JP7330996B2 - Cd73を標的とする抗体および抗体-薬物複合体、その製造方法と使用 - Google Patents
Cd73を標的とする抗体および抗体-薬物複合体、その製造方法と使用 Download PDFInfo
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Description
2) ADOがNK細胞と腫瘍細胞の間の接着に干渉することで、NK細胞の細胞毒性顆粒を放出する能力を低下させ、細胞毒性作用を弱める。
4) ADOがM1型マクロファージの分化を抑制し、炎症促進サイトカインIL-12、TNF-α、iNOSなどの放出を減少させ、M2型マクロファージを活性化し、大量の抗炎症サイトカイン(TGF-β、アルギナーゼ1)を生成させることで、腫瘍の免疫逃避の発生を手伝う。
本発明の第一の側面では、抗体の重鎖可変領域であって、以下の3つの相補性決定領域CDR:
配列番号10で示されるCDR1、
配列番号11で示されるCDR2、および
配列番号12で示されるCDR3、
あるいは、
配列番号1で示されるCDR1、
配列番号2で示されるCDR2、および
配列番号3で示されるCDR3、
あるいは、
配列番号21で示されるCDR1、
配列番号22で示されるCDR2、および
配列番号23で示されるCDR3を含み、
ここで、上記アミノ酸配列のうちの任意の一つのアミノ酸配列は、さらに、任意に少なくとも一つのアミノ酸の付加、欠失、修飾および/または置換がありながら、CD73結合親和力を維持する誘導配列を含む重鎖可変領域を提供する。
配列番号10、配列番号11、配列番号12で示されるmAb002cの重鎖相補性決定領域HCDR1、HCDR2、HCDR3、あるいは
配列番号1、配列番号2、配列番号3で示されるmAb001cの重鎖相補性決定領域HCDR1、HCDR2、HCDR3、あるいは
配列番号21、配列番号22、配列番号23で示されるmAb004cの重鎖相補性決定領域HCDR1、HCDR2、HCDR3を含む。
もう一つの好適な例において、前記重鎖可変領域は、さらに、ヒト由来のFR領域またはマウス由来のFR領域を含む。
もう一つの好適な例において、前記重鎖可変領域は配列番号16、配列番号17、配列番号18で示されるアミノ酸配列を有する。
もう一つの好適な例において、前記重鎖可変領域は配列番号27、配列番号28、配列番号29で示されるアミノ酸配列を有する。
もう一つの好適な例において、前記重鎖可変領域は配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号45、配列番号46で示されるアミノ酸配列を有する。
もう一つの好適な例において、前記重鎖可変領域は配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41で示されるアミノ酸配列を有する。
もう一つの好適な例において、前記の抗体の重鎖は、さらに、重鎖定常領域を含む。
もう一つの好適な例において、前記の重鎖定常領域は、ヒト由来のもの、マウス由来のものまたはウサギ由来のものである。
あるいは、
配列番号13で示されるCDR1'、
配列番号14で示されるCDR2'、および
配列番号15で示されるCDR3'、
あるいは、
配列番号4で示されるCDR1'、
配列番号5で示されるCDR2'、および
配列番号6で示されるCDR3'、
あるいは、
配列番号24で示されるCDR1'、
配列番号25で示されるCDR2'、および
配列番号26で示されるCDR3'を含み、
ここで、上記アミノ酸配列のうちの任意の一つのアミノ酸配列は、さらに、任意に少なくとも一つのアミノ酸の付加、欠失、修飾および/または置換がありながら、CD73結合親和力を維持する誘導配列を含む軽鎖可変領域を提供する。
配列番号13、配列番号14、配列番号15で示されるmAb002cの軽鎖相補性決定領域LCDR1、LCDR2、LCDR3、あるいは
配列番号4、配列番号5、配列番号6で示されるmAb001cの軽鎖相補性決定領域LCDR1、LCDR2、LCDR3、あるいは
配列番号24、配列番号25、配列番号26で示されるmAb004cの軽鎖相補性決定領域LCDR1、LCDR2、LCDR3を含む。
もう一つの好適な例において、前記軽鎖可変領域は、さらに、ヒト由来のFR領域またはマウス由来のFR領域を含む。
もう一つの好適な例において、前記軽鎖可変領域は配列番号19、配列番号20で示されるアミノ酸配列を有する。
もう一つの好適な例において、前記軽鎖可変領域は配列番号30で示されるアミノ酸配列を有する。
もう一つの好適な例において、前記軽鎖可変領域は配列番号36、配列番号37、配列番号47で示されるアミノ酸配列を有する。
もう一つの好適な例において、前記軽鎖可変領域は配列番号42、配列番号43、配列番号44で示されるアミノ酸配列を有する。
もう一つの好適な例において、前記の抗体の軽鎖は、さらに、軽鎖定常領域を含む。
もう一つの好適な例において、前記の軽鎖定常領域は、ヒト由来のもの、マウス由来のものまたはウサギ由来のものである。
(1) 本発明の第一の側面に記載の重鎖可変領域、および/または
(2) 本発明の第三の側面に記載の軽鎖可変領域、
あるいは、本発明の第二の側面に記載の重鎖、および/または本発明の第四の側面に記載の軽鎖
を有する抗体を提供する。
もう一つの好適な例において、前記抗体は、動物由来の抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはこれらの組み合わせから選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記ヒト化抗体のCDR領域は、1、2、または3個のアミノ酸の変化を含む。
もう一つの好適な例において、前記の動物はヒト以外の哺乳動物、好ましくはマウス、ヒツジ、ウサギである。
もう一つの好適な例において、前記の抗体は二本鎖抗体、または一本鎖抗体である。
もう一つの好適な例において、前記の抗体はモノクローナル抗体である。
もう一つの好適な例において、前記の抗体は部分的にまたは全部ヒト化したモノクローナル抗体である。
もう一つの好適な例において、前記付加、欠失、修飾および/または置換のアミノ酸の数は、1~7個、好ましくは1~3個、より好ましくは1個である。
もう一つの好適な例において、前記少なくとも1個のアミノ酸の付加、欠失、修飾および/または置換を経た配列は、相同性が少なくとも80%のアミノ酸配列である。
もう一つの好適な例において、前記少なくとも1個のアミノ酸の付加、欠失、修飾および/または置換を経た誘導配列は、細胞表面のCD73タンパク質または組み換えCD73タンパク質の酵素触媒を抑制する機能を有する。
もう一つの好適な例において、前記の抗体は、薬物複合体の形態である。
もう一つの好適な例において、前記抗体は、
(a) CD73のアデノシン一リン酸(AMP)の加水分解を触媒してアデノシンを生成させる活性を抑制すること、
(b) 特異的に腫瘍細胞、および/または腫瘍微環境における免疫/ストローマ細胞のCD73に結合すること、
(c) 腫瘍/腫瘍微環境のCD73のAMPの加水分解を触媒する活性を抑制すること、
(d) 腫瘍細胞の遷移または転移を抑制すること、
(e) 腫瘍の生長を抑制し、併用時の抗腫瘍治療効果を向上させること、
(f) 免疫細胞の増殖・生存および機能を促進することにより、腫瘍免疫の効果を向上させること
からなる群から選ばれる1つまたは複数の特徴を有する。
(i) 本発明の第一の側面に記載の重鎖可変領域、本発明の第二の側面に記載の重鎖、本発明の第三の側面に記載の軽鎖可変領域、本発明の第四の側面に記載の軽鎖、または本発明の第五の側面に記載の抗体、ならびに
(ii) 任意の発現および/または精製を補助するタグ配列
を有する組み換えタンパク質を提供する。
もう一つの好適な例において、前記のタグ配列は6Hisタグを含む。
もう一つの好適な例において、前記の組み換えタンパク質(またはポリペプチド)は融合タンパク質を含む。
もう一つの好適な例において、前記の組み換えタンパク質は、単量体、二量体、または多量体である。
本発明の第八の側面では、外来の本発明の第七の側面に記載のCAR構築物を発現する組み換え免疫細胞を提供する。
もう一つの好適な例において、前記の免疫細胞は、NK細胞、T細胞からなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記の免疫細胞は、ヒト由来のものまたはヒト以外の哺乳動物(たとえばマウス)由来のものである。
(a) 本発明の第一の側面に記載の重鎖可変領域、本発明の第二の側面に記載の重鎖、本発明の第三の側面に記載の軽鎖可変領域、本発明の第四の側面に記載の軽鎖、または本発明の第五の側面に記載の抗体からなる群から選ばれる抗体部分、ならびに
(b) 検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、酵素、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる、前記抗体部分とカップリングするカップリング部分
を含む抗体-薬物複合体を提供する。
もう一つの好適な例において、前記の抗体部分と前記のカップリング部分は化学結合またはリンカーを介してカップリングしている。
Abは抗CD73抗体である。
LUはリンカー(連結基とも呼ばれる)である。
Dは薬物である。
そして、下付き文字pは1~10、好ましくは1~8から選ばれる値である。)
もう一つの好適な例において、LUは二置換マレイミド系リンカーである。
(ただし、
Ar'は、置換または無置換のC6~C10アリール基、置換または無置換の5~12員ヘテロアリール基、置換または無置換のC6~C10のアリーレン基、置換または無置換の5~12員ヘテロアリーレン基からなる群から選ばれる。
L1はAr'基に連結した-O(CH2CH2O)n-で、ここで、nは1~20から選ばれる任意の整数である。
L2は化学結合、またはAA-PAB構造で、ここで、AAは2~4個のアミノ酸からなるポリペプチド断片で、PABはp-アミノベンジルカルバモイル基である。
CTDはアミド結合を介してL2に結合した細胞毒性系小分子薬物である。
mは1.0~5.0、好ましくは3.0~4.2、より好ましくは3.5~4.5、さらに好ましくは3.8~4.2、またさらに好ましくは3.9~4.1、最も好ましくは4.0である。
AbはCD73を標的とする抗体である。)
もう一つの好適な例において、前記の式Ibは式IaにおけるN-フェニルマレイミドが開環した産物である。
もう一つの好適な例において、前記の抗体部分と前記のカップリング部分は共役結合を介して(たとえばそれぞれリンカーに共役結合して)カップリングしている。
もう一つの好適な例において、前記の閉環または開環のマレイミド基が抗体のヒンジ領域のジスルフィド鎖が還元したチオール基に連結している。
もう一つの好適な例において、前記の抗体-薬物複合体は、前記抗体または抗体断片のヒンジ領域のジスルフィド鎖が還元して一対のシステイン残基が生成し、そして前記システイン残基におけるチオール基と式Icで表される置換マレイミド系リンカー-薬物複合体におけるアリールスルフィドが置換反応することにより、抗体-薬物複合体Iaおよび/またはIbを得る。
もう一つの好適な例において、前記Ar'は、フェニル基、ハロベンゼン、C1~C4アルキルフェニル基、C1~C4アルコキシフェニル基、2-ピリジル基、2-ピリミジニル基、1-メチルピリミジン-2-イル基、
もう一つの好適な例において、前記のAAは、Val-Cit(バリン-シトルリン)、Val-Ala(バリン-アラニン)、Phe-Lys(フェニルアラニン-リシン)、Ala-Ala-Asn(アラニン-アラニン-アスパラギン)、D-Ala-Phe-Lys(D-アラニン-フェニルアラニン-リシン)、Gly-Gly-Phe-Gly(グリシン-グリシン-フェニルアラニン-グリシン)、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
(i)マイタンシン誘導体(DM1、DM4)、オーリスタチンおよびドラスタチン、
(ii)モノメチルオーリスタチンE(MMAE)、モノメチルオーリスタチンF(MMAF)、モノメチルドラスタチン10(MMAD)系誘導体またはこれらの組み合わせ、ならびに
(iii)DNA損傷薬物、好ましくは、デュオカルマイシン、ピロロ[2,1-c][1,4]ベンゾジアゼピン(PBD)を含む前記のDNA損傷薬物
からなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記抗体の重鎖可変領域の配列は、配列番号7、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号45、配列番号46、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41からなる群から選ばれ、かつ/または
前記抗体の軽鎖可変領域の配列は、配列番号8、配列番号9、配列番号19、配列番号20、配列番号30、配列番号36、配列番号37、配列番号47、配列番号42、配列番号43、配列番号44からなる群から選ばれる。
本発明のもう一つの側面では、(i)診断試薬の製造、ならびに/あるいは(b)CD73関連疾患を予防および/または治療する薬物の製造に使用される、本発明の第九の側面に記載の抗体-薬物複合体の使用を提供する。
もう一つの好適な例において、前記検出試薬、検出プレートまたはキットは、
(1)サンプルにおけるCD73タンパク質の検出、および/または
(2)腫瘍細胞における内因性のCD73タンパク質の検出、および/または
(3)CD73タンパク質を発現する腫瘍細胞の検出
に使用される。
もう一つの好適な例において、前記の検出試薬、検出プレートまたはキットは、CD73関連疾患の診断に使用される。
もう一つの好適な例において、前記の腫瘍の薬剤耐性は、腫瘍免疫治療薬の薬剤耐性、腫瘍標的治療薬の薬剤耐性、通常の腫瘍化学治療の薬剤耐性、放射線治療の非感受性を含む。
もう一つの好適な例において、前記の薬物は、
(a) CD73のアデノシン一リン酸(AMP)の加水分解を触媒してアデノシンを生成させる活性を抑制すること、
(b) 特異的に腫瘍細胞、および/または腫瘍微環境における免疫/ストローマ細胞のCD73に結合すること、
(c) 腫瘍/腫瘍微環境のCD73のAMPの加水分解を触媒する活性を抑制すること、
(d) 腫瘍細胞の遷移または転移を抑制すること、
(e) 腫瘍の生長を抑制し、併用時の抗腫瘍治療効果を向上させること、
(f) 免疫細胞の増殖・生存および機能を促進することにより、腫瘍免疫の効果を向上させること
からなる群から選ばれることに使用される。
もう一つの好適な例において、前記CD73関連は、腫瘍の発生、生長および/または転移を含む。
もう一つの好適な例において、前記の癌は、固形腫瘍、血液癌を含む。
もう一つの好適な例において、前記の癌は、CD73高発現の腫瘍である。
もう一つの好適な例において、前記のCD73高発現の腫瘍は、乳癌、肺癌、膵臓腺癌、卵巣癌、前立腺癌、直腸癌、脳膠細胞腫、メラノーマ、白血病、リンパ腫、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記の癌は、薬剤耐性の腫瘍である。
もう一つの好適な例において、前記のCD73高発現の腫瘍とは、腫瘍組織におけるCD73転写物および/またはタンパク質のレベルL1と正常組織における転写物および/またはタンパク質のレベルL0の比が、L1/L0≧2、好ましくは≧3である。
もう一つの好適な例において、前記代謝関連疾患は、糖尿病、食事性肥満および脂肪炎症を含む。
もう一つの好適な例において、前記感染疾患は、細菌およびウイルスの感染を含む。
(i) 本発明の第一の側面に記載の重鎖可変領域、本発明の第二の側面に記載の重鎖、本発明の第三の側面に記載の軽鎖可変領域、本発明の第四の側面に記載の軽鎖、または本発明の第五の側面に記載の抗体、本発明の第六の側面に記載の組み換えタンパク質、本発明の第八の側面に記載の免疫細胞、本発明の第九の側面に記載の抗体-薬物複合体、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる活性成分と、
(ii) 薬学的に許容される担体と
を含む薬物組成物を提供する。
本発明のもう一つの側面では、
(i) 本発明の第九の側面に記載の抗体-薬物複合体またはその組み合わせと、
(ii) 薬学的に許容される担体と
を含む薬物組成物を提供する。
もう一つの好適な例において、前記の薬物組成物は液体製剤である。
もう一つの好適な例において、前記の薬物組成物は注射剤である。
(1) 本発明の第一の側面に記載の重鎖可変領域、本発明の第二の側面に記載の重鎖、本発明の第三の側面に記載の軽鎖可変領域、本発明の第四の側面に記載の軽鎖、または本発明の第五の側面に記載の抗体、あるいは
(2) 本発明の第六の側面に記載の組み換えタンパク質、
(3) 本発明の第七の側面に記載のCAR構築物
からなる群から選ばれるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
本発明の第十三の側面では、本発明の第十二の側面に記載のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
もう一つの好適な例において、前記のベクターは、細菌プラスミド、ファージ、酵母プラスミド、植物細胞ウイルス、哺乳動物細胞ウイルス、たとえばアデノウイルス、レトロウイルス、またはほかのベクターを含む。
本発明の第十五の側面では、体外でサンプルにおけるCD73を検出(診断的なものまたは非診断的なものを含む)する方法であって、
(1) 体外において、前記サンプルを本発明の第五の側面に記載の抗体と接触させる工程、
(2) 抗原-抗体複合体が形成したか検出し、ここで、複合体が形成したというのはサンプルにCD73が存在することを意味する工程
を含む方法を提供する。
本発明の第十七の側面では、
(1) 本発明の第五の側面に記載の抗体を含有する第一の容器、および/または
(2) 本発明の第五の側面に記載の抗体に対する二次抗体を含有する第二の容器を含むか、
あるいは、本発明の第十六の側面に記載の検出プレートを含む
キットを提供する。
本発明の第十八の側面では、組み換えポリペプチドの製造方法であって、
(a) 発現に適切な条件において、本発明の第十四の側面に記載の宿主細胞を培養する工程、
(b) 培養物から、本発明の第五の側面に記載の抗体または本発明の第六の側面に記載の組み換えタンパク質である、組み換えポリペプチドを単離する工程
を含む方法を提供する。
もう一つの好適な例において、前記の方法は、さらに、必要な対象にほかの薬物または治療方法を併用して治療する工程を含む。
もう一つの好適な例において、前記のほかの薬物または治療方法は、抗腫瘍免疫治療薬、腫瘍標的治療薬、腫瘍化学治療、腫瘍放射線治療を含む。
もう一つの好適な例において、前記の抗腫瘍免疫治療薬は、PD-1、PD-L1モノクローナル抗体を含む。
本発明の第一の側面に記載の重鎖可変領域および/または本発明の第三の側面に記載の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列をヒト抗体の定常領域のヌクレオチド配列を含有する発現ベクターにクローニングした後、動物細胞に形質移入することによってヒト-マウスキメラ抗体を発現させる工程
を含む方法を提供する。
本発明の第二十一の側面では、ヒト化抗体を製造する方法であって、
本発明の第一の側面に記載の重鎖可変領域および/または本発明の第三の側面に記載の軽鎖可変領域におけるCDR領域のヌクレオチド配列をヒト由来抗体のFR領域を含有するヌクレオチド配列の鋳型に導入し、さらにそれをヒト抗体の定常領域を含有する発現ベクターにクローニングした後、動物細胞に形質移入することによってヒト化抗体を発現させる工程
を含む方法を提供する。
本発明の第二十三の側面では、モデル動物の体内における腫瘍の生長を抑制する方法であって、必要な対象に本発明の第五の側面に記載の抗体、前記抗体の抗体-薬物複合体、または前記抗体を発現するCAR-T細胞を施用する工程を含む方法を提供する。
もう一つの好適な例において、前記薬物は単独で投与してよく、腫瘍免疫療法、腫瘍標的薬物、細胞毒性薬物、放射線治療を含む手段と併用してもよい。
(1) 抗体を還元試薬と緩衝液において反応させ、還元された抗体を得る工程と、
(2) 式Icのリンカー-薬物複合体を工程(1)で得られた還元された抗体と緩衝液と有機溶媒の混合液において架橋(カップリング)させ、抗体-薬物複合体1aおよび/または1bを得る工程と
を含む方法を提供する。
もう一つの好適な例において、前記製造方法の架橋反応は、下記式で表される通りである。
もう一つの好適な例において、前記工程(1)では、還元試薬は、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩(TCEP)、β-メルカプトエタノール、β-メルカプトエチルアミン塩酸塩、またはジチオトレイトール(DTT)である。
もう一つの好適な例において、前記の緩衝液は、リン酸二水素カリウム-水酸化ナトリウム(KH2PO4-NaOH)/塩化ナトリウム(NaCl)/ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)緩衝液、リン酸水素二ナトリウム-クエン酸/塩化ナトリウム(NaCl)/ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)、ホウ酸-ホウ砂/塩化ナトリウム(NaCl)/ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)、ヒスチジン-水酸化ナトリウム/塩化ナトリウム(NaCl)/ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)、およびPBS/ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)からなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記の工程(2)における有機溶媒は、アセトニトリル(ACN)、ジメチルホルムアミド(DMF)、ジメチルアセトアミド(DMA)、ジメチルスルホキシド(DMSO)からなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記の工程(2)では、前記の架橋反応は0~37℃で行われる。
もう一つの好適な例において、前記の工程(1)では、β-メルカプトエタノール、β-メルカプトエチルアミン塩酸塩またはDTTで還元させ、前記の工程(1)と工程(2)の間に、さらに、還元反応が終了した後、産物から脱塩カラムまたは限外ろ過によって還元剤を除去する工程(1a)を含む。
もう一つの好適な例において、pH6~8の緩衝液で、抗体-薬物複合体Iaを内部で抗体-薬物複合体Ibに転換させる。
図面の説明
本発明者は幅広く深く研究し、大量のスクリーニングを行ったところ、意外に、5つの抗CD73モノクローナル抗体を得たが、それぞれmAb001~mAb005と名付けた。活性測定の結果から、mAb001(IgG1-κ)、mAb002(IgG1-κ)、mAb004(IgG2b-κ)を選択してヒト-マウスキメラ抗体mAb001c、mAb002c、mAb004cを構築した。前記の抗体は高度に特異的にCD73抗原に結合することができ、ELISAによるそのEC50はそれぞれ0.024 nM、0.016 nM、0.038 nMであった。そして、前記の抗体は顕著な抗腫瘍活性を有しながら、哺乳動物自身に顕著に毒性・副作用がない。また、mAb001c、mAb002cに基づいて設計されたヒト化抗体および相応する抗体-薬物複合体(ADC)も優れた特性を有する。また、本発明の新規なリンカーによって得られたCD73抗体-薬物複合体の製品は、均一性が高く、体内外における安定性をさらに向上させるという優勢を有する。これに基づき、本発明を完成させた。
本明細書で用いられるように、用語「抗体」または「免疫グロブリン」は同様な構造特徴を持つ、約150000ダルトンのヘテロテトラマーの糖タンパク質で、2つの同じ軽鎖(L)と2つの同じ重鎖(H)からなるものである。各軽鎖は、重鎖に1つの共有ジスルフィド結合によって結合しているが、重鎖間のジスルフィド結合の数は、免疫グロブリンのアイソタイプによるものである。各重鎖および軽鎖も、それぞれ一定の間隔の鎖内ジスルフィド結合を有する。各重鎖は、1つの末端に可変領域(VH)を有し、その先に多数の定常領域を有する。各軽鎖は、一方の末端に可変領域(VL)を有し、他方の末端に定常領域を有する。軽鎖の定常領域は重鎖の一つ目の定常領域と、軽鎖の可変領域は重鎖の可変領域と対向している。特殊なアミノ酸残基が軽鎖と重鎖の可変領域の間に界面を形成している。
本発明は、完全の抗体だけではなく、免疫活性を有する抗体の断片または抗体とほかの配列からなる融合タンパク質も含む。そのため、本発明は、さらに、前記抗体の断片、誘導体および類似体を含む。
本発明において、本発明の抗体は、さらにその保存的変異体を含み、本発明の抗体のアミノ酸配列と比較すると、10個以下、好ましくは8個以下、より好ましくは5個以下、最も好ましくは3個以下のアミノ酸が類似または近い性質を持つアミノ酸で置換されてなるポリペプチドをいう。これらの保存的突然変異のポリペプチドは、表Aのようにアミノ酸の置換を行って生成することが好ましい。
本発明は、3種類のCD73を標的とする高特異性で高親和力の抗体であって、重鎖および軽鎖を含み、前記重鎖は重鎖可変領域(VH)のアミノ酸配列を、前記軽鎖は軽鎖可変領域(VL)のアミノ酸配列を含有する抗体を提供する。
1. 好ましくは、重鎖可変領域(VH)のアミノ酸配列、軽鎖可変領域(VL)のアミノ酸配列は以下のポリペプチド配列を有するHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2およびLCDR3を含む。
a2)HCDR2は配列番号2のWIYPGNLNIKYNEKFKGで、配列番号11のEINPSNGRSNYNEKFKS、または配列番号22のDINPNNGGSVYNQKFKGである。
a3)HCDR3は配列番号3のDDNYAWFAY、配列番号12のRGVSGNYFDY、または配列番号23のITGTGYWSFDVである。
a4)LCDR1は配列番号4のKASQDVSTAVA、配列番号13のKASQDINTYLS、または配列番号24のRASENIYSNLAである。
a5)LCDR2は配列番号5のWTNTRHT、配列番号14のRSNILVD、または配列番号25のGATNLAEである。あるいは、
a6)LCDR3は配列番号6のQQHYSTPFT、配列番号15のLQYDEFPYT、または配列番号26のQHFWGIPWTである。
a7)上記アミノ酸配列のうちの任意の一つのアミノ酸配列が少なくとも一つのアミノ酸の付加、欠失、修飾および/または置換を経た、CD73結合親和力を有する配列。
好ましくは、前記の抗体は細胞表面のCD73タンパク質および組み換えCD73タンパク質の酵素触媒を抑制する機能を有し、迅速に細胞によって取り込まれてリソソームに入ることができる。
本発明に係る抗体の誘導体は、一本鎖抗体、およびまたは抗体断片、たとえばFab、Fab'、(Fab')2あるいは当該分野におけるほかの既知の抗体の誘導体など、ならびにIgA、IgD、IgE、IgGおよびIgM抗体またはほかのサブタイプの抗体のうちの任意の一つまたは複数でもよい。
ここで、前記動物は、哺乳動物、たとえばマウスが好ましい。
本発明の抗体は、ヒトCD73を標的とするキメラ抗体、ヒト化抗体、CDR接木および/または修飾の抗体でもよい。
本発明の一つの好適な実施例において、上記配列番号4~6、配列番号13~15、配列番号24~26のうちの任意の一つまたは複数の配列、あるいはこれらが少なくとも1個のアミノ酸の付加、欠失、修飾および/または置換を経た、CD73結合親和力を有する配列は、軽鎖可変領域(VL)のCDR領域に位置する。
本発明の上記内容において、より好適に、前記付加、欠失、修飾および/または置換のアミノ酸の数は、1~7個、より好ましくは1~5個、より好ましくは1~3個、より好ましくは1~2個でもよい。
もう一つの好適な例において、前記の抗体はヒト-マウスキメラ抗体mAb001c、mAb001c-VK-SGS、mAb002c、mAb002c-VH-QG、mAb002c-VH-NA、mAb002c-VK-SG、mAb002c-VH-QG/VK-SG、mAb004c、mAb004c-VH-QG、mAb004c-VH-NAである。
もう一つの好適な例において、前記の抗体はヒト化抗体Hu001c-14、Hu001c-15、Hu001c-21、Hu001c-22、Hu001c-23、Hu001c-24、Hu001c-25、Hu001c-28、Hu001c-30、Hu001c-31、Hu001c-32である。
もう一つの好適な例において、前記の抗体はヒト化抗体Hu002c-2、Hu002c-3、Hu002c-4、Hu002c-6、Hu002c-7、Hu002c-8、Hu002c-10、Hu002c-11、Hu002c-12、Hu002c-14、Hu002c-15、Hu002c-16である。
もう一つの好適な例において、前記ヒト化抗体の重鎖および軽鎖の可変領域(VH/VL)のアミノ酸配列の番号は表2に示される。
本発明の3種類の抗体は、併用してもよく、CAR構築物、CAR構築物を含む組み換え免疫細胞、抗体-薬物複合体などの構築に使用してもよく、(a)検出試薬、検出プレートまたはキットの製造、ならびに/あるいは(b)CD73関連疾患を予防および/または治療する薬物の製造に使用してもよい。
本発明の配列表に係る各配列が表す意味は以下の通りである。
本発明の抗体またはその断片のDNA分子の配列は、通常の技術で、たとえば、PCR増幅あるいはゲノムライブラリースクリーニングなどの方法によって得ることができる。また、軽鎖および重鎖のコード配列を一体に融合し、一本鎖抗体を形成してもよい。
関連の配列を獲得すれば、組み換え法で大量に関連配列を獲得することができる。この場合、通常、その配列をベクターにクローンした後、細胞に導入し、さらに通常の方法で増殖させた宿主細胞から関連配列を単離して得る。
また、特に断片の長さが短い場合、人工合成の方法で関連配列を合成してもよい。通常、まず多数の小さい断片を合成し、そして連接させることにより、配列の長い断片を得ることができる。
さらに、本発明は、上記の適当なDNA配列および適当なプロモーターあるいは制御配列を含むベクターに関する。これらのベクターは、タンパク質を発現するように、適当な宿主細胞の形質転換に用いることができる。
宿主細胞は、原核細胞、たとえば細菌細胞、あるいは、低等真核細胞、たとえば酵母細胞、あるいは、高等真核細胞、たとえば哺乳動物細胞でもよい。好適な動物細胞は、CHO-S、HEK-293細胞を含むが、これらに限定されない。
得られたモノクローナル抗体は、通常の手段で同定することができる。たとえば、モノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降、あるいは体外結合試験(たとえば放射免疫測定(RIA)または酵素結合免疫吸着測定(ELISA))で測定することができる。モノクローナル抗体の結合親和力は、例えばMunson等, Anal. Biochem.,107:220(1980)のScatchard分析で測定することができる。
また、本発明は本発明の抗体に基づいた抗体-薬物複合体(antibody-drug conjugate、ADC)を提供する。
典型的に、前記抗体-薬物複合体は前記抗体、およびエフェクター分子を含み、前記抗体と前記エフェクター分子がカップリング、好ましくは化学的にカップリングしている。ここで、前記エフェクター分子は治療活性を有する薬物が好ましい。また、前記エフェクター分子は毒素タンパク質、化学治療薬、小分子薬物または放射性核種のうちの一つまたは複数でもよい。
典型的な本発明に適するカップリング形態は、K-LockとC-Lockの2種類のカップリング形態を含む。K-Lockのカップリング形態では、薬物分子が抗体の配列におけるリシン(K)残基にカップリングし、C-Lockのカップリング形態では、薬物分子が抗体の配列におけるシステイン残基(C)にカップリングする。
一部の実施形態において、本発明の方法は、抗体-リンカー複合体の形成に足りる条件において、抗体を二機能性リンカー化合物と結合させる工程を含む。これらの実施形態において、本発明の方法は、さらに、薬物部分がリンカーを介して抗体に共役結合するのに足りる条件において、抗体リンカー複合体を薬物部分と結合させる工程を含む。
Abは抗体である。
LUはリンカーである。
Dは薬物である。
そして、下付き文字pは1~10、好ましくは1~8から選ばれる値である。)
本明細書で用いられるように、「薬物」とは広義的に任意の所望の生物活性を有し、かつ本発明に係る複合体が製造しやすいように反応性官能基を有する化合物である。所望の生物活性は、ヒトまたはほかの動物の疾患の診断、治癒、緩和、治療、予防を含む。そのため、必要な反応性官能基を有するものであれば、用語「薬物」に係る化合物は、正式の国家薬局方、およびたとえば米国の正式の同じような療法・薬局方、正式の全国処方集、またはその任意の増刊などで確認された薬物を含む。典型的な薬物は、医師用卓上参考書(PDR)および米国食品医薬品局(FDA)のオレンジブックに示された。もちろん、新薬の発見と発展に従い、これらの薬物も本発明に係る薬物複合体における「薬物」に取り入れられる。
用語「細胞毒性薬剤」とは細胞の発現活性、細胞機能を抑制または阻害する物質ならびに/あるいは細胞を破壊する物質である。当該用語は、放射性同位元素、化学治療剤および毒素、たとえば細菌、真菌、植物または動物由来の小分子毒素または酵素活性毒素を含み、その断片および/またはバリアントも含まれる。細胞毒性薬剤の例は、オーリスタチン類(たとえば、オーリスタチンE、オーリスタチンF、MMAEおよびMMAF)、クロルテトラサイクリン、マイタンシノイド、リシン、リシンA-鎖、コンブレタスタチン、デュオカルマイシン、ドラスタチン、アドリアマイシン、ダウノルビシン、タキソール、シスプラチン、cc1065、臭化エチジウム、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド(tenoposide)、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ジヒドロキシアントラセンジオン、アクチノマイシン、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素(PE)A、PE40、アブリン、アブリンA鎖、モデシンA鎖、α-八連球菌、ゲロニン、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン、エノマイシン、クリシン(curicin)、クロチン、カリケアミシン、サボンソウ(Sapaonaria officinalis)阻害剤および糖質コルチコイドおよびほかの化学治療剤、および放射性同位元素、たとえばAt211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212または213、P32およびLu177を含むLuの放射性同位元素を含むが、これらに限定されない。抗体は、プロドラッグをその活性形態に転換できる抗癌プロドラッグ活性化酵素とカップリングしてもよい。
より好ましくは、前記の薬物とは、癌治療に使用される細胞毒性薬物、または所望の生物活性を有するタンパク質もしくはポリペプチド、たとえば毒素、たとえばアブリン、リシンA、緑膿菌外毒素やジフテリア毒素で、ほかの適切なタンパク質は腫瘍壊死因子、インターフェロン-α、インターフェロン-β、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織型プラスミノーゲン活性化因子、および生物反応調節製剤、たとえばリンホカイン、インターロイキン-1(IL-1)、インターロイキン-2(IL-2)、インターロイキン-6(IL-6)、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、顆粒球コロニー刺激因子、またはほかの成長因子を含む。
もう一つの好適な本発明の薬物はPNU-159682誘導体で、PNU-159682はネモルビシン(Nemorubicin)のヒト肝臓ミクロソームにおける主な活性代謝物で、MMDXおよびアドリアマイシンと比べ、活性が3000倍向上した。
本発明は、抗体-薬物複合体に関し、より具体的に、治療への使用を有するCD73抗体-薬物複合体に関する。リンカーを介して抗CD73抗体を化学治療薬または小分子毒素とカップリングさせることができる。また、本発明は、抗CD73抗体-薬物複合体によって哺乳動物の細胞または関連する病理的状況を治療する方法に関する。
本発明は、新規な二置換マレイミド系リンカーをCD73を標的とする抗体にカップリングさせ、当該リンカーは全部/部分的に抗体の軽鎖-重鎖および重鎖-軽鎖のジスルフィド結合が還元されたシステインのチオール基にクロスカップリングしてもよく、そしてこのようなカップリング方法によって得られるCD73を標的とするCD73抗体-薬物複合体は、従来の抗体-薬物複合体よりも、より狭い薬物/抗体比(DAR)の分布を有する
(ただし、
Ar'は、置換または無置換のC6~C12アリーレン基、置換または無置換の5-12員ヘテロアリーレン基からなる群から選ばれる。
L1はAr'基に連結した-O(CH2CH2O)n-で、ここで、nは1~20から選ばれる任意の整数である。
L2は化学結合、またはAA-PAB構造で、ここで、AAは2~4個のアミノ酸からなるポリペプチド断片で、PABはp-アミノベンジルカルバモイル基である。
CTDはアミド結合を介してL2に結合した細胞毒性系小分子薬物である。
mは3.8~4.2である。
AbはCD73を標的とする抗体である。)
本発明は、ジアリールチオマレイミド単位および一つのカップリング基を含むリンカーまたはカップリング試薬を提供する。ジアリールチオマレイミド単位は抗体鎖間のチオール基(還元後)の架橋に、カップリング基は小分子薬物または薬物-リンカー単位とのカップリングに使用される。当該ジアリールチオマレイミド単位と抗体における開放のシステイン-システインのジスルフィド結合の2つの硫黄原子の二座結合(bidentate binding)のため、これらのADCは均質で単座リンカーを含有するADCよりも強い安定性を有する。そのため、向上した体内における半減期を有し、全身性放出の細胞毒素の量を減少し、そして単座リンカーのADCよりも安全な薬物性質を有する。
本発明において、リンカー-薬物複合体は式Icで表される置換マレイミド系リンカー-薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を含む。
(ただし、
RはXまたはArS-である。
Xはハロゲンからなる群から選ばれ、好ましくは臭素またはヨウ素である。
Ar'は、置換または無置換のC6~C10アリール基、置換または無置換の5~12員ヘテロアリール基、置換または無置換のC6~C10のアリーレン基、置換または無置換の5~12員ヘテロアリーレン基からなる群から選ばれる。
L1はAr'基に連結した-O(CH2CH2O)n-で、ここで、nは1~20、好ましくは1~10から選ばれる任意の整数である。
L2は化学結合またはAA-PAB構造で、ここで、AAはジペプチドまたはトリペプチドまたはテトラペプチドの断片(すなわち、2~4個のアミノ酸がペプチド結合を介して連結してなる断片)で、PABはp-アミノベンジルカルバモイル基である。
CTDはアミド結合を介してL2に結合した細胞毒性系小分子薬物および/または自己免疫疾患の治療薬および抗炎症薬である。)
式Icで表される化合物の通常の製造の流れは以下の通りである。
nグリコールとブロモ酢酸t-ブチルの反応によって中間体Aを得た後、置換のニトロフルオロベンゼンと芳香求核置換させて中間体Bを得る。また、中間体Bは、p-トルエンスルホン酸エステルで保護された中間体Fと置換のニトロフルオロフェノールの反応によって得ることもできる。中間体Bにおけるニトロ基をアミノ基に還元させて中間体Cを得た後、2,3-ジブロモ無水マレイン酸と環化反応させて中間体Dを得た後、さらにアリールチオフェノールと置換反応させてリンカー断片分子Eを得る。ジペプチド/トリペプチド-PAB細胞毒性薬物を持つリンカーと縮合させることにより、一連の分子Fを得ることができる。反応経路は以下の通りである。
反応系に100mlのジクロロメタンを入れて抽出し、200mlの1N希塩酸で1回洗浄し、200mlの水で2回洗浄し、200mlの飽和食塩水で1回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、回転蒸留で有機相を乾燥した。200~300メッシュのシリカゲルでカラムを充填し、PE:EA=5:1-2:1の溶離でカラムクロマトグラフィーによって分離した。回転蒸留で乾燥して中間体B-1(2.8 g, 収率44.2%)を得た。
減圧で蒸発させて溶媒を除去した後、カラムクロマトグラフィー(200メッシュ~300メッシュのシリカゲル)によって分離・精製し、ジクロロメタンをカラムに充填して洗浄した後、ゆっくり極性を上げて2%から10%のメタノールを流し、収集して蒸発で溶媒を除去してサフラン色の油状産物F-1(2.2g, 収率72%)を得た。LC-MS(M+)理論値: 821.2、実測値: 821.3 (ESI, M+H+)。
抗体-薬物複合体の製造経路は以下の通りである。抗体の鎖間ジスルフィド結合が還元され、2n個(たとえば8個)のチオール基が生成する。本発明の置換マレイミド系リンカー-薬物複合体(式Ic)は還元された抗体のチオール基とカップリングし、相応する抗体-薬物複合体が生成し、そのうち、当該抗体-薬物複合体に以下に示される一つまたは二つの形態が存在する。
得られる抗体-薬物複合体の薬物抗体比(DAR)は比較的に均一である。本発明の異なるマレイミドリンカー(リンカー断片)を使用する場合、ADC産物の均一性が非常に高い(通常、DAR優位産物(たとえばDARが約4のもの)はすべてのADCの少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%またはそれ以上を占める)。DARがある程度ばらつくADCについて、均一性がより良いサンプルが必要な場合、さらに、疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)、分子排除クロマトグラフィー(SEC)、イオン交換クロマトグラフィー(IEC)によって分離・精製してもよいが、これらの方法に限定されない。
本発明の抗体またはそのADCは検出に有用で、たとえば検体を検出することによって診断情報を提供することができる。
本発明において、使用される検体(サンプル)は細胞、組織検体および生検標本を含む。本発明で用いられる用語「生検」は当業者に既知のすべての種類の生検を含む。そのため、本発明で使用される生検は、たとえば腫瘍の切除検体、内視鏡方法あるいは器官の穿刺または針刺しによって調製された組織検体を含む。
本発明で使用される検体は固定または保存された細胞または組織検体を含む。
また、本発明は、本発明の抗体(またはその断片)を含有するキットを提供するが、本発明の一つの好適な例において、前記のキットはさらに容器、使用説明書、緩衝液などを含む。好適な例において、本発明の抗体は検出プレートに固定されてもよい。
本発明は、本発明の用途、たとえば診断製剤の製造、あるいはCD73関連疾患を予防および/または治療する薬物の製造に使用される用途を提供する。前記CD73関連疾患は、腫瘍の発生、生長および/または転移、腫瘍薬剤耐性疾患、炎症、代謝関連疾患などを含む。
本発明の抗体、ADCまたはCAR-Tなどの使用は、以下のものを含むが、これらに限定されない。
(i)腫瘍、特にCD73高発現の腫瘍の発生、生長および/または転移を診断、予防および/または治療する。前記腫瘍は、乳癌(たとえばトリプルネガティブ乳癌)、肺癌(たとえば非小細胞肺癌)、膵臓腺癌、悪性脳膠細胞腫、胃癌、肝臓癌、食道癌、腎臓癌、結直腸癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮内膜癌、卵巣癌、子宮頸癌、白血病、骨髄癌、血管肉腫など、特にトリプルネガティブ乳癌、非小細胞肺癌、膵臓腺癌、悪性脳膠細胞腫、より好ましくはトリプルネガティブ乳癌および/または非小細胞肺癌を含むが、これらに限定されない。
(ii)自己免疫疾患を診断、予防および/または治療する。前記自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、I型糖尿病、乾癬、多発性硬化症を含むが、これらに限定されない。
(iii)炎症を診断、予防および/または治療する。前記炎症は、リウマチ性関節炎、骨関節炎、強直性脊椎炎、痛風、ライター症候群、乾癬性関節炎、感染性関節炎、結核性関節炎、ウイルス性関節炎、真菌性関節炎、糸球体性腎炎、全身性エリテマトーデス、クローン病、潰瘍性大腸炎、急性肺損傷、慢性閉塞性肺疾患、特発性肺線維症を含むが、これらに限定されない。
(iv)代謝関連疾患を診断、予防および/または治療する。前記代謝関連疾患は、糖尿病、食事性肥満および脂肪炎症を含むが、これらに限定されない。
さらに、本発明は組成物を提供する。好適な例において、前記の組成物は薬物組成物で、上記の抗体またはその活性断片あるいはその融合タンパク質またはそのADCまたは相応するCAR-T細胞と、薬学的に許容される担体とを含有する。通常、これらの物質を無毒で不活性で薬学的に許容される水系担体で配合し、ここで、pH値は配合される物質の性質および治療しようとする疾患にもよるが、pH値は通常5~8程度、好ましくは6~8程度である。配合された薬物組成物は通常の経路で給与することができ、腫瘍内、腹膜内、静脈内、あるいは局部給与が含まれるが、これらに限定されない。
本発明に係る抗体は、ヌクレオチド配列によって細胞内で発現されて細胞治療に使用してもよく、たとえば、前記抗体はキメラ抗原受容体T細胞免疫療法(CAR-T)などに使用することができる。
本発明の薬物組成物は直接CD73タンパク質分子との結合に使用することができるため、腫瘍などの疾患の予防および治療に有用である。また、ほかの治療剤と併用してもよい。
本発明の抗体-薬物複合体で治療する場合、本分野の通常の方法によって送達することができる。たとえば、リポソーム、ヒドロゲル、シクロデキストリン、生分解可能なナノカプセル、または生物粘着性ミクロスフェアによって細胞に導入することができる。あるいは、前記核酸またはベクターは現場で直接注射または輸液ポンプによって送達することができる。
(a)本発明の抗体は優れた生物活性および特異性を有し、かつ高い親和力(ELISA測定によるそのEC50は0.016~0.038nMである)を有し、CD73酵素機能の抑制活性(酵素活性測定によるそのIC50は0.025~0.039nMである)を有する。また、腫瘍細胞のCD73に良い結合親和力(FACS測定によるそのEC50は0.35~2.5nMである)を有し、かつ腫瘍CD73酵素の機能を抑制し(IC50値は0.2nM~0.6nMである)、CD73を標的とする治療抗体として有用である。
(b)本発明のヒト化抗体はマウス由来抗体に相当する活性のみならず、より低い免疫原性を有する。
(c)本発明の抗体およびADCはいずれも顕著な体内抗腫瘍活性を有しながら、哺乳動物、たとえばモデルマウス自身に明らかな毒性・副作用がない。
(d)本発明の抗体はヒトリンパ球に顕著な増殖保護作用を有し、有効にアデノシン一リン酸(AMP)のT細胞に対する増殖抑制を逆転させてINF-γの発現と分泌を促進することができ、そのEC50は0.01~0.08nMである。
(f)本発明に係る抗体-薬物複合体(ADC)は正常ヒトリンパ球の増殖に顕著な毒性・副作用がなく、細胞増殖抑制試験で測定されたそのIC50は>100nMである。
(g)本発明に係る抗体-薬物複合体(ADC)は哺乳動物、たとえばカニクイザルに高度または意外な毒性・副作用を示さず、臨床薬物として応用する潜在的な将来性がある。
(h)本発明によって提供される新規なリンカーは、簡単な化学方法によってCD73を標的とする抗体とカップリングすることができ、従来のカップリング手段と比べ、このようなリンカーで得られるCD73抗体-薬物複合体はDAR値の分布が非常に狭いため、生成する製品は均一性が高く、得られる複合体における単一の分布の成分(DAR:4)が80%以上で、複合体の体外腫瘍細胞増殖の抑制活性は従来のmcVC-PAB複合体よりも生物学活性、安全性などの薬らしさの面においてある程度向上または維持する。
(i)本発明はマレイミドのジスルフィド鎖の橋架けによってより良い安定性を有し、Ar'部位に置換基を導入することによってマレイミドの開環・加水分解の反応速度を調節してマレイミドの開環後の環化・二次加水分解反応を緩和さることができ、体内においてスルフィド交換反応および開環後の環化・二次加水分解反応が生じにくく、さらにCD73抗体-薬物複合体の体外と体内の安定性を強化させる。
工程(1)、ハイブリドーマ細胞の製造:
まず、ヒトCD73タンパク質の細胞外領域(CD73-ECD)を抗原として製造した。NCBI:NP_002517.1アミノ酸の27番目から547番目を参照し、遺伝子クローニング技術および哺乳動物ベクター発現系によって炭素末端ポリヒスチジンタグ(C-terminus polyhistidine-tagged)が付いた抗原を得たが、具体的なアミノ酸配列は以下の通りである(配列番号48):
WELTILHTNDVHSRLEQTSEDSSKCVNASRCMGGVARLFTKVQQIRRAEPNVLLLDAGDQYQGTIWFTVYKGAEVAHFMNALRYDAMALGNHEFDNGVEGLIEPLLKEAKFPILSANIKAKGPLASQISGLYLPYKVLPVGDEVVGIVGYTSKETPFLSNPGTNLVFEDEITALQPEVDKLKTLNVNKIIALGHSGFEMDKLIAQKVRGVDVVVGGHSNTFLYTGNPPSKEVPAGKYPFIVTSDDGRKVPVVQAYAFGKYLGYLKIEFDERGNVISSHGNPILLNSSIPEDPSIKADINKWRIKLDNYSTQELGKTIVYLDGSSQSCRFRECNMGNLICDAMINNNLRHTDEMFWNHVSMCILNGGGIRSPIDERNNGTITWENLAAVLPFGGTFDLVQLKGSTLKKAFEHSVHRYGQSTGEFLQVGGIHVVYDLSRKPGDRVVKLDVLCTKCRVPSYDPLKMDEVYKVILPNFLANGGDGFQMIKDELLRHDSGDQDINVVSTYISKMKVIYPAVEGRIKAHHHHHHHHHH
上記3種類の細胞を準備できたら、PEGを介して免疫脾臓細胞とSP2/0細胞を融合させ、PEGを除去し、飼育細胞を含有するHAT完全培地で再懸濁させ、96ウェルプレートに接種して培養し、ELISA/FACS法によって陽性ウェルをスクリーニングした。最後に、さらに陽性ウェルの細胞に対して有限希釈法によってクローン化培養を行い、ELISAまたはFACSによって力価が高く、形態が良く、単一クローンで生長する細胞をスクリーニングし、続いて連続3回の陽性クローン率がすべて100%になるまでサブクローニングによるスクリーニングを行い、当該細胞株に対して増幅培養およびライブラリー構築が行えるようになった。
工程(1)でスクリーニングされたハイブリドーマ細胞をローラーボトルにおいて14日増幅培養した後、細胞の培養上清を収集し、0.22μmろ膜でろ過した後、得られた培養上清を一定の速度で予め平衡化されたプロテインA樹脂カラムに入れ、そして0.1M Tris-HCl(pH=8.0、1.5M NaCl含有)でカラムを平衡化した。その後、0.1Mクエン酸ナトリウム緩衝液で平衡カラムを溶離し、溶離液を収集して定量し、SDS-PAGE電気泳動、SEC-HPLCおよび内毒素検出を行った。得られた精製抗体を分けて-80℃で凍結保存して使用に備えた。
スクリーニングを繰り返し、選ばれた5つのハイブリドーマモノクローナル抗体に対して生物活性および標的特異性の測定を行った。図1Aに示すように、蛍光活性化セルソーター(FACS)によって単一クローン細胞培養液の上清を検出したところ、5つの抗体はいずれも特異的にヒト由来CD73高発現のMDA-MB-231細胞(CD73-P)には結合することができたが、CD73低発現のMDA-MB-453細胞(CD73-N)には顕著な結合活性がなかった。その後、精製された抗体サンプルに対して勾配希釈、FACS検出を行ったところ、図1Bに示すように、mAb001、mAb002、mAb003、mAb004、mAb005はMDA-MB-231細胞に優れた結合親和力を有し、FACS検出によるそのEC50はそれぞれ1.24nM、0.65nM、10.7nM、4.69nM、26.07nMである。
優れた特異性および親和力から、優先的にmAb001、mAb002、mAb004を選んで配列決定を行った。プライマーを設計して通常のPCR技術によって重鎖(VH)、軽鎖(VL)の可変領域の断片(図2を参照する)を増幅し、ベクターにクローニングし、配列決定した。通常の配列決定およびKabatデータベースを使用した分析により、以下の重鎖可変領域(VH)、軽鎖可変領域(VL)のアミノ酸配列、相補性決定領域(CDR)の情報を得た(下線「_」で示されたのはCDR-1/2/3のアミノ酸配列である)。
QVQLQQSGPELVKPGASVRISCKTSGYTFTNYYIYWVKQRPGQGLEWIGWIYPGNLNIKYNEKFKGKSTLTADKSSSTAFMQLSSLTSEDSAVYFCARDDNYAWFAYWGQGTLVTVSS
配列番号16 mAb002の重鎖可変領域(VH)のアミノ酸配列
QVQLQQPGAELVKPGASVRLSCKASGYTLTSYWMHWVKKRPGQGLEWIGEINPSNGRSNYNEKFKSKATLTVDRSSSTVYMQLGSLTSEDSAVYYCARRGVSGNYFDYWGQGTTLTVSS
配列番号27 mAb004の重鎖可変領域(VH)のアミノ酸配列
EVQLQQSGPELVKPGASVKIPCKASGYTFTDYNMDWVKQSHGKSLEWIGDINPNNGGSVYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDTAVYYCGRITGTGYWSFDVWGTGTTVTVSP
DIVMTQSHKFMSTSIGDRVSITCKASQDVSTAVAWYQQKPGQSPKLLIYWTNTRHTGVPDRFTGNTSGTEHTLTISSVQAEDLALYYCQQHYSTPFTFGSGTTLEIK
配列番号19 mAb002の軽鎖可変領域(VL)のアミノ酸配列
DIKMTQSPSSMYASLGERVTMTCKASQDINTYLSWFQQKPGKSPKTLIYRSNILVDGVPSRFSGSRSGQDYYLTITSLEYEDMGIYYCLQYDEFPYTFGGGTKLELK
配列番号30 mAb004の軽鎖可変領域(VL)のアミノ酸配列
DIQMTQSPASLSVSVGETVTITCRASENIYSNLAWYQQKQGKSPQLLVYGATNLAEGVPSRFSGSGLGTQYSLKISSLQSEDFGSYYCQHFWGIPWTFGGGTKLEIK
遺伝子組み換え技術によって3組の可変領域の配列(配列番号7、配列番号16、配列番号27、配列番号8、配列番号19、配列番号30を参照する)をヒトIgG1重鎖定常領域およびκ鎖定常領域を含有するベクターにクローニングし、配列決定で間違いがないと確認されたら、形質移入技術および哺乳動物発現系(FreeStyle(商標)293T細胞)によって構築されたキメラ型抗体を発現させて精製し(図3を参照する)、得られたヒト-マウスキメラ型抗体をそれぞれmAb001c、mAb002c、mAb004cと名付けた。
前記抗体の可変領域の配列は数個の不利なアミノ酸を含有し、それに対して点突然変異による改造を行った。以下、点突然変異された後の重鎖可変領域(VH)、軽鎖可変領域(VL)のアミノ酸配列(下線「_」で示されたのはCDRのアミノ酸配列である)。
DIVMTQSHKFMSTSIGDRVSITCKASQDVSTAVAWYQQKPGQSPKLLIYWTNTRHTGVPDRFTGSGSGTEHTLTISSVQAEDLALYYCQQHYSTPFTFGSGTTLEIK
配列番号17 mAb002-VH-QG
QVQLQQPGAELVKPGASVRLSCKASGYTLTSYWMHWVKKRPGQGLEWIGEINPSQGRSNYNEKFKSKATLTVDRSSSTVYMQLGSLTSEDSAVYYCARRGVSGNYFDYWGQGTTLTVSS
配列番号18 mAb002-VH-NA
QVQLQQPGAELVKPGASVRLSCKASGYTLTSYWMHWVKKRPGQGLEWIGEINPSNARSNYNEKFKSKATLTVDRSSSTVYMQLGSLTSEDSAVYYCARRGVSGNYFDYWGQGTTLTVSS
DIKMTQSPSSMYASLGERVTMTCKASQDINTYLSWFQQKPGKSPKTLIYRSNILVSGVPSRFSGSRSGQDYYLTITSLEYEDMGIYYCLQYDEFPYTFGGGTKLELK
配列番号28 mAb004-VH-QG
EVQLQQSGPELVKPGASVKIPCKASGYTFTDYNMDWVKQSHGKSLEWIGDINPNQGGSVYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDTAVYYCGRITGTGYWSFDVWGTGTTVTVSP
配列番号29 mAb004-VH-NA
EVQLQQSGPELVKPGASVKIPCKASGYTFTDYNMDWVKQSHGKSLEWIGDINPNNAGSVYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDTAVYYCGRITGTGYWSFDVWGTGTTVTVSP
上記のようなヒト-マウスキメラ抗体および前記抗体突然変異体の番号、前記抗体の重鎖および軽鎖の番号を表-1にまとめた。
表-1:ヒト-マウスキメラ抗体およびその突然変異体
コーティング液でCD73タンパク質の細胞外領域(CD73-ECD)を1μg/mLになるように希釈し、ELISAプレートを100μL/ウェル、4℃で一晩コーティングした。残った抗原を洗い流し、1%BSAで室温で2hブロッキングした後、3倍勾配で希釈された各モノクローナル抗体を100μL/ウェルで入れ、室温で1hインキュベートした。結合しなかった抗体を洗い流し、適切な濃度で西洋ワサビペルオキシダーゼで標識された抗マウスの二次抗体を100μL/ウェルで入れ、室温で0.5hインキュベートした。結合しなかった二次抗体を洗い流し、TMB呈色液を入れて約15min反応させ、1N HCLを50μL/ウェルで入れ、呈色反応を停止させた後、450nmにおける吸光度を測定し、そしてデータを分析した。
検出結果は図4に示すように、mAb001c、mAb002c、mAb004cはCD73-ECDに対して強い親和性を有し、EC50がそれぞれ0.024nM、0.016nM、0.038nMであった。
検出結果は図13に示すように、前記mAb001c/mAb002c/mAb004c突然変異体のELISAによるEC50値は0.05 nM~0.093nMであった。
抗原希釈液でヒト組み換えCD73酵素(CD73細胞外領域)を0.1μg/mLになるように希釈し、均一に96ウェル低吸着培養プレートに25μL/ウェルで敷いた。50μLの3倍勾配で2nMから0.0009nMに希釈されたCD73抗体を培養プレートに入れ、均一に混合し(最終濃度は1nM~0.00045nMである)、37℃で1hインキュベートした後、25μLの1.2mM AMPおよび0.4mM ATPを含有する混合液を入れ、37℃で1hインキュベートした。上記反応液を50μL取り出してもう一つの96ウェルプレートに入れ、各ウェルに50μLのCellTiter-Glo試薬を入れ、均一に混合して光を避けて3~5min反応させ、マイクロプレートリーダーによって蛍光シグナル強度を検出した。
検出結果は図16に示すように、mAb001c-Vk-SGSのIC50は0.02nMであった。
検出結果は図17に示すように、mAb002c-VH-QG/VK-SGのIC50は0.038nM、0.06nMであった。
CD73高発現のトリプルネガティブ乳癌細胞MDA-MB-231、非小細胞肺癌細胞NCI-H1299、Calu-1、脳膠細胞腫細胞U87MG、膵臓腺癌細胞SW1990とともに、CD73低発現の乳癌細胞MDA-MB-453、非小細胞肺癌細胞NCI-H460を使用し、キメラ抗体の細胞表面のCD73に対する結合状況を測定した。3×105個の腫瘍細胞を抗体と均一に混合した後(最終濃度5μg/mL)、4℃で1hインキュベートし、PBSで細胞を2回洗浄して結合しなかった一次抗体を除去し、さらに標的細胞をPEで標識された二次抗体と4℃で30minインキュベートし、PBSで細胞を2回洗浄して結合しなかった二次抗体を除去し、最後に細胞を200μLのPBSに再懸濁させ、蛍光活性化セルソーター(FACS)によって結合率を検出した。
CD73高発現(U87MG、Calu-1、NCI-H1299)、CD73低発現(MDA-MB-453)の細胞株を使用し、細胞表面のCD73タンパク質の量と酵素活性の関連性を研究した。まず、100μLの上記各細胞株の数を2倍勾配で20000から625に希釈し、均一に96ウェル細胞培養プレートに敷き、37℃で16h培養した後、無血清の培地で3回洗浄して残った血清を除去し、ゆっくり50μLの300μM AMPを入れ、均一に混合し、37℃で3h培養した。気をつけて25μLの培養液上清を取り出し、もう一つの96ウェルプレートに入れ、25μLの100μM ATPを入れ、均一に混合した。各ウェルに50μLのCellTiter-Glo試薬を入れ、均一に混合して光を避けて3~5min反応させ、マイクロプレートリーダーによって蛍光シグナル強度を検出した。
結果は図7に示すように、検出試験の線形範囲内で、CD73低発現のMDA-MB-453細胞は極めて低量(バックグランドレベル)の酵素活性しか示さず、CD73高発現の3株の細胞はいずれも高い酵素活性を示したことから、腫瘍細胞の表面のCD73タンパク質レベルがその酵素活性に密接に関連することが確認された。
CD73高発現のトリプルネガティブ乳癌細胞MDA-MB-231、非小細胞肺癌細胞NCI-H1299を標的細胞とし、100μLの3倍勾配で200nMから0.091nMに希釈された被験抗体を一次抗体とし、それぞれ100μのLRPMI-1640無血清培地に懸濁させた1×105個のMDA-MB-231と均一に混合し、あるいは100μLの3倍勾配で100nMから0.046nMに希釈されたmAb001c、mAb002c、mAb004cを一次抗体として100μLのRPMI-1640無血清培地に懸濁させた1×105個のNCI-H1299細胞と均一に混合した後、4℃で1hインキュベートし、PBSで細胞を2回洗浄して結合しなかった一次抗体を除去し、さらに標的細胞を200μLの2μg/mLのPEで標識された二次抗体と4℃で30minインキュベートし、PBSで細胞を2回洗浄して結合しなかった二次抗体を除去し、最後に細胞を200μLのPBSに再懸濁させ、フローサイトメトリーによって被験抗体の相応する細胞表面CD73に対する結合親和力(Binding affinity)を測定した。
検出結果は図9に示すように、mAb001c、mAb002c、mAb004cはNCI-H1299に対して優れた結合親和力を有し、EC50がそれぞれ1.0nM、0.39nM、2.2nMであった。
検出結果は図18に示すように、前記mAb001c/mAb002cの誘導突然変異体はMDA-MB-231に同様に優れた結合親和力を有し、mAb001c-VK-SGSのEC50値は1.39nMで、mAb002c-VH-QG/NAのEC50値は0.43nMで、mAb002c-VK-SGのEC50値は0.46nMであった。
上記結果のように、本実施例のモノクローナル抗体はヒト由来腫瘍細胞のCD73を作用標的とすることができる。
CD73高発現のトリプルネガティブ乳癌細胞MDA-MB-231、非小細胞肺癌細胞NCI-H1299およびCalu-1を標的細胞とした。適切な数の腫瘍細胞(予備実験によって確認された)を96ウェルプレートに敷き、37℃で16時間培養した後、無血清RPMI-1640培地で細胞を3回洗浄し、50μLの3倍勾配で200nMから0.091nMに希釈された被験抗体を96ウェルプレートに入れ、37℃で30minインキュベートした後、25μLの0.9mMのAMPを入れ、37℃、5%CO2で3h培養した(抗体の最終濃度は133.3nM~0.06nMである)。上記培養上清を25μL取り出してもう一つの96ウェルプレートに入れ、25μLの0.1mM ATPを入れ、均一に混合した。各ウェルに50μLのCellTiter-Glo試薬を入れ、均一に混合して光を避けて3~5min反応させ、マイクロプレートリーダーによって蛍光シグナル強度を検出した。
検出結果は図11に示すように、mAb001c、mAb002c、mAb004cはNCI-H1299細胞の表面のCD73のAMPの加水分解を触媒する機能を抑制し、IC50がそれぞれ0.236nM、0.191nM、0.385nMであった。
検出結果は図12に示すように、mAb001c、mAb002c、mAb004cはCalu-1細胞の表面のCD73のAMPの加水分解を触媒する機能を抑制し、IC50がそれぞれ0.506nM、0.281nM、0.630nMであった。
Germlineデータベースから検索してmAb001c、mAb002cの非CDR領域に最もマッチするヒト化鋳型を選択した後、ヒト由来鋳型のCDR領域の代わりに抗体のCDR領域を選ばれたヒト化鋳型に導入し、さらたIgG1の定常領域と組み換え、同時にマウス由来抗体の3次元構造を元に、残基を包埋し、CDR領域と直接相互作用がある残基、およびVLとVHの配座に大きく影響する残基に対して復帰突然変異を行った。
具体的に、mAb001cのヒト化を行って7つのヒト化重鎖の可変領域(配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号45、配列番号46)、および3つのヒト化軽鎖の可変領域(配列番号36、配列番号37、配列番号47)を得た。
配列番号32 mAb001-VH_HuG.5 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYIYWVRQAPGQRLEWIGWIYPGNLNIKYNEKFKGRVTITADKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDDNYAWFAYWGQGTLVTVSS
配列番号33 mAb001-VH_HuG.6 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYIYWVKQRPGQRLEWIGWIYPGNLNIKYNEKFKGRVTITADKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDDNYAWFAYWGQGTLVTVSS
配列番号35 mAb001-VH_HuG.8
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSGYTFTNYYIYWVKQRPGQGLEWIGWIYPGNLNIKYNEKFKGRVTITADKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDDNYAWFAYWGQGTLVTVSS
配列番号45 mAb001-VH_HuG.9
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYIYWVRQAPGQRLEWIGWIYPGNLNIKYNEKFKGRSTLTADKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDDNYAWFAYWGQGTLVTVSS
配列番号46 mAb001-VH_HuG.10
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYIYWVKQRPGQRLEWIGWIYPGNLNIKYNEKFKGRSTLTADKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDDNYAWFAYWGQGTLVTVSS
配列番号37 mAb001-VK_HuG.2 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGKSPKLLIYWTNTRHTGVPSRFSGSGSGTDHTLTISSLQPEDFATYYCQQHYSTPFTFGQGTKLEIK
配列番号 47 mAb001-VK_HuG.0
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWTNTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYSTPFTFGQGTKLEIK
配列番号39 mAb002-VH_HuG1 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGEINPSQGRSNYNEKFKSRVTLTVDRSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARRGVSGNYFDYWGQGTLVTVSS
配列番号40 mAb002-VH_HuG2 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGEINPSQGRSNYNEKFKSKVTLTVDRSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARRGVSGNYFDYWGQGTLVTVSS
配列番号41 mAb002-VH_HuG3 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLTSYWMHWVKKAPGQGLEWIGEINPSQGRSNYNEKFKSKVTLTVDRSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARRGVSGNYFDYWGQGTLVTVSS
配列番号43 mAb002-VK_HuG2 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINTYLSWFQQKPGKSPKSLIYRSNILVSGVPSRFSGSGSGQDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYDEFPYTFGGGTKLEIK
配列番号44 mAb002-VK_HuG3 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINTYLSWFQQKPGKSPKSLIYRSNILVSGVPSRFSGSGSGQDYTLTISSLQPEDFAIYYCLQYDEFPYTFGGGTKLEIK
表2におけるヒト化抗体を勾配希釈し、ELISA法によってそのCD73タンパク質に対する親和力を測定したが、実験方法は実施例4を参照する。
実験結果は図14、図15に示すように、前記2組のヒト化抗体はいずれもCD73タンパク質に対して強い結合親和力を有し、EC50値が0.02nM~0.13nMであった。
表2におけるヒト化抗体を勾配希釈し、実施例5の方法に従って抗体の組み換えCD73酵素の活性に対する影響を測定した。
実験結果は図16、図17に示すように、前記2組のヒト化抗体はいずれもCD73酵素に対して極めて強い抑制効果を有し、そのIC50値が0.02nM~0.3nMであった。
フローサイトメトリーによって表2におけるヒト化抗体のMDA-MB-231、NCI-H1299肺癌細胞の表面のCD73に対する親和力を測定したが、実験方法は実施例6を参照する。
試験結果は図19、図21に示すように、前記2組のヒト化抗体はMDA-MB-231細胞の表面のCD73に対して高い親和活性を有し、EC50値が0.2nM~0.8nMであった。
試験結果は図20、図22に示すように、前記2組のヒト化抗体はNCI-H1299細胞の表面のCD73に対して高い親和活性を有し、EC50値が0.3nM~1.4nMであった。
表2におけるヒト化抗体のNCI-H1299細胞の表面のCD73酵素の機能に対する影響を測定したが、実験方法は実施例8を参照する。
実験結果は図23、図24に示すように、前記2組のヒト化抗体はNCI-H1299細胞の表面のCD73酵素に対して高い抑制活性を有し、IC50値が0.2nM~0.6nMであった。
50%の密度でMDA-MB-231細胞を共焦点レーザーシャーレに敷き、37℃で6 h培養した後、5μg/mLのCD73抗体を入れ、それぞれ37℃で4hまたは4℃で1hインキュベートし、PBSで3回洗浄して細胞と結合しなかった抗体を除去し、4%のパラホルムアルデヒドで室温で30min固定した。PBSで3回洗浄し、0.4% Triton X-100で10min透過処理した。PBSで3回洗浄した後、37℃の条件においてLamp-2(ウサギ抗ヒト)抗体を1hインキュベートし、細胞リソソームの位置を標識した。PBSで結合しなかった抗体を洗い流し、37℃でR-PEで標識されたヒツジ抗ヒト二次抗体およびAlexa Fluor 488で標識されたロバ抗ウサギ二次抗体を30 minインキュベートした。結合しなかった二次抗体を洗い流し、DAPIで10min染色して細胞核の位置を標識した後、共焦点レーザー顕微鏡(20×)によって抗体の取り込み状況を観察した。
ランダムに免疫欠陥裸ヌードマウス(Balb/c,nude)をいくつかの群に分け、100μLの5×106のU87MG、または9×106のNCI-H1299を含有する細胞懸濁液を100μLの示されたヒト化抗体と均一に混合し(最終濃度は50μg/腫瘍である)、さらに200μLの細胞-抗体混合液をヌードマウスの背中の皮下に接種した(n=4)。hIgG1をサブタイプがマッチする陰性対照とした。抗体の皮下腫瘍の生長に対する抑制作用を観察し、週に2~3回ヌードマウスの体重および腫瘍の大きさを測定し、腫瘍生長曲線を描き、活性を評価した。
結果は図27に示すように、ヒト化抗体Hu001c-14、ヒト化抗体Hu001c-24~32はいずれも顕著にU87MG腫瘍のヌードマウスの体内における生長を抑制した。
結果は図28に示すように、ヒト化抗体Hu001c-14~15、ヒト化抗体Hu002c-3~8はいずれも顕著にNCI-H1299腫瘍のヌードマウスの体内における生長を抑制した。
結果は図29に示すように、ヒト化抗体Hu001c-14~15、ヒト化抗体Hu001c-23~32はいずれも顕著にNCI-H1299腫瘍のヌードマウスの体内における生長を抑制した。
まず、複数の異なる分子の種類の乳癌細胞株に対し、細胞の全タンパク質を調製し、精確に定量した後、イムノブロット試験(ウエスタンブロット、Western blot)によってCD73タンパク質の発現レベルを検出した。
結果は図30に示すように、CD73タンパク質は一部の高侵襲で高転移の基底型乳癌(Basal-type、臨床においてトリプルネガティブ乳癌として表れることが多い)細胞株では高度な異常活性化・発現を示したが、悪性度が比較的に低い管腔型乳癌(Luminal-type、臨床においてホルモン受容体陽性乳癌として表れることが多い)細胞株では陰性またはわずかな発現を示した。
その後、癌細胞株エンサイクロペディア(Cancer Cell Line Encyclopedia、CCLE)データベースにおける乳癌細胞株のCD73 mRNA発現レベルを分析した。結果は図31に示すように、高侵襲で高転移の基底型乳癌細胞株におけるCD73 mRNAの発現レベルはいずれも管腔型乳癌細胞株よりも高く、かつ統計学的に有意であった。そのため、本発明のCD73を標的とする抗体は、トリプルネガティブ乳癌を診断、予防および治療する使用においてより顕著な効果がある。
まず、複数の異なる組織由来で、異なる分子の種類の肺癌細胞株に対し、細胞の全タンパク質を調製し、精確に定量した後、イムノブロット試験(ウエスタンブロット、Western blot)によってCD73タンパク質の発現レベルを検出した。
結果は図32に示すように、CD73タンパク質は多くの非小細胞肺癌(NSCLC)細胞株において異常に活性化して発現した。
その後、CCLEデータベースにおける肺癌細胞株のCD73 mRNAレベルを分析した。結果は図32に示すように、非小細胞肺癌(NSCLC)細胞株におけるCD73 mRNA発現レベルが小細胞肺癌(SCLC)よりも高く、本発明のCD73を標的とする抗体は、非小細胞肺癌(NSCLC)を診断、予防および治療する使用においてより顕著な効果があることが示唆された。
PBMCの再生、増幅およびスクリーニング:まず、500ng/mLのCD3/CD28抗体および100IU/mLのIL-2を含有する培地でPBMCを3~4日再生培養した後、スクリーニングキット(Stemcell、Cat#1795)によってPBMCをスクリーニングしてCD3陽性のT細胞を得た。
結果は図34、図35に示すように、ヒト化CD73抗体Hu001c-14、Hu002c-3はヒトT細胞に顕著な増殖保護作用を有し、有効にAMPのT細胞に対する増殖抑制を逆転させ、そのEC50がそれぞれ0.08±0.01nMおよび0.01±0.001nMであった。
結果は図36、図37に示すように、ヒト化CD73抗体Hu001c-14、Hu002c-3は有効にAMPのT細胞のINF-γの発現/分泌に対する抑制作用を逆転させた。
US20160194407で公開されたMEDI9447抗体の重鎖、軽鎖の可変領域の配列(VH/VL)から、その重鎖、軽鎖の可変領域を人工合成し、それぞれヒトIgG1重鎖定常領域を含有するベクター、κ鎖定常領域またはλ鎖定常領域を含有するベクターにクローニングし、配列決定で間違いがないと確認されたら、FreeStyle(商標) 293T細胞系において発現および精製した後、それぞれMEDI9447-κ(本発明のCD73抗体に一致する)またはMEDI9447-λを得、抗体を製造する実験条件が実施例3、実施例10に一致するようにした。
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAYSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLGYGRVDEWGRGTLVTVSS
軽鎖可変領域(VL)配列番号50
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSLSNIGRNPVNWYQQLPGTAPKLLIYLDNLRLSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCATWDDSHPGWTFGGGTKLTVL
表-3:抗体の測定活性
表-4:ヒト化抗体のヌードマウス体内における抗腫瘍活性
表-5:ヒト化抗体のヌードマウス体内における抗腫瘍活性
1×105個の腫瘍細胞を抗体mAb001cと均一に混合した後(最終濃度10μg/mL)、4℃で1hインキュベートし、PBSで細胞を2回洗浄して結合しなかった一次抗体を除去し、さらに標的細胞をPEで標識された二次抗体と4℃で30minインキュベートし、PBSで細胞を2回洗浄して結合しなかった二次抗体を除去し、最後に細胞を200μLのPBSに再懸濁させ、蛍光活性化セルソーター(FACS)によって結合率を検出した。
検出結果は図38に示すように、mAb001cはCD73高発現の腫瘍細胞を特異的に認識して結合し、結合率の蛍光強度の順序はCalu-1、NCI-H1299、U87MG、Calu-6、NCI-H441、NCI-H292、SW1990、MDA-MB-231の順で、CD73低発現の腫瘍細胞MDA-MB-453、NCI-H460は極めて弱い結合蛍光強度を示した。
50%の密度でMDA-MB-231細胞を共焦点レーザーシャーレに敷き、37℃で6 h培養した後、5μg/mLのCD73抗体を入れ、それぞれ37℃で4hまたは4℃で1hインキュベートし、PBSで3回洗浄して細胞と結合しなかった抗体を除去し、4%のパラホルムアルデヒドで室温で30min固定した。PBSで3回洗浄し、0.4% Triton X-100で10min透過処理した。PBSで3回洗浄した後、37℃の条件においてLamp-2(ウサギ抗ヒト)抗体を1hインキュベートし、細胞リソソームの位置を標識した。PBSで結合しなかった抗体を洗い流し、37℃でR-PEで標識されたヒツジ抗ヒト二次抗体およびAlexa Fluor 488で標識されたロバ抗ウサギ二次抗体を30 minインキュベートした。結合しなかった二次抗体を洗い流し、DAPIで10min染色して細胞核の位置を標識した後、共焦点レーザー顕微鏡(20×)によって抗体の取り込み状況を観察した。
結果は図39に示すように、Hu001c-14、Hu001c-15はいずれも迅速かつ大幅にMDA-MB-231細胞によってリソソームに取り込まれた。当該結果から、本発明の抗体は抗体-薬物複合体(ADC)の製造に適することが示され、CD73-ADCは良いADC薬物特性を有し、広域で高特異性のCD73陽性腫瘍を標的とする治療薬に有用であるという将来性が示唆された。
CD73を標的とするヒト化抗体Hu001c-14原液にPBS/EDTA(pH=7.4)緩衝液をその濃度が20 mg/mlになるように入れた後、2.6 eqのTCEPで25℃で2時間還元させ、取り出した後、氷の上に置いて冷却し、精製せずにそのまま6.0 eqのmc-VC-PAB-MMAE(上海皓元化学から購入され、予めDMAに溶解させた)を入れ、0℃で1時間反応させ、システインを入れて反応を停止させた。G25脱塩カラムによって過剰量の小分子を除去し、そして20mM クエン酸-クエン酸ナトリウム/6%ショ糖、pH 6.6の緩衝液に置換し、孔径0.22μmのろ過装置によって除菌し、-80℃で保存したが、得られた抗体複合体をHu001c14-vcMMAEと名付けた。ヒト化抗体Hu001c-14の質量分析グラフ(図42)とその抗体複合体Hu001c14-vcMMAEのHICおよび質量分析グラフ(図40、図43)のいずれからも、抗体がカップリング反応した後、抗体複合体Hu001c14-vcMMAEになり、複合体の分子量が予測値に合致し、平均DAR値が約4.0であったことが示された。
CD73を標的とするヒト化抗体Hu001c-15原液にPBS/EDTA(pH=7.4)緩衝液をその濃度が20mg/mlになるように入れた後、2.6 eqのTCEPで25℃で2時間還元させ、取り出した後、氷の上に置いて冷却し、精製せずにそのまま6.0 eqのmc-VC-PAB-MMAE(上海皓元化学から購入され、予めDMAに溶解させた)を入れ、0℃で1時間反応させ、システインを入れて反応を停止させた。G25脱塩カラムによって過剰量の小分子を除去し、そして20mM クエン酸-クエン酸ナトリウム/6%ショ糖、pH 6.6の緩衝液に置換し、孔径0.22μmのろ過装置によって除菌し、-80℃で保存したが、得られた抗体複合体をHu001c15-vcMMAEと名付けた。抗体Hu001c-15の質量分析グラフ(図47)とその抗体複合体Hu001c15-vcMMAEのHICおよび質量分析グラフ(図45、図48)のいずれからも、抗体Hu001c-15がカップリング反応した後、抗体複合体Hu001c15-vcMMAEになり、複合体の分子量が予測値に合致し、平均DAR値が約4.0であったことが示された。
本実施例で使用された細胞系は米国培養細胞系統保存機関(ATCC)または中国科学院細胞ライブラリーから購入され、相応する説明に従って培養され、MDA-MB-453、Calu-1、U87MG、Calu-6、NCI-H441、NCI-H292、MDA-MB-231、PC9、HCC827、NCI-H1975が含まれる。対数増殖期にある上記細胞を、それぞれ800~2500個細胞/ウェルの密度(細胞の増殖速度による)で96ウェル細胞培養プレートに150μL/ウェルで接種し、37℃、5% CO2で5~12 h培養した後、それぞれ異なる濃度のCD73-ADCを入れ、各薬物濃度に2~4個の重複ウェル、および相応する溶媒対照とブランク対照のウェルを設け、5~6日作用させた後(細胞の増殖速度によるが、細胞分裂の回数が十分になるようにした)、培養液を捨て、MTS反応液(Promegaから購入、cat# G3581)を100μL/ウェルで入れ、37℃で所定の色の深さになるまで反応させ、各群の細胞活力を測定し(OD490nm)、そして生存率=(OD投与-ODブランク)/(OD対照-ODブランク)×100%という式で細胞生存率を計算した。GraphPad Prism 5ソフトによって上記データを分析し、そしてそれぞれ上記CD73抗体-薬物複合体の異なる細胞株におけるIC50値を計算した。
図50に示すように、CD73-ADCはCD73低発現の細胞MDA-MB-453に対する増殖抑制作用が顕著ではなかったが、CD73高発現のCalu-1(図51)、U87MG(図52)、Calu-6(図53)、NCI-H441(図54)、NCI-H292(図55)、MDA-MB-231(図56)、PC9(図57)、HCC827(図58)、NCI-H1975(図59)のいずれにも強い細胞増殖抑制作用を示した。
全体的に、CD73-ADCの細胞毒活性(IC50値)から、CD73-薬物複合体の細胞毒活性が被験細胞のCD73発現レベルに直接関連することが示されることから、CD73を標的とする特異的細胞毒性と判断された(図60)。表-6に一部の細胞増殖抑制試験のIC50値をまとめた。
ヒト末梢血単核球(peripheral blood mononuclear cell、PBMC)凍結保存管はいずれもJiangsu Xidier Biological Technology Co. Ltd.によって提供された。まず、500ng/mLのCD3/CD28抗体および100IU/mLのIL-2を含有する培地でPBMCを3~4日再生培養した後、スクリーニングキット(提供先:Stemcell、Cat#1795)によってスクリーニングしてCD3陽性のT細胞を得、さらに蛍光標識した。予め調製された蛍光色素CFSE(カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル、carboxyfluorescein succinimidyl ester)を細胞懸濁液(最終濃度2.5μM)に入れ、37℃で5minインキュベートし、PBSで3回洗浄した後、試験に使用した。
また、もう一つの試験において、CFSEで標識されたT細胞を96ウェルプレートに敷き(2×104個細胞/ウェル)、各ウェルに勾配希釈されたCD73-ADC(最終濃度100nM~0.00128nM、n=3)または対照溶媒を入れ、5日培養した後、FACSによって生細胞数を読み取り、投与量曲線図を作ってIC50値を計算した。図62に示すように、Hu001c14-BL20-MMAE、Hu001c15-BL20-MMAEは被験濃度の区間では顕著な毒性・副作用を示さなかった(IC50>100nM)。
それぞれ200μLの5×106 U87MG、NCI-H441、NCI-H292を含有する細胞懸濁液を免疫欠陥マウス(Balb/c,nude)の背中の皮下に接種した。腫瘍体積が100~300 mm3に生長したら、腫瘍体積の大きさおよびヌードマウスの体重によってランダムに群分けを行い(n=8)、それぞれ5mg/kg、3mg/kg、1mg/kg、0.3mg/kgの投与量で、週に1回尾静脈から投与し、計2週間投与した。同時に、hIgG(hIgG1-MMAE)を陰性対照とし、15mg/kgドセタキセル(Docetaxel)を陽性対照とした。週に2~3回腫瘍体積およびヌードマウスの体重を測定して記録することによって腫瘍の生長曲線を描いた。腫瘍体積(V)の計算式は、V=1/2×a×b2で、ここで、a、bはそれぞれ腫瘍の長さ、幅を表す。
3種類の好適なヒト化CD73-ADCとしてHu001c14-BL20-MMAE、Hu001c14-vcMMAE、Hu001c15-BL20-MMAEの体内抗腫瘍活性の結果をそれぞれ図63~図67に示す。
図64に示すように、U87MG腫瘍モデルにおいて、Hu001c14-BL20-MMAEは3mg/kg、1mg/kgで投与する場合、投与量に関連する治療効果を示した。そして、同等の3mg/kgの投与量では、Hu001c14-BL20-MMAEはHu001c14-vcMMAEよりも強い抗腫瘍活性を示したことから、BL20-MMAEリンカーはより優れたことが示された。
図66に示すように、NCI-H441腫瘍モデルにおいて、Hu001c14-BL20-MMAE、Hu001c15-BL20-MMAEは1mg/kgで投与した後、いずれも顕著な腫瘍の消退につながり、0.3mg/kgで投与した後も顕著な抗腫瘍活性があったことから、NCI-H441腫瘍はCD73-ADCに対する高度な感受性を有することがさらに明らかになった。
図67に示すように、NCI-H292腫瘍モデルにおいて、Hu001c14-BL20-MMAE、Hu001c15-BL20-MMAEは3mg/kg、1mg/kgで投与した後、いずれも完全に腫瘍の生長を抑制した(図67A)。もう一つの独立した腫瘍消退試験において、腫瘍体積が~700mm3になったら投与し、5mg/kg Hu001c14-BL20-MMAEの治療効果が顕著に5mg/kg Docetaxelよりも優れた(図67B)。
カニクイザルCD73/NT5E細胞外領域の配列(EHH53214.1; Met1-Lys547)で炭素末端にポリヒスチジンタグが付いた組み換えカニクイザルCD73酵素を製造し、具体的なアミノ酸配列は配列番号48で示される。
表2におけるヒト化抗体を勾配希釈し、実施例5の方法に従って抗体の組み換えカニクイザルCD73酵素の活性に対する影響を測定した。
試験結果は図68、図69に示すように、前記2組のヒト化抗体はいずれもカニクイザルCD73酵素に対して予想された抑制効果を有し、IC50値の範囲がそのヒトCD73酵素に対する陽区性活性に相当する。
雌のカニクイザルを2匹使用し、単回の静脈内投与によって3 mg/kgのHu001c14-vcMMAE(被験物番号FD114-ADC)を投与した後、連続21日観察し、22日目に再び静脈内投与によって6mg/kgのHu001c14-vcMMAE(被験物番号FD114-ADC)を投与し、さらに連続21日観察した後(計42日後)安楽死させて解剖した。試験期間では、ケージサイド観察(cageside observation)、体重、飼料消耗量、血液学、血液凝集、血漿生化学、免疫表現型(6 mg/kg投与後の21日目のみで検出された)、形態学の肉眼観察および生物分析といった指標を評価した。
1、 CD73ヒト化抗体-薬物複合体Hu001c14-vcMMAE、Hu001c15-vcMMAE、Hu001c14-BL20-MMAE、Hu001c15-BL20-MMAEはいずれも良いCD73特異的な腫瘍細胞殺傷活性を有し、すなわち、CD73高発現の腫瘍細胞の増殖に極めて強い抑制作用を有するが、CD73低発現の細胞の増殖に顕著な毒性がない。
2、 CD73ヒト化抗体-薬物複合体Hu001c14-BL20-MMAE、Hu001c15-BL20-MMAEは、健常者のT細胞の細胞増殖に顕著な毒性がない。
4、 新規なリンカーのより優れた均一性および安定性のため、Hu001c14-BL20-MMAE、Hu001c15-BL20-MMAEはいずれもより低い非特異性の(標的化部分(targeting moiety)の脱離による)毒性・副作用を示し、たとえば、そのCD73低発現のMDA-MB-453に対する細胞毒性のIC50値がさらに向上した(図50、表-6)。
5、 Hu001c14-vcMMAEを静脈内投与によってカニクイザル(3mg/kg、6mg/kg)に投与する初歩的な毒理試験から、CD73-ADCは予想に合致する制御可能な安全性を示すため、臨床で応用する潜在的な将来性がある。
配列番号1: mAb001 HCDR1
NYYIY
配列番号2: mAb001 HCDR2
WIYPGNLNIKYNEKFKG
配列番号3: mAb001 HCDR3
DDNYAWFAY
配列番号4: mAb001 LCDR1
KASQDVSTAVA
配列番号5: mAb001 LCDR2
WTNTRHT
配列番号6: mAb001 LCDR3
QQHYSTPFT
配列番号7: mAb001-VH
QVQLQQSGPELVKPGASVRISCKTSGYTFTNYYIYWVKQRPGQGLEWIGWIYPGNLNIKYNEKFKGKSTLTADKSSSTAFMQLSSLTSEDSAVYFCARDDNYAWFAYWGQGTLVTVSS
配列番号8: mAb001-VL
DIVMTQSHKFMSTSIGDRVSITCKASQDVSTAVAWYQQKPGQSPKLLIYWTNTRHTGVPDRFTGNTSGTEHTLTISSVQAEDLALYYCQQHYSTPFTFGSGTTLEIK
配列番号9: mAb001-VL-SGS
DIVMTQSHKFMSTSIGDRVSITCKASQDVSTAVAWYQQKPGQSPKLLIYWTNTRHTGVPDRFTGSGSGTEHTLTISSVQAEDLALYYCQQHYSTPFTFGSGTTLEIK
SYWMH
配列番号11: mAb002 HCDR2
EINPSNGRSNYNEKFKS
配列番号12: mAb002 HCDR3
RGVSGNYFDY
配列番号13: mAb002 LCDR1
KASQDINTYLS
配列番号14: mAb002 LCDR2
RSNILVD
配列番号15: mAb002 LCDR3
LQYDEFPYT
QVQLQQPGAELVKPGASVRLSCKASGYTLTSYWMHWVKKRPGQGLEWIGEINPSNGRSNYNEKFKSKATLTVDRSSSTVYMQLGSLTSEDSAVYYCARRGVSGNYFDYWGQGTTLTVSS
配列番号17: mAb002-VH-QG
QVQLQQPGAELVKPGASVRLSCKASGYTLTSYWMHWVKKRPGQGLEWIGEINPSQGRSNYNEKFKSKATLTVDRSSSTVYMQLGSLTSEDSAVYYCARRGVSGNYFDYWGQGTTLTVSS
配列番号18: mAb002-VH-NA
QVQLQQPGAELVKPGASVRLSCKASGYTLTSYWMHWVKKRPGQGLEWIGEINPSNARSNYNEKFKSKATLTVDRSSSTVYMQLGSLTSEDSAVYYCARRGVSGNYFDYWGQGTTLTVSS
配列番号19: mAb002-VL
DIKMTQSPSSMYASLGERVTMTCKASQDINTYLSWFQQKPGKSPKTLIYRSNILVDGVPSRFSGSRSGQDYYLTITSLEYEDMGIYYCLQYDEFPYTFGGGTKLELK
配列番号20: mAb002-VL-SG
DIKMTQSPSSMYASLGERVTMTCKASQDINTYLSWFQQKPGKSPKTLIYRSNILVSGVPSRFSGSRSGQDYYLTITSLEYEDMGIYYCLQYDEFPYTFGGGTKLELK
DYNMD
配列番号22: mAb004 HCDR2
DINPNNGGSVYNQKFKG
配列番号23: mAb004 HCDR3
ITGTGYWSFDV
配列番号24: mAb004 LCDR1
RASENIYSNLA
配列番号25: mAb004 LCDR2
GATNLAE
配列番号26: mAb004 LCDR3
QHFWGIPWT
EVQLQQSGPELVKPGASVKIPCKASGYTFTDYNMDWVKQSHGKSLEWIGDINPNNGGSVYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDTAVYYCGRITGTGYWSFDVWGTGTTVTVSP
配列番号28: mAb004-VH-QG
EVQLQQSGPELVKPGASVKIPCKASGYTFTDYNMDWVKQSHGKSLEWIGDINPNQGGSVYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDTAVYYCGRITGTGYWSFDVWGTGTTVTVSP
配列番号29: mAb004-VH-NA
EVQLQQSGPELVKPGASVKIPCKASGYTFTDYNMDWVKQSHGKSLEWIGDINPNNAGSVYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDTAVYYCGRITGTGYWSFDVWGTGTTVTVSP
配列番号30: mAb004-VL
DIQMTQSPASLSVSVGETVTITCRASENIYSNLAWYQQKQGKSPQLLVYGATNLAEGVPSRFSGSGLGTQYSLKISSLQSEDFGSYYCQHFWGIPWTFGGGTKLEIK
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSGYTFTNYYIYWVRQAPGQRLEWMGWIYPGNLNIKYNEKFKGRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDDNYAWFAYWGQGTLVTVSS
配列番号32: mAb001-VH_HuG.5
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYIYWVRQAPGQRLEWIGWIYPGNLNIKYNEKFKGRVTITADKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDDNYAWFAYWGQGTLVTVSS
配列番号33: mAb001-VH_HuG.6 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYIYWVKQRPGQRLEWIGWIYPGNLNIKYNEKFKGRVTITADKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDDNYAWFAYWGQGTLVTVSS
配列番号34: mAb001-VH_HuG.7 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYIYWVKQRPGQGLEWIGWIYPGNLNIKYNEKFKGRVTITADKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDDNYAWFAYWGQGTLVTVSS
配列番号35: mAb001-VH_HuG.8 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSGYTFTNYYIYWVKQRPGQGLEWIGWIYPGNLNIKYNEKFKGRVTITADKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDDNYAWFAYWGQGTLVTVSS
配列番号36: mAb001-VK_HuG.1
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWTNTRHTGVPSRFSGSGSGTDHTLTISSLQPEDFATYYCQQHYSTPFTFGQGTKLEIK
配列番号37: mAb001-VK_HuG.2
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGKSPKLLIYWTNTRHTGVPSRFSGSGSGTDHTLTISSLQPEDFATYYCQQHYSTPFTFGQGTKLEIK
配列番号39: mAb002-VH_HuG1 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGEINPSQGRSNYNEKFKSRVTLTVDRSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARRGVSGNYFDYWGQGTLVTVSS
配列番号40: mAb002-VH_HuG2 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGEINPSQGRSNYNEKFKSKVTLTVDRSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARRGVSGNYFDYWGQGTLVTVSS
配列番号41: mAb002-VH_HuG3 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLTSYWMHWVKKAPGQGLEWIGEINPSQGRSNYNEKFKSKVTLTVDRSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARRGVSGNYFDYWGQGTLVTVSS
配列番号42: mAb002-VK_HuG1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINTYLSWFQQKPGKAPKSLIYRSNILVSGVPSRFSGSGSGQDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYDEFPYTFGQGTKLEIK
配列番号43: mAb002-VK_HuG2 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINTYLSWFQQKPGKSPKSLIYRSNILVSGVPSRFSGSGSGQDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYDEFPYTFGGGTKLEIK
配列番号44: mAb002-VK_HuG3 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINTYLSWFQQKPGKSPKSLIYRSNILVSGVPSRFSGSGSGQDYTLTISSLQPEDFAIYYCLQYDEFPYTFGGGTKLEIK
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYIYWVRQAPGQRLEWIGWIYPGNLNIKYNEKFKGRSTLTADKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDDNYAWFAYWGQGTLVTVSS
配列番号46: mAb001-VH_HuG.10
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYIYWVKQRPGQRLEWIGWIYPGNLNIKYNEKFKGRSTLTADKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDDNYAWFAYWGQGTLVTVSS
配列番号47: mAb001-VK_HuG.0
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWTNTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYSTPFTFGQGTKLEIK
WELTILHTNDVHSRLEQTSEDSSKCVNASRCMGGVARLFTKVQQIRRAEPNVLLLDAGDQYQGTIWFTVYKGAEVAHFMNALRYDAMALGNHEFDNGVEGLIEPLLKEAKFPILSANIKAKGPLASQISGLYLPYKVLPVGDEVVGIVGYTSKETPFLSNPGTNLVFEDEITALQPEVDKLKTLNVNKIIALGHSGFEMDKLIAQKVRGVDVVVGGHSNTFLYTGNPPSKEVPAGKYPFIVTSDDGRKVPVVQAYAFGKYLGYLKIEFDERGNVISSHGNPILLNSSIPEDPSIKADINKWRIKLDNYSTQELGKTIVYLDGSSQSCRFRECNMGNLICDAMINNNLRHTDEMFWNHVSMCILNGGGIRSPIDERNNGTITWENLAAVLPFGGTFDLVQLKGSTLKKAFEHSVHRYGQSTGEFLQVGGIHVVYDLSRKPGDRVVKLDVLCTKCRVPSYDPLKMDEVYKVILPNFLANGGDGFQMIKDELLRHDSGDQDINVVSTYISKMKVIYPAVEGRIKAHHHHHHHHHH
配列番号49: MEDI9447重鎖可変領域(MEDI9447-VH)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAYSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLGYGRVDEWGRGTLVTVSS
配列番号50: MEDI9447軽鎖可変領域(MEDI9447-VL)
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSLSNIGRNPVNWYQQLPGTAPKLLIYLDNLRLSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCATWDDSHPGWTFGGGTKLTVL
Claims (11)
- 重鎖および軽鎖を含む、CD73に結合する抗体であって、
前記重鎖は、以下の3つの相補性決定領域(CDR)を含む重鎖可変領域を有し:
配列番号10で示されるCDR1、
配列番号11で示されるCDR2、および
配列番号12で示されるCDR3;
前記軽鎖は、以下の3つの相補性決定領域(CDR)を含む軽鎖可変領域を有し:
配列番号13で示されるCDR1'、
配列番号14で示されるCDR2'、および
配列番号15で示されるCDR3';
または、
前記重鎖は、以下の3つの相補性決定領域(CDR)を含む重鎖可変領域を有し:
配列番号1で示されるCDR1、
配列番号2で示されるCDR2、および
配列番号3で示されるCDR3;
前記軽鎖は、以下の3つの相補性決定領域(CDR)を含む軽鎖可変領域を有し:
配列番号4で示されるCDR1'、
配列番号5で示されるCDR2'、および
配列番号6で示されるCDR3';
または、
前記重鎖は、以下の3つの相補性決定領域(CDR)を含む重鎖可変領域を有し:
配列番号21で示されるCDR1、
配列番号22で示されるCDR2、および
配列番号23で示されるCDR3;
前記軽鎖は、以下の3つの相補性決定領域(CDR)を含む軽鎖可変領域を有し:
配列番号24で示されるCDR1'、
配列番号25で示されるCDR2'、および
配列番号26で示されるCDR3';
前記抗体。 - (i)請求項1に記載の抗体、および
(ii)任意の発現および/または精製を補助するタグ配列
を含む、組み換えタンパク質。 - キメラ抗原受容体(CAR)であって、前記のCARのモノクローナル抗体抗原結合領域scFV断片はCD73と特異的に結合する結合領域であり、かつ、
前記scFvは、
以下の3つの相補性決定領域(CDR)を含む重鎖可変領域と:
配列番号10で示されるCDR1、
配列番号11で示されるCDR2、および
配列番号12で示されるCDR3;
以下の3つの相補性決定領域(CDR)を含む軽鎖可変領域と:
配列番号13で示されるCDR1'、
配列番号14で示されるCDR2'、および
配列番号15で示されるCDR3';
を有し、または、
以下の3つの相補性決定領域(CDR)を含む重鎖可変領域と:
配列番号1で示されるCDR1、
配列番号2で示されるCDR2、および
配列番号3で示されるCDR3;
以下の3つの相補性決定領域(CDR)を含む軽鎖可変領域と:
配列番号4で示されるCDR1'、
配列番号5で示されるCDR2'、および
配列番号6で示されるCDR3';
を有し、または、
以下の3つの相補性決定領域(CDR)を含む重鎖可変領域と:
配列番号21で示されるCDR1、
配列番号22で示されるCDR2、および
配列番号23で示されるCDR3;
以下の3つの相補性決定領域(CDR)を含む軽鎖可変領域と:
配列番号24で示されるCDR1'、
配列番号25で示されるCDR2'、および
配列番号26で示されるCDR3';
を有する、前記CAR。 - 外来の請求項3に記載のCARを発現することを特徴とする、組み換え免疫細胞。
- (a)請求項1に記載の抗体と、
(b)検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、酵素、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる、前記抗体部分とカップリングするカップリング部分と
を含む、抗体-薬物複合体。 - 前記抗体-薬物複合体が、下記分子式で表される、請求項5に記載の抗体-薬物複合体。
Abは請求項1に記載の抗体である。
LUはリンカー(連結基とも呼ばれる)である。
Dは薬物である。
そして、下付き文字pは1~10である。) - LUが、6-マレイミドカプロイル-バリン-シトルリン-p-アミノベンジルオキシカルボニル(MC-val-cit-PAB)、6-マレイミドカプロイル-アラニン-フェニルアラニン-p-アミノベンジルオキシカルボニル(MC-ala-phe-PAB)、マレイミドプロピオニル-バリン-シトルリン-p-アミノベンジルオキシカルボニル(MP-val-cit-PAB)、マレイミドプロピオニル-アラニン-フェニルアラニン-p-アミノベンジルオキシカルボニル(MP-ala-phe-PAB)、N-スクシンイミジル4-(2-ピリジルチオ)バレラート(SPP)、N-スクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボナート(SMCC)、N-ヒドロキシスクシンイミジル4-(2-ピリジルジチオ)ブチレート(SPDB)またはN-スクシンイミジル(4-ヨードアセチル)アミノベンゾエート(SIAB)および二置換マレイミド系リンカーからなる群から選ばれる、請求項6に記載の抗体-薬物複合体。
- Dが、
(i)マイタンシン誘導体、オーリスタチンおよびドラスタチン、
(ii)モノメチルオーリスタチンE(MMAE)、モノメチルオーリスタチンF(MMAF)、モノメチルドラスタチン10(MMAD)系誘導体またはこれらの組み合わせ、ならびに
(iii)DNA損傷薬物
からなる群から選ばれる、請求項6に記載の抗体-薬物複合体。 - (a)抗体と、
(b)検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、酵素、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる、前記抗体部分とカップリングするカップリング部分と
を含む、抗体-薬物複合体であって、
前記抗体が、以下に示す重鎖可変領域(VH)配列および軽鎖可変領域(VL)配列:
- (a)検出試薬、検出プレートまたはキットの製造、ならびに/あるいは(b)CD73関連疾患を予防および/または治療する薬物の製造に使用される、請求項1に記載の抗体、請求項2に記載の組み換えタンパク質、請求項4に記載の免疫細胞、請求項5に記載の抗体-薬物複合体、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる活性成分の使用。
- (i)請求項1に記載の抗体、請求項2に記載の組み換えタンパク質、請求項4に記載の免疫細胞、請求項5に記載の抗体-薬物複合体、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる活性成分と、
(ii)薬学的に許容される担体と
を含有する、薬物組成物。
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