CN108107201A - 一种胱抑素c检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种胱抑素C检测试剂盒及其制备方法，试剂盒包括试剂R1、试剂R2和胱抑素C校准品，试剂R1包括防腐剂、表面活性剂、增乳剂和缓冲液；试剂R2包括胱抑素C抗体、聚苯乙烯胶乳微球、胶乳微球活化剂、封闭剂、增乳剂、防腐剂、表面活性剂和缓冲液。在活化的聚苯乙烯胶乳微球溶液中缓慢滴加胱抑素C抗体稀释溶液，搅拌反应后得偶联胱抑素C抗体的聚苯乙烯胶乳微球悬浊液，然后进行封闭，采用化学交联的方式将抗体与胶乳微球偶联在一起，将传统方法中离心、清洗和超声重悬的过程省去。本发明的生产工艺精简，且试剂盒空白吸光度低、灵敏度高、精密度高和线性范围大的优点。

Description

一种胱抑素C检测试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明属于医学体外诊断试剂领域，具体涉及到一种胱抑素C检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
肾小球滤过率(GFR)的评估对诊断肾病有非常重要的意义。预测GFR的方法有多种，其中菊粉清除试验是评估GFR的金标准，但是此实验操作复杂、不适合糖尿病患者检测，同时菊粉有时会引起发热症状，所以不经常用于临床诊断。相反，检测血清中肌酐的含量是比较方便且容易操作的，然而肌酐会受年龄、性别、营养状态和饮食等的影响，所以不同人群的检测结果可能会不准确。
胱抑素C是人体内含量最为丰富的蛋白酶抑制剂，是一种非糖基化的碱性蛋白质，能从肾小球自由滤过，不被肾小管重吸收和分泌，并且肾脏是其唯一排出的器官，在所有有核细胞中的产生是持续恒定的，不受年龄、性别、饮食情况的影响，所以胱抑素C代替肌酐评估GFR可以表现出更高的准确性和灵敏性，为肾脏早期疾病诊断提供有效的检测依据。经研究证明，胱抑素C的检测在原发性肾炎及肾病、糖尿病肾病、肝硬化、高血压等的早期诊断中有重要意义。
很多医院已经开展胱抑素C项目的检测，所以许多厂家也已投入胱抑素C检测试剂盒的生产。但是现在绝大多数的胱抑素C检测试剂盒的制备方法中，试剂的配制过程较为繁琐，需要多步离心、清洗和超声重悬，而且不同粒径的胶乳微球离心的转速不同，不同试剂量的超声重悬时间也不一致，这些步骤使制备过程又增加了一些可变因素，且增加了研发和生产成本，同时生产效率低、生产周期长。
发明内容
为了解决现有技术的问题，本发明提供了一种胱抑素C检测试剂盒及其制备方法，采用化学交联的方式将抗体与胶乳微球偶联在一起，并且确定了胶乳微球、活化剂、抗体等各原料的最佳配比，从而将传统方法中离心、清洗和超声重悬的过程省去，生产工艺得以优化和精简，大大节约了成本，并且提高了生产效率，同时又保证了试剂盒空白吸光度低、灵敏度高、精密度高和线性范围大的优点。
为了达到上述目的，本发明提供以下技术方案：
一种胱抑素C检测试剂盒，包括试剂R1、试剂R2和胱抑素C校准品，试剂R1包括防腐剂0.8g/L～2g/L、表面活性剂体积分数为1％～5％、增乳剂0.2g/L～0.5g/L、缓冲液10mmol/L～200mmol/L；试剂R2包括胱抑素C抗体40mg/L～45mg/L、聚苯乙烯胶乳微球10g/L～20g/L、胶乳微球活化剂25mg/L～36mg/L、封闭剂50g/L～70g/L、增乳剂0.2g/L～0.5g/L、防腐剂0.8g/L～2g/L、表面活性剂0.2％～0.5％、缓冲液10mmol/L～200mmol/L；胱抑素C校准品中胱抑素C蛋白的浓度为0～8mg/L。
优选地，所述缓冲液包括2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液、甘氨酸缓冲液、Goods缓冲液、硼酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、氯化铵缓冲液中的至少一种。
优选地，所述胶乳微球活化剂为碳化二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)、异氰酸酯中的一种。
优选地，所述防腐剂为叠氮钠、对羟基苯甲酸、硫柳汞和ProClin系列中的一种。
优选地，所述表面活性剂为吐温-20、聚氧乙烯月桂醚、聚氧乙烯苯基醚中的一种。
优选地，所述增乳剂为PEG20000、十二烷基硫酸钠、聚乙烯吡咯烷酮k30中的一种或两种，优选为PEG20000。
优选地，所述封闭剂为牛血清白蛋白(BSA)、蔗糖、明胶中的一种。
优选地，所述聚苯乙烯胶乳微球的粒径为50～200nm，表面修饰基团为羧基。
优选地，所述胱抑素C抗体为兔抗人胱抑素C多克隆抗体。
一种胱抑素C检测试剂盒的制备方法，包括试剂R1的制备方法、试剂R2的制备方法和胱抑素C校准品的制备方法。
试剂R1的制备方法如下：
称取10mmol/L～200mmol/L的缓冲液，然后加入体积分数为1％～5％的表面活性剂、0.2g/L～0.5g/L的增乳剂和0.8g/L～2g/L的防腐剂，混匀，得试剂R1。
试剂R2的制备方法如下：
(1)稀释抗体，用50mmol/L的MES缓冲液稀释胱抑素C抗体至1mg/mL～2mg/mL，得胱抑素C抗体稀释溶液；
(2)用50mmol/L的MES缓冲液溶解胶乳微球活化剂，得到7mg/mL～10mg/mL的活化剂溶液；
(3)胶乳微球活化，在聚苯乙烯胶乳微球10g～20g中加入活化剂溶液4mL～6mL，25℃～37℃搅拌反应30min～45min，得活化的聚苯乙烯胶乳微球溶液；
(4)抗体与胶乳微球偶联：在步骤(3)活化的聚苯乙烯胶乳微球溶液中缓慢滴加步骤(1)中的所有的胱抑素C抗体稀释溶液，得到胱抑素C抗体与聚苯乙烯胶乳微球质量比为0.002:1～0.005:1，然后25℃～37℃搅拌反应2h～3h即得偶联胱抑素C抗体的聚苯乙烯胶乳微球悬浊液；
(5)悬浊液封闭：在步骤(4)的偶联胱抑素C抗体的聚苯乙烯胶乳微球悬浊液中加入50g/L～70g/L封闭剂后25℃～37℃封闭30min～60min；
(6)悬浊液封闭完成后加入含有体积分数为0.2％～0.5％的表面活性剂、0.8g/L～2g/L防腐剂、0.2g/L～0.5g/L增乳剂的10mmol/L～200mmol/L缓冲液至终体积为1L，混匀后即得试剂R2。
胱抑素C校准品的制备方法如下：
将纯化好的胱抑素C蛋白用含有9g/L氯化钠、1g/L叠氮钠的10mmol/L～200mmol/L磷酸盐缓冲液进行稀释，使胱抑素C蛋白的浓度分别控制在0.5mg/L、1mg/L、2mg/L、4mg/L、8mg/L，得到胱抑素C校准品，所述胱抑素C校准品均为无色透明液体。
本发明中所用的聚苯乙烯胶乳微球的粒径为50nm～200nm，粒径过大的胶乳微球在检测高浓度样本时，其聚集产生的吸光度可能会超出检测限而导致结果不准确；粒径过小的胶乳微球聚集时产生的吸光度变化太小，测试结果很难达到灵敏度要求，因此本发明限定了聚苯乙烯胶乳微球的粒径大小，使试剂盒具有高灵敏度。聚苯乙烯胶乳微球表面修饰基团为羧基，胱抑素C抗体为兔抗人胱抑素C多克隆抗体，具有氨基，羧基与氨基之间形成酰胺键，从而使得二者偶联，即聚苯乙烯胶乳微球和胱抑素C抗体之间采用化学交联法进行偶联。胶乳微球活化剂可以帮助聚苯乙烯胶乳微球的羧基和胱抑素C抗体的氨基之间形成酰胺键，而本身并未成为实际偶联的一部分。封闭剂会将聚苯乙烯胶乳微球表面暴露的疏水性表面封闭，从而降低聚苯乙烯胶乳微球与非胱抑素C蛋白的非特异性结合，以及减少聚苯乙烯胶乳微球的自动聚集，使试剂盒的空白吸光度低，精度高。试剂R1和试剂R2中均含有表面活性剂、防腐剂和增乳剂，表面活性剂能够吸附在聚苯乙烯胶乳微球的表面，降低聚苯乙烯胶乳微球表面张力，使其不易聚集，提高聚苯乙烯胶乳微球在溶液中的分散性和稳定性；增乳剂能够改善溶液中各种构成相之间的表面张力，使溶液形成均匀稳定的分散体系；防腐剂能够抑制微生物的生长，保证试剂的质量。
采用上述技术方案，本发明实现的有益效果如下：
(1)本发明限定了胱抑素C检测试剂盒中各原料种类及配比，聚苯乙烯乳胶微球与胱抑素C抗体通过化学交联法进行偶联，从而将传统方法中用于抗体活化和偶联的离心和超声重悬的过程省去，生产工艺得以精简和优化，节约成本，提高生产效率。
(2)制备过程简单，生产周期短，减少了制备过程中的可变因素，使最终产品具有高质量，且保持高质量的一致性。
(3)本发明的试剂盒通过各原料种类及其配比、胶乳微球的粒径限定等，制备得到的试剂盒空白吸光度低、灵敏度高、精密度高和线性范围大的优点。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明。
实施例1
一种胱抑素C检测试剂盒，包括试剂R1、试剂R2和胱抑素C校准品，试剂R1包括防腐剂0.8g/L～2g/L、表面活性剂体积分数为1％～5％、增乳剂0.2g/L～0.5g/L、缓冲液10mmol/L～200mmol/L；试剂R2包括胱抑素C抗体40mg/L～45mg/L、聚苯乙烯胶乳微球10g/L～20g/L、胶乳微球活化剂25mg/L～36mg/L、封闭剂50g/L～70g/L、增乳剂0.2g/L～0.5g/L、防腐剂0.8g/L～2g/L、表面活性剂0.2％～0.5％、缓冲液10mmol/L～200mmol/L；胱抑素C校准品中胱抑素C蛋白的浓度为0～8mg/L。
所述缓冲液包括2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液、甘氨酸缓冲液、Goods缓冲液、硼酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、氯化铵缓冲液中的至少一种。
所述胶乳微球活化剂为碳化二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)、异氰酸酯中的一种。
所述防腐剂为叠氮钠、对羟基苯甲酸、硫柳汞和ProClin系列中的一种。
所述表面活性剂为吐温-20、聚氧乙烯月桂醚、聚氧乙烯苯基醚中的一种。
所述增乳剂为PEG20000、十二烷基硫酸钠、聚乙烯吡咯烷酮k30中的一种或两种，优选为PEG20000。
所述封闭剂为牛血清白蛋白(BSA)、蔗糖、明胶中的一种。
所述聚苯乙烯胶乳微球的粒径为50～200nm，表面修饰基团为羧基。
所述胱抑素C抗体为兔抗人胱抑素C多克隆抗体。
实施例2
一种胱抑素C检测试剂盒的制备方法包括试剂R1的制备方法、试剂R2的制备方法和胱抑素C校准品的制备方法。
试剂R1的制备方法如下：
称取800mL 50mmol/L的甘氨酸缓冲液(pH6.1-6.7)，然后加入15mL的吐温-20、0.25g PEG-20000和0.9g叠氮钠，定容至1L，混匀，得试剂R1。
试剂R2的制备方法如下：
(1)稀释抗体，用40mL 50mmol/L的MES缓冲液(pH8.1-8.5)稀释兔抗人胱抑素C多克隆抗体至1mg/mL，得兔抗人胱抑素C多克隆抗体稀释溶液；
(2)用4.5mL 50mmol/L的MES缓冲液溶解36mg EDC，得到8mg/mL活化剂溶液；
(3)胶乳微球活化，在20g粒径为100nm的聚苯乙烯胶乳微球中加入4.5mL活化剂溶液，25℃搅拌反应30min，得活化的聚苯乙烯胶乳微球溶液；
(4)抗体与胶乳微球偶联：在步骤(3)活化的聚苯乙烯胶乳微球溶液中缓慢滴加步骤(1)中的所有的兔抗人胱抑素C多克隆抗体稀释溶液，得到胱抑素C抗体与聚苯乙烯胶乳微球质量比为0.002:1，25℃搅拌反应3h即得偶联兔抗人胱抑素C多克隆抗体的聚苯乙烯胶乳微球悬浊液；
(5)悬浊液封闭：在步骤(4)的偶联兔抗人胱抑素C多克隆抗体的聚苯乙烯胶乳微球悬浊液中加入55g蔗糖后25℃封闭30min；
(6)悬浊液封闭完成后加入含有4mL吐温-20、0.9g叠氮钠、0.45g PEG20000的50mmol/L硼酸盐缓冲液至终体积为1L，混匀后即得试剂R2。
胱抑素C校准品的制备方法如下：
将纯化好的胱抑素C蛋白用含有9g/L氯化钠、1g/L叠氮钠的100mmol/L磷酸盐缓冲液进行稀释，使胱抑素C蛋白的浓度分别控制在0.5mg/L、1mg/L、2mg/L、4mg/L、8mg/L，得到胱抑素C校准品，所述胱抑素C校准品均为无色透明液体。
使用胱抑素C检测试剂盒检测待测血清中胱抑素C含量的步骤：
(1)取200μL试剂R1与5μL待测血清样本混匀；
(2)将混匀后的溶液在37℃孵育5min；
(3)再加入50μL试剂R2，立即测定读取待测血清样本的吸光度A1和胱抑素C校准品的吸光度，5min后测定读取待测血清样本的吸光度A2和胱抑素C校准品的吸光度，利用吸光度计算待测血清样本中胱抑素C的含量。
实施例3
一种胱抑素C检测试剂盒的制备方法包括试剂R1的制备方法、试剂R2的制备方法和胱抑素C校准品的制备方法。
试剂R1的制备方法如下：
称取800mL 50mmol/L的甘氨酸缓冲液(pH6.1-6.7)，然后加入50mL的吐温-20、0.5g PEG-20000和2g叠氮钠，定容至1L，混匀，得试剂R1。
试剂R2的制备方法如下：
(1)稀释抗体，用45mL 50mmol/L的MES缓冲液(pH8.1-8.5)稀释兔抗人胱抑素C多克隆抗体至1mg/mL，得兔抗人胱抑素C多克隆抗体稀释溶液；
(2)用2.5mL 50mmol/L的MES缓冲液溶解25mg EDC，得到10mg/mL活化剂溶液；
(3)胶乳微球活化，在15g粒径为50nm的聚苯乙烯胶乳微球中加入2.5mL活化剂溶液，37℃搅拌反应45min，得活化的聚苯乙烯胶乳微球溶液；
(4)抗体与胶乳微球偶联：在步骤(3)活化的聚苯乙烯胶乳微球溶液中缓慢滴加步骤(1)中的所有的兔抗人胱抑素C多克隆抗体稀释溶液，得到胱抑素C抗体与聚苯乙烯胶乳微球质量比为0.003:1，37℃搅拌反应2h即得偶联兔抗人胱抑素C多克隆抗体的聚苯乙烯胶乳微球悬浊液；
(5)悬浊液封闭：在步骤(4)的偶联兔抗人胱抑素C多克隆抗体的聚苯乙烯胶乳微球悬浊液中加入70g蔗糖后37℃封闭60min；
(6)悬浊液封闭完成后加入含有2mL吐温-20、2g叠氮钠、0.2g PEG20000的100mmol/L硼酸盐缓冲液至终体积为1L，混匀后即得试剂R2。
胱抑素C校准品的制备方法如下：
将纯化好的胱抑素C蛋白用含有9g/L氯化钠、1g/L叠氮钠的150mmol/L磷酸盐缓冲液进行稀释，使胱抑素C蛋白的浓度分别控制在0.5mg/L、1mg/L、2mg/L、4mg/L、8mg/L，得到胱抑素C校准品，所述胱抑素C校准品均为无色透明液体。
上述虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (10)

1.一种胱抑素C检测试剂盒，包括胱抑素C校准品，其特征在于：还包括试剂R1、试剂R2；试剂R1包括防腐剂0.8g/L～2g/L、表面活性剂体积分数为1％～5％、增乳剂0.2g/L～0.5g/L、缓冲液10mmol/L～200mmol/L；试剂R2包括胱抑素C抗体40mg/L～45mg/L、聚苯乙烯胶乳微球10g/L～20g/L、胶乳微球活化剂25mg/L～36mg/L、封闭剂50g/L～70g/L、增乳剂0.2g/L～0.5g/L、防腐剂0.8g/L～2g/L、表面活性剂0.2％～0.5％、缓冲液10mmol/L～200mmol/L。
2.根据权利要求1所述的一种胱抑素C检测试剂盒，其特征在于：所述缓冲液包括2-吗啉乙磺酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、Goods缓冲液、硼酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、氯化铵缓冲液中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的一种胱抑素C检测试剂盒，其特征在于：所述胶乳微球活化剂为碳化二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺、异氰酸酯中的一种。
4.根据权利要求1所述的一种胱抑素C检测试剂盒，其特征在于：所述防腐剂为叠氮钠、对羟基苯甲酸、硫柳汞和ProClin系列中的一种；所述表面活性剂为吐温-20、聚氧乙烯月桂醚、聚氧乙烯苯基醚中的一种；所述增乳剂为PEG20000、十二烷基硫酸钠、聚乙烯吡咯烷酮k30中的一种或两种。
5.根据权利要求4所述的一种胱抑素C检测试剂盒，其特征在于：所述增乳剂为PEG20000。
6.根据权利要求1所述的一种胱抑素C检测试剂盒，其特征在于：所述封闭剂为牛血清白蛋白、蔗糖、明胶中的一种。
7.根据权利要求1所述的一种胱抑素C检测试剂盒，其特征在于：所述聚苯乙烯胶乳微球的粒径为50～200nm，表面修饰基团为羧基。
8.根据权利要求1所述的一种胱抑素C检测试剂盒，其特征在于：所述胱抑素C抗体为兔抗人胱抑素C多克隆抗体。
9.根据权利要求1所述的一种胱抑素C检测试剂盒，其特征在于：所述胱抑素C校准品中胱抑素C蛋白的浓度为0～8mg/L。
10.如权利要求1-9任一项所述的一种胱抑素C检测试剂盒的制备方法，其特征在于：包括试剂R1的制备方法、试剂R2的制备方法和胱抑素C校准品的制备方法；
试剂R1的制备方法如下：
称取10mmol/L～200mmol/L的缓冲液，然后加入体积分数为1％～5％的表面活性剂、0.2g/L～0.5g/L的增乳剂和0.8g/L～2g/L的防腐剂，混匀，得试剂R1；
试剂R2的制备方法如下：
(1)稀释抗体，用50mmol/L的MES缓冲液稀释胱抑素C抗体至1mg/mL～2mg/mL，得胱抑素C抗体稀释溶液；
(2)用50mmol/L的MES缓冲液溶解胶乳微球活化剂，得到7mg/mL～10mg/mL的活化剂溶液；
(3)胶乳微球活化，在聚苯乙烯胶乳微球10g～20g中加入活化剂溶液4mL～6mL，25℃～37℃搅拌反应30min～45min，得活化的聚苯乙烯胶乳微球溶液；
(4)抗体与胶乳微球偶联：在步骤(3)活化的聚苯乙烯胶乳微球溶液中缓慢滴加步骤(1)中的胱抑素C抗体稀释溶液，得到胱抑素C抗体与聚苯乙烯胶乳微球质量比为0.002:1～0.005:1，然后25℃～37℃搅拌反应2h～3h即得偶联胱抑素C抗体的聚苯乙烯胶乳微球悬浊液；
(5)悬浊液封闭：在步骤(4)的偶联胱抑素C抗体的聚苯乙烯胶乳微球悬浊液中加入50g/L～70g/L封闭剂后25℃～37℃封闭30min～60min；
(6)悬浊液封闭完成后加入含有体积分数为0.2％～0.5％的表面活性剂、0.8g/L～2g/L防腐剂、0.2g/L～0.5g/L增乳剂的10mmol/L～200mmol/L缓冲液至终体积为1L，混匀后即得试剂R2；
胱抑素C校准品的制备方法如下：
将纯化好的胱抑素C蛋白用含有9g/L氯化钠、1g/L叠氮钠的10mmol/L～200mmol/L磷酸盐缓冲液进行稀释，使胱抑素C蛋白的浓度分别控制在0.5mg/L、1mg/L、2mg/L、4mg/L、8mg/L，得到胱抑素C校准品，所述胱抑素C校准品均为无色透明液体。
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