JP7509716B2 - 抗体変異体およびその使用 - Google Patents
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Description
本発明は、変異型Fcドメインを含むポリペプチドおよび関連する抗体に関する。より詳細には、本発明は、Fcドメインにおける1つまたは複数のアミノ酸改変に起因する改変されたエフェクター機能を有する、Fcドメインを含有する抗体またはポリペプチドに関する。
抗体のFc領域によって媒介されるエフェクター機能は、病原体の死滅ならびに抗原の排除および分解といった、外来性実体の破壊を可能にする。抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用(ADCC)および抗体依存性細胞媒介性食作用(ADCP)は、Fc受容体(FcR)を保有する細胞にFc領域が結合することによって惹起され、一方、補体依存性細胞傷害作用(CDC)は、補体活性化の古典的経路を惹起するC1qにFc領域が結合することによって惹起される。
免疫グロブリンのFcドメインと結合領域とを含む親ポリペプチドのエフェクター機能を増強する方法であって、該親ポリペプチドに対して、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345、E430、S440、Q386、P247、I253、S254、Q311、D/E356、T359、E382、Y436およびK447に対応するものから選択される少なくとも1つのアミノ酸残基に変異を導入する段階を含み、ただし、S440における変異がS440YまたはS440Wであることを条件とする、方法。
[本発明1002]
親抗体のエフェクター機能を増強する方法であって、該親抗体に対して、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345、E430、S440、Q386、P247、I253、S254、Q311、D/E356、T359、E382、Y436およびK447に対応するものから選択される少なくとも1つのアミノ酸残基に変異を導入する段階を含み、ただし、S440における変異がS440YまたはS440Wであることを条件とする、本発明1001の方法。
[本発明1003]
免疫グロブリンのFcドメインと結合領域とを含む親ポリペプチドのエフェクター機能を低下させる方法であって、該親ポリペプチドに対して、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439およびS440に対応するものから選択される1つのアミノ酸残基に変異を導入する段階を含み、ただし、S440における変異がS440YでもS440Wでもないことを条件とし、例えば、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439に対応する位置での変異がK439D/Eであり、かつ/またはヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する位置での変異がS440K/H/Rである、方法。
[本発明1004]
親抗体のエフェクター機能を低下させる方法であって、該親抗体に対して、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439およびS440に対応するものから選択される1つのアミノ酸残基に変異を導入する段階を含み、ただし、S440における変異がS440YでもS440Wでもないことを条件とし、例えば、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439に対応する位置での変異がK439D/Eであり、かつ/またはヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する位置での変異がS440K/H/Rである、本発明1003の方法。
[本発明1005]
前記親抗体が単一特異性、二重特異性または多重特異性抗体である、本発明1002または1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
前記親抗体が、免疫グロブリンの第1のCH2-CH3領域と第1の抗原結合領域とを含む第1のポリペプチド、および免疫グロブリンの第2のCH2-CH3領域と第2の抗原結合領域とを含む第2のポリペプチドを含む二重特異性抗体であり、該第1および第2の抗原結合領域が同じ抗原上または異なる抗原上の異なるエピトープと結合し、該第1のCH2-CH3領域がヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK409、T366、L368、K370、D399、F405およびY407に対応するものから選択される位置にさらなるアミノ酸置換を含み;該第2のCH2-CH3領域がヒトIgG1重鎖のFc領域におけるF405、T366、L368、K370、D399、Y407およびK409に対応するものから選択される位置にさらなるアミノ酸置換を含み、かつ該第1のCH2-CH3領域における該さらなるアミノ酸置換が該第2のCH2-CH3領域における該さらなるアミノ酸置換とは異なる、本発明1005の方法。
[本発明1007]
前記親抗体が二重特異性抗体でありかつ第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドを含み、該第1のポリペプチドが免疫グロブリンの第1のCH2-CH3領域と第1の抗原結合領域とを含み、該第2のポリペプチドが免疫グロブリンの第2のCH2-CH3領域と第2の抗原結合領域とを含み、該第1および第2の抗原結合領域が同じ抗原上または異なる抗原上の異なるエピトープと結合し、前記方法が、該第1および第2のCH2-CH3領域のそれぞれに対して、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345、E430、S440、Q386、P247、I253、S254、Q311、D/E356、T359、E382、Y436およびK447に対応するものから選択される少なくとも1つのアミノ酸残基に変異を導入する段階を含み、ただし、S440における変異がS440YまたはS440Wであることを条件とする、本発明1005または1006の方法。
[本発明1008]
S440およびK447以外の1つまたは複数の位置に変異を導入する段階、ならびに
(i)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439およびS440に対応するアミノ酸残基のそれぞれにおける変異であって、ただし、S440における変異がS440YでもS440Wでもないことを条件とする、変異、
(ii)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447および448に対応するアミノ酸残基のそれぞれにおける変異、例えばヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447K/R/Hおよび448E/D、好ましくはヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447Kおよび448E、または
(iii)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447、448および449に対応するアミノ酸残基のそれぞれにおける変異、例えばヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447D/E、448K/R/Hおよび449P、好ましくはヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447E、448Kおよび449P
をさらに導入する段階を含む、本発明1001~1002および1005~1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
S440以外の1つまたは複数の位置に変異を導入する段階、ならびにヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439およびS440に対応するアミノ酸残基のそれぞれに変異をさらに導入する段階を含み、ただし、S440における変異がS440YでもS440Wでもないことを条件とする、本発明1008の方法。
[本発明1010]
ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439に対応する位置での変異がK439D/Eであり、かつ/またはヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する位置での変異がS440K/H/Rである、本発明1009の方法。
[本発明1011]
少なくとも第1および第2の親ポリペプチドの組み合わせのエフェクター機能を増強する方法であって、該少なくとも第1および第2の親ポリペプチドがそれぞれ免疫グロブリンのFcドメインと結合領域とを含み、該方法が、
(i)該少なくとも第1および/または第2の親ポリペプチドに対して、
(a)アロステリック変異をもたらすCH2-CH3領域内のアミノ酸残基、
(b)CH2-CH3領域の疎水性ノブ内のアミノ酸残基、
(c)N末端CH3ヘリックス内のアミノ酸残基、
(d)C末端CH3 β-ストランド内のアミノ酸残基であって、ただし、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する変異の場合には該変異がS440YまたはS440Wであることを条件とする、アミノ酸残基、および
(e)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345、E382またはQ386に対応するアミノ酸残基
からなる群より選択される1つまたは複数のアミノ酸残基に変異を導入する段階を含む、方法。
[本発明1012]
少なくとも第1および第2の親抗体の組み合わせのエフェクター機能を増強する方法であって、該少なくとも第1および第2の親抗体がそれぞれ免疫グロブリンのFcドメインと抗原結合領域とを含み、該方法が、
(i)該少なくとも第1および/または第2の親抗体に対して、
(a)アロステリック変異をもたらすCH2-CH3領域内のアミノ酸残基、
(b)CH2-CH3領域の疎水性ノブ内のアミノ酸残基、
(c)N末端CH3ヘリックス内のアミノ酸残基、
(d)C末端CH3 β-ストランド内のアミノ酸残基であって、ただし、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する変異の場合には該変異がS440YまたはS440Wであることを条件とする、アミノ酸残基、および
(e)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345、E382またはQ386に対応するアミノ酸残基
からなる群より選択される1つまたは複数のアミノ酸残基に変異を導入する段階を含む、本発明1011の方法。
[本発明1013]
前記少なくとも第1および/または第2の親抗体における変異が、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345、E430、S440、Q386、P247、I253、S254、Q311、D/E356、T359、E382、Y436およびK447に対応するものから選択される少なくとも1つのアミノ酸残基にあり、ただし、S440における変異がS440YまたはS440Wであることを条件とする、本発明1012の方法。
[本発明1014]
前記第1および第2の親抗体の両方に変異を導入する段階を含む、本発明1012または1013の方法。
[本発明1015]
(i)前記第1の親抗体に対して、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345、E430、S440、Q386、P247、I253、S254、Q311、D/E356、T359、E382、Y436およびK447に対応するものから選択される少なくとも1つのアミノ酸残基に変異を導入する段階であって、ただし、S440における変異がS440YまたはS440Wであることを条件とする、段階、
(ii)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345、E430、S440、Q386、P247、I253、S254、Q311、D/E356、T359、E382、Y436およびK447に対応するものから選択されるアミノ酸残基に変異を含まない前記第2の親抗体を用意する段階
を含む、本発明1012の方法。
[本発明1016]
S440以外の1つまたは複数の位置に変異を導入する段階を含み、かつ、以下の段階をさらに含む、本発明1012~1015のいずれかの方法:
(i)前記第1の親抗体に対して、ヒトIgG1重鎖のFc領域における位置K439に対応するアミノ酸残基に第2の変異を導入する段階;および
(ii)前記第2の親抗体に対して、ヒトIgG1重鎖のFc領域における位置S440に対応するアミノ酸残基に第2の変異を導入する段階であって、ただし、S440における変異がS440YでもS440Wでもないことを条件とする、段階;ここで段階(ii)および(iii)は代替的に以下であってもよい:
(i)前記第1の親抗体に対して、ヒトIgG1重鎖のFc領域における位置S440に対応するアミノ酸残基に第2の変異を導入する段階であって、ただし、S440における変異がS440YでもS440Wでもないことを条件とする、段階;および
(ii)前記第2の親抗体に対して、ヒトIgG1重鎖のFc領域における位置K439に対応するアミノ酸残基に第2の変異を導入する段階。
[本発明1017]
ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439に対応する位置での変異がK439D/Eであり、かつヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する位置での変異がS440K/H/Rである、本発明1016の方法。
[本発明1018]
前記少なくとも第1および第2の親抗体がそれぞれ、単一特異性、二重特異性および多重特異性抗体の群から選択されうる、本発明1012~1017のいずれかの方法。
[本発明1019]
前記少なくとも第1および第2の親抗体が、同じ抗原上または異なる抗原上の異なるエピトープと結合する二重特異性または多重特異性抗体である、本発明1018の方法。
[本発明1020]
前記少なくとも第1および第2の親抗体がそれぞれ、免疫グロブリンの第1のCH2-CH3領域と第1の抗原結合領域とを含む第1のポリペプチド、および免疫グロブリンの第2のCH2-CH3領域と第2の抗原結合領域とを含む第2のポリペプチドを含む二重特異性抗体であり、該第1および第2の抗原結合領域が同じ抗原上または異なる抗原上の異なるエピトープと結合し、該第1のCH2-CH3領域がヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK409、T366、L368、K370、D399、F405およびY407に対応するものから選択される位置にさらなるアミノ酸置換を含み;該第2のCH2-CH3領域がヒトIgG1重鎖のFc領域におけるF405、T366、L368、K370、D399、Y407およびK409に対応するものから選択される位置にさらなるアミノ酸置換を含み、かつ該第1のCH2-CH3領域における該さらなるアミノ酸置換が、該第2のCH2-CH3領域における該さらなるアミノ酸置換とは異なる、本発明1018または1019の方法。
[本発明1021]
前記変異が、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345、E430、S440からYまたはW、およびQ386に対応するものから選択される少なくとも1つのアミノ酸残基にあり、好ましくは該変異が、E345のR、Q、NもしくはKへの置換、E430のT、SもしくはGへの置換、S440のYもしくはWへの置換、またはQ386のKへの置換のうちの少なくとも1つのアミノ酸置換である、本発明1001~1002、1005~1007、1011~1015および1018~1020のいずれかの方法。
[本発明1022]
前記親抗体に対して、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345、E430、S440、Q386、P247、I253、S254、Q311、D/E356、T359、E382、Y436およびK447に対応するものから選択される少なくとも2つのアミノ酸残基に変異を導入する段階を含み、ただし、S440における変異がS440YまたはS440Wであることを条件とする、本発明1001~1002、1005~1007、1011~1015および1018~1020のいずれかの方法。
[本発明1023]
前記親抗体に対して、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345、E430、Q386およびS440に対応するものから選択される少なくとも2つのアミノ酸残基に変異を導入する段階を含み、ただし、S440における変異がS440YまたはS440Wであることを条件とし、例えば、該少なくとも2つのアミノ酸における変異が、E345のR、Q、NもしくはKへの変異、E430のT、SもしくはGへの変異、S440のYもしくはWへの変異、またはQ386のKへの変異から選択される、本発明1022の方法。
[本発明1024]
前記エフェクター機能が、C1q結合、補体活性化、補体依存性細胞傷害作用(CDC)、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用(ADCC)、FcRn結合、Fc-γ受容体結合を含むFc受容体結合、プロテインA結合、プロテインG結合、抗体依存性細胞食作用(ADCP)、補体依存性細胞傷害作用(CDCC)、補体増強性細胞傷害作用、オプソニン作用、Fc含有ポリペプチドの細胞内移行、標的ダウンモジュレーション、ADC取り込み、アポトーシスの誘導、細胞死、細胞周期停止、およびそれらの任意の組み合わせから選択されるFc媒介性エフェクター機能である、本発明1001~1023のいずれかの方法。
[本発明1025]
前記抗体がその抗原と結合したときに前記エフェクター機能が増強される、本発明1001~1002および1005~1024のいずれかの方法。
[本発明1026]
前記抗原が、抗原発現細胞、細胞膜またはビリオンの表面にある、本発明1025の方法。
[本発明1027]
以下の段階を含む、免疫グロブリンのFcドメインと結合領域とを含む親ポリペプチドが結合する標的を発現する細胞、細胞膜またはビリオンに対してエフェクター応答を誘導する方法:
(i)本発明1001~1024のいずれかに従って変異させた、1つの親ポリペプチド、または少なくとも第1の親ポリペプチドと第2の親ポリペプチドの組み合わせを用意する段階;および
(ii)段階(i)の変異させた親ポリペプチドまたは段階(i)の変異させた少なくとも第1の親ポリペプチドと第2の親ポリペプチドの組み合わせの調製物を、ヒト補体またはエフェクター細胞の存在下で、抗原を発現する細胞、細胞膜またはビリオンと接触させる段階。
[本発明1028]
以下の段階を含む、親抗体が結合する抗原を発現する細胞、細胞膜またはビリオンに対してエフェクター応答を誘導する本発明1027の方法:
(i)本発明1001~1024のいずれかに従って変異させた、1つの親抗体、または少なくとも第1の親抗体と第2の親抗体の組み合わせを用意する段階;および
(ii)段階(i)の変異させた親抗体または段階(i)の変異させた少なくとも第1の親抗体と第2の親抗体の組み合わせの調製物を、ヒト補体またはエフェクター細胞の存在下で、抗原を発現する細胞、細胞膜またはビリオンと接触させる段階。
[本発明1029]
前記エフェクター応答が、補体依存性細胞傷害作用(CDC)、C1q結合、補体活性化、補体依存性細胞傷害作用(CDC)、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用(ADCC)、FcRn結合、Fc-γ受容体結合を含むFc受容体結合、プロテインA結合、プロテインG結合、抗体依存性細胞食作用(ADCP)、補体依存性細胞傷害作用(CDCC)、補体増強性細胞傷害作用、オプソニン作用、Fc含有ポリペプチドの細胞内移行、標的ダウンモジュレーション、ADC取り込み、アポトーシスの誘導、細胞死、細胞周期停止およびそれらの任意の組み合わせから選択されるFc媒介性エフェクター応答である、本発明1027または1028の方法。
[本発明1030]
以下の段階を含む、免疫グロブリンのFcドメインと結合領域とを含む少なくとも第1および第2の親ポリペプチドの組み合わせの特異性を高める方法:
A)
(i)該第1の親ポリペプチドに対して、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439に対応する位置のアミノ酸残基に変異を導入する段階;および
(ii)該第2の親ポリペプチドに対して、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する位置のアミノ酸残基に変異を導入する段階であって、ただし、S440における変異がS440YでもS440Wでもないことを条件とする、段階;
B)
(i)該第1の親ポリペプチドに対して、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447D/Eに対応する位置のアミノ酸残基に変異を導入する段階;および
(ii)該第2の親ポリペプチドに対して、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447K/R/Hおよび448Pに対応する位置のアミノ酸残基に変異を導入する段階;または
C)
(i)該第1の親ポリペプチドに対して、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447D/Eに対応する位置のアミノ酸残基に変異を導入する段階;および
(ii)該第2の親ポリペプチドに対して、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447K/R/H、448K/R/Hおよび449Pに対応する位置のアミノ酸残基に変異を導入する段階。
[本発明1031]
以下の段階を含む、少なくとも第1および第2の親抗体の組み合わせの特異性を高める本発明1030の方法:
(i)該第1の親抗体に対して、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439に対応する位置のアミノ酸残基に変異を導入する段階;および
(ii)該第2の親抗体に対して、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する位置のアミノ酸残基に変異を導入する段階であって、ただし、S440における変異がS440YでもS440Wでもないことを条件とする、段階。
[本発明1032]
ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439に対応する位置での変異がK439D/Eであり、かつヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する位置での変異がS440K/H/Rである、本発明1031の方法。
[本発明1033]
前記親抗体または第1の親抗体と第2の親抗体の前記組み合わせが、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgDまたはIgEであり、任意でヒト完全長抗体、例えばヒト完全長IgG1抗体である、本発明1001~1032のいずれかの方法。
[本発明1034]
免疫グロブリンのFcドメインと結合領域とを含む親ポリペプチドの変異体であって、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345、E430、S440、Q386、P247、I253、S254、Q311、D/E356、T359、E382、Y436およびK447に対応するものから選択される少なくとも1つのアミノ酸残基に変異を含み、ただし、S440における変異がS440YまたはS440Wであることを条件とする、変異体。
[本発明1035]
抗原結合領域とFcドメインとを含む親抗体の変異体であって、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345、E430、S440、Q386、P247、I253、S254、Q311、D/E356、T359、E382、Y436およびK447に対応するものから選択される少なくとも1つのアミノ酸残基に変異を含み、ただし、S440における変異がS440YまたはS440Wであることを条件とする、本発明1034の変異体。
[本発明1036]
少なくとも1つのアミノ酸残基における前記変異が、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345X、E430X、S440W/Y、Q386K、P247G、I253V、S254L、Q311L/W、D/E356R、E382VおよびY436Iに対応するものから選択され、ここでXが天然型アミノ酸などの任意のアミノ酸である、本発明1035の変異体。
[本発明1037]
少なくとも1つのアミノ酸残基における前記変異が、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345X、E430X、S440W/Y、Q386Kに対応するものから選択され、ここでXが天然型アミノ酸などの任意のアミノ酸である、本発明1036の変異体。
[本発明1038]
少なくとも1つのアミノ酸残基における前記変異が、ヒトIgG1重鎖のFc領域における
E345R/Q/N/K/A/C/D/F/G/H/I/L/M/P/S/T/V/W/Y、
E430T/S/G/A/C/D/F/H/I/L/K/M/N/P/Q/R/V/W/Y、
S440W/Y、および
Q386K
に対応するものから選択される、本発明1037の変異体。
[本発明1039]
少なくとも1つのアミノ酸残基における前記変異が、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345R/Q/N/K、E430T/S/G、S440Y/W、およびQ386Kに対応するものから選択される、本発明1038の変異体。
[本発明1040]
免疫グロブリンのFcドメインと結合領域とを含む親ポリペプチドの変異体であって、
(a)アロステリック変異をもたらすCH2-CH3領域内のアミノ酸残基、
(b)CH2-CH3領域の疎水性ノブ内のアミノ酸残基、
(c)N末端CH3ヘリックス内のアミノ酸残基、
(d)C末端CH3 β-ストランド内のアミノ酸残基であって、ただし、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する変異の場合には該変異がS440YまたはS440Wであることを条件とする、アミノ酸残基、および
(e)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345、E382またはQ386に対応するアミノ酸残基
の群から選択される少なくとも2つのアミノ酸残基に変異を含み、該少なくとも2つのアミノ酸変異が異なる、変異体。
[本発明1041]
抗原結合領域とFcドメインとを含む親抗体の変異体であって、
(a)アロステリック変異をもたらすCH2-CH3領域内のアミノ酸残基、
(b)CH2-CH3領域の疎水性ノブ内のアミノ酸残基、
(c)N末端CH3ヘリックス内のアミノ酸残基、
(d)C末端CH3 β-ストランド内のアミノ酸残基であって、ただし、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する変異の場合には該変異がS440YまたはS440Wであることを条件とする、アミノ酸残基、および
(e)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345、E382またはQ386に対応するアミノ酸残基
の群から選択される少なくとも2つのアミノ酸残基に変異を含み、該少なくとも2つのアミノ酸変異が異なる、本発明1040の変異体。
[本発明1042]
ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345、E430、S440、Q386、P247、I253、S254、Q311、D/E356、T359、E382、Y436およびK447に対応するものから選択される少なくとも2つのアミノ酸残基における変異を含み、ただし、S440における変異がS440YまたはS440Wであることを条件とする、本発明1041の変異体。
[本発明1043]
ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345X、E430X、S440W/Y、Q386K、P247G、I253V、S254L、Q311L/W、D/E356R、E382VおよびY436Iに対応するものから選択される少なくとも2つのアミノ酸残基における変異を含み、ここでXが天然型アミノ酸などの任意のアミノ酸である、本発明1042の変異体。
[本発明1044]
ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345X、E430X、S440W/YおよびQ386Kのものに対応する群から選択される少なくとも2つのアミノ酸残基における変異を含み、ここでXが天然型アミノ酸などの任意のアミノ酸である、本発明1043の変異体。
[本発明1045]
ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345R/Q/N/K/A/C/D/F/G/H/I/L/M/P/S/T/V/W/Y、E430T/S/G/A/C/D/F/H/I/L/K/M/N/P/Q/R/V/W/Y、S440W/Y、およびQ386Kに対応するものから選択される、少なくとも2つのアミノ酸残基における変異を含む、本発明1044の変異体。
[本発明1046]
前記少なくとも2つのアミノ酸残基における前記変異が、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345R/Q/N/K、E430T/S/G、S440Y/W、およびQ386Kに対応するものから選択される、本発明1045の変異体。
[本発明1047]
前記変異がS440およびK447以外の位置にあり、前記変異体が、
(i)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439もしくはS440に対応する少なくとも1つのアミノ酸残基における変異であって、ただし、S440における変異がS440WでもS440Yでもないことを条件とする、変異;
(ii)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447D/Eに対応するか、もしくはK447K/R/Hおよび448Pに対応する、少なくとも1つのアミノ酸残基における変異;または
(iii)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447D/Eに対応するか、もしくはK447K/R/Hおよび448K/R/Hおよび449Pに対応する、少なくとも1つのアミノ酸残基における変異
をさらに含む、本発明1034~1046のいずれかの変異体。
[本発明1048]
前記変異がS440以外の位置にあり、前記変異体が、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439またはS440に対応する少なくとも1つのアミノ酸残基における変異をさらに含み、ただし、S440における変異がS440WでもS440Yでもないことを条件とする、本発明1047の変異体。
[本発明1049]
免疫グロブリンのFcドメインと結合領域とを含む親ポリペプチドの変異体であって、
(a)アロステリック変異をもたらすCH2-CH3領域内のアミノ酸残基、
(b)CH2-CH3領域の疎水性ノブ内のアミノ酸残基、
(c)N末端CH3ヘリックス内のアミノ酸残基、
(d)C末端CH3 β-ストランド内のアミノ酸残基であって、ただし、それがヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する変異を含まないことを条件とする、アミノ酸残基、および
(e)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345、E382またはQ386に対応するアミノ酸残基
の群から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基に変異を含み、かつ
(i)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439またはS440に対応する少なくとも1つのアミノ酸残基におけるさらなる変異であって、ただし、S440における変異がS440WでもS440Yでもないことを条件とする、変異;
(ii)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447D/Eに対応するか、もしくはK447K/R/Hおよび448Pに対応する、少なくとも1つのアミノ酸残基におけるさらなる変異;または
(iii)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447D/Eに対応するか、もしくはK447K/R/Hおよび448K/R/Hおよび449Pに対応する、少なくとも1つのアミノ酸残基におけるさらなる変異
を含む、変異体。
[本発明1050]
抗原結合領域と免疫グロブリンのFcドメインとを含む親抗体の変異体であって、
(a)アロステリック変異をもたらすCH2-CH3領域内のアミノ酸残基、
(b)CH2-CH3領域の疎水性ノブ内のアミノ酸残基、
(c)N末端CH3ヘリックス内のアミノ酸残基、
(d)C末端CH3 β-ストランド内のアミノ酸残基であって、ただし、それがヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する変異を含まないことを条件とする、アミノ酸残基、および
(e)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345、E382またはQ386に対応するアミノ酸残基
の群から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基に変異を含み、かつ
(i)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439またはS440に対応する少なくとも1つのアミノ酸残基におけるさらなる変異であって、ただし、S440における変異がS440WでもS440Yでもないことを条件とする、変異;
(ii)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447D/Eに対応するか、もしくはK447K/R/Hおよび448Pに対応する、少なくとも1つのアミノ酸残基におけるさらなる変異;または
(iii)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447D/Eに対応するか、もしくはK447K/R/Hおよび448K/R/Hおよび449Pに対応する、少なくとも1つのアミノ酸残基におけるさらなる変異
を含む、本発明1049の変異体。
[本発明1051]
IgG1重鎖のFc領域におけるK439およびS440に対応する位置の両方にアミノ酸変異を含み、ただし、S440における変異がS440YでもS440Wでもないことを条件とする、本発明1049または1050の変異体。
[本発明1052]
ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439に対応する位置での変異がK439D/Eであり、かつ/またはヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する位置での変異がS440K/H/Rである、本発明1047~1051のいずれかの変異体。
[本発明1053]
免疫グロブリンのFcドメインと結合領域とを含む親ポリペプチドの変異体であって、
(i)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439およびS440に対応するものから選択される少なくとも1つのアミノ酸残基における変異であって、ただし、S440における変異がS440YでもS440Wでもないことを条件とし、例えば、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439に対応する位置での変異がK439D/Eであり、かつ/もしくはヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する位置での変異がS440K/H/Rである、変異;
(ii)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447D/Eに対応するか、もしくはK447K/R/Hおよび448Pに対応する、少なくとも1つのアミノ酸残基における変異;または
(iii)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447D/Eに対応するか、もしくはK447K/R/Hおよび448K/R/Hおよび449Pに対応する、少なくとも1つのアミノ酸残基における変異
を含む、変異体。
[本発明1054]
抗原結合領域と免疫グロブリンのFcドメインとを含む親抗体の変異体であって、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439およびS440に対応するものから選択される少なくとも1つのアミノ酸残基に変異を含み、ただし、S440における変異がS440YでもS440Wでもないことを条件とし、例えば、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439に対応する位置での変異がK439D/Eであり、かつ/またはヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する位置での変異がS440K/H/Rである、本発明1053の変異体。
[本発明1055]
単一特異性抗体、二重特異性抗体または多重特異性抗体から選択される、本発明1034~1054のいずれかの変異体。
[本発明1056]
免疫グロブリンの第1のCH2-CH3領域と第1の抗原結合領域とを含む第1のポリペプチド、および免疫グロブリンの第2のCH2-CH3領域と第2の抗原結合領域とを含む第2のポリペプチドを含む二重特異性抗体であって、該第1および第2の抗原結合領域が同じ抗原上または異なる抗原上の異なるエピトープと結合し、かつ
該第1および第2のCH2-CH3領域がそれぞれ、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345、E430、S440、Q386、P247、I253、S254、Q311、D/E356、T359、E382、Y436およびK447に対応するものから選択される少なくとも1つのアミノ酸残基に第1の変異を含み、ただし、S440における変異がS440YまたはS440Wであることを条件とする、本発明1055の変異体。
[本発明1057]
前記第1のポリペプチドが、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK409、T366、L368、K370、D399、F405およびY407に対応するものから選択されるアミノ酸残基にさらなる変異を含み;かつ
前記第2のポリペプチドが、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるF405、T366、L368、K370、D399、Y407およびK409に対応するものから選択されるアミノ酸残基にさらなる変異を含み、かつ該第1のポリペプチドにおける該さらなる変異が該第2のポリペプチドにおける該さらなる変異とは異なる、二重特異性抗体である本発明1056の変異体。
[本発明1058]
薬物、毒素または放射性標識と結合体化されており、例えばリンカーを介して毒素と結合体化されている、本発明1034~1057のいずれかの変異体。
[本発明1059]
融合タンパク質の一部である、本発明1034~1057のいずれかの変異体。
[本発明1060]
ヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgDまたはIgE抗体であり、任意でヒト完全長抗体、例えばヒト完全長IgG1抗体である、本発明1034~1059のいずれかの変異体。
[本発明1061]
親ポリペプチドの第1の変異体および親ポリペプチドの第2の変異体を含む組成物であって、該第1の変異体が免疫グロブリンの第1のFcドメインと結合領域とを含み、該第2の変異体が免疫グロブリンの第2のFcドメインと結合領域とを含み、かつ
(i)該第1の変異体がヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439に対応する位置に変異を含み、かつ該第2の変異体がヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する位置に変異を含み、ただし、S440における変異がS440YでもS440Wでもないことを条件とするか、
(ii)該第1の変異体がヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447D/Eに対応する位置に変異を含み;かつ該第2の変異体がヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447K/R/Hおよび448Pに対応する位置に変異を含むか、または
(iii)該第1の変異体がヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447D/Eに対応する位置に変異を含み;かつ該第2の変異体がヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447K/R/H、448K/R/Hおよび449Pに対応する位置に変異を含む、
組成物。
[本発明1062]
親抗体の第1の変異体および親抗体の第2の変異体を含む組成物であって、該第1の変異体が免疫グロブリンの第1のFcドメインと抗原結合領域とを含み、該第2の変異体が免疫グロブリンの第2のFcドメインと抗原結合領域とを含み、かつ
(i)該第1の変異体がヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439に対応する位置に変異を含み、かつ該第2の変異体がヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する位置に変異を含み、ただし、S440における変異がS440YでもS440Wでもないことを条件とするか、
(ii)該第1の変異体がヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447D/Eに対応する位置に変異を含み;かつ該第2の変異体がヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447K/R/Hおよび448Pに対応する位置に変異を含むか、または
(iii)該第1の変異体がヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447D/Eに対応する位置に変異を含み;かつ該第2の変異体がヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447K/R/H、448K/R/Hおよび449Pに対応する位置に変異を含む、
本発明1061の組成物。
[本発明1063]
親抗体の第1の変異体および親抗体の第2の変異体を含む組成物であって、該第1の変異体が免疫グロブリンの第1のFcドメインと抗原結合領域とを含み、該第2の変異体が免疫グロブリンの第2のFcドメインと抗原結合領域とを含み、該第1の変異体がヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439に対応する位置に変異を含み、かつ第2の変異体がS440に対応する位置における変異を含み、ただし、S440における変異がS440YでもS440Wでもないことを条件とする、本発明1062の組成物。
[本発明1064]
前記第1の変異体が免疫グロブリンの第1のFcドメインと抗原結合領域とを含み、該第1の変異体が
(i)
(a)アロステリック変異をもたらすCH2-CH3領域内のアミノ酸残基、
(b)CH2-CH3領域の疎水性ノブ内のアミノ酸残基、
(c)N末端CH3ヘリックス内のアミノ酸残基、
(d)C末端CH3 β-ストランド内のアミノ酸残基であって、ただし、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する変異の場合は該変異がS440YまたはS440Wであることを条件とする、アミノ酸残基、および
(e)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345、E382またはQ386に対応するアミノ酸残基
の群から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基における、K439における変異以外の第1の変異、ならびに
(ii)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439に対応する位置における第2の変異
を含み;かつ
前記第2の変異体が免疫グロブリンの第2のFcドメインと抗原結合領域とを含み、該第2の変異体が
(i)
(a)アロステリック変異をもたらすCH2-CH3領域内のアミノ酸残基、
(b)CH2-CH3領域の疎水性ノブ内のアミノ酸残基、
(c)N末端CH3ヘリックス内のアミノ酸残基、
(d)C末端CH3 β-ストランド内のアミノ酸残基、および
(e)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345、E382またはQ386に対応するアミノ酸残基
の群から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基における、S440における変異以外の第1の変異、ならびに
(ii)IgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する位置における第2の変異であって、ただし、S440における変異がS440YでもS440Wでもないことを条件とする、変異
を含む、本発明1063の組成物。
[本発明1065]
前記第1の変異体が
(i)
(a)アロステリック変異をもたらすCH2-CH3領域内のアミノ酸残基、
(b)CH2-CH3領域の疎水性ノブ内のアミノ酸残基、
(c)N末端CH3ヘリックス内のアミノ酸残基、
(d)C末端CH3 β-ストランド内のアミノ酸残基であって、ただし、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する変異の場合は該変異がS440YまたはS440Wであることを条件とする、アミノ酸残基、および
(e)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345、E382またはQ386に対応するアミノ酸残基
の群から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基における、K439における変異以外の第1の変異、ならびに
(ii)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439に対応する位置における第2の変異
を含み、かつ
前記第2の変異体がヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する位置に変異を含み、該変異がS440YでもS440Wでもない、
本発明1063の組成物。
[本発明1066]
前記第1の変異体がヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439に対応する位置における変異を含み;かつ
前記第2の変異体が免疫グロブリンの第2のFcドメインと抗原結合領域とを含み、該第2の変異体が
(i)
(a)アロステリック変異をもたらすCH2-CH3領域内のアミノ酸残基、
(b)CH2-CH3領域の疎水性ノブ内のアミノ酸残基、
(c)N末端CH3ヘリックス内のアミノ酸残基、
(d)C末端CH3 β-ストランド内のアミノ酸残基、および
(e)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345、E382またはQ386に対応するアミノ酸残基
の群から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基における、S440における変異以外の第1の変異、ならびに
(ii)IgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する位置における第2の変異であって、ただし、S440における変異がS440YでもS440Wでもないことを条件とする、変異
を含む、本発明1063の組成物。
[本発明1067]
ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439に対応する位置での変異がK439D/Eであり、かつ/またはヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する位置での変異がS440K/H/Rである、本発明1061~1066のいずれかの組成物。
[本発明1068]
免疫グロブリンのFcドメインと結合領域とを含む親ポリペプチドの第1の変異体、および免疫グロブリンのFcドメインと結合領域とを含む親ポリペプチドの第2の変異体を含む組成物であって、該第1の変異体が免疫グロブリンの第1のFcドメインと第1の抗原結合領域とを含み、該第1の変異体が、
(a)アロステリック変異をもたらすCH2-CH3領域内のアミノ酸残基、
(b)CH2-CH3領域の疎水性ノブ内のアミノ酸残基、
(c)N末端CH3ヘリックス内のアミノ酸残基、
(d)C末端CH3 β-ストランド内のアミノ酸残基であって、ただし、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する変異の場合は該変異がS440YまたはS440Wであることを条件とする、アミノ酸残基、および
(e)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345、E382またはQ386に対応するアミノ酸残基
の群から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基に第1の変異を含み、かつ
該第2の変異体が、
(a)アロステリック変異をもたらすCH2-CH3領域内のアミノ酸残基、
(b)CH2-CH3領域の疎水性ノブ内のアミノ酸残基、
(c)N末端CH3ヘリックス内のアミノ酸残基、
(d)C末端CH3 β-ストランド内のアミノ酸残基であって、ただし、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する変異の場合は該変異がS440YまたはS440Wであることを条件とする、アミノ酸残基、および
(e)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345、E382またはQ386に対応するアミノ酸残基
の群から選択されるアミノ酸残基に変異を含まない、
組成物。
[本発明1069]
抗体の第1の変異体および親抗体の第2の変異体を含む組成物であって、該第1の変異体が免疫グロブリンの第1のFcドメインと第1の抗原結合領域とを含み、該第1の変異体が、
(a)アロステリック変異をもたらすCH2-CH3領域内のアミノ酸残基、
(b)CH2-CH3領域の疎水性ノブ内のアミノ酸残基、
(c)N末端CH3ヘリックス内のアミノ酸残基、
(d)C末端CH3 β-ストランド内のアミノ酸残基であって、ただし、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する変異の場合は該変異がS440YまたはS440Wであることを条件とする、アミノ酸残基、および
(e)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345、E382またはQ386に対応するアミノ酸残基
の群から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基に第1の変異を含み、かつ
該第2の変異体が免疫グロブリンの第2のFcドメインと第2の抗原結合領域とを含み、該第2の変異体が、
(a)アロステリック変異をもたらすCH2-CH3領域内のアミノ酸残基、
(b)CH2-CH3領域の疎水性ノブ内のアミノ酸残基、
(c)N末端CH3ヘリックス内のアミノ酸残基、
(d)C末端CH3 β-ストランド内のアミノ酸残基であって、ただし、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する変異の場合は該変異がS440YまたはS440Wであることを条件とする、アミノ酸残基、および
(e)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345、E382またはQ386に対応するアミノ酸残基
の群から選択されるアミノ酸残基に変異を含まない、
本発明1068の組成物。
[本発明1070]
前記第1および第2の変異体が、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345、E430、Q386、P247、I253、S254、Q311、D/E356、T359、E382、Y436およびK447に対応するものから選択される少なくとも1つのアミノ酸残基に変異を含む、本発明1061~1067のいずれかの組成物。
[本発明1071]
前記第1および第2の変異体における変異が異なる、本発明1070の組成物。
[本発明1072]
前記第1の変異体が、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345、E430、S440、Q386、P247、I253、S254、Q311、D/E356、T359、E382、Y436およびK447に対応するものから選択される少なくとも1つのアミノ酸残基に変異を含み、ただし、S440における変異がS440YまたはS440Wであることを条件とする、本発明1068または1069の組成物。
[本発明1073]
前記第1の変異体および第2の変異体がそれぞれヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgDまたはIgE抗体であり、任意でそれぞれがヒト完全長抗体、例えばそれぞれがヒト完全長IgG1抗体である、本発明1061~1072のいずれかの組成物。
[本発明1074]
前記第1の変異体および第2の変異体が、単一特異性抗体、二重特異性抗体または多重特異性抗体から選択される、本発明1061~1073のいずれかの組成物。
[本発明1075]
前記第1および第2の変異体が、同じ抗原上または異なる抗原上の異なるエピトープと結合する、本発明1061~1074のいずれかの組成物。
[本発明1076]
前記第1の変異体および第2の変異体の一方または両方が薬物、毒素または放射性標識と結合体化されており、例えば該第1の変異体および第2の変異体の一方または両方がリンカーを介して毒素と結合体化されている、本発明1061~1075のいずれかの組成物。
[本発明1077]
前記第1の変異体および第2の変異体の一方または両方が融合タンパク質の一部である、本発明1061~1075のいずれかの組成物。
[本発明1078]
本発明1034~1060のいずれかの変異体または本発明1061~1077のいずれかの組成物と薬学的に許容される担体とを含む組成物。
[本発明1079]
治療において同時に、別々にまたは逐次的に使用するための、本発明1034~1060のいずれかで定められた第1の変異体および第2の変異体を含むキット・オブ・パーツ。
[本発明1080]
癌などの疾患の治療のための、本発明1034~1079のいずれかの変異体、組成物またはキット・オブ・パーツ。
[本発明1081]
本発明1034~1079のいずれかの変異体、組成物またはキット・オブ・パーツの投与を含む、ヒトの治療のための方法。
[本発明1082]
本発明1034~1079のいずれかの変異体、組成物またはキット・オブ・パーツの投与を含む、ヒトにおける癌の治療のための方法。
本発明のこれらの局面および他の局面、特に抗体変異体のさまざまな使用および治療応用について、以下にさらに詳細に説明する。
本明細書で説明するように、驚いたことに、Fc:C1q結合に直接的には関与しないアミノ酸における変異は、それにもかかわらず、抗体のCDCを増強することができ、さらに抗体の他のFc媒介性エフェクター機能も向上させることができる。このことは、IgG1抗体などの抗体分子が、後にC1qによる結合を受けるオリゴマー構造を形成しうるという仮説を裏づける。さらに、ある種の変異はCDC誘導を低下させることが見いだされているものの、同一または異なる抗体分子におけるそのような変異のある種の組み合わせはCDC誘導の回復をもたらし、かつ、抗体のオリゴマー形成に対するさらなる特異性を示し、それによって、より特異的なCDC誘導を促進した。CDC応答を増強する具体的な変異についても、実施例に示されているように、ADCC応答の向上、結合力の増強、細胞内移行の増強、およびマウス腫瘍モデル系におけるインビボ活性によって特徴づけた。これらの発見は、増強されたCDC誘導能力、より選択的なCDC誘導性、および/または他の向上したエフェクター機能を有する新規な抗体ベースの治療薬を可能にする。
「単一変異体」という用語は、親ポリペプチドまたは抗体と比較してエフェクター機能が増強されている本発明の変異体と解釈されるものとする。
保存的置換に関するアミノ酸残基のクラス
別の保存的アミノ酸残基置換のクラス
アミノ酸残基の別の物理的および機能的な分類
元のアミノ酸‐位置‐置換されたアミノ酸;
三文字コードまたは一文字コードは、コードXaaおよびXを含めて、アミノ酸残基を指し示すために用いられる。したがって、「E345R」または「Glu345Arg」という表記は、変異体が、親抗体での位置345におけるアミノ酸に対応する変異型アミノ酸の位置に、この2つを以下に指し示すようにアライメントした場合に、グルタミン酸のアルギニンによる置換を含むことを意味する。
位置‐置換されたアミノ酸;例えば、「448E」のような表記を用いる。
元のアミノ酸‐位置;または「E345」。
「Glu345Arg,Lys,Trp」または「E345R,K,W」または「E345R/K/W」または「E345をR、KまたはWに(E345 to R, K or W)」を、本発明の文脈において互換的に用いることができる。
。ところで、これは345Xとの表記と等価であり、ここでXは任意のアミノ酸を表している。また、これらの置換を、E345A、E345C、その他、またはE345A、C、その他、またはE345A/C/その他と表すこともできる。同じことが、本明細書で言及する各位置およびあらゆる位置についても同様に成り立ち、そのような置換の任意のものが本明細書に具体的に含まれる。
本明細書において親抗体(第1の親抗体または第2の親抗体)に言及して記載される態様はすべて、免疫グロブリンのFcドメインと結合領域とを含む親ペプチド(第1の親ペプチドまたは第2の親ポリペプチド)に関する態様としても解釈されるべきであることが理解されるべきである。
そのため、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345、E430、S440、Q386、P247、I253、S254、Q311、D/E356、T359、E382、Y436およびK447に対応するものから選択されるアミノ酸残基の変異を、本発明の文脈において「単一変異体」局面または「エフェクター増強性変異」と称することもできる。
第1の変異はヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439に対応するアミノ酸残基にあり、かつ第2の変異はヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応するアミノ酸残基にあるか、または
第1の変異はヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応するアミノ酸残基にあり、かつ第2の変異はヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439に対応するアミノ酸残基にある。
(i)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439およびS440に対応するアミノ酸残基のそれぞれに、ただし、S440における変異がS440YでもS440Wでもないことを条件とする、
(ii)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447および448に対応するアミノ酸残基のそれぞれに、例えばヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447K/R/Hおよび448E/D、好ましくはヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447Kおよび448Eなど、または
(iii)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447、448および449に対応するアミノ酸残基のそれぞれに、例えばヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447D/E、448K/R/Hおよび449P、好ましくはヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447E、448Kおよび449Pなど。
A)
(i)第1の親ポリペプチドに対して、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439に対応する位置のアミノ酸残基に変異を導入する段階;および
(ii)第2の親ポリペプチドに対して、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する位置のアミノ酸残基に変異を導入する段階、ただし、S440における変異がS440YでもS440Wでもないことを条件とする、段階
B)
(i)第1の親ポリペプチドに対して、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447D/Eに対応する位置のアミノ酸残基に変異を導入する段階;および
(ii)第2の親ポリペプチドに対して、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447K/R/Hおよび448Pに対応する位置のアミノ酸残基に変異を導入する段階;または
C)
(i)第1の親ポリペプチドに対して、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447D/Eに対応する位置のアミノ酸残基に変異を導入する段階;および
(ii)第2の親ポリペプチドに対して、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447K/R/H、448K/R/Hおよび449Pに対応する位置のアミノ酸残基に変異を導入する段階
を含む方法に関する。
(i)第1の親抗体に対して、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439に対応する位置のアミノ酸残基に変異を導入する段階;および
(ii)第2の親抗体に対して、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する位置のアミノ酸残基に変異を導入する段階、ただし、S440における変異がS440YでもS440Wでもないことを条件とする、段階
を含む方法にも関する。
第1の変異はヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439に対応するアミノ酸残基にあり;
第2の変異はヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応するアミノ酸残基にある。
(i)少なくとも第1および/または第2の親ポリペプチドに対して、以下のものからなる群より選択される1つまたは複数のアミノ酸残基に変異を導入する段階:
(a)アロステリック変異をもたらすCH2-CH3領域内のアミノ酸残基、
(b)CH2-CH3領域の疎水性ノブ内のアミノ酸残基、
(c)N末端CH3ヘリックス内のアミノ酸残基、
(d)C末端CH3 β-ストランド内のアミノ酸残基、ただし、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する変異の場合に該変異がS440YまたはS440Wであることを条件とする、および
(e)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345、E382またはQ386に対応するアミノ酸残基
を含む方法に関する。
(i)少なくとも第1および/または第2の親抗体に対して、以下のものからなる群より選択される1つまたは複数のアミノ酸残基に変異を導入する段階:
(a)アロステリック変異をもたらすCH2-CH3領域内のアミノ酸残基、
(b)CH2-CH3領域の疎水性ノブ内のアミノ酸残基、
(c)N末端CH3ヘリックス内のアミノ酸残基、
(d)C末端CH3 β-ストランド内のアミノ酸残基、ただし、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する変異の場合に該変異がS440YまたはS440Wであることを条件とする、アミノ酸残基、および
(e)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345、E382またはQ386に対応するアミノ酸残基
を含む方法に関する。
(i)第1の親抗体に対して、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345、E430、S440、Q386、P247、I253、S254、Q311、D/E356、T359、E382、Y436およびK447に対応するものから選択される少なくとも1つのアミノ酸残基に変異を導入する段階、ただし、S440における変異がS440YまたはS440Wであることを条件とする、段階
(ii)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345、E430、S440、Q386、P247、I253、S254、Q311、D/E356、T359、E382、Y436およびK447に対応するものから選択されるアミノ酸残基に変異を含まない第2の親抗体を用意する段階。
(i)第1の親抗体に対して、ヒトIgG1重鎖のFc領域における位置K439に対応するアミノ酸残基に第2の変異を導入する段階;および
(ii)第2の親抗体に対して、ヒトIgG1重鎖のFc領域における位置S440に対応するアミノ酸残基に第2の変異を導入する段階、ただし、S440における変異がS440YでもS440Wでもないことを条件とする、段階;ここで段階(ii)および(iii)は代替的に以下であってもよい:
(i)第1の親抗体に対して、ヒトIgG1重鎖のFc領域における位置S440に対応するアミノ酸残基に第2の変異を導入する段階、ただし、S440における変異がS440YでもS440Wでもないことを条件とする;および
(ii)第2の親抗体に対して、ヒトIgG1重鎖のFc領域における位置K439に対応するアミノ酸残基に第2の変異を導入する段階。
(i)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447および448に対応するアミノ酸残基のそれぞれにおける変異、例えばヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447K/R/Hおよび448E/D、好ましくはヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447Kおよび448E、または
(ii)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447、448および449に対応するアミノ酸残基のそれぞれにおける変異、例えばヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447D/E、448K/R/Hおよび449P、好ましくはヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447E、448Kおよび449P。
クローディン4;CS-1;CSF2RA;CSPG-4;CTLA4;Cripto;DLL4;ED-B;EFNA2;EGFR;エンドセリンB受容体;ENPP3;EPCAM;ERBB2;ERBB3;FAPα;FcγRI;FCER2;FGFR3;フィブリンIIβ鎖;FLT1;FOLH1;FOLR1;FRP-1;GD3ガングリオシド;GDF2;GLP1R;グリピカン-3;GPNMB;HBV(B型肝炎ウイルス);HCMV(ヒトサイトメガロウイルス);熱ショックタンパク質90ホモログ[カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)];単純ヘルペスウイルスgD糖タンパク質;HGF;HIV-1;HIV-1 IIIB gp120 V3ループ;HLA-DRB(HLA-DRβ);ヒト呼吸器合胞体ウイルス、糖タンパク質F;ICAM1;IFNA1;IFNA1;IFNB1 bispecific;IgE Fc;IGF1R;IGHE連結領域;IL12B;IL13;IL15;IL17A;IL1A;IL1B;IL2RA;IL4;IL5;IL5RA;IL6;IL6R;IL9;インターロイキン-2受容体βサブユニット;ITGA2;ITGA2B ITGB3;ITGA4 ITGB7;ITGA5;ITGAL;ITGAV_ITGB3;ITGB2;KDR;L1CAM;Lewis-y;リピドA、リポ多糖LPSのドメイン;LTA;MET;MMP14;MMp15;MST1R;MSTN;MUC1;MUC4;MUC16;MUC5AC;NCA-90顆粒球細胞抗原;ネクチン4;NGF;NRP;NY-ESO-1;OX40L;PLAC-1;PLGF;PDGFRA;PD1;PDL1;PSCA;ホスファチジルセリン;PTK-7;緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)血清型IATS O11;RSV(ヒト呼吸器合胞体ウイルス、糖タンパク質F);ROR1;RTN4;SELL;SELP;STEAP1;志賀毒素様毒素II Bサブユニット[大腸菌(Escherichia coli)];SLAM7;SLC44A4;SOST;表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermidis)リポテイコ酸;T細胞受容体α_β;TF;TGFB1;TGFB2;TMEFF2;TNC;TNF;TNFRSF10A;TNFRSF10B;TNFRSF12A;TNFSF13;TNFSF14;TNFSF2;TNFSF7;TRAILR2;TROP2;TYRP1;VAP-1;およびビメンチン。
親抗体、第1の親抗体または第2の親抗体に言及して本明細書において記載されたすべての態様は、免疫グロブリンのFcドメインと結合領域とを含む親ポリペプチド、第1の親ペプチドまたは第2の親ポリペプチドに関する態様としても解釈されるべきであることが理解されるべきである。
(i)請求項1~24のいずれか一項に従って変異させた1つの親ポリペプチドまたは少なくとも第1の親ポリペプチドと第2の親ポリペプチドの組み合わせを用意する段階;および
(ii)段階(i)の変異させた親ポリペプチドまたは段階(i)の変異させた少なくとも第1の親ポリペプチドと第2の親ポリペプチドの組み合わせの調製物を、ヒト補体またはエフェクター細胞の存在下で、抗原を発現する細胞、細胞膜またはビリオンと接触させる段階
を含む方法に関する。
(i)本明細書に記載された方法のいずれかに従って変異させた1つの親抗体または少なくとも第1の親抗体と第2の親抗体の組み合わせを用意する段階;および
(ii)段階(i)の変異させた親抗体または段階(i)の変異させた少なくとも第1の親抗体と第2の親抗体の組み合わせの調製物を、ヒト補体またはエフェクター細胞の存在下で、抗原を発現する細胞、細胞膜またはビリオンと接触させる段階
を含む方法にも関する。
クローディン4;CS-1;CSF2RA;CSPG-4;CTLA4;Cripto;DLL4;ED-B;EFNA2;EGFR;エンドセリンB受容体;ENPP3;EPCAM;ERBB2;ERBB3;FAPα;FcγRI;FCER2;FGFR3;フィブリンIIβ鎖;FLT1;FOLH1;FOLR1;FRP-1;GD3ガングリオシド;GDF2;GLP1R;グリピカン-3;GPNMB;HBV(B型肝炎ウイルス);HCMV(ヒトサイトメガロウイルス);熱ショックタンパク質90ホモログ[カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)];単純ヘルペスウイルスgD糖タンパク質;HGF;HIV-1;HIV-1IIIB gp120 V3ループ;HLA-DRB(HLA-DRβ);ヒト呼吸器合胞体ウイルス、糖タンパク質F;ICAM1;IFNA1;IFNA1;IFNB1 bispecific;IgE Fc;IGF1R;IGHE連結領域;IL12B;IL13;IL15;IL17A;IL1A;IL1B;IL2RA;IL4;IL5;IL5RA;IL6;IL6R;IL9;インターロイキン-2受容体βサブユニット;ITGA2;ITGA2BITGB3;ITGA4ITGB7;ITGA5;ITGAL;ITGAV_ITGB3;ITGB2;KDR;L1CAM;Lewis-y;リピドA、リポ多糖LPSのドメイン;LTA;MET;MMP14;MMp15;MST1R;MSTN;MUC1;MUC4;MUC16;MUC5AC;NCA-90顆粒球細胞抗原;ネクチン4;NGF;NRP;NY-ESO-1;OX40L;PLAC-1;PLGF;PDGFRA;PD1;PDL1;PSCA;ホスファチジルセリン;PTK-7;緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)血清型IATSO11;RSV(ヒト呼吸器合胞体ウイルス、糖タンパク質F);ROR1;RTN4;SELL;SELP;STEAP1;志賀毒素様毒素IIBサブユニット[大腸菌(Escherichia coli)];SLAM7;SLC44A4;SOST;表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermidis)リポテイコ酸;T細胞受容体α_β;組織因子(TF);TGFB1;TGFB2;TMEFF2;TNC;TNF;TNFRSF10A;TNFRSF10B;TNFRSF12A;TNFSF13;TNFSF14;TNFSF2;TNFSF7;TRAILR2;TROP2;TYRP1;VAP-1;およびビメンチン。
(i)IgG1重鎖のFc領域におけるE345、E430、S440、P247、I253、S254、Q311、D/E356、T359、E382、Q386、Y436およびK447からなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸残基に変異を含む抗体を用意する段階;ならびに
(ii)該抗体の調製物を、ヒト補体またはエフェクター細胞の存在下で、細胞、細胞膜またはビリオンと接触させる段階
を含む方法に関する。
第1の抗体のFc領域におけるE345、E430、S440、P247、I253、S254、Q311、D/E356、T359、E382、Q386、Y436およびK447に対応するものから選択される少なくとも1つのアミノ酸残基に第1の変異を含む第1の抗体を投与する段階;
第2の抗体のFc領域におけるE345、E430、S440、P247、I253、S254、Q311、D/E356、T359、E382、Q386、Y436およびK447に対応するものから選択される少なくとも1つのアミノ酸残基に第2の変異を含む第2の抗体を投与する段階
をさらに含み、ここで第1および第2の抗体を同時に、別々にまたは逐次的に投与することができる。第1および第2の抗体は、同一または異なる標的上の同じまたは異なるエピトープと結合しうる。標的は、同じ細胞もしくは細胞種上にあってもよく、または異なる細胞もしくは細胞種上にあってもよい。
(i)抗体のFc領域における少なくとも1つのアミノ酸に変異を含む親抗体の変異体を用意する段階であって、該少なくとも1つのアミノ酸がE345、E382およびH433からなる群より選択される段階;ならびに
(ii)変異体の調製物を、ヒト補体またはエフェクター細胞の存在下で、細胞と接触させる段階
を含む方法に関する。
(i)抗体のFc領域におけるK439EおよびS440K変異を含む親抗体の変異体を用意する段階;ならびに
(ii)変異体の調製物を、ヒト補体またはエフェクター細胞の存在下で、細胞と接触させる段階
を含む方法に関する。
(i)K439E変異を含む第1の親抗体の第1の変異体およびS440K変異を含む第2の親抗体の第2の変異体を用意する段階;ならびに
(ii)ヒト補体および/またはエフェクター細胞の存在下で、細胞を、第1および第2の変異体に同時に、別々にまたは逐次的に接触させる段階
を含む方法に関する。
別の主要な局面において、本発明は、C1qと結合する抗体のエフェクター機能を増強する、抗体における変異を同定する方法であって、
(i)E345、E430、S440、K439、P247、I253、S254、Q311、D/E356、T359、E382、Q386、Y436およびK447からなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸における変異を含む少なくとも1つの抗体を調製する段階;
(ii)抗原発現細胞の表面と結合したときの抗体のC1q活性を、親抗体と比較して評価する段階;ならびに
(iii)増強されたC1q結合力を有する任意の変異体の変異を選択する段階
を含む方法に関する。
(i)E345、E430、S440、K439、P247、I253、S254、Q311、D/E356、T359、E382、Q386、Y436およびK447からなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸における変異を含む、少なくとも1つの親抗体の変異体を調製する段階;
(ii)エフェクター細胞または補体の存在下で抗原発現細胞の表面と結合したときに変異体によって誘導されるCDC応答を、親抗体と比較して評価する段階;ならびに
(iii)増強されたCDC応答を有する任意の変異体の変異を選択する段階
を含む方法に関する。
親抗体
本明細書で記載しているように、本発明はとりわけ、免疫グロブリンのCH2および/またはCH3領域、例えば抗体の重鎖に1つまたは複数の変異を含む、親抗体の変異体に関する。改変の前に本発明の出発材料として用いることになる、野生型抗体であってもよい「親」抗体は、例えば、Kohler et al., Nature 256, 495 (1975)によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製されてもよく、または組換えDNA法によって作製されてもよい。また、モノクローナル抗体を、例えば、Clackson et al., Nature 352, 624 628 (1991)およびMarks et al., J. Mol. Biol. 222, 581 597 (1991)に記載された手法を用いて、ファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。モノクローナル抗体は任意の適した供給源から得ることができる。したがって、例えば、モノクローナル抗体を、関心対象の抗原による免疫処置を受けたマウスから得られたマウス脾臓B細胞から調製されたハイブリドーマから、例えば、表面上に抗原を発現する細胞の形、または関心対象の抗原をコードする核酸の形で得ることができる。また、モノクローナル抗体を、免疫処置を受けたヒトまたは非ヒト哺乳動物(例えばウサギ、ラット、イヌ、霊長動物など)の抗体発現細胞に由来するハイブリドーマから得ることもできる。
に総説)。HuMAbマウスの調製は、
に詳細に記載されている。また、
も参照されたい。これらのトランスジェニックマウスからの脾細胞を用いて、ヒトモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを周知の手法に従って作製することができる。
クローディン4;CS-1;CSF2RA;CSPG-4;CTLA4;Cripto;DLL4;ED-B;EFNA2;EGFR;エンドセリンB受容体;ENPP3;EPCAM;ERBB2;ERBB3;FAPα;FcγRI;FCER2;FGFR3;フィブリンIIβ鎖;FLT1;FOLH1;FOLR1;FRP-1;GD3ガングリオシド;GDF2;GLP1R;グリピカン-3;GPNM B;HBV(B型肝炎ウイルス);HCMV(ヒトサイトメガロウイルス);熱ショックタンパク質90ホモログ[カンジダ・アルビカンス];単純ヘルペスウイルスgD糖タンパク質;HGF;HIV-1;HIV-1IIIB gp120 V3ループ;HLA-DRB(HLA-DRβ);ヒト呼吸器合胞体ウイルス、糖タンパク質F;ICAM1;IFNA1;IFNA1;IFNB1 bispecific;IgE Fc;IGF1R;IGHE連結領域;IL12B;IL13;IL15;IL17A;IL1A;IL1B;IL2RA;IL4;IL5;IL5RA;IL6;IL6R;IL9;インターロイキン-2受容体βサブユニット;ITGA2;ITGA2B ITGB3;ITGA4 ITGB7;ITGA5;ITGAL;ITGAV_ITGB3;ITGB2;KDR;L1CAM;Lewis-y;リピドA、リポ多糖LPSのドメイン;LTA;MET;MMP14;MMp15;MST1R;MSTN;MUC1;MUC4;MUC16;MUC5AC;NCA-90顆粒球細胞抗原;ネクチン4;NGF;NRP;NY-ESO-1;OX40L;PLAC-1;PLGF;PDGFRA;PD1;PDL1;PSCA;ホスファチジルセリン;PTK-7;緑膿菌血清型IATS O11;RSV(ヒト呼吸器合胞体ウイルス、糖タンパク質F);ROR1;RTN4;SELL;SELP;STEAP1;志賀毒素様毒素IIBサブユニット[大腸菌];SLAM7;SLC44A4;SOST;表皮ブドウ球菌リポテイコ酸;T細胞受容体α_β;TF;TGFB1;TGFB2;TMEFF2;TNC;TNF;TNFRSF10A;TNFRSF10B;TNFRSF12A;TNFSF13;TNFSF14;TNFSF2;TNFSF7;TRAILR2;TROP2;TYRP1;VAP-1;およびビメンチン。
に総説)。HuMAb(登録商標)マウスの調製は、
に詳細に記載されている。また、
も参照されたい。
親抗体、第1の親抗体または第2の親抗体に言及して本明細書において記載されたすべての態様は、免疫グロブリンのFcドメインと結合領域とを含む親ポリペプチド、第1の親ポリペプチドまたは第2の親ポリペプチドに関する態様としても解釈されるべきであることが理解されるべきである。
(a)アロステリック変異をもたらすCH2-CH3領域内のアミノ酸残基、
(b)CH2-CH3領域の疎水性ノブ内のアミノ酸残基、
(c)N末端CH3ヘリックス内のアミノ酸残基、
(d)C末端CH3 β-ストランド内のアミノ酸残基、ただし、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する変異の場合に該変異がS440YまたはS440Wであることを条件とするアミノ酸残基、および
(e)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345、E382またはQ386に対応するアミノ酸残基。
からなる群の任意のものに対応するアミノ酸置換であってもよい。これらは、実施例19、表17に示されているように、細胞溶解の増強を有する(Wien133細胞で39%超)。
(a)アロステリック変異をもたらすCH2-CH3領域内のアミノ酸残基、
(b)CH2-CH3領域の疎水性ノブ内のアミノ酸残基、
(c)N末端CH3ヘリックス内のアミノ酸残基、
(d)C末端CH3 β-ストランド内のアミノ酸残基、ただし、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する変異の場合に該変異がS440YまたはS440Wであることを条件とする、アミノ酸残基、および
(e)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345、E382またはQ386に対応するアミノ酸残基
の群から選択される少なくとも2つのアミノ酸残基に変異を含み、該少なくとも2つのアミノ酸変異が異なる、変異体に関する。
(a)アロステリック変異をもたらすCH2-CH3領域内のアミノ酸残基、
(b)CH2-CH3領域の疎水性ノブ内のアミノ酸残基、
(c)N末端CH3ヘリックス内のアミノ酸残基、
(d)C末端CH3 β-ストランド内のアミノ酸残基、ただし、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する変異の場合に該変異がS440YまたはS440Wであることを条件とする、アミノ酸残基、および
(e)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345、E382またはQ386に対応するアミノ酸残基
から選択される少なくとも2つのアミノ酸残基に変異を含み、該少なくとも2つのアミノ酸変異が異なる、変異体にも関する。
に対応するものから選択される。
(a)アロステリック変異をもたらすCH2-CH3領域内のアミノ酸残基、
(b)CH2-CH3領域の疎水性ノブ内のアミノ酸残基、
(c)N末端CH3ヘリックス内のアミノ酸残基、
(d)C末端CH3 β-ストランド内のアミノ酸残基、ただし、それがヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する変異を含まないことを条件とする、アミノ酸残基、および
(e)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345、E382またはQ386に対応するアミノ酸残基
の群から選択される少なくとも3つのアミノ酸残基における変異を含み、該少なくとも3つのアミノ酸変異が異なる、変異体に関する。
から選択されるアミノ酸置換またはアミノ酸置換の組み合わせ(Dall'Acqua et al.、前記)が含まれる。
親抗体、第1の親抗体または第2の親抗体に言及して本明細書において記載されたすべての態様は、免疫グロブリンのFcドメインと結合領域とを含む親ポリペプチド、第1の親ポリペプチドまたは第2の親ポリペプチドに関する態様としても解釈されるべきであることが理解されるべきである。
(i)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439およびS440に対応するものから選択される少なくとも1つのアミノ酸残基における変異、ただし、S440における変異がS440YでもS440Wでもないことを条件とし、例えば、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439に対応する位置での変異がK439D/Eであり、かつ/またはヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する位置での変異がS440K/H/Rである、変異;
(ii)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447D/Eに対応するか、もしくはK447K/R/Hおよび448Pに対応する、少なくとも1つのアミノ酸残基における変異;または
(iii)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447D/Eに対応するか、もしくはK447K/R/Hおよび448K/R/Hおよび449Pに対応する、少なくとも1つのアミノ酸残基における変異
を含む変異体に関する。
(i)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439またはS440に対応する少なくとも1つのアミノ酸残基における変異、ただし、S440における変異がS440WでもS440Yでもないことを条件とする、変異;
(ii)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447D/Eに対応するか、またはK447K/R/Hおよび448Pに対応する、少なくとも1つのアミノ酸残基における変異;または
(iii)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447D/Eに対応するか、またはK447K/R/Hおよび448K/R/Hおよび449Pに対応する、少なくとも1つのアミノ酸残基における変異
をさらに含む。
(a)アロステリック変異をもたらすCH2-CH3領域内のアミノ酸残基、
(b)CH2-CH3領域の疎水性ノブ内のアミノ酸残基、
(c)N末端CH3ヘリックス内のアミノ酸残基、
(d)C末端CH3 β-ストランド内のアミノ酸残基、ただし、それがヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する変異を含まないことを条件とする、アミノ酸残基、および
(e)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345、E382またはQ386に対応するアミノ酸残基
の群から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基に変異を含む変異体に関し、
ここで該変異体は、
(i)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439またはS440に対応する少なくとも1つのアミノ酸残基におけるさらなる変異、ただし、S440における変異がS440WでもS440Yでもないことを条件とする、変異;
(ii)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447D/Eに対応するか、もしくはK447K/R/Hおよび448Pに対応する、少なくとも1つのアミノ酸残基におけるさらなる変異;または
(iii)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447D/Eに対応するか、もしくはK447K/R/Hおよび448K/R/Hおよび449Pに対応する、少なくとも1つのアミノ酸残基におけるさらなる変異
を含む。
(a)アロステリック変異をもたらすCH2-CH3領域内のアミノ酸残基、
(b)CH2-CH3領域の疎水性ノブ内のアミノ酸残基、
(c)N末端CH3ヘリックス内のアミノ酸残基、
(d)C末端CH3 β-ストランド内のアミノ酸残基、ただし、それがヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する変異を含まないことを条件とする、アミノ酸残基、および
(e)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345、E382またはQ386に対応するアミノ酸残基
の群から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基に変異を含む変異体に関し、
ここで該変異体は、
(i)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439またはS440に対応する少なくとも1つのアミノ酸残基におけるさらなる変異、ただし、S440における変異がS440WでもS440Yでもないことを条件とする、変異
(ii)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447D/Eに対応するか、もしくはK447K/R/Hおよび448Pに対応する、少なくとも1つのアミノ酸残基におけるさらなる変異;または
(iii)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447D/Eに対応するか、もしくはK447K/R/Hおよび448K/R/Hおよび449Pに対応する、少なくとも1つのアミノ酸残基におけるさらなる変異
を含む。
親抗体、第1の親抗体または第2の親抗体に言及して本明細書において記載されたすべての態様は、免疫グロブリンのFcドメインと結合領域とを含む親ポリペプチド、第1の親ポリペプチドまたは第2の親ポリペプチドに関する態様としても解釈されるべきであることが理解されるべきである。
(a)アロステリック変異をもたらすCH2-CH3領域内のアミノ酸残基、
(b)CH2-CH3領域の疎水性ノブ内のアミノ酸残基、
(c)N末端CH3ヘリックス内のアミノ酸残基、
(d)C末端CH3 β-ストランド内のアミノ酸残基、ただし、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する変異の場合に該変異がS440YまたはS440Wであることを条件とする、アミノ酸残基、および
(e)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345、E382またはQ386に対応するアミノ酸残基
から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基における変異、
ならびにヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439に対応するアミノ酸残基における変異
を含む変異体にも関する。
(a)アロステリック変異をもたらすCH2-CH3領域内のアミノ酸残基、
(b)CH2-CH3領域の疎水性ノブ内のアミノ酸残基、
(c)N末端CH3ヘリックス内のアミノ酸残基、
(d)C末端CH3 β-ストランド内のアミノ酸残基、ただし、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する変異の場合に該変異がS440YまたはS440Wであることを条件とする、アミノ酸残基、および
(e)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345、E382またはQ386に対応するアミノ酸残基
から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基における変異、
ならびにヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応するアミノ酸残基における変異
を含む変異体にも関する。
(i)
(a)アロステリック変異をもたらすCH2-CH3領域内のアミノ酸残基、
(b)CH2-CH3領域の疎水性ノブ内のアミノ酸残基、
(c)N末端CH3ヘリックス内のアミノ酸残基、
(d)そのC末端CH3 β-ストランド内のアミノ酸残基、ただし、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する変異の場合に該変異がS440YまたはS440Wであることを条件とする、アミノ酸残基、および
(e)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345、E382またはQ386に対応するアミノ酸残基
の群から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基における、K439における変異以外の第1の変異、ならびに
(ii)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439に対応する位置にある第2の変異
を含み、かつ、
第2の変異体は免疫グロブリンの第2のFcドメインと抗原結合領域とを含み、該第2の変異体は
(i)
(a)アロステリック変異をもたらすCH2-CH3領域内のアミノ酸残基、
(b)CH2-CH3領域の疎水性ノブ内のアミノ酸残基、
(c)N末端CH3ヘリックス内のアミノ酸残基、
(d)そのC末端CH3 β-ストランド内のアミノ酸残基、および
(e)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345、E382またはQ386に対応するアミノ酸残基、
の群から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基における、S440における変異以外の第1の変異、ならびに
(ii)IgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する位置にある第2の変異、ただし、S440における変異がS440YでもS440Wでもないことを条件とする、変異
を含む。
からなる群の任意のものに対応するアミノ酸置換であってもよい少なくとも1つのアミノ酸残基における変異を含み、かつ第1の変異体はヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439に対応する位置にある第2の変異を含み;かつ第2の変異体はヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する位置にある第2の変異を含む。
親抗体、第1の親抗体または第2の親抗体に言及して本明細書において記載されたすべての態様は、免疫グロブリンのFcドメインと結合領域とを含む親ポリペプチド、第1の親ポリペプチドまたは第2の親ポリペプチドに関する態様としても解釈されるべきであることが理解されるべきである。
第1および第2のCH2-CH3領域はそれぞれ、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345、E430、S440、Q386、P247、I253、S254、Q311、D/E356、T359、E382、Y436およびK447に対応するものから選択される少なくとも1つのアミノ酸残基に第1の変異を含み、ただし、S440における変異はS440YまたはS440Wであることを条件とする。
第2のポリペプチドは、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるF405、T366、L368、K370、D399、Y407およびK409に対応するものから選択されるアミノ酸残基にさらなる変異を含み、かつ第1のポリペプチドにおける前記さらなる変異が第2のポリペプチドにおける前記さらなる変異とは異なる。
親抗体、第1の親抗体または第2の親抗体に言及して本明細書において記載されたすべての態様は、免疫グロブリンのFcドメインと結合領域とを含む親ポリペプチド、第1の親ポリペプチドまたは第2の親ポリペプチドに関する態様としても解釈されるべきであることが理解されるべきである。
(i)前記第1の変異体がヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439に対応する位置に変異を含み、前記第2の変異体がヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する位置に変異を含み、ただし、S440における変異がS440YでもS440Wでもないことを条件とし、
(ii)前記第1の変異体がヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447D/Eに対応する位置に変異を含み;前記第2の変異体がヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447K/R/Hおよび448Pに対応する位置に変異を含み、または
(iii)前記第1の変異体がヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447D/Eに対応する位置に変異を含み;前記第2の変異体がヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447K/R/H、448K/R/Hおよび449Pに対応する位置に変異を含む、
組成物に関する。
(i)前記第1の変異体がヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439に対応する位置に変異を含み、前記第2の変異体がヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する位置に変異を含み、ただし、S440における変異がS440YでもS440Wでもないことを条件とし、
(ii)前記第1の変異体がヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447D/Eに対応する位置に変異を含み;前記第2の変異体がヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447K/R/Hおよび448Pに対応する位置に変異を含み、または
(iii)前記第1の変異体がヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447D/Eに対応する位置に変異を含み;前記第2の変異体がヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447K/R/H、448K/R/Hおよび449Pに対応する位置に変異を含む、
組成物に関する。
(i)
(a)アロステリック変異をもたらすCH2-CH3領域内のアミノ酸残基、
(b)CH2-CH3領域の疎水性ノブ内のアミノ酸残基、
(c)N末端CH3ヘリックス内のアミノ酸残基、
(d)C末端CH3 β-ストランド内のアミノ酸残基、ただし、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する変異の場合に該変異がS440YまたはS440Wであることを条件とする、アミノ酸残基、および
(e)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345、E382またはQ386に対応するアミノ酸残基
の群から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基における、K439における変異以外の第1の変異、ならびに
(ii)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439に対応する位置にある第2の変異
を含み、かつ
第2の変異体は免疫グロブリンの第2のFcドメインと抗原結合領域とを含み、該第2の変異体は
(i)
(a)アロステリック変異をもたらすCH2-CH3領域内のアミノ酸残基、
(b)CH2-CH3領域の疎水性ノブ内のアミノ酸残基、
(c)N末端CH3ヘリックス内のアミノ酸残基、
(d)C末端CH3 β-ストランド内のアミノ酸残基、および
(e)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345、E382またはQ386に対応するアミノ酸残基、
の群から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基における、S440における変異以外の第1の変異、ならびに
(ii)IgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する位置にある第2の変異、ただし、S440における変異がS440YでもS440Wでもないことを条件とする、変異
を含む。
(i)
(a)アロステリック変異をもたらすCH2-CH3領域内のアミノ酸残基、
(b)CH2-CH3領域の疎水性ノブ内のアミノ酸残基、
(c)N末端CH3ヘリックス内のアミノ酸残基、
(d)C末端CH3 β-ストランド内のアミノ酸残基、ただし、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する変異の場合に該変異がS440YまたはS440Wであることを条件とする、アミノ酸残基、および
(e)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345、E382またはQ386に対応するアミノ酸残基
の群から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基における、K439における変異以外の第1の変異、ならびに
(ii)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439に対応する位置にある第2の変異
を含み、かつ
第2の変異体はヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する位置に変異を含み、それはS440YでもS440Wでもない。
第2の変異体は免疫グロブリンの第2のFcドメインと抗原結合領域とを含み、該第2の変異体は、
(i)
(a)アロステリック変異をもたらすCH2-CH3領域内のアミノ酸残基、
(b)CH2-CH3領域の疎水性ノブ内のアミノ酸残基、
(c)N末端CH3ヘリックス内のアミノ酸残基、
(d)C末端CH3 β-ストランド内のアミノ酸残基、および
(e)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345、E382またはQ386に対応するアミノ酸残基、
の群から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基における、S440における変異以外の第1の変異、ならびに
(ii)IgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する位置にある第2の変異、ただし、S440における変異がS440YでもS440Wでもないことを条件とする、変異
を含む。
該第1の変異体が免疫グロブリンの第1のFcドメインと第1の抗原結合領域とを含み、第1の変異体が、
(a)アロステリック変異をもたらすCH2-CH3領域内のアミノ酸残基、
(b)CH2-CH3領域の疎水性ノブ内のアミノ酸残基、
(c)N末端CH3ヘリックス内のアミノ酸残基、
(d)C末端CH3 β-ストランド内のアミノ酸残基、ただし、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する変異の場合に該変異がS440YまたはS440Wであることを条件とする、アミノ酸残基、および
(e)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345、E382またはQ386に対応するアミノ酸残基
の群から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基に第1の変異を含み、かつ
第2の変異体が、
(a)アロステリック変異をもたらすCH2-CH3領域内のアミノ酸残基、
(b)CH2-CH3領域の疎水性ノブ内のアミノ酸残基、
(c)N末端CH3ヘリックス内のアミノ酸残基、
(d)C末端CH3 β-ストランド内のアミノ酸残基、ただし、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する変異の場合に該変異がS440YまたはS440Wであることを条件とする、アミノ酸残基、および
(e)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345、E382またはQ386に対応するアミノ酸残基
の群から選択されるアミノ酸残基に変異を含まない、組成物に関する。
(i)
(a)アロステリック変異をもたらすCH2-CH3領域内のアミノ酸残基、
(b)CH2-CH3領域の疎水性ノブ内のアミノ酸残基、
(c)N末端CH3ヘリックス内のアミノ酸残基、
(d)C末端CH3 β-ストランド内のアミノ酸残基、ただし、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する変異の場合に該変異がS440YまたはS440Wであることを条件とする、アミノ酸残基、および
(e)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345、E382またはQ386に対応するアミノ酸残基
の群から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基における、K439における変異以外の第1の変異、ならびに
(ii)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439に対応する位置にある第2の変異
を含み、かつ
第2の変異体がヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する位置に変異を含み、それがS440YでもS440Wでもない、態様にも関する。
第2の変異体が免疫グロブリンの第2のFcドメインと抗原結合領域とを含み、該第2の変異体が、
(i)
(a)アロステリック変異をもたらすCH2-CH3領域内のアミノ酸残基、
(b)CH2-CH3領域の疎水性ノブ内のアミノ酸残基、
(c)N末端CH3ヘリックス内のアミノ酸残基、
(d)C末端CH3 β-ストランド内のアミノ酸残基、および
(e)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345、E382またはQ386に対応するアミノ酸残基、
の群から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基における、S440における変異以外の第1の変異、ならびに
(ii)IgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する位置にある第2の変異、ただし、S440における変異がS440YでもS440Wでもないことを条件とする、変異
を含む態様にも関する。
(a)アロステリック変異をもたらすCH2-CH3領域内のアミノ酸残基、
(b)CH2-CH3領域の疎水性ノブ内のアミノ酸残基、
(c)N末端CH3ヘリックス内のアミノ酸残基、
(d)C末端CH3 β-ストランド内のアミノ酸残基、ただし、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する変異の場合に該変異がS440YまたはS440Wであることを条件とする、アミノ酸残基、および
(e)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345、E382またはQ386に対応するアミノ酸残基
の群から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基に第1の変異を含み、かつ
第2の変異体が免疫グロブリンの第2のFcドメインと第2の抗原結合領域とを含み、該第2の変異体が、
(a)アロステリック変異をもたらすCH2-CH3領域内のアミノ酸残基、
(b)CH2-CH3領域の疎水性ノブ内のアミノ酸残基、
(c)N末端CH3ヘリックス内のアミノ酸残基、
(d)C末端CH3 β-ストランド内のアミノ酸残基、ただし、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する変異の場合に該変異がS440YまたはS440Wであることを条件とする、アミノ酸残基、および
(e)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345、E382またはQ386に対応するアミノ酸残基
の群から選択されるアミノ酸残基に変異を含まない、
組成物に関する。
親抗体、第1の親抗体または第2の親抗体に言及して本明細書において記載されたすべての態様は、免疫グロブリンのFcドメインと結合領域とを含む親ポリペプチド、第1の親ポリペプチドまたは第2の親ポリペプチドに関する態様としても解釈されるべきであることが理解されるべきである。
(i)前記第1の変異体がヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439に対応する位置に変異を含み、かつ前記第2の変異体がヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する位置に変異を含み、ただし、S440における変異がS440YでもS440Wでもないことを条件とし、
(ii)前記第1の変異体がヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447D/Eに対応する位置に変異を含み;かつ前記第2の変異体がヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447K/R/Hおよび448Pに対応する位置に変異を含み、または
(iii)前記第1の変異体がヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447D/Eに対応する位置に変異を含み;かつ前記第2の変異体がヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447K/R/H、448K/R/Hおよび449Pに対応する位置に変異を含む、
キット・オブ・パーツに関する。
(i)前記第1の変異体がヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439に対応する位置に変異を含み、前記第2の変異体がヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する位置に変異を含み、ただし、S440における変異がS440YでもS440Wでもないことを条件とし、
(ii)前記第1の変異体がヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447D/Eに対応する位置に変異を含み;かつ前記第2の変異体がヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447K/R/Hおよび448Pに対応する位置に変異を含み、または
(iii)前記第1の変異体がヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447D/Eに対応する位置に変異を含み;かつ前記第2の変異体がヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447K/R/H、448K/R/Hおよび449Pに対応する位置に変異を含む、
キット・オブ・パーツに関する。
第1の変異体は免疫グロブリンの第1のFcドメインと抗原結合領域とを含み、該第1の変異体は、
(i)
(a)アロステリック変異をもたらすCH2-CH3領域内のアミノ酸残基、
(b)CH2-CH3領域の疎水性ノブ内のアミノ酸残基、
(c)N末端CH3ヘリックス内のアミノ酸残基、
(d)C末端CH3 β-ストランド内のアミノ酸残基、ただし、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する変異の場合に該変異がS440YまたはS440Wであることを条件とする、アミノ酸残基、および
(e)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345、E382またはQ386に対応するアミノ酸残基
の群から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基における、K439における変異以外の第1の変異、ならびに
(ii)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439に対応する位置にある第2の変異
を含み、かつ
第2の変異体は免疫グロブリンの第2のFcドメインと抗原結合領域とを含み、該第2の変異体は
(i)
(a)アロステリック変異をもたらすCH2-CH3領域内のアミノ酸残基、
(b)CH2-CH3領域の疎水性ノブ内のアミノ酸残基、
(c)N末端CH3ヘリックス内のアミノ酸残基、
(d)C末端CH3 β-ストランド内のアミノ酸残基、および
(e)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345、E382またはQ386に対応するアミノ酸残基
の群から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基における、S440における変異以外の第1の変異、ならびに
(ii)IgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する位置にある第2の変異、ただし、S440における変異がS440YでもS440Wでもないことを条件とする、変異
を含む。
(i)
(a)アロステリック変異をもたらすCH2-CH3領域内のアミノ酸残基、
(b)CH2-CH3領域の疎水性ノブ内のアミノ酸残基、
(c)N末端CH3ヘリックス内のアミノ酸残基、
(d)C末端CH3 β-ストランド内のアミノ酸残基、ただし、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する変異の場合に該変異がS440YまたはS440Wであることを条件とする、アミノ酸残基、および
(e)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345、E382またはQ386に対応するアミノ酸残基
の群から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基における、K439における変異以外の第1の変異、ならびに
(ii)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439に対応する位置にある第2の変異
を含み、かつ
第2の変異体はヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する位置に変異を含み、それはS440YでもS440Wでもない。
第1の変異体はヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439に対応する位置に変異を含み;かつ
第2の変異体は免疫グロブリンの第2のFcドメインと抗原結合領域とを含み、ここで該第2の変異体は
(i)
(a)アロステリック変異をもたらすCH2-CH3領域内のアミノ酸残基、
(b)CH2-CH3領域の疎水性ノブ内のアミノ酸残基、
(c)N末端CH3ヘリックス内のアミノ酸残基、
(d)C末端CH3 β-ストランド内のアミノ酸残基、および
(e)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345、E382またはQ386に対応するアミノ酸残基
の群から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基における、S440における変異以外の第1の変異、ならびに
(ii)IgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する位置にある第2の変異、ただし、S440における変異がS440YでもS440Wでもないことを条件とする、変異
を含む。
ここで第1の変異体は免疫グロブリンの第1のFcドメインと第1の抗原結合領域とを含み、第1の変異体が、
(a)アロステリック変異をもたらすCH2-CH3領域内のアミノ酸残基、
(b)CH2-CH3領域の疎水性ノブ内のアミノ酸残基、
(c)N末端CH3ヘリックス内のアミノ酸残基、
(d)C末端CH3 β-ストランド内のアミノ酸残基、ただし、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する変異の場合に該変異がS440YまたはS440Wであることを条件とする、アミノ酸残基、および
(e)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345、E382またはQ386に対応するアミノ酸残基
の群から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基に第1の変異を含み、かつ
第2の変異体が、
(a)アロステリック変異をもたらすCH2-CH3領域内のアミノ酸残基、
(b)CH2-CH3領域の疎水性ノブ内のアミノ酸残基、
(c)N末端CH3ヘリックス内のアミノ酸残基、
(d)C末端CH3 β-ストランド内のアミノ酸残基、ただし、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する変異の場合に該変異がS440YまたはS440Wであることを条件とする、アミノ酸残基、および
(e)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345、E382またはQ386に対応するアミノ酸残基
の群から選択されるアミノ酸残基に変異を含まない、キット・オブ・パーツに関する。
(i)
(a)アロステリック変異をもたらすCH2-CH3領域内のアミノ酸残基、
(b)CH2-CH3領域の疎水性ノブ内のアミノ酸残基、
(c)N末端CH3ヘリックス内のアミノ酸残基、
(d)C末端CH3 β-ストランド内のアミノ酸残基、ただし、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する変異の場合に該変異がS440YまたはS440Wであることを条件とする、アミノ酸残基、および
(e)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345、E382またはQ386に対応するアミノ酸残基
の群から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基における、K439における変異以外の第1の変異、ならびに
(ii)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439に対応する位置にある第2の変異
を含み、かつ
第2の変異体がヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する位置に変異を含み、それがS440YでもS440Wでもない
態様にも関する。
第2の変異体が免疫グロブリンの第2のFcドメインと抗原結合領域とを含み、該第2の変異体が
(i)
(a)アロステリック変異をもたらすCH2-CH3領域内のアミノ酸残基、
(b)CH2-CH3領域の疎水性ノブ内のアミノ酸残基、
(c)N末端CH3ヘリックス内のアミノ酸残基、
(d)C末端CH3 β-ストランド内のアミノ酸残基、および
(e)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345、E382またはQ386に対応するアミノ酸残基
の群から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基における、S440における変異以外の第1の変異、ならびに
(ii)IgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する位置にある第2の変異、ただし、S440における変異がS440YでもS440Wでもないことを条件とする、変異
を含む、態様にも関する。
第1の変異体が免疫グロブリンの第1のFcドメインと第1の抗原結合領域とを含み、該第1の変異体が、
(a)アロステリック変異をもたらすCH2-CH3領域内のアミノ酸残基、
(b)CH2-CH3領域の疎水性ノブ内のアミノ酸残基、
(c)N末端CH3ヘリックス内のアミノ酸残基、
(d)C末端CH3 β-ストランド内のアミノ酸残基、ただし、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する変異の場合に該変異がS440YまたはS440Wであることを条件とする、アミノ酸残基、および
(e)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345、E382またはQ386に対応するアミノ酸残基
の群から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基に第1の変異を含み、かつ
第2の変異体が免疫グロブリンの第2のFcドメインと第2の抗原結合領域とを含み、該第2の変異体が、
(a)アロステリック変異をもたらすCH2-CH3領域内のアミノ酸残基、
(b)CH2-CH3領域の疎水性ノブ内のアミノ酸残基、
(c)N末端CH3ヘリックス内のアミノ酸残基、
(d)C末端CH3 β-ストランド内のアミノ酸残基、ただし、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する変異の場合に該変異がS440YまたはS440Wであることを条件とする、アミノ酸残基、および
(e)ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345、E382またはQ386に対応するアミノ酸残基
の群から選択されるアミノ酸残基に変異を含まない、
キット・オブ・パーツに関する。
親抗体、第1の親抗体または第2の親抗体に言及して本明細書において記載されたすべての態様は、免疫グロブリンのFcドメインと結合領域とを含む親ポリペプチド、第1の親ポリペプチドまたは第2の親ポリペプチドに関する態様としても解釈されるべきであることが理解されるべきである。
親抗体、第1の親抗体または第2の親抗体に言及して本明細書において記載されたすべての態様は、免疫グロブリンのFcドメインと結合領域とを含む親ポリペプチド、第1の親ポリペプチドまたは第2の親ポリペプチドに関する態様としても解釈されるべきであることが理解されるべきである。
親抗体、第1の親抗体または第2の親抗体に言及して本明細書において記載されたすべての態様は、免疫グロブリンのFcドメインと結合領域とを含む親ポリペプチド、第1の親ポリペプチドまたは第2の親ポリペプチドに関する態様としても解釈されるべきであることが理解されるべきである。
親抗体、第1の親抗体または第2の親抗体に言及して本明細書において記載されたすべての態様は、免疫グロブリンのFcドメインと結合領域とを含む親ポリペプチド、第1の親ポリペプチドまたは第2の親ポリペプチドに関する態様としても解釈されるべきであることが理解されるべきである。
親抗体、第1の親抗体または第2の親抗体に言及して本明細書において記載されたすべての態様は、免疫グロブリンのFcドメインと結合領域とを含む親ポリペプチド、第1の親ポリペプチドまたは第2の親ポリペプチドに関する態様としても解釈されるべきであることが理解されるべきである。
a)該変異体の該Fc領域をコードするヌクレオチド構築物を用意する段階、
b)該ヌクレオチド構築物を宿主細胞において発現させる段階、および
c)該宿主細胞の細胞培養物から該抗体変異体を回収する段階。
7D8変異体の設計および作製
ヒトモノクローナル抗体HuMab-7D8(WO 2004/035607号に記載)をモデル抗体として用いた。これは、オファツムマブ(HuMax-CD20、2F2)を含むヒト抗CD20 IgG1抗体の一群に属する。これらの抗体はCD20分子上の独特な膜近位エピトープを標的とし、強いCDCを示す。
7D8変異体による細胞上でのCD20結合
精製した抗体試料のCD20陽性細胞に対する結合をFACS分析によって分析した。第1のセットの変異(表3)をDaudi細胞において試験し、第2のセットの変異(表4)はRaji細胞において試験した。ポリスチレン製96ウェル丸底プレート(Greiner bio-one 650101)中にて、105個の細胞を50μL中で、RPMI1640/0.1% BSA中にある抗体調製物の系列希釈物(Daudiに対する第1のセットについては3倍希釈で0.04~10μg/mLの範囲、Rajiに対する第2のセットについては3倍希釈で0.003~10μg/mLの範囲)とともに4℃で30分間インキュベートした。RPMI1640/0.1% BSAにて2回洗浄した後に、細胞を100μL中で、二次抗体とともに4℃で30分間インキュベートした。二次抗体としては、フルオロセインイソチオシアネート(FITC)結合ウサギ-抗ヒトIgG(F0056, Dako, Glostrup, Denmark;1/100)を、Daudi細胞に対するすべての実験、およびRaji細胞に対する7D8抗体による実験に用いた。Raji細胞に対する精製7D8抗体による実験については、R-フィコエリトリン(R-PE)結合ヤギF(ab')2抗ヒトκ軽鎖(2062-09、SouthernBiotech;1/500)を二次抗体として用いた。次に、細胞をPBS/0.1% BSA/0.02%アジドにて2回洗浄し、100μLのPBS/0.1% BSA/0.02%アジド中に再懸濁させた上で、FACS Cantoll(BD Biosciences)にて分析した。結合曲線を、GraphPad Prism V5.01ソフトウエア(GraphPad Software, San Diego, CA, USA)を用いる非線形回帰(可変勾配によるシグモイド用量反応)を用いて解析した。
7D8変異体によるC1q結合ELISA
精製抗体をプラスチック表面上にコーティングしてランダムな抗体多量体化を生じさせるELISAにおいて、7D8変異体によるC1q結合について試験した。プールヒト血清をC1qの供給源として用いた。
1 平均およびSDは、少なくとも3回の実験から算出した。
2 統計:Dunnett多重比較検定(GraphPad Prism 5.01)を用いた対数変換データに対する一元配置ANOVA。有意性は野生型IgG1-7D8との比較で算出した:(na)該当なし (ns)非有意 (*)p=0.01~0.05 (**)p=0.001~0.01 (***)p<0.001。
7D8変異体による細胞上でのC1q結合
プラスチック表面上に抗体をコーティングすることにより、抗体結合およびFc尾部提示に関する人工的な静止系が得られる。そのため、細胞ベースアッセイにより補体結合についても試験した。ここでは、抗体によりオプソニン化されたCD20陽性B細胞における結合をFACS分析によって測定した。セット1の変異体を用いる実験では、Daudi細胞またはRaji細胞を氷上で、10% FBSを含む90μLのRPMI1640培地中に懸濁させた(2×106個/mL)。10μLのC1q濃度系列(Complement Technologies, Tyler, TX)を添加した(最大結合に応じて、最終濃度範囲は0~60μg/mLおよび0~140μg/mLの間でさまざまである)。続いて、10μLの精製抗体(最終濃度10μg/mL、すなわち飽和濃度)を添加し、反応混合物を直ちに37℃水浴に移して、1時間インキュベートした。セット2の変異体を用いる実験では、試験mAbを大量にDaudi細胞に添加し、続いてさまざまな濃度のC1qをアリコートに添加した上で、混合物を上記の通りにインキュベートした。細胞をPBS/1% BSAで3回洗浄し、ウサギFITC-標識抗C1q抗体(DakoCytomation、10ug/mL)ととともに室温で30分間インキュベートした。細胞をPBS/1% BSAで洗浄して、PBS中に再懸濁させるか、または2%ホルムアミドを含むPBS中で固定した。フローサイトメトリーをFACSCalibur flow cytometer(BD Biosciences)で行い、較正されたビーズ(Spherotech)を用いて、平均蛍光強度を可溶性蛍光色素分子等量(MESF)に変換した。指定の7D8抗体でオプソニン化したCD20陽性細胞に対するC1qの結合の解離定数(KD値)を、SigmaPlot(登録商標)ソフトウエア(Systat Software Inc., Washington)を用いて算出した。平均KD値を反復結合実験(Daudi細胞においては4回、Raji細胞においては3回)によって算出し、野生型7D8でオプソニン化した細胞上のC1q結合に関するKD値と比較した(表7および表8)。
* 野生型7D8との比較(t-検定)
**(na)該当なし
*** 7D8の平均KDは実験1、2、3、4、10および11から算出した。
**** これらの変異体の結合が弱すぎるため、信頼性のある適合曲線およびKD値を計測することができなかった。
* 野生型7D8との比較(t-検定)
**(na)該当なし
*** 7D8の平均KDは実験1、2、3、4、10および11から算出した。
CD20陽性Raji細胞でのCDCアッセイにおける7D8変異体によるC1q活性
観察されたC1q結合力の変化がCDC活性に及ぼす影響について調べるために、IgG1-7D8変異体でオプソニン化した細胞を用いたC1q活性を、CDCアッセイにおいて試験した。すなわち、所定の濃度系列のC1qを加えたC1q枯渇正常ヒト血清を用いて、CDCアッセイを行った。0.1×106個のRaji細胞を、丸底96ウェルプレート(Nunc, Rochester, NY)中にて、0.1% BSAを加えた総容積100μLのRPMI1640培地中で、10μg/mLの精製抗体およびヒトC1qの濃度系列(0.005、0.025、0.1、0.3、1.0、5.0、30.0μg/mL)とともに室温で15分間プレインキュベートした。次に、25μLのC1q枯渇血清(Quidel, San Diego, CA)を添加して、37℃にて水浴中で30分間インキュベートするか、またはインキュベーター内で45分間インキュベートした。インキュベーション後に、試料を氷上に置くことによって反応を停止させた。細胞溶解については、ヨウ化プロピジウム(PI, Sigma Aldrich, Zwijndrecht, Netherlands)生細胞排除アッセイを用いることによってFACSで決定した。溶解率(% lysis)は以下の通りに求めた:溶解率=(PI陽性細胞の数/細胞の総数)×100%。
(1)(n)実験の数
(2)平均およびSDは、実施したすべての実験から算出した。
(3)統計:Dunnett多重比較検定(GraphPad Prism 5.01)を用いた対数変換データに対する一元配置ANOVA。有意性は野生型IgG1-7D8との比較で算出した:(na)該当なし (nd)未決定 (ns)非有意 (*)p=0.01~0.05 (**)p=0.001~0.01 (***)p<0.001。
(4)溶解が50%に達しない場合には、CH50を>30μg/mLに設定した
(5)溶解度50%に達しなかった変異体についてはP値を決定することができなかった。しかし、これらはIgG1-7D8-WTとは有意に異なるものと推測される。
CD20陽性細胞でのCDCアッセイにおける、7D8変異体によるCDC
0.1×106個の細胞を、丸底96ウェルプレート(Nunc, Rochester, NY)中にて、総容積80μL中で、抗体の濃度系列(0.01、0.03、0.1、0.3、1.0、3.0、10.0、30.0μg/mL)とともに、振盪機上にて室温で15分間プレインキュベートした。次に、20μLの正常ヒト血清をC1qの供給源として添加し(最終濃度20%)、37℃のインキュベーター内で45分間インキュベートした。0.1% BSAを加えた30μLの氷冷RPMI培地を添加することによって反応を停止させた。細胞溶解は、ヨウ化プロピジウムを用いることによってFACSで決定した。
については野生型7D8よりも有意に不良なCDC(より高いEC50)が見いだされ、これらは高い抗体濃度でしかCDCを誘導しなかった;対照として含めたC1q結合能欠損性変異体IgG1-7D8-K322Aは、CDCを誘導する能力をほぼ完全に喪失しており、試験した濃度ではEC50に達しなかった;IgG1-7D8-H435Rは、Daudi細胞において、野生型7D8よりも効率的なCDCを示した。重要なこととして、C1q活性CDCアッセイと一致して、E345RはDaudi細胞において野生型7D8よりも劇的に良好なCDCを示し、EC50値が10分の1の低さであった(表10)。図8は、いずれも単一変異体としてはCDCの喪失をもたらすK439E変異とS440K変異を組み合わせることにより、両方の変異を1つの分子中に組み合わせた場合(K439E/S440K二重変異体)に、または両方の単一変異体を組み合わせた場合(K439E+S440K混合物)に、CDCが回復したことを示している。
(1)(n)実験の数
(2)平均およびSDは、実施したすべての実験から算出した。
(3)統計:Dunnett多重比較検定(GraphPad Prism 5.01)を用いた対数変換データに対する一元配置ANOVA。有意性は野生型7D8との比較で算出した:(na)該当なし (nd)未決定 (ns)非有意 (*)p=0.01~0.05 (**)p=0.001~0.01 (***)p<0.001。
(4)溶解が50%に達しない場合には、EC50を>30μg/mLに設定した
(5)EC50に達しなかった変異体についてはP値を決定することができなかった。しかし、これらは野生型7D8-WTとは有意に異なるものと推測される。
(1)(n)実験の数
(2)平均およびSDは、実施したすべての実験から算出した。
(3)統計:Dunnett多重比較検定(GraphPad Prism 5.01)を用いた対数変換データに対する一元配置ANOVA。有意性は野生型IgG1-7D8との比較で算出した:(na)該当なし (nd)未決定 (ns)非有意 (*)p=0.01~0.05 (**)p=0.001~0.01 (***)p<0.001。
(4)CH50に達しない場合には、CH50を>30μg/mLに設定した
(5)EC50に達しなかった変異体についてはP値を決定することができなかった。しかし、これらは野生型7D8-WTとは有意に異なるものと推測される。
CDC誘導能による7D8変異体のランク付け
試験した7D8変異体について、Daudi細胞におけるC1q結合アッセイ(実施例4に記載)とRaji細胞におけるC1q活性アッセイ(実施例5に記載)との間、ならびにDaudi細胞におけるC1q結合アッセイとDaudi細胞およびRaji細胞おけるCDCアッセイとの間(実施例6に記載)に相関が見いだされた(相関データ表13)。そのため、Daudi細胞における結合アッセイのKD値を用いて、試験したすべての7D8変異体を、表12に示すように、それらがCDCを誘導する能力に従ってランク付けした。
* 信頼性のある適合曲線がない。イタリック体のKD値は、これらの変異体の結合が弱すぎるため、測定することができなかった。
CD38抗体005変異体の設計および作製
ヒトモノクローナル抗体HuMab 005は、WO/2006/099875号に記載されている完全ヒトIgG1,κ抗体である。本明細書ではそれを、同定されたFc変異がCDC活性を増強することを検証するためのモデル抗体として用いた。試験した変異は表14に列記されている。
HuMab-005変異体による細胞上でのCD38結合
CD38陽性Daudi細胞およびRaji細胞に対する非精製抗体試料の結合を、FACS分析によって分析した。105個の細胞を、ポリスチレン製96ウェル丸底プレート中にて、100μL中で、RPMI1640/0.1% BSA中にある抗体調製物の系列希釈物(0.01、0.03、0.1、0.3、1.0、3.0、10.0、30.0μg/mL)とともに、4℃で30分間インキュベートした。RPMI1640/0.1% BSAにて2回洗浄した後に、細胞を、FITC結合ウサギF(ab')2抗ヒトIgG(カタログ番号F0056;DAKO;1:150)とともに、50μL中で、4℃で30分間インキュベートした。次に、細胞をPBS/0.1% BSA/0.02%アジドにて2回洗浄し、100μL PBS/0.1% BSA/0.02%アジド中に再懸濁させた上で、FACS Cantoll(BD Biosciences)で分析した。結合曲線はGraphPad Prism V5.01ソフトウエアを用いて解析した。陰性対照として、擬似トランスフェクトした細胞の上清を用いた。
CD38抗体005の変異体による、CD38陽性細胞でのCDCアッセイ
0.1×106個のDaudi細胞またはRaji細胞を、丸底96ウェルプレート中にて、総容積100μLで、非精製抗体の濃度系列(0.01、0.03、0.1、0.3、1.0、3.0、10.0、30.0μg/mL)とともに、振盪機上にて室温で15分間プレインキュベートした。次に、25μLの正常ヒト血清をC1qの供給源として添加し(最終濃度20%)、37℃のインキュベーター内で45分間インキュベートした。プレートを氷上に載せることによって反応を停止させた。10μLのヨウ化プロピジウムを添加し、細胞溶解をFACSによって決定した。
CDC増強性変異E345Rを含むIgG1抗体は、野生型抗体よりも、Fc結合ペプチドDCAWHLGELVWCTによるCDCの阻害に対する感受性が低い
IgGのFc:Fc境界面にある疎水性パッチ中のアミノ酸位置を変異させることによって、CDCの活性が損なわれること、または増強されることが見いだされた。b12結晶構造において観察されているような、Fc-Fc境界面での相互作用、およびそれ故に可能性としてオリゴマー(例えば、ヘキサマー環)構造の形成がCDCの活性に及ぼす関与についてさらに調べた。すなわち、野生型IgG Fcの表面上の疎水性パッチ領域におけるコンセンサス結合部位を標的とする、13残基のペプチド(DCAWHLGELVWCT(SEQ ID NO:9))を用いた(Delano et al., Science 2000 Feb 18; 287(5456): 1279-83)。実際に、種々の異なる分子との相互作用に向けて備わっている適応領域としてのIgG Fcの表面上のコンセンサス結合部位の実体(Delano et al., Science 2000 Feb 18;287(5456): 1279-83)は、IgG1 b12結晶構造においてFc-Fc相互作用に関与する疎水性パッチにおけるコアアミノ酸の実体と一致する(Saphire et al., Science 2001 Aug 10; 293(5532): 1155-9)。結合境界面のすべてに存在する相互作用は、共通する6つのアミノ酸のセット(Met-252、Ile-253、Ser-254、Asn-434、His-435およびTyr-436)、ならびに共通の骨格接触によって媒介される(Delano et al., Science 2000 Feb 18;287(5456): 1279-83)。そのため、Fc結合ペプチドはFc-Fc相互作用に影響を及ぼし、その結果としてCDCの活性にも影響を及ぼすと予想される。
CD38抗体HuMAb 005の変異体によるCD38発現細胞の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用(ADCC)
Daudi細胞を採取し(5×106個/ml)、洗浄(PBSにて2回、1200rpm、5分間)した上で、10%コスミック仔ウシ血清(cosmic calf serum)(CCS)(HyClone, Logan, UT, USA)を加えた1mLのRPMI1640培地中に収集し、それに対して200μCiの51Cr(クロム-51;Amersham Biosciences Europe GmbH, Roosendaal, Netherlands)を添加した。混合物を振盪水浴中にて37℃で1時間インキュベートした。細胞の洗浄(PBSにて2回、1200rpm、5分間)の後に、細胞を、10% CCSを加えたRPMI1640培地中に再懸濁させ、トリパンブルー排除によって算定して、1×105個/mLの濃度に希釈した。
(試料cpm - Abと無関係な溶解のcpm)/(最大溶解のcpm - 自然発生的な溶解のcpm)×100%
野生型7D8と比較した7D8変異体のFcRn結合および薬物動態分析
新生児Fc受容体(FcRn)は、IgGを分解から防御することにより、IgGの長い血漿中半減期の原因となる。抗体の細胞内移行後に、FcRnはエンドソーム内で抗体Fc領域と結合するが、そこは相互作用が安定な穏やかな酸性環境(pH 6.0)にある。環境が中性(pH7.4)である原形質膜までリサイクルされると、相互作用がなくなり、抗体は再び血流中に放出される。これがIgGの血漿中半減期に影響する。
Fc結合性表面タンパク質を発現する細菌に対するIgG抗体の殺菌活性を高めるためのFc-Fc安定化変異E345Rの使用
補体カスケード系は病原体に対する重要な宿主防御機構であり、病原体を認識する上で3種の異なる活性化経路に分けることができる:i)病原体に結合した抗体へのC1q結合によって活性化される抗体媒介性古典的経路、ii)レクチン、およびiii)補体系が病原体を直接認識し、抗体がなくても病原体によって誘発される、代替経路。この3つの経路は、C3切断およびC3b沈着の段階で集束する。微生物は、補体回避の複数の機序を生み出しており、その1つはプロテインAによって媒介される(Joiner Ann. Rev. Microbiol. (1988) 42: 201-30;Foster Nat Rev Microbiol (2005) Dec;3(12) :948-58)。プロテインAは黄色ブドウ球菌の細胞壁で最初に同定され、IgGのFc領域に結合することがよく知られている(Deisenhofer et al., Biochem (1981) 20, 2361-70;Uhlen et al., J. Biol. Chem (1984) 259,1695-1702)。これまでのところ、プロテインAの抗食作用効果および黄色ブドウ球菌の病的作用におけるその役割は、プロテインAとIgGとの相互作用によって説明されており、当該相互作用は、好中球のFc受容体により認識される抗体の指向を誤ったものにする(Foster Nat Rev Microbiol (2005) Dec;3(12): 948-58)。
2つの異なる治療モノクローナル抗体の混合物による結合を同時に受けた標的細胞にCDC活性化を限定するCDC阻害性変異の使用
実施例6に記載したように、CD20抗体7D8の変異K439EおよびS440Kは、モノクローナル抗体としてのCDCの活性を低下させた。これらの変異を含有する7D8抗体を混合することにより、CDCが回復した。すなわち、効率的なCDCは、両方の変異型抗体による結合を同時に受けた細胞に限定された。実施例10に記載したように、CD38抗体005の変異K439EおよびS440K は、モノクローナル抗体としてのCDCの活性を低下させた。これらの変異を含有する005抗体を混合することにより、CDCが回復した。すなわち、効率的なCDCは、両方の変異型抗体による結合を同時に受けた細胞に限定された。
2つの異なるモノクローナル抗体の混合物において、E345Rを補完性の阻害性変異K439EおよびS440Kと組み合わせることによる、増強されたCDCの特異性の増強
実施例6に記載したように、CD20抗体7D8の変異K439EおよびS440Kは、モノクローナル抗体としてのCDCの活性を低下させた。これらの変異を含有する7D8抗体を混合することにより、CDCが回復した。すなわち、効率的なCDCは、両方の変異型抗体による結合を同時に受けた細胞に限定された。実施例10に記載したように、CD38抗体005の変異K439EおよびS440K は、モノクローナル抗体としてのCDCの活性を低下させた。これらの変異を含有する005抗体を混合することにより、CDCが回復した。すなわち、効率的なCDCは、両方の変異型抗体による結合を同時に受けた細胞に限定された。
効率的なCDC活性化を、治療用に投与される抗体のみからなる抗体複合体に限定するためのCDC阻害性変異の使用
実施例6に記載したように、CD20抗体7D8の二重変異体K439E/S440Kは、K439EまたはS440K単一点変異体によって減じたCDC効率を回復させた。実施例10に記載したように、CD38抗体005の二重変異体K439E/S440Kは、K439EまたはS440K単一点変異体によって阻害されたCDC効率を回復させた。観察されたように、これらの単一点変異は、Fc:Fc境界面の対向面における変異していないアミノ酸とのFc:Fc相互作用を損なわせた。Fc:Fc境界面の対向面への代償変異の導入により、CDC効率が回復した。このように、効率的なCDCは、見たところ、両方の変異を含有する抗体からなる抗体複合体に限定された。
CDC活性化の増強を、治療用に投与された抗体のみからなる抗体複合体に限定する、CDC阻害性変異の使用
実施例6に記載したように、CD20抗体7D8の二重変異体K439E/S440Kは、K439EまたはS440K単一点変異体によって減じたCDC効率を回復させた。実施例10に記載したように、CD38抗体HuMAb 005の二重変異体K439E/S440Kは、K439EまたはS440K単一点変異体によって阻害されたCDC効率を回復させた。観察されたように、これらの単一点変異は、Fc:Fc境界面の対向面における変異していないアミノ酸とのFc:Fc相互作用を損なわせた。Fc:Fc境界面の対向面への代償変異の導入により、CDC効率が回復した。このように、効率的なCDCは、見たところ、両方の変異を含有する抗体のみからなる抗体複合体に限定された。
CDCアッセイによって検出されたFc:Fc相互作用を介する抗体オリゴマー形成を刺激する変異を同定するための、変異体スクリーニングアプローチの使用
実施例6および10に記載したように、CD20およびCD38という2つの異なる標的抗原を認識する抗体についてのCDCを、前記抗原をさまざまなレベルで発現する複数の細胞株に対して増強する、アミノ酸変異が同定された。驚いたことに、単一点変異E345Rは、抗CD38抗体005に対するWien133細胞のCDC依存性細胞溶解をもたらすには十分であるが、これらの細胞を野生型IgG1フォーマットでのCDCによって溶解させることはできないことが実証された。
*「del」は、表記の位置にアミノ酸残基の欠失があったことを意味する。
B細胞リンパ腫皮下異種移植モデルにおけるIgG1-7D8-E345Rのインビボ活性
IgG1-7D8-E345R抗体のインビボ抗腫瘍活性を、Raji-luc #2D1細胞による皮下モデルにおいて評価した。これらの細胞は細胞1個当たりほぼ300,000個のCD20分子(QIFIKIT分析による決定、データは提示せず)および高度の補体防御受容体発現を示す。10%コスミック仔ウシ血清(HyClone, Logan, UT)、ペニシリンおよびストレプトマイシン、1%(v/v)ピルビン酸ナトリウムならびに1μg/mLピューロマイシン(P-8833, Sigma, Zwijndrecht)を加えたRPMI中で細胞を培養した。細胞を対数増殖期(集密度およそ70%)に採取した。6~11週齡の雌性SCIDマウス(C.B-17/IcrPrkdc-scid/CRL)を用いた(Charles-River)。第0日に、200μL PBS中にある5×106個のRaji-luc #2D1細胞を各マウスの右側腹部に皮下注射した。腫瘍の発育をキャリパー測定によってモニターした。平均腫瘍体積が100mm3となった時点(第7日前後)で、マウスを複数群(n=9)に分けて、マウス1匹当たり抗体50μg(2.5mg/kg)の単回用量の腹腔内(i.p.)注射を行った。すべての抗体試料に無関係な抗体b12を加えて、総抗体濃度が0.5mg/mLになるようにした。処置群を表18に示している。処置から7日後に、抗体投与の適正さを確かめる目的でヒトIgG血清レベルを決定するために、血液試料を入手した。腫瘍の測定は、1500mm3というエンドポイント腫瘍体積に達するまで、腫瘍が潰瘍化を示すまで、または重篤な臨床徴候が観察されるまで、キャリパー(PLEXX)を用いて毎週少なくとも2回行った。
B細胞リンパ腫皮下異種移植モデルにおけるIgG1-005-E345Rのインビボ活性
IgG1-005-E345R抗体のインビボ抗腫瘍活性を、Raji-luc #2D1細胞による皮下モデルにおいて評価した。これらの細胞は細胞1個当たりほぼ150,000個のCD38分子(QIFIKIT分析による決定、データは提示せず)および高度の補体防御受容体発現を示す。腫瘍接種および測定に関するプロトコールは、実施例20に記載したものと基本的には同じである。第0日に、200μL PBS中にある5×106個のRaji-luc #2D1細胞をSCIDマウスの右側腹部に皮下注射した。平均腫瘍体積が100mm3となった時点(第7日前後)で、マウスを複数群(n=7)に分けて、マウス1匹当たり抗体500μg(25mg/kg)の単回用量の腹腔内(i.p.)注射を行った。処置群を表19に示している。大きな苦痛を避けるために、腫瘍の測定は、1500mm3というエンドポイント腫瘍体積に達するまで、腫瘍が潰瘍化を示すまで、または重篤な臨床徴候が観察されるまで行った。
一価標的結合はE345R抗体のCDC活性をさらに増強する
b12結晶構造において観察されるIgG1ヘキサマー環の分子表面は、ヘキサマー環内の各IgGについて、2つのC1q結合部位のうち一方は環構造に対して上向きであって、もう一方の部位は下向きであり、さらに各抗体の1つのFabアームは上方に配向し、1つは下方に配向していて、その結果、抗原結合にかかわるのは抗体1つ当たり1つのFabアームのみであることを明らかに示しており、このことはヘキサマー抗体環における抗体分子1つ当たりの結合が一価であることを示唆する。一価であることにより、抗体が抗原結合に際してヘキサマー化に適合した配向をとっている可能性がある。この仮説を検証するために、E345R変異を有する二重特異性CD38/EGFR抗体のCDC活性を、この二重特異性抗体がCD38を介して一価でしか結合することができないCD38陽性でEGFR陰性のWien133細胞において試験して、同じくE345R変異を有する二価結合CD38抗体のCDC活性と比較した。ヒトモノクローナル抗体HuMax-EGFr(2F8、WO 2004/056847号に記載)を、この実施例に記載したEGFR抗体の基礎になるものとして用いた。
オリゴマー形成増強性E345R変異は、DuoBody(商標)などの他の抗体フォーマットに適用しうる
E345R変異の効果を、DuoBodyフォーマットの二重特異性抗体において試験した。CDCアッセイを、CD20陽性でCD38陽性のWien133細胞およびRaji細胞においてCD20/CD38二重特異性抗体を用いて行った。
E345RはEGFR抗体2F8によるCDCを復旧させ、一価標的結合によってそれをさらに増強することができる
実施例6、10および26に記載したように、E345Rは種々の血液腫瘍標的を認識する抗体(CD20およびCD38)についてのCDCを増強するか、または復旧させた。この分析を固形腫瘍抗原にも拡張するために、EGFR抗体2F8のCDC能力に対するE345Rの効果を、A431類表皮癌細胞において試験した。さらに、E345R媒介性CDC誘導に対する一価EGFR標的化の効果についても、EGFR陽性でCD20陰性のA431細胞において二重特異性EGFR×CD20抗体(IgG1-2F8-E345R/F405L × IgG1-7D8-E345R/K409R)を用いて試験した。
E345Rは、CD38抗体003ならびにCD20抗体11B8およびリツキシマブによるCDCを増強するか、または復旧させる
実施例6、10および24に記載したように、E345Rは、前記抗原をさまざまなレベルで発現する複数の細胞株に対して試験されたように、いくつかの抗体のCDC活性を、異なる標的特異性(CD20、CD38およびEGFR)で増強するか、または誘導する。このことから、E345R変異の導入は、既存の抗体についてのCDCを増強するかまたは復旧させるための一般的な機序であると判断された。このことをさらに裏づけるために、CDCに対するE345R変異の効果を、Daudi細胞およびWien133細胞に対する固有のCDC活性がさまざまであるさらなる抗体:WO 2006/099875号に記載されたCD38抗体003、ならびにWO 2005/103081号に記載されたCD20抗体リツキシマブ(I型)および11B8(II型)に関しても試験した。CD20抗体は2つのサブグループに分けることができる(Beers et al. Seminars in Hematology 47, (2) 2010, 107-114)。I型CD20抗体は、原形質膜中のCD20分子を脂質ラフト中に再分布させ、そのことで抗体Fc領域をクラスター化してC1q結合を向上させることによって、補体を活性化してCDCを誘発する顕著な能力を呈する。II型CD20抗体はCD20分布を明らかには変化させず、それに付随するクラスター化も伴わず、それらはCDCへの効果が比較的低い。
E345Rは組織因子抗体の細胞内移行を増強する
増強されたオリゴマー形成によって抗体細胞内移行の増強が誘導されるか否かについて検討するために、野生型およびE345R変異型の組織因子(TF)抗体の共局在試験を、リソソームマーカーLAMP1を用いて、共焦点顕微鏡検査によって行った。
共局在率=APCピクセルと共局在するFITCのTPI/APCのTPI
TPI、総ピクセル強度
CD20発現は同程度であるが膜結合型補体調節タンパク質のレベルが異なる種々のB細胞株における、リツキシマブ中のE345R変異によるCDCの増強
実施例25および28は、Daudi細胞およびWien133細胞に対する野生型リツキシマブのCDC活性が、E345R変異を導入することによって増強されたことを示している。この増強されたCDC活性は、Fc-Fc相互作用のE345R媒介性安定化に起因する。続いて、それに伴って形成された標的細胞膜上のヘキサマー抗体環構造が、細胞膜の近傍にある活性化補体成分の捕捉および濃縮を助長することによって、膜傷害性複合体の効率的な生成を促進させることができる。この効率的な補体活性化の結果として、膜結合型補体調節タンパク質(mCRP)による阻害効果が部分的に克服されうると考えられる。CD55、CD46およびCD59などのmCRPの過剰発現は、モノクローナル抗腫瘍抗体を用いる免疫療法の奏効のための障害になると考えられている(Jurianz et al., Mol Immunol 1999 36 :929-39;Fishelson et al. Mol Immunol 2003 40: 109-23, Gorter et al., Immunol Today 1999 20: 576-82, Zell et al., Clin Exp Immunol. 2007 Dec 150(3): 576-84)。このことから、mCRPであるCD46、CD55およびCD59のレベルは異なるがCD20標的発現のレベルは同等である一連のB細胞株に対するリツキシマブ-E345Rの活性を、野生型リツキシマブのそれと比較した。
野生型抗体およびE345R抗体に関するCDC動態の比較
実施例6(DaudiおよびRajiに対するCD20抗体7D8)、実施例10(Daudi、RajiおよびWien133に対するCD38抗体005)ならびに実施例25(DaudiおよびWien133に対するCD38抗体003ならびにCD20抗体リツキシマブおよび11B8)に記載された種々の細胞株に対する種々の抗体に関するEC50値の低下および最大溶解の増強によって観察されたように、Fc:Fc相互作用を安定化するE345R変異の導入は、CDCを増強させるか、または復旧させることが示された。次に、野生型抗体とE345R抗体との間でのCDC活性の差をさらに解明するために、CDC反応の動態を分析した。
E345R変異を伴うか、または伴わない二重特異性抗体に関するCDC動態の比較
実施例23には、DuoBodyプラットフォームによって作製されたCD38×CD20二重特異性抗体であるIgG1-005-F405L × IgG1-7D8-K409Rに対してE345R変異を適用して、Raji細胞およびWien133細胞でのCDCアッセイにおけるEC50の低下によって観察されたように、致死能力の増強をもたらしうることが記載されている。次に、E345Rを伴うCD38×CD20二重特異性抗体とそれを伴わないものとの間でのCDC活性の差をさらに解明するために、CDC反応の動態を分析した。
E345Rを伴うおよび伴わない一価結合抗体に関するCDC動態の比較
実施例22は、一価標的結合により、CD38陽性でEGFR陰性のWien133細胞に対するCD38×EGFR二重特異性抗体による最大溶解の増強によって観察されたように、E345R抗体のCDC活性がさらに増強されたことを示している。次に、E345Rを伴う一価性結合抗体とそれを伴わないものとの間でのCDC媒介性致死能力の差をさらに解明するために、CDC反応の動態を分析した。
治療用抗体とE345R/Q386K抗体との組み合わせによるCDC
実施例19に記載したように、IgG1-005に由来する変異型CD38抗体は、野生型抗体のE345位置をグルタミン酸(E)以外の任意のアミノ酸に置換することによって、Wien133細胞において効率的なCDCを誘導することができた。このことは、CDCの前提条件としてのオリゴマー形成が、抗体の位置345でのグルタミン酸側鎖の存在によって妨げられることを示唆する。1つのFc上のE345は、ヘキサマー抗体環構造において対向する第2のFc部分上のQ386に近接しているため、第1の抗体におけるオリゴマー形成のE345媒介性妨害は、第2の抗体のQ386位置での置換によっておそらく取り除かれうると考えられる。これにより、続いて、第1の抗体におけるE345が、第2の抗体における変異させた386位置と、この両方の抗体を組み合わせた場合に、より良好に相互作用することが可能になると考えられる。この仮説を検証するために、Wien133に対して、一例として野生型抗体(IgG1-003、IgG1-005またはIgG1-11B8)をIgG1-005-E345R/Q386KまたはIgG1-005-E345R/Q386K/E430Gと混合するCDCアッセイを行った。
E345RはIgG2、IgG3およびIgG4抗体アイソタイプにおけるCDCを誘導した
オリゴマー形成促進性変異の導入によって、非IgG1抗体アイソタイプのCDC活性が刺激されうるか否かを検討するために、当技術分野において公知の方法によって、CD38抗体IgG1-005のアイソタイプ変異体をヒトIgG2、IgG3またはIgG4の定常ドメインを用いて作製し、IgG2-005、IgG3-005およびIgG4-005を得た。さらに、オリゴマー形成増強性E345R変異をこれらの抗体すべてに導入して、IgG2-005-E345R、IgG3-005-E345RおよびIgG4-005-E345Rを得た。同様の様式で、CD38抗体IgG1-003からIgG2-003およびIgG2-003-E345Rも作製した。種々のアイソタイプのCDC活性を、インビトロCDCアッセイにおいて比較した。
患者由来のCD38陽性B細胞慢性リンパ球白血病(CLL)細胞についてのエクスビボCDCアッセイにおけるIgG1-005およびIgG1-005-E345RによるCDC
CLL患者試料由来の凍結保存された初代細胞を、CDB-IDIBAPS-Hospital Clinic(Dr. Elias Campo, Hematopathology Unit, Department of Pathology, Hospital Clinic, Institut d'Investigacions Biomediques August Pi i Sunyer(IDIBAPS), University of Barcelona, Barcelona, Spain)からの血液学バイオバンク(hematopathology biobank)から、または米国国立心肺血液研究所(National Heart, Lung and Blood Institute(NHLBI))(Dr. Adrian Wiestner, NHLBI, Hematology Branch of the NationalInstitutes of Health(NIH), Bethesda)による臨床研究例から得た。Hospital Clinic(Barcelona, Spain)の国際倫理委員会(Institutional Ethics Committee)またはNIHの施設内審査委員会(Institutional Review Board)およびヘルシンキ宣言(Declaration of Helsinki)に準拠して、すべての患者からインフォームドコンセントを得た。すべての試料を、遺伝学的および免疫表現型的に特性決定した。
当業者は、通例の実験を用いて、本明細書に記載された本発明の具体的な態様の多くの同等物を認識し、または確認することができるであろう。そのような同等物は、以下の特許請求の範囲に含まれるものとする。従属請求項において開示された態様の任意のおよび全ての組み合わせも、本発明の範囲内にあると企図している。
Claims (12)
- 親抗体の補体依存性細胞傷害作用(CDC)を増強させる方法であって、ここで、親抗体が、免疫グロブリンの第1のCH2-CH3領域と第1の抗原結合領域とを含む第1のポリペプチド、および免疫グロブリンの第2のCH2-CH3領域と第2の抗原結合領域とを含む第2のポリペプチドを含む二重特異性抗体であり、該第1および第2の抗原結合領域が同じ抗原上または異なる抗原上の異なるエピトープと結合し、ここで、該第1および第2のCH2-CH3領域は、E345RもしくはE430G置換を含み、さらにここで、該第1のCH2-CH3領域がヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK409R、およびF405Lに対応するものから選択される位置にさらなるアミノ酸置換を含み;該第2のCH2-CH3領域がヒトIgG1重鎖のFc領域におけるF405L、およびK409Rに対応するものから選択される位置にさらなるアミノ酸置換を含み、かつ該第1のCH2-CH3領域における該さらなるアミノ酸置換が該第2のCH2-CH3領域における該さらなるアミノ酸置換とは異なる、方法。
- ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439およびS440に対応するアミノ酸残基のそれぞれに変異を導入する段階を含み、ただし、S440における変異がS440YでもS440Wでもないことを条件とする、請求項1記載の方法。
- ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439に対応する位置での変異がK439D/Eであり、またはヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する位置での変異がS440K/H/Rである、請求項2記載の方法。
- 前記抗体がその抗原と結合したときに前記補体依存性細胞傷害作用(CDC)が増強される、請求項1~3のいずれか一項記載の方法。
- 前記抗原が、抗原発現細胞、細胞膜またはビリオンの表面にある、請求項4記載の方法。
- 前記親抗体または第1の親抗体と第2の親抗体の前記組み合わせが、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE、またはヒト完全長IgG1抗体である、請求項1~5のいずれか一項記載の方法。
- 免疫グロブリンの第1のCH2-CH3領域と第1の抗原結合領域とを含む第1のポリペプチド、および免疫グロブリンの第2のCH2-CH3領域と第2の抗原結合領域とを含む第2のポリペプチドを含む二重特異性抗体である親抗体の変異体であって、該第1および第2の抗原結合領域が同じ抗原上または異なる抗原上の異なるエピトープと結合し、かつ
該第1および第2のCH2-CH3領域がそれぞれ、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345R、およびE430Gに対応するものから選択される第1の変異を含み、さらにここで、該第1のCH2-CH3領域は、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK409R、およびF405Lに対応するものから選択される位置にさらなるアミノ酸置換を含み;さらにここで、該第2のCH2-CH3領域は、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるF405L、およびK409Rに対応するものから選択される位置にさらなるアミノ酸置換を含み、さらにここで、該第1のCH2-CH3領域における該さらなるアミノ酸置換が該第2のCH2-CH3領域における該さらなるアミノ酸置換とは異なる、変異体。 - 薬物、毒素または放射性標識と結合体化されている、請求項7記載の変異体。
- 融合タンパク質の一部である、請求項7~8のいずれか一項記載の変異体。
- ヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE抗体、またはヒト完全長IgG1抗体である、請求項7~9のいずれか一項記載の変異体。
- 請求項7~10のいずれか一項記載の変異体と薬学的に許容される担体とを含む組成物。
- 癌の治療のための、請求項7~11のいずれか一項記載の変異体または組成物。
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