CN107228940A - 一种胱抑素c的检测试剂及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及体外诊断试剂技术领域,特别涉及一种胱抑素C的检测试剂及方法。该检测试剂由试剂1和试剂2组成;试剂1包括氯化铵、聚氧乙烯月桂醚、氯化钠、PEG6000、防腐剂和水;试剂2包括包被有胱抑素C单克隆抗体的胶乳微球、Tris‑Hcl缓冲液、蔗糖、明胶、NP30、防腐剂和水。本发明试剂的检测结果准确性高、精密度好,线性范围宽,特异性好,稳定性好,抗干扰能力强,方便在全自动生化分析仪上检测,适用范围广,便于推广使用。
Description
技术领域
本发明涉及体外诊断试剂技术领域,特别涉及一种胱抑素C的检测试剂及方法。
背景技术
胱抑素C是一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂,分子量为13.3KD,由122个氨基酸残基组成,可由机体所有有核细胞产生,产生率恒定。循环中的胱抑素C仅经肾小球滤过而被清除,是一种反映肾小球滤过率变化的内源性标志物,并在近曲小管重吸收,但重吸收后被完全代谢分解,不返回血液,因此,其血中浓度由肾小球滤过决定,而不依赖任何外来因素,如性别、年龄、饮食的影响,是一种反映肾小球滤过率变化的理想同源性标志物。它是新近发展起来的评估肾功能的一种敏感性好、特异性高的指标。
目前,胱抑素C的检测方法有:放射免疫法、ELISA法、免疫荧光法和胶乳免疫比浊法等,其中放射免疫法因其存在放射性污染,操作复杂,检测时间长已渐被市场淘汰;酶联免疫法受人为因素影响较大,且不适合急诊样本的检测;免疫荧光法灵敏度好,特异性强,结果快速、准确,但此方法需要昂贵的仪器,测定成本高,临床难以普及。其中免疫比浊法,快速简便、精密度高、易于自动化、适于大批量标本的同时检测,便于推广,适合临床检测。但需要的抗体用量大,对抗体要求高(应具有高特异性、高滴度和高亲和力),颗粒大小不同的胱抑素C会产生不一致的光散射与光吸收,而且受标本中的基质的影响较明显,容易受到类风湿因子的干扰,所以研发一种成本低、特异性好、偏差小的检测方法是目前的市场需求。
公开号为CN104360081A中公开了一种胱抑素C的检测试剂盒,包括彼此独立的试剂R1和试剂R2,试剂R1主要由缓冲液1、稳定剂1、防腐剂1、EDTA、增凝剂和保护剂1组成,试剂R2主要由交联胱抑素C抗体的聚苯乙烯胶乳微球、缓冲液2、稳定剂2、防腐剂2、保护剂2组成。但实施例中公开的试剂盒在抗干扰能力方面还存在一定的欠缺。
发明内容
有鉴于此,本发明提供了一种胱抑素C的检测试剂及方法。该检测试剂抗干扰能力强、特异性高、准确度高、稳定性好。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了一种胱抑素C的检测试剂,检测试剂由试剂1和试剂2组成;
试剂1包括氯化铵、聚氧乙烯月桂醚、氯化钠、PEG6000、防腐剂和水;
试剂2包括包被有胱抑素C单克隆抗体的胶乳微球、Tris-Hcl缓冲液、蔗糖、明胶、NP30、防腐剂和水。
作为优选,试剂1中各组分的含量为:
氯化铵:0.2~1.0mmol/L;
聚氧乙烯月桂醚:0.1~1.0wt%;
氯化钠:150mmol/L;
PEG6000:2wt%;
防腐剂:0.01~0.05wt%;
试剂1的pH值为7~9。
优选地,试剂1中各组分的含量为:
氯化铵:0.2mmol/L;
聚氧乙烯月桂醚:0.3wt%;
氯化钠:150mmol/L;
PEG6000:2wt%;
防腐剂:0.05wt%;
试剂1的pH值为7.5。
作为优选,试剂2中各组分的含量为:
包被有胱抑素C单克隆抗体的胶乳微球:0.05~0.2wt%;
Tris-Hcl缓冲液:20~80mmol/L;
蔗糖:1~5wt%;
明胶:0.2~0.8wt%;
NP30:0.05~0.2wt%;
防腐剂:0.3wt%;
试剂2的pH值为6~8。
优选地,试剂2中各组分的含量为:
包被有胱抑素C单克隆抗体的胶乳微球:0.1wt%;
Tris-Hcl缓冲液:50mmol/L;
蔗糖:3wt%;
明胶:0.5wt%;
NP30:0.1wt%;
防腐剂:0.3wt%;
试剂2的pH值为7。
作为优选,试剂1中防腐剂为叠氮钠。
作为优选,试剂2中防腐剂为Proclin300。
在本发明提供的实施例中,包被有胱抑素C单克隆抗体的胶乳微球是由胱抑素C单克隆抗体和胶乳微球采用化学交联法得到。
作为优选,抗体包被胶乳的化学交联剂为乙二胺(EDA)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)。
作为优选,抗体包被胶乳的封闭剂为甘氨酸缓冲液。
作为优选,甘氨酸缓冲液的质量浓度为1%~5%,pH值6.5~8.5。
作为优选,胱抑素C单克隆抗体为鼠抗人载胱抑素C单克隆抗体。
作为优选,胶乳微球为疏水微球,所述疏水微球为带磺酸基基团、羧基基团或醛基基团的一种或两种以上的胶乳微球。
作为优选,胶乳微球的平均粒径为80~120nm。
在本发明提供的实施例中,胶乳微球的平均粒径为99nm。
作为优选,胱抑素C单克隆抗体与胶乳微球的质量比为(0.1~1):100。
本发明还一种检测胱抑素C含量的方法,包括:待测样本加入试剂1中,孵育5~10min;再加入试剂2,孵育5~10min,在550nm波长下测定吸光度,通过胱抑素C的标准曲线得到待测样本中胱抑素C的含量;
试剂1包括氯化铵、聚氧乙烯月桂醚、氯化钠、PEG6000、防腐剂和水;
试剂2包括包被有胱抑素C单克隆抗体的胶乳微球、Tris-Hcl缓冲液、蔗糖、明胶、NP30、防腐剂和水。
作为优选,孵育的温度为37℃。
作为优选,孵育的时间为5分钟。
本发明提供了一种胱抑素C的检测试剂及方法。该检测试剂由试剂1和试剂2组成;试剂1包括氯化铵、聚氧乙烯月桂醚、氯化钠、PEG6000、防腐剂和水;试剂2包括包被有胱抑素C单克隆抗体的胶乳微球、Tris-Hcl缓冲液、蔗糖、明胶、NP30、防腐剂和水。本发明至少具有如下优势之一:
(1)本发明试剂的操作过程简单,相较于传统双试剂胶乳免疫比浊法,工作试剂无需配制,可直接在各种自动分析仪上使用。
(2)采用化学偶联的方法在胶乳微球上包被抗体,试剂稳定性良好。
(3)类风湿因子、溶血、黄疸和脂浊样本对测定结果没有明显干扰。
(4)本发明试剂的检测结果准确性高、灵敏度好,精密度好,重复性好,线性范围宽,特异性好,稳定性好,保存期长,方便在全自动生化分析仪上检测,适用范围广,便于推广使用。可很大程度上降低医院检测人员的工作强度,提高其工作效率,可广泛应用于各级医院、卫生预防部门和医学生物科研单位测定人血清中胱抑素C的含量。
具体实施方式
本发明公开了一种胱抑素C的检测试剂及方法,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
中英文对照:
Brij-35:聚氧乙烯月桂醚;
PEG:聚乙二醇;
NP30:壬基酚聚氧乙烯(30)醚。
本发明提供的胱抑素C的检测试剂及方法中所用试剂或仪器均可由市场购得。
以下实施例中市售国产胱抑素C试剂盒(胶乳增强免疫比浊法)的配方如下:
试剂1:50mmol/L含1.0%NaN3的甘氨酸缓冲液
试剂2:抗人Cys-C-IgG的致敏乳胶颗粒悬液
下面结合实施例,进一步阐述本发明:
实施例1:本发明检测胱抑素C的试剂及方法
本实施例检测胱抑素C的试剂包括:
试剂1:氯化铵0.2mol/L,叠氮钠0.05%,Brij-35 0.3%,氯化钠150mmol/L,PEG6000 2%,用氨水调pH值,pH 7.5;
试剂2:抗体包被的胶乳微粒(0.1%浓度),Tris-Hcl缓冲液50mmol/L,蔗糖3%,明胶0.5%,NP30 0.1%,Proclin300 0.3%,pH7.0。
其中,抗体包被的胶乳微粒的制备方法为:
(1)取1ml(10mg/mL)洗涤处理后的乳胶颗粒,加入到50mL的乙二胺(EDA,1mol/L,pH4.75)中,孵育90min。
(2)加入固体的EDC至终浓度10mM,缓慢搅拌90min。
(3)用纯净水充分洗涤,最后一次重悬于pH7.5的磷酸盐buffer中。
(4)抗体浓度大约7.5mg/ml10%的乳胶颗粒(直径99nm),加入到0.05mol/L磷酸盐,0.15mol/L NaCl的缓冲液中(pH7.5),反应6小时。
(5)加入终止液终止反应。终止液:甘氨酸1%,pH7.5,充分混匀2小时。
检测方法:由全自动生化分析仪加入3μL样本,180μL试剂1,37℃反应5分钟,再加入60μL试剂2,37℃反应5分钟,测定550nm的吸光度值,根据标准曲线计算样品中胱抑素C的百分含量。
实施例2:本发明试剂及方法的准确度分析
试验仪器:日立7080全自动生化分析仪
检测样品:20名体检者血样;
对比方法试剂盒:市售国产胱抑素C试剂盒(胶乳增强免疫比浊法);
用实施例1的检测方法和对比方法分别测定20例样品,检测结果见表1。
表1分析结果
结果显示,根据检测结果计算出的R2值为0.988,大于0.95,表明本发明所述方法检测结果与对比试剂盒检测结果无明显差异,具有较高准确度(符合度)。
实施例3:本发明试剂及方法的精密度分析
试验仪器:日立7080全自动生化分析仪;
检测样品:任意一血清样品:
采用实施例1的检测方法和对比专利(CN201410735830.9-一种改良的胱抑素C检测试剂盒)实施例3的检测方法对同一待测样品重复检测10次,检测结果见表2。
表2检测样品胱抑素C浓度(10次)及标准差率(变异系数)
结果显示,本发明标准差率为2.4%,小于标准要求的10%,小于对比专利方法的3.81%,表明本发明所述方法具有较高的精密度。
实施例4:本发明试剂及方法的线性分析
试验仪器:日立7080全自动生化分析仪;
检测样品:高胱抑素C血清样品(8mg/L);
将胱抑素C血清样品稀释成6个不同的浓度,依次为0mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L、4.0mg/L、8.0mg/L,采用实施例1的检测方法对上述样品的每个浓度进行2次检测,计算相关系数R值,其中,实施例1的检测结果见表3。
表3线性试验结果
结果显示,根据实施例1检测结果计算出的R值为0.9966,接近于1,表明本发明方法在0.0mg/L-8.0mg/L的范围内具有良好的线性度。
实施例5:本发明检测胱抑素C的试剂盒
本实施例检测胱抑素C的试剂包括:
试剂1:氯化铵0.5mol/L,叠氮钠0.03%,Brij-35 0.1%,氯化钠150m mol/L,PEG6000 2%,用氨水调pH值,pH 7.0;
试剂2:抗体包被的胶乳微粒(0.05%浓度),Tris-Hcl缓冲液80mmol/L,蔗糖1%,明胶0.8%,NP30 0.05%,Proclin300 0.3%,pH6.0。
其中,抗体包被的胶乳微粒的制备方法为:
(1)取1ml(10mg/mL)洗涤处理后的乳胶颗粒,加入到50mL的乙二胺(EDA,1mol/L,pH4.75)中,孵育90min。
(2)加入固体的EDC至终浓度10mM,缓慢搅拌90min。
(3)用纯净水充分洗涤,最后一次重悬于pH7.5的磷酸盐buffer中。
(4)抗体浓度大约7.5mg/ml 10%的乳胶颗粒(直径99nm),加入到0.05mol/L磷酸盐,0.15mol/L NaCl的缓冲液中(pH7.5),反应6小时。
(5)加入终止液终止反应。终止液:甘氨酸1%,pH7.5,充分混匀2小时。
检测方法:由全自动生化分析仪加入3μL样本,180μL试剂1,37℃反应5分钟,再加入60μL试剂2,37℃反应5分钟,测定550nm的吸光度值,根据标准曲线计算样品中胱抑素C的百分含量。
实施例6:本发明检测胱抑素C的试剂盒
本实施例检测胱抑素C的试剂包括:
试剂1:氯化铵1.0mol/L,叠氮钠0.01%,Brij-35 1.0%,氯化钠150m mol/L,PEG6000 2%,用氨水调pH值,pH 9;
试剂2:抗体包被的胶乳微粒(0.2%浓度),Tris-Hcl缓冲液20mmol/L,蔗糖5%,明胶0.2%,NP30 0.2%,Proclin300 0.3%,pH8.0。
其中,抗体包被的胶乳微粒的制备方法为:
(1)取1ml(10mg/mL)洗涤处理后的乳胶颗粒,加入到50mL的乙二胺(EDA,1mol/L,pH4.75)中,孵育90min。
(2)加入固体的EDC至终浓度10mM,缓慢搅拌90min。
(3)用纯净水充分洗涤,最后一次重悬于pH7.5的磷酸盐buffer中。
(4)抗体浓度大约7.5mg/ml10%的乳胶颗粒(直径99nm),加入到0.05mol/L磷酸盐,0.15mol/L NaCl的缓冲液中(pH7.5),反应6小时。
(5)加入终止液终止反应。终止液:甘氨酸1%,pH7.5,充分混匀2小时。
检测方法:由全自动生化分析仪加入3μL样本,180μL试剂1,37℃反应5分钟,再加入60μL试剂2,37℃反应5分钟,测定550nm的吸光度值,根据标准曲线计算样品中胱抑素C的百分含量。
实施例7:本发明试剂的抗干扰性分析
在同一份血清样本中加入不同浓度的类风湿因子(50,150,250,500、800IU/mL);血红蛋白(0,1.25,2.5,5,10g/L);胆红素(0,128,256,512,1024μmol/L);甘油三酯(0,10,20,40,80mmol/L)采用实施例1、5、6的检测方法和对比专利(CN201410735830.9-一种改良的胱抑素C检测试剂盒)实施例3的检测方法与未加入类风湿因子,血红蛋白,胆红素,甘油三酯的血清做对比,计算样品胱抑素C浓度的平均值和偏差,其检测结果见表4-7。
表4抗类风湿因子干扰实验结果
表5抗溶血干扰结果
表6抗黄疸干扰实验结果
表7抗黄疸干扰实验结果
结果显示,本发明实施例1、5、6的试剂类风湿因子≤800IU/mL,血红蛋白≤10g/L,胆红素≤1024μmol/L,甘油三酯≤80mmol/L对测值没有影响,而对比专利仅在类风湿因子<300IU/mL,血红蛋白≤5g/L,胆红素≤512μmol/L,甘油三酯≤80mmol/L对测值没有影响;可见本申请的抗干扰能力好于对比专利。
实施例8:本发明试剂的稳定性
取本发明实施例6的检测试剂和本发明实施例6配方中不添加蔗糖的试剂进行常规贮存稳定性试验,2-8℃放置分别按实例6的检测方法,2,5,8,10,12个月进行检测,检测低值质控和中值质控的标准偏差,其检测结果见表8。
表8稳定性实验结果
结果显示,添加蔗糖的本发明试剂稳定性好于不添加蔗糖的本发明试剂,可见,蔗糖的添加起到了增强本发明试剂稳定性的效果。
以上仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种胱抑素C的检测试剂,其特征在于,所述检测试剂由试剂1和试剂2组成;
所述试剂1包括氯化铵、聚氧乙烯月桂醚、氯化钠、PEG6000、防腐剂和水;
所述试剂2包括包被有胱抑素C单克隆抗体的胶乳微球、Tris-Hcl缓冲液、蔗糖、明胶、NP30、防腐剂和水。
2.根据权利要求1所述的检测试剂,其特征在于,所述试剂1中各组分的含量为:
氯化铵:0.2~1.0mmol/L;
聚氧乙烯月桂醚:0.1~1.0wt%;
氯化钠:150mmol/L;
PEG6000:2wt%;
防腐剂:0.01~0.05wt%;
所述试剂1的pH值为7~9。
3.根据权利要求1所述的检测试剂,其特征在于,所述试剂2中各组分的含量为:
包被有胱抑素C单克隆抗体的胶乳微球:0.05~0.2wt%;
Tris-Hcl缓冲液:20~80mmol/L;
蔗糖:1~5wt%;
明胶:0.2~0.8wt%;
NP30:0.05~0.2wt%;
防腐剂:0.3wt%;
所述试剂2的pH值为6~8。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的检测试剂,其特征在于,所述试剂1中防腐剂为叠氮钠,所述试剂2中防腐剂为Proclin300。
5.根据权利要求1或3所述的检测试剂,其特征在于,所述包被有胱抑素C单克隆抗体的胶乳微球是由胱抑素C单克隆抗体和胶乳微球采用化学交联法得到。
6.根据权利要求5所述的检测试剂,其特征在于,所述胱抑素C单克隆抗体为鼠抗人载胱抑素C单克隆抗体。
7.根据权利要求5所述的检测试剂,其特征在于,所述胶乳微球为疏水微球,所述疏水微球为带磺酸基基团、羧基基团或醛基基团的一种或两种以上的胶乳微球。
8.根据权利要求5或7所述的检测试剂,其特征在于,所述胶乳微球的平均粒径为80~120nm。
9.根据权利要求5所述的检测试剂,其特征在于,所述胱抑素C单克隆抗体与所述胶乳微球的质量比为(0.1~1):100。
10.一种检测胱抑素C含量的方法,其特征在于,包括:待测样本加入试剂1中,孵育5~10min;再加入试剂2,孵育5~10min,在550nm波长下测定吸光度,通过胱抑素C的标准曲线得到待测样本中胱抑素C的含量;
所述试剂1包括氯化铵、聚氧乙烯月桂醚、氯化钠、PEG6000、防腐剂和水;
所述试剂2包括包被有胱抑素C单克隆抗体的胶乳微球、Tris-Hcl缓冲液、蔗糖、明胶、NP30、防腐剂和水。
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