precursor. Las sustituciones de aminoácidos pueden intercambiar un aminoácidos natural por otro aminoácido de origen natural, o por un derivado de aminoácido de origen no natural. Las sustituciones de aminoácidos pueden ser conservativas o no conservativas. En el contexto de la presente divulgación, las sustituciones conservativas pueden definirse mediante sustituciones dentro de las clases de aminoácidos reflejadas en una o más de las siguientes tres tablas:

l r min i r i i n n rv iv

continuación

Clases de sustituciones de restos de aminoácidos conservativas alternativas

Clasificaciones de restos de aminoácidos físicas funcionales alternativas

En el contexto de la presente divulgación, una sustitución en una variante se indica como:

Aminoácido original - posición - aminoácido sustituido;

Se utiliza el código de tres letras o el de una letra, incluidos los códigos Xaa y X para indicar los restos de aminoácidos. En consecuencia, la notación "E345R" o "Glu345Arg" significa, que la variante comprende una sustitución de ácido glutámico por arginina en la posición del aminoácido variante correspondiente al aminoácido en posición 345 en el anticuerpo precursor. , cuando los dos están alineados como se indica a continuación.

Cuando una posición como tal no está presente en un anticuerpo, pero la variante comprende una inserción de un aminoácido, por ejemplo:

Posición - aminoácido sustituido; se utiliza la notación, por ejemplo, "448E".

Esta notación es especialmente relevante en relación con la una o más modificaciones en una serie de polipéptidos o anticuerpos homólogos.

Análogamente, cuando la identidad del uno o más restos de aminoácidos de sustitución es irrelevante:

Aminoácido original - posición; o "E345".

Para una modificación donde el uno o más aminoácidos originales y/o uno o más aminoácidos sustituidos pueden comprender más de uno, pero no todos los aminoácidos, la sustitución de ácido glutámico por arginina, lisina o triptófano en la posición 345: "Glu345Arg,Lys,Trp" o "E345R,K,W" o "E345R/K/W" o "E345 a R, K o W" pueden utilizarse indistintamente en el contexto de la divulgación.

Además, la expresión "una sustitución" abarca una sustitución en uno cualquiera de los otros diecinueve aminoácidos naturales, o en otros aminoácidos, tales como aminoácidos no naturales. Por ejemplo, una sustitución del aminoácido E en la posición 345 incluye cada una de las siguientes sustituciones: 345A, 345C, 345D, 345G, 345H, 345F, 3451,345K, 345L, 345M, 345N, 345Q, 345R, 345S, 345T, 345V, 345W y 345Y. Esto es, por cierto, equivalente a la designación 345X, en donde la X designa cualquier aminoácido. Estas sustituciones también pueden designarse como E345A, E345C, etc., o E345A,C,ect, o E345A/C/ect. Lo mismo se aplica por analogía a todas y cada una de las posiciones mencionadas en el presente documento, para incluir específicamente en el presente documento cualquiera de dichas sustituciones.

Un aminoácido o segmento de una secuencia que "corresponde" a un aminoácido o segmento de otra secuencia es aquel que (i) se alinea con el otro aminoácido o segmento utilizando un programa estándar de alineación de secuencias como ALIGN, ClustalW o similar, típicamente en la configuración predeterminada y (ii) tiene una identidad de secuencia con la SEQ ID NO:1 de al menos el 50 %, al menos el 80 %, al menos 90 % o al menos 95 %. Por ejemplo, los alineamientos de secuencias mostrados en las Figuras 2 y 3 pueden utilizarse para identificar cualquier aminoácido en la secuencia Fc de IgG2, IgG3 o IgG4 que se corresponda con un aminoácido concreto en la secuencia Fc de IgG1.

La presente divulgación se refiere a variantes, a saber, anticuerpos precursores y/o variantes de anticuerpos, que tienen cierto grado de identidad con los aminoácidos P247 a K447 de las SEQ ID NOS:1, 2, 3, 4 y 5, dichos anticuerpos precursores y/o variantes se denominarán en adelante "anticuerpos homólogos".

Para los fines de la presente divulgación, el grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos, así como el grado de identidad entre dos secuencias de nucleótidos, se determina mediante el programa "align", que es un alineamiento Needleman-Wunsch (es decir, un alineamiento global). El programa se utiliza para alinear secuencias tanto de polipéptidos como de nucleótidos. La matriz de puntuación predeterminada BLOSUM50 se utiliza para los alineamientos de polipéptidos, y la matriz de identidad predeterminada se utiliza para los alineamientos de nucleótidos, la penalización del primer resto de un hueco es de -12 para polipéptidos y de -16 para nucleótidos. Las penalizaciones por tener más restos en un hueco son -2 para polipéptidos y -4 para nucleótidos.

"Align" forma parte del paquete FASTA versión v20u6 (véase W. R. Pearson y D. J. Lipman (1988), "Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85:2444-2448 y W. R. Pearson (1990) "Rapid and Sensitive Sequence Comparaison with FASTP and FASTA", Methods in Enzymology 183:63-98). Los alineamientos de proteínas FASTA utilizan el algoritmo Smith-Waterman sin limitación en el tamaño de hueco (véase "Smith-Waterman Algorithm"), T. F. Smith y M. S. Waterman (1981) J. Mol. Biolo. 147:195-197).

Tal como se usa en el presente documento, la expresión "célula efectora" se refiere a una célula inmunitaria que está implicada en la fase efectora de una respuesta inmunitaria, en contraposición con las fases innata y de activación de una respuesta inmunitaria. Los ejemplos de células inmunitarias incluyen una célula de origen mieloide o linfoide, por ejemplo, linfocitos (tal como linfocitos B y linfocitos T, incluidos linfocitos T citolíticos (CTL)), células citolíticas, linfocitos citolíticos naturales, macrófagos, monocitos, eosinófilos, células polimorfonucleares, tal como neutrófilos, granulocitos, mastocitos y basófilos. Algunas células efectoras expresan receptores de Fc (FcR) o receptores del complemento y llevan a cabo funciones inmunitarias específicas. En algunas realizaciones, una célula efectora tal como, por ejemplo, un linfocito citolítico natural, puede inducir ADCC. Por ejemplo, monocitos, macrófagos, neutrófilos, células dendríticas y células de Kupffer que expresan FcR, participan en la destrucción específica de células diana y en la presentación de antígenos a otros componentes del sistema inmunitario o en la unión a células que presentan antígenos. En algunas realizaciones, la ADCC puede potenciarse aún más mediante la activación clásica del complemento impulsada por el anticuerpo, lo que da lugar a la deposición de fragmentos de C3 activados en la célula diana. Los productos de escisión de C3 son ligandos de los receptores del complemento (CR), tales como CR3, expreso en células mieloides. El reconocimiento de los fragmentos del complemento por los RC en células efectoras puede fomentar una mayor ADCC mediada por el receptor Fc. En algunas realizaciones, la activación clásica del complemento impulsada por el anticuerpo produce fragmentos de C3 en la célula diana. Estos productos de escisión de C3 pueden fomentar la citotoxicidad celular directa dependiente del complemento (CDCC). En algunas realizaciones, una célula efectora puede fagocitar un antígeno diana, partícula diana o célula diana. La expresión de un receptor de FcR particular o receptor del complemento en una célula efectora puede estar regulada por factores humorales, tales como citocinas. Por ejemplo, se ha descubierto que la expresión de FcyRI está regulada positivamente por interferón y (IFN-y) y/o G-CSF. Esta expresión potenciada aumenta la actividad citotóxica de las células portadoras de F^cyRI contra las células diana. Una célula efectora puede fagocitar un antígeno diana o fagocitar o lisar una célula diana. En algunas realizaciones, la activación clásica del complemento impulsada por el anticuerpo produce fragmentos de C3 en la célula diana. Estos productos de escisión de C3 pueden fomentar la fagocitosis directa de las células efectoras o indirectamente al potenciar la fagocitosis mediada por anticuerpos.

Se pretende que el término "vector", tal como se usa en el presente documento, se refiera a una molécula de ácido nucleico que puede inducir la transcripción de un segmento de ácido nucleico ligado al vector. Un tipo de vector es un "plásmido", que tiene la forma de un bucle circular de ADN bicatenario. Otro tipo de vector es un vector vírico, en donde el segmento de ácido nucleico puede estar ligado al genoma vírico. Determinados vectores son capaces de replicarse de manera autónoma en una célula hospedadora en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores episómicos de mamífero). Otros vectores (tales como vectores no episómicos de mamífero) pueden integrarse en el genoma de una célula hospedadora tras su introducción en la célula hospedadora y de este modo se replican junto con el genoma del hospedador. Por otra parte, determinados vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que están unidos operativamente. Dichos vectores se denominan en el presente documento "vectores de expresión recombinantes" (o simplemente "vectores de expresión"). En general, los vectores de expresión útiles en las técnicas de ADN recombinante se encuentran normalmente en forma de plásmidos. En la presente memoria descriptiva, "plásmido" y "vector" pueden usarse indistintamente, ya que el plásmido es la forma de vector más comúnmente usada. Sin embargo, la presente divulgación pretende incluir dichas formas de vectores de expresión diferentes, tales como vectores víricos (tal como retrovirus, adenovirus y virus adenoasociados defectuosos para la replicación), que tienen funciones equivalentes.

La expresión "célula hospedadora recombinante" (o simplemente "célula hospedadora"), tal como se usa en el presente documento, pretende hacer referencia a una célula en la que se ha introducido un vector de expresión. Debe entenderse que dichos términos pretenden hacer referencia no solamente a la célula objeto en particular, sino también a la descendencia de dicha célula. Como pueden producirse determinadas mutaciones en generaciones posteriores debido a una mutación o a influencias ambientales, dicha descendencia puede, de hecho, ser idéntica a la célula original, pero aun así se incluyen dentro del alcance de la expresión "célula hospedadora", tal como se usa en el presente documento. Las células hospedadoras recombinantes incluyen, por ejemplo, transfectomas, tales como las células CHO, células HEK-293, PER.C6, células NS0 y células linfocíticas, y células procariotas tales como E. coli y otros hospedadores eucariotas como células vegetales y hongos.

El término "transfectoma", tal como se usa en el presente documento, incluye células hospedadoras eucariotas recombinantes que expresan el Ab o un antígeno diana, tales como las células CHO, PER.C6, células NS0, células HEK-293, células vegetales u hongos, incluidas las células de levadura.

El término "preparación" se refiere a preparaciones de variantes de anticuerpos y a las mezclas de diferentes variantes de anticuerpos que pueden tener mayor capacidad de formar oligómeros cuando interactúan con el antígeno asociado a una célula (por ejemplo, un antígeno expresado en la superficie de la célula), una membrana celular, un virión u otra estructura, permitiendo así una mayor unión de C1q, activación del complemento, CDC, ADCC, ADCP, otras funciones efectoras mediadas por Fc, internalización, regulación negativa, apoptosis, captación de conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC), avidez o una combinación de cualquiera de los mismos. Se proporcionan en los Ejemplos algunas ilustraciones de, por ejemplo, avidez de unión a Clq (Ejemplo 4), CDC (Ejemplos 5, 6 y 10, 16, 19, 22, 23, 24, 25); ADCC (Ejemplo 12) y eficacia in vivo (Ejemplo 20, 21). Las variantes de acuerdo con los aspectos del presente documento denominados como "mutante simple", "doble mutante" y "mutantes mixtos", se describe en más detalle a continuación, junto con ejemplos de procesos para su preparación y métodos de uso.

Tal como se usa en el presente documento, el término "afinidad" es la fuerza de unión de una molécula, por ejemplo, un anticuerpo, con otra, por ejemplo, una diana o antígeno, en un único sitio, como la unión monovalente de un sitio de unión a antígeno individual de un anticuerpo a un antígeno.

Tal como se usa en el presente documento, el término "avidez" se refiere a la fuerza combinada de múltiples sitios de unión entre dos estructuras, tal como entre múltiples sitios de unión a antígeno de anticuerpos que interactúan simultáneamente con una diana o, por ejemplo, entre el anticuerpo y el C1q. Cuando hay más de una interacción de unión presente, las dos estructuras solo se disociarán cuando todos los sitios de unión se disocien, y por lo tanto, la velocidad de disociación será más lenta que para los sitios de unión individuales y, por tanto, proporcionará una mayor fuerza de unión total eficaz (avidez) en comparación con la fuerza de unión de los sitios de unión individuales (afinidad).

Tal como se usa en el presente documento, el término "oligómero" se refiere a una molécula que consiste en más de una unidad monomérica, pero con un número limitado de unidades monoméricas (por ejemplo, anticuerpos), a diferencia de un polímero que, al menos en principio, consiste en un número ilimitado de monómeros. Los ejemplos de oligómeros son dímeros, trímeros, tetrámeros, pentámeros y hexámeros. A menudo se utilizan prefijos griegos para designar el número de unidades monoméricas del oligómero, por ejemplo, un tetrámero compuesto por cuatro unidades y un hexámero por seis unidades.

El término "oligomerización", tal como se usa en el presente documento, pretende referirse a un proceso que convierte los monómeros en un grado de polimerización finito. En la presente memoria, se observa, que la oligomerización de los dominios Fc se produce después de la unión a la diana por parte de los polipéptidos que contienen dominios Fc, tales como anticuerpos, preferentemente aunque no de forma limitativa en la superficie de una célula. La oligomerización de los anticuerpos puede evaluarse, por ejemplo, mediante un ensayo de unión a C1q en la superficie celular (como se describe en los ejemplos 4 y 9), el ensayo de eficacia de C1q (como se describe en el ejemplo 5) y la citotoxicidad dependiente del complemento descrita en los ejemplos 6, 10 y 19).

La expresión "se une a C1q", tal como se usa en el presente documento, pretende referirse a la unión de C1q en el contexto de la unión de C1q a un anticuerpo unido a su antígeno. Debe entenderse que el anticuerpo unido a su antígeno como algo que pasa tanto in vivocomo in vitro en el contexto descrito en el presente documento. La unión de C1q puede evaluarse, por ejemplo, utilizando un anticuerpo inmovilizado en una superficie artificial (por ejemplo, plástico en placas para ELISA), como se describe en el ejemplo 3) o mediante la unión a un antígeno predeterminado en una superficie celular o virión (como se describe en los ejemplos 4 y 9). La unión de C1q a un oligómero de anticuerpo debe entenderse en la presente memoria como una interacción multivalente que da lugar a una unión de alta avidez.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión "activación del complemento" se refiere a la activación de la ruta clásica del complemento, que se activa por la unión del componente del complemento C1q a un anticuerpo unido a su antígeno. C1q es la primera proteína en los primeros eventos de la cascada del complemento clásica que implica una serie de reacciones de escisión que culminan en la formación de una actividad enzimática denominada C3 convertasa, que escinde el componente del complemento C3 en C3b y C3a. C3b se une covalentemente a C5 en la membrana para formar C5b, que a su vez activa eventos tardíos de la activación del complemento en los que los componentes del complemento terminales C5b, C6, C7, C8 y C9 se ensamblan en un complejo de ataque a la membrana (MAC). La cascada del complemento da como resultado la creación de poros debido a los cuales se produce la lisis celular, también conocida como CDC. La activación del complemento puede evaluarse utilizando la eficacia de C1q (como se describe en el ejemplo 5), cinética de CDC (tal como se describe en los Ejemplos 28, 29 y 30), ensayos de CDC (como se describe en los ejemplos 6, 10, 19, 25, 27 y 33) o mediante el método del depósito celular de C3b y C4b descrito en Beurskens et al 1 de abril de 2012vol. 188 n.° 7: 3532-3541.

La expresión "citotoxicidad dependiente del complemento" ("CDC"), tal como se usa en el presente documento, pretende referirse al proceso de activación del complemento mediado por el anticuerpo que da como resultado la lisis del anticuerpo unido a su diana en una célula o virión como resultado de los poros en la membrana que se crean por el ensamblaje de MAC. La CDC puede evaluarse mediante un ensayo in vitro tal como un ensayo de CDC en el que se utiliza suero humano normal como fuente de complemento, como se describe en los ejemplos 6, 10, 19, 25, 27 y 33 o en un ensayo de eficacia de C1q, como se describe en el ejemplo 5, en el que el suero humano normal tiene limitación de C1q.

La expresión "citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo" ("ADCC"), como se utiliza en el presente documento, pretende referirse a un mecanismo para la destrucción de células o viriones diana recubiertos con anticuerpo mediante células que expresan receptores Fc que reconocen la región constante del anticuerpo unido. La ADCC puede determinarse por métodos como, por ejemplo, el ensayo de ADCC descrito en el ejemplo 12.

La expresión "fagocitosis celular dependiente de anticuerpo" ("ADCP"), como se utiliza en el presente documento, pretende referirse a un mecanismo para eliminar células o viriones diana recubiertos con anticuerpo mediante su internalización por fagocitos. Las células o los viriones diana recubiertos de anticuerpos e internalizados se confinan en una vesícula llamada fagosoma, que a continuación se fusiona con uno o más lisosomas para formar un fagolisosoma. La ADCP puede evaluarse utilizando un ensayo de citotoxicidad in vitro con macrófagos como células efectoras y videomicroscopía, como se describe en van Bij et al. en el volumen 53 del Journal of Hepatology, fascículo 4, octubre de 2010, páginas 677-685. O como se describe en el ejemplo 14 para, por ejemplo, S. aureus fagocitado por PMN.

La expresión "citotoxicidad celular dependiente del complemento" ("CDCC"), como se utiliza en el presente documento, se refiere a un mecanismo de destrucción de células o viriones diana por células que expresan receptores del complemento que reconocen los productos de escisión del complemento 3 (C3) que están unidos covalentemente a las células o viriones diana como resultado de la activación del complemento mediada por anticuerpo. La CDCC puede evaluarse de forma similar a la descrita para la ADCC.

El término "regulación negativa", tal como se usa en el presente documento, pretende referirse a un proceso que disminuye el número de moléculas, tales como antígenos o receptores, en una superficie celular, por ejemplo, mediante la unión de un anticuerpo a un receptor.

El término "internalización", tal como se usa en el presente documento, pretende referirse a cualquier mecanismo por el que un anticuerpo o polipéptido que contiene Fc se internaliza en una célula que expresa la diana desde la superficie celular y/o desde el medio circundante, por ejemplo, mediante endocitosis. La internalización de un anticuerpo se puede evaluar usando un ensayo directo que mide la cantidad de anticuerpo internalizado (tal como, por ejemplo, el ensayo de colocalización lisosómica descrito en el Ejemplo 26).

La expresión "conjugado anticuerpo-fármaco", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un anticuerpo o polipéptido que contiene Fc que tiene especificidad por al menos un tipo de célula neoplásica, un fármaco, y un enlazador que acopla el fármaco a, por ejemplo, el anticuerpo. El enlazador es escindible o no escindible en presencia de la célula neoplásica; en donde el conjugado de anticuerpo-fármaco destruye la célula neoplásica. La expresión " captación de un conjugado anticuerpo-fármaco", como se utiliza en el presente documento, se refiere al proceso por el cual los conjugados de anticuerpo-fármaco se unen a una diana sobre una célula seguido de la captación/internalización por la membrana celular y de este modo se arrastra al interior de la célula. La captación del conjugado anticuerpo-fármaco puede evaluarse como "internalización y destrucción celular mediada por anticuerpos con un ADC dirigido contra TF en un ensayo de destrucción in vitro" como se describe en el documento WO 2011/157741.

El término "apoptosis", como se utiliza en el presente documento, se refiere al proceso de muerte celular programada (PCD) que se puede producir en una célula. Los eventos bioquímicos producen cambios celulares característicos (morfología) y la muerte. Estos cambios incluyen formación de burbujas, retracción celular, fragmentación nuclear, condensación de la cromatina y fragmentación del ADN cromosómico. La unión de un anticuerpo a un determinado receptor puede inducir la apoptosis.

La unión al receptor de Fc se puede medirse indirectamente como se describe en el Ejemplo 12.

El término "FcRn", como se utiliza en el presente documento, se refiere al receptor Fc neonatal que es un receptor Fc. Se descubrió por primera vez en roedores como un receptor único capaz de transportar IgG desde la leche materna a través del epitelio del intestino de los roedores recién nacidos hasta el torrente sanguíneo de los recién nacidos. Estudios posteriores revelaron un receptor similar en los seres humanos. En seres humanos, sin embargo, se ha descubierto en la placenta, para ayudar a facilitar el transporte de las IgG maternas hasta el feto en desarrollo, y también se ha demostrado que tiene un papel en el control de la sustitución de IgG. El FcRn se une a la IgG a un pH ácido de 6,0-6,5 pero no a un pH neutro o superior. Por lo tanto, FcRn se puede unir a la IgG en la luz del intestino (el interior del intestino) a un pH ligeramente ácido y garantizar una transporte unidireccional suficiente hasta la cara basolateral (dentro del cuerpo) donde el pH es de neutro a básico (pH 7,0-7,5). Este receptor también tiene un papel en la recuperación de IgG en el adulto mediante su aparición en la ruta de la endocitosis de las células endoteliales. Los receptores FcRn de los endosomas ácidos se unen a las IgG internalizadas mediante pinocitosis, recirculándolas hasta la superficie celular, liberándolas en el pH básico de la sangre, evitando así que tengan una degradación lisosómica. Este mecanismo puede explicar la mayor semivida de las IgG en la sangre en comparación con otros isotipos. El Ejemplo 13 describe un ensayo que muestra la unión de IgG a FcRn a pH 6,0 en ELISA.

La expresión "Proteína A", como se usa en el presente documento, pretende referirse a una proteína de superficie MSCRAMM de 56 kDa que se encuentra originalmente en la pared celular de la bacteria Staphylococcus aureus. Está codificada por el gen spa y su regulación está controlada por la topología del ADN, osmolaridad celular y un sistema bicomponente denominado ArlS-ArlR. Es de utilidad en la investigación bioquímica por su capacidad para unirse a las inmunoglobulinas. Está compuesta por cinco dominios de unión a Ig homólogos que se pliegan en un haz de tres hélices. Cada dominio puede unirse a proteínas de muchas especies de mamíferos, sobre todo las IgG. Se une a la región Fc de la cadena pesada de la mayoría de las inmunoglobulinas (superponiéndose al sitio de unión conservado de los receptores FcRn) y también interactúa con la región Fab de la familia VH3 humana. A través de estas interacciones en el suero, las moléculas de IgG se unen a las bacterias a través de su región Fc en lugar de hacerlo únicamente a través de sus regiones Fab, mediante lo cual, la bacteria interrumpe la opsonización, la activación del complemento y la fagocitosis.

La expresión "Proteína G", como se utiliza en el presente documento, pretende referirse a una proteína de unión a inmunoglobulinas expresada en las bacterias estreptocócicas de los grupos C y G, muy parecida a la Proteína A, pero con diferentes especificidades. Se trata de una proteína de superficie celular de 65 kDa (proteína G148) y 58 kDa (proteína G C40) que se aplica en la purificación de anticuerpos a través de su unión a la región Fc.

La expresión "región CH2" o "dominio CH2", como se usa en el presente documento, pretende referirse a la región CH2 de una inmunoglobulina. De este modo, por ejemplo, la región CH2 de un anticuerpo de IgG1 humana corresponde a los aminoácidos 228-340 según el sistema de numeración de la UE.

La expresión "región CH3" o "dominio CH3", como se usa en el presente documento, pretende referirse a la región CH3 de una inmunoglobulina. De este modo, por ejemplo, la región CH3 de un anticuerpo de IgG1 humana corresponde a los aminoácidos 341-447 según el sistema de numeración de la UE.

El término "mutaciones alostéricas", tal como se usa en el presente documento, pretende referirse a modificaciones, por ejemplo inserciones, sustituciones y deleciones, de los aminoácidos P247 y E430, en polipéptidos que contienen el dominio Fc, según la numeración del índice UE, tal como se establece en Kabat.

El término "mutaciones de botón hidrófobo", tal como se usa en el presente documento, pretende referirse a modificaciones, por ejemplo inserciones, sustituciones y deleciones, de los aminoácidos 1253, y S254 y Q311, en polipéptidos que contienen el dominio Fc, según la numeración del índice UE, tal como se establece en Kabat. Los botones hidrófobos se describen en Delano WL, et al., Science 287, (2000), páginas 1279-1283, por ejemplo, en la página 1281.

La expresión "mutaciones en la hélice CH3 del extremo N", tal como se usa en el presente documento, pretende referirse a modificaciones, por ejemplo inserciones, sustituciones y deleciones, de los aminoácidos R355 y D356 y E356 y E357 y M358 y L358 y ^t359, más específicamente de D356 y E356 y T359, en polipéptidos que contienen el dominio Fc, según la numeración del índice U^e, tal como se establece en Kabat.

La expresión "mutaciones en la cadena beta de CH3 del extremo N", tal como se usa en el presente documento, pretende referirse a modificaciones, por ejemplo inserciones, sustituciones y deleciones, de los aminoácidos Y436 y T437 y Q438 y K439 y S440 y L441, más específicamente de Y436 y K439 y S440, en polipéptidos que contienen el dominio Fc, según la numeración del índice U^e, tal como se establece en Kabat.

Métodos para alterar una función efectora de un anticuerpo

Debe entenderse que todas las realizaciones descritas en el presente documento con referencia a un anticuerpo precursor, primer anticuerpo precursor o segundo anticuerpo precursor también deberán entenderse como realizaciones relativas a un polipéptido, primer precursor o segundo precursor, que comprende un dominio Fc de una inmunoglobulina y una región de unión.

La presente divulgación también se refiere a un método para aumentar la función efectora de un polipéptido precursor que comprende un dominio Fc de una inmunoglobulina y una región de unión, cuyo método comprende introducir una mutación en el polipéptido precursor en al menos un resto de aminoácido seleccionado entre los correspondientes a E345, E430, S440, Q386, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Y436 y K447 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, con la condición de que la mutación en S440 sea S440Y o S440W.

En una realización, el polipéptido precursor puede ser un anticuerpo.

Por tanto, la presente divulgación también se refiere a un método para aumentar la función efectora de un polipéptido precursor, que comprende introducir una mutación en el anticuerpo precursor en al menos un resto de aminoácido seleccionado entre los correspondientes a E345, E430, S440, Q386, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Y436 y K447 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, con la condición de que la mutación en S440 sea S440Y o S440W.

La referencia a "D/E356" se refiere en el presente contexto a las variantes alotípicas en la secuencia de la IgG1 humana. En el alotipo IgGlm(za) de la IgG1 humana, el aminoácido en la posición 356 es D, mientras que en el alotipo IgG1m(f) de la IgG1 humana, el aminoácido en la posición 356 es E.

La introducción de una mutación en un anticuerpo precursor según un método o uso de la presente divulgación da como resultado una variante o variante de anticuerpo. Por tanto, el método o métodos de la presente divulgación pueden llevarse a cabo para obtener cualquier variante o variante de anticuerpo que se describe en el presente documento.

La variante de anticuerpo obtenida a partir de un método o uso de la presente divulgación tiene una función efectora aumentada en comparación con el anticuerpo precursor. De forma típica, el efecto de un anticuerpo sobre una función efectora puede determinarse mediante el valor CE50, que es la concentración del anticuerpo necesaria para obtener la mitad del valor de la lisis máxima.

La lisis máxima es la lisis obtenida cuando se utiliza una cantidad del anticuerpo en saturación, donde saturación se refiere a la cantidad de anticuerpo para la cual todos los antígenos del anticuerpo están unidos al anticuerpo.

La expresión "aumentar una función efectora" o "mejorar una función efectora" se refiere en el contexto de la presente divulgación a que hay una disminución del valor CE50 de la variante de anticuerpo en comparación con el anticuerpo precursor. La disminución del valor CE50 puede ser, por ejemplo, de al menos o aproximadamente 2 veces, tal como al menos o aproximadamente 3 veces, o al menos o aproximadamente 5 veces, o al menos o aproximadamente 10 veces. Como alternativa, "aumentar una función efectora" o "mejorar una función efectora" significa que hay un aumento en la cantidad máxima de células lisadas (donde la cantidad total de células se fija en el 100%) por ejemplo del 10% al 100% de todas las células, tal como en aproximadamente un 10%, aproximadamente un 20 %, aproximadamente un 30 %, aproximadamente un 40 %, aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 60 %, aproximadamente un 70 %, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 90 % y aproximadamente un 100% en condiciones donde el anticuerpo precursor lisa menos del 100% de todas las células.

Se puede someter a ensayo una variante para determinar el aumento o mejora de la función efectora clonando los dominios variables de la cadena pesada de IgG1-005 o IgG1-7D8 en la variante y analizar su eficacia en ensayos CDC, como los descritos para Daudi (Ejemplo 6) y Wien (Ejemplo 10). Utilizando un dominio variable HC IgG1-7D8 y células Daudi, se definiría un aumento por una CE50 más de 2 veces inferior a la CE50 de la IgG1-7D8 en la condición estudiada, tal como aproximadamente 2 veces, aproximadamente 3 veces, aproximadamente 5 veces, aproximadamente 10 veces más de 10 veces inferior al valor de CE50, la concentración a la que se observa la lisis semimáxima. Utilizando un dominio variable HC IgG1-005 y células Daudi, se definiría un aumento por una CE50 más de 2 veces inferior a la CE50 de la IgG1-005 en la condición estudiada, tal como aproximadamente 2 veces, aproximadamente 3 veces, aproximadamente 5 veces, aproximadamente 10 veces más de 10 veces inferior al valor de CE50, la concentración a la que se observa la lisis semimáxima. Utilizando un dominio variable HC IgG1-7D8 y células Wien133, se definiría un aumento por una CE50 más de 2 veces inferior a la CE50 de la IgG1-7D8 en la condición estudiada, tal como aproximadamente 2 veces, aproximadamente 3 veces, aproximadamente 5 veces, aproximadamente 10 veces más de 10 veces inferior al valor de CE50, la concentración a la que se observa la lisis semimáxima. Utilizando un dominio variable HC IgG1-005 y células Wien133, se definiría un aumento por un incremento en la lisis semimáxima comprendido de 10% al 100% para todas las células, tal como en aproximadamente un 10 %, aproximadamente un 20 %, aproximadamente un 30 %, aproximadamente un 40 %, aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 60 %, aproximadamente un 70 %, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 90% y aproximadamente un 100%. Un aumento en la eficacia de CDC también podría definirse por un valor de CE50 más de 2 veces inferior a la CE50 de la IgG1-005 en la condición estudiada, tal como aproximadamente 2 veces, aproximadamente 3 veces, aproximadamente 5 veces, aproximadamente 10 veces más de 10 veces inferior al valor de CE50, la concentración a la que se observa una lisis semimáxima en las condiciones en las que se detecta la lisis de las células Wien133.

La divulgación también se refiere a mutaciones en estas posiciones específicas que tienen un efecto mejorado en las funciones efectoras de la variante de anticuerpo, que se por introducción de una mutación en un anticuerpo precursor de acuerdo con un método de la presente divulgación (por ejemplo, como se muestra en el Ejemplo 19). Sin pretender imponer ninguna teoría, se cree que la sustitución de al menos un aminoácido del grupo de posiciones anteriormente mencionado estimula la oligomerización. Los anticuerpos se unen con mayor avidez (ilustrado en el ejemplo 2; el etiquetado directo de IgG-7D8-E345R produjo un aumento de la unión a células Daudi en comparación con IgG-7D8-WT), lo que hace que los anticuerpos se unan durante más tiempo a las células y, por tanto, que se habiliten diferentes funciones efectoras, por ejemplo, aumento de la unión de C1q, eficacia de ^cD^cpor C1q, ADCC, internalización, ADCP y/o eficacia in vivo. Estos efectos se han ilustrado en el ejemplo 4 (unión de C1q a las células), ejemplo 5 (eficacia de C1q en un ensayo CDC), ejemplo 6, 7, 27, 28 y 29 (ensayo CDC), ejemplo 12 (ADCC), ejemplo 26 (internalización) y ejemplos 21 y 22 (eficacia in vivo).

Así, la mutación de un resto de aminoácido seleccionado entre los correspondientes a E345, E430, S440, Q386, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Y436 y K447 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana también se pueden denominar como aspecto de "mutante simple" o "mutaciones potenciadoras del efector" en el contexto de la presente divulgación.

En otro aspecto, la presente divulgación también proporciona el uso de una o más mutaciones de la Tabla 1, tal como una mutación de un resto de aminoácido seleccionado entre los correspondientes a E345, E430, S440, Q386, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Y436 y K447 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, para aumentar una función efectora, por ejemplo, uno o más de (i) unión a C1q, (ii) activación del complemento, (iii) CDC, (iv) formación de oligómeros, (v) estabilidad del oligómero, (vi) citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (CCDA), (vii) unión a FcRn, (viii) unión al receptor Fc-gamma, (ix) unión a la proteína A, (x) unión a la proteína G, (xi) fagocitosis celular dependiente de anticuerpo (ADCP), (xii) citotoxicidad celular dependiente del complemento (CDCC), (xiii) citotoxicidad potenciada por el complemento, (xiv) unión al receptor del complemento de un anticuerpo opsonizado mediada por el anticuerpo, (xv) internalización, (xvi) regulación negativa, (xvii) inducción de la apoptosis, (xviii) opsonización y (xix) una combinación de cualquiera de (i) a (xviii), de un anticuerpo cuando se une a su antígeno en una célula, sobre una membrana celular, sobre un virión o sobre otra partícula. En una realización de (iv) o (v), el oligómero es un hexámero. En una realización, al menos otra función efectora del anticuerpo, tal como la unión a C1q, activación del complemento, citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC), unión a FcRn, unión al receptor Fc-gamma, unión a la proteína A, unión a la proteína G, ADCP, citotoxicidad celular dependiente del complemento (CDCC), citotoxicidad potenciada por el complemento, unión al receptor del complemento de un anticuerpo opsonizado mediada por el anticuerpo, fagocitosis mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCP), internalización, apoptosis, y/o unión al receptor del complemento de un anticuerpo opsonizado está también aumentada o alternativamente aumentada, como en particular la unión a FcRn, ADCC, unión al receptor Fc-gamma, unión a la proteína A, unión a la proteína G, ADCP, CDCC, citotoxicidad potenciada por el complemento, opsonización y cualesquiera combinaciones de los mismos.

En una realización, la función efectora del anticuerpo precursor se incrementa cuando el anticuerpo precursor se une a su antígeno en una célula que lo expresa, sobre una membrana celular o sobre un virión.

La presente divulgación también se refiere a introducir una mutación en un anticuerpo precursor, en un resto de aminoácido correspondiente a uno de K439 o S440 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana que disminuye la función efectora del anticuerpo precursor (ejemplos 5, 6 y 10).

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un método para disminuir la función efectora de un polipéptido precursor que comprende un dominio Fc de una inmunoglobulina y una región de unión, cuyo método comprende introducir una mutación en el polipéptido precursor en un resto de aminoácido seleccionado entre los correspondientes a K439 y S440 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, con la condición de que la mutación en S440 no sea S440Y o S440W, tal como en donde la mutación en la posición correspondiente a K439 en la región Fc de la cadena pesada de IgG1 humana es K439D/E, y/o la mutación en la posición correspondiente a S440 en la región Fc de la cadena pesada de IgG1 humana es S440K/H/R.

En una realización, el polipéptido precursor puede ser un anticuerpo.

Así, en otro aspecto, la presente divulgación también se refiere también a un método para disminuir la función efectora de un anticuerpo precursor, que comprende introducir una mutación en el anticuerpo precursor en un resto de aminoácido seleccionado entre los correspondientes a K439 y S440 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, con la condición de que la mutación en S440 no sea S440Y o S440W, tal como en donde la mutación en la posición correspondiente a K439 en la región Fc de la cadena pesada de IgG1 humana es K439D/E, y/o la mutación en la posición correspondiente a S440 en la región Fc de la cadena pesada de IgG1 humana es S440K/H/R.

Como se muestra en el ejemplo 6, la sustitución de aminoácidos en la posición K439E o S440K, como "mutantes simples" disminuye la c Dc en comparación con una cualquiera de las primeras mutaciones de acuerdo con el método de la presente divulgación.

La variante de anticuerpo obtenida a partir de dicho método de disminuir la función efectora tiene una función efectora disminuida en comparación con el anticuerpo precursor. De forma típica, el efecto de un anticuerpo sobre una función efectora puede medirse por el valor Ce50, que es la concentración del anticuerpo necesaria para obtener la mitad del valor de la lisis máxima.

La expresión "disminución una función efectora" se refiere en el contexto de la presente divulgación a que hay un aumento en el valor CE50 de la variante de anticuerpo en comparación con el anticuerpo precursor. El aumento del valor CE50 puede ser, por ejemplo, de al menos o aproximadamente 2 veces, tal como al menos o aproximadamente 3 veces, o al menos o aproximadamente 5 veces, o al menos o aproximadamente 10 veces. Como alternativa, "disminuir una función efectora" significa que hay una disminución de la cantidad máxima de células lisadas por ejemplo del 10% al 100% de todas las células, tal como aproximadamente un 10%, aproximadamente un 20 %, aproximadamente un 30 %, aproximadamente un 40 %, aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 60 %, aproximadamente un 70 %, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 90 % y aproximadamente un 100% en condiciones donde el anticuerpo precursor lisa menos del 100% de todas las células.

Se puede someter a ensayo una variante para determinar la disminución de la función efectora clonando los dominios variables de la cadena pesada de IgG1-005 o IgG1-7D8 en la variante y analizar su eficacia en ensayos CDC, como los descritos para Daudi (Ejemplo 6) y Wien (Ejemplo 10). Utilizando un dominio variable HC IgG1-7D8 y células Daudi, se definiría la disminución por una CE50 más de 2 veces inferior a la CE50 de la IgG1-7D8 en la condición estudiada, tal como aproximadamente 2 veces, aproximadamente 3 veces, aproximadamente 5 veces, aproximadamente 10 veces más de 10 veces inferior al valor de CE50, la concentración a la que se observa la lisis semimáxima. Utilizando un dominio variable HC IgG1-005 y células Daudi, se definiría una disminución por una CE50 más de 2 veces inferior a la CE50 de la IgG1-005 en la condición estudiada, tal como aproximadamente 2 veces, aproximadamente 3 veces, aproximadamente 5 veces, aproximadamente 10 veces más de 10 veces inferior al valor de CE50, la concentración a la que se observa la lisis semimáxima. Utilizando un dominio variable HC IgG1-7D8 y células Wien133, se definiría la disminución por una CE50 más de 2 veces inferior a la CE50 de la IgG1-7D8 en la condición estudiada, tal como aproximadamente 2 veces, aproximadamente 3 veces, aproximadamente 5 veces, aproximadamente 10 veces más de 10 veces inferior al valor de CE50, la concentración a la que se observa la lisis semimáxima. Utilizando un dominio variable HC IgG1-005 y células Wien133, se definiría una disminución por un incremento en la lisis máxima comprendido de 10% al 100% para todas las células, tal como en aproximadamente un 10 %, aproximadamente un 20 %, aproximadamente un 30 %, aproximadamente un 40 %, aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 60 %, aproximadamente un 70 %, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 90 % y aproximadamente un 100 %. Una disminución en la eficacia de CDC también podría definirse por un valor de CE50 más de 2 veces inferior a la CE50 de la IgG1-005 en la condición estudiada, tal como aproximadamente 2 veces, aproximadamente 3 veces, aproximadamente 5 veces, aproximadamente 10 veces más de 10 veces inferior al valor de CE50, la concentración a la que se observa una lisis semimáxima en las condiciones en las que se detecta la lisis de las células Wien133.

En una realización, la función efectora disminuye, cuando el anticuerpo precursor se une a su antígeno en una célula que expresa el antígeno, sobre una membrana celular o sobre un virión.

Por tanto, en otro aspecto, la divulgación se refiere al uso de al menos una mutación adicional en una variante de anticuerpo que comprende una mutación en un resto de aminoácido seleccionado entre los correspondientes a K439 y S440 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, con la condición de que la mutación en S440 no sea S440Y o S440W, para restaurar una función efectora de la variante del anticuerpo cuando está unido a su antígeno en una célula que expresa el antígeno, sobre una membrana celular o sobre un virión, en donde

la primera mutación se realiza en un resto de aminoácido que corresponde a K439 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana y la segunda mutación se realiza en un resto de aminoácido correspondiente a S440 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, o

la primera mutación se realiza en un resto de aminoácido correspondiente a S440 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana y la segunda mutación se realiza en un resto de aminoácido correspondiente a K439 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana.

En una realización, el anticuerpo precursor es un anticuerpo monoespecífico, biespecífico o multiespecífico.

Si el anticuerpo precursor es un anticuerpo monoespecífico que comprende dos regiones CH2-CH3, una mutación de acuerdo con la presente divulgación puede en principio estar presente solamente en una de las regiones CH2-CH3, aunque para la mayoría de los fines prácticos una mutación que aumenta o disminuye una función efectora de acuerdo con la presente divulgación está presente en ambas regiones CH2-CH3.

Si el anticuerpo precursor es un anticuerpo biespecífico que comprende dos regiones CH2-CH3, una mutación de acuerdo con la presente divulgación puede en principio estar presente solamente en una de las regiones CH2-CH3; es decir, en cualquiera de la primera o segunda región CH2-CH3, aunque para la mayoría de los fines prácticos una mutación que aumenta o disminuye una función efectora de acuerdo con la presente divulgación está presente tanto en la primera como en la segunda región CH2-CH3 del anticuerpo biespecífico.

Los ejemplos adecuados de anticuerpos monoespecíficos, biespecíficos o multiespecíficos incluyen cualquiera de los descritos en el presente documento.

En una realización particular, el anticuerpo precursor o primer y/o segundo anticuerpo puede ser un anticuerpo biespecífico tal como la proteína heterodimérica descrita en el documento WO 11/131746, que se incorpora por referencia en el presente documento.

En una realización, el anticuerpo precursor es un anticuerpo biespecífico que comprende un primer anticuerpo que comprende una primera región CH2-CH3 de una inmunoglobulina y una primera región de unión a antígeno, y un segundo polipéptido que comprende una segunda región CH2-CH3 de una inmunoglobulina y una segunda región de unión a antígeno, en donde la primera y la segunda regiones de unión a antígeno se unen a diferentes epítopos del mismo antígeno o a diferentes antígenos.

En una realización adicional, dicha primera región CH2-CH3 comprende una sustitución de aminoácido adicional en una posición seleccionada entre las correspondientes a K409, T366, L368, K370, D399, F405 y Y407 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana; y en donde dicha segunda región CH2-CH3 comprende una sustitución adicional de aminoácido en una posición seleccionada entre las correspondientes a F405, T366, L368, K370, D399, Y407 y K409 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, y en donde dicha sustitución de aminoácido adicional en la primera región CH2-CH3 es diferente de dicha sustitución del aminoácido adicional en la segunda región CH2-CH3.

En una realización adicional, dicha primera región CH2-CH3 comprende una sustitución de aminoácido en una posición correspondiente a K409 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana; y dicha segunda región CH2-CH3 comprende una sustitución de aminoácido en una posición correspondiente a F405 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana.

En una realización, dicho método comprende introducir en cada una de dicha primera y segunda región CH2-CH3 una mutación en al menos un resto de aminoácido seleccionado entre los correspondientes a E345, E430, S440, Q386, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Y436 y K447 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, con la condición de que la mutación en S440 sea S440Y o S440W.

En una realización adicional, la mutación introducida en la primera y segunda región CH2-CH3 en al menos un resto de aminoácido seleccionada entre las correspondientes a E345, E430, S440, Q386, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Y436 y K447 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, con la condición de que la mutación en S440 sea S440Y o S440W, puede ser en la misma posición del resto de aminoácido o en una posición diferente. En una realización adicional, puede ser la misma mutación o una diferente en la misma posición del resto de aminoácido.

En otra realización, dicho método comprende introducir en la primera o segunda región CH2-CH3 una mutación en al menos un resto de aminoácido seleccionado entre los correspondientes a E345, E430, S440, Q386, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Y436 y K447 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, con la condición de que la mutación en S440 sea S440Y o S440W.

Cualesquiera de las mutaciones enumeradas en la Tabla 1 se puede introducir en el anticuerpo biespecífico. El Ejemplo 24 muestra que la introducción de la mutación E345R en un anticuerpo biespecífico CD20xEGFR mejora la eficacia de la CDC. Los Ejemplos 23, 29 y 30 también describen algunos de los diferentes anticuerpos biespecíficos que comprenden una mutación de acuerdo con la presente divulgación.

En una realización, dicho método comprende introducir la mutación en una o más posiciones distintas de S440 y K447, e introducir adicionalmente una mutación

(i) en cada uno de los restos de aminoácido correspondientes a K439 y S440 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, con la condición de que la mutación en S440 no sea S440Y o S440W,

(ii) en cada uno de los restos de aminoácido correspondientes a K447 y 448 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, tal como K447K/R/H y 448E/D en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, preferentemente K447K y 448E en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, o

(iii) en cada uno de los restos de aminoácido correspondientes a K447, 448 y 449 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, tales como K447D/E, 448K/R/H y 449P en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, preferentemente K447E, 448K y 449P en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana.

En una realización, dicho método comprende introducir la mutación en una o más posiciones diferentes de S440, e introducir adicionalmente una mutación en cada uno de los restos de aminoácido correspondientes a K439 y S440 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, con la condición de que la mutación adicional en S440 no sea S440Y o S440W.

La introducción de mutaciones en ambos restos de aminoácido correspondientes a K439 y S440 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana de un anticuerpo precursor, con la condición de que la mutación en S440 no sea S440Y o S440W también se denomina en el presente documento como el aspecto "doble mutante". Se ha descubierto que las mutaciones S440Y y S440W, como se ha descrito en otro lugar, aumentan una función efectora cuando se introducen en un anticuerpo precursor.

Como también se describe en otra parte, la presente divulgación se refiere a la introducción de mutaciones identificadas en un resto de aminoácido correspondiente a K439 o S440 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana que produce una disminución de una función efectora (ejemplos 5, 6, 10). Sin embargo, cuando se introducen mutaciones inhibidoras en ambos restos de aminoácido correspondientes a K439 y S440 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, se restaura la disminución de la función efectora, de manera que se parezca a la función efectora del anticuerpo precursor sin mutación en las mutaciones K439 y S440. Sin embargo, la presencia de las mutaciones K439 y S440, sin pretender imponer ninguna teoría, se cree que restringe la inducción de las funciones efectoras a los complejos oligoméricos formados exclusivamente por anticuerpos que exclusivamente comprenden ambas mutaciones K439 y S440. Así, si las mutaciones K439 y S440 se incluyen en un anticuerpo terapéutico, se cree, sin pretender imponer ninguna teoría, que cuando dichos anticuerpos terapéuticos se administren a un paciente, la inducción de las funciones efectoras queda limitada a los complejos de anticuerpos oligoméricos que contienen los anticuerpos terapéuticos que comprenden las mutaciones K439/S440, pero que no contienen los propios anticuerpos del paciente, que no comprenden las mutaciones K439 y S440, limitando de este modo los posibles efectos secundarios causados por la interacción del anticuerpo terapéutico con los propios anticuerpos del paciente.

Cuando se combinan las mutaciones en posición K439 y/o S440 con la primera mutación, se obtiene una mejora de la CDC y se aumenta la especificidad de la CDC.

Así, en otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un método para aumentar la especificidad de una combinación de al menos un primer y un segundo polipéptido precursor que comprende un dominio Fc de una inmunoglobulina y una región de unión, que comprende

A)

(i) introducir en el primer polipéptido precursor una mutación en un resto de aminoácido en la posición correspondiente a K439 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana; y

(ii) introducir en el segundo polipéptido precursor una mutación en un resto de aminoácido en la posición correspondiente a S440 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, con la condición de que la mutación en S440 no sea S440Y o S440W,

B)

(i) introducir en el primer polipéptido precursor una mutación en un resto de aminoácido en la posición correspondiente a K447D/E en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana; y

(ii) introducir en el segundo polipéptido precursor una mutación en un resto de aminoácido en la posición correspondiente a K447K/R/H y 448P en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana; o

C)

(ii) introducir en el segundo polipéptido precursor una mutación en un resto de aminoácido en la posición correspondiente a K447K/R/H, 448K/R/H y 449P en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana. En una realización, el polipéptido precursor, primer polipéptido precursor y segundo polipéptido precursor puede ser cada uno un anticuerpo.

Así, en un aspecto adicional, la presente divulgación se refiere a un método para aumentar la especificidad de una combinación de al menos un primer y un segundo anticuerpo precursor, que comprende

(i) introducir en el primer anticuerpo precursor una mutación en un resto de aminoácido en la posición correspondiente a K439 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana; y

(ii) introducir en el segundo anticuerpo precursor una mutación en un resto de aminoácido en la posición correspondiente a S440 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, con la condición de que la mutación en S440 no sea S440Y o S440W.

La primera y segunda variante de anticuerpo preferirán la oligomerización entre sí en comparación con cualquier anticuerpo no modificado o de origen natural como se muestra en el ejemplo 10.

El aumento de la especificidad es con respecto a la "inducción de una función efectora". Así, dicho método es, en una realización, un método para aumentar la especificidad de la inducción de una función efectora mediante una combinación de al menos un primer y un segundo anticuerpo precursor.

Realizando el método de aumentar la especificidad, o la especificidad de la inducción de una función efectora, mediante una combinación de al menos un primer y un segundo anticuerpo precursor, se obtiene una combinación de una primera variante y una segunda variante de anticuerpo.

Cuando se introduce una mutación en cualquiera de K439 o S440 de un anticuerpo precursor, la variante de anticuerpo obtenida de este modo tiene una función efectora disminuida en comparación con el anticuerpo precursor. Sin embargo, como también se describe en otra parte en el presente documento, las mutaciones en K439 y S440 pueden complementarse o restaurar la función efectora de un anticuerpo que comprenda ambas mutaciones. Esta capacidad de las mutaciones en K439 y S440 para complementarse mutuamente puede utilizarse de forma similar en dos anticuerpos. Por tanto, cuando se introduce una mutación de K439 en un primer anticuerpo precursor y se introduce una mutación de S440 en un segundo anticuerpo precursor, o viceversa, la disminución de la función efectora ya no se observa cuando la primera y la segunda variante de anticuerpo se utilizan combinadas. La expresión "aumentar la especificidad" o "mejorar la especificidad" se refiere en este contexto a que una respuesta efectora inducida por una combinación de la primera variante de anticuerpo que comprende una mutación en K439 y una segunda variante de anticuerpo que comprende una mutación en S440 es mayor que la respuesta efectora inducida por una cualquiera de la primera variante de anticuerpo que comprende una mutación en K439 o la segunda variante de anticuerpo que comprende una mutación en S440.

Al introducir ambas sustituciones de aminoácidos en K439 y S440, la especificidad de la oligomerización aumenta. Cuando se combinan las mutaciones en posición K439 y/o S440 con la primera mutación, se obtiene una mejora de la CDC y se aumenta la especificidad de la CDC.

En una realización, el al menos primer y segundo anticuerpos precursores se unen al mismo epítopo.

En una realización, el al menos primer y segundo anticuerpos precursores se unen a diferentes epítopos en el mismo antígeno.

En una realización, el al menos primer y segundo anticuerpos precursores se unen a diferentes epítopos sobre diferentes dianas.

En una realización, el primer y segundo anticuerpo precursor tienen secuencias de VL y VH iguales o diferentes. En una realización, la combinación de al menos un primer y un segundo anticuerpo precursor comprende un primer anticuerpo precursor y un segundo anticuerpo.

En una realización, la especificidad aumenta, cuando una combinación del primer y segundo anticuerpo precursor se une a su antígeno en una célula que expresa el antígeno, sobre una membrana celular o sobre un virión.

De este modo, otro aspecto de la presente divulgación también se refiere al uso de una mutación en dos o más restos de aminoácidos de un anticuerpo para aumentar la especificidad de, por ejemplo, la función efector inducida por, el anticuerpo cuando está unido a su antígeno en una célula que expresa el antígeno, sobre una membrana celular o sobre un virión, en donde

una primera mutación se realiza en un resto de aminoácido que corresponde a K439 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana;

una segunda mutación se realiza en un resto de aminoácido que corresponde a S440 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana.

En un segundo aspecto la presente divulgación se refiere a un método para aumentar la función efectora de una combinación de al menos un primer y un segundo polipéptido precursor, en donde cada uno del al menos primer y segundo polipéptido precursor comprende un dominio Fc de una inmunoglobulina y una región de unión, en donde dicho método comprende

(i) introducir en el al menos primer y/o segundo polipéptido precursor una mutación en uno o más restos de aminoácidos. seleccionados entre el grupo que consiste en:

(a) un resto de aminoácido dentro de la región CH2-CH3 que proporciona mutaciones alostéricas,

(b) un resto de aminoácido dentro de los botones hidrófobos de la región CH2-CH3,

(c) un resto de aminoácido dentro de la hélice CH3 del extremo N,

(d) un resto de aminoácido dentro de la cadena beta CH3 del extremo C, con la condición de que, cuando una mutación correspondiente a S440 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, la mutación sea S440Y o S440W, y

(e) un resto de aminoácido correspondiente a E345, E382 o Q386 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana.

En una realización, cada uno del primer y/o segundo polipéptido precursor puede ser un anticuerpo.

Así, en una realización la presente divulgación se refiere a un método para aumentar la función efectora de una combinación de al menos un primer y un segundo anticuerpo precursor, en donde cada uno del al menos primer y segundo anticuerpo precursor comprende un dominio Fc de una inmunoglobulina y una región de unión a antígeno, en donde dicho método comprende

(i) introducir en el al menos primer y/o segundo anticuerpo precursor una mutación en uno o más restos de aminoácidos. seleccionados entre el grupo que consiste en:

(c) un resto de aminoácido dentro de la hélice CH3 del extremo N,

Cuando se realiza este método, se obtiene una combinación de al menos una primera y una segunda variante de anticuerpo. La al menos primera y segunda variante de anticuerpo obtenidas por este método tienen, cuando se combinan, una función efectora aumentada en comparación con una combinación del primer y segundo anticuerpo precursor.

La expresión "función efectora aumentada " debe entenderse como se describe en el presente documento.

El primer y/o segundo anticuerpo precursor puede ser cualquier anticuerpo precursor como se describe en el presente documento.

Los métodos para aumentar una función efectora de una combinación de un primer y un segundo anticuerpo pueden realizarse, en particular, para obtener una primera y/o segunda variante de anticuerpo que tenga cualesquiera de las características de una variante de anticuerpo como se describe en el presente documento. La presente divulgación también se refiere a introducir una mutación en un resto de aminoácido seleccionado de (a), (b), (c), (d) y/o (e) que da como resultado una combinación de una primera y segunda variante de anticuerpo con una función efectora aumentada en comparación con una combinación del primer y segundo anticuerpo precursor.

En una realización, la combinación de al menos un primer y un segundo anticuerpo precursor comprende otros anticuerpos precursores, tales como un tercer, cuarto o quinto anticuerpo precursor.

En una realización, (a) un resto de aminoácido dentro de la región CH2-CH3 que proporciona mutaciones alostéricas es un resto de aminoácido seleccionado de entre los correspondientes a P247 o E430 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana.

En una realización, (b) un resto de aminoácido dentro de los botones hidrófobos de la región CH2-CH3 es un resto de aminoácido seleccionado de entre los correspondientes a 1253, S254 y Q311 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana.

En una realización, (c) un resto de aminoácido dentro de la hélice CH3 del extremo N es un resto de aminoácido seleccionado de entre las correspondientes D/E356 y T359 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana. En una realización, (d) un resto de aminoácido dentro de la cadena beta CH3 del extremo C es un resto de aminoácido seleccionado de entre los correspondientes a Y436 y S440.

Los restos de aminoácido en (b), (c), (d) y (e) son restos de aminoácidos que están situados en la interfaz Fc:Fc de dos anticuerpos, de este modo, la parte Fc de un anticuerpo que puede interactuar con la parte Fc de otro anticuerpo cuando los dos anticuerpos están cercanos entre sí.

Así, en una realización adicional, la mutación en el al menos primer y/o segundo anticuerpo precursor se realiza en al menos un resto de aminoácido seleccionado entre los correspondientes a E345, E430, S440, Q386, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Y436 y K447 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, con la condición de que la mutación en S440 sea S440Y o S440W.

En una realización, (i) comprende introducir una mutación tanto en el primero como en el segundo anticuerpo precursor.

En otra realización, dicho método comprende:

(i) introducir una mutación en el primer anticuerpo precursor en al menos un resto de aminoácido seleccionado entre los correspondientes a E345, E430, S440, Q386, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Y436 y K447 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, con la condición de que la mutación en S440 sea S440Y o S440W,

(ii) proporcionar el segundo anticuerpo precursor que no comprende una mutación en un resto de aminoácido seleccionada entre los correspondientes a E345, E430, S440, Q386, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Y436 y K447 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana.

En una realización, dicho método comprende introducir la mutación en al menos un resto de aminoácido distinto de S440, en donde dicho método además comprende las etapas de introducir la mutación en una o más posiciones diferentes de S440, y en donde dicho método además comprende las etapas de:

(i) introducir en el primer anticuerpo precursor una segunda mutación en el resto de aminoácido correspondiente a una posición K439 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana; y

(ii) introducir en el segundo anticuerpo precursor una segunda mutación en el resto de aminoácido correspondiente a una posición S440 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, con la condición de que la mutación en S440 no sea S440Y o S440W; en donde las etapas (ii) y (iii) pueden ser alternativamente (i) introducir en el primer anticuerpo precursor una segunda mutación en el resto de aminoácido correspondiente a una posición S440 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, con la condición de que la mutación en S440 no sea S440Y o S440W; y

(ii) introducir en el segundo anticuerpo precursor una segunda mutación en el resto de aminoácido correspondiente a una posición K439 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana.

Para aquellas realizaciones divulgadas en donde el segundo precursor no comprende una mutación en un resto de aminoácido seleccionada entre las correspondientes a E345, E430, S440, Q386, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Y436 y K447 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, la expresión "segunda mutación" de la etapa (ii) puede ser una primera mutación, por ejemplo, el segundo anticuerpo precursor puede no comprender otras mutaciones salvo la mutación introducida en la etapa (ii). La expresión "segunda mutación" en las etapas (i) y (ii) tampoco pretende limitar el número de mutaciones que se pueden introducir en el primer y/o segundo anticuerpo precursor.

En una realización, el anticuerpo precursor, el primer anticuerpo precursor y el segundo anticuerpo precursor pueden seleccionarse cada uno del grupo que consiste, aunque no de forma limitativa, en anticuerpos monoespecíficos, biespecíficos y multiespecíficos. El biespecífico puede ser, por ejemplo, una proteína heterodimérica.

En una realización, el primer y segundo anticuerpos precursores son anticuerpos monoespecíficos, que pueden, por ejemplo, unirse a los mismos o diferentes epítopos. Si el primer y segundo anticuerpo precursor se unen a diferentes epítopos, estos pueden estar en el mismo antígeno o en uno diferente.

En otra realización, el primer anticuerpo precursor es un anticuerpo monoespecífico y el segundo anticuerpo precursor es un anticuerpo biespecífico o multiespecífico, o viceversa.

En una realización, el primer y segundo anticuerpos precursores son anticuerpos biespecíficos o multiespecíficos. En una realización, el primer y segundo anticuerpos precursores biespecíficos o multiespecíficos son anticuerpos iguales o diferentes. En una realización, el primer y segundo anticuerpos precursores biespecíficos o multiespecíficos se unen a diferentes epítopos en el mismo antígeno o en diferentes antígenos. Así, en una realización, dichos al menos primer y segundo anticuerpos precursores son anticuerpos biespecíficos o multiespecíficos que se unen a diferentes epítopos del mismo antígeno o en diferentes antígenos.

En otra realización, el primer anticuerpo precursor es un anticuerpo monoespecífico y el segundo anticuerpo precursor es un anticuerpo biespecífico, o viceversa. El monoespecífico puede unirse al mismo epítopo que el biespecífico (una parte del biespecífico) o el monoespecífico y el biespecífico pueden unirse a diferentes epítopos del mismo antígeno o en diferentes antígenos. El anticuerpo biespecífico puede unirse a diferentes epítopos del mismo antígeno o diferentes antígenos.

En una realización, cada uno de dichos al menos primer y segundo anticuerpos precursores es un anticuerpo biespecífico que comprende un primer anticuerpo que comprende una primera región CH2-CH3 de una inmunoglobulina y una primera región de unión a antígeno, y un segundo polipéptido que comprende una segunda región CH2-CH3 de una inmunoglobulina y una segunda región de unión a antígeno, en donde la primera y la segunda regiones de unión a antígeno se unen a diferentes epítopos del mismo antígeno o a diferentes antígenos, y en donde dicha primera región CH2-CH3 comprende una sustitución de aminoácido adicional en una posición seleccionada entre las correspondientes a K409, T366, L368, K370, D399, F405 y Y407 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana; y en donde dicha segunda región CH2-CH3 comprende una sustitución adicional de aminoácido en una posición seleccionada entre las correspondientes a F405, T366, L368, K370, D399, Y407 y K409 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, y en donde dicha sustitución de aminoácido adicional en la primera región CH2-CH3 es diferente de dicha sustitución del aminoácido adicional en la segunda región CH2-CH3.

En una realización de los métodos y/o usos divulgados en el presente documento del anticuerpo precursor, ya se trate de un anticuerpo precursor, un primer anticuerpo precursor o un segundo anticuerpo precursor, puede contener otras mutaciones distintas a las de la presente divulgación que se ha comprobado que afectan a una función efectora. Estas otras mutaciones pueden introducirse al mismo tiempo que las mutaciones de la presente divulgación que afectan a una función efectora o pueden introducirse secuencialmente, los métodos o usos de la presente divulgación no se limitan a la introducción simultánea o secuencial de mutaciones. El anticuerpo biespecífico puede ser cualquier anticuerpo biespecífico y los métodos y usos de la presente divulgación no se limitan a ningún formato biespecífico en particular, ya que se prevé que puedan utilizarse diferentes formatos.

El método de combinar un primer anticuerpo que comprende una de dichas mutaciones que puede aumentar una función efectora con un segundo anticuerpo que no comprende dicha mutación puede, como se muestra en el Ejemplo 31, aumentar la función efectora de la combinación. Por tanto, sin pretender imponer ninguna teoría, se cree que, por ejemplo, este método puede utilizarse para combinar un anticuerpo terapéutico, como segundo anticuerpo, que ha demostrado ser seguro pero no lo suficientemente eficaz con un primer anticuerpo que incluye una mutación, y que por lo tanto da como resultado una combinación que es eficaz.

Así, en una realización, el segundo anticuerpo precursor que no comprende una mutación en un resto de aminoácido seleccionada entre las correspondientes a E345, E430, S440, Q386, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Y436 y K447 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, es un anticuerpo terapéutico. En una realización particular se trata de un anticuerpo terapéutico que tiene un perfil de seguridad adecuado. En una realización puede ser un anticuerpo terapéutico que tenga un perfil de seguridad adecuado pero que no sea suficientemente eficaz.

Los ejemplos de segundo anticuerpo que no comprenden una mutación en un resto de aminoácido seleccionado entre los correspondientes a E345, E430, S440, Q386, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Y436 y K447 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, incluyen, aunque no de forma limitativa, cualquiera de los siguientes; (90Y) clivatuzumab tetraxetan; (90Y) tacatuzumab tetraxetan; (99mTc) fanolesomab; (99mTc) nofetumomab Merpentan; (99mTc) pintumomab; 3F8; 8H9; abagovomab; abatacept; abciximab; Actoxumab; adalimumab; adecatumumab; afelimomab; aflibercept; Afutuzumab; alacizumab pegol; albiglutida; ALD518; alefacept; alemtuzumab; Alirocumab; altumomab; Altumomab pentetato; alvircept sudotox; amatuximab; AMG714/HuMax-IL15; anatumomab mafenatox; Anrukinzumab (= IMA-638); apolizumab; arcitumomab; aselizumab; atacicept; atinumab; Atlizumab (= tocilizumab); atorolimumab; baminercept; Bapineuzumab; basiliximab; bavituximab; bectumomab; belatacept; belimumab; benralizumab; bertilimumab; besilesomab; bevacizumab; Bezlotoxumab; biciromab; bifarcept; bivatuzumab; Bivatuzumab mertansine; blinatumomab; blosozumab; brentuximab vedotina; briakinumab; briobacept; brodalumab; canakinumab; cantuzumab mertansina; cantuzumab ravtansina; caplacizumab; capromab; Capromab pendetida; carlumab; catumaxomab; CC49; cedelizumab; certolizumab pegol; cetuximab; Ch.14.18; citatuzumab bogatox; cixutumumab; Clazakizumab; clenoliximab; Clivatuzumab tetraxetan; conatumumab; conbercept; CR6261; crenezumab; dacetuzumab; daclizumab; dalantercept; dalotuzumab; daratumumab; Demcizumab; denosumab; Detumomab; Dorlimomab aritox; drozitumab; dulaglutide; ecromeximab; eculizumab; edobacomab; edrecolomab; efalizumab; efungumab; elotuzumab; elsilimomab; enavatuzumab; enlimomab; enlimomab pegol; enokizumab; ensituximab; epitumomab; epitumomab cituxetan; epratuzumab; erlizumab; ertumaxomab; etanercept; etaracizumab; etrolizumab; exbivirumab; Fanolesomab; faralimomab; farletuzumab; Fasinumab; FBTA05; felvizumab; Fezakinumab; ficlatuzumab; figitumumab; flanvolumab; fontolizumab; foralumab; foravirumab; fresolimumab; fulranumab; galiximab; ganitumab; gantenerumab; gavilimomab; gemtuzumab; Gemtuzumab ozogamicin; gevokizumab; girentuximab; glembatumumab; Glembatumumab vedotin; golimumab; Gomiliximab; GS6624; anticuerpos dirigidos contra CD74; anticuerpos dirigidos contra cMet como se divulga en el documento WO 2011/110642; anticuerpos dirigidos contra Her2 como se divulga en los documentos WO 2011/147986 o WO 2011/147982; anticuerpos dirigidos contra IL8 como se divulga en el documento WO 2004/058797; anticuerpos dirigidos contra TAC como se divulga en el documento WO 2004/045512; anticuerpos dirigidos contra el factor tisular (TF) como se divulga en los documentos WO 2010/066803 o WO 2011/157741; ibalizumab; ibritumomab tiuxetan; icrucumab; igovomab; Imciromab; inclacumab; indatuximab ravtansine; infliximab; inolimomab; inotuzumab-ozogamicina; intetumumab; yodo (1241) girentuximab; ipilimumab; iratumumab; itolizumab; ixekizumab; keliximab; labetuzumab; lebrikizumab; lemalesomab; lenercept; lerdelimumab; lexatumumab; libivirumab; lintuzumab; lorvotuzumab mertansina; lucatumumab; lumiliximab; mapatumumab; maslimomab; matuzumab; mavrilimumab; mepolizumab; metelimumab; milatuzumab; minretumomab; mirococept; mitumomab; mogamulizumab; morolimumab; motavizumab; moxetumomab; pasudotox; muromonab-CD3; nacolomab tafenatox; namilumab; naptumomab estafenatox; narnatumab; natalizumab; nebacumab; necitumumab; nerelimomab; nimotuzumab; Nivolumab; Nofetumomab; merpentan; obinutuzumab; Ocaratuzumab; ocrelizumab; odulimomab; ofatumumab; olaratumab; olokizumab; omalizumab; onartuzumab; onercept; oportuzumab monatox; oregovomab; otelixizumab; oxelumab; ozoralizumab; pagibaximab; palivizumab; panitumumab; panobacumab; pascolizumab; pateclizumab; patritumab; pegsunercept; Pemtumomab; pertuzumab; pexelizumab; Pintumomab; Placulumab; ponezumab; priliximab; pritumumab; PRO 140; quilizumab; racotumomab; radretumab; rafivirumab; ramucirumab; ranibizumab; raxibacumab; regavirumab; reslizumab; RG1507/HuMax-IGF1R; RG1512/HuMaxpSelectin; rilonacept; rilotumumab; rituximab; robatumumab; roledumab; romosozumab; rontalizumab; rovelizumab; ruplizumab; samalizumab; sarilumab; satumomab; Satumomab pendetide; secukinumab; sevirumab; sibrotuzumab; sifalimumab; siltuximab; siplizumab; sirukumab; solanezumab; solitomab; Sonepcizumab; sontuzumab; sotatercept; stamulumab; sulesomab; suvizumab; tabalumab; Tacatuzumab tetraxetan; tadocizumab; talizumab; tanezumab; taplitumomab paptox; tefibazumab; telimomab aritox; tenatumomab; teneliximab; teplizumab; teprotumumab; TGN1412; Ticilimumab (= tremelimumab); tigatuzumab; TNX-650; Tocilizumab (= atlizumab); toralizumab; torapsel; tositumomab; tralokinumab; trastuzumab; trastuzumab emtansina; TRBS07; trebananib; tregalizumab; tremelimumab; tucotuzumab celmoleucina; tuvirumab; ublituximab; urelumab; urtoxazumab; ustekinumab; vapaliximab; vatelizumab; vedolizumab; veltuzumab; vepalimomab; vesencumab; visilizumab; volociximab; Vorsetuzumab mafodotina; votumumab; zalutumumab; zanolimumab; ziralimumab; y zolimomab aritox.

En una realización de los métodos y usos de la presente divulgación, la mutación en al menos un resto de aminoácido, o en uno o más restos de aminoácidos, correspondientes a E345, E430, S440, Q386, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Y436 y K447 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, con la condición de que la mutación en S440 sea S440Y o S440W, puede estar en cualquiera de las posiciones de aminoácidos ilustrativas y preferidas enumeradas en la Tabla 1. Así, cada una de las posiciones de aminoácidos enumeradas en la Tabla 1 es una realización independiente y no limitativa de una mutación en el al menos un aminoácido.

Cualesquiera de las mutaciones o combinaciones de las mismas descritas en el presente documento se puede introducir de acuerdo con un método de la presente divulgación.

Las mutaciones seleccionadas entre las sustituciones de aminoácidos ilustrativas o preferidas pueden someterse a ensayos apropiados que permitan la formación de oligómeros de anticuerpos unidos a antígenos y detecten una mayor unión a C1q, activación del complemento, CDC, ADCC y/o internalización, tales como los descritos en los Ejemplos. Por ejemplo, la avidez de unión a C1q puede determinarse de acuerdo con un ensayo similar al descrito en el Ejemplo 4, utilizando células que expresan el antígeno para la variante del anticuerpo. Los ejemplos de ensayos de CDC se proporcionan en los Ejemplos 5, 6, 10, 16, 19, 22, 23, 24 o 25. En el Ejemplo 12 se proporciona un ejemplo de ensayo ADCC. En el Ejemplo 26 se proporciona un ejemplo de ensayo de internalización. Finalmente, para discriminar entre mutaciones en restos de aminoácidos directamente implicados en la unión de C1q de las mutaciones que afectan a la formación de oligómeros, un ensayo ELISA de unión a C1q, de acuerdo con, por ejemplo, el Ejemplo 3, se puede compararse con la unión de C1q en un ensayo con células de acuerdo con, por ejemplo, Ejemplo 4.

En una realización adicional, dicha mutación se selecciona entre las correspondientes a E345, E430, S440 y Q386 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, con la condición de que la mutación en S440 sea S440Y o S440W.

En una realización alternativa, la mutación en al menos uno de los restos de aminoácido o en uno o mas restos de aminoácidos, es un resto de aminoácido que corresponde a E382 y H433 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana.

En una realización particular, una mutación se realiza en el resto de aminoácido que corresponde a E345 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana.

En una realización particular, una mutación se realiza en el resto de aminoácido que corresponde a E430 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana.

En una realización particular, una mutación se realiza en el resto de aminoácido que corresponde a S440 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, con la condición de que la mutación sea S440Y o S440W.

En una realización particular, una mutación se realiza en el resto de aminoácido que corresponde a Q386 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana.

En una realización alternativa, una mutación se realiza en un resto de aminoácido que corresponde a E382 o H433 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana.

En una realización, la mutación en al menos un resto de aminoácido puede ser una sustitución de aminoácido, una deleción de aminoácido o una inserción de aminoácido.

En una realización, la mutación en al menos un resto de aminoácido es una deleción de aminoácido.

En una realización, la mutación en al menos un resto de aminoácido es una inserción de aminoácido.

En una realización particular, la mutación en al menos un resto de aminoácido es una sustitución de aminoácido. En una realización, la mutación en al menos un resto de aminoácido se puede seleccionar entre cualesquiera de las sustituciones de aminoácidos, deleciones de aminoácidos enumeradas en la Tabla 1. Asimismo, cada sustitución de aminoácidos preferida en cada resto de aminoácido específico enumerado en la Tabla 1 es una realización independiente y específica no limitante para este uso. Los ejemplos de sustituciones de aminoácidos incluyen intercambiar un resto R por un resto R, e intercambiar un resto H por un resto R.

En una realización adicional, la mutación en al menos un resto de aminoácido es una sustitución de aminoácido seleccionada entre las correspondientes a E345X, E430X, S440Y o W, y Q386K en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, en donde X se refiere a cualquier aminoácido, por ejemplo, cualquier aminoácido natural o no natural. En particular, X puede referirse a cualquiera de los 20 aminoácidos de origen natural.

Así, en una realización, la mutación se realiza en al menos un resto de aminoácido seleccionado entre los correspondientes a E345, E430, S440 a Y o W, y Q386 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, preferentemente, en donde la mutación es al menos una sustitución de aminoácidos de los siguientes: E345 a R, Q, N o K, E430 a T, S o G, S440 a Y o W, o Q386 a K.

Así, en una realización, E345X puede ser E345R, Q, N, K, Y, A, C, D, F, G, H, I, L, M, P, S, T, V, W o Y; en particular E345A, D, G, H, K, N, Q, R, S, T, Y o W, o más en particular E345D, K, N, Q, R o W; o incluso más en particular E345R, Q, N, K o Y. En otra realización adicional, E430X puede ser E430T, S, G, F, H, A, C, D, I, K, L, M, N, P, Q, R, V, W o Y; en particular E430T, S, G, F o H. En una realización preferida, la sustitución de aminoácidos se selecciona del grupo que comprende E345R, E345Q, E345N, E345K, E345Y, E430T, E430S, E430G, E430F, E430H, S440W e S440Y. En una realización adicional, la mutación en al menos un resto de aminoácido se selecciona entre E345R y E430G. En una realización adicional, la mutación en al menos un resto de aminoácido es E345R. En una realización adicional, la mutación en al menos un resto de aminoácido es E430G.

En una realización alternativa, la mutación en al menos un resto de aminoácido se selecciona entre las correspondientes a 1253, H310, Q311, E382, G385, H433, N434, Y436 y Q438 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, tal como E382 o H433. En una realización alternativa adicional, la mutación en al menos un resto de aminoácido puede ser una sustitución de aminoácido seleccionada entre las correspondientes a I253E, N, Q, S o T, por ejemplo I253N o Q; H310N, Q, W o Y, por ejemplo H310Q; Q311E o R, E382D, H, K, R, N, Q, S, T, W o Y, por ejemplo, E382D, Q, K o R); G385E, H, K, N, Q, R, S, T, W o Y, por ejemplo, G385D, E, K o R; H433R; N434D, E, H, K, Q, R, S, T, W o Y, por ejemplo, N434H, K, Q o R; Y436A, E, F, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T o V, por ejemplo, Y436N, Q, S o T; Q438A, E, G, H, K, N, Q, R, S, T, W o Y, o por ejemplo Q438 N, S o T.

Así, en una realización alternativa adicional, la mutación en al menos un resto de aminoácido puede ser una sustitución de aminoácido seleccionada entre las correspondientes a P247G, I253V, S254L/V, Q311L/W, D/E356G/R, T359R, E382L/V y Y436I en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, por ejemplo en particular E382L, V, D, Q, K o R o H433R. En una realización alternativa adicional, la mutación en al menos un resto de aminoácido se selecciona entre E382R y H433R. En una realización alternativa, la mutación es E382R. En otra realización alternativa, la mutación es H433R.

En otra realización, la mutación no está en un resto de aminoácido directamente implicado en la unión de Clq, opcionalmente como se determina comparando la unión de C1q en un ensayo ELISA de acuerdo con el Ejemplo 3 con la unión de C1q en un ensayo basado en células de acuerdo con el Ejemplo 4.

En una realización, la mutación no está en un resto de aminoácido correspondiente a 1253, N434 o Q311, y opcionalmente no está en un resto de aminoácido que corresponde a H433, o bien la sustitución de aminoácido no es H433A.

En una realización, la al menos una mutación es una mutación, es decir, no se introduce más de una mutación en el anticuerpo precursor.

En otra realización, el método o uso de acuerdo con la presente divulgación comprende introducir una mutación en al menos dos, tales como dos, tres, cuatro, cinco, o más, de los restos de aminoácidos de la Tabla 1.

Cualesquiera de las combinaciones de mutaciones descritas en el presente documento se puede introducir de acuerdo con un método de la presente divulgación.

En una realización, el método o uso de acuerdo con la presente divulgación comprende introducir en el anticuerpo precursor una mutación en al menos dos restos de aminoácidos seleccionados entre los correspondientes a E345, E430, S440, Q386, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Y436 y K447 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, con la condición de que la mutación en S440 sea S440Y o S440W.

En una realización, el método o uso de acuerdo con la presente divulgación comprende introducir en el anticuerpo precursor una mutación en al menos dos restos de aminoácidos seleccionados entre los correspondientes a E345, E430, Q386 y S440 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, con la condición de que la mutación en S440 sea S440Y o S440W, tal como en donde la mutación en los al menos dos aminoácidos se selecciona entre los siguientes: E345 a R, Q, N o K, E430 a T, S o G, S440 a Y o W, o Q386 a K.

En una realización alternativa, las posiciones de la primera mutación pueden seleccionarse del grupo formado por las posiciones 1253, H310, Q311, E345, E382, G385, H433, N434, Y436 y Q438.

En una realización, el método comprende además introducir en el anticuerpo una nueva/tercera mutación en un resto de aminoácido correspondiente a E345, E430, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Q386, Y436 o K447 en la primera y/o segunda regiones Fc.

Por ejemplo, más de una, tales como dos, tres, cuatro o cinco, en particular dos o tres mutaciones se introducen en el anticuerpo precursor en restos de aminoácidos seleccionados entre los correspondientes a E345, E430, S440, Q386, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Y436 y K447 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana. Por ejemplo, al menos uno de los restos de aminoácidos que corresponde a E345, E430 y S440 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, puede estar mutado, tales como dos o todos los E345, E430 y S440, opcionalmente junto con una mutación en uno o más de los otros aminoácidos enumerados en la Tabla 1. Las al menos dos mutaciones pueden ser cualquier sustitución de restos de aminoácidos en la posición E345 junto con cualquier sustitución de restos de aminoácidos en la posición E430 o S440, o pueden ser cualquier sustitución de aminoácidos en la posición E430 junto con cualquier resto de aminoácidos de la posición S440.

En una realización adicional, las dos o tres mutaciones se introducen en el anticuerpo precursor en restos de aminoácidos seleccionados entre los correspondientes a E345, E430, S440 y Q386 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana.

En una realización, la más de una mutación puede ser en particular sustituciones de aminoácidos.

Así, de acuerdo con la presente divulgación, el método o uso, comprende introducir en el anticuerpo al menos una, tales como una, dos, tres, cuatro, cinco o seis, sustituciones de aminoácidos seleccionadas entre el siguiente grupo que consiste en P247G, I253V, S254L, Q311L/W, E345X, D/E356G/R, T359R, E382L/V, Q386K, E430X, Y436I y S440Y/W. En las realizaciones preferidas, la sustitución de aminoácidos se selecciona entre el grupo que consiste en E345X, E430X, S440Y/W y Q386K.

En una realización alternativa, las al menos dos mutaciones, tales como dos, tres, cuatro o cinco mutaciones, se realizan en restos de aminoácidos seleccionados entre los correspondientes a H310, G385, H433, N434 y Q438 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana.

En otra realización alternativa, la al menos una mutación, opcionalmente dos o tres mutaciones, se seleccionan entre el grupo que consiste de E345R, E382R y H433R. En otra realización alternativa, al menos uno de los restos de aminoácidos que corresponde a E382 y H433 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana puede estar mutados, tal como ambos, opcionalmente junto con una mutación en uno o más de los otros aminoácidos enumerados en la Tabla 1.

En algunas realizaciones de los métodos y/o usos de la presente divulgación, se introduce una mutación en un resto de aminoácido correspondiente a K439 y/o S440 en un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo precursor, un primer anticuerpo precursor, un segundo anticuerpo precursor y combinaciones de los mismos. Como se ha descrito anteriormente, introducir una mutación en los restos de aminoácidos que corresponden a K439 y S440 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, muestra limitar las interacciones intermoleculares entre anticuerpos a los que comprenden dichas mutaciones (Ejemplos 4, 5, 6, 10). Dependiendo de si K439 y S440 se introducen en el mismo anticuerpo precursor, o en un primer y segundo anticuerpo precursor, respectivamente, estos aspectos también se denominan "doble mutante" y "mutante mixto". En una realización de la presente divulgación, la mutación en un resto de aminoácido correspondiente a K439 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana es una sustitución de aminoácido.

En una realización de la presente divulgación, la mutación en un resto de aminoácido correspondiente a S440 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana es una sustitución de aminoácido.

En todas las realizaciones de la presente divulgación, en donde una mutación en una posición correspondiente a K439 y S440 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, ya sea en el mismo polipéptido o anticuerpo, o en el primer y segundo polipéptido o anticuerpo puede estar sustituida por una mutación en:

(i) en cada uno de los restos de aminoácido correspondientes a K447 y 448 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, tal como K447K/R/H y 448E/D en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, preferentemente K447K y 448E en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, o

(ii) en cada uno de los restos de aminoácido correspondientes a K447, 448 y 449 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, tales como K447D/E, 448K/R/H y 449P en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, preferentemente K447E, 448K y 449P en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana.

Así, las combinaciones de dichas mutaciones incluyen cualquiera de las descritas en la Tabla 2A y 2B.

En una realización de la presente divulgación, las mutaciones en un resto de aminoácido correspondiente a K439 y S440 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana son en ambos casos sustituciones de aminoácidos. En una realización, la mutación en un resto de aminoácido correspondiente a K439 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana es una sustitución de aminoácido dentro de un aminoácido seleccionado entre E y D. En otra realización, la mutación es K439E.

En una realización, la mutación en un resto de aminoácido correspondiente a S440 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana es una sustitución de aminoácido dentro de un aminoácido seleccionado entre K, R y H. En otra realización, la mutación es S440K.

Así, en una realización adicional, las mutaciones introducidas en el anticuerpo precursor en los restos de aminoácidos correspondientes a K439 y S440 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana son sustituciones de aminoácidos seleccionadas entre K439E y D y S440K, R y H.

Así, en realizaciones adicionales, las mutaciones introducidas en el anticuerpo precursor en los restos de aminoácidos correspondientes a K439 y S440 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana son las sustituciones de aminoácidos K439E y S440K.

Algunos métodos y usos de la presente divulgación comprenden un primer y un segundo anticuerpo precursor. Así, en una realización adicional, la mutación introducida en el primer anticuerpo precursor en un resto de aminoácido correspondiente a K439 es una sustitución de aminoácidos seleccionada entre K439E y D, por ejemplo K439E y la mutación introducir en el segundo anticuerpo precursor en un resto de aminoácido correspondiente a S440 es una sustitución de aminoácidos seleccionada entre S440K, R y H, por ejemplo, S440K. Las mutaciones en el primer y segundo anticuerpo precursor se pueden introducir viceversa, es decir, también puede ser que la mutación en un resto de aminoácido correspondiente a S440 se introduzca en el primer anticuerpo precursor, mientras que la mutación en un esto de aminoácido que corresponde a K439 se introduce en el segundo anticuerpo precursor en donde las mutaciones pueden ser las sustituciones de aminoácidos preferidas como se ha descrito anteriormente.

En una realización de los métodos o usos de acuerdo con la presente divulgación, la función efectora aumenta cuando el anticuerpo se une a su antígeno.

En una realización adicional, la función efectora aumenta cuando el anticuerpo se une a su antígeno, en donde el antígeno está en una célula que expresa el antígeno, membrana celular o virión. En una realización, la región Fc de una cadena pesada de IgG1 comprende la secuencia de restos 130 a 330 de la SEQ ID NO:1.

El anticuerpo precursor puede ser cualquier anticuerpo precursor como se describe en el presente documento. En este contexto, se entiende que el anticuerpo precursor es también el primer anticuerpo precursor y el segundo anticuerpo precursor.

En una realización, el anticuerpo precursor es un anticuerpo de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, IgA1, IgA2, IgD o IgE humana.

En una realización, el anticuerpo precursor es un anticuerpo humano de longitud completa, tal como un anticuerpo de IgG1 humano de longitud completa.

En una realización, el anticuerpo precursor, primer anticuerpo precursor y segundo anticuerpo precursor es un anticuerpo de IgG1 humano, por ejemplo de alotipo IgGlm(za) o IgG1m(f), que opcionalmente comprende una región Fc que comprende la SEQ ID NO:1 o 5.

En una realización, el anticuerpo precursor es un anticuerpo IgG2 humano, que opcionalmente comprende una región Fc que comprende la SEQ ID NO:2.

En una realización, el anticuerpo precursor es un anticuerpo IgG3 humano, que opcionalmente comprende una región Fc que comprende la SEQ ID NO:3.

En una realización, el anticuerpo precursor es un anticuerpo IgG4 humano, que opcionalmente comprende una región Fc que comprende la SEQ ID NO:4.

En una realización, el anticuerpo precursor es un anticuerpo biespecífico.

En una realización, el anticuerpo precursor es un anticuerpo que se describe en el presente documento, por ejemplo, un fragmento de anticuerpo que comprende al menos una parte de una región Fc, anticuerpos monovalentes (descritos en el documento WO2007059782 de Genmab); anticuerpos de cadena pesada, que consiste solamente en dos cadenas pesadas y que se encuentran de forma natural por ejemplo en camélidos (por ejemplo, Hamers-Casterman (1993) Nature 363:446); ThioMabs (Roche, WO2011069104), dominio diseñado mediante ingeniería genética de intercambio de cadena (SEED o Seed-body) que son moléculas de tipo anticuerpo asimétricas y biespecíficas (Merck, documento WO2007110205); Triomab (Fresenius, Lindhofer et al. (1995 J Immunol 155:219); FcAAdp (Regeneron, documento WO2010151792), Azymetric Scaffold (Zymeworks/Merck, documento WO2012/058768), mAb-Fv (Xencor, documento WO2011/028952), inmunoglobulina de doble dominio variable (Abbott, DVD-Ig, patente de Estados Unidos n.° 7612181; anticuerpos de doble cabeza y doble dominio (Unilever; Sanofi Aventis, documento WO20100226923), Di-diabody (ImClone/Eli Lilly), formatos de anticuerpo de tipo "botón en ojal" (Genentech, documento WO9850431); DuoBody (Genmab, documento WO 2011/131746); formatos de anticuerpo de direccionamiento electrostático (Amgen, documentos EP1870459 y WO 2009089004; Chugai, documento US201000155133; Oncomed, documento WO2010129304A2); IgG1 e IgG2 biespecíficos (Rinat Neurosciences Corporation, documento WO11143545), CrossMAbs (Roche, documento WO2011117329), LuZ-Y (Genentech), Biclonic (Merus), anticuerpos de dominio de direccionamiento doble (GSK/Domantis), anticuerpos dos en uno que reconocen dos dianas (Genentech, NovImmune), Mabs reticulados (Karmanos Cancer Center), cuerpo CovX (CovX/Pfizer), biespecíficos de tipo IgG (ImClone/Eli Lilly, Shen, J., et al. J Immunol Methods, 2007. 318(1-2): p. 65-74) y cuerpo DIG y cuerpo PIG (Pharmabcine), , y moléculas de redireccionamiento de doble afinidad (Fc-DART o Ig-DART, de Macrogenics, documentos w O/2008/157379, WO/2010/080538, Zybodies (Zyngenia), enfoques de cadena ligera común (Crucell/ Merus, documento US7262028) o de cadena pesada común (kA Bodies de NovImmune), así como proteínas de fusión que comprenden una secuencia de polipéptido fusionada con un fragmento de anticuerpo que contiene un dominio Fc tales como las fusiones scFv, como BsAb de ZymoGenetics/BMS), HERCULES de Biogen Idec (US007951918), SCORPIONS de Emergent BioSolutions/Trubion, Ts2Ab (MedImmune/AZ (Dimasi, N., et al. J Mol Biol, 2009. 393(3): p. 672-92), fusión scFv de Novartis, fusión scFv de Changzhou Adam Biotech Inc (documento CN 102250246), TvAb de Roche (documentos WO 2012025525, WO 2012025530), mAb2 de f-Star (documento WO2008/003116) y fusiones scFv dobles. También debe entenderse que el término anticuerpo, salvo que se especifique otra cosa, también incluye anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales (como anticuerpos monoclonales humanos), mezclas de anticuerpos (policlonales recombinantes), por ejemplo, generadas por tecnologías explotadas por Symphogen y Merus (Oligoclonics), y polipéptidos análogos a anticuerpos, tales como anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados. Un anticuerpo generado puede poseer cualquier isotipo, potencialmente.

opcionalmente seleccionado entre el grupo que consiste en un anticuerpo monovalente, un anticuerpo de cadena pesada, un dominio de intercambio de cadenas genomanipulado (SEED), un triomab, una inmunoglobulina de dominio variable doble (DVD), un anticuerpo de botón en ojal (KiH), un minianticuerpo, una molécula de redireccionamiento de doble afinidad (Fc-DART o Ig-DART); un anticuerpo LUZ-Y, un anticuerpo Biclonic, un anticuerpo de doble direccionamiento (DT)-Ig, un anticuerpo dos en uno, un Mab de reticulación, un mAb2, un cuerpo CovX, un anticuerpo biespecífico de tipo IgG, un Ts2Ab, un BsAb, un anticuerpo Hercules, un TvAb, un anticuerpo de fusión ScFv/Fc, un SCORPION, un fragmento scFv fusionado a un dominio Fc y un fragmento scFv doble fusionado a un dominio Fc.

En otra realización, el antígeno es expresa sobre la superficie de una célula.

En otra realización, la célula es una célula tumoral humana.

En una realización adicional, el antígeno se selecciona del grupo que consiste en erbB1 (EGFR), erbB2 (HER2), erbB3, erbB4, MUC-1, CD4, CD19, CD20, CD38, CD138, CXCR5, c-Met, proteína de la envoltura de HERV, periostina, Bigh3, SPARC, BCR, CD79, CD37, EGFrvIII, IGFr, L1-CAM, AXL, factor tisular (TF), CD74, EpCAM y MRP3.

En otra realización, el antígeno está asociado con una membrana celular.

En otra realización, el antígeno está asociado con un virión, opcionalmente, en donde el antígeno está comprendido en la cubierta proteica o en una envoltura lipídica del virión.

En otra realización, el anticuerpo es un anticuerpo humano, que opcionalmente se une a al menos un antígeno seleccionado entre CD20 y CD38.

En otra realización, el anticuerpo se une al mismo epítopo que al menos uno de 7D8 y 005, comprendiendo opcionalmente una región variable de cadena pesada y/o variable de cadena ligera de al menos uno de 7D8 y 005.

En cualquier uso de acuerdo con la presente divulgación, el anticuerpo que no tiene ninguna mutación de la presente divulgación puede ser cualquier anticuerpo precursor. Por tanto, los usos del presente documento proporcionan cualesquiera variantes de dichos anticuerpos precursores.

En una realización adicional de la presente divulgación, la función efectora es una función efectora mediada por Fc seleccionada entre unión a C1q, activación del complemento, citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC), unión a FcRn, unión al receptor Fc, incluida la unión al receptor Fc-gamma, unión a la proteína A, unión a la proteína G, fagocitosis celular dependiente de anticuerpo (ADCP), citotoxicidad celular dependiente del complemento (CDCC), citotoxicidad potenciada por el complemento, opsonización, internalización del polipéptido que contiene Fc, regulación negativa de la diana, captación de ADC, inducción de la apoptosis, muerte celular, detención del ciclo celular y cualquier combinación de las mismas.

En una realización particular, la función efectora es la unión a C1q, activación del complemento (eficacia de C1q) citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC), unión al receptor Fc, por ejemplo, unión al receptor Fc-gamma, Internalización del polipéptido que contiene

Fc o cualquier combinación de los mismos.

En una realización, la función efectora es la unión a C1q.

En una realización, la función efectora es

activación del complemento (eficacia de C1q).

En una realización, la función efectora es

citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).

En una realización, la función efectora es

citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADC En una realización, la función efectora es la unión al receptor Fc, por ejemplo incluida la unión al receptor Fcgamma.

En una realización, la función efectora es

internalización del polipéptido que contiene Fc.

En una realización, la función efectora es una combinación de la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) y la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC).

En otra realización, la una o más mutaciones aumentan una función efectora adicional seleccionada entre unión a FcRn, ADCC, unión al receptor Fc-gamma, unión a la proteína A, unión a la proteína G, ADCP, citotoxicidad celular dependiente del complemento (CDCC), citotoxicidad potenciada por el complemento, unión al receptor del complemento de un anticuerpo opsonizado mediada por el anticuerpo, y cualquier combinación de las mismas. En otro aspecto, la divulgación se refiere a un método para aumentar la avidez de una preparación de un anticuerpo precursor para C1q, que comprende la etapa de mutar al menos un aminoácido en la región Fc del anticuerpo, en donde el al menos un aminoácido se selecciona entre el grupo que consiste en E345, E430, S440, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Q386, Y436 y K447.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión "unión a C1q", cuando se utiliza en el contexto de una variante de anticuerpo o un anticuerpo precursor, incluye cualquier mecanismo del primer componente en la ruta clásica de activación del complemento mediada por la unión de la variante o el anticuerpo a los tejidos o factores del hospedador, incluyendo diversas células del sistema inmunitario (como las células efectoras). La unión a C1q de un anticuerpo puede evaluarse mediante un ELISA (tal como por ejemplo, el ELISA de unión a C1q utilizado en los Ejemplos 3 y 4), o la eficacia de C1q puede evaluarse mediante un ensayo CDC (tal como por ejemplo, el ensayo CDC utilizado en el Ejemplo 5). En una realización adicional, la avidez de unión a C1q del anticuerpo se determina con el ensayo descrito en el Ejemplo 4.

En todos los métodos de acuerdo con la presente divulgación, el anticuerpo que no tiene ninguna mutación de la presente divulgación puede ser cualquier anticuerpo precursor. Por tanto, los métodos del presente documento proporcionan cualesquiera variantes de dichos anticuerpos precursores.

El anticuerpo precursor, el primer anticuerpo precursor, el segundo anticuerpo precursor, o las variantes de los mismos obtenidas por los métodos y/o usos de la presente divulgación se pueden unir a cualquier diana como se describe en el presente documento.

Los ejemplos de antígenos o dianas también divulgados en el presente documento son; 5T4; ADAM-10; ADAM-12; ADAM17; AFP; AXL; antígeno de ántrax ANGPT2; BSG; CAIX; CAXII; CA 72-4; antígeno asociado a carcinoma CTAA16.88; CCL11; CCL2; CCR4; CCR5; CCR6; CD2; CD3E; CD4; CD5; CD6; CD15; CD18; CD19; CD20; CD22; CD24; CD25; CD29; CD30; CD32B; CD33; CD37; CD38; CD40; CD40LG; CD44; CD47; CD52; CD56; CD66E; CD72; CD74; CD79a; CD79b; CD80; CD86; CD98; CD137; CD147; CD138; CD168; CD200; CD248; CD254; CD257; CDH3; CEA; CEACAM5; CEACAM6; CEACAM8; Claudin4; CS-1; CSF2RA; CSPG-4; CTLA4; Cripto; DLL4; ED-B; EFNA2; EGFR; receptor de la endotelina B; ENPP3; EPCAM; ERBB2; ERBB3; FAP alfa; Fc gamma RI; FCER2; FGFR3; cadena beta de fibrina II; FLT1; FOLH1; FOLR1; FRP-1; gangliósido GD3; GDF2; GLP1R; Glipicano-3; GPNMB; VHB (virus de la hepatitis B); CMVH (citomegalovirus humano); homólogo de la proteína de choque térmico 90 [Candida albicans]; glicoproteína gD del virus del herpes simple; HGF; VIH-1; bucle V3 de la gp120 del VIH-1 IIIB; HLA-DRB (HLA-DR beta); virus sincitial respiratorio humano, glicoproteína F; ICAM1; IFNA1; IFNA1; IFNB1 biespecífico; IgE Fc; IGF1R; región de conexión de IGHE; IL12B; IL13; IL15; IL17A; IL1A; IL1B; IL2RA; IL4; IL5; IL5RA; IL6; IL6R; IL9; subunidad beta del receptor de interleucina 2; ITGA2; ITGA2B ITGB3; ITGA4 ITGB7; ITGA5; ITGAL; ITGAV_ITGB3; ITGB2; KDR; L1CAM; Lewis-y; lípido A, dominio del lipopolisacárido LPS; LTA; MET; MMP14; MMp15; MST1R; MSTN; MUC1; MUC4; MUC16; MUC5AC; antígeno de granulocitos NCA-90; Nectina 4; NGF; NRP; NY-ESO-1; OX40L; PLAC-1; PLGF; PDGFRA; PD1; PDL1; PSCA; fosfatidilserina; PTK-7; Pseudomonas aeruginosa serotipo IATS O11; VRS (virus respiratorio sincitial humano, glicoproteína F); ROR1; RTN4; SELL; SELP; STEAP1; Subunidad B de la toxina de tipo Shiga [Escherichia coli]; SLAM7; SLC44A4; SOST; Ácido lipoteico de Staphylococcus epidermidis; receptor alfa_beta de células T; TF; TGFB1; TGFB2; TMEFF2; TNC; TNF; TNFRSF10A; TNFRSF10B; TNFRSF12A; TNFSF13; TNFSF14; TNFSF2; TNFSF7; TRAILR2; TROP2; TYRP1; VAP-1; y Vimentina.

Métodos para inducir una respuesta efectora

Debe entenderse que todas las realizaciones descritas en el presente documento con referencia a un anticuerpo precursor, el primer anticuerpo precursor o el segundo anticuerpo precursor también deberán entenderse como realizaciones relativas a un precursor, primer polipéptido precursor o segundo polipéptido precursor que comprende un dominio Fc de una inmunoglobulina y una región de unión.

En otro aspecto principal, la presente divulgación se refiere a un método para inducir una respuesta efectora, contra una célula, membrana celular o virión que expresa una diana a la que se une un anticuerpo precursor que comprende un dominio Fc de una inmunoglobulina y una región de unión, que comprende

(i) proporcionar un polipéptido precursor o una combinación de al menos un primer polipéptido precursor y un segundo polipéptido precursor que se ha mutado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24; y (ii) poner en contacto una preparación del polipéptido precursor mutado de la etapa i) o la combinación mutada de al menos un primer polipéptido precursor y un segundo polipéptido precursor de la etapa i) con la célula, membrana celular o virión que expresa un antígeno en presencia del complemento humano o una célula efectora.

En una realización, cualquiera o todos los polipéptidos precursores, primer polipéptido precursor y segundo polipéptido precursor puede ser un anticuerpo.

Así, en una realización, la presente divulgación se refiere a métodos de usar las variantes de anticuerpos descritas en el presente documento para inducir una respuesta efectora, por ejemplo, activación del complemento, CDC u otra respuesta efectora contra una célula, membrana celular, virión u otra partícula asociada con el antígeno o antígenos. La presente divulgación también se refiere a un método para inducir una respuesta efectora, contra una célula, membrana celular o virión que expresa un antígeno al que se une un anticuerpo precursor, que comprende

(i) proporcionar un anticuerpo precursor o una combinación de al menos un primer anticuerpo precursor y un segundo anticuerpo precursor que se ha mutado de acuerdo con cualquiera de los métodos descritos en el presente documento; y

(ii) poner en contacto una preparación del anticuerpo precursor mutado de la etapa i) o la combinación mutada de al menos un primer anticuerpo precursor y un segundo anticuerpo precursor de la etapa i) con la célula, membrana celular o virión que expresa un antígeno en presencia del complemento humano o una célula efectora.

El anticuerpo precursor, cada uno del primer anticuerpo precursor y el segundo anticuerpo precursor se puede seleccionar de cualquier anticuerpo precursor descrito en el presente documento, en particular, cualquiera de los descritos anteriormente en relación con los métodos de alterar la función efectora de un anticuerpo.

En una realización, el antígeno es expresa sobre la superficie de una célula.

En una realización, la célula es una célula tumoral humana.

En una realización adicional, el antígeno se selecciona del grupo que consiste en erbBI (EGFR), erbB2 (HER2), erbB3, erbB4, MUC-1, CD4, CD19, CD20, CD38, CD138, CXCR5, c-Met, proteína de la envoltura de HERV, periostina, Bigh3, SPARC, BCR, CD79, CD37, EGFrvlII, IGFr, L1-CAM, AXL, factor tisular (TF), CD74, EpCAM y MRP3.

En otra realización, el antígeno está asociado con una membrana celular.

En otra realización, el anticuerpo se une al mismo epítopo que al menos uno de 7D8 y 005, comprendiendo opcionalmente una región variable de cadena pesada y/o variable de cadena ligera de al menos uno de 7D8 y 005. En una realización adicional de la presente divulgación, la respuesta efectora inducida es la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), una respuesta efectora mediada por Fc seleccionada entre respuesta efectora mediada por Fc seleccionada entre unión a C1q, activación del complemento, citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC), unión a FcRn, unión al receptor Fc, incluida la unión al receptor Fc-gamma, unión a la proteína A, unión a la proteína G, fagocitosis celular dependiente de anticuerpo (ADCP), citotoxicidad celular dependiente del complemento (CDCC), citotoxicidad potenciada por el complemento, opsonización, internalización del polipéptido que contiene Fc, regulación negativa de la diana, captación de ADC, inducción de la apoptosis, muerte celular, detención del ciclo celular y cualquier combinación de las mismas.

En una realización particular, la respuesta efectora es la unión a C1q, activación del complemento (eficacia de C1q), citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC), unión al receptor Fc, por ejemplo, unión al receptor Fc-gamma, Internalización del polipéptido que contiene Fc o cualquier combinación de los mismos.

En una realización, la respuesta efectora es la unión a C1q.

En una realización, la respuesta efectora es la activación del complemento (eficacia de C1q).

En una realización, la respuesta efectora es la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).

En una realización, la respuesta efectora es la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC). En una realización, la respuesta efectora es la unión al receptor Fc, por ejemplo incluida la unión al receptor Fcgamma.

En una realización, la respuesta efectora es la internalización del polipéptido que contiene Fc.

En una realización, la respuesta efectora es una combinación de la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) y la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC).

En otra realización, el método aumenta una respuesta efectora adicional seleccionada entre unión a FcRn, ADCC, unión al receptor Fc-gamma, unión a la proteína A, unión a la proteína G, ADCP, citotoxicidad celular dependiente del complemento (CDCC), citotoxicidad potenciada por el complemento, unión al receptor del complemento de un anticuerpo opsonizado mediada por el anticuerpo, y cualquier combinación de las mismas.

En otro aspecto, la divulgación se refiere a un método para aumentar la avidez de una preparación de un anticuerpo precursor para C1q, que comprende la etapa de mutar al menos un aminoácido en la región Fc del anticuerpo, en donde el al menos un aminoácido se selecciona entre el grupo que consiste en E345, E430, S440, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Q386, Y436 y K447.

Los ejemplos de antígenos o dianas también divulgados en el presente documento que pueden constituir la diana son: 5T4; ADAM-10; ADAM-12; ADAM17; AFP; AXL; antígeno de ántrax ANGPT2; BSG; CAIX; CAXII; CA 72-4; antígeno asociado a carcinoma CTAA16.88; CCL11; CCL2; CCR4; CCR5; CCR6; CD2; CD3E; CD4; CD5; CD6; CD15; CD18; CD19; CD20; CD22; CD24; CD25; CD29; CD30; CD32B; CD33; CD37; CD38; CD40; CD40LG; CD44; CD47; CD52; CD56; CD66E; CD72; CD74; CD79a; CD79b; CD80; CD86; CD98; CD137; CD147; CD138; CD168; CD200; CD248; CD254; CD257; CDH3; CEA; CEACAM5; CEACAM6; CEACAM8; Claudin4; CS-1; CSF2RA; CSPG-4; CTLA4; Cripto; DLL4; ED-B; EFNA2; EGFR; receptor de la endotelina B; ENPP3; EPCAM; ERBB2; ERBB3; FAP alfa; Fc gamma RI; FCER2; FGFR3; cadena beta de fibrina II; FLT1; FOLH1; FOLR1; FRP-1; gangliósido GD3; GDF2; GLP1R; Glipicano-3; GPNMB; VHB (virus de la hepatitis B); CMVH (citomegalovirus humano); homólogo de la proteína de choque térmico 90 [Candida albicans]; glicoproteína gD del virus del herpes simple; HGF; VIH-1; bucle V3 de la gp120 del VIH-1 IIIB; HLA-DRB (HLA-DR beta); virus sincitial respiratorio humano, glicoproteína F; ICAM1; IFNA1; IFNA1; IFNB1 biespecífico; IgE Fc; IGF1R; región de conexión de IGHE; IL12B; IL13; IL15; IL17A; IL1A; IL1B; IL2RA; IL4; IL5; IL5RA; IL6; IL6R; IL9; subunidad beta del receptor de interleucina 2; ITGA2; ITGA2B ITGB3; ITGA4 ITGB7; ITGA5; ITGAL; ITGAV_ITGB3; ITGB2; KDR; L1CAM; Lewis-y; lípido A, dominio del lipopolisacárido LPS; LTA; MET; MMP14; MMp15; MST1R; MSTN; MUC1; MUC4; MUC16; MUC5AC; antígeno de granulocitos NCA-90; Nectina 4; NGF; NRP; NY-ESO-1; OX40L; PLAC-1; PLGF; PDGFRA; PD1; PDL1; PSCA; fosfatidilserina; PTK-7; Pseudomonas aeruginosa serotipo IATS O11; VRS (virus respiratorio sincitial humano, glicoproteína F); ROR1; RTN4; SELL; SELP; STEAP1; Subunidad B de la toxina de tipo Shiga [Escherichia coli]; SLAM7; SLC44A4; SOST; Ácido lipoteico de Staphylococcus epidermidis; receptor alfa_beta de células T; factor tisular (TF); TGFB1; TGFB2; TMEFF2; TNC; TNF; TNFRSF10A; TNFRSF10B; TNFRSF12A; TNFSF13; TNFSF14; TNFSF2; TNFSF7; TRAILR2; TROP2; TYRP1; VAP-1; y Vimentina.

En una realización, la célula es una célula tumoral humana o una célula bacteriana.

En otra realización, el antígeno se selecciona del grupo que consiste en erbB1 (EGFR), erbB2 (HER2), erbB3, erbB4, MUC-1, CD4, CD19, CD20, CD25, CD32, CD37, CD38, CD74, CD138, CXCR5, c-Met, proteína de la envoltura de HERV, periostina, Bigh3, SPARC, BCR, CD79, EGFrvIII, IGFr, L1-CAM, EpCAM y MRP3.

En una realización adicional, el antígeno es CD20 o CD38.

En otra realización, el anticuerpo IgG1 precursor es un anticuerpo IgG1 humano.

En otra realización, el anticuerpo precursor se selecciona entre 7D8 y 005.

En una realización, la célula es una célula tumoral humana.

En otra realización, el primer y el segundo antígenos se selecciona de forma independiente del grupo que consiste de erbB1 (EGFR), erbB2 (HER2), erbB3, erbB4, MUC-1, CD4, CD19, CD20, CD25, CD32, CD37, CD38, CD74, CD138, cXc R5, c-Met, proteína de la envoltura de HERV, periostina, Bigh3, SPARC, BCR, CD79, EGFrvIII, IGFr, L1-CAM, AXL, factor tisular (TF), EpCAM y MRP3.

En otra realización, el primer y segundo anticuerpos precursores son completamente humanos, opcionalmente en donde el primer y segundo anticuerpos precursores se unen a antígenos independientemente seleccionados entre CD20 y CD38.

En una realización adicional, el primer y segundo anticuerpos precursores se seleccionan independientemente entre 7D8 y 005.

En otra realización adicional más, la célula es una célula bacteriana.

En otra realización, la célula bacteriana se selecciona del grupo que consiste en S. aureus, S.Epidermidis, S. pneumonia, Bacillus anthracis, Pseudomonas aeruginosa, Chlamydia, E. coli, Salmonella, Shigella, Yersinia, S.

typhimurium, Neisseria meningitides y Mycobacterium tuberculosis.

En otra realización, el primer y/o segundo antígeno es ácido lipoteico (LTA), opcionalmente en donde al menos uno del primer y segundo anticuerpo precursor es pagibaximab.

En otra realización, el antígeno se expresa sobre un virión.

En otra realización, el primer y el segundo anticuerpo se unen al mismo antígeno.

En otra realización, el primer y segundo anticuerpos comprenden la misma secuencia VH, secuencia VL o ambas secuencias VH y VL.

Para los fines de la presente divulgación, la célula diana que expresa o está asociada de otro modo a un antígeno puede ser cualquier célula procariota o eucariota. Algunos ejemplos de células que expresan antígenos son, aunque no de forma limitativa, células de mamífero, especialmente células humanas, tales como células cancerosas humanas; y organismos unicelulares tales como bacterias, protozoos y hongos unicelulares como células de levadura. Las membranas celulares que comprenden o están asociadas de otro modo con un antígeno incluyen membranas celulares parciales y/o rotas derivadas de una célula que expresa el antígeno. Un antígeno asociado a un virión o a una partícula vírica puede estar comprendido en, o estar asociado a, la cubierta proteica y/o la envoltura lipídica del virión.

La célula diana puede ser, por ejemplo, una célula tumoral. Los antígenos tumorales adecuados incluyen cualquier diana o antígeno descrito en el presente documento, aunque no de forma limitativa, erbB1 (EGFR), erbB2 (HER2), erbB3, erbB4, MUC-1, CD4, CD19, CD20, CD25, CD32, CD37, CD38, CD74, CD138, CXCR5, c-Met, proteína de la envoltura de HERV, periostina, Bigh3, SPARC, BCR, CD79, EGFrvIII, IGFR, L1-CAM, AXL, factor tisular (TF), EpCAM y MRP3. Los antígenos preferidos incluyen CD20, CD38, HER2, EGFR, IGFR, CD25, CD74 e CD32. Los ejemplos de anticuerpos incluyen el anticuerpo dirigido contra CD20, 7D8, como se divulga en el documento WO 2004/035607, anticuerpo dirigido contra CD38, 005, como se divulga en el documento WO 06/099875, anticuerpos dirigido contra CD20, 11B8, como se divulga en el documento WO 2004/035607, anticuerpo dirigido contra CD38, 003, como se divulga en el documento WO 06/099875, anticuerpo dirigido contra EGFR, 2F8, como se divulga en el documento WO 02/100348. En el presente documento se proporcionan ejemplos de otros anticuerpos particulares. Como alternativa, la célula diana puede ser una célula bacteriana, tal como, por ejemplo, S. aureus, S. epidermidis, S. pneumonia, Bacillus anthracis, Pseudomonas aeruginosa, Chlamydia, E. coli, Salmonella, Shigella, Yersinia, S. typhimurium, Neisseria meningitides y Mycobacterium tuberculosis. Los ejemplos de antígenos incluyen ácido lipoteico (LTA) y los ejemplos de anticuerpos incluyen pagibaximab.

Como alternativa, la diana puede estar presente en la superficie de un virus, célula fúngica u otra partícula, tales como, por ejemplo, virus del Nilo occidental, virus del dengue, virus de la hepatitis C (VHC), virus de inmunodeficiencia humana (VIH), virus del papiloma humano, virus de Epstein-Barr, Herpesvirus, poxvirus, virus de la gripe aviar, VRS, Aspergillus, Candida albicans, Cryptococcus e Histoplasma.

En una realización, la etapa de puesta en contacto (ii) se realiza in vitro.

En una realización, la etapa de puesta en contacto (ii) se realiza in vivo.

En otra realización, la etapa (ii) comprende administrar las variantes a un sujeto.

En una realización adicional, el sujeto padece cáncer, una infección bacteriana o una infección vírica. La etapa de puesta en contacto (ii) de las realizaciones anteriormente mencionadas se pueden realizar in vitro o in vivo. En el último caso, la etapa (ii) puede comprender además administrar la preparación o preparaciones a un sujeto, opcionalmente, un sujeto que padece cáncer o una infección bacteriana. A continuación se ofrecen más detalles sobre las aplicaciones terapéuticas.

El primer y el segundo anticuerpos comprenden regiones de unión a antígeno que pueden unirse al mismo epítopo o a otro diferente. Dichos epítopos pueden estar en la misma diana o en otra diferente.

En una realización, el primer y el segundo anticuerpo se unen a diferentes epítopos en diferentes dianas. Dichas dianas se pueden expresar en la misma célula o tipo de célula, o se puede expresar en diferentes células o tipos de células. En dicha realización, la mejora de una función efectora se dirige únicamente a las células o tipos de células que expresan ambas dianas, reduciendo de este modo los riesgos de cualquier daño colateral a células o tipos de células que no son la causa de la enfermedad a tratar.

Sin pretender imponer ninguna teoría, se cree que la mejora de la CDC puede restringirse a las células diana que expresan dos dianas/antígenos específicos simultáneamente, siempre que el primer y el segundo anticuerpo se unan a epítopos que se encuentren en la misma célula, aprovechando así la expresión combinada de las dianas para mejorar la selectividad de la inducción de la CDC potenciada.

Cuando las dianas se expresan en diferentes células o tipos de células, se cree, sin pretender imponer ninguna teoría, que la administración en cualquier orden del primer y segundo anticuerpo mejorará la potenciación de la CDC y posiblemente también otras funciones efectoras mediante el "reclutamiento" de una segunda célula o tipo celular que exprese la segunda diana.

En una realización, en donde se usa una combinación de un primer y un segundo anticuerpo, la etapa (ii) puede realizarse simultáneamente, por separado, o secuencialmente, poner en contacto la célula con los anticuerpos precursores primero y segundo mutados en presencia del complemento humano y/o una célula efectora.

En otro aspecto más, la divulgación se refiere a un método para mejorar la capacidad de inducción de la CDC de una preparación de un anticuerpo precursor, que comprende la etapa de mutar al menos un aminoácido en la región Fc del anticuerpo, en donde el al menos un aminoácido se selecciona entre el grupo que consiste en E345, E430, S440, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Q386, Y436 y K447.

En un aspecto alternativo, la presente divulgación se refiere a un método para inducir una respuesta efectora, opcionalmente una respuesta CDC, contra una célula, membrana celular o virión que expresa un antígeno al que se une un anticuerpo precursor IgG1, que comprende

(i) proporcionar un anticuerpo que comprende una mutación en al menos un resto de aminoácido seleccionado entre el grupo que consiste de E345, E430, S440, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Q386, Y436 y K447 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1; y

(ii) poner en contacto una preparación del anticuerpo con la célula, membrana celular o virión en presencia del complemento humano o una célula efectora.

En otra realización alternativa, el método comprende además administrar un primer anticuerpo que comprende una primera mutación en al menos un resto de aminoácido seleccionado entre los correspondientes a E345, E430, S440, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Q386, Y436 y K447 en la región Fc del primer anticuerpo;

administrar un segundo anticuerpo que comprende una segunda mutación en al menos un resto de aminoácido seleccionado entre los correspondientes a E345, E430, S440, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Q386, Y436 y K447 en la región Fc del segundo anticuerpo;

en donde el primer y el segundo anticuerpos pueden administrarse simultáneamente, por separado o de forma secuencial. El primer y segundo anticuerpo pueden unirse al mismo epítopo o a otro diferente en la misma diana u otra diferente. La una o más dianas se pueden encontrar en la misma o en diferentes células o tipos de células. En otro aspecto alternativo, la divulgación se refiere a un método para mejorar la capacidad de inducción de la CDC de una preparación de un anticuerpo precursor IgG1, que comprende mutar al menos un aminoácido en la región Fc del anticuerpo, en donde el al menos un aminoácido se selecciona entre el grupo que consiste en E345, E382 e H433.

En otro aspecto alternativo, la divulgación se refiere a un método para inducir una respuesta efectora, opcionalmente una respuesta CDC, contra una célula, membrana celular o virión que expresa un antígeno al que se une un anticuerpo precursor IgG1, que comprende las etapas de

(i) proporcionar una variante del anticuerpo precursor que comprende una mutación en al menos un resto de aminoácido en la región Fc del anticuerpo, el al menos un aminoácido se selecciona entre el grupo que consiste en E345, E382 y H433; y

(ii) poner en contacto una preparación de la variante con la célula en presencia del complemento humano o una célula efectora.

En otro aspecto alternativo, la divulgación se refiere a un método para inducir una respuesta efectora, opcionalmente una respuesta CDC, contra una célula que expresa un antígeno al que se une un anticuerpo precursor IgG1, que comprende las etapas de

(i) proporcionar una variante del anticuerpo precursor que comprende mutaciones K439E y a S440K en la región Fc del anticuerpo; y

En otro aspecto alternativo, la divulgación se refiere a un método para inducir una respuesta CDC contra una célula, membrana celular o virión que expresa un primer antígeno al que se une un primer anticuerpo precursor IgG1 y un segundo antígeno al que se une un segundo anticuerpo precursor, que comprende las etapas de

(i) proporcionar una primera variante del primer anticuerpo precursor que comprende una mutación K439E y una segunda variante del segundo anticuerpo precursor que comprende una mutación S440K; y

(ii) simultáneamente, por separado o secuencialmente, poner en contacto la célula con la primera y segunda variante en presencia del complemento humano y/o una célula efectora.

En otro aspecto alternativo, la divulgación proporciona un método para inducir una respuesta CDC u otra respuesta efectora contra una diana célula, membrana celular, virión u otra partícula asociada a un antígeno al que se une un anticuerpo IgG1 o IgG3, que comprende las etapas de (i) proporcionar una variante del anticuerpo que comprende una mutación en al menos un aminoácido correspondiente a E345, E430 y S440 en la región Fc de un anticuerpo de IgG1; y (ii) poner en contacto una preparación de la variante con la célula en presencia del complemento humano y/o células efectoras.

En un aspecto alternativo adicional, la divulgación proporciona un método para inducir respuesta ADCC o ADCP contra, o una fagocitosis de, una célula diana, membrana celular, virión u otra partícula asociada a un antígeno al que se une un anticuerpo IgG1 o IgG3, que comprende las etapas de (i) proporcionar una variante del anticuerpo que comprende una mutación en al menos un aminoácido correspondiente a E345, E430 o S440 en la región Fc de un anticuerpo de IgG1; y (ii) poner en contacto una preparación de la variante con la célula en presencia de una célula efectora.

La divulgación también proporciona un método para inducir una respuesta CDC u otra respuesta efectora contra una célula diana, membrana celular, virión u otra partícula asociada a un antígeno al que se une un anticuerpo IgG1 o IgG3, que comprende las etapas de (i) proporcionar una variante del anticuerpo que comprende una mutación en K439 que es K439E y una mutación en S440 que es S440K o S440R en la región Fc del anticuerpo; y (ii) poner en contacto una preparación de la variante con la célula en presencia del complemento humano y/o una célula efectora La divulgación también proporciona un método para inducir una respuesta CDC u otra respuesta efectora contra una célula diana, membrana celular o virión que expresa un primer antígeno al que se une un primer anticuerpo IgG1 y un segundo antígeno al que se une un segundo anticuerpo, que comprende las etapas de (i) proporcionar una primera variante que es el primer anticuerpo que comprende una mutación K439E y una segunda variante que es el segundo anticuerpo que comprende una mutación S440K o S440K; y (ii) simultáneamente, por separado o secuencialmente, poner en contacto la célula con preparaciones de la primera y segunda variante en presencia del complemento humano o una célula efectora.

En realizaciones separadas y específicas, el primer y el segundo anticuerpos se unen a (i) diferentes antígenos; (ii) diferentes epítopos en el mismo antígeno, (iii) el mismo epítopo en un antígeno, y (iv) el mismo epítopo en un antígeno y comprenden las mismas secuencias VH y/o VL.

En una realización, el primer y segundo anticuerpos comprenden además una mutación en uno o más de E345, E430 y S440, tal como E345R. En una realización, el primer y segundo anticuerpos comprenden además una mutación en uno o más de E345, E382 y H433, tal como E345R.

Otros métodos

En otro aspecto principal, la divulgación se refiere a un método para identificar una mutación en un anticuerpo que mejora la función efectora del anticuerpo para unirse a C1q, que comprende las etapas de

(i) preparar al menos un anticuerpo que comprende una mutación en al menos un aminoácido seleccionado entre el grupo que consiste de E345, E430, S440, K439, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Q386, Y436 y K447;

(ii) evaluar la actividad C1q del anticuerpo cuando se une a la superficie de la célula que expresa el antígeno en comparación con el anticuerpo precursor; y

(iii) seleccionar la mutación de cualquier variante que tenga un aumento de la avidez de C1q.

En una realización, el al menos un anticuerpo comprende al menos una sustitución de aminoácidos seleccionada del grupo de E345R, E345Q, E345N, E345K, E345Y, E430T, E430S, E430G, E430F, E430H, S440W e S440Y.

En otro aspecto principal adicional, la divulgación se refiere a un método para identificar una mutación en un anticuerpo precursor que aumenta la capacidad del anticuerpo para inducir una respuesta CDC, que comprende las etapas de

(i) preparar al menos una variante del anticuerpo precursor que comprende una mutación en al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en E345, E430, S440, K439, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Q386, Y436 y K447;

(ii) evaluar la respuesta CDC inducida por la variante cuando se une a la superficie de una célula que expresa el antígeno, en presencia de células efectoras o del complemento, en comparación con el anticuerpo precursor; y (iii) seleccionar la mutación de cualquier variante que tenga un aumento en la respuesta CDC.

En una realización, el al menos un aminoácido se selecciona de E345, E382 e H433.

En otro aspecto, la divulgación se refiere, a un método para aumentar la avidez de una preparación de un anticuerpo IgG1 precursor para C1q, que comprende mutar al menos un aminoácido en la región Fc del anticuerpo, en donde el al menos un aminoácido se selecciona entre el grupo que consiste en E345, E382 e H433.

Anticuerpos de la presente divulgación

Anticuerpos precursores

Como se describe en el presente documento, la presente invención se refiere, entre otras cosas, a variantes de anticuerpos precursores que comprenden una o más mutaciones en la región CH2 y/o CH3 de una inmunoglobulina, por ejemplo, en el anticuerpo la cadena pesada. Los anticuerpos precursores, que pueden ser anticuerpos naturales, a utilizar como material de partida de la presente invención antes de su modificación pueden producirse, por ejemplo, por el método del hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al, Nature 256, 495 (1975), o pueden producirse por métodos de ADN recombinante. Los anticuerpos monoclonales también se pueden aislar a partir de fagotecas de anticuerpos usando las técnicas descritas en Clackson, por ejemplo, Clackson et al., Nature 352, 624 628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581 597 (1991). Los anticuerpos monoclonales pueden obtenerse de cualquier fuente adecuada. Por tanto, por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden obtenerse a partir de hibridomas preparados a partir de linfocitos B esplénicos de murino obtenidos de ratones inmunizados con un antígeno de interés, por ejemplo en forma de células que expresan el antígeno en la superficie, o un ácido nucleico que codifica un antígeno de interés. Los anticuerpos monoclonales también pueden obtenerse a partir de hibridomas derivados de células que expresan anticuerpos de seres humanos inmunizados o de mamíferos no humanos, como los conejos, ratas, perros, primates, etc.

Los anticuerpos precursores pueden ser, por ejemplo, anticuerpos quiméricos o humanizados. En otra realización, el anticuerpo es un anticuerpo humano. Los anticuerpos monoclonales humanos pueden generarse utilizando ratones transgénicos o transcromosómicos, por ejemplo, los ratones HuMAb, que llevan partes del sistema inmunitario humano en lugar del sistema del ratón. El ratón HuMAb,contiene un minilocus de genes de la inmunoglobulina humana que codifican las secuencias de la inmunoglobulina de la cadena pesada (|j y y) y la cadena ligera k humanas no reordenadas, junto con mutaciones dirigidas que inactivan los loci endógenos de la cadena j y k (Lonberg, N. et al., Nature 368, 856859 (1994)). En consecuencia, los ratones presentan una expresión reducida de IgM o k de ratón y, en respuesta a la inmunización, los transgenes humanos de cadena pesada y ligera introducidos, experimentan un cambio de clase y mutación somática para generar anticuerpos monoclonales humanos de alta afinidad IgG,K (Lonberg, N. et al. (1994), supra; revisado en Lonberg, N. Handbook of Experimental Pharmacology 113, 49101 (1994), Lonberg, N. y Huszar, D., Intern. Rev. Immunol. Vol. 136593 (1995) y Harding, F. y Lonberg, N. Ann. N.Y. Acad. Sci 764536546 (1995)). La preparación de los ratones HuMAb se describe con detalle en Taylor, L. et al., Nucleic Acids Research 20, 6287 6295 (1992), Chen, J. et al., International Immunology 5, 647 656 (1993), Tuaillon et al., J. Immunol. 152, 2912 2920 (1994), Taylor, L. et al., International Immunology 6, 579 591 (1994), Fishwild, D. et al., Nature Biotechnology 14, 845 851 (1996). Véanse también los documentos US 5.545.806, uS 5.569.825, US 5.625.126, US 5.633.425, US 5.789.650, US 5.877.397, US 5.661.016, US 5.814.318, US 5.874.299, US 5.770.429, US 5.545.807, WO 98/24884, WO 94/25585, WO 93/1227, WO 92/22645, WO 92/03918 y WO 01/09187. Los esplenocitos de estos ratones transgénicos pueden utilizarse para generar hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales humanos según técnicas bien conocidas.

Asimismo, los anticuerpos humanos de la presente divulgación o los anticuerpos de la presente divulgación de otras especies pueden identificarse mediante tecnologías de visualización, que incluyen, sin limitación, expresión en fago, expresión en retrovirus, expresión en ribosomas, expresión en células de mamífero, expresión en levaduras y otras técnicas conocidas en la materia, y las moléculas resultantes se pueden someter a maduración adicional, como la maduración por afinidad, dichas técnicas son bien conocidas en la materia. Una estrategia particular, que se describe en el Ejemplo 17, puede aplicarse a cualquier anticuerpo para preparar y obtener una variante de la invención mediante expresión en fago.

El anticuerpo precursor no se limita a los anticuerpos que tienen un dominio Fc natural, por ejemplo, un Fc humano, sino que también puede ser un anticuerpo que tenga mutaciones distintas a las de la presente invención, tales como, por ejemplo, mutaciones que afectan a la glicosilación o que permiten que el anticuerpo sea un anticuerpo biespecífico. Por el término "anticuerpo natural" se entiende cualquier anticuerpo que no comprenda ninguna mutación introducida genéticamente. Un anticuerpo que comprende modificaciones de origen natural, por ejemplo, diferentes alotipos, debe entenderse como un "anticuerpo natural" en el sentido de la presente invención y, por tanto, puede entenderse como un anticuerpo precursor. Dichos anticuerpos pueden servir como plantilla para una o más mutaciones de acuerdo con la presente divulgación, proporcionando de este modo los anticuerpos variantes de la divulgación. Un ejemplo de un anticuerpo precursor que comprende mutaciones que no sean las de la presente invención es el anticuerpo biespecífico descrito en el documento WO2011/131746 (Genmab), que utiliza condiciones reductoras para promover el intercambio de media molécula de dos anticuerpos que comprenden regiones CH3 de tipo IgG4, formando así anticuerpos biespecíficos sin la formación concomitante de agregados. Otros ejemplos de anticuerpos precursores incluyen, aunque no de forma limitativa, anticuerpos biespecíficos tales como los biespecíficos heterodiméricos: Triomabs (Fresenius); IgG1 e IgG2 biespecíficos (Rinat Neurosciences Corporation); FcAAdp (Regeneron); Botones en ojales (Genentech); Direccionamiento electrostático (Amgen, Chugai, Oncomed); SEEDbodies (Merck); Azymetric scaffold (Zymeworks); mAb-Fv (Xencor); y LUZ-Y (Genentch). Otros formatos de anticuerpos precursores incluyen, sin limitación, un anticuerpo natural, un anticuerpo de longitud completa o un fragmento de anticuerpo que contenga Fc, un anticuerpo humano o cualquier combinación de los mismos.

El anticuerpo precursor puede unirse a cualquier diana, los ejemplo de dichas dianas o antígenos pueden estar dirigidos, y no de forma limitativa, contra; 5T4; ADAM-10; ADa M-12; ADAM17; AFP; AXL; antígeno de ántrax ANGPT2; BSG; CAIX; CAXII; CA 72-4; antígeno asociado a carcinoma CTAA16.88; CCL11; CCL2; CCR4; CCR5; CCR6; CD2; CD3E; CD4; CD5; CD6; CD15; CD18; CD19; CD20; CD22; CD24; CD25; CD29; CD30; CD32B; CD33; CD37; CD38; CD40; CD40LG; CD44; CD47; CD52; CD56; CD66E; CD72; CD74; CD79a; CD79b; CD80; CD86; CD98; CD137; CD147; CD138; CD168; CD200; CD248; CD254; CD257; CDH3; CEA; CEACAM5; CEACAM6; CEACAM8; Claudin4; CS-1; CSF2RA; CSPG-4; CTLA4; Cripto; DLL4; ED-B; EFNA2; EGFR; receptor de la endotelina B; ENPP3; EPCAM; ERBB2; ERBB3; FAP alfa; Fc gamma RI; FCER2; FGFR3; cadena beta de fibrina II; FLT1; FOLH1; FOLR1; FRP-1; gangliósido GD3; GDF2; GLP1R; Glipicano-3; GPNMB; VHB (virus de la hepatitis B); CMVH (citomegalovirus humano); homólogo de la proteína de choque térmico 90 [Candida albicans]; glicoproteína gD del virus del herpes simple; HGF; VIH-1; bucle V3 de la gp120 del VIH-1 IIIB; HLA-DRB (HLA-D^rbeta); virus sincitial respiratorio humano, glicoproteína F; ICAM1; IFNA1; lFNA1; IFNB1 biespecífico; IgE Fc; IGF1R; región de conexión de IGHE; IL12B; IL13; IL15; IL17A; IL1A; IL1B; IL2RA; IL4; IL5; IL5RA; IL6; IL6R; IL9; subunidad beta del receptor de interleucina 2; ITGA2; ITGA2B ITGB3; ITGA4 ITGB7; ITGA5; ITGAL; ITGAV_ITGB3; ITGB2; KDR; L1CAM; Lewis-y; lípido A, dominio del lipopolisacárido LPS; LTA; MET; MMP14; MMp15; MST1R; MSTN; MUC1; MUC4; MUC16; MUC5AC; antígeno de granulocitos NCA-90; Nectina 4; NGF; NRP; NY-ESO-1; OX40L; PLAC-1; PLGF; PDGFRA; PD1; PDL1; PSCA; fosfatidilserina; PTK-7; Pseudomonas aeruginosa serotipo IATS O11; VRS (virus respiratorio sincitial humano, glicoproteína F); ROR1; RTN4; SELL; SELP; STEAP1; Subunidad B de la toxina de tipo Shiga [Escherichia coli]; SLAM7; SLC44A4; SOST; Ácido lipoteico de Staphylococcus epidermidis; receptor alfa_beta de células T; TF; TGFB1; TGFB2; TMEFF2; TNC; TNF; TNFRSF10A; TNFRSF10B; TNFRSF12A; TNFSF13; TNFSF14; TNFSF2; TNFSF7; TRAILR2; TROP2; TYRP1; VAP-1; y Vimentina.

El anticuerpo precursor puede ser cualquier anticuerpo humano de cualquier isotipo, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgE e IgD, opcionalmente un anticuerpo humano de longitud completa, tal como un anticuerpo de IgG1 humano de longitud completa. El anticuerpo precursor puede comprender una secuencia de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, y 5.

Los anticuerpos monoclonales, tales como el precursor y/o las variantes, para usar en la presente invención, se pueden producir, por ejemplo, por el método del hibridoma descrito por primera vez en Kohler et al, Nature 256, 495 (1975), o pueden producirse por métodos de ADN recombinante. Los anticuerpos monoclonales también se pueden aislar a partir de fagotecas de anticuerpos usando las técnicas descritas en Clackson, por ejemplo, Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581-597 (1991). Los anticuerpos monoclonales pueden obtenerse de cualquier fuente adecuada. Por tanto, por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden obtenerse a partir de hibridomas preparados a partir de linfocitos B esplénicos de murino obtenidos de ratones inmunizados con un antígeno de interés, por ejemplo en forma de células que expresan el antígeno en la superficie, o un ácido nucleico que codifica un antígeno de interés. Los anticuerpos monoclonales también pueden obtenerse a partir de hibridomas derivados de células que expresan anticuerpos de seres humanos inmunizados o de mamíferos no humanos, como ratas, perros, primates, etc.

En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo humano. Dichos anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra cualquier antígeno pueden generarse utilizando partes que transportan ratones transgénicos o transcromosómicos del sistema inmunitario humano más bien que del sistema del ratón. Estos ratones transgénicos y transcromosómicos incluyen los ratones denominados en el presente documento como ratones HuMAb® y ratones KM, respectivamente, y se denominan colectivamente en este documento "ratones transgénicos".

El ratón HuMAb® contiene un minilocus de genes de la inmunoglobulina humana que codifican las secuencias de la inmunoglobulina de la cadena pesada (m y ^y) y la cadena ligera k humanas no reordenadas, junto con mutaciones dirigidas que inactivan los loci endógenos de la cadena m y k (Lonberg, N. et al., Nature 368, 856-859 (1994)). En consecuencia, los ratones presentan una expresión reducida de IgM o k de ratón y, en respuesta a la inmunización, los transgenes humanos de cadena pesada y ligera introducidos, experimentan un cambio de clase y mutación somática para generar anticuerpos monoclonales humanos de alta afinidad IgG,K (Lonberg, N. et al. (1994), supra; revisado en Lonberg, N. Handbook of Experimental Pharmacology 113, 49-101 (1994), Lonberg, N. y Huszar, D., Intern. Rev. Immunol. Vol. 1365-93 (1995) y Harding, F. y Lonberg, N. Ann. N.Y. Acad. Sci 764536-546 (1995) ). La preparación de los ratones HuMAb® se describe con detalle en Taylor, L. et al., Nucleic Acids Research 20, 6287 6295 (1992), Chen, J. et al., International Immunology 5, 647-656 (1993), Tuaillon et al., J. Immunol. 152, 2912-2920 (1994), Taylor, L. et al., International Immunology 6, 579-591 (1994), Fishwild, D. et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996). Véanse también los documentos US 5.545.806, US 5.569.825, US 5.625.126, US 5.633.425, US 5.789.650, US 5.877.397, US 5.661.016, US 5.814.318, US 5.874.299, US 5.770.429, US 5.545.807, WO 98/24884, WO 94/25585, WO 93/1227, WO 92/22645, WO 92/03918 y WO 01/09187.

Los ratones HCo7, HCo12, HCo17 y HCo20 tienen una alteración de la JKD en sus genes de la cadena ligera (kappa) endógena (como se describe en Chen et al, EMBO J. 12, 821-830 (1993)), una alteración CMD en sus genes de cadena pesada endógena (como se describe en el Ejemplo 1 del documento WO 01/14424) y un transgén de la cadena ligera kappa humana KCo5 (como se describe en Fishwild et al, Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)). Adicionalmente, los ratones Hco7 tienen un transgén de la cadena pesada humana HCo7 (como se describe en el documento US 5.770.429), los ratones HCo12 tienen un transgén de la cadena pesada humana HCo12 (como se describe en el Ejemplo 2 del documento WO 01/14424), los ratones HCo17 tienen un transgén de la cadena pesada humana HCo17 (como se describe en el Ejemplo 2 del documento WO 01/09187) y los ratones HCo20 tienen un transgén de la cadena pesada humana HCo20. Los ratones resultantes expresan transgenes de cadenas pesadas y ligeras kappa de inmunoglobulina humana en un fondo homocigótico para alterar los loci de las cadenas pesadas y ligeras endógenas de ratón.

En la cepa de ratones KM, el gen de la cadena ligera kappa endógeno de ratón se ha alterado homocigóticamente como se describe en Chen et al, EMBO J. 12, 811-820 (1993) y el gen de la cadena pesada endógeno de ratón se ha alterado homocigóticamente como se describe en el Ejemplo 1 del documento WO 01/09187. Esta cepa de ratón lleva un transgén de cadena ligera kappa humana, KCo5, como se describe en Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996). Esta cepa de ratón también lleva un transcromosoma de la cadena pesada humana compuesto por el fragmento hCF del cromosoma 14 (SC20), como se describe en el documento WO 02/43478. Los ratones HCo12-Balb/C pueden generarse cruzando HCo12 con KCo5[J/K](Balb) como se describe en el documento WO/2009/097006. Los esplenocitos de estos ratones transgénicos pueden utilizarse para generar hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales humanos según técnicas bien conocidas.

Asimismo, cualquier región de unión al antígeno puede obtenerse de anticuerpos humanos o de anticuerpos de otras especies identificados mediante tecnologías de expresión, que incluyen, sin limitación, expresión en fago, expresión en retrovirus, expresión en ribosomas y otras técnicas, usando técnicas conocidas en la materia, y las moléculas resultantes se pueden someter a maduración adicional, como la maduración por afinidad, ya que estas técnicas son bien conocidas en la materia (véase, por ejemplo, Hoogenboom et al, J. Mol. Biol. 227, 381 (1991) (expresión en fago), Vaughan et al., Nature Biotech 14, 309 (1996) (expresión en fago), Hanes y Plucthau, PNAS USA 94, 4937 4942 (1997) (expresión en ribosoma), Parmley y Smith, Gene 73, 305-318 (1988) (expresión en fago), Scott TIBS 17, 241-245 (1992), Cwirla et al., PNAS USA 87, 6378-6382 (1990), Russel et al., Nucl. Acids Research 21, 1081-1085 (1993), Hogenboom et al., Immunol. Reviews 130, 43-68 (1992), Chiswell y McCafferty TIBTECH 10, 80-84 (1992) y documento US 5.733.743). Si se utilizan tecnologías de expresión para producir anticuerpos que no son humanos, dichos anticuerpos pueden estar humanizados.

En otro aspecto, la divulgación se refiere a un polipéptido precursor que comprende un dominio Fc y una región de unión. Se entiende que en el contexto de la presente invención todas las realizaciones relativas al anticuerpo precursor se aplican de forma similar a un "polipéptido precursor".

Una mutación de acuerdo con la presente divulgación puede ser, aunque no de forma limitativa, una deleción, inserción o sustitución de uno o más aminoácidos. Dicha sustitución de aminoácidos puede ser con cualquier aminoácido natural o no natural.

"Mutantes simples"

Las variantes de anticuerpos o polipéptidos de acuerdo con el aspecto del "mutante simple" de la presente divulgación comprenden una mutación, de forma típica una sustitución de aminoácidos, en al menos un resto de aminoácido mostrado en la Tabla 1, que enumera cada resto de aminoácido, numerado según el índice de la UE en un anticuerpo de IgG1 humana, junto con el aminoácido en la posición correspondiente de un anticuerpo precursor IgG2, IgG3, e IgG4 así como las sustituciones de aminoácidos "Ilustrativas" y "Preferidas". El segmento de IgG2 que corresponde a los restos P247 a K447, el segmento de Fc de IgG3 que corresponde a los restos P247 a K447 y el segmento de IgG4 que corresponde a los restos P247 a K447 en IgG1se muestran en la Figura 2.

Tabla 1: Sitios de mutación ilustrativos sustituciones de aminoácidos ara el as ecto del "mutante sim le"

continuación

Como se observa en la Tabla 1, las sustituciones de aminoácidos que dieron como resultado un aumento de la lisis celular de las células Wien133 en el Ejemplo 19 se incluyen como "Sustituciones preferidas".

En un aspecto, la presente divulgación se refiere a una variante de un polipéptido precursor que comprende un dominio Fc de una inmunoglobulina y una región de unión, en donde la variante comprende una mutación en al menos un resto de aminoácido seleccionado entre los correspondientes a E345, E430, S440, Q386, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Y436 y K447 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, con la condición de que la mutación en S440 sea S440Y o S440W.

En una realización de la divulgación, la variante de anticuerpo polipéptido puede ser un anticuerpo.

Por tanto, en otro aspecto, la divulgación se refiere a una variante de un anticuerpo precursor que comprende una región de unión a antígeno y el dominio Fc de una inmunoglobulina, en donde la variante comprende una mutación en al menos un resto de aminoácido seleccionado entre los correspondientes a E345, E430, S440, Q386, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Y436 y K447 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, con la condición de que la mutación en S440 sea S440Y o S440W. Como alternativa, el resto de aminoácidos se selecciona entre los correspondientes a H310, G385, H433, N434, Q438 y K439 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana.

Cada uno de los restos de aminoácidos que corresponde a E345, E430, S440, Q386, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Y436 y K447 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana se puede agrupar de acuerdo con lo siguiente como se ha descrito anteriormente:

(c) un resto de aminoácido dentro de la hélice CH3 del extremo N,

Una mutación de acuerdo con la presente divulgación puede ser, aunque no de forma limitativa, una deleción, inserción o sustitución de uno o más aminoácidos. Dicha sustitución de aminoácidos puede ser con cualquier aminoácido natural o no natural. Por tanto, en una realización de la divulgación, la mutación en al menos un resto de aminoácido es una deleción. En otra realización de la divulgación, la mutación en al menos un resto de aminoácido es una inserción. En otra realización, la mutación en al menos un resto de aminoácido es una sustitución.

En una realización adicional de la divulgación, la mutación en al menos un resto de aminoácido es una sustitución de aminoácido seleccionada entre las correspondientes a E345X, E430X, S440W/Y, Q386K, en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, en donde X es cualquier aminoácido, tal como un aminoácido de origen natural. En una realización preferida de la divulgación, la mutación en al menos un resto de aminoácido es una sustitución de aminoácido seleccionada entre las correspondientes a E345R,Q,N,K,A,C,D,F,G,H,I,L,M,P,S,T,V,W,Y; E430T,S,G,A,C,D,F,H,I,L,K,M,N,P,Q,R,V,W,Y; S440W,Y, y Q386K en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana.

En una realización preferida adicional de la divulgación, la mutación en al menos un resto de aminoácido es una sustitución de aminoácido seleccionada entre las correspondientes a E345R/Q/N/K, E430T/S/G, S440Y/W, y Q386K en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana.

Como alternativa, el al menos un resto de aminoácido selecciona entre E382 y H433. Como alternativa especial, las sustituciones de aminoácidos incluyen E345Y,D,W; y E430F,H. Como alternativa, E382D,Q,K,R; y H433R.

En una realización específica de la divulgación, la sustitución de aminoácido es E345R. En una realización alternativa, la mutación se selecciona entre el grupo que consiste en 1253 a E, N, Q, S o T; H310 a N, Q, W o Y; Q311 a E o R; E382 a D, H, K, R, N, Q, S, T, W o Y; G385 a E, H, K, N, Q, R, S, T, W o Y; H433 a R; N434 a D, E, H, K, Q, R, S, T, W o Y; Y436 a A, E, F, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T o V; Q438 a A, E, G, H, K, N, Q, R, S, T, W o Y; K439 a D, H, Q, R, W o Y; y S440 a D, E, H, F, N, Q, W o Y.

En otra realización alternativa de la divulgación, la mutación se selecciona entre el grupo que consiste en 1253 a N o Q; H310 a Q; Q311 a E o R; E382 a D, Q, K o R); G385 a D, E, K o R; H433 a R; N434 a H, K, Q o R; Y436 a N, Q, S o T; Q438 a N, S o T; K439 a Q; y S440 a D, E o Q.

En otra realización alternativa de la divulgación, la mutación se selecciona entre el grupo que consiste en E382 a D, Q, K o R); y H433 a R.

En una realización de la divulgación, la variante comprende una mutación E382R.

En una realización de la divulgación, la variante comprende una mutación H433R.

Como se muestra en los Ejemplos, las variantes del anticuerpo CD38 HuMab-005 y -003 y/o del anticuerpo CD20 HuMab-7D8 y -11B8 y del anticuerpo rituximab y/o EGFR HuMab-2F8 que incluían una de estas sustituciones de aminoácidos tenían una mayor unión a C1q, activación del complemento y/o CDC que los HuMab 005 y 7D8 naturales, respectivamente.

Debe entenderse que la variante también puede comprender solo una mutación de las "sustituciones ilustrativas" enumeradas en la Tabla 1. La variante también puede comprender más de una mutación, tales como dos, tres, cuatro, cinco o seis de cualquiera de las mutaciones enumeradas en la Tabla 1.

Una realización preferida de la presente invención, por tanto, proporciona una variante que comprende una mutación en un resto de aminoácido seleccionado entre los enumerados en el aspecto anterior. Las mutaciones de aminoácidos particulares pueden ser una sustitución de aminoácidos correspondiente a cualquiera del grupo que consiste en P247G, I253V, S254L, Q311L, Q311W, E345A, E345C, E345D, E345F, E345G, E345H, E345I, E345K, E345L, E345M, E345N, E345P, E345Q, E345R, E345S, E345T, E345V, E345W, E345Y, D/E356G, D/E356R, T359R, E382L, E382V, Q386K, E430A, E430C, E430D, E430F, E430G, E430H, E430I, E430K, E430L, E430M, E430N, E430P, E430Q, E430R, E430S, E430T, E430V, E430W, E430Y, Y436I, S440Y e S440W. Estas tienen una mayor lisis celular (>39 % en células Wien133) como se muestra en el Ejemplo 19, Tabla 17.

En una realización alternativa de la divulgación, la variante comprende una mutación en un resto de aminoácido seleccionado entre los correspondientes a E382R, H433R, H435R y H435A.

Además de las mutaciones indicadas, la variante puede tener cualquiera de las características descritas para el anticuerpo precursor. En particular, puede ser un anticuerpo humano. La variante puede ser además, además de las mutaciones, de cualquier subtipo de IgG1.

Cuando se une a su antígeno en la superficie de una célula que expresa el antígeno, sobre una membrana celular, en un virión, o en otra partícula, o el antígeno está asociado a un virión, opcionalmente, en donde el antígeno está comprendido en la cubierta proteica o en una envoltura lipídica del virión, dicha variante de anticuerpo puede tener, en comparación con el anticuerpo precursor, al menos una de las siguientes características: (i) aumento de la unión a C1q, (ii) activación del complemento mediada por anticuerpo, (iii) CDC mediada por anticuerpo, (iv) formación de oligómeros, (v) estabilidad del oligómero o una combinación de cualquiera de los puntos (i) a (v). En una realización de (iv) o (v), el oligómero es un hexámero. En una realización, la variante tiene también o alternativamente otra función efectora conservada o mejorada, tal como la unión a C1q, activación del complemento, citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC), unión a FcRn, unión al receptor Fc, incluida la unión al receptor Fc-gamma, unión a la proteína A, unión a la proteína G, fagocitosis celular dependiente de anticuerpo (ADCP), citotoxicidad celular dependiente del complemento (CDCC), citotoxicidad potenciada por el complemento, opsonización, internalización del polipéptido que contiene Fc, regulación negativa de la diana, captación de ADC, inducción de la apoptosis, muerte celular, detención del ciclo celular y cualquier combinación de las mismas.

Sin pretender quedar limitado a teoría particular alguna, el efecto causado por la sustitución de aminoácidos en las posiciones indicadas, con los restos de aminoácidos de la Tabla 1 puede, por ejemplo, causar el efecto en sí mismo, estar involucrado en el contacto con el dominio Fc de otra molécula directamente, o puede estar mutado para interactuar con otro dominio Fc directamente o afectar indirectamente a la interacción intermolecular Fc:Fc. Por tanto, se cree que las sustituciones, sin pretender imponer ninguna teoría, aumentan directa o indirectamente la fuerza de unión entre las moléculas de anticuerpos en la forma oligomérica, mejorando la estabilidad de la estructura del oligómero, tal como una estructura hexamérica, pentamérica, tetramérica, trimérica o dimérica. Por ejemplo, la sustitución de aminoácidos puede ser una que promueva o refuerce la formación de nuevos enlaces intermoleculares Fc:Fc, tales como, aunque no de forma limitativa, interacciones de Van der Waals, enlaces de hidrógeno, interacciones carga-carga o interacciones de apilamiento aromático, o uno que promueva el aumento de la entropía en la interacción Fc:Fc por la liberación de moléculas de agua. Con referencia a la Tabla 1, las "sustituciones ilustrativas" pueden seleccionarse según el tamaño y las propiedades fisicoquímicas que participen o promueven las interacciones Fc:Fc intermoleculares o las interacciones intramoleculares (mutaciones alostéricas). Las "sustituciones preferidas" pueden seleccionarse según el tamaño y las propiedades fisicoquímicas óptimas para participar o estimular las interacciones Fc:Fc intermoleculares o las interacciones intramoleculares (mutaciones alostéricas).

Las "sustituciones ilustrativas" de los aminoácidos enumerados en la Tabla 1, incluyen intercambiar un resto R por un resto R, e intercambiar un resto H por un resto R. Cada "Sustitución ilustrativa" de aminoácidos en cada resto de aminoácido específico enumerado en la Tabla 1 es una realización independiente y específica no limitante de acuerdo con la invención. Asimismo, cada "Sustitución preferida" de aminoácidos en cada resto de aminoácido específico enumerado en la Tabla 1 es una realización independiente y específica no limitante de acuerdo con la invención.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a una variante de un polipéptido precursor que comprende un dominio Fc de una inmunoglobulina y una región de unión, en donde la variante comprende una mutación en al menos dos restos de aminoácidos seleccionados entre el grupo de

(c) un resto de aminoácido dentro de la hélice CH3 del extremo N,

(e) un resto de aminoácido correspondiente a E345, E382 o Q386 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana,

en donde las al menos dos mutaciones de aminoácidos son diferentes.

En una realización de la divulgación, el polipéptido precursor y por lo tanto también la variante del mismo, puede ser un anticuerpo.

De este modo, la presente divulgación también se refiere a una variante de un anticuerpo precursor que comprende una región de unión a antígeno y un dominio a Fc, en donde la variante comprende una mutación en al menos dos restos de aminoácidos seleccionados entre el grupo de

(c) un resto de aminoácido dentro de la hélice CH3 del extremo N,

en donde las al menos dos mutaciones de aminoácidos son diferentes.

Por tanto, una variante de la realización anterior puede comprender una mutación en al menos dos, tales como dos, tres, cuatro, cinco, o más de los de aminoácidos Tabla 1.

En cualquiera de las realizaciones de la divulgación donde dicha mutación en al menos dos aminoácidos está comprendida en la variante, puede estar presente en cada una de las cadenas pesadas de la variante, o una de las dos puede estar comprendida en una de las cadenas pesadas y la otra puede estar comprendida en la otra cadena pesada, respectivamente o viceversa.

En una realización de la divulgación, la variante comprende una mutación en al menos dos restos de aminoácidos seleccionados entre los correspondientes a E345, E430, S440, Q386, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Y436 y K447 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, con la condición de que la mutación en S440 sea S440Y o S440W. Como alternativa, la variante comprende además una mutación en al menos un resto seleccionado entre el grupo que consiste de H310, G385, H433, N434, Q438 y K439.

En una realización de la divulgación, la variante comprende una mutación en al menos dos restos de aminoácidos seleccionados entre los correspondientes a E345X, E430X, S440W/Y, Q386K, P247G, I253V, S254L, Q311L/W, D/E356R, E382V y Y436I en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, en donde X es cualquier aminoácido, tal como un aminoácido de origen natural.

Por ejemplo, la variante del anticuerpo puede comprender una mutación en al menos uno de los E345, E430, S440 y Q386, alternativamente E382 y H433, tales como dos o todos los E345, E430, S440 y Q386, alternativamente E382 y H433, opcionalmente que comprende, además, una mutación en uno o más de los otros aminoácidos enumerados en la Tabla 1. Por tanto, en una realización adicional, la variante comprende una mutación en al menos dos restos de aminoácidos seleccionados entre el grupo de las correspondientes a E345X, E430X, S440W/Y, y Q386K en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, en donde X es cualquier aminoácido, tal como un aminoácido de origen natural.

Los ejemplos de combinaciones de una mutación en al menos dos restos de aminoácidos son E345X/E430X, E345X/S440Y o W, E345X/Q386K, E430X/S440Y o W, y E430X/Q386K.

En una realización de la divulgación, la mutación en al menos dos restos de aminoácidos es una deleción, inserción o sustitución. Dicha sustitución de aminoácidos puede ser con cualquier aminoácido natural o artificial.

En una realización particular de la divulgación, la mutación en al menos dos restos de aminoácidos puede ser una sustitución de aminoácidos correspondiente a cualquiera del grupo que consiste en P247G, I253V, S254L, Q311L, Q311W, E345A, E345C, E345D, E345F, E345G, E345H, E345I, E345K, E345L, E345M, E345N, E345P, E345Q, E345R, E345S, E345T, E345V, E345W, E345Y, D/E356G, D/E356R, T359R, E382L, E382V, Q386K, E430A, E430C, E430D, E430F, E430G, E430H, E430I, E430K E430L, E430M, E430N, E430P, E430Q, E430R, E430S, E430T, E430V, E430W, E430Y, Y436I, S440Y e S440W.

En una realización preferida de la divulgación, la variante comprende una mutación en al menos dos restos de aminoácidos son sustituciones de aminoácidos seleccionadas entre las correspondientes a E345R,Q,N,K,A,C,D,F,G,H, I, L,M,P,S,T,V,W,Y; E430T,S,G,A,C,D,F,H,I,L,K,M,N,P,Q,R,V,W,Y; S440W,Y; y Q386K, en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana.

Alternativamente, la mutación adicional se selecciona entre las correspondientes a I253E,N,Q,S,T; H310N,Q,W,Y; Q311 E,R; E382D,H,K,R,N,Q,S,T,W,Y; G385E,H,K,N,Q,R,S,T,W,Y; H433R; N434D,E,H,K,Q,R,S,T,W,Y; Y436,A,E,F,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V; Q438A,E,G,H,K,N,Q,R,S,T,W,Y; K439D,H,Q,R,W,Y; y S440D,E,H,F,N,Q En una realización preferida de la divulgación, la mutación en al menos dos restos de aminoácidos son sustituciones de aminoácidos seleccionadas entre las correspondientes a E345R/Q/N/K, E430T/S/G, S440Y/W, y Q386K en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana. Alternativamente, la mutación adicional se selecciona entre las correspondientes a I253N, Q; H310Q; Q311E,R; E382D,Q,K,R; G385D,E,K,R; H433R; N434H,K,Q,R; Y436N,Q,S,T; Q438N,S,T; K439Q; y S440D,E,Q.

Los ejemplos de combinaciones específicas de una mutación en al menos dos restos de aminoácidos son E345R/E430T, E345R/S440Y, E345R/S440W, E345R/Q386K, E345R/E430G, E345Q/E430T, E345Q/S440Y, E345Q/S440W, E430T/S440Y, E430T/S440W, E430T/Q386K y S440Y/Q386K.

En una realización específica de la divulgación, la mutación no está en un resto de aminoácido correspondiente a 1253, N434 o Q311. En una realización adicional o alternativa, la mutación no está en H433, o la sustitución de aminoácidos no es H433A.

En una realización, la presente divulgación se refiere a un variante que comprende una mutación en al menos tres restos de aminoácidos seleccionados entre el grupo de

(c) un resto de aminoácido dentro de la hélice CH3 del extremo N,

(d) un resto de aminoácido dentro de la cadena beta CH3 del extremo C, con la condición de que no comprenda una mutación que corresponde a S440 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, y

en donde las al menos tres mutaciones de aminoácidos son diferentes.

En una realización particular de la divulgación, la variante comprende una mutación en los restos de aminoácidos, que son sustituciones de aminoácidos que corresponden a E345R, Q396K y E430G, que puede estar en una o ambas cadenas pesadas de la variante.

La mutación en los al menos tres restos de aminoácidos puede seleccionarse individualmente entre las sustituciones enumeradas en la Tabla 1. Los ejemplos no limitativos de las variantes que comprenden al menos tres mutaciones son: E345R/E430G/S440Y, E345R/E430G/S440W, E345K/E430G/S440Y, E345K/E430G/S440W, E345Q/E430G/S440Y, E345Q/E430G/S440W, E345N/E430G/S440Y, E345N/E430G/S440W, E345R/E430T/S440Y, E345R/E430T/S440W, E345K/E430T/S440Y, E345K/E430T/S440W, E345Q/E430T/S440Y, E345Q/E430T/S440W, E345N/E430T/S440Y, E345N/E430T/S440W, E345R/E430S/S440Y, E345R/E430S/S440W, E345K/E430S/S440Y, E345K/E430S/S440W, E345Q/E430S/S440Y, E345Q/E430S/S440W, E345N/E430S/S440Y, E345N/E430S/S440W, E345R/E430F/S440Y, E345R/E430F/S440W, E345K/E430F/S440Y, E345K/E430F/S440W, E345Q/E430F/S440Y, E345Q/E430F/S440W, E345N/E430F/S440Y y E345N/E430F/S440W.

Además de las mutaciones en uno o más aminoácidos de las Tablas 1 o 2A y B, la cadena pesada de la IgG puede comprender mutaciones adicionales conocidas en la técnica, por ejemplo, mutaciones que mejoran aún más las funciones efectoras. Dichas mutaciones adicionales incluyen mutaciones conocidas que potencian el CDC, la unión al receptor Fc-gamma o la unión de FcRn y/o la mejora de las funciones efectoras mediadas por el receptor Fcgamma.

En una realización de la divulgación, una variante de acuerdo con la invención comprende además una modificación potenciadora de CDC conocida, por ejemplo, un intercambio de segmentos entre isotipos de IgG para generar moléculas de IgG quiméricas (Natsume et al., 2008 Cancer Res 68(10), 3863-72); una o más sustituciones de aminoácidos en la región bisagra (Dall'Acqua et al., 2006 J Immunol 177, 1129-1138) y/o una o más sustituciones de aminoácidos en o cerca del sitio de unión a C1q en el dominio CH2, centrado alrededor de los restos D270, K322, P329 y P331 (Idusogie et al., 2001 J Immunol 166, 2571-2575; Michaelsen et al., 2009 Scand J Immunol 70, 553-564 y el documento WO 99/51642). Por ejemplo, en una realización, una variante de acuerdo con la divulgación comprende además una combinación de cualquiera de las sustituciones de aminoácidos S267E, H268F, S324T, S239d , G236A y I332E, que proporciona una función efectora mejorada mediante CDC o ADCC (Moore et al., 2010 mAbs 2(2), 181-189)). Otras mutaciones Fc que afectan a la unión con los receptores Fc (descritas en los documentos WO 2006/105062, WO 00/42072, patente de los EE.UU. 6.737.056 y patente de los EE.UU. 7.083.784) o las propiedades físicas de los anticuerpos documento (descritas en el documento WO 2007/005612 A1) también se pueden usar el las variantes de la invención.

En una realización, una variante de acuerdo con la divulgación comprende además modificaciones que mejoran la unión del receptor Fc-gamma y/o la función efectora mediada por el receptor Fc-gamma. Dichas modificaciones incluyen (i) la reducción de la cantidad de fucosa en la glicosilación unida al CH2 (glicogenomanipulación) (Umana P, et al., Nat Biotechnol 1999; 17: 176-80; Niwa R, et al., Clin Cancer Res 2004; 10: 6248-55.)) y (ii) mutagénesis dirigida a sitio de los aminoácidos situados en las regiones bisagra o CH2 de los anticuerpos (genomanipulación de proteínas) (Lazar GA, et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2006; 103: 4005-10).

En una realización, una variante de acuerdo con la divulgación se genomanipula además en el sitio de unión del FcRn, por ejemplo, para prolongar la semivida (t1/2) de los anticuerpos IgG. Dichas modificaciones incluyen (i) mutaciones N434A y T307A/E380A/N434A (Petcova et al. Int Immunol. 18 Dic 2006(12):1759); (ii) una sustitución de uno o más de Pro238, Thr256, Thr307,Gln311, Asp312, Glu380, Glu382 y Asn434 en un resto de alanina mejorando la unión a FcRn (Shields RL, et al. J. Biol. Chem. 2001;276:6591); y (iii) una sustitución de aminoácidos o una combinaciones de sustituciones de aminoácidos seleccionados entre M252Y/S254T/T256E, M252W, M252Y, M252Y/T256Q, M252F/T256D, V308T/L309P/Q311S, G385D/Q386P/N389S, G385R/Q386T/P387R/N389P, H433K/N434F/Y436H, N434F/Y436H, H433R/N434Y/Y436H, M252Y/S254T/T256EH433K/N434F/Y436H o M252Y/S254T/T256EG385R/Q386T/P387R/N389P en IgG1, aumentando la afinidad por el FcRn (Dall'Acqua et al., supra).

"Doble mutante"

Debe entenderse que todas las realizaciones de la divulgación descritas en el presente documento con referencia a un anticuerpo precursor, el primer anticuerpo precursor o el segundo anticuerpo precursor también deberán entenderse como realizaciones relativas a un precursor, primer polipéptido precursor o segundo polipéptido precursor que comprende un dominio Fc de una inmunoglobulina y una región de unión.

Como se ha descrito anteriormente y más adelante, la presente divulgación también se refiere a un aspecto "doble mutante", en donde dos mutaciones disminuyen individualmente una función efectora, pero juntas restauran la función efectora que tenía el anticuerpo precursor. Cuando se utilizan conjuntamente, aumenta la especificidad de la variante. Las variantes de anticuerpos según el aspecto "doble mutante" comprenden dos mutaciones, de forma típica sustituciones de aminoácidos, en el par de interacción de restos de aminoácidos específicos K439 y S440. De esta manera en un aspecto, la presente divulgación se refiere a una variante de un polipéptido precursor que comprende un dominio Fc de una inmunoglobulina y una región de unión, en donde la variante comprende una mutación

(i) en al menos un resto de aminoácido seleccionado entre los correspondientes a K439 y S440 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, con la condición de que la mutación en S440 no sea S440Y o S440W, tal como en donde la mutación en la posición correspondiente a K439 en la región Fc de la cadena pesada de IgG1 humana es K439D/E, y/o la mutación en la posición correspondiente a S440 en la región Fc de la cadena pesada de IgG1 humana es S440K/H/R;

(ii) en al menos un resto de aminoácido que corresponde a K447D/E o que corresponde a K447K/R/H y 448P en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana; o

(iii) en al menos un resto de aminoácido que corresponde a K447D/E o que corresponde a K447K/R/H y 448K/R/H y 449P en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana.

En una realización de la divulgación, el polipéptido precursor y, por lo tanto también la variante del mismo, puede ser un anticuerpo.

Por tanto, en un aspecto, la presente divulgación se refiere a una variante de un anticuerpo precursor que comprende una región de unión a antígeno y el dominio Fc de una inmunoglobulina, en donde la variante comprende una mutación en al menos un resto de aminoácido seleccionado entre los correspondientes a K439 y S440 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, con la condición de que la mutación en S440 no sea S440Y o S440W, tal como en donde la mutación en la posición correspondiente a K439 en la región Fc de la cadena pesada de IgG1 humana es K439D/E, y/o la mutación en la posición correspondiente a S440 en la región Fc de la cadena pesada de IgG1 humana es S440K/H/R. La Tabla 2A y B muestran las sustituciones "Ilustrativas" y "Preferidas" para los aspectos "doble mutante" (Tabla A) y "mutante mixto" (Tabla 2B).

Tabla 2A: Sitios de mutación ilustrativos sustituciones de aminoácidos ara el as ecto "doble mutante"

Tabla 2B: Sitios de mutación ilustrativos y sustituciones de aminoácidos, para el aspecto "mutantes mixtos" (Ab1

En una realización de la divulgación de la variante, cuando la mutación está en posiciones distintas a las den S440 y K447, y en donde la variante comprende además una mutación

(i) en al menos un resto de aminoácido que corresponde a K439 o S440 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, con la condición de que la mutación en S440 no sea S440W o S440Y;

En consecuencia, la divulgación proporciona una variante de un anticuerpo que comprende una primera mutación en un resto de la región CH2 y/o CH3 de una cadena pesada de IgG1 humana correspondiente a K439, y una segunda mutación en un residuo de la región CH2 y/o CH3 de una cadena pesada de IgG1 humana correspondiente a S440. Se contempla en la presente divulgación que la variante también pueda comprender solo una de las sustituciones de restos de aminoácidos, tales como uno cualquiera de K439E o S440K, tal como que la variante comprende una mutación en K439, opcionalmente, sin mutación en S440.

En una realización, la divulgación se refiere a la variante, en donde la mutación en K439 es una sustitución de aminoácidos en un aminoácido seleccionado entre E y D, tal como K439E.

En otra realización, la divulgación comprende una mutación en S440, opcionalmente, sin mutación en K439.

En una realización, la divulgación se refiere a la variante, en donde la mutación en S440 es una sustitución de aminoácidos en un aminoácido seleccionado entre K, R y H, tal como S440K.

En una realización, la divulgación comprende mutaciones tanto en K439 como en S440.

En otra realización de la divulgación, la mutación en K439 se selecciona de K439 a D, E o R, y la mutación en S440 se selecciona de S440 a D, E, K, H y R.

En otra realización de la divulgación, la mutación en K439 se selecciona entre K439D y K439E, y la mutación en S440 se selecciona entre S440K, S440R y S440H.

En otra realización de la divulgación, la variante comprende mutaciones K439E y S440K.

Como se describe en los Ejemplos 4-6, las variantes de anticuerpos que comprenden solo una de las mutaciones K439E y S440K tenían una K^dfuertemente aumentada para C1q, lo que refleja una disminución de la activación del complemento y/o de la capacidad CDC. Sorprendentemente, se ha descubierto que las variantes de anticuerpos HuMAb 7D8 o 005 que comprendían ambas mutaciones tenían una unión a C1q o CDC restaurada o aumentada. Sin pretender imponer ninguna teoría específica, el mecanismo subyacente podría explicarse tal vez por que las respectivas mutaciones se compensan estéricamente entre sí, como se ilustra en las Figuras 4 y 5.

Cualquier "doble mutante" como se describe en el presente documento también puede utilizarse junto con una mutación que por sí misma sea capaz de aumentar una función efectora. Por tanto, el aspecto "doble mutante" se puede combinar con el aspecto "mutante simple", por ejemplo, la variante puede comprender además una mutación en cualquiera de las posiciones de aminoácidos enumeradas en la Tabla 1 o cualesquiera otras realizaciones descritas para el aspecto "mutante simple" anterior. Por tanto, en una realización, la mutación está en posiciones distintas a las de S440 y en donde la variante además comprende una mutación en al menos un resto de aminoácido correspondiente a K439 o S440 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, con la condición de que la mutación en S440 no sea S440W o S440Y.

En un aspecto, la presente divulgación se refiere a una variante de un polipéptido precursor que comprende un dominio Fc de una inmunoglobulina y una región de unión, en donde la variante comprende una mutación en al menos un resto de aminoácidos seleccionado entre el grupo de

(c) un resto de aminoácido dentro de la hélice CH3 del extremo N,

(e) un resto de aminoácido correspondiente a E345, E382 o Q386 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, y en donde la variante comprende una mutación adicional

En una realización de la divulgación, el polipéptido precursor y, por lo tanto la variante del mismo, puede ser un anticuerpo.

Por tanto, en un aspecto, la presente divulgación se refiere a una variante de un anticuerpo precursor que comprende una región de unión a antígeno y el dominio a Fc de una inmunoglobulina, en donde la variante comprende una mutación en al menos un resto de aminoácidos seleccionado entre el grupo de

(c) un resto de aminoácido dentro de la hélice CH3 del extremo N,

(e) un resto de aminoácido correspondiente a E345, E382 o Q386 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, y

en donde la variante comprende una mutación adicional

(i) en al menos un resto de aminoácido que corresponde a K439 o S440 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, con la condición de que la mutación en S440 no sea S440W o S440Y,

En una realización de la divulgación, la variante comprende una mutación en al menos un resto de aminoácido seleccionado entre los correspondientes a E345, E430, S440, Q386, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Y436 y K447 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, con la condición de que la mutación en S440 sea S440Y o S440W, y la variante comprenda una mutación adicional en al menos un resto de aminoácido correspondiente a K439 o S440 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, con la condición de que la mutación en S440 no sea S440W o S440Y.

En una realización adicional de la divulgación, la variante comprende una mutación en al menos un resto de aminoácido es una sustitución de aminoácido seleccionada entre las correspondientes a E345X, E430X, S440W/Y, Q386K, en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, en donde X es cualquier aminoácido, tal como un aminoácido de origen natural, y la variante comprende una mutación adicional en al menos un resto de aminoácido correspondiente a K439 o S440 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, con la condición de que la mutación en S440 no sea S440W o S440Y.

En una realización de la divulgación, la variante comprende una mutación de aminoácidos en las dos posiciones correspondientes a K439 y S440 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1, con la condición de que la mutación en S440 no sea S440Y o S440W.

En una realización adicional de la divulgación, la mutación en la posición correspondiente a K439 en la región Fc de la cadena pesada de IgG1 humana es K439D/E, y/o la mutación en la posición correspondiente a S440 en la región Fc de la cadena pesada de IgG1 humana es S440K/H/ R.

En una realización adicional de la divulgación, la primera mutación se realiza en un resto de aminoácidos seleccionada entre las correspondientes a E345, E430, Q386 y S440 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, con la condición de que la mutación en S440 sea S440Y o S440W; y la segunda y tercera mutación es una sustitución de aminoácidos en la posición K439E o S440K.

En una realización de la divulgación, la primera mutación es una deleción, inserción o sustitución. Dicha sustitución puede ser cualquier aminoácido natural o no natural.

En una realización adicional de la divulgación, la primera mutación se selecciona entre el grupo de E345R,Q,N,K,A,F,G,H,I,L,M,P,S,T,V,W,Y,C,D; E430T,S,G,A,F,H,L,P,R,V,C,D,I,K,M,N,Q,W,Y; y S440W,Y,D; y la segunda y tercera mutación es una sustitución de aminoácidos en la posición K439E o S440K.

En una realización preferida de la divulgación, la una mutación se selecciona entre el grupo de E345R,Q,N,K,Y; E430T,S,G,F,H; S440W,Y; y Q386K.

Otro ejemplo, en una realización de la presente divulgación, la variante comprende las mutaciones E345R, K439E y S440K, proporcionando de este modo una medición aumentada y más específica de una respuesta CDC.

En una realización de la divulgación, la variante comprende una mutación en al menos dos restos de aminoácidos seleccionados entre los correspondientes a E345, E430, S440, Q386, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Y436 y K447 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, con la condición de que la mutación en S440 sea S440Y o S440W, y la variante comprenda una mutación adicional en al menos un resto de aminoácido correspondiente a K439 o S440 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, con la condición de que la mutación en S440 no sea S440W o S440Y.

En una realización adicional de la divulgación, la variante comprende una mutación en al menos dos restos de aminoácidos es una sustitución de aminoácido seleccionada entre las correspondientes a E345X, E430X, S440W/Y, Q386K, en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, en donde X es cualquier aminoácido, tal como un aminoácido de origen natural, y la variante comprende una mutación adicional en al menos un resto de aminoácido correspondiente a K439 o S440 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, con la condición de que la mutación en S440 no sea S440W o S440Y.

En una realización adicional de la divulgación, la primera y la segunda mutación se realizan en restos de aminoácidos seleccionados entre los correspondientes a E345, E430, Q386 y S440 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, con la condición de que la mutación en S440 sea S440Y o S440W; y la tercera y cuarta mutación es una sustitución de aminoácidos en la posición K439E o S440K.

En otra realización de la divulgación, la variante comprende una mutación en ambas posiciones K439 y S440, como se describe en el presente documento, tiene un aumento en una función efectora mediada por Fc seleccionada entre unión a C1q, activación del complemento, citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC), unión a FcRn, unión al receptor Fc, incluida la unión al receptor Fcgamma, unión a la proteína A, unión a la proteína G, fagocitosis celular dependiente de anticuerpo (ADCP), citotoxicidad celular dependiente del complemento (CDCC), citotoxicidad potenciada por el complemento, opsonización, internalización del polipéptido que contiene Fc, regulación negativa de la diana, captación de ADC, inducción de la apoptosis, muerte celular, detención del ciclo celular y cualquier combinación de las mismas, en comparación con el anticuerpo precursor o una variante de anticuerpo que comprende una mutación en solo uno de K439 y S440.

La divulgación también proporciona el uso de las mutaciones K439E y S440K en un anticuerpo para restaurar una o más de (i) avidez de unión a C1q, (ii) activación del complemento mediada por anticuerpo, (iii) CDC mediada por anticuerpo, (iv) formación de oligómeros, (v) estabilidad del oligómero o una combinación de cualquiera de los puntos (i) a (v), en comparación con el anticuerpo precursor, que puede, por ejemplo, ser un anticuerpo natural o una variante de anticuerpo que comprenda solo una de las mutaciones K439E o S440K. En una realización de (iv) o (v), el oligómero es un hexámero.

En una realización de la divulgación, la variante se selecciona de un anticuerpo monoespecífico, anticuerpo biespecífico o anticuerpo multiespecífico.

Mutantes mixtos

Como se ha descrito anteriormente, los inventores de la presente invención también han descubierto que hay mutaciones que por sí solas disminuyen una función efectora, pero que cuando se utilizan conjuntamente se restablece la función efectora, por ejemplo las mutaciones en las posiciones K439 y S440 de la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana. Este concepto también puede utilizarse para garantizar el emparejamiento de dos anticuerpos diferentes, por tanto, al introducir K439 en un anticuerpo y ^s440 en el otro. Por tanto, las variantes de anticuerpos según el aspecto "mutante mixto" comprenden una mutación, pero una que típicamente produzca una interacción Fc:Fc reducida o muy reducida entre moléculas Fc idénticas. Sin embargo, puesto que las variantes de anticuerpos "mutantes mixtos" de la invención pueden emparejarse entre sí; proporcionando una unión a C1q activación del complemento, CDC, formación de oligómero y/o estabilidad del oligómero para la variante del anticuerpo específico restaurada o incluso aumentada, en comparación con, por ejemplo, cada variante en solitario o con una mezcla del anticuerpo precursor o anticuerpos precursores. En una realización de la divulgación, el oligómero es un hexámero. En una realización, el par de variantes de anticuerpo tienen también o alternativamente otra función efectora conservada o mejorada, tal como la unión a C1q, activación del complemento, citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC), unión a FcRn, unión al receptor Fc, incluida la unión al receptor Fc-gamma, unión a la proteína A, unión a la proteína G, fagocitosis celular dependiente de anticuerpo (ADCP), citotoxicidad celular dependiente del complemento (CDCC), citotoxicidad potenciada por el complemento, opsonización, intemalización del polipéptido que contiene Fc, regulación negativa de la diana, captación de ADC, inducción de la apoptosis, muerte celular, detención del ciclo celular y cualquier combinación de las mismas. Este aspecto de la invención proporciona una serie de aplicaciones en las que se puede regular no solo la fuerza sino también la selectividad en la unión a C1q, la activación del complemento, la CDC u otra función efectora.

En la Tabla 2 se muestran ejemplos de sitios de mutación para cada variante de anticuerpo en un par "mutante mixto". Específicamente, la invención proporciona una variante de un anticuerpo que comprende una región de unión a antígeno y el dominio Fc de una inmunoglobulina, cuya variante comprende una mutación en un resto de la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana correspondiente a uno de K439 y S440. En una realización, la mutación es en K439 y es una sustitución de aminoácidos en un aminoácido seleccionado entre E o D, tal como K439E. En una realización, la mutación es en S440 y es una sustitución de aminoácidos en un aminoácido seleccionado entre K, R o H, tal como S440K.

Así, en una realización la presente divulgación se refiere a una variante que comprende una mutación en al menos un resto de aminoácido seleccionado entre:

(c) un resto de aminoácido dentro de la hélice CH3 del extremo N,

(e) un resto de aminoácido correspondiente a E345, E382 o Q386 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana;

y en un resto de aminoácido que corresponde a K439 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana. En otra realización la presente divulgación se refiere a una variante que comprende una mutación en al menos un resto de aminoácido seleccionado entre:

(c) un resto de aminoácido dentro de la hélice CH3 del extremo N,

y en un resto de aminoácido que corresponde a S440 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana. En una realización de la divulgación, las dos realizaciones anteriormente descritas se pueden combinar en el aspecto de pareja de "mutante mixto" de la presente invención.

Cada variante de una pareja de "mutante mixto" puede comprender además una mutación en un aminoácido enumerado en la Tabla 1.

En una realización de la presente divulgación, la pareja de "mutante mixto" comprende una primera variante de un anticuerpo precursor y una segunda variante de un anticuerpo precursor,

en donde la primera variante comprende un primer dominio Fc de una inmunoglobulina y una región de unión a antígeno, en donde dicha primera variante comprende (i) una primera mutación en al menos un resto de aminoácido distinto de una mutación en K439 seleccionada del grupo de

(c) un resto de aminoácido dentro de la hélice CH3 del extremo N,

(d) un resto de aminoácido dentro de esa cadena beta CH3 del extremo C, con la condición de que, cuando una mutación correspondiente a S440 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, la mutación sea S440Y o S440W, y

(ii) una segunda mutación en la posición que corresponde a K439 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana; y

en donde la segunda variante comprende un segundo dominio Fc de una inmunoglobulina y una región de unión a antígeno, en donde dicha segunda variante comprende (i) una primera mutación en al menos un resto de aminoácido distinto de una mutación en S440 seleccionada del grupo de

(c) un resto de aminoácido dentro de la hélice CH3 del extremo N,

(d) un resto de aminoácido dentro de esa cadena beta CH3 del extremo C, y

y (ii) una segunda mutación en la posición correspondiente a S440 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1, con la condición de que la mutación en S440 no sea S440Y o S440W.

Otros ejemplos de pares de "mutantes mixtos" pueden comprender además, y no se limitan a, cualquiera de los siguientes pares; ; una primera variante que comprende la mutación K447E y una segunda variante que comprende la mutación K447/P448; una primera variante que comprende la mutación K447E y una segunda variante que comprende la mutación K447/K448/P449.

En una realización de la divulgación, la mutación es una deleción, inserción o sustitución. Dicha sustitución de aminoácidos puede ser con cualesquiera aminoácidos naturales o no naturales. En una realización, la mutación es una deleción. En otra realización, la mutación es una inserción. En otra realización, la mutación es una sustitución de un aminoácido.

En una realización particular de la divulgación, la primera variante y/o la segunda variante comprende una mutación en al menos un resto de aminoácido seleccionado entre los correspondientes a E345, E430, S440, Q386, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Y436 y K447 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, con la condición de que la mutación en S440 sea S440Y o S440W.

En una realización particular de la divulgación, la primera variante y/o la segunda variante comprende un mutación en al menos un resto de aminoácido que puede ser una sustitución de aminoácidos correspondiente a cualquiera del grupo que consiste en P247G, I253V, S254L, Q311L, Q311W, E345A, E345C, E345D, E345F, E345G, E345H, E345I, E345K, E345L, E345M, E345N, E345P, E345Q, E345R, E345S, E345T, E345V, E345W, E345Y, D/E356G, D/E356R, T359R, E382L, E382V, Q386K, E430A, E430C, E430D, E430F, E430G, E430H, E430I, E430K, E430L, E430M, E430N, E430P, E430Q, E430R, E430S, E430T, E430V, E430W, E430Y, Y436I, S440Y y S440W, y la primera variante comprende una segunda mutación en la posición correspondiente a K439 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana; y la segunda variante comprende una segunda mutación en la posición correspondiente a S440 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana.

Por ejemplo, en una realización de la divulgación, una variante en un pareja de "mutante mixto" comprende las mutaciones E345R y K439E, mientras que la otra variante comprende mutaciones E345R y S440K, lo que permite una mayor y más específica avidez de unión a C1q, activación del complemento, CDC, formación de oligómeros, estabilidad del oligómero y/u otra función relacionada con el efector, como la unión a FcRn, ADCC, unión al receptor Fc-gamma, unión a la proteína A, unión a la proteína G, ADCP, CDCC, citotoxicidad potenciada por el complemento, fagocitosis mediada por anticuerpo, internalización, apoptosis, unión al receptor del complemento de un anticuerpo opsonizado y/o combinaciones de las mismas.

El aspecto "mutante mixto", también puede comprender dos variantes comprendiendo cada una más de una de las mutaciones enumeradas en la Tabla 1, en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, tal como una primera variante que comprende las mutaciones S440K/K447E, y una segunda variante que comprende la mutación K439E/K447/P448; tal como una primera variante que comprende las mutaciones K439e/ K447e , y una segunda variante que comprende la mutación S440K/K447/P448.

Las variantes de un pareja de "mutante mixto" como se describe en el presente documento, pueden derivar del mismo anticuerpo precursor o de diferentes anticuerpos precursores. Asimismo, el aspecto "mutante mixto" también puede emplearse en anticuerpos biespecíficos o asimétricos. Asimismo, el primero, el segundo y el tercer anticuerpo pueden unirse a diferentes epítopos, en la misma diana o en dianas diferentes.

Asimismo, el aspecto "mutante mixto" puede proporcionar una respuesta CDC u otra respuesta efectora que se dirija más específicamente a las células tumorales que expresan dos antígenos tumorales específicos, utilizando un primer anticuerpo con una mutación K439E contra el primer antígeno y un segundo anticuerpo con una mutación S440K o S440R contra el segundo antígeno. Utilizando el aspecto "mutante mixto" que comprende tres variantes, siendo opcionalmente anticuerpos biespecíficos, se puede proporcionar una respuesta CDC u otra respuesta efectora que se dirija más específicamente a las células tumorales que expresan al menos dos, tales como dos, tres, cuatro, cinco o seis, antígenos tumorales específicos.

En una realización de cualquiera de los aspectos "mutante simple", "doble mutante" y "mutante mixto" de la divulgación, la variante se selecciona de un anticuerpo monoespecífico, anticuerpo biespecífico o anticuerpo multiespecífico.

En cualquier realización del aspecto "mutante mixto" de la divulgación, la primera, la segunda y/o tercera variante puede comprender la misma mutación o una diferente de cualquiera de las sustituciones de aminoácidos enumeradas en la Tabla 1.

Anticuerpos multiespecíficos

Debe entenderse que cualquier realización de los aspectos "mutante simple", "doble mutante" y "mutante mixto" descritos en el presente documento puede utilizarse en el aspecto de anticuerpos multiespecíficos descrito a continuación.

En un aspecto principal, la divulgación se refiere a una variante, que es un anticuerpo biespecífico que comprende un primer anticuerpo que comprende una primera región CH2-CH3 de una inmunoglobulina y una primera región de unión a antígeno, y un segundo polipéptido que comprende una segunda región CH2-CH3 de una inmunoglobulina y una segunda región de unión a antígeno, en donde la primera y la segunda regiones de unión a antígeno se unen a diferentes epítopos del mismo antígeno o a diferentes antígenos. y en donde

cada una de la primera y segunda región CH2-CH3 comprende una primera mutación en al menos un resto de aminoácido seleccionado entre los correspondientes a E345, E430, S440, Q386, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Y436 y K447 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, con la condición de que la mutación en S440 sea S440Y o S440W.

En una realización de la divulgación, la mutación es una deleción, inserción o sustitución. Dicha sustitución de aminoácidos puede ser con cualesquiera ácidos naturales o no naturales.

El anticuerpo biespecífico de la presente divulgación no está limitado a un formato particular y puede ser cualquiera de los descritos anteriormente y en el presente documento.

En una realización de la presente divulgación, el primer y el segundo polipéptido comprende una primera mutación en un resto de aminoácido seleccionado entre los correspondientes a E345, E430, S440, Q386, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Y436 y K447 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana.

En una realización particular de la divulgación, la mutación en al menos un resto de aminoácidos puede ser una sustitución de aminoácidos correspondiente a cualquiera del grupo que consiste en P247G, I253V, S254L, Q311L, Q311W, E345A, E345C, E345D, E345F, E345G, E345H, E345I, E345K, E345L, E345M, E345N, E345P, E345Q, E345R, E345S, E345T, E345V, E345W, E345Y, D/E356G, D/E356R, T359R, E382L, E382V, Q386K, E430A, E430C, E430D, E430F, E430G, E430H, E430I, E430L, E430M, E430N, E430P, E430Q, E430R, E430S, E430T, E430V, E430W, E430Y, Y436I, S440Y e S440W.

En una realización particular de la divulgación, el anticuerpo biespecífico tiene el formato descrito en el documento WO 2011/131746. Por tanto, en una realización de la divulgación, la variante que es un anticuerpo biespecífico, en donde el primer polipéptido comprende una mutación adicional en un resto de aminoácido seleccionado entre los correspondientes a K409, T366, L368, K370, D399, F405 y Y407 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana; y

el segundo polipéptido comprende una mutación adicional en un resto de aminoácido seleccionado entre los correspondientes a F405, T366, L368, K370, D399, Y407 y K409 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, y en donde dicha mutación adicional en el primer polipéptido es diferente de la dicha mutación adicional en el segundo polipéptido.

En una realización particular de la divulgación, el anticuerpo biespecífico que tiene un primer polipéptido comprende la mutación adicional en el resto de aminoácido que corresponde a K409 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, y el segundo polipéptido comprende la mutación adicional en el resto de aminoácido que corresponde a F405 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana. Dichos anticuerpos biespecíficos de acuerdo con la divulgación se pueden generar como se describe en el Ejemplo 22. Además, el efecto de la destrucción CDC mediante las proteínas heterodiméricas generadas se puede someter a ensayo usando un ensayo como el utilizado en el Ejemplo 23.

En una realización particular de la divulgación, el anticuerpo biespecífico que comprende un primer y un segundo polipéptido, en donde el primer polipéptido comprende una mutación en el resto de aminoácido que corresponde a K409 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana; el segundo polipéptido comprende una mutación en el resto de aminoácido que corresponde a F405 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana; y el primer y/o segundo polipéptido comprende además una mutación en el resto de aminoácido que corresponde a la sustitución de aminoácido E345r en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana.

En una realización particular de la divulgación, el anticuerpo biespecífico que comprende un primer y un segundo polipéptido, en donde el primer polipéptido comprende una mutación en el resto de aminoácido que corresponde a K409 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana; el segundo polipéptido comprende una mutación en el resto de aminoácido que corresponde a F405 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana; cada uno del primer y/o el segundo polipéptido comprende adicionalmente una mutación en los restos de aminoácidos que corresponde a la sustitución de aminoácidos E345R y Q386K en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana. Dichas mutaciones adicionales pueden estar tanto en el primer como en el segundo polipéptido, o E345R puede estar en el primer polipéptido y Q386K en el segundo; o viceversa.

En una realización particular de la divulgación, el anticuerpo biespecífico que comprende un primer y un segundo polipéptido, en donde el primer polipéptido comprende una mutación en el resto de aminoácido que corresponde a K409 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana; el segundo polipéptido comprende una mutación en el resto de aminoácido que corresponde a F405 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana; cada uno del primer y/o el segundo polipéptido comprende adicionalmente una mutación en los restos de aminoácidos que corresponden a la sustitución de aminoácido E345R, Q386K y E430G en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana. Dichas mutaciones pueden estar tanto en el primer como en el segundo polipéptido, o el primer polipéptido puede comprender las mutaciones E345R y E430G y el segundo polipéptido puede comprender la mutación Q386K; o viceversa.

El anticuerpo biespecífico puede comprender, por ejemplo, una región de unión a antígeno de un anticuerpo CD20 y una región de unión a antígeno de un anticuerpo ^cD38, y una sustitución de aminoácidos en uno o más aminoácidos enumerados en las Tablas 1 y/o 2. Los ejemplos de regiones de unión a CD20 incluyen las correspondientes a ofatumumab (2F2), 7D8 y 11B8, descrita en el documento WO2004/035607, y Rituximab (documento WO 2005/103081). Los ejemplos de regiones de unión a CD38 incluyen las de 003 y daratumumab (005), descritas en el documento WO2006/099875.

En una realización de la divulgación, el anticuerpo biespecífico se une a diferentes epítopos de la misma diana o en una diana diferente.

En otra realización de la divulgación, la primera mutación en el primer y segundo polipéptido puede ser la misma o diferente.

En una realización del aspecto de "mutante simple", "doble mutante", "mutante mixto" y anticuerpo multiespecífico de la divulgación, la variante es un anticuerpo de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD o IgE humana, opcionalmente un anticuerpo humano de longitud completa, tal como un anticuerpo de IgG1 humano de longitud completa.

En cualquier aspecto de "mutante simple", "mutante doble", "mutante mixto" y los aspectos de anticuerpos multiespecíficos de la divulgación, la unión a C1q del anticuerpo se determina de acuerdo con el ensayo descrito en el Ejemplo 4, el CDC se determina de acuerdo con el ensayo descrito en el Ejemplo 5, 6 o 10, la mutación no está en un resto de aminoácido directamente implicado en la unión de C1q, opcionalmente como se determina comparando la unión de C1q en un ensayo ELISA de acuerdo con el Ejemplo 3 con la unión de C1q en un ensayo basado en células de acuerdo con el ensayo descrito en el Ejemplo 4 y el ADCC se determina de acuerdo con el ensayo descrito en el Ejemplo 12.

Adicionalmente, la divulgación proporciona la preparación de una variante de cualquier aspecto de "mutante simple", "mutante doble", "mutante mixto" y anticuerpo multiespecífico descritos anteriormente. La divulgación también proporciona una composición que comprende una variante de cualquier aspecto y realización "doble mutante" descrita anteriormente, por ejemplo, una composición farmacéutica. La divulgación también proporciona el uso de cualquier variante de este tipo, preparación o composición como medicamento.

Los anteriores aspectos de la divulgación relativos a los anticuerpos "mutante simple", "doble mutante", "mutante mixto" y anticuerpo multiespecífico son especialmente de aplicación a las moléculas de anticuerpos humanos que tienen una cadena pesada IgG1 que comprende el segmento correspondiente, P247 a K447, que corresponde a los restos subrayados 130 to 330 de la región constante de la cadena pesada de la IgG1 humana (N.° de registro UniProt P01857; SEQ ID NO:1):

1 astkgpsvfp lapsskstsg gtaalgclvk dyfpepvtvs wnsgaltsgv 51 htfpavlqss glyslssvvt vpssslgtqt yicnvnhkps ntkvdkkvep 101 kscdkthtcp pcpapellgg psvflfppkp kdtlmisrtp evtcvvvdvs 151 hedpevkfnw yvdgvevhna ktkpreeqyn styrvvsvlt vlhqdwlngk 201 eykckvsnka lpapiektis kakgqprepq vytlppsrde ltknqvsltc 251 lvkgfypsdi avewesngqp ennykttppv ldsdgsffly skltvdksrw 301 qqgnvfscsv mhealhnhyt qkslslspgk

La presente divulgación también puede aplicarse a moléculas de anticuerpos que tengan una porción de cadena pesada IgG2 humana. Los restos de aminoácidos P247 a K447 de la cadena pesada de la IgG1 corresponden a los restos subrayados 126 a 326 de la región constante de la cadena pesada de la IgG2 (número de acceso P01859; SEQ ID NO:2)

1 astkgpsvfp lapcsrstse staalgclvk dyfpepvtvs wnsgaltsgv 51 htfpavlqss glyslssvvt vpssnfgtqt ytcnvdhkps ntkvdktver 101 kccvecppcp appvagpsvf lfppkpkdtl misrtpevtc vvvdvshedp 151 evqfnwyvdq vevhnaktkp reeqfnstfr vvsvltvvhq dwlngkeykc 201 kvsnkglpap iektisktk.g qprepqvytl ppsreemtkn qvsltclvkg 251 ...fypsdiavew esngqpenny kttppmldsd gsfflysklt vdksrwqqgn 301 ...vfscsvmhea lhnhytqksl slspgk

La presente divulgación también puede aplicarse a moléculas de anticuerpos que tengan una porción de cadena pesada IgG3 humana. Los restos de aminoácidos P247 a K447 de la cadena pesada de IgG1 corresponden a los restos 177 a 377 de la región constante de la cadena pesada de IgG3 (N.° de registro UniProt P01860, SEQ ID NO:3), subrayados en lo siguiente:

1 astkgpsvfp lapcsrstsg gtaalgclvk dyfpepvtvs wnsgaltsgv 51 htfpavlqss glyslssvvt vpssslgtqt ytcnvnhkps ntkvdkrvel 101 ktplgdttht cprcpepksc dtpppcprcp epkscdtppp cprcpepksc 151 dtpppcprcp apellggpsv flfppkpkdt lmisrtpevt cvvvdvshed 201 pevqfkwyvd qvevhnaktk preeqynstf rvvsvltvlh qdwlnqkeyk 251 ckvsnkalpa piektisktk qqprepqvyt lppsreemtk nqvsltclvk 301 qfypsdiave wessqqpenn ynttppmlds dqsfflyskl tvdksrwqqq 351 nifscsvmhe alhnrftqks lslspqk

La presente divulgación también puede aplicarse a moléculas de anticuerpos que tengan una porción de cadena pesada IgG4 humana. Los restos de aminoácidos P247 a K447 de la cadena pesada de la IgG1 corresponden a los restos subrayados 127 a 327 de la región constante de la cadena pesada de la IgG4 (número de acceso P01859, SEQ ID NO: 4)

1 astkgpsvfp lapcsrstse staalgclvk dyfpepvtvs wnsgaltsgv 51 htfpavlqss glyslssvvt vpssslgtkt ytcnvdhkps ntkvdkrves 101 kygppcpscp apeflggpsv flfppkpkdt lmisrtpevt cvvvdvsqed 151 pevqfnwyvd gvevhnaktk preeqfnsty rvvsvltvlh qdwlngkeyk 201 ckvsnkglps siektiskak ggprepqvyt lppsqeemtk nqvsltclvk 251 gfypsdiave wesngqpenn ykttppvlds dgsfflysrl tvdksrwqeg 301 nvfscsvmhe alhnhytqks lslslqk

La presente divulgación también puede aplicarse a un anticuerpo que tenga una porción de cadena pesada de alotipo humano IgG1m(f). La secuencia de aminoácidos del alotipo IgG1m(f) (la secuencia CH3 está subrayada) -SEQ ID NO:5

1

gtaalgclvk dyfpepvtvs wnsgaltsgv

51

vpssslgtqt yicnvnhkps ntkvdkrvep

101

psvflfppkp kdtlmisrtp evtcvvvdvs

151

ktkpreeqyn styrvvsvlt vlhqdwlngk

201

kakqqprepq vytlppsree mtknqvsltc

251

ennykttppv ldsdgs ffly skltvdksrw

301

qkslslspgk

Un alineamiento de los respectivos segmentos de las regiones constantes de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 e IgG1m se muestra en la Figura 2. En consecuencia, cualquier mutación en un aminoácido descrito en la Tabla 1 o en la Tabla 2A y B puede introducirse en su posición equivalente en la IgG2, IgG3, IgG4, y/o IgG1m(f) como se define en el alineamiento para obtener una variante de acuerdo con la invención.

En una realización de la divulgación, la invención proporciona una variante de un anticuerpo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 de longitud completa, que comprende una o más sustituciones de aminoácidos de acuerdo con cualquier aspecto descrito anteriormente.

En cualquiera de los aspectos de "mutante simple", "doble mutante", "mutante mixto" de la divulgación y el anticuerpo multiespecífico, la región Fc de una cadena pesada de IgG1 puede comprender la secuencia de restos 130 a 330 de la SEQ ID NO:1, restos 126-326 de la SEQ ID NO:2, restos 177 a 377 de la SEQ ID NO:3 o restos 127 a 327 de la SEQ ID NO:4.

En una realización de la divulgación, un anticuerpo precursor que comprende una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 1-5, tales como las SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID N.°: 4 o SEQ ID N.°: 5.

En una realización de la divulgación, la región Fc de una cadena pesada de IgG1 comprende la secuencia de restos 130 a 330 de la SEQ ID NO:1.

En una realización de la divulgación, el anticuerpo precursor es un anticuerpo de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, IgA1, IgA2, IgD o IgE humana.

En una realización de la divulgación, el anticuerpo precursor es un anticuerpo humano de longitud completa, tal como un anticuerpo de IgG1 humano de longitud completa.

En una realización de la divulgación, el anticuerpo precursor, primer anticuerpo precursor y segundo anticuerpo precursor es un anticuerpo de IgG1 humano, por ejemplo de alotipo IgG1m(za) o IgG1m(f), que opcionalmente comprende una región Fc que comprende la SEQ ID NO:1 o 5.

En una realización de la divulgación, el anticuerpo precursor es un anticuerpo IgG2 humano, que opcionalmente comprende una región Fc que comprende la SEQ ID NO:2.

En una realización de la divulgación, el anticuerpo precursor es un anticuerpo IgG3 humano, que opcionalmente comprende una región Fc que comprende la SEQ ID NO:3.

En una realización de la divulgación, el anticuerpo precursor es un anticuerpo IgG4 humano, que opcionalmente comprende una región Fc que comprende la SEQ ID NO:4.

En realizaciones particulares de cualquiera de los aspectos "mutante simple", "doble mutante" "mutante mixto" y anticuerpo multiespecífico de la divulgación, la variante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene un grado de identidad con los aminoácidos P247 a K447 de las SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4 y 5 de al menos un 70 %, 72 %, 74 %, 76 %, 78 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o de al menos un 99 %, salvo por las mutaciones introducidas de acuerdo con la presente invención.

Por tanto, la variante puede comprender una secuencia de acuerdo con las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO: 4, o SEQ ID NO:5 salvo por cualquier mutación definida en el presente documento.

En cualquiera de los aspectos anteriores de "mutante simple", "mutante doble", "mutante mixto" y multiespecífico de acuerdo con la presente divulgación, puede entenderse que incluye las siguientes realizaciones.

En una realización de la divulgación, el primer y/o segundo anticuerpo precursor es un fragmento de anticuerpo, opcionalmente seleccionado entre el grupo que consiste en un anticuerpo monovalente, un anticuerpo de cadena pesada, un dominio de intercambio de cadenas genomanipulado (SEED), un triomab, una inmunoglobulina de dominio variable doble (DVD), un anticuerpo de botón en ojal (KiH), un minianticuerpo, una molécula de redireccionamiento de doble afinidad (Fc-DART o Ig-DART); un anticuerpo LUZ-Y, un anticuerpo Biclonic, un anticuerpo de doble direccionamiento (DT)-Ig, un anticuerpo dos en uno, un Mab de reticulación, un mAb2, un cuerpo CovX, un anticuerpo biespecífico de tipo IgG, un Ts2Ab, un BsAb, un anticuerpo Hercules, un TvAb, un anticuerpo de fusión ScFv/Fc, un SCORPION, un fragmento scFv fusionado a un dominio Fc y un fragmento scFv doble fusionado a un dominio Fc.

En una realización adicional de la divulgación, tanto el primer como el segundo anticuerpo precursor se unen a un antígeno expresado en la superficie de una célula tumoral humana.

En una realización adicional de la divulgación, los antígenos del primer y el segundo anticuerpo precursor se seleccionan de forma independiente del grupo que consiste de erbB1 (EGFR), erbB2 (HER2), erbB3, erbB4, MUC-1, CD4, CD19, CD20, CD38, CD138, CXCR5, c-Met, proteína de la envoltura de He Rv , periostina, Bigh3, SPARC, BCR, CD79, CD37, EGFrvIII, L1-CAM, AXL, factor tisular (TF), CD74, EpCAM y MRP3.

En una realización adicional de la divulgación, el primer y segundo anticuerpos precursores son completamente humanos.

En una realización adicional de la divulgación, los antígenos del primer y segundo anticuerpo precursor, en cualquier orden, se seleccionan de CD20 y CD38, opcionalmente en donde el primer y segundo anticuerpos precursores, en cualquier orden, se seleccionan de 7D8 y 005.

En una realización adicional de la divulgación, tanto el primer anticuerpo como el segundo anticuerpo se unen a antígenos expresados en la superficie de una célula bacteriana o un virión.

En otra realización de la divulgación, la célula bacteriana se selecciona del grupo que consiste en S. aureus, S. epidermidis, S. pneumonía, Bacillus anthracis, Pseudomonas aeruginosa, Chlamydia trachomatis, E. coli, Salmonella, Shigella, Yersinia, S. typhimurium, Neisseria meningitides y Mycobacterium tuberculosis.

En una realización adicional de la divulgación, el primer y el segundo anticuerpo precursor se unen al mismo antígeno.

En otra realización de la divulgación, el primer y segundo anticuerpos precursores son el mismo anticuerpo.

En otra realización de la divulgación, el anticuerpo precursor se selecciona entre 7D8 y 005.

Composiciones

La presente invención proporciona una composición que comprende una primera variante de un anticuerpo precursor, en donde la primera variante es un anticuerpo humano de longitud completa, y una segunda variante de un anticuerpo precursor, en donde la segunda variante es un anticuerpo humano de longitud completa, en donde la primera variante comprende un primer dominio Fc de una inmunoglobulina y una región de unión a antígeno, en donde la segunda variante comprende un segundo dominio Fc de una inmunoglobulina y una región de unión a antígeno, y en donde dicha primera variante y la segunda variante comprenden una mutación que corresponde a E430G en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana y dicha primera variante comprende una mutación que corresponde a K439E en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, y dicha segunda variante comprende una mutación que corresponde a S440K en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, en donde las posiciones de aminoácidos se numeran de acuerdo con el índice Eu y en donde la primera y la segunda variante comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 % de grado de identidad con los restos de aminoácidos 130 a 330 de la SEQ ID NO 1 o 5, en donde la primera y la segunda variantes pueden emparejarse entre sí; proporcionando una unión a C1q restaurada o aumentada, activación del complemento y/o CDC, para el par de variantes de anticuerpos específicos, en comparación con cada variante en solitario o con una mezcla del anticuerpo precursor o anticuerpos precursores.

En la composición de acuerdo con la invención, cada una de la primera variante y la segunda variante pueden ser un anticuerpo IgG1 humano de longitud completa.

En la composición de acuerdo con la invención, la primera variante y la segunda variante pueden seleccionarse de un anticuerpo monoespecífico, anticuerpo biespecífico o anticuerpo multiespecífico.

En la composición de acuerdo con la invención, la primera y la segunda variantes pueden unirse a diferentes epítopos del mismo antígeno o a diferentes antígenos.

En la composición de acuerdo con la invención, una o ambas de la primera variante y la segunda variante se conjugan con un fármaco, toxina o radiomarcador, tal como por ejemplo, en donde una o ambas de la primera variante y la segunda variante se conjugan con una toxina a través de un enlazador.

Otro aspecto de la invención proporciona una composición como la descrita anteriormente y un transportador farmacéuticamente aceptable.

Un aspecto adicional de la invención proporciona una composición como la descrita anteriormente para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad, tal como el cáncer.

La divulgación también se refiere a composiciones que comprenden variantes y anticuerpos precursores que pueden ser cualquier variante y anticuerpo precursor como se describe en el presente documento. A continuación se describen aspectos y realizaciones específicas. Además, dichas variantes pueden obtenerse de acuerdo con cualquier método descrito en el presente documento.

En un aspecto, la presente divulgación se refiere a una composición que comprende una primera variante de un polipéptido precursor y una segunda variante de un polipéptido precursor, en donde la primera variante comprende un primer dominio Fc de una inmunoglobulina y una región de unión, en donde la segunda variante comprende un segundo dominio Fc de una inmunoglobulina y una región de unión, y en donde

(i) dicha primera variante comprende una mutación en la posición correspondiente a K439 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, y dicha segunda variante comprende una mutación en la posición correspondiente a S440 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, con la condición de que la mutación en S440 no sea S440Y o S440W,

(ii) dicha primera variante comprende una mutación en la posición correspondiente a K447D/E en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana; y dicha segunda variante comprende una mutación en la posición correspondiente a K447K/R/H y 448P en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, o

(iii) dicha primera variante comprende una mutación en la posición correspondiente a K447D/E en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana; y dicha segunda variante comprende una mutación en la posición correspondiente a K447K/R/H, 448K/R/H y 449P en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana.

En una realización de la divulgación, la primera o ambas variantes de un polipéptido precursor y la segunda variante de un polipéptido precursor pueden ser un anticuerpo.

Por tanto, en uno de los aspectos, la divulgación se refiere a una composición que comprende una primera variante de un anticuerpo precursor y una segunda variante de un anticuerpo precursor, en donde la primera variante comprende un primer dominio Fc de una inmunoglobulina y una región de unión a antígeno, en donde la segunda variante comprende un segundo dominio Fc de una inmunoglobulina y una región de unión a antígeno, y en donde (i) dicha primera variante comprende una mutación en la posición correspondiente a K439 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, y dicha segunda variante comprende una mutación en la posición correspondiente a S440 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, con la condición de que la mutación en S440 no sea S440Y o S440W,

En una realización de la divulgación, la composición que comprende una primera variante de un anticuerpo precursor y una segunda variante de un anticuerpo precursor, en donde la primera variante comprende un primer dominio Fc de una inmunoglobulina y una región de unión a antígeno, en donde la segunda variante comprende un segundo dominio Fc de una inmunoglobulina y una región de unión a antígeno, y en donde dicha primera variante comprende una mutación en la posición correspondiente a K439 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, y en donde la segunda variante comprende una mutación en la posición correspondiente a S440, con la condición de que la mutación en S440 no sea S440Y o S440W.

En una realización de la divulgación, la composición que comprende la primera variante de un anticuerpo precursor y la segunda variante de un anticuerpo precursor,

(c) un resto de aminoácido dentro de la hélice CH3 del extremo N,

(d) un resto de aminoácido dentro de la cadena beta CH3 del extremo C, y

(ii) una segunda mutación en la posición correspondiente a S440 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1, con la condición de que la mutación en S440 no sea S440Y o S440W.

En otra realización de la divulgación, la composición que comprende la primera variante de un anticuerpo y la segunda variante de un anticuerpo precursor, en donde la primera variante comprende (i) una primera mutación en al menos un resto de aminoácido distinto de una mutación en K439 seleccionada del grupo de

(c) un resto de aminoácido dentro de la hélice CH3 del extremo N,

(ii) una segunda mutación en la posición que corresponde a K439 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, y

en donde la segunda variante comprende una mutación en la posición correspondiente a S440 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, que no es S440Y ni S440W.

En otra realización de la divulgación, la composición que comprende la primera variante de un anticuerpo precursor y la segunda variante de un anticuerpo precursor,

en donde la primera variante comprende una mutación en la posición correspondiente a K439 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana; y

(c) un resto de aminoácido dentro de la hélice CH3 del extremo N,

(d) un resto de aminoácido dentro de la cadena beta CH3 del extremo C, y

En una realización de la divulgación, la mutación en la posición correspondiente a K439 en la región Fc de la cadena pesada de IgG1 humana es K439D/E, y/o la mutación en la posición correspondiente a S440 en la región Fc de la cadena pesada de IgG1 humana es S440K/H/ R.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a una composición que comprende una primera variante de un polipéptido precursor que comprende un dominio Fc de una inmunoglobulina y una región de unión y una segunda variante de un polipéptido precursor que comprende un dominio Fc de una inmunoglobulina y una región de unión, en donde

la primera variante comprende un primer dominio Fc de una inmunoglobulina y una región de unión a antígeno, en donde la primera variante comprende una mutación en al menos un resto de aminoácidos seleccionado entre el grupo de

(c) un resto de aminoácido dentro de la hélice CH3 del extremo N,

(e) un resto de aminoácido correspondiente a E345, E382 o Q386 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, y en donde

la segunda variante no comprende una mutación en un resto de aminoácido seleccionado del grupo de

(c) un resto de aminoácido dentro de la hélice CH3 del extremo N,

En una realización de la divulgación, el primer y/o segundo polipéptido precursor puede ser un anticuerpo.

La presente divulgación también se refiere a una realización de la composición, en donde la primera variante comprende

(i) una primera mutación en al menos un resto de aminoácido distinto de una mutación en K439 seleccionada del grupo de

(c) un resto de aminoácido dentro de la hélice CH3 del extremo N,

(ii) una segunda mutación en la posición correspondiente a K439 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, y

La presente divulgación también se refiere a una realización de la composición, en donde la primera variante comprende una mutación en la posición correspondiente a K439 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana; y

(a) un resto de aminoácido dentro de la región CH2-CH3 que proporciona mutaciones alostéricas, (b) un resto de aminoácido dentro de los botones hidrófobos de la región CH2-CH3,

(c) un resto de aminoácido dentro de la hélice CH3 del extremo N,

(d) un resto de aminoácido dentro de la cadena beta CH3 del extremo C, y

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a una composición que comprende una primera variante de un anticuerpo y una segunda variante de un anticuerpo precursor, en donde

(c) un resto de aminoácido dentro de la hélice CH3 del extremo N,

en donde la segunda variante comprende un segundo dominio Fc de una inmunoglobulina y una segunda región de unión a antígeno,

en donde dicha segunda variante no comprende una mutación en un resto de aminoácido seleccionado del grupo de (a) un resto de aminoácido dentro de la región CH2-CH3 que proporciona mutaciones alostéricas,

(c) un resto de aminoácido dentro de la hélice CH3 del extremo N,

En las realizaciones de la divulgación, en donde la segunda variante no comprende ninguna de las mutaciones enumeradas y descritas en el presente documento, dicha segunda variante puede incluir cualquiera de los ejemplos adecuados de segundo anticuerpo enumerados anteriormente en relación con los métodos de funciones efectoras. En una realización de la divulgación, la primera y la segunda variante comprende una primera mutación en al menos un resto de aminoácido seleccionada entre las correspondientes a E345, E430, Q386, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Y436 y K447 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana.

En una realización de la divulgación, la primera comprende una mutación en al menos un resto de aminoácido seleccionado entre los correspondientes a E345, E430, S440, Q386, P247, 1253, S254, Q311, D/E356, T359, E382, Y436 y K447 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, con la condición de que la mutación en S440 sea S440Y o S440W.

En una realización particular de la divulgación, la primera variante comprende una mutación en los restos de aminoácidos que corresponden a E345R y Q386K en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, y la segunda variante no comprende dichas mutaciones.

En una realización particular, de la divulgación, la primera variante comprende una mutación en los restos de aminoácidos que corresponden a E345R, Q386K y E430G en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, y la segunda variante no comprende dichas mutaciones.

En una realización de la divulgación, la al menos una primera mutación en la primera y segunda variantes son diferentes.

En una realización de la divulgación, cada una de la primera variante y la segunda variante es un anticuerpo de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD o IgE humana, opcionalmente cada una es un anticuerpo humano de longitud completa, tal como cada una es un anticuerpo de IgG1 humano de longitud completa.

En una realización de la divulgación, la primera variante y la segunda variante se seleccionan de un anticuerpo monoespecífico, anticuerpo biespecífico o anticuerpo multiespecífico.

En una realización adicional de la divulgación, la primera y la segunda variantes se unen a diferentes epítopos del mismo antígeno o a diferentes antígenos. Por tanto, en la realización, en donde el primer y el segundo anticuerpo son anticuerpos biespecíficos que pueden unirse a dos epítopos diferentes. Los al menos dos anticuerpos biespecíficos pueden ser iguales o diferentes. Si los anticuerpos biespecíficos son diferentes, la composición, por tanto, comprende el direccionamiento de hasta cuatro epítopos diferentes en las mismas o diferentes dianas.

En una realización adicional de la divulgación, una o ambas de la primera variante y la segunda variante se conjugan con un fármaco, toxina o radiomarcador, tal como por ejemplo, en donde una o ambas de la primera variante y la segunda variante se conjugan con una toxina a través de un enlazador.

En una realización adicional de la divulgación, una o ambas de la primera variante y la segunda variante forman parte de una proteína de fusión.

En otro aspecto de la divulgación, la invención se refiere a una composición que comprende cualquier variante, cualquier anticuerpo biespecífico o cualquier composición descrita en el presente documento y un transportador farmacéuticamente aceptable.

Se contempla que cualquiera de las realizaciones según el aspecto "mutante mixto" también puede estar comprendida en cualquiera de las realizaciones de la composición.

En una realización de la divulgación, las variantes del primer y segundo anticuerpos precursores se unen a antígenos expresados en la misma célula.

En otra realización de la divulgación, la variante del primer anticuerpo precursor comprende una sustitución de aminoácido de K439 en un aminoácido seleccionado entre E y D.

En otra realización de la divulgación, la sustitución de aminoácidos en la variante del primer anticuerpo precursor es K439E.

En otra realización de la divulgación, la variante del segundo anticuerpo precursor comprende una sustitución de aminoácido de S440 en un aminoácido seleccionado entre K, R y H.

En otra realización de la divulgación, la sustitución de aminoácidos en la variante del segundo anticuerpo precursor es S440K.

En una realización alternativa de la divulgación, la variante del primer y/o segundo anticuerpo comprende además una mutación en un resto seleccionado del grupo que consiste en H310, G385, H433, N434 y Q438.

En una realización alternativa adicional de la divulgación, la variante del primer y/o segundo anticuerpo precursor además una mutación seleccionada de E345 a D, K, N, Q, R o W; E382 a D, Q, K o R); y H433 a R.

En una realización adicional de la divulgación, la variantes del primer y segundo anticuerpos precursores además comprenden una mutación seleccionada entre E345R, E382R y H433R, tal como E345R.

En otro aspecto de la divulgación, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende la variante del primer anticuerpo precursor y la variante del segundo anticuerpo precursor de una cualquiera de las realizaciones enumeradas anteriormente.

Las composiciones farmacéuticas pueden formularse de acuerdo con técnicas convencionales como las divulgadas en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a edición, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995. Una composición farmacéutica de la presente invención puede incluir, por ejemplo, diluyentes, cargas, sales, tampones, detergentes (por ejemplo, un detergente no iónico, tal como Tween-20 o Tween-80), estabilizantes (p. ej., azúcares o aminoácidos sin proteínas), conservantes, agentes de isotonicidad, antioxidantes, fijadores de tejidos, solubilizantes y/u otros materiales adecuados para su inclusión en una composición farmacéutica. Ejemplos de transportadores acuosos y no acuosos adecuados que pueden emplearse en las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen agua, solución salina, suero salino tamponado con fosfato, etanol, dextrosa, polioles (tal como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol).

La composición farmacéutica se puede administrar por cualquier vía y modo adecuados. En una realización, una composición farmacéutica de la presente invención se administra por vía parenteral. La expresión "administración parenteral" como se usa en el presente documento significa modos de administración diferentes de la administración entérica y tópica, generalmente por inyección, e incluyen la inyección e infusión epidérmica, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal, intratendinosa, transtraqueal, subcutáneo, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, intracraneal, intratorácica, epidural e intraesternal.

Kit de piezas

La divulgación también se refiere a kits de piezas para uso simultáneo, separado o secuencial en terapia que comprenden variantes y anticuerpos precursores, en donde cualquier variante y anticuerpo precursor puede ser como se describe en el presente documento. A continuación se describen aspectos y realizaciones específicos de la divulgación. Además, dichas variantes pueden obtenerse de acuerdo con cualquier método descrito en el presente documento.

La divulgación también se refiere a kits de piezas para uso simultáneo, separado o secuencial en terapia que comprenden variantes y anticuerpos precursores que pueden ser cualquier variante y anticuerpo precursor descritos en el presente documento. A continuación se describen aspectos y realizaciones específicas. Además, dichas variantes pueden obtenerse de acuerdo con cualquier método descrito en el presente documento.

En un aspecto, la presente divulgación se refiere a un kit de piezas para uso simultáneo, separado o secuencial en terapia que comprende una primera variante de un polipéptido precursor y una segunda variante de un polipéptido precursor, en donde la primera variante comprende un primer dominio Fc de una inmunoglobulina y una región de unión, en donde la segunda variante comprende un segundo dominio Fc de una inmunoglobulina y una región de unión, y en donde

Por tanto, en uno de los aspectos, la divulgación se refiere a un kit de piezas para uso simultáneo, separado o secuencial en terapia, que comprende una primera variante de un anticuerpo precursor y una segunda variante de un anticuerpo precursor, en donde la primera variante comprende un primer dominio Fc de una inmunoglobulina y una región de unión a antígeno, en donde la segunda variante comprende un segundo dominio Fc de una inmunoglobulina y una región de unión a antígeno, y en donde

En una realización de la divulgación, el kit de piezas para uso simultáneo, separado o secuencial en terapia, que comprende una primera variante de un anticuerpo precursor y una segunda variante de un anticuerpo precursor, en donde la primera variante comprende un primer dominio Fc de una inmunoglobulina y una región de unión a antígeno, en donde la segunda variante comprende un segundo dominio Fc de una inmunoglobulina y una región de unión a antígeno, y en donde dicha primera variante comprende una mutación en la posición correspondiente a K439 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, and en donde la segunda variante comprende una mutación en la posición correspondiente a S440, con la condición de que la mutación en S440 no sea S440Y o S440W.

En una realización de la divulgación, el kit de piezas para uso simultáneo, separado o secuencial en terapia, que comprende la primera variante de un anticuerpo precursor y la segunda variante de un anticuerpo precursor, en donde la primera variante comprende un primer dominio Fc de una inmunoglobulina y una región de unión a antígeno, en donde dicha primera variante comprende (i) una primera mutación en al menos un resto de aminoácido distinto de una mutación en K439 seleccionada del grupo de

(c) un resto de aminoácido dentro de la hélice CH3 del extremo N,

(d) un resto de aminoácido dentro de la cadena beta CH3 del extremo C, y

En otra realización de la divulgación, el kit de piezas para uso simultáneo, separado o secuencial en terapia, que comprende la primera variante de un anticuerpo y la segunda variante de un anticuerpo precursor, en donde la primera variante comprende

(c) un resto de aminoácido dentro de la hélice CH3 del extremo N,

En otra realización de la divulgación, el kit de piezas para uso simultáneo, separado o secuencial en terapia, que comprende la primera variante de un anticuerpo precursor y la segunda variante de un anticuerpo precursor, en donde la primera variante comprende una mutación en la posición correspondiente a K439 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana; y

en donde la segunda variante comprende un segundo dominio Fc de una inmunoglobulina y una región de unión a antígeno,

en donde dicha segunda variante comprende (i) una primera mutación en al menos un resto de aminoácido distinto de una mutación en S440 seleccionada del grupo de

(c) un resto de aminoácido dentro de la hélice CH3 del extremo N,

(d) un resto de aminoácido dentro de la cadena beta CH3 del extremo C, y

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un kit de piezas para uso simultáneo, separado o secuencial en terapia, que comprende una primera variante de un polipéptido precursor que comprende un dominio Fc de una inmunoglobulina y una región de unión y una segunda variante de un polipéptido precursor que comprende un dominio Fc de una inmunoglobulina y una región de unión, en donde

(c) un resto de aminoácido dentro de la hélice CH3 del extremo N,

La presente divulgación también se refiere a una realización del kit de piezas para uso simultáneo, separado o secuencial en terapia, en donde la primera variante comprende (i) una primera mutación en al menos un resto de aminoácido distinto de una mutación en K439 seleccionada del grupo de

(c) un resto de aminoácido dentro de la hélice CH3 del extremo N,

La presente divulgación también se refiere a una realización del kit de piezas para uso simultáneo, separado o secuencial en terapia, en donde la primera variante comprende una mutación en la posición correspondiente a K439 en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana; y

(c) un resto de aminoácido dentro de la hélice CH3 del extremo N,

(d) un resto de aminoácido dentro de la cadena beta CH3 del extremo C, y

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un kit de piezas para uso simultáneo, separado o secuencial en terapia, que comprende una primera variante de un anticuerpo y una segunda variante de un anticuerpo precursor, en donde la primera variante comprende un primer dominio Fc de una inmunoglobulina y una primera región de unión a antígeno, en donde la primera variante comprende una mutación en al menos un resto de aminoácidos seleccionado entre el grupo de

(c) un resto de aminoácido dentro de la hélice CH3 del extremo N,

En una realización particular de la divulgación, la primera variante comprende una mutación en los restos de aminoácidos que corresponden a E345R, Q386K y E430G en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, y la segunda variante no comprende dichas mutaciones.

En una realización adicional de la divulgación, la primera y la segunda variantes se unen a diferentes epítopos del mismo antígeno o a diferentes antígenos. Por tanto, en la realización, en donde el primer y el segundo anticuerpo son anticuerpos biespecíficos que pueden unirse a dos epítopos diferentes. Los al menos dos anticuerpos biespecíficos pueden ser iguales o diferentes. Si los anticuerpos biespecíficos son diferentes, el kit de piezas para uso simultáneo, separado o secuencial en terapia, por tanto, comprende el direccionamiento de hasta cuatro epítopos diferentes en las mismas o diferentes dianas.

Se contempla que cualquiera de las realizaciones según el aspecto "mutante mixto" de la divulgación también puede estar comprendida en cualquiera de los kits de piezas para uso simultáneo, separado o secuencial en terapia, en realizaciones.

En otro aspecto, la divulgación se refiere a un kit de piezas farmacéutico para uso simultáneo, separado o secuencial en terapia, que comprende la variante del primer anticuerpo precursor y la variante del segundo anticuerpo precursor de una cualquiera de las realizaciones enumeradas anteriormente.

El kit de piezas farmacéutico para uso simultáneo, separado o secuencial en terapia, se puede administrar por cualquier vía y modo adecuados. En una realización, un kit de piezas farmacéutico para uso simultáneo, separado o secuencial en terapia, de la presente invención se administra por vía parenteral. La expresión "administración parenteral" como se usa en el presente documento significa modos de administración diferentes de la administración entérica y tópica, generalmente por inyección, e incluyen la inyección e infusión epidérmica, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal, intratendinosa, transtraqueal, subcutáneo, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, intracraneal, intratorácica, epidural e intraesternal.

Combinaciones

Adicionalmente, la divulgación proporciona una preparación de una variante de cualquier aspecto o realización "mutante simple" descritos anteriormente, es decir, preparaciones que comprenden múltiples copias de la variante. La divulgación también proporciona una composición que comprende una variante de cualquier aspecto y realización "mutante simple" descritos anteriormente, por ejemplo, una composición farmacéutica. La divulgación también proporciona el uso de cualquier variante de "mutante simple" de este tipo, preparación o composición como medicamento.

La divulgación también proporciona combinaciones de variantes, en donde una variante comprende al menos una mutación seleccionada de forma independiente entre las de la Tabla 1 y otra variante comprende al menos otra mutación seleccionada de forma independiente entre las de la Tabla 1, así como las preparaciones y composiciones farmacéuticas de dichas combinaciones de variantes y su uso como medicamento. Preferentemente, las dos variantes se unen al mismo antígeno o a diferentes antígenos que suelen expresarse en la superficie de la misma célula, membrana celular, virión y/u otra partícula.

Conjugados

En un aspecto, la presente divulgación se refiere a una variante, en donde dicha variante está conjugada a un fármaco, toxina o radiomarcador, tal como en donde la variante se conjuga con una toxina a través de un enlazador. En una realización de la divulgación, dicha variante forma parte de una proteína de fusión.

En otro aspecto, la variante de la invención no está conjugada en el extremo C con otra molécula, tal como una toxina o un etiqueta. En una realización, la variante está conjugada con otra molécula en otro sitio, normalmente en un sitio que no interfiere con la formación del oligómero. Por ejemplo, la variante del anticuerpo puede, en el otro sitio, estar unida a un compuesto seleccionado del grupo que consiste en una toxina (incluyendo un radioisótopo) un profármaco o un fármaco. Dicho compuesto puede hacer que la destrucción de células diana sea más eficaz, por ejemplo, en la terapia del cáncer. La variante resultante es, por tanto, un inmunoconjugado.

Por tanto, en un aspecto adicional, la presente divulgación proporciona un anticuerpo unido o conjugado a uno o más restos terapéuticos, tales como una citotoxina, un fármaco quimioterapéutico, una citocina, un inmunosupresor y/o un radioisótopo. Estos conjugados se denominan en el presente documento como "inmunoconjugados" o "conjugados de fármacos". Los inmunoconjugados que incluyen una o más citotoxinas reciben el nombre de "inmunotoxinas".

Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que sea perjudicial para las células (por ejemplo, las destruya). Los agentes terapéuticos adecuados para formar los inmunoconjugados de la presente invención incluyen taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxiantracindiona, maitansina o un análogo o derivado de la misma, enediieno antitumoral que incluye neocarzinostatina, caliqueamicinas, esperamicinas, dinemicinas, lidamicina, kedarcidina o análogos o derivados de los mismos, antraciclinas, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol y puromicina, antimetabolitos (como metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, fludarabina, 5-fluorouracilo, decarbazina, hidroxiurea, asparaginasa, gemcitabina, cladribina), agentes alquilantes (tales como mecloretamina, tiotepa, clorambucilo, melfalán, carmustina (BSNU), lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, dacarbacina (DTIC), procarbazina, mitomicina C, cisplatino y otros derivados del platino, tal como carboplatino; así como duocarmicina A, duocarmicina SA, CC-1065 (también conocido como raquelmicina), o análogos o derivados de CC-1065), dolastatina, pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepinas (PDBs) o análogos de las mismas, antibióticos (como la dactinomicina (antes actinomicina)), bleomicina, daunorrubicina (antes daunomicina), doxorrubicina, idarrubicina, mitramicina, mitomicina, mitoxantrona, plicamicina, antramicina (AMC)), agentes antimitóticos (por ejemplo, inhibidores de la tubulina) como la monometil auristatina E, monometil auristatina F, u otros análogos o derivados de la dolastatina 10; inhibidores de la histona desacetilasa como los ácidos hidroxámicos tricostatina A, vorinostat (SAHA), belinostat, LAQ824 y panobinostat, así como las benzamidas, entinostat, CI994, mocetinostat y compuestos ácidos alifáticos como el fenilbutirato y el ácido valproico, inhibidores del proteasoma como Danoprevir, bortezomib, amatoxinas como la a-amantina, toxina diftérica y moléculas relacionadas (como la cadena A diftérica y sus fragmentos activos y las moléculas híbridas); toxina de ricina (como la ricina A o una toxina de cadena de ricina A deglicosilada), toxina del cólera, una toxina de tipo Shiga (SLT-I, SLT-II, SLT-IIV), toxina LT, toxina C3, toxina Shiga, toxina pertussis, toxina tetánica, inhibidor de la proteasa Bowman-Birk de la soja, exotoxina de Pseudomonas, alorina, saporina, modeccina, gelanina, cadena de abrina A, cadena de modecina A, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina y toxinas de enomicina. Otras moléculas conjugadas adecuadas son los péptidos antimicrobianos/líticos, como CLIP, Magainina 2, melitina, Cecropina y P18; ribonucleasa (RNasa), ADNasa I, enterotoxina-A estafilocócica, proteína antivírica pokeweed, toxina diftérica y endotoxina de Pseudomonas. Véanse, por ejemplo, Pastan et al., Cell 47, 641 (1986) y Goldenberg, Calif. A Cancer Journal for Clinicians 44, 43 (1994). Agentes terapéuticos que pueden administrarse junto con un anticuerpo de la presente invención como se describe en otra parte del presente documento, tal como, por ejemplo, citocinas o quimiocinas antineoplásicas, son también candidatos a restos terapéuticos útiles para conjugación con un anticuerpo de la presente invención.

En una realización de la divulgación, los conjugados de fármacos de la presente invención comprenden un anticuerpo como el divulgado en el presente documento conjugado con auristatinas o análogos y derivados de péptidos de auristatina (documentos US5635483; US5780588). Se ha demostrado que las auristatinas interfieren en la dinámica de los microtúbulos, hidrólisis de GTP y la división nuclear y celular (Woyke et al. (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12): 3580-3584) y tienen actividad antineoplásica (documento US5663149) y antifúngica (Pettit et al, (1998) Antimicrob. Agents and Chemother. 42:2961-2965. La fracción de fármaco de la auristatina puede estar unida al anticuerpo mediante un enlazador, a través del extremo N (amino) o C (extremo) dele resto peptídico del fármaco.

Los ejemplos de realizaciones de auristatina de la divulgación incluyen los restos de fármaco de auristatina monometilada unidos al extremo N, DE y DF, divulgados en Senter et al., Proceedings of the American Association for Cancer Research. Volumen 45, resumen número 623, presentados el 28 de marzo de 2004 y descritos en el documento US 2005/0238649).

Un ejemplo de realización de auristatina de la divulgación es MMAE (monometil auristatina E). Otro ejemplo de realización de auristatina es MMAF (monometil auristatina F).

En una realización, un anticuerpo de la presente divulgación comprende un ácido nucleico conjugado o una molécula asociada a un ácido nucleico. En una de dichas realizaciones de la divulgación, el ácido nucleico conjugado es una ribonucleasa citotóxica, un ácido nucleico de sentido contrario, una molécula de ARN inhibidora (por ejemplo, una molécula de ARNsi) o un ácido nucleico inmunoestimulador (por ejemplo, una molécula de ADN que contiene un motivo CpG inmunoestimulador). En otra realización de la divulgación, un anticuerpo de la presente invención se conjuga con un aptámero o una ribozima.

En una realización de la divulgación, se proporcionan anticuerpos que comprenden uno o más aminoácidos radiomarcados. Una variante radiomarcada puede utilizarse con fines tanto diagnósticos como terapéuticos (la conjugación con moléculas radiomarcadas es otra característica posible). Los ejemplos de etiquetas no limitantes para polipéptidos incluyen 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc y 1251, 1311 y 186Re. Los métodos para preparar aminoácidos radiomarcados y derivados peptídicos relacionados son conocidos en la técnica, (véanse por ejemplo Junghans et al., en Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2a Ed., Chafner y Longo, eds., Lippincott Raven (1996)) y los documentos US 4.681.581, US 4.735.210, US 5.101.827, US 5.102.990 (US RE35.500), US 5.648.471 y US 5.697.902. Por ejemplo, un radioisótopo se puede conjugar por el método de la cloramina-T.

En una realización de la divulgación, la variante de la presente divulgación se conjuga con un radioisótopo o con un quelato que contiene radioisótopos. Por ejemplo, la variante puede conjugarse con un enlazador quelante, por ejemplo, DOTA, DTPA o tiuxetan, que permite crear un complejo entre el anticuerpo y un radioisótopo. La variante también puede, o alternativamente, comprender o estar conjugada con uno o más aminoácidos radiomarcados u otra molécula radiomarcada. Una variante radiomarcada puede utilizarse con fines tanto diagnósticos como terapéuticos. En una realización, la variante de la presente invención se conjuga con un emisor alfa. Los ejemplos no limitativos de radioisotópicos incluyen 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 125I, 111In, 131I, 186Re, 213Bs, 225Ac y 227Th.

En una realización, la variante de la presente divulgación puede conjugarse con una citocina seleccionada del grupo que consiste en IL2, IL4, IL6, IL7, IL10, IL12, IL13, IL15, IL18, IL23, IL24, IL27, IL28a, IL28b, IL29, KGF, IFNa, IPNp, IFN-y, GMCSF, CD40L, ligando Flt3, factor citoblástico, ancestim y TNFa.

Las variantes de la presente divulgación también pueden estar químicamente modificadas por conjugación covalente con un polímero para, por ejemplo, aumentar su semivida en circulación. Los ejemplos de polímeros, y los métodos para unirlos a péptidos, se ilustran, por ejemplo, en los documentos US 4.766.106, US 4.179.337, US 4495285 y US 4609546. Los polímeros adicionales incluyen los polioles polioxietilados y polietilenglicol (PEG) (por ejemplo, un PEG con un peso molecular entre aproximadamente 1000 y aproximadamente 40.000), tal como entre aproximadamente 2000 y aproximadamente 20.000).

Puede emplearse cualquier método conocido en la técnica para conjugar la variante de la presente divulgación con la una o más moléculas conjugadas, tales como las anteriormente descritas, incluidos los métodos descritos en Hunter et al., Nature 144, 945 (1962), David et al., Biochemistry 13, 1014 (1974), Pain et al., J. Immunol. Meth. 40, 219 (1981) y Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30, 407 (1982). Dichas variantes pueden producirse conjugando químicamente el otro resto con el lado del extremo N o el lado del extremo C de la variante o fragmento de la misma (por ejemplo, una cadena H o L del anticuerpo) (véase, por ejemplo, Antibody Engineering Handbook, editado por Osamu Kanemitsu, publicado por Chijin Shokan (1994)). Dichos derivados de variantes conjugados también pueden generarse por conjugación en restos o azúcares internos, cuando sea apropiado.

Los agentes pueden acoplarse directa o indirectamente a una variante de la presente invención. Un ejemplo de acoplamiento indirecto de un segundo agente es el acoplamiento a través de un resto espaciador o enlazador a restos de cisteína o lisina en el anticuerpo biespecífico. En una realización de la divulgación, una variante se conjuga con una molécula de profármaco que puede activarse in vivo a un fármaco terapéutico mediante un espaciador o enlazador. En algunas realizaciones de la divulgación, el enlazador se puede escindir en condiciones intracelulares, de tal manera que la escisión del enlazador libera la unidad del fármaco del anticuerpo en el entorno intracelular. En algunas realizaciones de la divulgación, el enlazador es escindible por un agente escindible que está presente en el entorno intracelular (por ejemplo, dentro de un lisosoma o endosoma o caveola). Por ejemplo, los espaciadores o enlazadores pueden ser escindibles por enzimas asociadas a células tumorales u otras condiciones específicas del tumor, mediante lo cual se forma el fármaco activo. Ejemplos dichas tecnologías de profármacos y enlazadores se describen en los documentos WO02083180, WO2004043493, WO2007018431, WO2007089149, WO2009017394 y WO201062171 de Syntarga BV, et al. También se puede encontrar una tecnología adecuada de anticuerpo-fármaco y análogos de duocarmicina en la patente de Estados Unidos n.° 6.989.452 (Medarex), cuyo contenido se incorpora en el presente documento como referencia. De manera adicional o alternativa, el enlazador también puede ser, por ejemplo, un enlazador de peptidilo que se puede escindir con una enzima peptidasa o proteasa intracelular, incluidas aunque no de forma limitativa, una proteasa lisosómica o endosómica. En algunas realizaciones, el enlazador peptídico tiene una longitud de al menos dos aminoácidos o de al menos tres aminoácidos. Los agentes de escisión pueden incluir catepsinas B y D y plasmina, todas las cuales son conocidas por hidrolizar derivados de fármacos de tipo dipéptido, dando como resultado la liberación del fármaco activo dentro de las células diana (véase, por ejemplo Dubowchik y Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123). En una realización específica de la divulgación, el enlazador de peptidilo escindible por una proteasa intracelular es un enlazador Val-Cit (valina-citrulina) o un enlazador Phe-Lys (fenilalanina-lisina) (véase, por ejemplo, el documento US6214345, que describe la síntesis de doxorrubicina con el enlazador Val-Cit y diferentes ejemplos de enlazadores Phe-Lys). Los ejemplos de las estructuras de un enlazador Val-Cit y un enlazador Phe-Lys incluyen, aunque no de forma limitativa, el MC-vc-PAB descrito a continuación, MC-vc-GABA, MC-Phe-Lys-PAB o MC-Phe-Lys-GABA, en donde MC es la abreviatura de maleimido caproilo, vc es la abreviatura de Val-Cit, PAB es la abreviatura de p-aminobencilcarbamato y GABA es la abreviatura de ácido Y-aminobutírico. Una ventaja de utilizar la liberación proteolítica intracelular del agente terapéutico es que el agente se atenúa típicamente cuando se conjuga y las estabilidades séricas de los conjugados son típicamente altas.

En otra realización más de la divulgación, la unidad enlazadora no es escindible y el fármaco se libera por degradación del anticuerpo (véase el documento US 2005/0238649). De forma típica, dicho enlazador no es sustancialmente sensible al entorno extracelular. Tal como se usa en el presente documento, "no sustancialmente sensible al entorno extracelular" en el contexto de un enlazador significa que no más del 20 %, normalmente no más de un 15%, más típicamente no más de un 10 % y aún más típicamente no más de un 5%, no más de aproximadamente el 3 % o no más de aproximadamente el 1 % de los enlazadores, en una muestra del compuesto de conjugado anticuerpo-fármaco variante, se escinde cuando el compuesto de conjugado anticuerpo-fármaco variante se presenta en un entorno extracelular (por ejemplo, plasma). Que un enlazador no sea sustancialmente sensible al entorno extracelular puede determinarse, por ejemplo, incubando el compuesto de conjugado anticuerpofármaco variante con plasma durante un periodo de tiempo predeterminado (por ejemplo, 2, 4, 8, 16 o 24 horas) y cuantificando después la cantidad de fármaco libre presente en el plasma. Los ejemplos de realizaciones que comprenden MMAE o MMAF y varios componentes enlazadores tienen las siguientes estructuras (en donde Ab significa anticuerpo y p representa la carga de fármaco (o el número promedio de fármacos citostáticos o citotóxicos por molécula de anticuerpo), es de 1 a aproximadamente 8, por ejemplo p puede ser 4-6, tal como 3-5 o p puede ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8).

Los ejemplos donde que un enlazador escindible se combina con una auristatina incluyen MC-vc-PAB-MMAF (también designado como vcMMAF) y MC-vc-PAB-MMAF (también designado como vcMMAE), en donde MC es la abreviatura de maleimido caproilo, vc es la abreviatura del enlazador basado en Val-Cit (valina-citrulina) y PAB es la abreviatura de p-aminobencilcarbamato.

Otros ejemplos incluyen auristatinas combinadas con un enlazador no escindible, como mcMMAF (mc (MC es lo mismo que mc en este contexto) es una abreviatura de maleimido caproilo).

En una realización de la divulgación, el resto enlazador de fármaco es vcMMAE. El resto enlazador de fármaco vcMMAE y los métodos de conjugación se divulgan en los documentos WO2004010957, US7659241, US7829531, US7851437 y US 11/833.028 (Seattle Genetics, Inc.), (cuyo contenido se incorpora en el presente documento como referencia), y el resto enlazador de fármaco es vcMMAE se une a los anticuerpos en las cisteínas utilizando un método similar a los divulgados en dicho documento.

En una realización de la divulgación, el resto enlazador de fármaco es mcMMAF. El resto enlazador de fármaco mcMMAF y los métodos de conjugación se divulgan en el los documentos US7498298, US 11/833,954 y WO2005081711 (Seattle Genetics, Inc.), (cuyo contenido se incorpora en el presente documento como referencia), y el resto enlazador de fármaco es mcMMAF se une a las variantes en las cisteínas utilizando un método similar a los divulgados en dicho documento.

En una realización de la divulgación, la variante de la presente invención está unida a un enlazador quelante, por ejemplo tiuxetan, lo que permite conjugar el anticuerpo biespecífico con un radioisótopo.

En una realización de la divulgación, cada brazo (o brazo Fab) de la variante se acopla directa o indirectamente al mismo uno o más restos terapéuticos.

En una realización de la divulgación, solo un brazo de la variante está acoplado directa o indirectamente a uno o más restos terapéuticos.

En una realización de la divulgación, cada brazo de la variante se acopla directa o indirectamente a diferentes restos terapéuticos. Por ejemplo, en realizaciones donde la variante es un anticuerpo biespecífico y se prepara mediante el intercambio controlado del brazo Fab de dos anticuerpos monoespecíficos diferentes, por ejemplo un primer y segundo anticuerpo, como se describe en el presente documento, dichos anticuerpos biespecíficos pueden obtenerse utilizando anticuerpos monoespecíficos conjugados o asociados con diferentes restos terapéuticos.

Usos adicionales

En un aspecto adicional, la divulgación se refiere a una variante de la invención como se ha descrito anteriormente para su uso como medicamento, en particular para su uso como medicamento para el tratamiento de enfermedades o trastornos, en donde se desea la destrucción mediada por CDC de una célula diana (por ejemplo, una célula tumoral, bacteriana o fúngica) o de un organismo diana (por ejemplo, un virus) o de una célula infectada por una bacteria o un virus. Los ejemplos de dichas dolencias y trastornos incluyen, sin limitación, cáncer e infecciones bacterianas, víricas o fúngicas.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a las variantes, anticuerpos biespecíficos, composiciones y kits de piezas descritos en el presente documento, para el tratamiento de una enfermedad, tal como el cáncer.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un método para tratar un ser humano que comprende la administración de una variante, una composición o un kit de piezas descrito en el presente documento.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un método para el tratamiento del cáncer en un ser humano que comprende la administración de una variante, una composición o un kit de piezas

"Tratamiento" se refiere a la administración de una cantidad eficaz de un compuesto terapéuticamente activo de la presente invención con el fin de aliviar, mejorar, detener o erradicar (curar) síntomas o estados patológicos.

Una "cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a las dosificaciones y durante los periodos de tiempo necesarios, para lograr un resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo puede variar de acuerdo con factores tales como la patología, edad, el sexo y el peso del individuo y de la capacidad del anticuerpo para generar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz es también una en la que cualquier efecto tóxico o perjudicial del anticuerpo o porción de anticuerpo se ve sobrepasado por los efectos terapéuticamente beneficiosos.

Sin pretender imponer ninguna teoría, la cantidad eficaz de un compuesto terapéuticamente activo puede disminuir cuando se introduce en dicho compuesto terapéuticamente activo cualquier aspecto o realización de "mutante simple" de acuerdo con la presente invención.

Los antígenos adecuados para los anticuerpos contra el cáncer pueden ser los mismos que se describen en el presente documento. Los Ejemplos 15 a 18 describen aplicaciones específicas que proporcionan una activación del complemento o CDC mejorada y/o más específica en células tumorales. Por ejemplo, un anticuerpo antitumoral de acuerdo con el aspecto del "mutante simple", que comprende, por ejemplo, una mutación E345R, puede proporcionar una respuesta CDC o ADCC, ADCP potenciada en células tumorales. Asimismo, en una variante de este método, una mutación de acuerdo con el aspecto del "mutante simple", tal como, por ejemplo, E345R, E430, S440 o Q386, alternativamente E382 o H433R, o cualquiera de las mutaciones enumeradas en la Tabla 1, puede añadirse a cada anticuerpo, proporcionando así una respuesta CDC y/o ADCC mejorada dirigida específicamente a las células tumorales que expresan al menos dos antígenos.

Los anticuerpos adecuados para las infecciones bacterianas incluyen, sin limitación, las dirigidas a S. aureus, como el anticuerpo monoclonal quimérico de IgG1 pagibaximab (BSYX-A110; Biosynexus), dirigido al ácido lipoteico (LTA) que está integrado en la pared celular de los estafilococos, y que se describe en Baker (Nat Biotechnol. 24 de diciembre de 2006;(12):1491-3) y Weisman et al. (Int Immunopharmacol. mayo de 2009;9(5):639-44). El Ejemplo 14 describe una realización específica que utiliza variantes de anticuerpos de S. aureus que comprenden una mutación E345R. Sin embargo, otras mutaciones de la Tabla 1, incluidas, aunque no de forma limitativa E430G y S440W, alternativamente E382R y H433R, puede aplicarse de manera similar para mejorar la capacidad de mediación en CDC de un anticuerpo contra un antígeno bacteriano.

Los antígenos adecuados para las infecciones víricas o fúngicas pueden ser cualquiera de los descritos en el presente documento.

En una realización de la divulgación, el antígeno al que se une la variante es EphA2 no humano. En otra realización, la variante no se deriva del mAb EphA2 de 12G3H11 humano (descrito en Dall'Acqua et al, supra). En otra realización de la divulgación, el antígeno al que se une la variante no es IL-9. En otra realización, la variante no se deriva del anticuerpo Fa-hG1 o Fa-hG4 descrito en el documento WO2007005612, o cualquier variante del mismo. En una realización de la invención, el antígeno al que se une la variante no es gp120 del VIH-1. En otra realización de la invención, la variante no se deriva del anticuerpo b12 de IgGlK humana dirigido contra gp120.

En una realización particular de la divulgación, la variante deriva de un anticuerpo precursor biespecífico. El anticuerpo biespecífico puede ser de cualquier isotipo, tal como, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, y puede ser un anticuerpo de longitud completa o un fragmento del mismo que contiene Fc. Un ejemplo de método para preparar un anticuerpo biespecífico se describe en el documento WO 2008/119353 (Genmab).

Dosificaciones

Las dosis eficaces y las posologías del anticuerpo dependen de la enfermedad o dolencia a tratar y pueden ser determinados por los expertos en la materia. Un ejemplo de intervalo no limitante de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo de la presente invención es de aproximadamente 0,1 a 100 mg/kg, tal como aproximadamente de 0,1 a 50 mg/kg, por ejemplo aproximadamente de 0,1 a 20 mg/kg, tal como aproximadamente de 0,1 a 10 mg/kg, por ejemplo aproximadamente 0,5, aproximadamente tal como 0,3, aproximadamente 1, aproximadamente 3, aproximadamente 5 o aproximadamente 8 mg/kg.

Las variantes de anticuerpos de la presente divulgación también pueden administrarse junto con uno o más factores del complemento o componentes relacionados para mejorar la eficacia terapéutica de la variante y/o para compensar el consumo del complemento. Dichos factores del complemento y componentes relacionados incluyen, aunque no de forma limitativa, C1q, C4, C2, C3, C5, C6, C7, C8, C9, MBL y factor B. La administración combinada puede ser simultánea, separada o secuencial. En una realización particular, la invención proporciona un kit que comprende una composición farmacéutica que comprende una variante de la invención, y al menos un factor del complemento o componente relacionado en la misma o diferente composición farmacéutica, junto con instrucciones de uso.

Las variantes de anticuerpos de la presente divulgación también pueden administrarse en terapia combinada, es decir, combinados con otros agentes terapéuticos de interés para la enfermedad o dolencia que se va a tratar. En consecuencia, en una realización de la divulgación, el medicamento que contiene anticuerpos es para su combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales, tales como agentes citotóxicos, quimioterapéuticos o antiangiogénicos. Dicha administración combinada puede ser simultánea, separada o secuencial.

En una realización adicional de la divulgación, la presente invención proporciona un método durante tratar o prevenir una enfermedad, tales como cáncer, cuyo método comprende administrar a un sujeto que lo necesita. una cantidad terapéuticamente eficaz de un una variante o composición farmacéutica de la presente invención, junto con radioterapia y/o cirugía.

Método de preparación

La divulgación también proporciona ácidos nucleicos aislados y vectores que codifican una variante de acuerdo con cualquiera de los aspectos descritos anteriormente, así como vectores y sistemas de expresión que codifican las variantes. Las construcciones de ácido nucleico adecuadas, los vectores y sistemas de expresión para los anticuerpos y variantes de los mismos son conocidos en la materia y se describen en los Ejemplos. En las realizaciones donde la variante comprende no solo una cadena pesada (o fragmento que contiene Fc) sino también una cadena ligera, las secuencias de nucleótidos que codifican las porciones de cadena pesada y ligera pueden estar presentes en el mismo ácido nucleico o vector o en otros diferentes.

La divulgación también proporciona un método para producir, en una célula hospedadora, una variante de anticuerpo de acuerdo con cualquiera de los aspectos descritos anteriormente, en donde dicha variante comprende al menos la región Fc de una cadena pesada, comprendiendo dicho método las siguientes etapas:

a) proporcionar una construcción de nucleótidos que codifica dicha región Fc de dicha variante,

b) expresar dicha construcción de nucleótidos en una célula hospedadora, y

c) recuperar dicha variante de anticuerpo a partir de un cultivo celular de dicha célula hospedadora.

En algunas realizaciones de la divulgación, el anticuerpo es un anticuerpo de cadena pesada. En la mayoría de las realizaciones, sin embargo, el anticuerpo también contendrá una cadena ligera y, por lo tanto, dicha célula hospedadora expresa además una construcción que codifica la cadena ligera, bien en el mismo vector o en otro diferente.

Las células hospedadoras adecuadas para la expresión recombinante de anticuerpos son bien conocidas en la técnica, e incluyen células CHO, HEK-293, PER-C6, NS/0 y Sp2/0. En una realización de la divulgación, dicha célula hospedadora es una célula capaz de realizar la glicosilación de proteínas ligada a Asn, por ejemplo, una célula eucariota, tal como una célula de mamífero, por ejemplo una célula humana. En una realización adicional de la divulgación, dicha célula hospedadora es una célula no humana que se ha modificado genéticamente para producir glicoproteínas con glicosilación similar a la humana o humana. Ejemplos de este tipo de células son Pichia pastoris modificada genéticamente (Hamilton et al, Science 301 (2003) 1244-1246; Potgieter et al., J. Biotechnology 139 (2009) 318-325) y Lemna minor modificada genéticamente (Cox et al., Nature Biotechnology 12 (2006) 1591-1597). En una realización de la divulgación, dicha célula hospedadora es una célula hospedadora que no es capaz de eliminar eficazmente los restos de lisina K447 en el extremo C de las cadenas pesadas de los anticuerpos. Por ejemplo, En la Tabla 2 de Liu et al. (2008) J Pharm Sci 97: 2426 (cuyo contenido se incorpora en el presente documento como referencia) se enumeran varios de estos sistemas de producción de anticuerpos, por ejemplo Sp2/0, NS/0 o glándula mamaria transgénica (cabra), en donde solo se obtiene una eliminación parcial de las lisinas del extremo C. En una realización de la divulgación, la célula hospedadora es una célula hospedadora con una maquinaria de glicosilación alterada. Se han descrito en la técnica dichas células que se pueden usar como células hospedadoras donde expresan variantes de la invención para producir de este modo un anticuerpo con glucosilación alterada. Véanse, por ejemplo, Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-1, así como los documentos EP1176195; WO03/035835; y WO99/54342. Los métodos adicionales para generar glicoformas modificadas por ingeniería genética son conocidas en la técnica e incluyen, aunque no de forma limitativa, las descritas en Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al, 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473), documentos US6602684, WO00/61739A1; WO01/292246A1; WO02/311140A1; WO 02/30954A1; la tecnología Potelligent™ (Biowa, Inc. Princeton, N.J.); tecnología de ingeniería de glicosilación GLYCOMAB™ (GLYCART biotechnology AG, Zúrich, Suiza); el documento US 20030115614; Okazaki et al., 2004, JMB, 336: 1239-49.

La divulgación también se refiere a un anticuerpo obtenido o que se puede obtener por el método de la invención descrito anteriormente.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a una célula hospedadora que puede producir una variante de anticuerpo de la invención. En una realización de la divulgación, la célula hospedadora se ha transformado o transfectado con una construcción nucleotídica de la invención.

La presente invención se ilustra adicionalmente por medio de los siguientes ejemplos, que no deberán considerarse como limitantes.

Ejemplos

Ejemplo 1

Diseño y generación de mutantes 7D8

Se utilizó el anticuerpo monoclonal humano HuMab-7D8 (descrito en el documento WO 2004/035607) como anticuerpo modelo. Pertenece a un grupo de anticuerpos humanos contra CD20 de IgG1, incluyendo ofatumumab (HuMax-CD20, 2F2). Estos anticuerpos se dirigen a un epítopo único de la membrana proximal de la molécula CD20 y muestran una fuerte CDC.

Para estudiar la relevancia funcional de las interacciones oligoméricas Fc-Fc en la activación del complemento y la CDC, los aminoácidos del parche hidrófobo en la interfase Fc:Fc se mutaron para interrumpir potencialmente la interacción lateral Fc-Fc y la eficacia CDC del 7D8. En un primer conjunto de mutantes (Tabla 3), se introdujeron mutaciones para cambiar la carga en posiciones que se eligieron basándose en la estructura cristalina de 1HZH y que se describieron como expuestas en parches hidrófobos del dominio CH2-CH3 (Burton Mol Immunol marzo de 1985;22(3):161-206)).

De la primera serie de mutaciones, se descubrió que I253D y H433A inducían el efecto más fuerte sobre la pérdida de CDC por 7D8 (por ejemplo, Ejemplo 5). La estructura cristalina de 1HZH muestra que 1253 y H433 se unen a dos bolsillos diferentes en las posiciones Fc opuestas del anticuerpo asociado. Según estos datos, se sintetizó un segundo conjunto de mutaciones, alrededor de las posiciones 1253 y H433 de la estructura cristalina para estudiar más a fondo la importancia de los restos en la interfase Fc:Fc lateral sobre CDC. El segundo conjunto de mutaciones alrededor de las posiciones 1253 y H433 que potencialmente desestabilizan la interfase Fc:Fc y, en consecuencia, la CDC, se enumeran en la Tabla 4.

Para excluir la posibilidad de que la alteración de los sitios de unión directa para C1q fuera la causa de los efectos observados en la CDC, se generó un doble mutante basado en dos mutantes simples que mostraban pérdida de CDC, para estudiar su capacidad para de restaurar la pérdida de CDC debida a los mutantes simples. Este principio se representa de forma esquemática en la Figura 1D. El doble mutante aparece en la Tabla 5 y se muestra una representación estructural en la Figura 4 y la Figura 5.

Los mutantes se prepararon utilizando el kit de mutagénesis dirigida al sitio Quikchange (Stratagene, EE.UU.). En resumen, se utilizaron un cebador directo y otro inverso que codificaban la mutación deseada para replicar un molde de ADN plasmídico de longitud completa que codificaba la cadena pesada 7D8 con el alotipo IgG1m(f). La mezcla de ADN resultante se digirió usando Dpnl para eliminar el ADN plasmídico original, y se utilizó para transformar E. coli. El ADN plasmídico mutante aislado de las colonias resultantes se comprobó mediante secuenciación del ADN (Agowa, Alemania). Las mezclas de ADN plasmídico que codifican las cadenas tanto pesada como ligera de los anticuerpos se transfectaron transitoriamente a células Freestyle HEK293F (Invitrogen, EE.UU.) utilizando 293fectina (Invitrogen, EE.UU.) esencialmente como describe el fabricante.

Tabla 3: C n n 1 m i n inr i n l mini H2- H3 de 7D8.

Tabla 4: Con n 2 m i n inr i n l mini H2-CH3 de 7D8.

continuación

Tabla 5: Mutaciones dobles introducidas en el dominio CH2-CH3 de 7D8 para combinar dos mutaciones simples que muestran cada una érdida de CDC.

Ejemplo 2

Unión de CD20 a células por mutantes 7D8

La unión de las muestras de anticuerpos purificados a las células positivas para CD20 se analizó mediante análisis FACS. El primer conjunto de mutaciones (Tabla 3) se estudió en células Daudi y el segundo conjunto de mutaciones (Tabla 4) se estudió en células Raji. Se incubaron105 células en 50 pl en placas de fondo redondo de 96 pocillos de poliestireno (Greiner bio-one 650 l0 l) con diluciones seriadas de preparaciones de anticuerpo (intervalo de 0,04 a 10 pg/ml en diluciones triples para el primer conjunto en Daudi y intervalo de 0,003 a 10 pg/ml en diluciones triples para el segundo conjunto en Raji) en RPMI1640/0,1 % de BSA a 4 °C durante 30 min. Después de lavar dos veces en RPMI1640/0,1 % de BSA, las células se incubaron en 100 pl con el anticuerpo secundario a 4 °C durante 30 minutos. Como anticuerpo secundario, un anticuerpo de conejo conjugado con isotiocianato de fluoresceína dirigido contra IgG humana (FITC) (F0056, Dako, Glostrup, Dinamarca; 1/100) se usó en todos los experimentos con células Daudi y en los experimentos con anticuerpos 7D8 en células Raji. Para los experimentos con anticuerpos 7D8 purificados en células Raji, un F(ab')2 de cabra conjugado con R-ficoeritrina (R-PE) dirigido contra la cadena ligera kappa humana (2062-09, SouthernBiotech; 1/500) se utilizó como anticuerpo secundario. A continuación, las células se lavaron dos veces en PBS/0,1 % de BSA/0,02 % de azida, se resuspendieron en 100 pl de PBS/0,1 % de BSA/0,02 % de azida y se analizaron en un equipo FACS Cantoll (BD Biosciences). Las curvas de unión se analizaron mediante regresión no lineal (dosis-respuesta sigmoidea con pendiente variable) utilizando el programa informático GraphPad Prism V5.01 (GraphPad Software, San Diego, CA, EE.UU.).

La unión del anticuerpo 7D8 a las células Daudi no se vio afectada por la introducción de las mutaciones puntuales en el dominio CH2-CH3 y fue idéntica para todos los mutantes estudiados y el 7D8 natural. Asimismo, la unión del anticuerpo 7D8 a las células Raji no se vio significativamente afectada por la introducción de las mutaciones puntuales en el dominio CH2-CH3 en comparación con el 7D8 natural, excepto para E345R. Se detectó una disminución de la unión de IgG1-7D8-E345R en las células Raji positivas para CD20 a concentraciones de ensayo superiores a 0,3 pg/ml. También para H433D y H433R, se detectó una disminución de la unión a la mayor concentración de anticuerpos estudiada (10 pg/ml). La menor unión debido a IgG1-7D8-E345R, H433D y H433R podría explicarse por la protección del epítopo del anticuerpo secundario, ya que el etiquetado directo de E345R y H433R dio como resultado una unión similar o incluso mayor a las células Daudi. La mayor avidez puede explicarse por el aumento de la unión Fc-Fc lateral de E345R y H433R en comparación con la IgG1-7D8 natural.

La combinación de las mutaciones K439E y S440K no afectó a la unión del anticuerpo 7D8 a las células Raji y fue idéntica a la de los mutantes simples y al 7D8 natural.

Ejemplo 3

ELISA de unión a C1q por mutantes 7D8

La unión de C1q mediante los mutantes 7D8 se estudió en un ELISA, en el que los anticuerpos purificados se aplicaron como revestimiento a la superficie de plástico, provocando la multimerización aleatoria de los anticuerpos. Como fuente de C1q se utilizó suero humano combinado.

Placas ELISA Microlon de 96 pocillos (Greiner, Alemania) se recubrieron durante la noche a 4 °C con diluciones seriadas de anticuerpos en PBS (intervalo 0,58-10,0 |jg/ml en diluciones de 1,5 veces). Las placas se lavaron y se bloquearon con 200 jl/pocillo de PBS 0,5x complementado con 0,025% de Tween 20 y 0,1 % de gelatina. Con lavados entre incubaciones, las placas se incubaron secuencialmente con suero humano combinado al 3 % (Sanquin, n.° producto M0008) durante 1 hora a 37 °C, con 100 jl/pocillo de anticuerpo de conejo contra C1q humano (DAKO, n.° de producto A0136, 1/4.000) durante 1 h a TA, y con 100 jl/pocillo de anticuerpo de conejo contra IgG-HRP de porcino (DAKO, P0399, 1:10.000) como anticuerpo detector durante 1 h a TA. El revelado se realizó durante aprox. 30 minutos con 1 mg/ml de ácido 2,2'-azino-bis (3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico) (ABTS; Roche, Mannheim, Alemania). La reacción se detuvo mediante la adición de 100 j l de ácido oxálico al 2%. La absorbencia se midió a 405 nm en un lector de microplacas (Biotek, Winooski, VT). Los datos transformados logarítmicamente se analizaron ajustando curvas de dosis-respuesta sigmoideas con pendiente variable mediante el programa informático GraphPad Prism. Los valores datos de CE50 de los mutantes se normalizaron por placa frente a la IgG1-7D8 natural y se multiplicaron por el promedio de todos los datos de la IgG1-7D8 natural.

Como se muestra en la Figura 6 y en la Tabla 6, las mutaciones puntuales estudiadas tuvieron un efecto mínimo sobre la unión de C1q medida por ELISA. Para el mutante IgG1-7D8-I253D, se midió una unión de C1q algo menos eficaz en el ELISA (valor CE50 más alto). Se estudió la eficacia del recubrimiento para todos los anticuerpos y se descubrió que era similar para todos los anticuerpos.

____________________________ Tabla 6: CE50 para la unión de C1q en ELISA____________________________ Anticuerpo CE ⁵⁰ promedio (pg/ml) ¹ DE ¹ Significancia ²IgG1-7D8-WT 2,048 0 Na

IgG1-7D8-I253D 3,838 1,341 *

IgG1-7D8-I253Y 2,209 0,385 Ns

IgG1-7D8-I253A 2,556 0,187 Ns

IgG1-7D8-Q311A 2,182 0,062 ns

IgG1-7D8-H433A 3,327 1,719 ns

IgG1-7D8-N434A 2,120 0,492 ns

IgG1-7D8-H435A 2,267 0,317 ns

IgG1-7D8-H435R 1,242 0,492 ns

1 La media y la DE se calcularon a partir de al menos 3 experimentos.

2 Estadística: ANOVA monolareral con datos transformados logarítmicamente utilizando la prueba de comparación múltiple de Dunnett (GraphPad Prism 5.01). La significancia se calculó en comparación con la IgG1-7D8 natural: (na) no aplicable (ns) no significativo (*) p=0,01 a 0,05 (**) p=0,001 a 0,01 (***) p<0,001.

Ejemplo 4

Unión de C1q en células por mutantes 7D8

El recubrimiento de anticuerpos sobre una superficie de plástico produce un sistema estático artificial de unión de anticuerpos y presentación de colas de Fc. Por lo tanto, la unión del complemento también se estudió en un ensayo con células, en el que se midió la unión de C1q a linfocitos B positivos para CD20 opsonizados con anticuerpos mediante análisis FACS. En los experimentos con los mutantes del conjunto 1, las células Daudi o Raji se suspendieron sobre hielo en 90 j l de medio RPMI 1640 con un 10% de F^bS (2 x106 células/ml). 10 j l de una concentración seriada de C1q (Complement Technologies, Tyler, TX) (el intervalo de concentración final varía entre 0-60 jg/ml y 0-140 jg/ml dependiendo de la unión máxima). A continuación, se añadieron 10 j l de anticuerpo purificado (concentración final 10 jg/ml, es decir, condiciones de saturación) y las mezclas de reacción se transfirieron inmediatamente a un baño de agua a 37 °C y se incubaron durante una hora. En los experimentos con los mutantes del conjunto 2, el mAb de prueba se añadió a las células Daudi a granel, a continuación se añadieron concentraciones variables de C1q a las alícuotas y las mezclas se incubaron como se ha indicado anteriormente. Las células se lavaron tres veces con PBS/1 % de BSA y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente con anticuerpos contra C1q marcados con FITC de conejo (DakoCytomation, 10 ug/ml). Las células se lavaron con PBS/1 %BSA y se resuspendieron en PBS o se fijaron en formaldehído al 2 % en PBS. La citometría de flujo se realizó en un citómetro de flujo FACSCalibur (BD Biosciences) y las intensidades medias de fluorescencia se convirtieron a moléculas de fluorescencia soluble equivalente (MESF) utilizando perlas calibradas (Spherotech).

Las constantes de disociación (valores Kd) para la unión de C1q a las células positivas para CD20 opsonizadas con los anticuerpos 7D8 indicados se calcularon utilizando el programa informático SigmaPlot® (Systat Software Inc., Washington). Se calcularon los valores medios de K^da partir de experimentos de unión repetidos (4 veces en células Daudi, 3 veces en células Raji) y se compararon con el valor de Kd para la unión de C1q en células opsonizadas con el 7D8 natural (Tabla 7 y Tabla 8).

Los mutantes del conjunto 1 se probaron en células Daudi y Raji y dieron los mismos resultados. A diferencia del resultados de ELISA de C1q, la mayoría de los mutantes estudiados mostraron una menor avidez de unión de C1q (aumento de la Kd) tanto en células Daudi (Tabla 7A) como en células Raji (Tabla 8) opsonizadas con anticuerpos. En comparación con el 7D8 natural, IgG1-7D8-Q311A y H435A mostraron poca o ninguna disminución, I253A, I253Y y N434A una disminución más pronunciada, e I253D y H433A una disminución muy drástica de la avidez de unión de C1q en células Daudi o Raji opsonizadas. IgG1-7D8-H435R mostró una avidez ligeramente mayor (menor Kd) para la unión a C1q que el 7D8 natural en ambos tipos de células, que, sin embargo, no fue significativa.

Los mutantes del conjunto 2 se estudiaron en células Daudi. En comparación con el 7D8 natural, IgG1-7D8-E345R, E382R y H433R mostraron una mayor avidez de unión a las células Daudi opsonizadas, que se refleja en los valores más bajos de K^d (Tabla 7B). El resto de mutantes del conjunto 2 mostraron una menor avidez de unión en comparación con el 7D8 natural, con G385D, Y436D, Q438D, K439E y S440K mostrando valores de Kd drásticamente aumentados (Tabla 7B) y mostrando H433D e Y436C una unión tan drásticamente reducida que no se pudo medir un valor de K^dfiable.

El doble mutante IgG1-7D8-K439E/S440K mostró un restablecimiento de la unión de C1q en las células Daudi opsonizadas con anticuerpos, mientras que ambos mutantes simples mostraron una disminución de la unión de C1q en comparación con el 7D8 natural. La avidez de unión del doble mutante K439E/S440K fue incluso ligeramente mayor en comparación con el 7D8 natural (Tabla 7C). Las mezclas de mutantes simples IgG1-7D8-K439E e IgG1-7D8-K440E pudieron restaurar completamente la unión de C1q que fue comparable a la unión de C1q del 7D8 natural (Tabla 7C).

La discrepancia entre la unión de C1q sin alterar en el ELISA (Ejemplo 3) y la unión de C1q afectada en el ensayo con células por los mutantes IgG1-7D8, muestra que las posiciones CH3 estudiadas que participan en la interacción Fc:Fc entre las moléculas de anticuerpos, no alteran directamente la unión de C1q, pero son determinantes importantes que afectan al posicionamiento dinámico de las colas Fc de los anticuerpos cuando se unen a las células, y por tanto también a la fuerza de la unión de C1q.

Tabla 7A: Valores de K^dpara la unión de C1q a células Daudi opsonizadas con anticuerpos (mutantes del conjunto

Tabla 7B: Valores de K^dpara la unión de C1q a células Daudi opsonizadas con anticuerpos (mutantes del conjunto

2

continuación

Tabla 7C: Valores de K ara la unión de C1 a células Daudi osonizadas con anticuer os doble mutante

T l : Vl r K r l nin 1 ll R i niz n ni r m n l n n 1)

Ejemplo 5

Eficacia de C1q por los mutantes 7D8 en un ensayo CDC en células Raji positivas para CD20

La eficacia de C1q utilizando células opsonizadas con mutantes de IgG1-7D8 se estudió en un ensayo CDC para investigar el impacto de los cambios observados en la avidez de unión de C1q sobre la actividad CDC. Por lo tanto, se realizó un ensayo CDC utilizando suero humano normal empobrecido en C1q que se complementó con una serie de concentraciones definidas de C1q. 0,1 x 106 células Raji se preincubaron en placas de 96 pocillos de fondo redondo (Nunc, Rochester, NY) con 10 pg/ml de anticuerpo purificado y una serie de concentraciones de C1q humano (0,005, 0,025, 0,1, 0,3, 1,0, 5,0, 30,0 pg/ml) a TA durante 15 minutos en un volumen total de 100 pl de medio RPMI1640, suplementado con 0,1 % de BSA. A continuación, se añadieron 25 pl de suero empobrecido en C1q (Quidel, San Diego, CA) y se incubaron a 37 °C en un baño de agua durante 30 minutos o en una incubadora durante 45 minutos. Después de la incubación, la reacción se detuvo colocando las muestras sobre hielo. La lisis celular se determinó por FACS utilizando yoduro de propidio (PI, Sigma Aldrich, Zwijndrecht, Países Bajos) en un ensayo de exclusión de células viables. El % lisis se determinó como se indica a continuación: % de lisis = (número de células pos Pl/número total de células) x 100 %.

La lisis por el 7D8 natural en presencia de 30 pg/ml de C1q menos la lisis cuando no se añadió C1q, se ajustó al 100 %. Los valores CH50 (la concentración de C1q que produce un 50 % de lisis) se calcularon a partir del ajuste de las curvas de dosis-respuesta sigmoideas en datos transformados logarítmicamente utilizando el programa informático GraphPad Prism. Los valores de CH50 de los mutantes se normalizaron con respecto al 7D8 natural (Tabla 9).

Los datos de la Tabla 9 muestran que, de acuerdo con las mediciones de la avidez de unión de C1q, IgG1-7D8-Q311A, E382R y H435A no mostraron una disminución de la eficacia de C1q; I253A, I253Y, G385D, N434A e Y436C una disminución significativa de la eficacia de C1q; y I253D, H310K, K322A, H433A, H433D, Y436D, Q438D, K439E y S440K perdieron casi por completo la capacidad de inducir CDC a todas las concentraciones de C1q estudiadas. IgG1-7D8-H435R y H433R utilizaron C1q de forma algo más eficaz, lo que dio como resultado una CDC más eficaz que la de 7D8 natural. IgG1-7D8-E345R mostró un aumento drástico de la eficacia de C1q, que dio como resultado una lisis CDC significativamente mayor en comparación con el 7D8 natural (Tabla 9).

La Figura 7 muestra que la combinación de la mutación K439E y S440K, que tienen como resultado en ambos casos la pérdida de CDC como mutante simple, restauró la CDC en el ensayo de eficacia de C1q cuando se combinaron ambas mutaciones en una sola molécula (mutante doble K439E/S440K) o cuando se combinaron ambos mutantes simples (mezcla K439E S440K).

T l : H r l fi i 1 n n n D n l l R i

continuación

Ejemplo 6

CDC por los mutantes 7D8 en un ensayo de CDC en células positivas para CD20

0,1 x 106 células se preincubaron en placas de 96 pocillos de fondo redondo (Nunc, Rochester, NY) con concentraciones seriadas de anticuerpos (0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1,0, 3,0, 10,0, 30,0 pg/ml) en un volumen total de 80 pl durante 15 minutos en un agitador a TA. A continuación, se añadieron 20 pl de suero humano normal como fuente de C1q (concentración final 20 %) y se incubaron en una incubadora a 37 °C durante 45 min. La reacción se detuvo añadiendo 30 pl de medio RPMI frío, suplementado con 0,1 % de BSA. La lisis celular se determinó por FACS utilizando yoduro de propidio.

Para los ensayos CDC en células Daudi, los valores CE50 (la concentración de anticuerpo que produce un 50 % de lisis) se calcularon a partir del ajuste de las curvas de dosis-respuesta sigmoideas en datos transformados logarítmicamente utilizando el programa informático GraphPad Prism. Los valores de CE50 de los mutantes se normalizaron con respecto al 7D8 natural (Tabla 10 y Tabla 11).

La Table 10 muestra que, en células Daudi, IgG1-7D8-I253A, Q311A, E382R, H433R y H435A no mostraron diferencias en la CDC en comparación con el 7D8 natural; se descubrió una CDC significativamente peor (mayor CE50) que la del 7D8 natural para IgG1-7D8-I253D, I253Y, H310K, G385D, H433A, H433D, N434A, Y436C, Y436D, Q438d , K439E, S440K e I253d/ H433A, que solo indujo la CDC a las concentraciones de anticuerpos más elevadas; El mutante IgG1-7D8-K322A deficiente en la unión de C1q, que se incluyó como control, perdió casi por completo la capacidad de inducir la CDC y no alcanzó la CE50 a las concentraciones estudiadas; IgG1-7D8-H435R mostró una CDC más eficaz que el 7D8 natural en células Daudi. Cabe destacar que, de acuerdo con el ensayo CDC de eficacia de C1q, E345R mostró una CDC drásticamente mejor que el 7D8 natural con un valor CE5010 veces menor en células Daudi (Tabla 10). La Figura 8 muestra que la combinación de la mutación K439E y S440K, que tienen como resultado en ambos casos la pérdida de CDC como mutante simple, restauró la CDC cuando se combinaron ambas mutaciones en una sola molécula (mutante doble K439E/S440K) o cuando se combinaron ambos mutantes simples (mezcla K439E S440K).

La Tabla 11 muestra que se descubrieron datos similares para los mutantes IgG1-7D8 en células Raji.

T l 1 : E l l rir l n D n l l D i

continuación

T l 11: E l l rir l n D n l l R i

continuación

Ejemplo 7

Clasificación de los mutantes 7D8 según su capacidad de inducir CDC

Para los mutantes de 7D8 estudiados, se encontró una correlación entre la unión de C1q en células Daudi (descrita en el Ejemplo 4) y los ensayos de eficacia de C1q en células Raji (descritos en el Ejemplo 5), y entre la unión de C1q en células Daudi y los ensayos de CDC en células Daudi y Raji (descritos en el Ejemplo 6) (datos de correlación Tabla 13). Por lo tanto, los valores Kd de los ensayos de unión a C1q en células Daudi se utilizaron para clasificar todos los mutantes de 7D8 estudiados según su capacidad de inducir la CDC, como se muestra en la Tabla 12. Tabla 12: Clasificación de todos los mutantes de 7D8 estudiados según los valores Kd descendentes para la unión de C1 en células Daudi ue sirve como medida derivada de su ca acidad de inducir CDC.

Tabla 13: correlación entre la unión de C1q en células Daudi (Ejemplo 4) y los ensayos de eficacia de C1q en células Raji (Ejemplo 5), y entre la unión de C1q en células Daudi y los ensayos de ^cD^cen células Daudi y Raji E m l . L r n f rm r n l rími m n n n liz r l rr l i n.

Ejemplo 8

Diseño y generación de mutantes del anticuerpo 005 de CD38

El anticuerpo monoclonal humano HuMab 005 es un anticuerpo de IgG1,K totalmente humano descrito en el documento WO/2006/099875. Aquí, se utilizó como anticuerpo modelo para la validación de las mutaciones Fc identificadas para mejorar la actividad CDC. Las mutaciones estudiadas se enumeran en la Tabla 14.

Se prepararon construcciones de ADN para los diferentes mutantes y se transfectaron transitoriamente como se describe en el Ejemplo 1, utilizando la cadena pesada de HuMab 005 con alotipo IgG1m(f) como molde para las reacciones de mutagénesis.

Tabla 14: n n m i n inr r n n l mini H2- H H M x-CD38).

Ejemplo 9

Unión de CD38 en células por mutantes HuMab-005

La unión de las muestras de anticuerpos sin purificar a las células Daudi y Raji positivas para CD38 se analizó por análisis FACS. Se incubaron 105 células en 100 pl en placas de 96 pocillos de fondo redondo de poliestireno con diluciones seriadas de preparaciones de anticuerpos (0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1,0, 3,0, 10,0, 30,0 pg/ml) en RPMI1640/0,1 % de BSA a 4 °C durante 30 minutos. Después de lavar dos veces en RPMI1640/0,1 % de BSA, las células se incubaron en 50 pl con F(ab')2 de conejo conjugado con FITC dirigido contra IgG humana (n.° de catálogo F0056; DAKO; 1:150) a 4 °C durante 30 minutos. A continuación, las células se lavaron dos veces en PBS/0,1 % de BSA/0,02 % de azida, se resuspendieron en 100 pl de PBS/0,1 % de BSA/0,02 % de azida y se analizaron en un equipo FACS Cantoll (BD Biosciences). Las curvas de unión se analizaron con el programa informático GraphPad Prism V5.01. Como control negativo, se utilizó el sobrenadante de las células transfectadas de forma simulada. La unión del HuMab 005 a las células Daudi no se vio muy afectada por la introducción de mutaciones puntuales en el dominio CH2-CH3. Todos los anticuerpos estudiados se unieron a las células Daudi de forma dependiente de la dosis. La unión fue similar a la del HuMab-005 natural para todos los mutantes estudiados, con la excepción de 005-E345R, que mostró una ligera disminución de la unión. Sin embargo, sin pretender imponer ninguna teoría, la menor unión podría ser el resultado de una menor unión por parte del anticuerpo secundario, análogamente al IgG1-7D8-E345 en el Ejemplo 2. La avidez de unión real por 005-E345R podría ser similar o incluso mayor en comparación con 005-WT, sin embargo, los inventores no pudieron confirmarlo debido a la falta de anticuerpos marcados directamente.

La unión de HuMab-005 a las células Raji tampoco se vio muy afectada por la introducción de mutaciones puntuales en el dominio CH2-CH3. Todos los anticuerpos estudiados se unieron a las células Raji de forma dependiente de la dosis. La unión máxima fue similar a la de 005 natural para los mutantes 005-I253D y H433A y menor para 005-E435R, K439E, S440K y la combinación de 005-K439E 005-S440K. Sin embargo, sin pretender imponer ninguna teoría, la menor unión podría ser el resultado de una menor unión por parte del anticuerpo secundario, análogamente a IgG1-7D8-E345R en el Ejemplo 2 (protección del epítopo).

Ejemplo 10

Ensayo CDC en células positivas para CD38 por mutantes del anticuerpo 005 de CD38

Se preincubaron 0,1 x106 células Daudi o Raji en placas de 96 pocillos de fondo redondo con una serie de concentraciones de anticuerpos no purificados (0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1,0, 3,0, 10,0, 30,0 pg/ml) en un volumen total de 100 pl durante 15 minutos en un agitador a TA. A continuación, se añadieron 25 pl de suero humano normal como fuente de C1q (concentración final 20 %) y se incubaron en una incubadora a 37 °C durante 45 min. La reacción se detuvo poniendo las placas sobre hielo. Se añadieron 10 pl de yoduro de propidio y se determinó la lisis celular mediante FACS.

La capacidad de mejora de CDC de la mutación E435R, que había mostrado potenciar la actividad CDC de los anticuerpos 7D8 y 005 en células Daudi y Raji, se analizó además en células Wien133 con diferentes concentraciones de suero humano normal (NHS). Se preincubaron 0,1 x106 células Wien133 durante 15 minutos en un agitador a TA en placas de 96 pocillos de fondo redondo con una serie de concentraciones de anticuerpos no purificados (0,001, 0,003, 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1,0, 3,0, 10,0, 30,0 pg/ml) en un volumen total de 50 pl. A continuación, se añadió NHS como fuente de C1q para alcanzar una concentración final del 20 % o del 50 % de NHS en un volumen total de 100 pl. La mezcla de reacción se incubó en una incubadora a 37 °C durante 45 minutos. La reacción se detuvo poniendo las placas sobre hielo. Se añadieron 10 pl de yoduro de propidio y se determinó la lisis celular mediante FACS.

Se identificaron las mutaciones en la región CH2-CH3 que daban como resultado bien la pérdida o bien el aumento de la actividad CDC para el anticuerpo 7D8 CD20, se descubrió que tenían el mismo efecto sobre el anticuerpo 005 que reconoce a CD38. La Figura 9 muestra que 005-I253D, H443A, K439E y S440K mostraron una pérdida completa de la actividad CDC tanto en células Daudi (Figura 9A) como en las Raji (Figura 9B), mientras que el mutante 005-E345R mostró una actividad CDC fuertemente mejorada en ambas líneas celulares. Comparable a los datos de 7D8, una combinación de 005-K439E 005-S440K, que tienen como resultado en ambos casos la pérdida de CDC como mutante simple, dio como resultado el restablecimiento de la CDC. Sorprendentemente, 005-E435R incluso indujo fuertemente la CDC en células Wien133, en las que el 005 natural no puede inducir la destrucción por CDC (Figura 9C). La destrucción por CDC debida a 005-E345R en células Wien133 se observó en concentraciones de suero tanto del 20 % como del 50 % (Figura 9C). También en células Raji, tanto 7D8-E345R como 005-E345R mostraron una CDC potenciada in vitro en suero al 50 %, con una eficacia similar a la del suero al 20 % (Figura 9D).

La mutación E345R en la región CH2-CH3 dio como resultado una mayor actividad CDC tanto en el anticuerpo 7D8 CD20 como en el anticuerpo 005 CD38, la mutación E345R se considera una modificación general del anticuerpo que se puede aplicar para inducir o potenciar la CDC.

Ejemplo 11

Los anticuerpos de IgG1 que contienen la mutación E345R potenciadora de CDC son menos sensibles a la inhibición de CDC por el péptido de unión a Fc DCAWHLGELVWCT que los anticuerpos naturales Cuando se mutaron posiciones de aminoácidos en el parche hidrófobo de la interfase Fc:Fc de la IgG, Se comprobó que la eficacia de los CDC estaba alterada o aumentada. La implicación de las interacciones en la interfaz Fc-Fc y, por tanto, posiblemente la formación de una estructura oligomérica (por ejemplo, un anillo hexamérico) como se observa en la estructura cristalina de la b12, sobre la eficacia de la CDC se estudió adicionalmente. Por lo tanto, se utilizó un péptido de 13 restos (DCAWHLGELVWCT (SEQ ID NO:7)) que se dirige a un sitio de unión de consenso en la región del parche hidrófobo de la superficie de la Fc de IgG natural (Delano et al., Science 18 de febrero de 2000;287(5456):1279-83). De hecho, la identificación del sitio de unión de consenso en la superficie de la Fc de IgG como una región adaptativa que está preparada para la interacción con una variedad de diversas moléculas (Delano et al., Science 18 de febrero de 2000;287(5456):1279-83), es consistente con la identificación de los aminoácidos fundamentales del parche hidrófobo que participan en la interacción Fc-Fc de la estructura cristalina de b12 de IgG1 (Saphire et al., Science, 10 de agosto de 2001;293(5532): 1155-9). Las interacciones que están presentes en todas las interfaces de unión están mediadas por un conjunto compartido de seis aminoácidos (Met-252, Ile-253, Ser-254, Asn-434, His-435 y Tyr-436), así como contactos compartidos en la cadena principal (Delano et al, Science 18 de febrero de 2000;287(5456):1279-83). En consecuencia, se esperaba que el péptido de unión a Fc alterara la interacción Fc-Fc y, en consecuencia, la eficacia de la CDC.

Se preincubaron 0,1 x106 células Daudi en 75 pl con 1,0 pg/ml de anticuerpo no purificado en placas de 96 pocillos de fondo redondo durante 10 minutos a temperatura ambiente en un agitador. Se añadieron 25 pl de una serie de concentraciones (intervalo 0,06-60 |jg/ml de concentración final) del péptido de unión a Fc DCAWHLGELVWCT a las células opsonizadas y se incubaron durante 10 minutos en un agitador a TA. A continuación, se añadieron 25 j l de NHS como fuente de complemento (concentración final 20 %) y se incubaron en un incubadora a 37 °C durante 45 minutos. La reacción se detuvo añadiendo 25 j l de medio RPMI frío, suplementado con 0,1 % de BSA. Se añadieron 15 j l de yoduro de propidio y se determinó la lisis celular mediante análisis FACS.

La CDC mediada por el 005 natural (Figura 10A) o 7D8 (Figura 10B) quedó inhibida por el péptido de unión a Fc DCAWHLGELVWCT de forma dependiente de la dosis. Estos datos de competición sugieren de nuevo la participación de las interacciones Fc-Fc en el parche hidrófobo de la IgG sobre la eficacia de la CDC. Ambos mutantes IgG1-005-E345R y IgG1-7D8-E345R potenciadores de CDC fueron menos sensibles a la competición por el péptido de unión a Fc en comparación con sus correspondientes anticuerpos naturales, lo que sugiere que la mutación E345R da como resultado a un aumento en la estabilidad de la interacción Fc-Fc y, en consecuencia, un aumento de la CDC.

Ejemplo 12

Citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC) en células que expresan CD38 mediante variantes del anticuerpo HuMAb 005 CD38

Se recogieron células Daudi (5x106 células/ml), se lavaron (dos veces en PBS, 1200 rpm, 5 min) y se recogieron en 1 ml de medio RPMI 1640 suplementado con 10% de suero de cósmido de ternera (CCS) (HyClone, Logan, UT, EE.UU.), a las que se añadieron 200 jC i de 51Cr (Cromo-51; Amersham Biosciences Europe GmbH, Roosendaal, Países Bajos). La mezcla se incubó en un baño de agua con agitación durante 1 hora a 37 °C. Tras el lavado de las células (dos veces en PBS, 1200 rpm, 5 min), las células se resuspendieron en medio RPMI 1640 suplementado con 10 % de CCS, se contaron por exclusión con azul de tripano y se diluyeron a una concentración de 1x105 células/ml. Por otra parte, se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) usando capa leucocitaria reciente (Sanquin, Ámsterdam, Países Bajos) utilizando la centrifugación en gradiente de densidad con Ficoll convencional de acuerdo con las instrucciones del fabricante (medio de separación de linfocitos; Lonza, Verviers, Francia). Tras la resuspensión de las células en medio RPMI 1640 suplementado con CCS al 10%, las células se contaron por exclusión con azul de tripano y se concentraron hasta 1x107 células/ml.

Para el experimento ADCC, 50 j l de células Daudi marcadas con 51Cr (5.000 células) se preincubaron con 15 jg/ml de anticuerpo IgG1-005 CD38 o mutante IgG1-005-E345R en un volumen total de 100 j l de medio RPMI suplementado con 10% de CCS en una placa de microtitulación de 96 pocillos. Después de 10 min a TA, se añadieron 50 j l de PBMC (500.000 células), dando como resultado una relación efector:diana de 100:1. La cantidad máxima de lisis celular se determinó incubando 50 j l de células Daudi marcadas con 51 Cr(5.000 células) con 100 j l de Triton-X100 al 5 %. La cantidad de lisis espontánea se determinó incubando 5.000 células Daudi marcadas con 51Cr en 150 j l de medio, sin anticuerpos ni células efectoras. El nivel de lisis celular independiente del anticuerpo se determinó incubando 5.000 células Daudi con 500.000 PBMC sin anticuerpo. Posteriormente, las células se incubaron 4 horas a 37 °C, CO2 al 5 %. Para determinar la cantidad de lisis celular, las células se centrifugaron (1200 rpm, 3 min) y 75 j l de sobrenadante se transfirieron a tubos micrométricos, después de lo cual se contó el 51Cr liberado utilizando un contador gamma. Las cuentas por minuto (cpm) medidas se utilizaron para calcular el porcentaje de lisis mediada por anticuerpos de la siguiente manera:

(cpm de muestra - cpm de lisis independiente de Ab)/(cpm de lisis máxima - cpm de lisis espontánea]x 100 % La Tabla 15 muestra los valores de CE50 calculados para IgG1-005-wt e IgG1-005-E345R en el ensayo ADCC realizado. Se analizaron cuatro muestras. IgG1-005-E345R muestra un valor CE50 significativamente menor que IgG1-005-wt para las cuatro muestras analizadas.

Tabla 15 Valores de^ CE50 calculados en los cuatro ex erimentos realizados.

(continuación)

Factor potenciado

3,3 veces

La Figura 11 muestra que en comparación con el anticuerpo natural HuMab-005, IgG1-005-E345R mutante demostró una mayor eficacia de la capacidad ADCC, siendo capaz de inducir ADCC a concentraciones más bajas.

Ejemplo 13

Análisis de la unión del FcRn y de la farmacocinética de los mutantes del 7D8 en comparación con el 7D8 natural

El receptor de Fc neonatal (FcRn) es responsable de la prolongada semivida en plasma de las IgG al proteger las IgG de la degradación. Tras la internalización del anticuerpo, el FcRn se une a las regiones Fc de los anticuerpos en los endosomas, donde la interacción es estable en un entorno ligeramente ácido (pH 6,0). Al reciclarse a la membrana plasmática, cuando el entorno es neutro (pH7,4), la interacción se pierde y el anticuerpo se libera de nuevo en la circulación. Esto influye en la semivida en plasma de las IgG.

La capacidad del mutante de 7D8, IgG1-7D8-E354R, para interactuar con el FcRn de ratón, macaco y ser humano se estudió en un ELISA. Todas las incubación se llevaron a cabo a temperatura ambiente. Placas de 96 pocillos se recubrieron con 5 pg/ml (100 pl/pocillo) de dominio extracelular de FcRn (ratón, humano o macaco ) producido de forma recombinante y biotinilado (FcRnECDHis-B2M-BIO), diluido en PBST más BSA al 0,2 %; 1 hora. Las placas se lavaron 3 veces con PBST y se añadieron diluciones en serie de 3 veces (en PBST/BSA al 0,2 %, pH 6,0) de IgG1-7D8 o IgG1-7D8-E354R natural, y las placas se incubaron durante 1 hora. Las placas se lavaron una vez con PBST/BSA al 0,2 %, pH 6,0. Se añadió anticuerpo de cabra dirigido contra IgG(Fab'2)-HRP humana (Jackson Immuno Research, n.° de catálogo: 109-035-097) diluido en PBST/BSA al 0,2 %, pH 6,0 y las placas se incubaron durante 1 hora. Tras el lavado, se añadió ABTS como sustrato y las placas se incubaron en la oscuridad durante 30 minutos. La absorbancia se leyó a 405, utilizando un lector EL808 ELISA.

Los ratones de este estudio se alojaron en una unidad de contención del Central Laboratory Animal Facility (Utrecht, Países Bajos) y se mantuvieron en jaulas con filtro, con agua y comida a voluntad. Todos los experimentos fueron autorizados por el comité de ética animal de la Universidad de Utrecht.

Para analizar la farmacocinética de los mutantes 7D8 in vivo, los ratones SCID (C.B-17/IcrCrl-scid-BR, Charles-River) recibieron inyecciones intravenosas de 100 pg (5 mg/kg) de 7D8 natural, IgG1-7D8-E354R, -S440K o K322A; 3 ratones por grupo.

Se tomaron muestras de sangre de 50 pl de la vena safena a los 10 minutos, 4 horas, 24 horas, 2 días, 7 días, 14 días y 21 días después de la administración del anticuerpo. La sangre se recogió en viales con heparina y se centrifugó durante 5 minutos a 10.000 g. El plasma se almacenó a -20 °C hasta la determinación de las concentraciones de mAb.

Las concentraciones de IgG humana se determinaron mediante un ELISA en sándwich. El clon MH16 de un MAb de ratón dirigido contra IgG-kappa humana (n.° M1268, CLB Sanquin, Países Bajos), recubierto en placas ELISA Microlon de 96 pocillos (Greiner, Alemania) a una concentración de 2 pg/ml se utilizó como anticuerpo de captura. Después de bloquear las placas con PBS suplementado con un 2 % de suero de pollo, se añadieron las muestras, diluidas en serie en el tampón ELISA (PBS complementado con Tween 20 al 0,05 % y suero de pollo al 2 %) y se incubaron en un agitador de placas durante 1 hora a temperatura ambiente (TA). A continuación, las placas se incubaron con inmunoglobulina de cabra dirigida contra IgG humana (n.° 109-035-098, Jackson, West Grace, PA) y se reveló con 2,2'-azino-bis (ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico) (ABTS; Roche, Mannheim, Alemania). La absorbencia se midió en un lector de microplacas (Biotek, Winooski, VT) a 405 nm.

Se eligieron ratones SCID porque tienen bajas concentraciones de IgG en plasma y, por tanto, un aclaramiento relativamente lento de IgG. Esto proporciona un modelo PK que es muy sensible para detectar cambios en el aclaramiento debido a la disminución de la unión de la parte Fcy al receptor Fc neonatal (FcRn).

Se realizaron las pruebas estadísticas con GraphPad PRISM versión 4 (Graphpad Software).

La Figura 12 muestra que tanto HuMab-7D8 natural como IgG1-7D8-E345R se unieron bien al FcRn de ratón, ser humano y macaco. La unión de la IgG1-7D8-E345R fue ligeramente mejor que la del 7D8 natural.

La Figura 13 muestra las concentraciones plasmáticas con el tiempo. No hubo diferencias en el cambio de las concentraciones plasmáticas (aclaramiento) con el tiempo para HuMab-7D8 natural frente a cualquiera de las IgG1-7D8-E345R, -S440K o K322A.

Ejemplo 14

Uso de la mutación estabilizadora de Fc-Fc, E345R, para aumentar la actividad bactericida de los anticuerpos de IgG contra bacterias que expresan proteínas de superficie Fc-bindina

El sistema de la cascada del complemento es un importante mecanismo de defensa del hospedador contra los patógenos y puede dividirse en tres rutas de activación diferentes para reconocer patógenos: i) la ruta clásica mediada por anticuerpos, que se activa tras la unión de C1q al anticuerpo unido al patógeno, ii) la lectina y iii) la vía alternativa, en el que el sistema del complemento reconoce directamente al agente patógeno y se activa por el mismo en ausencia de anticuerpos. Las tres rutas convergen en el paso de la escisión de C3 y la deposición de C3b. Los microorganismos han desarrollado múltiples mecanismos para evadir el complemento, uno de los cuales está mediado por la proteína A (Joiner Ann. Rev. Microbiol. (1988) 42:201-30; Foster Nat Rev Microbiol (2005) Dic;3(12):948-58). La proteína A se identificó por primera vez en la pared celular de Staphylococcus aureus y es bien conocida por su unión a la región Fc de la IgG (Deisenhofer et al., Biochem (1981) 20, 2361-70; Uhlen et al., J. Biol. Chem (1984) 259,1695-1702). Hasta el momento, el efecto antifagocítico de la proteína A y su papel en la patogénesis de S. aureus se explicaba por la interacción entre la proteína A y la IgG, lo que da como resultado una orientación incorrecta del anticuerpo para ser reconocido por el receptor Fc de los neutrófilos (Foster Nat Rev Microbiol (2005) Dic;3(12):948-58).

El Ejemplo 11 muestra que la CDC mediada por anticuerpos IgG1 específicos de linfocitos B quedó inhibida por el péptido competidor de la unión Fc DCAWHLGELVWCT. El péptido se dirige al sitio de unión de consenso de la Fc de IgG que coincide con el sitio de unión de la proteína A, proteína G y factor reumatoide (Delano et al., Science 18 de febrero de 2000;287(5456):1279-83). Según estos datos, se cree que el mecanismo de evasión del complemento mediado por la proteína A de las bacterias podría actuar compitiendo por la unión de Fc, lo que da como resultado una desestabilización de la interacción Fc-Fc de un anticuerpo específico de un microbio y, por consiguiente, la inhibición de la activación del complemento mediada por el anticuerpo. Por otra parte, el Ejemplo 11 también muestra que los anticuerpos IgG1 específicos de linfocitos B que contienen la mutación potenciadora de CDC, E345R, fueron menos sensibles a la inhibición de la CDC por el péptido de la unión Fc competidor, DCAWHLGELVWCT, que los anticuerpos precursores naturales. Cuando se extrapolan estos resultados a las proteínas de unión a Fc expresadas en los microbios, una mayor estabilización de las interacciones Fc-Fc de la IgG1 debido a la mutación E345R haría que los anticuerpos específicos del microbio fueran menos propensos a la inhibición del complemento por una estrategia de escape del patógeno a través de la competición por la unión a Fc por parte de las proteínas de superficie microbianas, como la proteína A. En consecuencia, la introducción de la mutación E345R en los anticuerpos de IgG dirigidos contra una bacteria daría lugar un aumento de la deposición de C3b en las bacterias y a una mayor actividad bactericida en comparación con los anticuerpos naturales.

Como medida in vitro para la eliminación de bacterias mediada por el complemento, tanto la fagocitosis por neutrófilos como la generación de C3a en plasma, que coincide con la deposición de C3b en la bacteria, se pueden determinar como se describe a continuación. De hecho, se ha descrito que la deposición de C3b en S. aureus da como resultado una mayor fagocitosis y se correlaciona con la eliminación de la bacteria (Rooijakkers et. al., Nature Immunology 2005: 6,920-927).

S. aureus se marcará con FITC incubando un cultivo bacteriano de crecimiento exponencial con 100 pg/ml de FITC durante 1 h a 37 °C en tampón carbonato 0,1 M (pH 9,6). Los linfocitos polimorfonucleares (PMN) humanos se aislarán utilizando un gradiente de Ficoll. Las bacterias marcadas con FITC se opsonizarán con una serie de concentraciones de anticuerpos específicos con o sin la mutación E345R. La fagocitosis se llevará a cabo in vitro incubando 1 x108 bacterias opsonizadas marcadas con FITC con PMN humanos en presencia de un 25 % de suero empobrecido en IgG como fuente del complemento durante 25 minutos a 37 °C en un volumen total de 200 pl bajo agitación vigorosa. Las células se fijarán y los eritrocitos se lisarán mediante incubación con la solución de lisado BD FACS durante 15 minutos a temperatura ambiente. Tras el lavado, la fagocitosis se medirá por FACS. La población de neutrófilos se seleccionará mediante clasificación de la dispersión frontal y lateral y la fagocitosis se expresará como fluorescencia media en la población de neutrófilos. Como alternativa, la generación de C3a se medirá en las muestras mediante ELISA como medida de la activación del complemento y del depósito de C3b.

Se espera que los anticuerpos específicos de S. aureus que contienen la mutación E345R induzcan más activación del complemento y fagocitosis por parte de los neutrófilos que los anticuerpos naturales. Un ejemplo de anticuerpo que podría utilizarse en estos experimentos es el anticuerpo monoclonal de IgG1 quimérico pagibaximab (BSYX-A110; Biosynexus), dirigido al ácido lipoteico (LTA) que está integrado en la pared celular de los estafilococos (Baker, Nat Biotechnol. 24 Dic 2006(12):1491-3; Weisman et al., Int Immunopharmacol. mayo de 2009;9(5):639-44).

Ejemplo 15

Uso de mutaciones inhibidoras de CDC que restringen la activación de CDC a las células diana unidas simultáneamente a una mezcla de dos anticuerpos monoclonales terapéuticos diferentes

Como se describe en el Ejemplo 6, las mutaciones K439E y S440K del anticuerpo 7D8 de CD20 disminuyeron la eficacia de CDC como anticuerpos monoclonales. La mezcla de anticuerpos 7D8 que contienen estas mutaciones restauró la CDC. Por lo tanto, la CDC eficaz se limitó a las células unidas por ambos anticuerpos mutantes simultáneamente. Como se describe en el Ejemplo 10, Las mutaciones K439E y S440K del anticuerpo 005 de CD38 disminuyeron la eficacia de CDC como anticuerpos monoclonales. La mezcla de anticuerpos 005 que contienen estas mutaciones restauró la CDC. Por lo tanto, la CDC eficaz se limitó a las células unidas por ambos anticuerpos mutantes simultáneamente.

Puede ser ventajoso restringir la inducción de una CDC eficaz a las células diana que expresan dos antígenos específicos simultáneamente, aprovechando su expresión combinada para mejorar la selectividad de la inducción de la CDC. Para restringir la inducción de CDC a las células unidas a los anticuerpos CD20 y CD38 simultáneamente, la pareja 7D8-K439E y 005-S440K o la pareja 7D8-S440K y 005-K439E se añadirán por separado o se mezclarán 1:1 en los experimentos de CDC como se indica a continuación. Se preincubarán 0,1 x106 células Daudi o Raji en placas de 96 pocillos de fondo redondo con una serie de concentraciones de anticuerpos no purificados o mezcla de anticuerpos (0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1,0, 3,0, 10,0, 30,0 pg/ml) en un volumen total de 100 pl durante 15 minutos en un agitador a TA. A continuación, se añadirá 25 pl de suero humano normal como fuente de complemento (concentración final 20 %) y se incubaron en una incubadora a 37 °C durante 45 min. La reacción se detendrá poniendo las placas sobre hielo. Se añadirán 10 pl de yoduro de propidio y se determinará la lisis celular mediante FACS. Se espera, que 7D8-K439E, 005-S440K, 7D8-S440K y 005-K439E muestren una eficacia limitada de la CDC. Se espera, que la adición simultánea de 7D8-K439E y 005-S440K restablezca la eficacia de la CDC específicamente en las células que expresan tanto CD20 como CD38. De manera análoga, se espera que la mezcla de 7D8-S440K y 005-K439E restablezca la eficacia de la CDC específicamente en las células que expresan tanto CD20 como CD38.

Ejemplo 16

Aumento de la especificidad de CDC potenciada mediante la combinación de E345R con las mutaciones inhibidoras complementarias K439E y S440K en una mezcla de dos anticuerpos monoclonales diferentes Como se describe en el Ejemplo 6, las mutaciones K439E y S440K del anticuerpo 7D8 de CD20 disminuyeron la eficacia de CDC como anticuerpos monoclonales. La mezcla de anticuerpos 7D8 que contienen estas mutaciones restauró la CDC. Por lo tanto, la CDC eficaz se limitó a las células unidas por ambos anticuerpos mutantes simultáneamente. Como se describe en el Ejemplo 10, Las mutaciones K439E y S440K del anticuerpo 005 de CD38 disminuyeron la eficacia de CDC como anticuerpos monoclonales. La mezcla de anticuerpos 005 que contienen estas mutaciones restauró la CDC. Por lo tanto, la CDC eficaz se limitó a las células unidas por ambos anticuerpos mutantes simultáneamente.

Puede ser ventajoso restringir la potenciación de la inducción de la CDC a las células diana que expresan dos antígenos específicos simultáneamente, aprovechando su expresión combinada para mejorar la selectividad de la inducción de la CDC potenciada. También puede ser ventajoso restringir la potenciación de la inducción de la CDC a las células diana que están unidas a mezclas de al menos dos anticuerpos diferentes simultáneamente, uniéndose dichos anticuerpos a un antígeno de la superficie celular idéntico en dos epítopos diferentes simultáneamente, o en dos epítopos similares o idénticos en competición cruzada.

Por lo tanto, para restringir la inducción de CDC potenciada a las células unidas a los anticuerpos CD20 y CD38 simultáneamente, la mutación potenciadora de la CDC, E345R, se combinó con mutaciones inhibidoras de la CDC en los anticuerpos 7D8-E345R/K439E, 7D8-E345R/S440K, 005-E345R/S440K y 005-E345R/K439E. Estos anticuerpos se añadieron por separado o se mezclaron 1:1 en los experimentos de CDC, como se indica a continuación. Se preincubaron 0,1 x 106 células Wien133 (también pueden utilizarse otros tipos celulares como las células Daudi o Raji) en placas de 96 pocillos de fondo redondo con una serie de concentraciones de anticuerpos no purificados (concentración final 0,056-10.000 ng/ml en diluciones triples para 7D8-E345R/K439E, 7D8-E345R/S440K, 005-E345R/S440K o 005-E345R/K439E) o mezclas de anticuerpos (concentraciones finales de 0,01 pg/ml de anticuerpo CD20 mezclado con 0-333 ng/ml en diluciones triples de anticuerpo CD38; o 3,3 pg/ml de anticuerpo CD38 mezclado con 0,0056-1.000 ng/ml en diluciones triples de anticuerpo CD20) en un volumen total de 100 pl durante 15 minutos en un agitador a TA. A continuación, se añadieron 25 pl de suero humano normal como fuente del complemento (concentración final 20 %) y se incubaron en una incubadora a 37 °C durante 45 min. La reacción se detuvo poniendo las placas sobre hielo. Se añadieron 10 pl de yoduro de propidio y se determinó la lisis celular mediante FACS.

Se mezcló una serie de concentraciones del anticuerpo 005-E345R/K439E o 005-E345R/S440K con una concentración fija de 0,01 pg/ml de anticuerpo doble mutante 7D8 (concentración máxima con CDC mínima en las células Wien133 como agente único según se determinó en la Figura 14A) para preparar las combinaciones complementarias 005-E345R/K439E 7D8-E345R/S440K o 005-E345R/S440K 7D8-E345R/K439E. La Figura 14C muestra que los anticuerpos 005 doble mutantes para CD38 indujeron CDC de forma dependiente de la dosis en presencia de una concentración fija del anticuerpo de CD20 complementario 7D8-E345R/K439E o 7D8-E345R/S440K, respectivamente. La eficacia de la CDC mediante estas combinaciones complementarias (Figura 14C) fue comparable a la del anticuerpo mutante único (potenciador) 005-E345R como agente único (Figura 14B).

Por el contrario, en presencia de anticuerpo irrelevante b12, tanto 005-E345R/K439E como 005-E345R/S440K apenas mostraron respuesta CDC en la serie de concentraciones estudiada (comparable a 005-E345R/K439E o a 005-E345R/S440K como agentes únicos de acuerdo con la Figura 14B).

Se mezcló una serie de concentraciones del anticuerpo 7D8-E345R/K439E o 7D8-E345R/S440K con una concentración fija de 3,3 pg/ml del anticuerpo doble mutante 005 (que mostraba una CDC pequeña pero limitada en células Wien133 como agente único, de acuerdo con la Figura 14B) para preparar las combinaciones complementarias 7D8-E345R/K439E 005-E345R/S440K o 7D8-E345R/S440K 005-E345R/K439E. La Figura 14D muestra que los anticuerpos 7D8 doble mutantes para CD20 indujeron CDC muy eficientemente en presencia del anticuerpo de CD38 complementario 005-E345R/K439E o 005-E345R/S440K, respectivamente, incluso en las concentraciones más bajas estudiadas, que parece ser una cantidad no superior a unas pocas moléculas de anticuerpos 7D8 doble mutante por célula. Para eliminar la contribución del aumento de la densidad de la cola de Fc en la membrana celular a la CDC potenciada, observada para la mezcla de anticuerpos 7D8 y 005 con mutaciones complementarias K439E y S440K, también se probaron combinaciones de anticuerpos con mutaciones no complementarias. La Figura 14D muestra que las combinaciones no complementarias mostraron una eficacia de CDC mucho menor que las combinaciones complementarias, como resultado de una interacción Fc-Fc menos eficaz que las combinaciones complementarias.

Estos datos sugieren que la inducción de la CDC (potenciada) por los anticuerpos terapéuticos puede limitarse a las células que se unen simultáneamente a una mezcla de dos anticuerpos complementarios, en este caso con diferentes especificidades antigénicas, aumentando de este modo la especificidad de las células diana al requerir la coexpresión de ambos antígenos.

Como se puede observar en las Figuras 14A y 14B, 7D8-E345R/K439E, 005-E345R/S440K, 7D8-E345R/S440K y 005-E345R/K439E mostraron una eficacia CDC limitada en comparación con 7D8-E345R en solitario. Se observa, además, que la mezcla de 7D8-E345R/K439E y 7D8-E345R/S440K permitía una CDC con eficacia potenciada en comparación con el anticuerpo 7D8 natural como agente único. De manera análoga, se observó que la mezcla de 005-E345R/K439E y 005-E345R/S440K permitía una CDC con eficacia potenciada en comparación con el anticuerpo 005 natural como agente único (no se muestran los datos).

Ejemplo 17

Uso de mutaciones inhibidoras de la CDC que restringen la activación eficaz de la CDC a complejos de anticuerpos formados exclusivamente por anticuerpos administrados terapéuticamente

Como se describe en el Ejemplo 6, el anticuerpo 7D8 de CD20 doble mutante K439E/S440K restauró la eficacia de la CDC disminuida por los mutantes simples puntuales K439E o S440K. Como se describe en el Ejemplo 10, el anticuerpo 005 de CD38 doble mutante K439E/S440K restauró la eficacia de la CDC inhibida por los mutantes simples puntuales K439E o S440K. Según lo observado, las mutaciones simples puntuales interrumpen la interacción Fc:Fc con el aminoácido no mutado en el lado orientado hacia la interfase Fc:Fc. La introducción de la mutación compensatoria en el lado orientado hacia la interfase Fc:Fc restauró la eficacia de la CDC. Por lo tanto, la CDC eficaz quedó aparentemente restringida a los complejos de anticuerpos constituidos exclusivamente por anticuerpos que contenían ambas mutaciones.

En otro ejemplo, la inducción de la CDC queda restringida a los complejos de anticuerpos formados exclusivamente por anticuerpos administrados terapéuticamente. Para restringir la inducción de CDC a las células unidas por anticuerpos terapéuticos CD20 o CD38 exclusivamente, las mutaciones inhibidoras de CDC K439E y S440K se combinarán en los anticuerpos 7D8-K439E/S440K o 005-K439E/S440K. Estos anticuerpos se añadirán por separado en los experimentos de CDC en ausencia o presencia de IgG no específica como se indica a continuación. Se preincubarán 0,1 x106 células Daudi o Raji en placas de 96 pocillos de fondo redondo con una serie de concentraciones de anticuerpos no purificados o mezcla de anticuerpos (0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1,0, 3,0, 10,0, 30,0 pg/ml) en un volumen total de 100 pl durante 15 minutos en un agitador a TA. A continuación, se añadirá 25 pl de suero humano normal como fuente de complemento (concentración final 20 %) y se incubaron en una incubadora a 37 °C durante 45 min. La reacción se detendrá poniendo las placas sobre hielo. Se añadirán 10 pl de yoduro de propidio y se determinará la lisis celular mediante FACS.

Se espera, que 7D8-K439E/S440K induzca la CDC con una eficacia similar a la del anticuerpo 7D8 natural. Se espera que la adición de IgG no específica a 7D8-K439E/S440K no afecte a la eficacia de la inducción de CDC para este anticuerpo. De manera análoga, se espera que 005-K439E/S440K permita la CDC con una eficacia similar a la del HuMAb 005 natural. Se espera que la adición de IgG no específica a 005-K439E/S440K no afecte a la eficacia de la inducción de CDC para este anticuerpo.

Uso de mutaciones inhibidoras de la CDC que restringen la activación de CDC potenciada a complejos de anticuerpos formados exclusivamente por anticuerpos administrados terapéuticamente

Como se describe en el Ejemplo 6, el anticuerpo 7D8 de CD20 doble mutante K439E/S440K restauró la eficacia de la CDC disminuida por los mutantes simples puntuales K439E o S440K. Como se describe en el Ejemplo 10, el anticuerpo de CD38 HuMAb 005 doble mutante K439E/S440K restauró la eficacia de la CDC inhibida por los mutantes simples puntuales K439E o S440K. Según lo observado, las mutaciones simples puntuales interrumpen la interacción Fc:Fc con el aminoácido no mutado en el lado orientado hacia la interfase Fc:Fc. La introducción de la mutación compensatoria en el lado orientado hacia la interfase Fc:Fc restauró la eficacia de la CDC. Por lo tanto, la CDC eficaz quedó aparentemente restringida a los complejos de anticuerpos constituidos exclusivamente por anticuerpos que contenían ambas mutaciones.

En otro ejemplo, la potenciación de la CDC queda restringida a los complejos de anticuerpos formados exclusivamente por anticuerpos administrados terapéuticamente. Mediante el cribado y la selección de mutaciones que estimulan la interacción Fc:Fc aprovechada para estimular la CDC, se podrían identificar mutaciones que pudieran formar complejos de anticuerpos inductores de CDC con anticuerpos séricos no específicos para el antígeno diana de interés. Para restringir la inducción de CDC potenciada a las células unidas a complejos de CD20 o a anticuerpos de CD38 exclusivamente, la mutación potenciadora de la CDC, E345R, se combinó con mutaciones inhibidoras de la CDC en los anticuerpos 7D8-E345R/K439E/S440K o 005-E345R/K439E/S440K. Estos anticuerpos se añadirán por separado en los experimentos de CDC en ausencia o presencia de IgG no específica como se indica a continuación. Se preincubarán 0,1 x106 células Daudi o Raji en placas de 96 pocillos de fondo redondo con una serie de concentraciones de anticuerpos no purificados o mezcla de anticuerpos (0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1,0, 3,0, 10,0, 30,0 |jg/ml) en un volumen total de 100 j l durante 15 minutos en un agitador a TA. A continuación, se añadirá 25 j l de suero humano normal como fuente de complemento (concentración final 20 %) y se incubaron en una incubadora a 37 °C durante 45 min. La reacción se detendrá poniendo las placas sobre hielo. Se añadirán 10 j l de yoduro de propidio y se determinará la lisis celular mediante FACS.

Se espera que 7D8-E345R/K439E/S440K induzca la CDC con eficacia potenciada en comparación con HuMAb 7D8 natural. Se espera que la adición de IgG no específica a 7D8-E345R/K439E/S440K no afecte a la eficacia de la inducción de CDC en comparación con el anticuerpo 7D8 natural. De manera análoga, se espera que el 005-E345R/K439E/S440K permita la CDC con mayor eficacia en comparación con el anticuerpo 005 natural. Se espera que la adición de IgG no específica al 005-E345R/K439E/S440K no afecte a la eficacia de la inducción de CDC en relación con el anticuerpo 005 natural.

Ejemplo 19

Uso de un enfoque de cribado de mutantes para identificar mutaciones que estimulan la oligomerización de anticuerpos mediada por la interacción Fc:Fc detectada en un ensayo CDC

Tal como se describe en los Ejemplos 6 y 10, se identificaron mutaciones de aminoácidos que estimulaban la CDC para los anticuerpos que reconocen dos antígenos diana diferentes, CD20 y CD38, en múltiples líneas celulares que expresan niveles variables de dichos antígenos. Sorprendentemente, la mutación simple puntual E345R demostró ser suficiente para dotar al anticuerpo 005 dirigidos contra CD38 de capacidad de lisis celular dependiente de la CDC en células Wien133, cuando no había conseguido lisar estas células mediante CDC para un formato de IgG1 natural.

Otras mutaciones en o en la periferia de la interfase Fc:Fc podrían estimular la oligomerización y la CDC de forma análoga. Como alternativa, las mutaciones podrían estimular indirectamente la oligomerización, por ejemplo, induciendo alostéricamente interacciones Fc:Fc.

Para determinar si otras mutaciones de aminoácidos podrían estimular la oligomerización de anticuerpos mediada por Fc, se cribó una biblioteca de mutantes de IgG1-005 dirigido contra CD38 mediante ensayos CDC, tanto individualmente como mezclados en parejas para seleccionar, por ejemplo, las parejas de aminoácidos que interactúan a través de la interfaz Fc:Fc. Sin embargo, la misma estrategia puede aplicarse a otros anticuerpos, tales como otra IgG1 o un anticuerpo de IgG3.

Se generó una biblioteca centrada en mutaciones en las posiciones indicadas en la Tabla 15. Las mutaciones se introdujeron en la región Fc de la IgG1-005 utilizando el kit de mutagénesis dirigida al sitio Quikchange (Stratagene, EE.UU.). En resumen, para cada posición de mutación deseada, se utilizaron un cebador directo y otro inverso que codificaban un codón degenerado en la ubicación deseada para replicar un molde de ADN plasmídico de longitud completa que codificaba la cadena pesada de 005 con el alotipo IgG1m(f). Las mezclas de ADN resultantes se digirieron usando Dpnl para eliminar el ADN plasmídico original, y se utilizó para transformar E. coli. Las colonias resultantes se agruparon y cultivaron y el ADN plasmídico se aisló de estos grupos y se retransformó en E. coli para obtener colonias clonales. El ADN plasmídico mutante aislado de las colonias resultantes se comprobó mediante secuenciación del ADN (LGC Genomics, Berlín, Alemania). Los casetes de expresión se amplificaron a partir del ADN del plásmido mediante PCR y las mezclas de ADN que contenían tanto una cadena pesada mutante como una cadena ligera natural de IgG1-005 se transfectaron transitoriamente a células Freestyle HEK293F (Invitrogen, EE.UU.) utilizando 293fectina (Invitrogen, EE.UU.) esencialmente como describe el fabricante. Se recogieron los sobrenadantes de las células transfectadas que contenían los anticuerpos mutantes. Los sobrenadantes de los anticuerpos mutantes se cribaron en ensayos CDC tanto individualmente como en mezclas emparejadas, como se indica a continuación.

Se preincubaron 0,1 x 106 células Daudi o Wien-133 (pueden utilizarse otros tipos de células, como las Raji) en placas de 96 pocillos de fondo redondo con 1,0 ug/ml de anticuerpos no purificados en un volumen total de 100 j l durante 15 minutos en un agitador a TA. A continuación, se añadieron 30 j l de suero humano normal como fuente del complemento (concentración final 30 %) y se incubaron en una incubadora a 37 °C durante 45 min. La reacción se detuvo poniendo las placas sobre hielo. Se añadieron 10 j l de yoduro de propidio y se determinó la lisis celular mediante FACS.

Las mutaciones descritas en la Tabla 16, Tabla 17 y Tabla 18 se seleccionaron por su capacidad de mejorar la oligomerización, según la se detectó por la eficiencia de la CDC, tanto como mutante simple cuando se mezclan con otros mutantes, por ejemplo, que orientan la mutación a través de la interfaz Fc:Fc. Opcionalmente, las mutaciones pueden cribarse adicionalmente por su capacidad para no alterar negativamente la unión a FcRn, proteína A o proteína G, ADCC, ADCP u otras funciones efectoras mediadas por el dominio Fc. La combinación de estas mutaciones puntuales estimulantes en un dominio Fc puede estimular aún más la oligomerización y la eficacia de la CDC.

Las mutaciones en la región CH2-CH3 incorporadas al anticuerpo 005 de CD38 se probaron para comprobar su capacidad para inhibir la oligomerización, determinada por CDC, en células Daudi. La lisis del anticuerpo mutante se comparó con la del 005 natural, para el que se fijó una lisis al 100 %. El punto de corte para la inhibición se fijó en < 66 % de lisis. Medido de esta manera, la mayoría de las mutaciones estudiadas inhibieron la CDC (véase la Tabla 16).

Las mutaciones en la región CH2-CH3 incorporadas al anticuerpo 005 de CD38 se probaron para comprobar su capacidad para potenciador la oligomerización, determinada por CDC, en células Wien133 (Tabla 17). El anticuerpo 005 de CD38 natural no pudo inducir la CDC en células Wien133. Los mutantes que mostraban una lisis celular >39 % se calificaron como potenciadoras. De forma totalmente inesperada, prácticamente todas las sustituciones obtenidas de los aminoácidos E345 y E430 estimularon la lisis celular mediante CDC. Para verificar este resultado, los aminoácidos (E345), E430 y S440 se sustituyeron con cada una de las posibles mutaciones mediante mutagénesis dirigida al sitio y se comprobó su capacidad para potenciar la oligomerización, determinada por mediante la CDC, en células Wien133 utilizando un nuevo lote de suero humano, produciendo una lisis alto más eficaz (Tabla 18). De nuevo, todas las sustituciones de E345 y E430 indujeron una ^cD^ceficaz en células Wien133. Las siguientes mutaciones preferidas provocaron una lisis celular >39 % en células Wien133: P247G, I253V, S254L, Q311L, Q311W, E345A, E345C, E345D, E345F, E345G, E345H, E345I, E345K, E345L, E345M, E345N, E345P, E345Q, E345R, E345S, E345T, E345V, E345W, E345Y, D/E356G, D/E356R, T359R, E382L, E382V, Q386K, E430A, E430C, E430D, E430F, E430G, E430H, E430I, E430L, E430M, E430N, E430P, E430Q, E430R, E430S, E430T, E430V, E430W, E430Y, Y436I, S440Y e S440W.

Tabla 16 Porcentaje de lisis en células Daudi en presencia de mutaciones puntuales del anticuerpo IgG1-005 a 1,0 ^g/ml. La IgG1-005 natural lisó el 66 % de las células en estas condiciones. Para cada una de las posiciones individuales que se han sustituido por otro aminoácido se proporcionan en la columna exterior izquierda. El aminoácido sustituido para cada posición particular se indica seguido del porcentaje de lisis medido indicado entre paréntesis () en las filas horizontales de las posiciones individuales.

Tabla 17 Porcentaje de lisis en células Wien-133 en presencia de mutantes puntuales del anticuerpo IgG1-005 a 1,0 |jg/ml. La IgG1-005 natural lisó el 3% de las células en estas condiciones. Para cada una de las posiciones individuales que se han sustituido por otro aminoácido se proporcionan en la columna exterior izquierda. El aminoácido sustituido para cada posición particular se indica seguido del porcentaje de lisis medido indicado entre paréntesis () en las filas horizontales de las posiciones individuales.

Tabla 18 Porcentaje de lisis en células Wien-133 en presencia de mutantes puntuales del anticuerpo IgG1-005 a 1,0 ^g/ml. La IgG1-005 natural lisó el 12 % de las células en estas condiciones. Cada una de las posiciones individuales que se han sustituido por otro aminoácido se proporcionan en la columna exterior izquierda. El aminoácido sustituido para cada posición particular se indica seguido del porcentaje de lisis medido indicado entre paréntesis () en las filas horizontales de las posiciones individuales.

Ejemplo 20

Eficacia/n vivo de IgG1-7D8-E345R en un modelo de xenoinjerto de linfoma de linfocitos B subcutáneo Se evaluó la eficacia antitumoral in vivo del anticuerpo IgG1-7D8-E345R en un modelo subcutáneo con células Rajiluc n.° 2D1. Estas células muestran ~300.000 moléculas CD20 por célula (determinado por análisis QIFIKIT, no se muestran los datos) y una alta expresión del receptor de defensa del complemento. Las células se cultivaron en RPMI con un 10% de suero de cósmido de ternera (HyClone, Logan, UT), penicilina y estreptomicina, piruvato sódico al 1 % (v/v) y 1 pg/ml de puromicina (P-8833, Sigma, Zwijndrecht). Las células se recogieron en fase logarítmica (aproximadamente un 70 % de confluencia). Se utilizaron ratones SCID hembra de seis a once semanas de edad (C.B-17/IcrPrkdc-scid/CRL) (Charles-River). El día 0 se inyectaron 5x106 células Raji-luc n.° 2D1 en 200 pl de PBS por vía subcutánea en el flanco derecho de cada ratón. El desarrollo del tumor se controló mediante la medición del calibre. Cuando el volumen medio del tumor era de 100 mm3 (alrededor del día 7), los ratones se clasificaron en grupos (n=9) y se trataron mediante la inyección intraperitoneal (i.p.) con una dosis única de 50 pg de anticuerpo por ratón (2,5 mg/kg). Todas las muestras de anticuerpos se complementaron con el anticuerpo irrelevante b12 para obtener una concentración total de anticuerpos de 0,5 mg/ml. En la Tabla 18 se muestran los grupos de tratamiento. Siete días después del tratamiento, se obtuvieron muestras de sangre para determinar los niveles de IgG humana en suero para comprobar la correcta administración de anticuerpos. Los tumores se midieron al menos dos veces por semana utilizando un calibre (PLEXX) hasta un volumen tumoral final de 1500 mm3, hasta que los tumores mostraron ulceraciones o hasta que se observaron signos clínicos graves.

Tabla 18: Gru os de tratamiento dosificación.

La Figura 15A muestra el crecimiento medio del tumor para el día 22, cuando todos los grupos seguían completos. El anticuerpo natural IgG1-7D8 inhibió levemente el crecimiento del tumor en comparación con el anticuerpo de control negativo IgG1-b12, aunque esto no fue estadísticamente significativo. Solo IgG1-7D8-E345R inhibió el crecimiento del tumor de forma significativa en comparación con el anticuerpo de control negativo IgGl-b12 (análisis ANOVA monolateral p< 0,01).

La Figura 15B muestra un gráfico de Kaplan-Meier del porcentaje de ratones con tamaños de tumor inferiores a 700 mm3. En comparación con los ratones tratados con el anticuerpo de control negativo IgG1-b12, la formación de tumores se retrasó significativamente en los ratones tratados con el anticuerpo IgG1-7D8-E345R (análisis Mantel-Cox p< 0,01), pero no en los ratones tratados con el IgG1-7D8 natural.

Estos datos demuestran que la mutación E345R aumentó la eficacia antitumoral in vivo del anticuerpo 7D8 de CD20.

Ejemplo 21

Eficacia/n vivo de IgG1-005-E345R en un modelo de xenoinjerto de linfoma de linfocitos B subcutáneo Se evaluó la eficacia antitumoral in vivo del anticuerpo IgG1-005-E345R en un modelo subcutáneo con células Rajiluc n.° 2D1. Estas células muestran ~150.000 moléculas CD38 por célula (determinado por análisis QIFIKIT, no se muestran los datos) y una alta expresión del receptor de defensa del complemento. El protocolo de inoculación y medición de tumores es básicamente el mismo que se ha descrito en el Ejemplo 20. El día 0 se inyectaron 5x106 células Raji-luc n.° 2D1 en 200 pl de PBS s.c. en el flanco derecho de cada ratón. Cuando el volumen medio del tumor era de 100 mm3 (alrededor del día 7), los ratones se clasificaron en grupos (n=7) y se trataron mediante la inyección i.p. con una dosis única de 500 pg de anticuerpo por ratón (25 mg/kg). En la Tabla 19 se muestran los grupos de tratamiento. Los tumores se midieron hasta un volumen tumoral final de 1.500 mm3 o hasta que los tumores presentaron ulceraciones o se observaron signos clínicos graves para evitar molestias mayores.

La Figura 16A muestra el crecimiento medio del tumor para el día 21, cuando todos los grupos seguían completos. El anticuerpo natural IgG1-005 inhibió levemente el crecimiento del tumor, aunque esto no fue estadísticamente significativo. Solo IgG1-005-E345R inhibió significativamente el crecimiento del tumor en comparación con el control de anticuerpos irrelevantes en el día 21 (ANOVA monolateral p< 0,05).

La Figura 16B muestra un gráfico de Kaplan-Meier del porcentaje de ratones con tamaños de tumor inferiores a 500 mm3. La formación de tumores se retrasó significativamente en los ratones tratados con el anticuerpo IgG1-005-E345R en comparación con los ratones tratados con el anticuerpo de control negativo IgGl-b12 (análisis de Mantel-Cox p<0,001) o con el IgG1-005 natural (p<0,05).

Estos datos muestran que la introducción de la mutación E345R en el anticuerpo 005 de CD38 dio como resultado una mayor actividad antitumoral in vivo.

Tabla 19: Gru os ^de tratamiento dosificación.

Ejemplo 22

La unión a la diana monovalente mejora aún más la eficacia de los anticuerpos E345R en CDC

Una superficie molecular del anillo hexamérico de la IgG1 observado en la estructura cristalina de b12 demuestra que para cada IgG del anillo hexamérico, uno de los dos sitios de unión a C1q está orientado hacia arriba y el otro está orientado hacia abajo de la estructura del anillo, y que también un brazo Fab de cada anticuerpo está orientado hacia arriba y otro hacia abajo, lo que hace que solo un brazo Fab por anticuerpo participe en la unión al antígeno, lo que sugiere una unión monovalente por molécula de anticuerpo en el anillo de anticuerpo hexamérico. La monovalencia podría hacer que los anticuerpos se unieran al antígeno en una orientación compatible con la hexamerización. Para analizar esta hipótesis, la eficacia de la CDC de un anticuerpo biespecífico CD38/EGFR con la mutación E345R se estudió en células Wien133 positivas para CD38 y negativas para eGf R, al que este anticuerpo biespecífico solo puede unirse de forma monovalente a través de CD38, y comparar con la eficacia CDC del anticuerpo CD38 de unión bivalente, también con la mutación E345R. El anticuerpo monoclonal humano HuMax-EGFr (2F8, descrito en el documento WO 2004/056847) se utilizó como base para los anticuerpos EGFR descritos en este ejemplo.

Los anticuerpos biespecíficos se generaron in vitro según la plataforma DuoBody™, es decir, el intercambio de brazos Fab inducido por 2-MEA como se describe en el documento WO 2011/147986. La base de este método es el uso de dominios CH3 complementarios, que fomentan la formación de heterodímeros en condiciones específicas de ensayo. Para permitir la producción de anticuerpos biespecíficos por este método, se generaron moléculas de IgG1 que llevaban determinadas mutaciones en el dominio CH3: en uno de los anticuerpos IgG1 precursores la mutación F405L, en el otro anticuerpo IgG1 precursor la mutación K409R. Para generar anticuerpos biespecíficos, estos dos anticuerpos precursores, cada anticuerpo a una concentración final de 0,5 mg/ml, se incubaron con 2-mercaptoetilamina-HCl (2-MEA) 25 mM en un volumen total de 100 pl de TE a 37 °C durante 90 min. La reacción de reducción se detuvo al eliminar el agente reductor 2-MEA mediante columnas de centrifugado (filtros centrífugos Microcon, 30k, Millipore) de acuerdo con el protocolo del fabricante.

Para el ensayo de CDC, se preincubaron 0,1 x 106 células Wien133 en placas de 96 pocillos de fondo redondo con una serie de concentraciones de anticuerpos (0,01 a 10,0 pg/ml) en un volumen total de 100 pl durante 15 minutos en un agitador a TA. A continuación, se añadieron 25 pl de suero humano normal como fuente del complemento (concentración final 20 %) y se incubaron en una incubadora a 37 °C durante 45 min. La reacción se detuvo poniendo las placas sobre hielo. Se añadieron 10 pl de yoduro de propidio y se determinó la lisis celular mediante FACS.

La Figura 17 muestra que, como se esperaba, los anticuerpos CD38 sin la mutación E345R (IgG1-005 natural e IgG-b12-K409R x IgG1-005-F405L) no indujeron la destrucción de las células Wien133. Tampoco el anticuerpo EGFR IgG1-2F8-E345R/F405L, que no se unió a las células Wien133 negativas para EGFR (no se muestran los datos), no indujo CDC, como se esperaba. La introducción de la mutación K409R no alteró la capacidad del anticuerpo IgG1-005-E345R para inducir la destrucción en ~60 % en las células Wien133 (como se describe en el Ejemplo 10). Curiosamente, el anticuerpo biespecífico CD38/EGFR IgG1-005-E345R/K409R x IgG1-2F8-E345R/F405L, que solo puede unirse de forma monovalente a las células Wien133 positivas para CD38 y negativas para EGFR, mostraron un aumento de la eliminación máxima de CDC (de ~60 % a ~100 % de destrucción).

Estos datos demuestran que el direccionamiento monovalente puede potenciar aún más la capacidad de eliminación máxima de los anticuerpos que contienen la mutación E345R potenciadora de CDC. Además, estos datos muestran que la mutación potenciadora de la oligomerización E345R, según se mide por el aumento de la actividad CDC, puede aplicarse a otros formatos de anticuerpos, como DuoBody.

Ejemplo 23

La mutación E345R potenciadora de la oligomerización puede aplicarse a otros formatos de anticuerpos como DuoBody™

El efecto de la mutación E345R se estudió en un anticuerpo biespecífico de formato DuoBody. Los ensayos CDC se llevaron a cabo con anticuerpos biespecíficos CD20/CD38 en células Wien133 y Raji positivas para CD20 y positivas para CD38.

Los anticuerpos biespecíficos se generaron como se describe en el Ejemplo 22. Para el ensayo de CDC, se preincubaron 0,1 x 106 células Wien133 o Raji en placas de 96 pocilios de fondo redondo con una serie de concentraciones de anticuerpos (0,01 a 30,0 |jg/ml) en un volumen total de 100 j l durante 15 minutos en un agitador a TA. A continuación, se añadieron 25 j l de suero humano normal como fuente del complemento (concentración final 20 %) y se incubaron en una incubadora a 37 °C durante 45 min. La reacción se detuvo poniendo las placas sobre hielo. Se añadieron 10 j l de yoduro de propidio y se determinó la lisis celular mediante FACs .

La Figura 18 muestra que la introducción de la mutación E345R mejoró la CDC del anticuerpo biespecífico IgG1-005-F405L x IgG1-7D8-K409R en células Wien 133 (Figura 18A) y Raji (Figura 18B). Estos datos demuestran que la mutación potenciadora de la oligomerización E345R puede aplicarse a otros formatos de anticuerpos para mejorar la actividad CDC.

Ejemplo 24

E345R rescata la CDC mediante el anticuerpo EGFR 2F8, que puede potenciarse adicionalmente mediante la unión a la diana monovalente

Tal como se describe en los Ejemplos 6, 10 y 26, E345R mejoró o rescató la CDC para los anticuerpos que reconocen diferentes dianas tumorales hematológicas (CD20 y CD38). Para el análisis a un antígeno de tumor sólido, el efecto de E345R sobre la capacidad CDC del anticuerpo 2F8 del EGFR se estudió en células de carcinoma epidermoide A431. Además, el efecto del direccionamiento monovalente del EGFR sobre la inducción de CDC mediada por E345R se estudió utilizando un anticuerpo biespecífico EGFRxCD20 (IgG1-2F8-E345R/F405L x IgG1-7D8-E345R/K409R) en células A431 positivas para EGFR y negativas para CD20.

Los anticuerpos biespecíficos se generaron como se describe en el Ejemplo 22. Para el ensayo de CDC, se marcaron 5 x106 células A431/ml con 100 jC i de 51Cr durante 1 h a 37 °C. Las células se lavaron tres veces con PBS y se resuspendieron en medio a una concentración de 1 x105 células/ml. 25.000 células marcadas se incubaron en placas de 96 pocillos de fondo redondo con una serie de concentraciones de anticuerpos no purificados (0-30 jg/ml en diluciones triples) en un volumen total de 100 j l durante 15 minutos a TA. A continuación, dilución se añadieron 50 j l de suero humano normal de dilución como fuente del complemento (concentración final 25 %) y se incubaron en una incubadora a 37 °C durante 1 h. Las células se centrifugaron (3 minutos a 300xg) y se añadieron 25 j l de sobrenadante a 100 j l de microscint en una optiplate blanca de 96 pocillos (PerkinElmer) para su incubación en un agitador (750 rpm) durante 15 minutos. La liberación de 51 Cr se determinó como cuentas por minuto (cpm) en un contador de centelleo. La lisis máxima (100 %) se determinó por el nivel de 51Cr medido en el sobrenadante de las células tratadas con Triton X-100. La lisis espontánea se determinó por el nivel de 51Cr medido en el sobrenadante de las células incubadas sin anticuerpos. La lisis celular específica se calculó según la fórmula: Lisis específica = 100 x (cpm muestra - cpm espontánea) / (cpm máxima - cpm espontánea).

La Figura 19 muestra que IgG1-2F8-E345R/F405L puede lisar las células A431 mediante CDC, mientras que el 2F8 natural no puede destruir las células A431. Estos datos muestran que la actividad CDC se puede recuperar en el anticuerpo EGFR 2F8 mediante la introducción de la mutación E345R. Esto amplía potencialmente la aplicabilidad de la mutación E345R potenciadora de CDC en anticuerpos dirigidos a antígenos de tumores sólidos.

El anticuerpo biespecífico EGFRxCD20 IgG-2F8-E345R/F405L x IgG1-7D8-E345R/K409R, mostró una mayor potenciación de la CDC en células A431 positivas para EGFR y negativas para CD20.

Estos datos respaldan adicionalmente la hipótesis de que la monovalencia facilita la formación de interacciones Fc-Fc y la posterior inducción de CDC como se postula para un anticuerpo de unión a CD38 descrito en el Ejemplo 22.

Ejemplo 25

E345R mejora o recupera la CDC por el anticuerpo 003 de CD38 y los anticuerpos 11B8 y rituximab de CD20 Tal como se describe en los Ejemplos 6, 10 y 24, E345R potencia o induce la actividad CDC de varios anticuerpos con diferentes especificidades de diana (CD20, CD38 y EGFR), como se ha estudiado para múltiples líneas celulares que expresan niveles variables de dichos antígenos. Por lo tanto, la introducción de la mutación E345R se consideró un mecanismo general para mejorar o recuperar la CDC de los anticuerpos existentes. Para respaldar adicionalmente esta afirmación, el efecto de la mutación E345R sobre la CDC se estudió en más anticuerpos con eficacia intrínseca variable en células Daudi y Wien133: el anticuerpo 003 de CD38, descrito en el documento WO 2006/099875 y los anticuerpos de CD20 rituximab (tipo I) y 11^b8 (tipo II), descritos en el documento WO 2005/103081. Los anticuerpos de CD20 pueden dividirse en dos subgrupos (Beers et al. Seminars in Hematology 47, (2) 2010, 107-114). Los anticuerpos CD20 de tipo I muestran una notable capacidad para activar el complemento e inducir la CDC mediante la redistribución de las moléculas CD20 de la membrana plasmática en balsas lipídicas, que agrupan las regiones Fc del anticuerpo y que permiten una mejor unión de C1q. Los anticuerpos CD20 de tipo II no modifican de forma apreciable la distribución de CD20 y sin agrupación concomitante, son relativamente ineficaces para CDC.

Se preincubaron 0,1 x106 células Daudi o Raji en placas de 96 pocillos de fondo redondo con una serie de concentraciones de anticuerpos no purificados (0,001, 0,003, 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1,0, 3,0, 10,0 |jg/ml) en un volumen total de 70 j l durante 15 minutos en un agitador a TA. A continuación, se añadieron 30 j l de suero humano normal como fuente de C1q (concentración final 30 %) y se incubaron en una incubadora a 37 °C durante 45 min. La reacción se detuvo poniendo las placas sobre hielo. Se añadieron 10 j l de yoduro de propidio y se determinó la lisis celular mediante FACS.

La Figura 20 muestra que la mutación E345R mejoró la CDC para todos los anticuerpos estudiados tanto en las células (A) Daudi como (B) Wien133. Curiosamente, a las concentraciones utilizadas todos los anticuerpos que no indujeron la CDC en el formato natural, indujeron eficazmente la CDC tras la introducción de la mutación E345R: el mAb 003 de CD38 y el MAb 11B8 de CD20 de tipo II en células Daudi, los mAb 005 y 003 de CD38 y el mAb 11B8 de CD20 de tipo II en células Wien133. Estos datos sugieren que la potenciación de la oligomerización de los anticuerpos, más específicamente mediante la introducción de una mutación E345R, es un mecanismo general para mejorar o recuperar la CDC en los anticuerpos existentes.

Ejemplo 26

E345R mejora la internalización de los anticuerpos del factor tisular

Para ensayar si una mayor oligomerización puede inducir una mayor internalización del anticuerpo, los estudios de colocalización de los anticuerpos contra al factor tisular (TF) tanto naturales como con mutaciones de E345R, con el marcador lisosómico LAMP1 se realizaron mediante microscopía confocal.

Se cultivaron células SK-OV-3 en cubreobjetos de vidrio (espesor de 1,5 micrómetros, Thermo Fisher Scientific, Braunschweig, Alemania) en medio de cultivo de tejidos estándar a 37 °C durante 1 día. Las células se preincubaron durante 1 hora con 50 jg/ml de leupeptina (Sigma) para bloquear la actividad lisosómica, tras lo cual se añadieron 10 jg/ml de anticuerpo contra el factor tisular (TF) (documento WO 2010/066803). Las células se incubaron durante 1, 3 o 16 horas más a 37 °C. A partir de ahora, las células se lavaron con PBS y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente (TA) con formaldehído al 4 % (Klinipath). Los portaobjetos se lavaron con tampón de bloqueo (PBS complementado con 0,1 % de saponina [Roche] y BSA al 2 % [Roche]) y se incubaron durante 20 minutos con tampón de bloqueo que contenía NH4Cl 20 mM para inactivar el formaldehído. Los portaobjetos se lavaron de nuevo con tampón de bloqueo y se incubaron durante 45 minutos a temperatura ambiente con un cóctel de anticuerpo de ratón dirigido contra CD107a-APC humano (BD Pharmingen) para identificar el LAMP1 lisosómico y de anticuerpo de cabra dirigido contra IgG-FITC humano (Jackson) para identificar los anticuerpos TF. Los portaobjetos se lavaron de nuevo con tampón de bloqueo y se montaron durante la noche en portaobjetos de microscopio con 20 j l de medio de montaje (se disolvieron 6 gramos de glicerol [Sigma] y 2,4 gramos de Mowiol 4-88 [Omnilabo] en 6 ml de agua destilada a los que se añadieron 12 ml de Tris 0,2^m[Sigma] pH8,5 y se incubaron durante 10 minutos a 50-60 °C; el medio de montaje se dividió en alícuotas y se almacenó a -20 °C). Los portaobjetos se fotografiaron con un microscopio confocal Leica SPE-II (Leica Microsystems) equipado con un objetivo de inmersión en aceite 63x 1,32 0,6 y el programa informático LAS-AF.

las imágenes TIFF en escala de grises de 12 bits se analizaron para determinar colocalización utilizando el programa informático MetaMorph® (versión Meta Series 6.1, Molecular Devices Inc, Sunnyvale California, EE.UU.). Las imágenes se importaron como pilas y se restó el fondo. Se utilizaron ajustes umbral idénticos (fijados manualmente) para todas las imágenes FITC y todas las imágenes APC. La colocalización se representó como la intensidad de píxeles de FITC en la región de interés (ROI), donde la ROI se compone de todas las regiones positivas para APC. Para comparar diferentes portaobjetos teñidos con diferentes anticuerpos TF, las imágenes se normalizaron utilizando la intensidad de los píxeles de APC. Se utilizó anticuerpo de ratón dirigido contra CD107a-APC humano para teñir el marcador lisosómico LAMP1 (CD107a). La intensidad de los píxeles de LAMP1 no debería diferir entre los distintos anticuerpos TF fotografiados.

Los valores normalizados de colocalización de FITC y APC se expresan en unidades arbitrarias según la fórmula [(TPI FITC x porcentaje de colocalización)/100] x [1/TPI APC]

Porcentaje de colocalización = TPI FITC que se colocaliza con un píxel APC/TPI APC TPI, intensidad de píxeles total

La Figura 21 representa la cantidad de intensidad de píxeles FITC de los anticuerpos TF naturales y con la mutación E345R que se solapan con el marcador lisosómico marcado con APC. Para cada anticuerpo o condición estudiada, se analizaron tres imágenes diferentes de un portaobjetos que contenía ~ 1, 3 o >5 células. Se observó una variación entre las diferentes imágenes para cada portaobjetos. Aun así, fue evidente que la mutación E345R para los anticuerpos 011 y 098 daba como resultado un aumento de la colocalización lisosómica después de 1 hora de incubación, en comparación con los 011 y 098 naturales. Estos resultados indican que la mutación E345R induce una intemalización más rápida y una colocalización lisosómica y, por lo tanto, podría potenciar los conjugados anticuerpo-fármaco.

Ejemplo 27

Aumento de la CDC por la mutación E345R en rituximab para diferentes líneas de linfocitos B con una expresión similar de CD20 pero con diferentes niveles de proteínas reguladoras del complemento unidas a la membrana

Los Ejemplos 25 y 28 muestran que la eficacia CDC del rituximab natural en células Daudi y Wien133 se vio reforzada al introducir la mutación E345R. Esta mayor eficacia de la CDC se debe a la estabilización de las interacciones Fc-Fc mediada por el E345R. La estructura anular del anticuerpo formada concomitantemente en la membrana de la célula diana puede así fomentar la generación eficaz del complejo de ataque a la membrana facilitando la captura y concentración de los componentes del complemento activado cerca de la membrana celular. Como resultado de esta eficaz activación del complemento, los efectos inhibidores de las proteínas reguladoras del complemento unidas a la membrana (mCRP) podrían superarse en parte. La sobreexpresión de los mCRP, tales como CD55, CD46 y CD59, se considera una barrera para el éxito de la inmunoterapia con anticuerpos monoclonales antitumorales (Jurianz et al., Mol Immunol 199936:929-39; Fishelson et al. Mol Immunol 200340:109-23, Gorter et al., Immunol Today 199920:576-82, Zell et al., Clin Exp Immunol. diciembre de 2007;150(3):576-84). Por lo tanto, la eficacia de rituximab-E345R se comparó con la de rituximab natural en una serie de líneas de linfocitos B con diferentes niveles de los mCRP CD46, CD55 y CD59, pero con niveles comparables de expresión de la diana CD20.

Las líneas de linfocitos B Daudi, WIL2-S, WSU-NHL, MEC-2 y ARH-77 expresan cantidades comparables de moléculas CD20 (~250.000 de capacidad específica de unión a anticuerpos - sABC), según lo determinado por análisis QIFIKIT (no se muestran los datos). Para comparar los niveles de expresión de las proteínas reguladoras del complemento entre estas líneas celulares, se realizó un análisis QIFIKIT para determinar los niveles de CD46 (anticuerpo de ratón contra CD46 humano, CBL488, clon J4.48 Chemicon), CD55 (anticuerpo de ratón contra CD55 humano, CBL511, Clon BRIC216, Chemicon), y CD59 (anticuerpo de ratón contra CD59 humano, MCA1054x, clon MEM-43, Serotec).

Para el ensayo de CDC, se preincubaron 0,1 x106 células en placas de 96 pocillos de fondo redondo con una serie de concentraciones de anticuerpos saturantes (0,002-40,0 pg/ml en diluciones cuádruples) en un volumen total de 100 pl durante 15 minutos en un agitador a TA. A continuación, se añadieron 25 pl de suero humano normal como fuente del complemento (concentración final 20 %) y se incubaron en una incubadora a 37 °C durante 45 min. La reacción se detuvo poniendo las placas sobre hielo. Se añadieron 10 pl de yoduro de propidio y se determinó la lisis celular mediante FACS. La destrucción mediada por CDC máxima se calculó a partir de dos experimentos independientes utilizando la parte superior de los valores de mejor ajuste de un ajuste no lineal en GraphPad PRISM 5.

La Figura 22A-D muestra que la introducción de E345R en el rituximab natural dio como resultado una mayor eficacia de la CDC, como se observa por un aumento de la lisis máxima y una disminución de la CE50 para todas las líneas de linfocitos B estudiadas.

La Figura 22E muestra que la destrucción mediada por CDC máxima inducida por el mutante rituximab-E345R fue siempre mayor que por el rituximab natural, independientemente de los niveles de expresión de las proteínas reguladoras del complemento unidas a la membrana. Estos datos indican que la introducción de E345R aumenta el potencial terapéutico de los anticuerpos monoclonales, ya que las células tumorales son menos eficaces para evadir el ataque del complemento mediado por los anticuerpos que contienen E345R.

Ejemplo 28

Comparación de la cinética CDC para los anticuerpos naturales y E345R

Se ha demostrado que la introducción de la mutación E345R estabilizadora de la interacción Fc:Fc mejora o recupera la CDC, como se observa por la disminución de los valores de CE50 y el aumento de la lisis máxima para diferentes anticuerpos en diferentes líneas celulares descritas en el Ejemplo 6 (anticuerpo 7D8 de CD20 en Daudi y Raji), Ejemplo 10 (anticuerpo 005 de CD38 en Daudi, Raji y Wien133) y Ejemplo 25 (anticuerpo 003 de CD38 y anticuerpos rituximab y 11B8 de CD20 en Daudi y Wien133). A continuación, se analizó la cinética de las reacciones de CDC para desentrañar mejor la diferencia de eficacia de CDC entre los anticuerpos naturales y los E345R.

Se preincubaron 0,1 x106 células Raji en placas de 96 pocillos de fondo redondo con el anticuerpo a una concentración de saturación (10,0 pg/ml) en un volumen total de 100 pl durante 15 minutos en un agitador a TA. A continuación, se añadieron 25 pl de suero humano normal como fuente del complemento (concentración final 20 %) y se incubaron en un incubadora a 37 °C durante diferentes períodos de tiempo, comprendidos entre 0 y 60 min. La reacción se detuvo poniendo las placas sobre hielo. Se añadieron 10 |jl de yoduro de propidio y se determinó la lisis celular mediante FACS.

La Figura 23A muestra que el anticuerpo de CD20 natural IgG1-7D8 mostró una eliminación máxima mediada por CDC del 80 % de las células Raji, que se alcanzó incluso después de 5 minutos en las condiciones estudiadas. Sin embargo, para 7D8-E345R, se observó una destrucción del 80 % delas células Raji aún más rápida, después de 3 minutos. La lisis máxima por IgG-7D8-E345R (95 %) también se alcanzó después de 5 minutos.

La Figura 23B muestra que también para el anticuerpo CD20 natural rituximab, que es menos potente que el 7D8 para inducir la CDC en las células Raji utilizadas, la introducción de la mutación E345R dio como resultado una eliminación más rápida de las células diana. El rituximab natural mostró una destrucción mediada por CDC máxima del 32 %, que se alcanzó después de 20 minutos. Rituximab-E345R alcanzó un 32 % de destrucción incluso después de aproximadamente 3 minutos y de forma notable, la lisis máxima por rituximab-E345R (85 %) también se alcanzó a los 20 minutos.

La Figura 23C+D muestra que las células Raji utilizadas, que son resistentes a la destrucción mediada por CDC para los anticuerpos de c D38 naturales IgGl-003 e IgG1-005, se podrían destruir rápidamente mediante la introducción de la mutación E345R. IgG1-003-E345R e IgG1-005-E345R mostraron una CdC máxima (50 % y 60 %, respectivamente) incluso después de 5 minutos.

En resumen, los anticuerpos E345R son más potentes que sus homólogos naturales, lo que es resultado de una combinación de mayor eficacia (menor CE50), mayor lisis máxima y una cinética de la reacción CDC más rápida. Ejemplo 29

Comparación de la cinética CDC de los anticuerpos biespecíficos con o sin la mutación E345R

En el Ejemplo 23 se describe que la mutación E345R puede aplicarse al anticuerpo biespecífico CD38xCD20 IgG1-005-F405L x IgG1-7D8-K409R que se generó con la plataforma DuoBody, dando como resultado una mayor capacidad de destrucción, como se observa por la disminución en el valor CE50 en los ensayos CDC con células Raji y Wien133. A continuación, se analizó la cinética de la reacción CDC para desentrañar la diferencia de eficacia CDC entre los anticuerpos biespecíficos CD38xCD20 con y sin E345R.

Se preincubaron 0,1 x106 células Raji en placas de 96 pocillos de fondo redondo con el anticuerpo a una concentración de saturación (10,0 jg/ml) en un volumen total de 100 j l durante 15 minutos en un agitador a TA. A continuación, se añadieron 25 j l de suero humano normal como fuente del complemento (concentración final 20 %) y se incubaron en un incubadora a 37 °C durante diferentes períodos de tiempo, comprendidos entre 0 y 60 min. La reacción se detuvo poniendo las placas sobre hielo. Se añadieron 10 j l de yoduro de propidio y se determinó la lisis celular mediante FACS.

La Figura 24 muestra que el anticuerpo biespecífico IgG1-005-F405L x IgG1-7D8-K409R indujo una destrucción mediada por CDC máxima del 83 %, que se alcanzó después de 10 minutos. La introducción de E345R dio como resultado un aumento de la destrucción máxima por IgG1-005-E345R-F405L x IgG1-7D8-E345R-K409R (98 %), que se alcanzó incluso después de 2 minutos. Estos datos indican que la introducción de la mutación E345R estabilizadora de Fc-Fc en el anticuerpo biespecífico da como resultado una destrucción mediada por CDC acelerada de las células diana.

Ejemplo 30

Comparación de la cinética CDC entre anticuerpos de unión monovalente con y sin E345R

El Ejemplo 22 muestra que la unión a la diana monovalente mejoró aún más la eficacia CDC de los anticuerpos E345r , como se observó por el aumento de la lisis máxima con un anticuerpo biespecífico CD38xEGFR en células Wien133 positivas para CD38 y negativas para EGFR. A continuación, se analizó la cinética de la reacción CDC para desentrañar la diferencia en la capacidad de destrucción mediada por CDC entre anticuerpos de unión monovalente con y sin E345R.

Los anticuerpos biespecíficos CD38xEGFR y CD20xEGFR, con o sin la mutación E345R, se generaron in vitro de acuerdo con la plataforma DuoBody como se ha descrito en el Ejemplo 22. La eficacia CDC de los anticuerpos biespecíficos CD38xEGFR se estudió en células Raji positivas para CD38 y negativas para EGFR, a las que los anticuerpos biespecíficos solo pueden unirse de forma monovalente a través de CD38. Se preincubaron 0,1 x106 células Raji en placas de 96 pocillos de fondo redondo con el anticuerpo a una concentración de saturación (10,0 jg/ml) en un volumen total de 100 j l durante 15 minutos en un agitador a TA. A continuación, se añadieron 25 j l de suero humano normal como fuente del complemento (concentración final 20 %) y se incubaron en un incubadora a 37 °C durante diferentes períodos de tiempo, comprendidos entre 0 y 60 min. La reacción se detuvo poniendo las placas sobre hielo. Se añadieron 10 j l de yoduro de propidio y se determinó la lisis celular mediante FAC^s.

La Figura 25 muestra que el anticuerpo biespecífico CD38xEGFR(IgG1-005-K409R x IgG1-2F8-F405L) indujo una destrucción mediada por CDC máxima del 55%, que se alcanzó después de aproximadamente 10 minutos. La introducción de E345R dio como resultado un aumento de la mortalidad máxima (96 %), que se alcanzó incluso en un plazo de 5 minutos.

La Figura 25 muestra que el anticuerpo biespecífico CD20xEGFR(IgG1-7D8-K409R x IgG1-2F8-F405L) indujo una destrucción mediada por CDC máxima del 85 %, que se alcanzó después de aproximadamente 5 minutos. Sin embargo, para el anticuerpo CD20xEGFR con E345R introducida, se observó una lisis del 85 % más rápida, después de 2 minutos. La lisis máxima por el anticuerpo E345R CD20xEGFR (97 %) también se alcanzó después de 5 minutos.

En resumen, la introducción de la mutación E345R en estos anticuerpos de unión monovalente dio como resultado anticuerpos más potentes, lo que es resultado de una combinación de mayor lisis máxima y una cinética de la reacción CDC más rápida.

Ejemplo 31

CDC mediante una combinación de anticuerpos terapéuticos y E345R/Q386K

Como se describe en el Ejemplo 19, los anticuerpos de CD38 mutantes derivados de IgG1-005 podían inducir una CDC eficaz en las células Wien133 cuando la posición E345 del anticuerpo natural se sustituía por cualquier aminoácido distinto del glutamato (E). Esto sugiere que la oligomerización, como requisito previo de la CDC, se ve obstaculizada por la presencia de la cadena lateral del glutamato en la posición 345 del anticuerpo. Dado que el E345 de un Fc está muy cerca del Q386 de la segunda molécula orientada hacia Fc en la estructura de anillo del anticuerpo hexamérico, el impedimento de la oligomerización mediado por el E345 en un primer anticuerpo podría eliminarse mediante sustituciones en la posición Q386 de un segundo anticuerpo. Esto permitiría que el E345 del primer anticuerpo interactuara mejor con la posición 386 mutada del segundo anticuerpo en caso de que se combinen ambos anticuerpos. Para analizar esta hipótesis, se realizaron ensayo CDC en Wien133, en la que los anticuerpos naturales (IgG1-003, IgG1-005 o IgG1 -11B8) se mezclaron con IgG1-005-E345R/Q386K o IgG1-005-E345R/Q386K/E430G, como ejemplo.

Se preincubaron 0,1 x106 células Wien133 en placas de 96 pocillos de fondo redondo con una serie de concentraciones de IgG1-005-E345R/Q386K sin purificar, IgG1-005-E345R/Q386K/E430G o el anticuerpo de control (0,0001-20,0 |jg/ml en diluciones de 3,33 veces) en presencia o ausencia de 1,0 o 10,0 jg/ml de anticuerpo natural IgG1-003, IgG1-005 o IgG1-11B8, en un volumen total de 100 j l durante 15 minutos en un agitador a TA. A continuación, se añadieron 25 j l de suero humano normal como fuente del complemento (concentración final 20 %) y se incubaron en una incubadora a 37 °C durante 45 min. La reacción se detuvo poniendo las placas sobre hielo. Se añadieron 10 j l de yoduro de propidio y se determinó la lisis celular mediante FACS.

La Figura 26A/B/C muestra que el anticuerpo IgG1-005-E345R/Q386K de CD38 indujo la lisis mediada por CDC en células Wien133 de forma dependiente de la dosis (línea discontinua). La combinación de IgG1-005-E345R/Q386K con 1 o 10 jg/ml del anticuerpo IgG1-003 de C^d38 natural (Figura 26A) o del anticuerpo IgG1-11B8 de CD20 natural (Figura 26B) dio como resultado un aumento de la lisis celular máxima. La combinación de IgG1-005-E345R/Q386K con IgG1-005 natural inhibió la CDC de forma dependiente de la dosis, posiblemente compitiendo por el sitio de unión (Figura 26C).

La Figura 26D/E/F muestra resultados similares para el anticuerpo IgG1-005-E345R/Q386K/E430G de CD38.

Estos datos indican que los anticuerpos IgG1-003 e IgG1-11B8 naturales participaron en la oligomerización de los anticuerpos y en la activación de CDC cuando se combinaron con IgG1-005-E345R/Q386K o IgG1-005-E345R/Q386K/E430G. En tales combinaciones, el impedimento de la oligomerización de debido a la posición E345 que está presente en el anticuerpo natural se podría eliminar, al menos en parte, mediante la sustitución Q386K en el anticuerpo mutante. Esta aplicación es especialmente interesante para mejorar las terapias con anticuerpos naturales en la posición E345, tales como rituximab, ofatumumab, daratumumab o trastuzumab. También, estos anticuerpos inductores de la oligomerización podrían fomentar la formación de complejos de unión celular con los anticuerpos propios del paciente dirigidos contra células diana, como las células tumorales o las bacterias.

El Ejemplo 19 describe múltiples aminoácidos, además del E345, que mejoran la CDC tras la mutación, por ejemplo E430 y S440, cuyas mutaciones específicas indujeron una CDC eficaz en células Wien133 cuando se incorporaron al anticuerpo CD38 IgG1-005. A excepción de los mutantes 1253 e Y436, las mutaciones identificadas potenciadoras de la oligomerización entran en contacto con aminoácidos no mutados en la segunda molécula orientada hacia Fc en la estructura de anillo hexamérico. Por lo tanto, se podría esperar que las mutaciones identificadas potenciadoras de la oligomerización, tanto en solitario como combinadas, también fomentaran la oligomerización con anticuerpos no mutados, y podría lograrse una mayor optimización de tales mutantes mediante una estrategia de selección similar a la aplicada en el Ejemplo 19.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende una primera variante de un anticuerpo precursor, en donde la primera variante es un anticuerpo humano de longitud completa, y una segunda variante de un anticuerpo precursor, en donde la segunda variante es un anticuerpo humano de longitud completa, en donde la primera variante comprende un primer dominio Fc de una inmunoglobulina y una región de unión a antígeno, en donde la segunda variante comprende un segundo dominio Fc de una inmunoglobulina y una región de unión a antígeno, y en donde dicha primera variante y la segunda variante comprenden una mutación que corresponde a E430G en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana y dicha primera variante comprende una mutación que corresponde a K439E en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, y dicha segunda variante comprende una mutación que corresponde a S440K en la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, en donde las posiciones de aminoácidos se numeran de acuerdo con el índice Eu y en donde la primera y la segunda variante comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 % de grado de identidad con los restos de aminoácidos 130 a 330 de la SEQ ID NO 1 o 5, en donde la primera y la segunda variantes pueden emparejarse entre sí; proporcionando una unión a C1q restaurada o aumentada, activación del complemento y/o ^cD^c, para el par de variantes de anticuerpos específicos, en comparación con cada variante en solitario o con una mezcla del anticuerpo precursor o anticuerpos precursores.

2. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en donde cada una de la primera variante y la segunda variante es un anticuerpo IgG1 humano de longitud completa.

3. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde la primera variante y la segunda variante se seleccionan de un anticuerpo monoespecífico, anticuerpo biespecífico o anticuerpo multiespecífico.

4. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la primera y la segunda variantes se unen a diferentes epítopos del mismo antígeno o a diferentes antígenos.

5. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde una o ambas de la primera variante y la segunda variante se conjugan con un fármaco, toxina o radiomarcador, tal como por ejemplo, en donde una o ambas de la primera variante y la segunda variante se conjugan con una toxina a través de un enlazador.

6. Una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y un transportador farmacéuticamente aceptable.

7. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para su uso en un método para el tratamiento de una enfermedad, tal como el cáncer.