BR112019022643A2 - conjugado de fármaco-anticorpo anti-fibrina insolúvel clivável por plasmina - Google Patents

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BR112019022643A2
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Fuchigami Hirobumi
Manabe Shino
Matsumura Yasuhiro
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Nat Cancer Center Japan
Rin Inst Inc
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Abstract

a presente invenção refere-se a um conjugado anticorpo-fármaco (adc) e uma composição contendo o conjugado para uso no tratamento de câncer. de acordo com a presente invenção, são providos um adc de um anticorpo específico para fibrina insolúvel e um fármaco no qual um ligante que liga o anticorpo ao fármaco tem uma sequência de clivagem por plasmina, e uma composição farmacêutica contendo o adc para uso no tratamento de câncer.

Description

CONJUGADO DE FÁRMACQ-ANTICORPO ANTI-FIBRINA INSOLÚVEL CLIVÁVEL POR PLASMINA CAMPO TÉCNICO
[001] A presente invenção refere-se a um conjugado anticorpo-fármaco e uma composição contendo o conjugado para uso no tratamento de câncer.
ANTECEDENTES DA TÉCNICA
[002] Foi revelado que, quando um vaso sanguíneo é traumatizado, se o sangue entrar em contato com a parede do vaso sanguíneo traumatizada ou com o tecido subendotelial do vaso sanguíneo ou um fator tecidual fluir para a corrente sanguínea, uma reação de coagulação sanguínea se inicia, o fibrinogênio no sangue ou lesão patológica muda para fibrina insolúvel, e uma rede de fibrina funciona como um forte tampão hemostático para endurecer o ferimento.
[003] Há muito tempo sugere-se que a coagulação do sangue está intimamente relacionada ao câncer (descrito no Plegmasia alba dolens por um médico francês em 1800, Trousseau). Dados epidemiológicos clínicos recentes também revelaram que a maioria dos cânceres, incluindo câncer de pâncreas, câncer gástrico e tumor cerebral, tem uma frequência de trombose significativamente maior devido à hipercoagulação do que indivíduos saudáveis (Literatura não patenteada 1) . Além disso, considera-se que o acúmulo de fibrina insolúvel, necrose coagulativa e angiogênese devido à coagulação anormal ocorre repetidamente também dentro dos tecidos do câncer com o progresso do câncer.
[004] A fibrina insolúvel não está presente nos tecidos em condições fisiológicas normais, ao contrário do fibrinogênio, que é um precursor da fibrina, estando
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2/45 amplamente presente no corpo vivo. 0 fibrinogênio é clivado pela trombina ativada vazada para o exterior de um vaso sanguíneo para formar um monômero de fibrina, e o monômero de fibrina polimeriza e reticula para formar fibras de fibrina. Assim, a fibrina insolúvel é gerada. Portanto, a fibrina insolúvel está especificamente presente nos tecidos em condições patológicas, tais como sangramento e inflamação, e é formada quando ocorre um estado patológico envolvendo coagulação, tais como, câncer, infarto do miocárdio ou infarto cerebral. Por conseguinte, a fibrina insolúvel é uma molécula marcadora para essas doenças relacionadas ao trombo. Em particular, a fibrina insolúvel presente em tecidos cancerígenos que não envolvem doenças circulatórias cerebrais, tais como, infarto do miocárdio e infarto cerebral, é exatamente uma molécula específica de câncer.
[005] Nesse contexto técnico, foi proposto um anticorpo específico para fibrina insolúvel e um conjugado anticorpo-fármaco (ADC) usando o anticorpo (Literatura de Patente 1).
Lista de citações
Literatura de patentes
[006] [Literatura de Patente 1]
WO 2014/133093
Sumário da Invenção
[007] Foi desenvolvido um ADC de um anticorpo específico para fibrina insolúvel e um fármaco, no qual um ligante que liga o anticorpo e o fármaco tem uma sequência de divagem por plasmina. Verificou-se que o ADC resultante é dispensado à fibrina insolúvel e é clivado por plasmina
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3/45 no local dispensado para liberar o fármaco no local. Além disso, verificou-se, usando um modelo animal com tumor, que o ADC resultante pode ter como alvo um local de acúmulo de fibrina insolúvel nas proximidades de um tumor e libera o fármaco no local para mostrar uma atividade anticâncer contra o tumor. Além disso, os foi adquirido um novo anticorpo especifico para fibrina insolúvel. A presente invenção é baseada nessas verificações.
[008] Ou seja, a presente invenção provê os seguintes itens:
(1) Um conjugado anticorpo-fármaco (ADC), em que o anticorpo é um anticorpo que se liga à fibrina e tem afinidade com fibrina insolúvel maior que a fibrinogênio, o fármaco é um agente citotóxico, e o anticorpo e o fármaco estão ligados um ao outro através de um ligante tendo um local de divagem por plasmina que permite a divagem por plasmina;
(2) O ADC de acordo com (1), em que o ligante compreende uma sequência peptídica valinaleucina-lisina como local de divagem por plasmina;
(3) Uma composição farmacêutica compreendendo o ADC de acordo com (1) ou (2) para uso no tratamento de câncer;
(4) A composição farmacêutica de acordo com (3), em que o câncer é um câncer invasivo;
(5) Um anticorpo que se liga à fibrina, em que o anticorpo tem uma região variável de cadeia pesada tendo CDR1 apresentada na SEQ ID NO: 1, CDR2 apresentada na SEQ ID NO: 2 e CDR3 apresentada na SEQ ID NO: 3, e
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4/45 uma região variável de cadeia leve tendo CDR1 apresentada na SEQ ID NO: 5, CDR2 apresentada na SEQ ID NO: 6, e CDR3 apresentada na SEQ ID NO: 7; um anticorpo que compete com o anticorpo pela ligação à fibrina; ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo;
(6) Um anticorpo que se liga à fibrina, em que o anticorpo tem uma região variável da cadeia pesada apresentada na SEQ ID NO: 4 e uma região variável da cadeia leve apresentada na SEQ ID NO: 8; ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo;
(7) Um anticorpo que se liga à fibrina, em que o anticorpo tem uma região variável da cadeia pesada tendo CDR1 apresentada na SEQ ID NO: 9, CDR2 apresentada na SEQ ID NO: 10 e CDR3 apresentada na SEQ ID NO: 11, e uma região variável da cadeia leve tendo CDR1 apresentada na SEQ ID NO: 13, CDR2 apresentada na SEQ ID NO: 14 e CDR3 apresentada na SEQ ID NO: 15;
um anticorpo que compete com o anticorpo para ligação à fibrina; ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo;
(8) Um anticorpo que se liga à fibrina, em que o anticorpo tem uma região variável da cadeia pesada apresentada na SEQ ID NO: 12 e uma região variável da cadeia leve apresentada na SEQ ID NO: 16; ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo;
(9) O ADC de acordo com (1) ou (2), em que o anticorpo é o anticorpo de acordo com qualquer um de (5) a (8);
(10) Uma composição farmacêutica compreendendo o ADC de
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5/45 acordo com (9); e (11) A composição farmacêutica de acordo com (10), para uso no tratamento de câncer.
Breve Descrição dos Desenhos
[009] [Figura 1] A Figura 1 mostra que os anticorpos obtidos pela presente invenção são específicos para fibrina insolúvel.
[0010] [Figura 2] A Figura 2 mostra que os anticorpos monoclonais específicos para fibrina insolúvel obtidos pela presente invenção se acumulam nos locais de formação de tumores.
[0011] [Figura 3] A Figura 3 mostra especialmente uma porção de fármaco e uma porção de ligação de um conjugado anticorpo-fármaco produzido pela presente invenção.
[0012] [Figura 4] A Figura 4 mostra os resultados da verificação da atividade anticâncer in vitro do conjugado anticorpo-fármaco produzido pela presente invenção.
[0013] [Figura 5] A Figura 5 mostra uma curva de Kaplan-Meier de um conjugado anticorpo-fármaco produzido pela presente invenção para um modelo de câncer de pâncreas espontâneo.
[0014] [Figura 6A] A Figura 6A mostra um efeito de suprimir um aumento no volume do tumor em camundongos de implantação subcutânea do tumor pelo conjugado anticorpofármaco produzido pela presente invenção.
[0015] [Figura 6B] A Figura 6B mostra alterações com o tempo em peso dos camundongos observados na Figura 6A.
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[0016] [Figura 7] A Figura 7 mostra as atividades citostáticas de um ADC tendo um ligante de plasmina com um local de divagem por plasmina ou um ADC tendo um ligante de catepsina que não tem um local de divagem por plasmina, mas tem um local de divagem por catepsina.
[0017] [Figura 8] A Figura 8 mostra um mecanismo de ação presumida de um conjugado anticorpo-fármaco produzido pela presente invenção.
Descrição das Modalidades
[0018] Na presente invenção, o termo indivíduo significa um mamifero, em particular um humano.
[0019] No presente relatório descritivo, o termo tratamento é usado para significar terapia (tratamento terapêutico) e prevenção (tratamento preventivo). No presente relatório descritivo, o termo terapia significa terapia, cura ou prevenção de uma doença ou distúrbio; melhoria da remissão; ou uma redução na velocidade do progresso de uma doença ou distúrbio. No presente relatório descritivo, o termo prevenção significa uma redução no risco de aparecimento de uma doença ou um estado patológico ou atraso no aparecimento de uma doença ou um estado patológico.
[0020] No presente relatório descritivo, o termo doença significa um sintoma cuja terapia é útil. No presente relatório descritivo, o termo câncer significa um tumor maligno.
[0021] No presente relatório descritivo, o termo anticorpo significa uma imunoglobulina e abrange um anticorpo policlonal e um anticorpo monoclonal. Um anticorpo preferido é um anticorpo monoclonal. Embora a
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7/45 origem do anticorpo não seja particularmente limitada, exemplos do anticorpo incluem anticorpos de animais não humanos, anticorpos de mamíferos não humanos e anticorpos humanos. 0 anticorpo pode ser um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado ou um anticorpo humano. Além disso, o anticorpo pode ser um anticorpo biespecífico.
[0022] No presente relatório descritivo, o termo quantidade terapeuticamente eficaz significa uma quantidade de um medicamento eficaz para o tratamento (prevenção e terapia) de uma doença ou condição. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um medicamento pode reduzir a velocidade de agravamento de um sintoma de uma doença ou condição, interromper o agravamento do sintoma, melhorar o sintoma, curar o sintoma ou suprimir o início ou o desenvolvimento do sintoma.
[0023] No presente relatório descritivo, o termo fibrina insolúvel significa fibrina reticulada pelo fator XIII. Em um corpo vivo, por exemplo, se ocorrer sangramento, o fibrinogênio é convertido em um monômero de fibrina pela ação da trombina, o monômero de fibrinogênio polimeriza para formar um polímero de fibrina insolúvel. O polímero de fibrina é reticulado pelo fator XIII em fibrina insolúvel.
[0024] No presente relatório descritivo, o termo anticorpo específico para fibrina insolúvel é um anticorpo que se liga à fibrina insolúvel e tem uma afinidade maior à fibrina insolúvel do que ao fibrinogênio. Um tal anticorpo específico para fibrina insolúvel pode ser facilmente obtido por triagem com uma afinidade para fibrina insolúvel e uma afinidade para fibrinogênio. A
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8/45 fibrina tem um local de epitopo que é exposto apenas quando a fibrina se torna insolúvel por alteração estrutural tridimensional na fibrina insolúvel. Por conseguinte, o anticorpo específico para fibrina insolúvel pode ser obtido por imunização com o domínio exposto, isto é, o domínio D como um imunogênio. Alternativamente, o anticorpo também pode ser obtido usando um peptídeo linear. Por exemplo, um anticorpo específico para fibrina insolúvel pode ser obtido por imunização com um peptídeo parcial da cadeia Ββ de fibrina correspondente às posições 231 a 246 da sequência de aminoácidos da cadeia Ββ de fibrina (por exemplo, cadeia Ββ de fibrina humana pode ter a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 25). Alternativamente, o anticorpo específico para fibrina insolúvel também pode ser obtido por imunização usando um peptídeo apresentado na SEQ ID NO: 26 ou SEQ ID NO: 27 como um imunogênio. Um tal anticorpo específico para fibrina insolúvel pode ser um anticorpo tendo uma maior afinidade com fibrina insolúvel do que com todos de fibrinogênio, monômeros de fibrina e polímeros de fibrina. Um anticorpo tendo uma proporção de afinidade para fibrina insolúvel em relação à afinidade para fibrinogênio de, por exemplo, maior que 1, 1,5 ou mais, 2 ou mais, 3 ou mais, 3 ou mais, 4 ou mais ou 5 ou mais pode ser obtido como um anticorpo específico para fibrina insolúvel. A afinidade significa afinidade de ligação (KD) e pode ser determinada por um método conhecido, como ELISA e ensaio de exclusão cinética.
[0025] No presente relatório descritivo, o termo competir significa embaralhar com outro anticorpo de ligação para se ligar a um antígeno. A competição pode
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9/45 ocorrer quando dois anticorpos têm locais de ligação para o mesmo antígeno. Tais anticorpos podem ser obtidos por imunização usando um epitopo descrito acima e/ou também verificando por ensaio competitivo se a ligação de um anticorpo a um antígeno é reduzida pelo outro anticorpo ou não.
[0026] No presente relatório descritivo, o termo conjugado anticorpo-fármaco (daqui em diante, também referenciado como ADC) significa uma substância na qual um anticorpo e um agente citotóxico estão ligados um ao outro. No ADC, o anticorpo e o agente citotóxico podem ser ligados entre si através de um ligante apropriado. Como agente citotóxico, pode ser usado um agente quimioterápico, um radioisótopo ou uma toxina. O termo ADC abrange um conjugado de um fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo e um fármaco.
[0027] No presente relatório descritivo, o termo fragmento de ligação a antígeno significa uma parte de um anticorpo em que a afinidade com um antígeno é mantida. O fragmento de ligação a antígeno pode compreender a região variável da cadeia pesada, a região variável da cadeia leve ou ambas no anticorpo da presente invenção. O fragmento de ligação a antígeno pode ser quimerizado ou humanizado. Exemplos do fragmento de ligação a antígeno incluem Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv (Fv de cadeia única), diabody e sc(Fv)2 (cadeia única (Fvh) · Tais fragmentos de anticorpo podem ser obtidos por, mas não particularmente limitados a, tratamento do anticorpo com uma enzima. Por exemplo, a digestão de um anticorpo com papaína resulta em Fab. Alternativamente, a digestão de um anticorpo com pepsina
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10/45 resulta em F (ab' ) 2, e Fab' pode ser obtido por redução adicional do F(ab')2. Na presente invenção, esses fragmentos de ligação a antigeno de um anticorpo podem ser usados.
[0028] Na presente invenção, o anticorpo e o agente citotóxico em um conjugado anticorpo-fármaco estão ligados entre si por meio de um ligante. Exemplos do agente citotóxico incluem agentes quimioterápicos (por exemplo, agentes anticâncer, tais como, agentes anticâncer disponiveis no mercado, por exemplo, auristatina (auristatina E, auristatina F fenilenodiamina (AFP), monometil auristatina E, monometil auristatina F e derivados dos mesmos), maitansinóides DM1 e DM4, e derivados dos mesmos), camptotecina (SN-38, irinotecano, lurtotecano, DB67, BMP1350, ST1481, CKD602, topotecano e exatecano e derivados dos mesmos), agentes ligantes para sulcos menores de DNA (enediina, lexitropsina e duocarmicina e derivados dos mesmos), taxanos (paclitaxel e docetaxel e derivados dos mesmos), policetideos (discodermolida e derivados dos mesmos), antraquinonas (mitoxantrona e derivados dos mesmos), benzodiazepina (pirrolobenzodiazepina, indolinobenzodiazepina e oxazolidinobenzodiazepina, e derivados dos mesmos), alcalóides da vinca (vincristina, vinblastina, vindesina e vinorelbina, e derivados dos mesmos), doxorrubicinas (doxorrubicina, morfolino-doxorrubicina e cianomorfolinodoxorrubicina, e derivados dos mesmos), glicosideos cardiacos (digitoxina e derivados dos mesmos), caliqueamicina, epotilona, criptoficina, cemadotina, cemadotina, rizoxina, netropsina, combrestatina,
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11/45 eluterobina, etoposídeo, T67 (tularik) e nocodazol); radioisótopos (por exemplo, 32P, 60C, 90Y, 11:LIn, 131I, 125I, 153Sm, 186Re, 188Re, e 212Bi) ; e toxinas (por exemplo, toxina A da difteria, endotoxina de Pseudomonas, ricina e saporina) e podem ser usadas como agente citotóxico no ADC da presente invenção. Como agente citotóxico no ADC da presente invenção, de preferência, por exemplo, pode ser usado camptotecina, em particular SN-38 ou exatecano. Como agente citotóxico, qualquer um dos usados no tratamento do câncer pode ser usado. 0 agente citotóxico pode ser um sal farmaceuticamente aceitável, um solvato (por exemplo, hidrato), um éster ou uma pró-fármaco dos agentes citotóxicos acima mencionados.
[0029] Na presente invenção, o ligante do ADC compreende uma sequência de divagem por plasmina e pode ser clivado na presença de plasmina. Na presente invenção, o ligante do ADC, as partes que não a sequência de divagem por plasmina, compreendem ligações químicas que são estáveis no processo desde a administração até a dispensação à fibrina insolúvel. O ADC da presente invenção em tal constituição é estável após administração ser dispensada à fibrina insolúvel e é clivado por plasmina após ligação com a fibrina insolúvel para liberar o agente citotóxico na proximidade da fibrina insolúvel. A sequência de divagem por plasmina é uma sequência de aminoácidos e, especificamente, pode ser uma cadeia peptídica compreendendo uma sequência de aminoácidos, tal como uma sequência de divagem por plasmina selecionada do grupo que consiste em valina-leucina-lisina, glicina-prolina-lisina, ácido glutâmico-lisina-lisina, lisina-fenilalanina-lisina,
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12/45 norvalina-cloro-hexilalanil-lisina e norleucina-hexahidrotirosina-lisina. Esse ligante pode ser adequadamente selecionado na produção do ADC e sintetizado por uma pessoa habilitada na técnica. Em um certo aspecto, como o ligante, por exemplo, um primeiro espaço pode ser inserido entre o anticorpo e a sequência de divagem por plasmina, em que, por exemplo, polietilenoglicol (PEG) , tal como o PEG, com cerca de 5 a 40 unidades repetidas por molécula, pode ser usado como o primeiro espaçador; e um segundo espaçador pode ser inserido entre a sequência de divagem por plasmina e o agente citotóxico, onde, por exemplo, o paminobenziloxicarbonila (PABC) pode ser usado como o segundo espaçador.
[0030] Em um certo aspecto, o ligante compreende um primeiro espaçador e uma sequência de divagem por plasmina. Em um certo aspecto, o ligante compreende um primeiro espaçador, uma sequência de divagem por plasmina e um segundo espaçador. Em um certo indivíduo, o ligante compreende PEG, uma sequência de divagem por plasmina e PABC.
[0031] Em um certo aspecto, o ligante não compreende porções cliváveis que não a sequência de divagem por plasmina.
[0032] Na ligação entre um anticorpo e o ligante, por exemplo, o ligante pode ser ligado a um grupo sulfidrila do anticorpo através de um grupo maleimida.
[0033] Em um certo aspecto, o anticorpo está ligado a um agente anticâncer via seu grupo sulfidrila através de um ligante tendo uma sequência de divagem por maleimidaPEG-plasmina. Em um certo aspecto, o anticorpo está ligado
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13/45 a um agente anticâncer via seu grupo sulfidrila através de um ligante tendo sequência de divagem por maleimida-PEGplasmina-PABC.
[0034] Em qualquer caso, no ADC da presente invenção, um agente anticâncer é ligado a um agente anticâncer através de um ligante que possui um local de divagem por plasmina que pode ser clivado por plasmina, e quando o ADC atinge um local de acúmulo de fibrina insolúvel, o ligante é clivado no local de divagem por plasmina pela plasmina presente na circunferência do mesmo para liberar o agente anticâncer na proximidade da fibrina insolúvel. Considera-se que na proximidade do tecido cancerígeno existem muitos locais de acúmulo de fibrina insolúvel devido a sangramentos causados pela invasão do câncer (ver Figura 8), e considera-se que o anticorpo da presente invenção (isto é, anticorpo especifico para fibrina insolúvel) é útil para se direcionar para o câncer em um sistema de dispensação de fármacos, e o ADC da presente invenção é útil como um agente terapêutico para o câncer.
[0035] A presente invenção provê os seguintes anticorpos:
um anticorpo que se liga à fibrina, em que o anticorpo tem uma região variável da cadeia pesada tendo CDR1 apresentada na SEQ ID NO: 1, CDR2 apresentada na SEQ ID NO: 2 e CDR3 apresentada na SEQ ID NO: 3, e uma região variável da cadeia leve tendo CDR1 apresentada na SEQ ID NO: 5, CDR2 apresentada na SEQ ID NO: 6 e CDR3 apresentada na SEQ ID NO: 7; e
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14/45 um anticorpo que compete com o anticorpo pela ligação à fibrina. Estes anticorpos podem ser usados como o anticorpo especifico para fibrina insolúvel.
[0036] A presente invenção também provê o seguinte anticorpo:
um anticorpo que se liga à fibrina, em que o anticorpo tem uma região variável da cadeia pesada apresentada na SEQ ID NO: 4 e uma região variável da cadeia leve apresentada na SEQ ID NO: 8. Este anticorpo pode ser usado como o anticorpo especifico para fibrina insolúvel.
[0037] Este anticorpo também é reconhecido como um anticorpo tendo uma região variável da cadeia pesada tendo CDR1 apresentada na SEQ ID NO: 1, CDR2 apresentada na SEQ ID NO: 2 e CDR3 apresentada na SEQ ID NO: 3, e uma região variável da cadeia leve com CDR1 apresentada na SEQ ID NO: 5, CDR2 apresentada na SEQ ID NO: 6 e CDR3 apresentada na SEQ ID NO: 7.
[0038] A presente invenção provê os seguintes anticorpos:
um anticorpo que se liga à fibrina, em que o anticorpo tem uma região variável da cadeia pesada tendo CDR1 apresentada na SEQ ID NO: 9, CDR2 apresentada na SEQ ID NO: 10 e CDR3 apresentada na SEQ ID NO: 11, e uma região variável da cadeia leve com CDR1 apresentada na SEQ ID NO: 13, CDR2 apresentada na SEQ ID NO: 14 e CDR3 apresentada na SEQ ID NO: 15; e um anticorpo que compete com o anticorpo pela ligação à
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15/45 fibrina. Estes anticorpos podem ser usados como o anticorpo especifico para fibrina insolúvel.
[0039] A presente invenção também provê o seguinte anticorpo:
um anticorpo que se liga à fibrina, em que o anticorpo tem uma região variável da cadeia pesada apresentada na SEQ ID NO: 12 e uma região variável da cadeia leve apresentada na SEQ ID NO: 16. Este anticorpo pode ser usado como o anticorpo especifico para fibrina insolúvel.
[0040] Este anticorpo também é reconhecido como um anticorpo tendo uma região variável da cadeia pesada tendo CDR1 apresentada na SEQ ID NO: 9, CDR2 apresentada na SEQ ID NO: 10 e CDR3 apresentada na SEQ ID NO: 11, e uma região variável da cadeia leve com CDR1 apresentada na SEQ ID NO: 13, CDR2 apresentada na SEQ ID NO: 14 e CDR3 apresentada na SEQ ID NO: 15.
[0041] Os anticorpos acima mencionados, anticorpos insolúveis específicos para fibrina e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos podem ser usados como parte do anticorpo no ADC da presente invenção.
[0042] De acordo com a presente invenção, é provida uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz do ADC (também referido como ADC da presente invenção). De acordo com a presente invenção, o ADC e a composição farmacêutica da presente invenção podem ser usados para o tratamento de câncer.
[0043] O câncer como um objeto a ser tratado pelo ADC ou pela composição farmacêutica da presente invenção
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16/45 não é particularmente limitado, e exemplos do mesmo incluem câncer de pulmão, câncer de pâncreas, câncer de cabeça e pescoço, câncer de próstata, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer de esôfago, câncer de estômago, câncer de cólon, câncer uterino, câncer de ovário, câncer de pele, câncer de tireoide, câncer tímico, câncer de rim, câncer testicular, câncer de pênis, câncer de fígado, câncer do trato biliar, tumor cerebral, tumor de osso e tecidos moles, tumor retroperitoneal, e angiossarcoma/linfangiossarcoma e cânceres metastáticos dos mesmos.
[0044] O indivíduo da presente invenção pode ser um indivíduo que não sofra de um distúrbio trombótico ou de uma doença associada a um distúrbio trombótico ou de um indivíduo que não seja diagnosticado como portador de um distúrbio trombótico ou de uma doença associada a um distúrbio trombótico. Consequentemente, pode-se esperar que reduza os efeitos colaterais em outros tecidos que não o câncer. Por conseguinte, pode ser determinado se um sujeito com câncer sofre de um distúrbio trombótico ou de uma doença associada a um distúrbio trombótico e, em seguida, o ADC da presente invenção pode ser administrado ao indivíduo que não sofre de um distúrbio trombótico ou de uma doença associada com um distúrbio trombótico. Se um indivíduo sofre de um distúrbio trombótico ou de uma doença associada a um distúrbio trombótico ou não pode ser determinado adequadamente por um médico.
[0045] Em um certo aspecto da presente invenção, a composição farmacêutica compreende o ADC da presente invenção e um excipiente. A composição farmacêutica da
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17/45 presente invenção pode ser administrada por um método, tal como, administração intravenosa, administração subcutânea, administração intratumoral, administração intraperitoneal, administração intraventricular e administração intramuscular. A dose pode ser determinada adequadamente por um médico, considerando, por exemplo, a idade, sexo, peso e gravidade de uma doença de um paciente.
[0046] O ADC da presente invenção não visa apenas a fibrina insolúvel que se acumula no estroma do câncer e permite que o agente citotóxico se acumule no local alvo, mas também tem um ligante que pode ser clivado por plasmina ativada no local, em que a fibrina insolúvel está presente e causa liberação do agente citotóxico no local alvo. Consequentemente, é possível deteriorar especificamente o câncer nas proximidades do local da liberação.
[0047] De acordo com a presente invenção, é provido o uso do anticorpo específico para fibrina insolúvel na fabricação de um medicamento para uso no tratamento de câncer. De acordo com a presente invenção, é provido o uso de um ADC de um anticorpo específico para fibrina insolúvel e de um agente citotóxico, em que o anticorpo e o agente citotóxico têm um local de divagem por plasmina que pode ser clivado por plasmina no ADC, na fabricação de medicamento para uso no tratamento de câncer.
[0048] De acordo com a presente invenção, é provido um método para o tratamento de câncer em um indivíduo em necessidade do mesmo, compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do ADC da presente invenção ao indivíduo. De acordo com a presente invenção, é provido um método para o tratamento de câncer em um
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18/45 indivíduo em necessidade do mesmo, compreendendo determinar se um individuo com câncer sofre de um distúrbio trombótico ou uma doença associada a um distúrbio trombótico ou não e, em seguida, administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do ADC da presente invenção ao individuo que não sofre de um distúrbio trombótico ou de uma doença associada a um distúrbio trombótico.
[0049] De acordo com a presente invenção, é provido o uso do ADC da presente invenção para uso em um método para o tratamento de câncer.
Exemplos
Exemplo 1: Produção de anticorpo específico para fibrina insolúvel
[0050] Neste exemplo, foi produzido um anticorpo que tem uma afinidade seletivamente maior com fibrina insolúvel do que com fibrinogênio (doravante, referido como anticorpo específico para fibrina insolúvel).
(1) Explicação de imunogênio
[0051] No exemplo, foram obtidos anticorpos imunizando animais com um peptídeo tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 6 ou com um peptídeo tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27 como imunogênios. (2) Método de imunização
[0052] Os camundongos foram imunizados 6 vezes a cada 2 semanas, como a seguir.
[0053] Os imunogênios para a primeira e a quarta imunização foram preparados como a seguir. Um peptídeo tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 6 e um peptídeo tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27 foram usados como imunogênios. Um imunogênio ajustado a 0,5
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19/45 mg/mL com PBS esterilizado foi colocado em uma seringa de 1 mL. 0 Adjuvante Completo de Freund (Difco) na mesma quantidade que o do imunogênio foi colocado em outra seringa de 1 mL. As seringas foram conectadas a um adaptador, e a extrusão foi realizada até sentir resistência. Na primeira e na quarta imunização, 200 gL do imunogênio foram administrados por via intraperitoneal.
[0054] O imunogênio para a segunda, terceira, quinta e sexta imunizações foi preparado como a seguir. Um imunogênio ajustado a 0,5 mg/mL com PBS esterilizado foi misturado com GERBU ADJUVANT 100 (nacalai tesque) na mesma quantidade do imunogênio em um tubo de 1,5 mL, e a mistura foi colocada em uma seringa de 1 mL. Nas segunda, terceira, quinta e sexta imunizações, 100 gL do imunogênio foram administrados por via intraperitoneal. Na imunização final, um imunogênio ajustado a 0,1 mg/mL com PBS esterilizado foi colocado em uma seringa de 1 mL, e 100 gL do imunogênio foram administrados pela primeira vez por via intraperitoneal e, após 10 minutos, 400 gL do imunogênio foram administrados na veia da cauda. (3) Medição de titulação de anticorpo
[0055] Uma semana antes da última imunização de cada rato, o sangue foi coletado da veia da cauda. O sangue foi centrifugado a 4.000xg por 10 minutos a 4°C e o sobrenadante foi coletado como uma amostra. O título de anticorpos foi medido por ELISA usando amostras preparadas por diluição em série duas vezes de 100 vezes a 12800 vezes. Antes do ELISA, uma placa imobilizada com antígeno foi preparada. O fibrinogênio do plasma humano (SIGMA) foi dissolvido em TBS (pH 8,5) para produzir uma solução de
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20/45 fibrinogênio de 20 qg/mL. A solução foi adicionada a uma imunoplaca de 96 poços a 50 μί/ροςο e foi deixada repousar a 4 °C durante a noite para preparar uma placa de fibrinogênio. Trombina diluída para 0,05 NIH U/mL com um diluente de trombina [L-cisteína 7 mM (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation), CaC12 1 mM (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation), TBS (pH 8,5)] foi adicionado à placa de fibrinogênio na 100 qL/poço e foi incubado a 37 °C por 2 horas para preparar uma placa de fibrina insolúvel. A placa na qual cada antígeno foi imobilizado foi lavada com 200 μί de PBS-T (PBS, 0,5% (v/v) de Tween 20) três vezes, e 200 μί de uma solução de bloqueio [PBS-T, 1% (p/v) BSA] foram adicionados a cada poço, seguido de ficar em repouso em temperatura ambiente por 1 hora para bloqueio. As amostras diluídas em série foram adicionadas à placa a 50 μί/ροςο e foram deixadas em repouso em temperatura ambiente por 1 hora. As soluções foram descartadas, e a placa foi lavada com PBS-T três vezes. Um anticorpo secundário diluído a 0,3 μρ/ιηΕ com a solução bloqueadora foi adicionado à placa a 50 μί/ροςο, depois foi deixado em repouso em temperatura ambiente por 30 minutos. Como anticorpo secundário, as imunoglobulinas policlonais de coelho anti-camundongo/HRP (Dako) e as imunoglobulinas policlonais de coelho anticamundongo/HRP (Dako) foram usadas adequadamente de acordo com a amostra. As soluções foram descartadas, a placa foi lavada com PBS-T três vezes, e uma solução de substrato cromogênico (solução de substrato 1-Step™ Slow TMB-ELISA, Thermo Fisher Scientific, Inc.) foi adicionada à placa a 100 μί/ροςο, seguido de uma reação em temperatura ambiente por 10 minutos. A reação foi parada pela adição de 30 μΐ de
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H2SO4 2N a cada poço. A absorbância no comprimento de onda de 450 nm foi medida com o paradigma Spectra Max (Molecular Devices).
(4) Preparação de hibridoma
[0056] O baço foi removido cirurgicamente de cada camundongo e imerso em meio RPMI 1640 suplementado com 200 unidades/mL de penicilina, 200 qg/mL de estreptomicina e 500 ng/mL de anfotericina B. RPMI 1640 foi injetado no baço usando uma seringa de 10 mL (TERUMO Corporation) e uma agulha de injeção 22G (TERUMO Corporation), e células do baço foram retiradas e passadas através de uma peneira EASY de 70 μπι (Greiner Bio-One). A suspensão de células coletadas foi centrifugada a 270xg por 5 minutos em temperatura ambiente, o sobrenadante foi removido e o precipitado foi colocado em suspensão em 10 mL de RPMI 1640. Após repetir essa lavagem com RPMI 1640 duas vezes, o precipitado foi colocado em suspensão em 5 mL do RPMI 1640, seguido pela fusão celular como na fusão celular usando os linfonodos ilíacos de camundongo.
(5) Triagem de hibridoma
[0057] A triagem por ELISA foi iniciada 10 dias após a fusão celular. Na triagem primária, 50 μΕ do sobrenadante da cultura de cada um dos poços foram dispensados para uso como anticorpo primário. As placas nas quais cada um dos peptídeos usados para a imunização foi imobilizado, foram preparadas. Um peptídeo foi diluído para 20 μρ/πιΕ com tampão de fosfato e adicionado a uma imunoplaca de 96 poços (MAXI BREAKAPART NUNC-IMMUNO MODULE, Nunc) a 50 μΕ/poço, depois sendo deixado em repouso em temperatura ambiente por 1 hora para imobilização. Após a
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22/45 imobilização, o ELISA foi realizado como na medição do título de anticorpos para verificar os poços contendo células produtoras de anticorpos.
[0058] Na triagem secundária, 50 μί do sobrenadante da cultura somente dos poços positivos na triagem primária foram dispensados para uso como anticorpo primário. O ELISA usando a placa de fibrina e a placa de fibrinogênio foi realizado como na medição do titulo de anticorpos para verificar poços contendo células que produzem anticorpos insolúveis específicos para fibrina. Os poços que foram positivos na triagem secundária foram submetidos à coleta de colônias usando ponta de pipeta Tip Yellow com escala de 200 μί (Watson). A ponta foi pressionada contra uma colônia, e 5 mL da colônia foram aspirados e semeados em uma nova placa de cultura de células de 96 poços Costar.
[0059] Na triagem terciária, 50 μί do sobrenadante da cultura dos poços nos quais a colônia foi semeada foram dispensados para uso como anticorpo primário. O ELISA usando a placa de fibrina e a placa de fibrinogênio foi realizado como na medição do titulo de anticorpos. As células nos poços que foram positivas na triagem terciária foram submetidas à diluição limitante.
[0060] Na triagem quaternária, 50 μί do sobrenadante da cultura de apenas poços de uma única célula foram dispensados para uso como anticorpo primário. O ELISA usando a placa de fibrina e a placa de fibrinogênio foi realizado como na medição do titulo de anticorpos para selecionar células que produzem anticorpos insolúveis específicos para fibrina.
[00 61] O clone 99-5 foi obtido de um camundongo
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23/45 imunizado com um peptídeo tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26. 0 clone 1101 foi obtido de um camundongo imunizado com um peptídeo tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27. O clone 99-5 pode ser referido simplesmente como clone 99.
Exemplo 2:Análise característica dos anticorpos monoclonais resultantes
[0062] Neste exemplo, a afinidade de um anticorpo foi verificada por ELISA e ressonância de plasmon de superfície (SPR).
(1) Verificação de afinidade por ELISA
[0063] Antes do ELISA, uma placa imobilizada com antígeno foi preparada. O fibrinogênio do plasma humano (SIGMA) foi dissolvido em TBS (pH 8,5) para produzir uma solução de fibrinogênio de 20 gg/mL. A solução foi adicionada a uma imunoplaca de 96 poços a 50 gL/poço e foi deixada repousar a 4 °C durante a noite para preparar uma placa de fibrinogênio. Trombina diluída para 0,05 NIH U/mL com um diluente de trombina [L-cisteína 7 mM (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation), CaC12 1 mM (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation), TBS (pH 8,5)] foi adicionada à placa de fibrinogênio na 100 gL/poço e foi incubada a 37 °C por 2 horas para preparar uma placa de fibrina. A placa na qual cada antígeno foi imobilizado foi lavada com 200 gL de PBST (PBS, 0,5% (v/v) de Tween 20) três vezes e 200 gL de uma solução de bloqueio [PBS-T, 1% (p/v) BSA] foram adicionados a cada poço, seguido de ficar em repouso em temperatura ambiente por 1 hora para bloqueio. As amostras diluídas em série com PBS foram adicionadas à placa a 50 gL/poço e foram deixadas em repouso em temperatura ambiente por 1
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24/45 hora. As soluções foram descartadas, e a placa foi lavada com PBS-T três vezes. Um anticorpo secundário diluido a 0,3 gg/mL com a solução bloqueadora foi adicionado à placa a 50 gL/poço, depois foi deixado em repouso em temperatura ambiente por 30 minutos. Como anticorpo secundário, as imunoglobulinas policlonais de coelho anti-camundongo/HRP (Dako) e as imunoglobulinas policlonais de coelho anticamundongo/HRP (Dako) foram usadas adequadamente de acordo com a amostra. As soluções foram descartadas, a placa foi lavada com PBS-T três vezes, e uma solução de substrato cromogênico foi adicionada à placa a 100 gL/poço, seguida de uma reação em temperatura ambiente por 10 minutos. A reação foi parada pela adição de 30 μΐ de H2SO4 2N a cada poço. A absorbância no comprimento de onda de 4 50 nm foi medida com o paradigma Spectra Max (Molecular Devices).
[0064] Os resultados foram mostrados na Figura 1.
Como mostrado na Figura 1, os anticorpos obtidos do clone 99 e do clone 1101, que foram recentemente preparados no exemplo descrito acima, eram anticorpos específicos para a fibrina insolúveis que se ligam mais fortemente à fibrina insolúvel do que ao fibrinogênio. Além disso, os anticorpos reagiram mais fortemente com fibrina do que o anticorpo obtido do clone 102-10 obtido no documento WO 2016/167227. (2) Verificação de afinidade por SPR
[0065] Quando um antigeno é insolúvel, embora o SPR não seja adequado para verificar a afinidade do antigeno, a medição por SPR foi realizada como referência para comparar os niveis de afinidade relativa entre os anticorpos.
[0066] A afinidade de um anticorpo para fibrina insolúvel foi calculada com base na análise por ressonância
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25/45 de plasmon de superfície (SPR) usando Biacore T200 (GE Healthcare) para avaliar a interação intermolecular do anticorpo. 0 tampão usado no canal de fluxo foi o tampão HBS-N (GE Healthcare) . 0 peptídeo do local do epitopo de 102-10 (ver WO 2016/167227) foi diluído para 1 gg/mL com acetato de sódio 10 mM, pH 5,5 (GE Healthcare) e foi imobilizado em um chip sensor (chip sensor Biacore CM5, GE Healthcare). A imobilização foi realizada usando um kit de acoplamento de amina (BR-1000-50, GE Healthcare) e ajustando a quantidade de imunização para 90 RU. Subsequentemente, uma reação antígeno-anticorpo foi realizada usando um anticorpo diluído para 48,875,0 93,75, 187,5, 375, 750 e 1500 nM com 1 X de tampão HBS-N por um método de cinética multicíclica nas condições mostradas na Tabela 1. Após a medição, a análise usando a avaliação BIA (GE Healthcare) foi realizada para determinar o valor KD, valor kd e valor ka.
[Tabela 1]
Tabela 1: Condições para SPR
Condições para medição na amostra tempo de contato120 s vazão 30 μΐ/min tempo de dissociação180 s
Condições para regeneração
Reagente Glicina-HCl 10 mM, pH 1,5 tempo de contato60 s vazão 30 μΐ/min período de estabilização30 s
[0067] Os resultados foram mostrados na Tabela 2.
[Tabela 2]
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Tabela 2: Afinidade de cada anticorpo produtor de clone
para o epitopo por SPR
Clone No. Constante de Taxa de Ligação ka (1/Ms) Constante de Taxa de Dissociação kd (1/s) Afinidade KD (M)
99-5 1,80 X 104 5,85 X 10 4 3,26 X IO-8
3435 1,63 X 104 3, 68 X 10 4 2,25 X IO-8
1101 9,37 X 104 3,25 X IO-3 6, 68 X IO-8
102-10 3,77 X 104 1,75 X IO-3 4, 64 X IO-8
Exemplo 3: Verificação do acúmulo de anticorpo ao câncer usando o modelo de implantação subcutânea do câncer de pâncreas
[0068] Neste exemplo, LSL-KrasG12D/+ e Ptfla-Cre providos por Y. Kawaguchi, C. Wright e D. Tuveson e LSLTrp53R172H/+ provido pelo National Cancer Institute em Frederick foram cruzados para produzir camundongos mutantes triplos p53/p48/K-Ras (modelo de camundongo com câncer pancreático), e uma linhagem celular de câncer pancreático derivada de camundongo mutante triplo foi estabelecida. Por conseguinte, a imagem in vivo foi realizada usando a linhagem celular. Foi relatado que os camundongos mutantes triplos simulam o desenvolvimento do câncer de pâncreas humano. A linhagem celular do câncer de pâncreas foi cultivada em 500 mL de um meio RPMI 1640 (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation) suplementado com 100 mL de soro fetal bovino inativado (FBS, Gibco) e 10 mL de 100 unidades/mL de penicilina, 100 qg/mL de estreptomicina e 250 ng/mL de anfotericina B (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation). O sobrenadante da cultura foi então removido.
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27/45
As células foram lavadas com PBS (Invitrogen) e foram adicionados 2 mL de tripsina-EDTA [0,25% (p/v) de tripsina1,0 mmol/L solução de ácido etilenodiaminotetra-acético-4Na com vermelho de fenol, FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation]. As células foram destacadas por pipetagem e colocadas em um tubo de 15 mL (Corning Incorporated) , seguido de centrifugação com uma centrifuga (centrifuga universal 5800, KUBOTA Corporation Co., Ltd.) a 270xg por 3 minutos a 4 °C. O sobrenadante foi removido, e o precipitado foi recolocado em suspensão em 10 mL de PBS, seguido de centrifugação a 270xg por 3 minutos a 4°C. Após repetir esse procedimento três vezes, a concentração foi ajustada para 2X106 células/50gL com PBS, e a solução celular foi injetada subcutaneamente em camundongos BALB/c Slc nu/nu com 5 semanas de idade (Japão SLC, Inc.) a 50 gL por camundongo a partir da base do pé esquerdo. Após um mês, um anticorpo anti-fibrina insolúvel rotulado com Alexa 647 ou um anticorpo de controle foi administrado a 300 gg por camundongo a partir da veia da cauda. O controle usado foi o controle Isotipo IgGl de Camundongo InVivoMAb (Bio X Cell) . Os camundongos foram fotografados com um sistema de observação do corpo vivo in vivo OV110 (Olympus Corporation) uma hora após a administração e nos primeiro, terceiro, quinto e sétimo dias após a administração.
[0069] Os resultados foram mostrados na Figura 2. Como mostrado na Figura 2, foi revelado a partir da imagem que o acúmulo dos anticorpos insolúveis anti-fibrina insolúvel resultantes (em particular, 1101 e 99) ao câncer é alto.
[0070] Subsequentemente, um tumor removido
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28/45 cirurgicamente foi incorporado em um composto de OCT (Sakura Finetek Japan Co., Ltd.) e congelado para produzir seções de camada fina de 6 μπι. As seções de camada fina foram secas em ar com um secador por 45 minutos e depois foram fixadas com acetona resfriada (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation) por 10 minutos. Após lavagem com PBS, a coloração nuclear com Hematoxilina de Mayer (Muto Pure Chemicals Co., Ltd.) foi realizada por 2 minutos. Após lavagem com água corrente por 10 minutos, o citoplasma foi corado com eosina, o álcool (Muto Pure Chemicals Co., Ltd.) diluído três vezes com etanol a 100%. Após lavagem com água corrente, a imersão em etanol 100% por 3 minutos e a imersão em xileno (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation) por 3 minutos foram repetidas três vezes para desidratação e permeação. Finalmente, as seções foram montadas com Mount-Quick (Daido Sangyo Co., Ltd.).
[0071] O tumor removido cirurgicamente foi incorporado em um composto OCT (Sakura Finetek Japan Co., Ltd.) e congelado para produzir seções de camada fina de 6 μπι. As seções de camada fina foram secas ao ar com um secador por 45 minutos e depois foram fixadas com acetona resfriada (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation) por 10 minutos. Após lavagem com PBS, as seções foram imersas em 0,3% (v/v) de H2O2 por 20 minutos para inibição endógena da peroxidase. Após lavagem com PBS por 5 minutos, três vezes, foi realizado o bloqueio com uma solução de bloqueio [5% (p/v) de leite desnatado (Difco), PBS] por 30 minutos. Nas seções, 200 μΕ de um anticorpo marcado com HRP diluído a 1 μρ/πιΕ com a solução bloqueadora foram adicionados em gotas, seguidos por uma reação a 4°C durante a noite. Após lavagem
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29/45 com PBS por 5 minutos três vezes, foi realizada uma reação enzima-substrato com tetra-hidrocloreto de 3,3'diaminobenzidina (Dako). Subsequentemente, a lavagem com água destilada estéril foi realizada por 3 minutos, e a coloração nuclear com Hematoxilina de Mayer (Muto Pure Chemicals Co., Ltd.) foi realizada por 2 minutos. Após lavagem com água corrente por 10 minutos, a imersão em etanol a 100% por 3 minutos e a imersão em xileno (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation) por 3 minutos foram repetidas três vezes para desidratação e permeação. Finalmente, as seções foram montadas com Mount-Quick (Daido Sangyo Co., Ltd.).
Exemplo 4: Atividade anticâncer in vitro
[0072] Neste exemplo, um conjugado anticorpofármaco (ADC) no qual a monometil auristatina E (MMAE) foi ligada ao anticorpo especifico para fibrina insolúvel resultante foi produzido, e a atividade anticâncer do ADC foi avaliada.
[0073] Como ADC, um ADC com a estrutura mostrada na Figura 3 foi sintetizado. Neste ADC, MMAE como agente anticâncer estava ligado a um anticorpo monoclonal (mAb). No ADC, o anticorpo e o MMAE foram ligados entre si por meio de um espaçador de polietilenoglicol (PEG) e um local de divagem por plasmina, Val-Leu-Lys. Por conseguinte, o ADC é clivado na presença de plasmina, e o MMAE é liberado do anticorpo.
[0074] O ADC foi sintetizado especificamente da seguinte forma.
[Fórmula 1]
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Figure BR112019022643A2_D0001
[0075] DIPEA (0,54 de p-nitrofenila (472 mg, uma solução de DMF (2 mL) mL, 3,10 mmol) e cloroformiato
1,55 mmol) foram adicionados a contendo Fmoc-Val-Leu-Lys(Mmt) álcool aminobenzilico (0,74 g, 0,773 mmol) a 0°C, seguido de agitação em temperatura ambiente por 12 horas. A solução reacional foi parada com uma solução aquosa saturada de cloreto de amônio, seguida por extração com clorofórmio. A camada de extração foi lavada com uma solução salina saturada, seca sobre Na2SÜ4 e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia em silica gel (CHCÍ3:MeOH = 95:5 a 9:1) para resultar em FmocVal-Leu-Lys Mmt)-OPABC-carbonato de p-nitrofenila como um produto amorfo incolor.
RMN ΧΗ (400 MHz, CDC13) : d 8,01 (br, 1H) , 7,76 (br, 1H) , 7,05-7,60 (m, 13H) , 6,78 (d, J = 6,8 Hz, 2H) , 5,49 (br, 1H) , 5,25 (br, 1H) , 4,94 (br, 1H) , 4,77 (s, 2H) , 4,04 (s, 3H) , 4,00-4,85 (m, 3H) , 3,75 (s, 3H) , 3,55-3, 90 (m, 2H) , 3,26 (d, J =19,6 Hz, 1H) , 3,00 (d, J = 19,6 Hz, 1H) , 2,32 (br, 1H) , 1,26 (s, 3H) , 1,05-2,25 (m, 15H) , 0,70-1,05 (m, 12H) ; HRMS (ESI-MS) : calculado para C72H85N6O17 : 1305, 5971: [M+H]+; encontrado 1305,5935.
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31/45
[Fórmula 2]
Figure BR112019022643A2_D0002
Figure BR112019022643A2_D0003
fiiWW
[0076] MMAE (14,1 mg, 0,0197 mmol) foi adicionado a uma solução de piridina (80 mL)/DMF (0,4 mL) contendo corpo de carbonato de p-nitrofenila (33,2 mg, 0,0296 mmol) e HOBt (0,5 mg, 0,0039 mmol) a 0°C . A solução reacional foi agitada em temperatura ambiente por 10 horas e foi então purificada por LH20 direto (clorofórmio : metanol = 1:1) para resultar em Fmoc-Val-Leu-Lys(Mmt)-OPABC-MMAE (22,7 mg, 68%) como um produto amorfo incolor.
MS (MALDI-TOFMS) calculado para [ C99H132N10O15+K] + 1739, 95; encontrado 1741,37.
[Fórmula 3]
Figure BR112019022643A2_D0004
[0077]
Foi adicionado piperidina (110 mL, 1,10
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32/45 mmol) a uma solução de DMF (3 mL) contendo Fmoc-Val-LeuLys(Mmt)-OPABC-MMAE (626 mg, 0,368 mmol), seguido de agitação em temperatura ambiente por 40 minutos. A solução reacional foi purificada por LH20 (clorofórmio:metanol = 1:1) e HPLC (YMC T4000 10,0 mL/min, CHCl3:MeOH = 4:1, 254 nm) para resultar em H-Val-Leu-Lys(Mmt)-OPABC-MMAE (458 mg, 84%) como um produto amorfo incolor. MS (MALDI-TOFMS) calculado para [C94H122N10O13+K] + 1519,02; encontrado 1519,65. [Fórmula 4]
Figure BR112019022643A2_D0005
Figure BR112019022643A2_D0006
Ws ò p / « \ L
Q
[0078] Uma solução de cloreto de metileno (1 mL) contendo DIPEA (160 mL, 0,927 mmol) e Mal-PEG12-OSu (295 mg, 0,340 mmol) foi adicionada a uma solução de cloreto de metileno (2 mL) contendo H-Val-Leu-Lys(Mmt)-OPABC-MMAE (458 mg, 0,309 mmol) a 0°C. A solução reacional foi agitada em temperatura ambiente por 22 horas, seguida de purificação por LH20 (clorofórmio : metanol =1:1) e HPLC de reciclagem
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33/45 de peneiras moleculares (YMC T4000 10,0 mL/min, CHCI3, 254 nm) para resultar em Mal-PEG12-Val-Leu-Lys(Mmt)-OPABC-MMAE (498 mg, 72%) como um produto amorfo incolor.
MS (MALDI-TOFMS) calculado para [ Cii8Hi8oNi2029+K-Mmt ] +
1997,51; encontrado 1999,49.
[Fórmula 5]
Figure BR112019022643A2_D0007
[0079] Dissolveu-se Mal-PEG12-Val-Leu-Lys(Mmt)OPABC-MMAE (498 mg, 0,223 mmol) em uma solução de cloreto de metileno TFA a 5% (2 mL) , e adicionou-se metanol (50 mL), depois mexeu-se em temperatura ambiente por 1 hora. A solução reacional foi purificada por LH20 direto (clorofórmio:metanol = 1:1) e depois por HPLC (YMC T4000, 10,0 mL/min, CHCI3, 254 nm) para resultar em Mal-PEG12-ValLeu-Lys-OPABC-MMAE (440 mg, 90%) como um produto amorfo incolor. MS (MALDI-TOFMS) calculado para [ C98Hi64Ni2O28+K] + 1997,51; encontrado 1998,31.
[0080] Subsequentemente, uma placa de fibrina foi
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34/45 produzida. Uma solução de fibrinogênio de 25 mg/mL (5 μΣ) foi adicionada a uma placa de 96 poços para cultura de células ao longo da superfície da parede. Uma solução de trombina (1 μΣ) foi adicionada a cada poço, seguida de centrifugação a 40xg a 4°C por 1 minuto. Após uma reação a 37°C por 2 horas, a placa foi armazenada a 4°C até o uso.
[0081] A linhagem celular 5-11 (células de câncer pancreático derivadas de camundongos TG) foi semeada na placa revestida com fibrina resultante a 2000 células/poço, seguida de cultura a 37 °C durante a noite. Como meio de cultura, foi usado um meio RPMI contendo FBS a 10%.
[0082] Foi preparada uma série de diluições com concentrações finais de 0 a 25 nM (em termos de MMAE) do ADC.
[0083] As concentrações finais de plasminogênio, tPA e antiplasmina (X2 foram ajustadas para aproximadamente as mesmas concentrações do plasma normal, isto é, cerca de 1500 nM, cerca de 0,3 nM e cerca de 1000 nM, respectivamente.
[0084] A solução de cultura foi removida da placa de fibrina, e 90 μΣ da solução contendo plasminogênio, tPA e antiplasmina (X2 foram adicionados à mesma, e 10 μΣ de uma série de diluições de ADC (no desenho, referido como FbnADC) foram então adicionados à mesma. Como controles, um anticorpo insolúvel de fibrina sozinho (no desenho, referido como IgG) e um ADC (no desenho, referido como ADC de controle) no qual um anticorpo anti-4M-Tag (controle IgG) foi usado como anticorpo na Figura 3. Após incubação a 37 °C por 72 horas, a solução de cultura foi removida. Uma solução reacional preparada misturando CCK-8
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35/45 (Dojindo Laboratories) e uma solução de cultura na proporção de 1:10 foi adicionada à placa, seguido de incubação a 37 °C por 3 horas. A IC50 foi calculada a partir de uma curva de densidade óptica determinada em A450.
[0085] Os resultados foram mostrados na Figura 4. O ADC do anticorpo especifico para fibrina insolúvel mostrou um efeito inibidor da proliferação de células cancerígenas, mas no controle, nenhum efeito significativo de inibição da proliferação tumoral foi observado. Este resultado demonstra que o anticorpo especifico para fibrina insolúvel-ADC se liga à fibrina revestida em uma placa e que o ligante é então clivado por plasmina para liberar MMAE para matar células tumorais. A IC50 do anticorpo especifico para fibrina insolúvel-ADC foi de 19 nM.
Exemplo 5: Atividade anticâncer in vivo do anticorpo específico para fibrina insolúvel-ADC
[0086] Foi estabelecida uma hipótese de que a proliferação in vivo de câncer danifica os vasos sanguíneos ao redor do câncer, causando sangramento e, consequentemente, fibrina insolúvel se acumula próximo ao tumor para interromper o sangramento e que um agente anticâncer pode ser dispensado na proximidade do câncer usando um anticorpo que se liga à fibrina insolúvel acumulada. Também foi criado um conceito de um novo agente anticâncer no qual um local de divagem por plasmina é inserido no ligante de um ADC e, assim, o ADC atingido pela fibrina insolúvel é clivado e libera adicionalmente a fibrina insolúvel do agente anticâncer dependentemente pela plasmina ativada na fibrina insolúvel. Foi estabelecida uma hipótese de que o ADC acumula consequentemente fibrina
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36/45 insolúvel de maneira dependente e libera o agente anticâncer para intensificar a especificidade do câncer.
[0087] Foi verificado o efeito terapêutico do ADC contra um modelo tendo câncer de pâncreas espontâneo (modelo de câncer de pâncreas espontâneo) nos camundongos mutantes triplos P53/K-ras/P48. O anticorpo especifico para fibrina insolúvel-ADC (0,3 mg (em termos de MMAE)/kg de peso/3 a 4 dias (isto é, 20 mg (em termos de ADC)/kg de peso/3 a 4 dias) foi administrado ao modelo, e uma curva de Kaplan-Meier foi determinada. O nivel de significância em um teste de Logrank foi definido como 0,05. Como o ADC de controle (no desenho, referido como ADC de controle), foi usado o anticorpo anti-4M-Tag.
[0088] Os resultados foram mostrados na Figura 5. Como mostrado na Figura 5, o ADC (no desenho, referido como CCFbn-ADC) melhorou significativamente a taxa de sobrevivência do modelo de câncer de pâncreas espontâneo em comparação com o controle. Consequentemente, ficou provado que as hipóteses descritas acima estão corretas.
Exemplo 6: Atividade anticâncer do anticorpo específico para fibrina insolúvel-ADC no modelo de tumor subcutâneo com deposição de fibrina
[0089] Neste exemplo, uma linhagem celular foi estabelecida a partir do câncer de pâncreas espontâneo derivado de mutante triplo, e um modelo de tumor subcutâneo obtido por implantação subcutânea da linhagem celular foi usado para verificação da atividade anticâncer do anticorpo específico para fibrina insolúvel-ADC.
[0090] A linhagem celular estabelecida a partir do câncer de pâncreas espontâneo derivado de mutante triplo
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37/45 foi denominada 5-11. 5xl05 células de 5-11 foram implantadas subcutaneamente em camundongos nude BALB/C para produzir um modelo de implantação subcutânea. Este modelo de implantação subcutânea apresentou deposição de fibrina por via subcutânea. 0 modelo de tumor subcutâneo resultante foi administrado com o anticorpo especifico para fibrina insolúvel-ADC (0,3 mg (em termos de MMAE)/kg de peso/3 a 4 dias (isto é, 20 mg (em termos de ADC)/kg de peso/3 a 4 dias), e a variação na taxa de aumento do volume do tumor foi observada. O nivel de significância em comparação com ANOVA foi apresentado em 0,01.
[0091] Os resultados foram mostrados na Figura 6A. Como mostrado na Figura 6A, o ADC (no desenho, referido como CCFbn-ADC) suprimiu significativamente o aumento no volume do tumor em comparação com o controle.
[0092] Variações no peso corporal ao longo do tempo no modelo de implante subcutâneo foram mostradas na Figura 6B. Como mostrado na Figura 6B, não houve aumento ou diminuição significativa no peso, o que revelou que o ADC da presente invenção pode ser um agente terapêutico com poucos efeitos colaterais.
[0093] Subsequentemente, o efeito antitumoral foi comparado ao caso de um ligante que não tem a sequência de divagem por plasmina.
[0094] O 44As3 foi semeado na placa revestida com fibrina resultante e a placa não revestida a 3000 células/poço, seguida de cultura a 37°C durante a noite. Como meio de cultura, foi usado um meio RPMI contendo FBS a 10% .
[0095] Foram preparadas séries de diluição com
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38/45 concentrações finais de 0 a 3 nM (em termos de MMAE) de um ADC tendo um ligante de catepsina (contendo valinacitrulina) e um ADC tendo um ligante de plasmina.
[0096] As concentrações finais de plasminogênio, tPA e antiplasmina (X2 foram ajustadas para aproximadamente as mesmas proporções de concentração que as do plasma normal, isto é, cerca de 150 nM, cerca de 0,03 nM e cerca de 100 nM, respectivamente.
[0097] A solução de cultura foi removida de cada placa, e 90 J_LL da solução contendo plasminogênio, tPA e antiplasmina (X2 e, em seguida, 10 J_LL de uma série de diluições de ADC foram adicionados a cada placa. Após incubação a 37 °C por 72 horas, a solução de cultura foi removida. Uma solução reacional preparada misturando CCK-8 (Dojindo Laboratories) e uma solução de cultura na proporção de 1:10 foi adicionada a cada placa, seguida de incubação a 37 °C por 2 horas. A IC50 foi calculada a partir de uma curva de densidade óptica determinada em A450.
[0098] Os resultados foram mostrados na Figura 7. Como mostrado na Figura 7, o ADC com um local de divagem por plasmina (no desenho, referido como ligante de plasmina) mostrou claramente um efeito de inibição da proliferação celular nas células tumorais, mas o ADC no qual o ligante tendo um local de divagem por plasmina foi substituído por um ligante tendo um local de divagem por catepsina (no desenho, referido como ligante de catepsina) mostrou quase nenhum efeito de inibição da proliferação celular nas células tumorais.
[0099] A partir dos resultados acima descritos, como mostrado na Figura 8, o mecanismo de ação do ADC da
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39/45 presente invenção é inferido da seguinte maneira: um conjugado anticorpo anti-fibrina insolúvel-agente citotóxico incluindo um ligante tendo um local de divagem por plasmina é dispensado pela circulação do sangue para a proximidade do câncer onde a fibrina insolúvel se acumula, o local do ligante é clivado por plasmina próxima à fibrina, e o agente citotóxico é liberado para a proximidade do câncer. Consequentemente, o câncer entra em contato com o agente citotóxico.
[00100] O câncer com um maior grau de malignidade é mais invasivo para os tecidos. Quando o câncer invade um vaso sanguíneo, ocorre sangramento, e fibrina insolúvel é formada no local do sangramento. O ADC da presente invenção é inferido como tendo uma eficácia especialmente alta em tal câncer com um alto grau de malignidade. Além disso, infere-se que o ADC mostra similarmente uma atividade anticâncer, mesmo se outro anticorpo específico para fibrina insolúvel for usado.
Exemplo 7: Análise de sequência do anticorpo
[00101] 5xl05 células foram transferidas de uma placa de 100 mm (Corning Incorporated) para um tubo de 15 mL, seguido de centrifugação a 270xg por 3 minutos a 4°C. Após a remoção do sobrenadante, 1 mL de RNAiso Plus (Takara Bio Inc.) foi adicionado ao tubo. As células foram transferidas para um Eppendorf e foram submetidas a vórtice. Subsequentemente, a suspensão de células foi deixada em repouso em temperatura ambiente por 5 minutos, seguida pela extração do RNA total com um RNeasy Mini Kit (Qiagen). Adicionou-se clorofórmio (200gL, FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation) à suspensão celular, agitou-se
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40/45 em vórtice por 30 segundos e deixou-se repousar por 3 minutos. Subsequentemente, a centrifugação foi realizada a 20.400Xg por 15 minutos a 4°C e foram coletados 500 μΕ do sobrenadante. Ao sobrenadante coletado, foram adicionados 500 μΕ de EtOH a 70%. A solução foi transferida para uma coluna de centrifugação RNeasy Mini e centrifugada a 15.000xg por 1 minuto em temperatura ambiente. O fluxo foi descartado, e 700 μΕ de tampão RW1 (Qiagen) foram adicionados à coluna, seguidos de centrifugação a 8.000xg por 1 minuto em temperatura ambiente. O fluxo foi descartado e 500 μΕ de tampão RPE (Qiagen) foram adicionados à coluna, seguidos de centrifugação a 8.000xg por 1 minuto em temperatura ambiente. Esta lavagem foi repetida três vezes e, finalmente, 50 μΕ de água destilada estéril foram adicionados à coluna, seguidos de centrifugação a 20.400xg por 1 minuto em temperatura ambiente para extrair o RNA.
[00102] O DNA complementar foi sintetizado a partir do RNA extraido usando um Kit de Amplificação de cDNA SMARTer RACE (Takara Bio Inc.). A mistura de tampão (5x2 μΕ de tampão da primeira fita, 1 μΕ de DTT 2 0 mM, 1 μϋ de Mistura dNTP 10 mM) foi ajustada previamente e foi deixada em temperatura ambiente. Um microlitro de 5'-CDS ininciador-A foi coletado em uma tira de 8 tubos de PCR (Thermo Fisher Scientific, Inc.), foram adicionados 300 ng de RNA total e o volume total foi ajustado para 3,75 μΕ com água sem Nuclease. A amostra foi reagida a 72 °C por 3 minutos e depois a 42°C por 2 minutos usando um sistema PCR ProFlex. Depois de girar para baixo, foi adicionado 1 μΕ de oligo SMARTerlIA. Uma solução preparada misturando 4 μΕ
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41/45 mistura de tampão, 0,25 gL de inibidor de RNase e 1 gL de Transcriptase Reversa SMART Scribe foi adicionada à amostra. A amostra foi reagida a 42°C por 90 minutos e, em seguida, a 72 °C por 10 minutos, usando um sistema de PCR ProFlex para sintetizar cDNA. A sequência do cDNA foi então analisada. As sequências dos anticorpos resultantes foram as seguintes.
[00103] A região variável da cadeia pesada de mAb (IgGl de camundongo) obtida do clone 99 (clone 99-5)
[Fórmula 6]
ATG GAT TGG CTG TGG AAC TTC CTA TTC CTG ATG GCA GCT GCC CAA ACT ATC CAA GCA CAG 60
M D W L W I. I. FLMAAAQS IQAQ
61 ATC CAG TTG CTG CAG TCT GGA G CCT GAG p i: CTC AAG AAG CCT GGA G GAG E ACA T GTC v AAG ATC TCC 120
I Q L V Q S L K CDRl K P K I s
121 TGC AAG GCT TCT GGG TAT ACC TTC ACA AAC TAT GGA ATG AAC TGG GTG AAG CAG GCT CCA 180
C K A S & Y F T N ¥ G M N f V K Q A P
CDR2
181 GGA AAG GGT TTA AAG TGG ATG GGC TGG ATA AAC ACC AAA ATT GGA GAG CCA ACA TAT GCT 240
G K G L t « M G W :I N T K I G E P T ¥ A
241 GAA GAG TTC AAG GGA CGG TTT GCC TTC TCT TTG GAA ACC TCT GCC AGÇ ACT GCC TAT TTG 300
E F. F K G R F A F S. L E T s A s T A V L
CDR3
301 CAG ATC AAC AAC CTC AAA AAT GAG GAC ACG GCT ACA TAT TTC TGT GCA AG A CTC CTT GAC 360
Q I X S L K N E D· T A T Y F C A R í. L D
361 TAC TGG GGC CAA GGC ACC ACT CTC ACA GTC TCC TCA GCC AAA ACG ACA CCC CCA TCT GTC 420
Y W G Q G T T L T V S s A K T T P P S V
[00104] A região variável da cadeia leve do mAb (IgGl de camundongo) obtida do clone 99 (clone 99-5)
[Fórmula 7]
l ATG M GAG E ACA GAC ACA T D T CTC l CTG I. CTA L TGG F GTG V CTG t CTG l. CTC L TGG W GTT V CCA P GGT TCC ACA G S T GGT G 60
61 GAC ATT CTC CTG ΑΓΓ CAA TCT CCA GCT' TCT' TTG GCT CTC TCT CTA GGG CAG ACC CCC ACC 120
D I V 1 T CDRl Q S : P A. S : L A V s L G'· Q R A T
121 ATA TCC I s TGC C AGA GCC AGT GAA AGT GTT GAT AGT TAT GGC AAT AGT ¥ G N S TTT F ATG M CAC H TGG W TAC; ¥ 180
R A S E S V I) s
181 CAG CAG AAA CCA GGA CAG CCA CCC AAA CTC CTC CDR2 ATC TAT CGT GCA TCC AAC CTA GAA TCT í 240
Q « K P G Q P P K t ; L I Y |R A s X 1. L u
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241
GGG ATC CCT GCC
G
AGG
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F
GGC AGT
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G
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301
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AGG ACA GAC TTC ACC CTC ACC ATT AAT
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G T
AAG
I
CTG GAA ATC
L E I
AAA CGG GCT GAT GCT GCA CCA ACT GTA
K R A
TCC s
420
[00105]
A região variável da cadeia pesada de mAb (IgGl de camundongo) obtida do clone
1101
[Fórmula 8]
ATG GAA
Μ E
TGT AAC
C N
TGG
ATA
I
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L
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P
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F
ATT
I
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L
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361
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240 :CAG AAG TTC, AAG GGC) AAG GCC AAA CTG ACT GCA GTC. ACA TCC GCC AAC ACT GCC TAC ATG Q I F K G |K
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GAG CTC AGC AGC CTG ACA
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G
CAA GGG
Q G
ACT
T
CTG
L
GTC
V
ACT GTC TCT CCA
T V
GCC
A
420
[00106]
A região variável da cadeia leve de mAb (IgGl de camundongo) obtida do clone 1101
[Fórmula
9]
ATG TCA
M S
GGT CAC AGC
G H
AGA AAC
R N
ATG AAG
Μ K
TTT CCT
F P
TCT s
CAA CTT
Q L
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181
241
301
GCC TGG TAT CAG CAG A
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TCT GGT GCA ACC AGT SCATS
GCT CCT AGG CTC TTA
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300
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D
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ACT TAT TAC TGTICAA CAG TAT TGG AGT
T Y ¥ C Q Q Y W S
360
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361
ACT CCG CTC ACG TTC
GGT GCT GGG ACC AAG CTG GAG CTG AAA CGG GCT GAT GCT GCA CCA
420
1. K
RADA A P
[00107]
A região variável da cadeia pesada de mAb (IgG2b de camundongo) obtida do clone 0211
[Fórmula 10]
1 ATG ÀAC nc GGG TTC AGC TTG ATT TTC CTT GTC CTT GTT TTA AAA GGT GTC CAG TGT GAA 60
M N F G P S L I F L V L V L K G V Q c I·'
61 GTC AAG CTG GTG GAG TCT GGG GGA GGC TTA GTG •AAG CCT GGA GGG TCC CTG AAA CTC TCC 120
V K L V E s G G G L ¥ P G G •S ; L K L s
CDR1
121 TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACT TTC AGT AGC TAT GCC ATG TCT TGG GTT CGC· CAG ACT CCA 180
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CDR2
181s GAG AAG AGG CTG GAG TGG GTC GCA ÍWXÃTT ACT ÁGT1KT WÃÍX A(X TAC fAT CCA GAC] 240
E K R L E f V A A I S S G β T t Y Y P D
241 ÍAGT GTC AAG GGclcGA TTC ACC ATC TCC AGA GAT AAT GCC AGG ÀAC ATC CTG TAC CTG CAA300 jS V K G ]r F T I S R D K A R R I L YL Q . ÇPR3
301 ATG AGC AGT CTG AGG TCT GAG GAC ACG GCC ATG TAT TAC TGT GTÁ AGA|GGC GGT ACGÃfÃJ 360
M S S L R S E D TAM Y ¥ C V R |G G T I J
361 [ÕGG GCT TAC 'Κβ!GCC CAA GGG ACT CTG GTC' ACT GTC TCT GCA402 |G A Y T |g 0 G T L V T V SA
[00108] A região variável da cadeia leve de mAb (IgG2b de camundongo) obtida do clone 0211
[Fórmula 11]
l ATG M GAA E TCA CAG S Q ACT T CAG GTC TTC Q V F CTC •I, TCC s CTG CTG 1. 1, CTC L TGG W GTA V TCT GGT S :G ACC T TGT c GGG G 60
61, ÀAC N ATT I ATC M ATG M ACA T CAS TCG CCA Q S P TCA S TCT s CTG GCT 1 A GTG V TCT s GCA, A GGA GAA G E AAG K CTC V ACT T 120
CDR1
121 ATG AGC TGT M S Ç AAG TCC AGT CAA AGT GTT TTA TAC AGT TCA AAT CAG AAG AAC TAC TTG GCC; 180 K S S Q S V L Y S S N Q K Ν Y L A j
CE)R2
181 TGG TAC CAG CAG AAA CCA GGG CAG TCT CCT AAA CTG CTG ATC TAC W ¥ Q Q K P G Q S l> K L L I Y TGG GCA TCC ACT AGG 240 W A R T R
241 GAA TCT E S GOT GTC CCT GAT CGC TTC ACA GGC AGT GGA TCT GGG ACA GAT TTT ACT CTT ACC 300 G V P 0 R F T G S G S G T 1) F T L T CDR3
301 361 ATC AGC I s TGG ACG W T AGT GTA CAA GCT GAA GAC CTG GCA GTT TAT TAC TCT S V Q A E D I, A V Y Y C TTC GGT GGA GGC ACC AAG CTG GAA ATC AAA F G G G T K L Β I K CAT CAA TAC CTC TCC TCGj 360 HL Q Y J„ 1 S a j 396
Listagem de Sequência
[00109] SEQ ID NOs: 1 a 3: correspondendo à cadeia pesada CDR1 a CDR3, respectivamente, do anticorpo 99.
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[00110] SEQ ID NO: 4: correspondente à região variável da cadeia pesada do anticorpo 99 (as posições de aminoácidos 1 a 19 são a sequência sinal).
[00111] SEQ ID NOs: 5 a 7: correspondendo à cadeia leve CDR1 a CDR3, respectivamente, do anticorpo 99.
[00112] SEQ ID NO: 8: correspondente à região variável da cadeia leve do anticorpo 99 (as posições de aminoácidos 1 a 19 são a sequência sinal).
[00113] SEQ ID NOs: 9 a 11: correspondente à cadeia pesada CDR1 a CDR3, respectivamente, do anticorpo 1101.
[00114] SEQ ID NO: 12: correspondente à região variável da cadeia pesada do anticorpo 1101 (posições de aminoácidos 1 a 19 são a sequência sinal).
[00115] SEQ ID NOs: 13 a 15: correspondendo à cadeia leve CDR1 a CDR3, respectivamente, do anticorpo 1101.
[00116] SEQ ID NO: 16: correspondente à região variável da cadeia leve do anticorpo 1101 (as posições de aminoácidos 1 a 27 são a sequência sinal).
[00117] SEQ ID NOs: 17 a 19: correspondente à cadeia pesada CDR1 a CDR3, respectivamente, do anticorpo 0211.
[00118] SEQ ID NO: 20: correspondente à região variável da cadeia pesada do anticorpo 0211 (as posições de aminoácidos 1 a 19 são a sequência sinal).
[00119] SEQ ID NOs: 21 a 23: correspondente à cadeia leve CDR1 a CDR3, respectivamente, do anticorpo 0211.
[00120] SEQ ID NO: 24: correspondente à região variável da cadeia leve do anticorpo 0211 (as posições de aminoácidos 1 a 20 são a sequência sinal).
[00121] SEQ ID NO: 25: cadeia Ββ de fibrina humana.
[00122] SEQ ID NO: 26: fragmento de cadeia Ββ de
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45/45 fibrina humana usado como imunogênio de 99.
[00123] SEQ ID NO: 27: fragmento de cadeia Ββ de fibrina humana usado como imunogênio de 1101.
[00124] SEQ ID NO: 28: fragmento de cadeia Ββ de fibrina humana (peptídeo N° 2) que pode ser usado como um imunogênio.

Claims (11)

1. Conjugado anticorpo-fármaco (ADC), caracterizado por o anticorpo ser um anticorpo que se liga à fibrina e tem afinidade com fibrina insolúvel maior que com fibrinogênio, o fármaco ser um agente citotóxico e o anticorpo e o fármaco estarem ligados entre si através de um ligante tendo um local de divagem por plasmina que permite a divagem por plasmina.
2. ADC, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o ligante ter uma sequência peptídica valina-leucinalisina como local de divagem por plasmina.
3. Composição farmacêutica compreendendo o ADC, como definido na reivindicação 1 ou 2, caracterizada por ser para uso no tratamento de câncer.
4. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de o câncer ser um câncer invasivo.
5. Anticorpo que se liga à fibrina, caracterizado pelo fato de o anticorpo ter uma região variável da cadeia pesada tendo CDR1 apresentada na SEQ ID NO: 1, CDR2 apresentada na SEQ ID NO: 2 e CDR3 apresentada na SEQ ID NO: 3, e uma região variável da cadeia leve tendo CDR1 apresentada na SEQ ID NO: 5, CDR2 apresentada na SEQ ID NO: 6 e CDR3 apresentada na SEQ ID NO: 7;
um anticorpo que compete com o anticorpo pela ligação à fibrina; ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo.
6. Anticorpo que se liga à fibrina, caracterizado pelo
Petição 870190110004, de 29/10/2019, pág. 60/70
2/2 fato de o anticorpo ter uma região variável da cadeia pesada apresentada na SEQ ID NO: 4 e uma região variável da cadeia leve apresentada na SEQ ID NO: 8; ou um fragmento de ligação a antigeno do mesmo.
7. Anticorpo que se liga à fibrina, caracterizado pelo fato de o anticorpo ter uma região variável da cadeia pesada tendo CDR1 apresentada na SEQ ID NO: 9, CDR2 apresentada na SEQ ID NO: 10 e CDR3 apresentada na SEQ ID NO: 11, e uma região variável da cadeia leve tendo CDR1 apresentada na SEQ ID NO: 13, CDR2 apresentada na SEQ ID NO: 14 e CDR3 apresentada na SEQ ID NO: 15;
um anticorpo que compete com o anticorpo pela ligação à fibrina; ou um fragmento de ligação a antigeno do mesmo.
8. Anticorpo que se liga à fibrina, caracterizado pelo fato de o anticorpo ter uma região variável da cadeia pesada apresentada na SEQ ID NO: 12 e uma região variável da cadeia leve apresentada na SEQ ID NO: 16; ou um fragmento de ligação a antigeno do mesmo.
9. ADC, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de o anticorpo ser o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 5 a 8.
10. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de compreender o ADC como definido na reivindicação 9.
11. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada por ser para uso no tratamento de câncer.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AR120079A1 (es) * 2019-09-19 2022-02-02 Seattle Genetics Inc Liberación selectiva de fármacos de conjugados internalizados de compuestos biológicamente activos
WO2021200932A1 (ja) 2020-03-31 2021-10-07 国立研究開発法人国立がん研究センター フィブリンに結合する抗体および当該抗体を含む医薬組成物
CN115552012A (zh) * 2020-03-31 2022-12-30 国立研究开发法人国立癌症研究中心 适于溶解纤维蛋白凝块的融合蛋白及包含该融合蛋白的药物组合物
TW202405178A (zh) * 2022-04-08 2024-02-01 日商凜研究所股份有限公司 與纖維蛋白結合的抗體及含有該抗體的纖維蛋白溶解性蛋白質以及含有該蛋白質的醫藥製劑

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3177776B2 (ja) * 1988-09-27 2001-06-18 武田薬品工業株式会社 ハイブリッドモノクローナル抗体，抗体産生ポリドーマおよび抗体含有薬剤
EP0710720A1 (en) 1988-06-13 1996-05-08 American Biogenetic Sciences, Inc. Method for the production of monoclonal antibodies utilizing a germfree animal
CA2372053C (en) 1999-04-28 2008-09-02 Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions and methods for cancer treatment by selectively inhibiting vegf
WO2003000736A1 (en) 2001-06-26 2003-01-03 Agen Biomedical Limited Humanized antibodies derived from dd-3b6/22, specific for the d-dimer fragment of fibrin
JP5593488B2 (ja) 2008-11-17 2014-09-24 独立行政法人国立がん研究センター 癌間質の構成因子に対して特異的結合能を有する物質と抗腫瘍性化合物との複合体による新規の癌ターゲティング治療
MX2012003811A (es) * 2009-10-02 2012-05-08 Univ California Anticuerpos monoclonales.
JP2012000072A (ja) * 2010-06-18 2012-01-05 Japan Health Science Foundation 新規な抗フィブリン抗体
WO2014133093A1 (ja) 2013-02-28 2014-09-04 独立行政法人国立がん研究センター 不溶性フィブリンに対する抗体
EP3024460B1 (en) * 2013-07-23 2020-07-22 Immunomedics, Inc. Method for producing antibody-sn-38 immunoconjugates with a cl2a linker
WO2016167227A1 (ja) * 2015-04-13 2016-10-20 国立研究開発法人国立がん研究センター 不溶性フィブリンに対する抗体

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