CN110577600A

CN110577600A - 靶向gpc3的抗体-药物偶联物及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN110577600A
Application number: CN201810582099.9A
Authority: CN
Inventors: 沈竞康; 孟韬; 康小强; 赖寿鹏; 马兰萍; 彭红丽; 王昕�; 陈驎; 杜志彦; 王英; 于霆; 张永良
Original assignee: Nanjing Wei Li Zhi Bo Biotechnology Co ltd; Shanghai Institute of Materia Medica of CAS
Current assignee: Nanjing Wei Li Zhi Bo Biotechnology Co ltd; Shanghai Institute of Materia Medica of CAS
Priority date: 2018-06-07
Filing date: 2018-06-07
Publication date: 2019-12-17
Anticipated expiration: 2038-06-07
Also published as: CN110577600B

Abstract

本发明描述了抗磷脂酰肌醇聚糖蛋白3(GPC3)的抗体药物偶联体，所采用的通过一类新型双取代马来酰亚胺连接子将强细胞毒活性物质和生物大分子进行偶联。该类连接子可选择性与二硫链同时作用，从而大大提高偶联物的物质均一性。本发明的连接子所制备的偶联物对于表达GPC3抗原的细胞株具有高抑制活性。此外，本发明还提供了上述偶联物的制备方法和用途。

Description

靶向GPC3的抗体-药物偶联物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及药物领域，更具体地，涉及靶向于磷脂酰肌醇聚糖蛋白3 (GPC3)的抗体-药物偶联物的及其制备方法和用途。

背景技术

肝细胞癌(HCC)是世界第五大最常见癌症和第三大最常见癌症死亡原因。根据美国癌症学会，肝细胞癌(HCC)占肝癌病例的约75％，往往直到晚期肝癌才会有症状。目前，手术是HCC最有效的治疗方法。然而，根治性肝脏切除术后肿瘤的复发率很高，5年生存率只有10％。此外，因为大多数的HCC患者是在疾病后期阶段才被诊断，因此根治性治疗，包括化疗、化疗栓塞、切除和质子束疗法，通常可能是无效的。索拉非尼(Nexavar)，是第一种临床批准的HCC 靶向药物，只能使总生存期延长2-3个月。肝癌在世界上最流行的肿瘤中位居第五并且在癌症相关死亡的最常见原因中位居第三。外科手术是肝癌的标准治疗，因为这种类型的癌症对大多数的化疗药物反应不好。因此，迫切需要开发具有不同作用机制的新药物。

磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)是硫酸乙酰肝素(HS)蛋白聚糖glypican 家族的一员，可通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚，附着在细胞表面。GPC3在细胞生长、分化和迁移过程中发挥重要的作用。有多项研究表明，GPC3在许多人类恶性肿瘤细胞和血清中表达。GPC3是一种有吸引力的肝癌特异性靶标，因为它在HCC中高表达，但是在正常组织中表达有限。GPC3已经显示出在超过70％的肝细胞癌活组织检查切片中高表达，但在邻近的非肿瘤组织中不表达。GPC3 阳性HCC患者的无病存活率显著低于GPC3阴性HCC患者。随着对GPC-3与恶性肿瘤形成机制研究的深入，研究人员还发现其在多种恶性肿瘤，如肺鳞癌、乳腺癌、胃癌、结直肠癌、神经母细胞瘤、Wilm肉瘤、脂肪肉瘤、睾丸非精原细胞瘤、卵巢癌、黑素瘤等肿瘤中过表达。

抗体-药物偶联物，是利用单克隆抗体特异性识别肿瘤细胞表面特定抗原的特点，从而实现精准地将抗肿瘤药物(如细胞毒剂或细胞抑制剂，小分子化疗物等)递送到肿瘤靶细胞，发生胞内积蓄并释放，达到精准杀伤肿瘤的目的。ADC 也因为其分子量大小合适，稳定性高，靶向性强，毒副作用小被认为是最具潜力的抗肿瘤药物。但成功开发ADC也存在诸多必须考虑且必须解决的问题，如抗体要特异性的识别病变部位，免疫致敏性低，能够高效迅速的发生细胞内吞作用；抗体-药物接头，在血液中稳定性要高并能在靶向细胞中特异的被激活并高效释放小分子药物(否则会对正常细胞产生了不可接受水平的毒性)；所偶联的小分子药物细胞杀伤能力要强等。

抗体药物偶联物一般由三部分组成：抗体或抗体类配体，小分子药物，和将配体与药物偶联起来的连接子。目前进入临床试验的抗体药物偶联物结构中，高活性的细胞毒性药物通常是通过连接子连接在配体表面的赖氨酸残基，或者抗体铰链区域的半胱氨酸残基(由链间二硫键部分还原得到)上,最佳的药物 /配体比值(DAR)为2-4。抗体表面大量的赖氨酸残基(超过80个)以及偶联反应的非选择性，导致偶联数目和位点的不确定性，进而导致生成的抗体药物偶联物的不均一性。例如，T-DM1(平均DAR值为3.5)的DAR值分布为0-8。同样，尽管抗体铰链区的链间二硫键只有四对，但为达到最佳平均DAR值(2-4)的要求，需要部分还原链间二硫键。由于现有的还原剂(DTT,TCEP等)无法选择性地还原链间二硫键，因此生成的偶联物也不是均一的产物，由多种组分组成，其主要组分的DAR值为0、2、4、6、8，而且对应每一种特定DAR值的组分都存在由于连接位点不同而形成的异构体。抗体药物偶联物产品的不均一性可以导致各成员组分间药物动力学性质，效价以及毒性的不均一性。例如，具有较高DAR 值的组分在体内被清除得更快，并导致更高的毒性。

针对以上偶联技术存在的问题，通过简单的化学方法对现有抗体实现定点偶联目的，会节省大量的资源，因此更加富有吸引力。然而现有技术中的方法大多存在偶联试剂合成路线较长、偶联试剂化学稳定性不佳、抗体偶联物电泳图较为杂乱，提示偶联过程中可能存在副反应、现有方案并未解决体内循环过程中的巯基交换(逆迈克尔加成反应)等问题。

因此，本领域迫切需要提供高效、简单、实用的化学偶联方法用于靶向 GPC3的抗体-药物偶联物研究与开发。

发明内容

本发明的目的是提供一种靶向磷脂酰肌醇聚糖蛋白3(GPC3)的抗体、其制备方法和用途。

本发明的目的是提供一种靶向磷脂酰肌醇聚糖蛋白3(GPC3)的抗体-药物偶联物。

本发明还提供了所述靶向GPC3的抗体-药物偶联物的制药用途，及其在抑制或预防肿瘤中作用。

本发明还提供了使用所述靶向GPC3的抗体-药物偶联物治疗哺乳动物细胞或相关病理性情况的方法。

本发明提供了一种偶联方法，将毒素小分子通过特定连接物偶联到靶向G PC3抗体上，在不改变抗体亲和性的基础上大幅提高抗体对肿瘤细胞的杀伤力。

在本发明的第一方面，提供了一种抗体的重链可变区，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：

SEQ ID NO:2所示的VH-CDR1，

SEQ ID NO:4所示的VH-CDR2，和

SEQ ID NO:6所示的VH-CDR3；

其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留GPC3结合亲和力的衍生序列。

在另一优选例中，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:30。

在另一优选例中，所述抗体的重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO:29。

在本发明的第二方面，提供了一种抗体的重链，所述的重链具有如本发明的第一方面所述的重链可变区。

在另一优选例中，所述抗体的重链的氨基酸序列为SEQ ID NO:34。

在另一优选例中，所述抗体的重链的核苷酸序列为SEQ ID NO:33。

在本发明的第三方面，提供了一种抗体的轻链可变区，所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：

SEQ ID NO:8所示的VL-CDR1，

SEQ ID NO:10所示的VL-CDR2，和

SEQ ID NO:12所示的VL-CDR3；

在另一优选例中，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:32。

在另一优选例中，所述抗体的轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO:31。

在本发明的第四方面，提供了一种抗体的轻链，所述的轻链具有如本发明的第三方面所述的轻链可变区。

在另一优选例中，所述抗体的轻链的氨基酸序列为SEQ ID NO:36。

在另一优选例中，所述抗体的轻链的核苷酸序列为SEQ ID NO:35。

在本发明的第五方面，提供了一种抗体，所述抗体具有：

(1)如本发明的第一方面所述的重链可变区；和/或

(2)如本发明的第三方面所述的轻链可变区；

或者，所述抗体具有：如本发明的第二方面所述的重链；和/或如本发明的第四方面所述的轻链，

在另一优选例中，所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列；和/或所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述的添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量，可以是1-20个，优选1-10个，更优选为1-7个，又更优选为1-5个，又更优选为1-3个，最优选为1-2个。

在另一优选例中，所述的经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留GPC3结合亲和力的衍生序列为同源性或序列相同性为至少96％的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述的抗体还包括重链恒定区和/或轻链恒定区。

在另一优选例中，所述的重链恒定区为人源的，和/或所述的轻链恒定区为人源的。

在另一优选例中，所述抗体的重链可变区还包括人源的框架区，和/或所述抗体的轻链可变区还包括人源的框架区。

在另一优选例中，所述抗体选自下组：动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、全人抗体、或其组合。

在另一优选例中，所述抗体为单链抗体、或双链抗体。

在另一优选例中，所述抗体为单克隆抗体。

在另一优选例中，所述的抗体是部分或全人源化、或全人的单克隆抗体。

在另一优选例中，所述抗体为抗体全长蛋白、或抗原结合片段。

在另一优选例中，所述抗体为双特异性抗体、或多特异性抗体。

在另一优选例中，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.30所示；和/或，所述的抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.32所示；

其中，上述重链可变区的氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/ 或取代至少一个氨基酸的，并与SEQ ID No.30所示的氨基酸序列具有至少80％同源性或序列相同性的衍生序列；

其中，上述轻链可变区的氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/ 或取代至少一个氨基酸的，并与SEQ ID No.32所示的氨基酸序列具有至少80％同源性或序列相同性的衍生序列。

在本发明的第六方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白包括：

(i)如本发明的第一方面所述的重链可变区、如本发明的第二方面所述的重链、如本发明的第三方面所述的轻链可变区、如本发明的第四方面所述的轻链、或如本发明的第五方面所述的抗体；以及

(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。

在本发明的第七方面，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码选自下组的多肽：

(1)如本发明的第一方面所述的重链可变区、如本发明的第二方面所述的重链、如本发明的第三方面所述的轻链可变区、如本发明的第四方面所述的轻链、或如本发明的第五方面所述的抗体；以及

(2)如本发明的第六方面所述的重组蛋白。

在另一优选例中，编码所述重链可变区的多核苷酸如SEQ ID NO:29所示；和/或，编码所述轻链可变区的多核苷酸如SEQ ID NO:31所示。

在另一优选例中，编码所述重链的多核苷酸如SEQ ID NO:33所示；和/或，编码所述轻链的多核苷酸如SEQ ID NO:35所示。

在本发明的第八方面，提供了一种载体，所述载体含有本发明的第七方面所述的多核苷酸。

在本发明的第九方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明的第八方面所述的载体或基因组中整合有本发明的第七方面所述的多核苷酸。

在本发明的第十方面，提供了一种抗体偶联物，所述抗体偶联物含有：

(a)抗体部分，所述抗体部分含有选自下组的元件：如本发明的第一方面所述的重链可变区、如本发明的第二方面所述的重链、如本发明的第三方面所述的轻链可变区、如本发明的第四方面所述的轻链，或所述抗体部分为本发明的第五方面所述的抗体；和

(b)与所述抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、或其组合。

在本发明的第十一方面，提供了一种免疫细胞，所述免疫细胞表达或在细胞膜外暴露有本发明的第五方面所述的抗体。

在本发明的第十二方面，提供了一种基于闭环或开环马来酰亚胺的抗体-药物偶联物，所述的偶联物具有式Ia和/或Ib所示的结构；

其中，

Ar'选自下组：取代或未取代的C6-C10芳基，取代或未取代的5-12元杂芳基，取代或未取代的C6-C10亚芳基，取代或未取代的5-12元亚杂芳基；

L₁为连接于Ar'基团上的-O(CH₂CH₂O)_n-，其中n选自1-20中任一整数，优选为 1-10中任一整数；

L₂为化学键或AA-PAB结构；其中，AA为二肽或三肽或四肽片断(即2-4个氨基酸组成的多肽片断)，PAB为对-氨基苄基氨甲酰基；

CTD为通过酰胺键键合于L₂的细胞毒类小分子药物和/或治疗自身免疫疾病和抗炎症的药物；

m为1.0～5.0，优选为3.0-4.2；更优选为3.5-4.5；又更优选为3.8-4.2，又更优选为3.9-4.1，最优选为4.0；

抗体(Ab)为靶向磷脂酰肌醇聚糖蛋白3(GPC3)的抗体或抗体片段。

在另一优选例中，所述的式Ib为式Ia中N-苯基马来酰亚胺开环后产物。

在另一优选例中，所述的偶联物共价连接有一个或多个药物组分。

在另一优选例中，所述的偶联物中，抗体和药物是通过共价方式(如通过分别共价连接于连接子上)进行偶联。

在另一优选例中，所述的闭环或开环的马来酰亚胺基团连接于抗体铰链区的二硫链还原后的巯基上。

在另一优选例中，所述的抗体-药物偶联物是通过所述抗体或抗体片断铰链区的二硫链还原生成一对半胱氨酸残基，并通过所述半胱氨酸残基中巯基与式Ic表示的取代马来酰亚胺类连接子-药物缀合物中的芳基硫醚发生取代反应，从而获得抗体- 药物偶联物Ia和/或Ib。

在另一优选例中，所述的闭环或开环的马来酰亚胺基团连接于完全还原后的抗体上，即铰链区的4对二硫链完全打开，优选m为3.8-4.2，更优选3.9-4.1，最优选 4.0。

在另一优选例中，所述靶向GPC3的抗体选自下组：单克隆抗体、双特异性抗体、嵌合抗体、人源化抗体、全人抗体。

在另一优选例中，所述抗体片段为抗体Fab片段。

在另一优选例中，所述抗体是能够与GPC3结合的抗体。

在另一优选例中，所述靶向GPC3的抗体或抗体片段为本发明的第五方面所述的抗体。

在另一优选例中，所述靶向GPC3的抗体或抗体片段为本发明的第五方面所述的抗体，其中所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.30所示；和/或，所述的抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.32所示；

在另一优选例中，所述靶向GPC3的抗体为GPC3-6。

在另一优选例中，所述Ar'选自下组：苯基、卤代苯、C1-C4烷基苯基、C1-C4 烷氧基苯基、2-吡啶基、2-嘧啶基、1-甲基咪唑-2-基、其中W为与羰基连接的胺基R¹，R¹选自-NH₂、其中：C1-C4烷基苯基进一步优选为4-甲基苯基；C1-C4 烷氧基苯基进一步优选为4-甲氧基苯基。

在另一优选例中，Ar'选自取代或未取代的亚苯基或吡啶基，所述的取代指基团上的氢原子被选自下组的一个或多个取代基所取代：卤素、C1-C4烷基、C1-C4 烷氧基、三氟甲基、腈基、酰胺基。

在另一优选例中，所述的AA选自下组：Val-Cit(缬氨酸-瓜氨酸)、Val-Ala(缬氨酸-丙氨酸)、Phe-Lys(苯丙氨酸-赖氨酸)、Ala-Ala-Asn(丙氨酸-丙氨酸-天冬酰胺)、D-Ala-Phe-Lys(D型丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸)、Gly-Gly-Phe-Gly(甘氨酸-甘氨酸- 苯丙氨酸-甘氨酸)。

在另一优选例中，所述的CTD为细胞毒类小分子药物，选自下组：微管蛋白抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、DNA结合剂。

在另一优选例中，所述的微管蛋白抑制剂选自下组：美登素(maytansine)衍生物、单甲基阿里他汀-E(MMAE)、单甲基阿里他汀-F(MMAF)、Monomethyl Dolastatin 10、Tubulysin类衍生物、Cryptophycin类衍生物、Taltobulin、或其组合。

在另一优选例中，所述的拓扑异构酶抑制剂选自下组：阿霉素(Doxorubicin) 代谢产物PNU-159682衍生物、依沙替康(Exatecan、DX8951)、伊立替康(irinotecan, CPT-11)代谢产物SN38衍生物。

在另一优选例中，所述的DNA结合剂选自下组：PBD类衍生物、duocarmycin 类衍生物、或其组合。

在另一优选例中，所述的CTD具有选自D1-D14的分子结构：

在另一优选例中，所述抗体-药物偶联物(ADC)选自下组：

偶联物ADC1结构如下：

偶联物ADC2结构如下：

偶联物ADC3结构如下：

偶联物ADC4结构如下：

偶联物ADC5结构如下：

偶联物ADC6结构如下：

m为3.5-4.5；优选3.8-4.2，更优选3.9-4.1，最优选4.0。

在另一优选例中，所述抗体-药物偶联物(ADC)选自下组：GPC3-6-BL9E (ADC1)、GPC3-6-BL20E(ADC2)。

在本发明的第十三方面，提供了本发明的第十二方面所述的抗体-药物偶联物的制备方法，包括步骤：

(1)用抗体与还原试剂在缓冲液中反应，得到经还原后的抗体；

(2)用式Ic连接子-药物缀合物与步骤(1)中得到的经还原后的抗体在缓冲液与有机溶剂混合液中进行交联(偶联)，得到抗体-药物偶联物Ia和/或Ib。

在另一优选例中，所述制备方法的反应式如式A所示：

在另一优选例中，所述步骤(1)中所述抗体经还原试剂还原，从而使抗体链间二硫键被还原，产生巯基基团。

在另一优选例中，所述步骤(1)中还原试剂为三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)、beta-巯基乙醇、beta-巯基乙胺盐酸盐、或二硫苏糖醇(DTT)。

在另一优选例中，所述的缓冲液选自下组：磷酸二氢钾-氢氧化钠 (KH₂PO₄-NaOH)/氯化钠(NaCl)/二乙基三胺五乙酸(DTPA)缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸/氯化钠(NaCl)/二乙基三胺五乙酸(DTPA)、硼酸-硼砂/氯化钠(NaCl)/二乙基三胺五乙酸(DTPA)、组氨酸-氢氧化钠/氯化钠(NaCl)/二乙基三胺五乙酸(DTPA)，和PBS/ 二乙基三胺五乙酸(DTPA)。

在另一优选例中，所述的步骤(2)中，有机溶剂在反应液中的体积占比不超过15％。

在另一优选例中，所述的步骤(2)中的有机溶剂选自下组：乙腈(ACN)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺(DMA)、二甲基亚砜(DMSO)、或其组合。

在另一优选例中，所述的步骤(2)中，所述的偶联反应在0-37℃下进行。

在另一优选例中，所述的步骤(1)采用beta-巯基乙醇、beta-巯基乙胺盐酸盐或DTT还原，在所述的步骤(1)和步骤(2)之间还包括步骤(1a)：在还原反应完成后，对产物进行过脱盐柱或超滤以去除还原剂。

在另一优选例中，在pH 6-8缓冲液中，抗体-药物偶联物Ia内转化为抗体-药物偶联物Ib。

在本发明的第十四方面，提供了一种药物组合物，它含有：

(i)活性成分，所述活性成分选自下组：如本发明的第一方面所述的重链可变区、如本发明的第二方面所述的重链、如本发明的第三方面所述的轻链可变区、如本发明的第四方面所述的轻链、或如本发明的第五方面所述的抗体、如本发明的第六方面所述的重组蛋白、如本发明的第十方面所述的抗体偶联物、如本发明的第十一方面所述的免疫细胞、如本发明的第十二方面所述的抗体-药物偶联物、或其组合；以及

(ii)药学上可接受的稀释剂，载体(载剂)和/或赋形剂。

在本发明的第十五方面，提供了一种活性成分的用途，所述活性成分选自下组：如本发明的第一方面所述的重链可变区、如本发明的第二方面所述的重链、如本发明的第三方面所述的轻链可变区、如本发明的第四方面所述的轻链、或如本发明的第五方面所述的抗体、如本发明的第六方面所述的重组蛋白、如本发明的第十方面所述的抗体偶联物、如本发明的第十一方面所述的免疫细胞、如本发明的第十二方面所述的抗体-药物偶联物、或其组合，其中所述活性成分被用于(a)制备诊断试剂或试剂盒；和/或(b)制备预防和/或治疗肿瘤的药物，其中，所述肿瘤为GPC3 高表达的肿瘤。

在另一优选例中，所述GPC3高表达的肿瘤选自下组：肝细胞癌、肝癌、肺鳞癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、黑色素瘤，前列腺癌，非小细胞肺癌，小细胞肺癌，恶性黑色素瘤，鳞状细胞癌，胶质母细胞瘤，肾细胞癌，胃肠道肿瘤，胰腺癌，前列腺癌，直结肠，胃癌，神经胶质瘤。

在本发明的第十六方面，提供了一种体外检测(包括诊断性或非诊断性)样品中GPC3蛋白的方法，所述方法包括步骤：

(1)在体外，将所述样品与如本发明的第五方面所述的抗体接触；

(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在GPC3 蛋白。

在本发明的第十七方面，提供了一种体外检测样品中GPC3蛋白的组合物，其包括如本发明的第五方面所述的抗体、如本发明的第六方面所述的重组蛋白、如本发明的第十方面所述的抗体偶联物、本发明的第十一方面所述的免疫细胞、或其组合作为活性成分。

在本发明的第十八方面，提供了一种检测板，所述的检测板包括：基片(支撑板)和测试条，所述的测试条含有如本发明的第五方面所述的抗体、如本发明的第六方面所述的重组蛋白、如本发明的第十方面所述的抗体偶联物、本发明的第十一方面所述的免疫细胞、或其组合。

在本发明的第十九方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒中包括：

(1)第一容器，所述第一容器中含有本发明的抗体；和/或

(2)第二容器，所述第二容器中含有抗本发明抗体的二抗；

或者，

所述试剂盒含有如本发明的第十八方面所述的检测板。

在本发明的第二十方面，提供了一种重组多肽的制备方法，该方法包括：

(a)在适合表达的条件下，培养如本发明的第九方面所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出重组多肽，所述的重组多肽是如本发明的第五方面所述的抗体或如本发明的第六方面所述的重组蛋白。

在本发明的第二十一方面，提供了一种药物组合，包括：

(i)第一活性成分，所述第一活性成分包括如本发明的第五方面所述的抗体1、或如本发明的第六方面所述的重组蛋白、或如本发明的第十方面所述的抗体偶联物、或如本发明的第十一方面所述的免疫细胞、或如本发明的第十二方面所述的抗体-药物偶联物、或如本发明的第十四方面所述的药物组合物、或其组合；

(ii)第二活性成分，所述第二活性成分包括第二抗体、或化疗剂。

在本发明的第二十二方面，提供了本发明的第五方面所述的抗体，或本发明的第六方面所述的重组蛋白、或本发明的第十方面所述的抗体偶联物、或本发明的第十一方面所述的免疫细胞、或本发明的第十二方面所述的抗体-药物偶联物、和/或本发明的第十四方面所述的药物组合物与第二抗体或化疗剂的组合在制备用于治疗GPC3高表达的肿瘤的药物中的用途。

在本发明的第二十三方面，提供了一种体外非治疗性抑制肿瘤细胞的方法，包括步骤：将所述肿瘤细胞与本发明的第五方面所述的抗体，本发明的第十方面所述的抗体偶联物或本发明的第十二方面所述的抗体-药物偶联物接触。

在另一优选例中，所述的接触是在体外培养体系中进行。

在本发明的第二十四方面，提供了一种预防和/或治疗肿瘤的方法，包括步骤：向有需要的对象施用有效量的如本发明的第五方面所述的抗体、或如本发明的第六方面所述的重组蛋白、或如本发明的第十方面所述的抗体偶联物、或如本发明的第十一方面所述的免疫细胞、或如本发明的第十二方面所述的抗体-药物偶联物、或如本发明的第十四方面所述的药物组合物、或其组合。

在另一优选例中，所述肿瘤为GPC3高表达的肿瘤。

在另一优选例中，所述的对象是哺乳动物，优选为人。

在另一优选例中，所述的治疗为抑制GPC3高表达的肿瘤的发生、生长和/或转移。

在本发明的第二十五方面，提供了一种减缓治疗对象中肿瘤生长的方法，包括步骤：联用有效量的本发明的第十方面所述的抗体偶联物或本发明的第十二方面所述的抗体-药物偶联物与一种或多种选自下组的治疗：辐射治疗、化疗剂治疗、生物治疗、或其组合。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示各种浓度的GPC3-6-BL20E、GPC3-6处理5天后对HepG细胞体外细胞增殖抑制作用。

图2显示各种浓度的GPC3-6-BL20E、GPC3-6处理5天后对Huh-7细胞体外细胞增殖抑制作用。

图3显示各种浓度的GPC3-6-BL20E、GPC3-6处理5天后对SMMC-7721细胞体外细胞增殖抑制作用。

图4显示各种浓度的GPC3-6-BL20E、GPC3-6处理5天后对NCI-H1975细胞体外细胞增殖抑制作用。

图5显示各种浓度的GPC3-6-BL20E、GPC3-6处理5天后对MDA-MB-231细胞体外细胞增殖抑制作用。

图6显示各种浓度的GPC3-6-BL20E、GPC3-6处理5天后对MDA-MB-486细胞体外细胞增殖抑制作用。

图7显示各种浓度的GPC3-6-BL20E、GPC3-6处理5天后对SKOV-3细胞体外细胞增殖抑制作用。

图8显示各种浓度的GPC3-6-BL20E、GPC3-6处理5天后对786-O细胞体外细胞增殖抑制作用。

图9流式细胞术分析GPC3受体在HepG细胞表面的表达。

图10流式细胞术分析GPC3受体在Huh-7细胞表面的表达。

图11流式细胞术分析GPC3受体在SMMC-7721细胞表面的表达。

图12流式细胞术分析GPC3受体在NCI-H1975细胞表面的表达。

图13流式细胞术分析GPC3受体在MDA-MB-231细胞表面的表达。

图14流式细胞术分析GPC3受体在SKOV-3细胞表面的表达。

图15流式细胞术分析GPC3受体在786-O细胞表面的表达。

图16显示了抗体GPC3-6质谱图。

图17显示了抗体偶联物GPC3-6-BL20E质谱图。

图18显示了抗体GPC3-6与人GPC3的结合曲线。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，意外地获得一组具有全新氨基酸序列、识别不同抗原表位的靶向GPC3的抗体(GPC3-6)，所述靶向GPC3的抗体可以和人GPC3结合，具有高亲和力(结合常数达到0.123nM)。更进一步，针对现有技术中抗体-药物偶联技术存在的问题，使用一类新型的连接子结构(该连接子可以全部/部分交叉偶联抗体的轻链-重链及重链-重链二硫键还原的半胱氨酸巯基上)与药物形成的缀合物(式Ic)(例如取代马来酰亚胺类连接子-药物缀合物)，通过简单的化学方法对靶向GPC3的抗体实现定点偶联药物，获得一种靶向GPC3的抗体-药物偶联物。应用此种偶联方法得到的靶向GPC3抗体药物偶联物，与传统抗体药物偶联物相比，具有更窄的药物/抗体比值(DAR)分布(m为3. 5-4.5；优选3.8-4.2，更优选3.9-4.1，最优选4.0)。本发明方法可提高药物的均一性，对于工艺与质量控制研究节省大量的资源，同时还可能提高偶联物的稳定性、药效与安全性等成药性质。实验结果表明，所述抗体-药物偶联物(例如G PC3-6-BL20E)具有显著的抗肿瘤效果。本发明还涉及所述抗GPC3抗体-药物偶联物的制药用途，及其在抑制或预防肿瘤中作用。在此基础上，发明人完成了本发明。

术语

如本文所用，术语“抗体药物偶联体”、“抗体偶联物”、“抗体药物偶联物”、“抗体-药物偶联物”“免疫偶联物”可互换使用，指抗体(Ab)或其活性片段与式Ic所示的连接子-药物缀合物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物形成的偶联物。

如本文所用，术语“本发明的抗体药物偶联体”、“本发明的抗体与药物偶联物”、或“本发明的抗体药物偶联物”、“本发明的ADC”可互换使用，指具有针对GPC3的本发明抗体或其活性片段与式Ic所示的连接子-药物缀合物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物形成的偶联物。

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4 等)。

在本文中，除特别说明之处，术语“C1-C4烷基”指具有1-4个碳原子的直链或支链烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、或类似基团。

术语“C1-C4烷氧基”指具有1-4个碳原子的直链或支链烷氧基，例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、或类似基团。

术语“卤素”指F、Cl、Br和I。

术语“C6-C10芳基”指具有6-10个碳原子的芳基，例如苯基、萘基等，所述的芳基可以是取代或未取代的。

术语“C6-C10亚芳基”指具有6-10个碳原子的亚芳基，例如亚苯基、亚萘基等，所述的亚芳基可以是取代或未取代的。

术语“5-12元杂芳基”、“5-12元亚杂芳基”指具有5-12个碳原子和一个或多个 (优选1-3个)选自O、S和/或N的杂原子的杂芳基或亚杂芳基，优选5-8元杂芳基或亚杂芳基。所述的杂芳基或亚杂芳基可以是取代或未取代的。

本发明中，术语“药学上可接受的”成分是指适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)，即有合理的效益/风险比的物质。

本发明中，术语“有效量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。因此，预先指定准确的有效量是没用的。然而，对于某给定的状况而言，可以用常规实验来确定该有效量，临床医师是能够判断出来的。

除非特别说明，本发明中，所有出现的化合物均意在包括所有可能的光学异构体，如单一手性的化合物，或各种不同手性化合物的混合物(即外消旋体)。本发明的所有化合物之中，各手性碳原子可以任选地为R构型或S构型，或R构型和S构型的混合物。

如本文所用，术语“本发明化合物”指式Ic所示的化合物。该术语还包括及式Ic化合物的各种晶型形式、药学上可接受的盐、水合物或溶剂化合物。

如本文所用，术语“药学上可接受的盐”指本发明化合物与酸或碱所形成的适合用作药物的盐。药学上可接受的盐包括无机盐和有机盐。一类优选的盐是本发明化合物与酸形成的盐。适合形成盐的酸包括但并不限于：盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸，甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苦味酸、甲磺酸、苯甲磺酸，苯磺酸等有机酸；以及天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸。

除非特别说明，本文中所使用的“氨基酸”意在包括任何常规氨基酸，如天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、苯丙氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸(蛋氨酸)、色氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苏氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸。

当本文中使用商品名时，该商品名意在包括商品名产品制剂、其相应的仿制药，以及商品名产品的活性药物组分。

抗体

如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区 (VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。

如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等,NIH Publ.No.91-3242, 卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。

脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同的两类(称为κ和λ)中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。

一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域来描述，称为可变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR 区域。

本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段(如抗原结合片段)或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。

在本发明中，抗体包括用本领域技术人员熟知技术所制备的鼠的、嵌合的、人源化的或者全人的抗体。重组抗体，例如嵌合的和人源化的单克隆抗体，包括人的和非人的部分，可以通过标准的DNA重组技术获得，它们都是有用的抗体。嵌合抗体是一个分子，其中不同的部分来自不同的动物种，例如具有来自鼠的单克隆抗体的可变区，和来自人免疫球蛋白的恒定区的嵌合抗体(见例如美国专利4,816,567 和美国专利4,816,397,在此通过引用方式整体引入本文)。人源化的抗体是指来源于非人物种的抗体分子，具有一个或多个来源于非人物种的互补决定区(CDRs)和来源于人免疫球蛋白分子的框架区域(见美国专利5,585,089，在此通过引用方式整体引入本文)。这些嵌合和人源化的单克隆抗体可以采用本领域熟知的DNA重组技术制备。

在本发明中，抗体可以是单特异性、双特异性、三特异性、或者更多的多重特异性。

在本发明中，本发明的抗体还包括其保守性变异体，指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本文的术语“抗体”以其最广泛的含义使用并且特别覆盖单克隆抗体、多克隆抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的生物活性(Miller等(2003)Journal of Immunology 170:4854-4861)。抗体可以为鼠、人、人源化、嵌合的抗体或来源于其它物种。抗体为由能够识别和结合特异性抗原的免疫系统产生的蛋白质(Janeway,C., Travers,P.,Walport,M.,Shlomchik(2001)ImmunoBiology,5thEd., Garland Publishing,NewYork)。靶抗原一般具有由多种抗体的CDRs识别的大量结合位点，也称作表位。特异性结合不同表位的各抗体具有不同的结构。因此，一种抗原可以具有一种以上相应的抗体。抗体包括全-长免疫球蛋白分子或全-长免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有特异性结合所关注靶标的抗原或其部分的分子，这类靶标包括，但不限于癌细胞或产生与自身免疫性疾病相关的自身免疫抗体的细胞。本文披露的免疫球蛋白可以具有免疫球蛋白分子的任意类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、 IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。免疫球蛋白可以来源于任意的物种。然而，优选地，免疫球蛋白来源于人、鼠或兔。

“抗体片段”包含全长抗体的一部分，一般为其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括：Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双抗体；线性抗体；微抗体 (minibody)(Olafsen等(2004)Protein Eng.Design&Sel.17(4):315-323)； Fab表达文库制备的片段；抗-独特型(抗-Id)抗体；CDR(互补决定区)；和以免疫特异性方式结合癌细胞抗原、病毒抗原或微生物抗原的上述任意的表位-结合片段；单-链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。

本发明中组成抗体药物偶联物的抗体最好保持其原有野生状态时的抗原结合能力。因此，本发明中的抗体能够，最好专一性地，与抗原结合。

典型地，本发明所述抗体是能够与GPC3结合的抗体。

抗体的制备

本发明抗体或其片段的DNA分子的序列可以用常规技术，比如利用PCR扩增或基因组文库筛选等方法获得。此外，还可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码所述的本发明的抗体(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。优选的动物细胞包括(但并不限于)：CHO-S、 HEK-293细胞。

通常，在适合本发明抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞。然后用常规的免疫球蛋白纯化步骤，如蛋白A-Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、离子交换层析、疏水层析、分子筛层析或亲和层析等本领域技术人员熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的抗体。

所得单克隆抗体可用常规手段来鉴定。比如，单克隆抗体的结合特异性可用免疫沉淀或体外结合试验(如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))来测定。单克隆抗体的结合亲和力例如可用Munson等,Anal.Biochem.,107:220(1980) 的Scatchard分析来测定。

本发明的抗体可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

药物

如本文所用，“药物”泛指任何具有期望的生物活性，并具有反应性官能团以便制备本发明所述偶联物的化合物。期望的生物活性包括，诊断，治愈，缓解，治疗，预防人或其它动物的疾病。因此，只要具有必需的反应性官能团，术语“药物”涉及的化合物包括正式国家药典，以及例如美国正式同种疗法药典，正式全国处方集，或者其任何增补本等确认的药物。典型的药物列于医师案头用药参考(PDR)和美国食品药品监督管理局(FDA)的橙皮书。应理解，随着新型药物不断被发现和发展，这些药物也应纳入本发明所述偶联药物的中的“药物”。

可用于构成本发明ADC的药物包括但并不限于：细胞毒剂(例如细胞毒类小分子药物)。

术语“细胞毒剂”是指抑制或阻止细胞表达活性、细胞功能和/或造成细胞破坏的物质。该术语包括放射性同位素、化学治疗剂以及毒素，如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或变体。细胞毒剂的例子包括但不限于：耳他汀类(例如，耳他汀E、耳他汀F、MMAE和MMAF)、金霉素、类美坦西醇、篦麻毒素、篦麻毒素A-链、考布他汀、多卡米星、多拉司他汀、阿霉素、柔红霉素、紫杉醇、顺铂、cc1065、溴化乙锭、丝裂霉素、依托泊甙、替诺泊甙(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙素、二羟基炭疽菌素二酮、放线菌素、白喉毒素、假单胞菌外毒素(PE)A、PE40、相思豆毒素、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-八叠球菌、白树毒素、迈托毒素(mitogellin)、局限曲菌素(retstrictocin)、酚霉素、依诺霉素、麻疯树毒蛋白(curicin)、巴豆毒素、卡奇霉素、肥皂草(Sapaonariaofficinalis)抑制剂以及糖皮质激素和其它化学治疗剂，以及放射性同位素，如 At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212或213、P32和包括Lu177在内的Lu的放射性同位素。抗体也可与能够将前药转化成其活性形式的抗癌前药活化酶偶联。

优选的小分子药物为具有高细胞毒性的化合物，优选单甲基澳瑞他汀(monomethylauristatin)、加利车霉素、美登素类、或其组合；更佳地选自：单甲基阿里他汀-E(MMAE)、单甲基阿里他汀-D(MMAD)、单甲基阿里他汀-F(MMAF)、或其组合。

较佳地，所述的药物是指：用于癌症治疗的细胞毒性药物，或具有期望生物活性的蛋白或多肽，例如一种毒素，如相思子毒素，蓖麻毒素A，假单胞菌外毒素，和白喉毒素；其他合适的蛋白包括肿瘤坏死因子，α-干扰素，β-干扰素，神经原生长因子，血小板衍生生长因子，组织型纤酶溶原生长因子，以及生物反应调节制剂，例如淋巴因子，白细胞介素-1(IL-1),白细胞介素-2(IL-2), 白细胞介素-6(IL-6),粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF),粒细胞集落刺激因子，或其它生长因子。

一种优选的本发明药物是美登素或类美登素。美登素化合物通过抑制微管蛋白的微管形成来抑制细胞增殖。类美登素是美登素的衍生物。美登素和类美登素都具有高效的细胞毒性，但是它们在癌症治疗的临床应用上具有很大的局限性，这主要是源于此类分子对肿瘤的低选择性。但是，这种高细胞毒性促使它们成为抗体药物偶联物的首选药物部分。以下列出了去乙酰基美登素的结构。

另一种优选的本发明药物是耳抑素肽类药物。耳抑素肽类药物是海兔毒素 10(Dolastatin10)的类似物，而后者是从海洋软体动物海兔体内分离出来的具有生物活性的多肽。海兔毒素10通过结合微管蛋白(与长春新碱同样的结合区域)而抑制微管蛋白聚合。海兔毒素10，耳抑素肽PE，耳抑素肽E都是线性多肽，含有四个氨基酸(其中三个氨基酸是海兔毒素类化合物所独有的)和C-端酰胺基团。两个代表性的耳抑素肽类化合物，单甲基耳抑素肽E(MMAE)和单甲基耳抑素肽F(MMAF)，都是抗体药物偶联物的首选药物。

Monomethyl Auristatin E(MMAE)

Monomethyl Auristatin F(MMAF)

Monomethyl Dolastatin 10(MMAD)

另一种优选的本发明药物是微管溶素(Tubulysin)。微管溶素首先由研究小组从粘细菌培养物中分离，是非常有效的细胞生长抑制剂，其通过抑制微管蛋白聚合并从而诱导细胞凋亡而起作用。微管溶素中的微管溶素D是最有效的，具有超过大多数其他微管蛋白调节剂(包括埃博霉素、长春碱和紫杉醇)10至 100倍的活性。紫杉醇和长春碱目前用于多种癌症的治疗，而埃博霉素衍生物正在临床试验中进行活性评价。微管溶素D的合成衍生物将提供与抑制和关键结合相互作用有关的必要信息，并且作为抗癌剂可以具有优越的性质，所述抗癌剂作为分离的实体或作为靶向抗体或配体上的化学弹头。微管溶素D是复杂的四肽，其可以分为四个区域，Mep(D-N-甲基哌啶甲酸)、Ile(异亮氨酸)、 Tuv(管式缬氨酸，tubuvaline)和Tup(管式苯丙氨酸，tubuphenylalanine)，如下式所示：

另一种优选的本发明药物是可抑制微管聚合的微生物来源的 cryptophycin衍生物。Cryptophycin是从蓝藻的培养物中分离得到的一种能抑制微管生成的新型抗肿瘤活性物质，对多种肿瘤有活性。Cryptophycin是一个脂溶性化合物，含有2个肽键及2个酯键，有5个光学活性中心及1个环氧基团。双肽双酯键都在一个大环结构中。Cryptophycin衍生物CP1和CP2结构如下式所示：

另一种优选的本发明药物是新型抗微管剂Taltobulin(HTI-286、 SPA-110)。Taltobulin抑制纯化微管的多聚化，干扰细胞内微管组织、诱导有丝分裂阻断以及诱导细胞凋亡。Taltobulin是细胞增殖强效抑制剂，对18种人肿瘤细胞系的平均IC50为2.5nM。和目前应用的抗微管剂相比，Taltobulin并不是p-糖蛋白的合适的底物，其中Taltobulin结构如下式所示：

一种药物是喜树碱类药物衍生物SN-38。SN-38是伊立替康盐酸盐(CPT-11) 的生物活性代谢物，为一类拓扑异构酶抑制剂。SN-38引起DNA拓扑异构酶I的抑制最强，剂量依赖性和时间依赖性地抑制DNA的合成，并造成频繁的DNA单链断裂。其中SN-38结构如下式所示：

另一种优选的本发明药物是鹅膏覃碱类药物(alpha-Amanitin)，结构如下式所示。alpha-Amanitin是一种来自毒蘑菇鬼笔鹅蕈(Amanita phalloides)的真菌毒素，二环八肽，能抑制真核RNA聚合酶Ⅱ与RNA聚合酶Ⅲ转录。

另一种优选的本发明药物是苯并二吡咯类抗生素(duocarmycins,CC-1065 等)和其它的环丙基吡咯吲哚-4-酮(cyclopropapyrroloind-4-one,CPI)衍生物。这类化合物是有效的DNA小沟结合-烷基化试剂。环丙苯并吲哚-4-酮 (cyclopropabenzindol-4-one，CBI)类似物的化学结构更稳定，生物活性更高，而且与它们含有天然CPI烷基化亚基的父系化合物相比更容易合成。一个代表性的CBI衍生物是酚羟基保护衍生物CBI，具有弱化的前药毒性和增强的水溶性 (其中CBI-seco类结构通式如下式所示)：

另一种优选的本发明药物是吡咯并苯二氮卓类(pyrrolo[2,1-c][1,4]ben zodi-azepines，PBDs)或者PBD二聚体类(PBD dimers)。PBD是一类由链霉菌产生的天然产物，其独特特性在于能够在DNA小沟，确切是在嘌呤-鸟嘌呤-嘌呤序列处，形成非扭曲的共价加和物。应用PBD作为部分小分子策略靶向锁定DNA 序列以及作为新型的抗癌和抗菌药物引起了越来越多的兴趣。应用一个柔性碳链连接两个PBD单元的C8/C8'的羟基基团，所得的二聚体具有增强的生物活性。 PBD二聚体被认为是可以产成序列选择性的DNA损伤，例如倒序的5'-Pu-GATC-P y-3'链间交联，从而导致其生物活性。这些化合物已被证明是高效的细胞毒性药物，可作为抗体药物偶联物的备选药物。

另一种优选的本发明药物是PNU-159682衍生物，PNU-159682是 Nemorubicin在人肝微粒体中的主要活性代谢产物，与MMDX和阿霉素相比，活性提高3000倍。

另一方面，药物并不仅仅局限于上述提到的类别，还包括所有可用于抗体药物偶联物的药物。并且尤其是那些能够通过与接头的酰胺键来配位，如通过具有碱性胺基(一级胺或二级胺)来配位的细胞毒素，例如上文中所示的细胞毒素D1-D14的结构。

连接子

按照在细胞内药物释放的机制，“连接子”或“抗体药物偶联物的连接子”可被分为两类：不可断裂连接子和可断裂连接子。

对于含有不可断裂连接子的抗体药物偶联物，其药物释放机制为：偶联物与抗原结合并被细胞内吞后，抗体在溶酶体中被酶解，释放出由小分子药物，连接子，和抗体氨基酸残基共同组成的活性分子。由此带来的药物分子结构改变并不减弱其细胞毒性，但由于活性分子是带电荷的(氨基酸残基)，从而导致其不能渗入邻近细胞。因此，此类活性药物不能杀死邻近不表达靶向抗原(抗原阴性细胞)的肿瘤细胞(旁观者效应,bystandereffect)。

可断裂连接子，顾名思义，可以在目标细胞内断裂并释放出活性药物(小分子药物本身)。可断裂连接子可分为两个主要的类别：化学不稳定连接子和酶不稳定连接子。化学不稳定连接子可以由于血浆和细胞质性质的不同而选择性的断裂。这样的性质包括pH值，谷胱甘肽浓度等。对pH值敏感的连接子，通常又称为酸断裂连接子。这样的连接子在血液的中性环境下相对稳定 (pH7.3-7.5)，但是在弱酸性的内涵体(pH5.0-6.5)和溶酶体(pH4.5-5.0)内将会被水解。第一代的抗体药物偶联物大多应用这类连接子，例如腙，碳酸酯，缩醛，缩酮类。由于酸断裂连接子有限的血浆稳定性，基于此类连接子的抗体药物偶联物通常具有较短的半衰期(2-3天)。这种较短的半衰期在一定程度上限制了pH敏感连接子在新一代抗体药物偶联物中的应用。

对于谷胱甘肽敏感的连接子，又称二硫键连接子。药物释放是基于细胞内谷胱甘肽的高浓度(毫摩尔范围)与血液中相对较低的谷胱甘肽浓度(微摩尔范围)差异引起的。对于肿瘤细胞而言尤其如此，其低含氧量导致还原酶的活性增强，因而导致更高的谷胱甘肽浓度。二硫键具有热力学稳定性，因此在血浆中具有较好的稳定性。

酶不稳定连接子，如肽连接子，能够更好地控制药物释放。肽连接子能够被溶酶体内蛋白酶，如组织蛋白酶(Cathepsin B)或纤溶酶(在一些肿瘤组织中此类酶含量增加)，有效地切断。这种肽连接被认为在血浆循环中非常稳定，这是因为细胞外不合宜的pH值及血清蛋白酶抑制剂导致蛋白酶通常不具备活性。鉴于较高的血浆稳定性和良好的细胞内断裂选择性和有效性，酶不稳定连接子被广泛用做抗体药物偶联物的可断裂连接子。典型的酶不稳定连接子包括 Val-Cit(VC),Phe-Lys等。

自释放连接子一般嵌合在可断裂连接子与活性药物之间，或者本身就是可断裂连接子的一部分。自释放连接子的作用机制是：当可断裂连接子在适宜的条件下断裂后，自释放连接子能够自发地进行结构重排，进而释放与之连接的活性药物。常见的自杀式连接子包括对氨基苄醇类(PAB)和β-葡萄糖醛酸苷类 (β-Glucuronide)等。

本发明提供了连接子或偶联试剂，包含二芳硫基马来酰亚胺单元和一个偶联基团。二芳硫基马来酰亚胺单元用于交联抗体链间的巯基基团(还原后)，而偶联基团用于与小分子药物或药物-连接子单元偶联。由于该二芳硫基马来酰亚胺单元与抗体中的开放半胱氨酸-半胱氨酸二硫键的两个硫原子的二齿结合 (bidentate binding)，因此这些ADC是均质的并比含有单齿接头的ADC具有更强的稳定性。因此它们将具有增长的体内半衰期，减少全身性释放的细胞毒素的量，并且比具有单齿接头的ADC更加安全的药物性质。

在另一个方面，所产生的药物-连接子单元通过该连接子与抗体偶联，生成部分链间交联的偶联物。与传统的抗体药物偶联物相比，应用本发明方法制备的抗体药物偶联物的药物/抗体比值(DAR)分布更窄，从而大幅提升了产品均一性及药理学特性均一性。该抗体药物偶联物可用于靶向输送药物到达目标细胞群体，例如肿瘤细胞。抗体药物偶联物可以特异性的与细胞表面蛋白结合，所产生的结合物随即被细胞内吞。在细胞内，药物以活性药物的方式释放出来产生功效。抗体包括嵌合抗体，人源化抗体，人抗体；可与抗原结合的抗体片段；或者抗体Fc融合蛋白；或者蛋白。“药物”是高活性药物(见定义部分)，在某种情况下，药物可以是聚乙二醇。

连接子-药物缀合物

在本发明中，连接子-药物缀合物包括式Ic所示的取代马来酰亚胺类连接子- 药物缀合物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物；

其中，

R为X或ArS-，

X选自下组：卤素，优选为溴或碘；

L₂为化学键或AA-PAB结构；其中，AA为二肽或三肽或四肽片断(即2-4个氨基酸通过肽键连接形成的片段)，PAB为对-氨基苄基氨甲酰基；

CTD为通过酰胺键键合于L₂的细胞毒类小分子药物和/或治疗自身免疫疾病和抗炎症的药物。

典型地，本发明中，所述式Ic化合物选自下组：

靶向GPC3的抗体

在本发明中，一类优选的ADC中，抗体部分为靶向GPC3(抗GPC3)的抗体。

本发明提供一种针对GPC3的高特异性和高亲和力的抗体，其包括重链和轻链，所述重链含有重链可变区(VH)氨基酸序列，所述轻链含有轻链可变区(VL) 氨基酸序列。

优选地，重链可变区(VH)氨基酸序列和轻链可变区(VL)氨基酸序列的各自 CDR选自下组：

a1)SEQ ID No.:2：VH-CDR1，SYGIN；

a2)SEQ ID No.:4：VH-CDR2，WISAYNGNTNYAQKLQG；

a3)SEQ ID No.:6：VH-CDR3，GSGLLPRIGGY；

a4)SEQ ID No.:8：VL-CDR1，RGDSLRTFYAT；

a5)SEQ ID No.:10：VL-CDR2，RKNNRPS；

a6)SEQ ID No.:12：VL-CDR3，NSRDSSGDHLV。

a7)上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的具有GPC3结合亲和力的序列。

在另一优选例中，所述经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸序列所形成的序列优选为同源性为至少80％，较佳地至少85％，更佳地至少为90％，最佳地至少95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列。

典型地，本发明提供了一种靶向GPC3(抗GPC3)的抗体，所述抗体具有：本发明的重链可变区；和/或本发明的轻链可变区；

典型地，这些优选的抗体具有以下CDR区：

其中，所述抗体的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：

SEQ ID No.:2所示的VH-CDR1；

SEQ ID No.:4所示的VH-CDR2；和

SEQ ID No.:6所示的VH-CDR3；

其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留TRAILR2结合亲和力的衍生序列；

所述抗体的轻链可变区包括以下三个的互补决定区CDR：

SEQ ID No.:8所示的VL-CDR1；

SEQ ID No.:10所示的VL-CDR2；和

SEQ ID No.:12所示的VL-CDR3；

上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的具有TRAILR2结合亲和力的衍生序列。

优选地，所述的靶向GPC3(抗GPC3)抗体具有以下骨架区：

较佳地，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:30；和/或所述的抗体的轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:32。

在另一优选例中，所述抗体的重链可变区(VH)氨基酸序列为如SEQ ID NO.30所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述抗体的轻链可变区(VL)氨基酸序列为如SEQ ID NO: 32所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述抗体重链可变区的氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并与SEQ ID No.30所示的氨基酸序列具有至少80％同源性或序列相同性的衍生序列。

在另一优选例中，所述抗体轻链可变区的氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并与SEQ ID No.32所示的氨基酸序列具有至少80％同源性或序列相同性的衍生序列。

较佳地，所述抗体的重链的氨基酸序列为SEQ ID NO:34；和/或所述的抗体的轻链的氨基酸序列为SEQ ID NO:36。

在另一优选例中，所述抗体重链的氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并与SEQ ID No.34所示的氨基酸序列具有至少80％同源性或序列相同性的衍生序列。

在另一优选例中，所述抗体轻链的氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并与SEQ ID No.36所示的氨基酸序列具有至少80％同源性或序列相同性的衍生序列。

在具体的实施方式中，所述同源性或序列相同性可以是80％以上，优选90％以上，更优选95％-98％，最优选99％以上。

本领域普通技术人员公知的测定序列同源性或相同性的方法包括但不限于：计算机分子生物学(Computational Molecular Biology)，Lesk，A.M.编，牛津大学出版社，纽约，1988；生物计算：信息学和基因组项目 (Biocomputing:Informatics and GenomeProjects)，Smith，D.W.编，学术出版社，纽约，1993；序列数据的计算机分析(ComputerAnalysis of Sequence Data)，第一部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编，HumanaPress，新泽西，1994；分子生物学中的序列分析(Sequence Analysis in MolecularBiology)，von Heinje，G.，学术出版社，1987和序列分析引物(Sequence AnalysisPrimer)，Gribskov，M. 与Devereux，J.编M Stockton Press，纽约，1991和Carillo，H.与Lipman，D.， SIAM J.Applied Math.，48:1073(1988)。测定相同性的优选方法要在测试的序列之间得到最大的匹配。测定相同性的方法编译在公众可获得的计算机程序中。优选的测定两条序列之间相同性的计算机程序方法包括但不限于：GCG程序包(Devereux，J.等，1984)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S，F. 等，1990)。公众可从NCBI和其它来源得到BLASTX程序(BLAST手册， Altschul，S.等，NCBI NLM NIH Bethesda，Md.20894；Altschul，S.等，1990)。熟知的Smith Waterman算法也可用于测定相同性。

本发明上述内容中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量，优选为不超过初始氨基酸序列总氨基酸数量的40％，更优选为不超过35％，更优选为1-33％，更优选为5-30％，更优选为10-25％，更优选为15-20％。

本发明上述内容中，更优选地，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量，可以是1-20个，优选1-10个，更优选为1-7个，又更优选为1-5个，又更优选为1-3个，最优选为1-2个。

在另一优选例中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量为1个、2 个、3个、4个、5个、6个或7个。

在另一优选例中，所述经过添加、缺失、修饰和/或取代的至少一个氨基酸具有结合GPC3抗原的活性。

在本发明中，所述抗体选自：动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、全人抗体或其组合。

本发明所述抗体可以是双链或单链抗体，并且可以是选自动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体，更优选为人源化抗体、人-动物嵌合抗体(如人-鼠嵌合抗体)，更优选为全人抗体。

本发明所述抗体衍生物可以是单链抗体、和/或抗体片段，如：Fab、Fab'、(Fab')2或该领域内其他已知的抗体衍生物等，以及IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM抗体或其他亚型的抗体中的任意一种或几种。

其中，所述动物优选为哺乳动物，如鼠。

本发明抗体可以是靶向人GPC3的嵌合抗体、人源化抗体、CDR嫁接和/或修饰的抗体。

更优选地，所述的靶向GPC3(抗GPC3)抗体为GPC3-6，该抗体与GPC3 抗原特异性结合，结合活性信息见实施例2。

核酸

本发明还提供一种核酸，其编码上述的分离的蛋白质或抗GPC3的抗体的重链、重链可变区或轻链、轻链可变区。

较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:29 所示。

较佳地，编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:31 所示。

较佳地，编码所述重链的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:33所示。

较佳地，编码所述轻链的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:35所示。

所述核酸的制备方法为本领域常规的制备方法，较佳地，包括以下的步骤：通过基因克隆技术获得编码上述蛋白质的核酸分子，或者通过人工全序列合成的方法得到编码上述蛋白质的核酸分子。

本领域技术人员知晓，编码上述蛋白质的氨基酸序列的碱基序列可以适当引入替换、缺失、改变、插入或增加来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对编码该蛋白序列基因的一个或多个碱基在保持抗体活性范围内进行替换、缺失或增加来制得。

载体

本发明还提供一种包含所述核酸的重组表达载体。

其中所述重组表达载体可通过本领域常规方法获得，即：将本发明所述的核酸分子连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体为本领域常规的各种载体，只要其能够容载前述核酸分子即可。所述载体较佳地包括：各种质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等。

本发明还提供一种包含上述重组表达载体的重组表达转化体。

其中，所述重组表达转化体的制备方法为本领域常规的制备方法，较佳地为：将上述重组表达载体转化至宿主细胞中制得。所述的宿主细胞为本领域常规的各种宿主细胞，只要能满足使上述重组表达载体稳定地自行复制，且所携带所述的核酸可被有效表达即可。较佳地，所述宿主细胞为E.coli TG1或E.coli BL21细胞(表达单链抗体或Fab抗体)，或者HEK293或CHO细胞(表达全长IgG 抗体)。将前述重组表达质粒转化至宿主细胞中，即可得本发明优选的重组表达转化体。其中所述转化方法为本领域常规转化方法，较佳地为化学转化法，热激法或电转法。

抗体偶联物

本发明还提供了基于本发明抗体的抗体偶联药物(antibody-drug conjugate，ADC)。

典型地，所述抗体偶联药物包括所述抗体、以及效应分子，所述抗体与所述效应分子偶联，并优选为化学偶联。其中，所述效应分子优选为具有治疗活性的药物。此外，所述效应分子可以是毒蛋白、化疗药物、小分子药物或放射性核素中的一种或多种。

本发明抗体与所述效应分子之间可以是通过偶联剂进行偶联。所述偶联剂的例子可以是非选择性偶联剂、利用羧基的偶联剂、肽链、利用二硫键的偶联剂中的任意一种或几种。所述非选择性偶联剂是指使效应分子和抗体形成共价键连接的化合物，如戊二醛等。所述利用羧基的偶联剂可以是顺乌头酸酐类偶联剂(如顺乌头酸酐)、酰基腙类偶联剂(偶联位点为酰基腙)中的任意一种或几种。

抗体上某些残基(如Cys或Lys等)用于与多种功能基团相连，其中包括成像试剂(例如发色基团和荧光基团)，诊断试剂(例如MRI对比剂和放射性同位素)，稳定剂(例如乙二醇聚合物)和治疗剂。抗体可以被偶联到功能剂以形成抗体- 功能剂的偶联物。功能剂(例如药物，检测试剂，稳定剂)被偶联(共价连接)至抗体上。功能剂可以直接地、或者是通过接头间接地连接于抗体。

抗体可以偶联药物从而形成抗体药物偶联物(ADCs)。典型地，ADC包含位于药物和抗体之间的接头。接头可以是可降解的或者是不可降解的接头。可降解的接头典型地在细胞内环境下容易降解，例如在目标位点处接头发生降解，从而使药物从抗体上释放出来。合适的可降解的接头包括，例如酶降解的接头，其中包括可以被细胞内蛋白酶(例如溶酶体蛋白酶或者内体蛋白酶)降解的含有肽基的接头，或者糖接头例如，可以被葡糖苷酸酶降解的含葡糖苷酸的接头。肽基接头可以包括，例如二肽，例如缬氨酸-瓜氨酸，苯丙氨酸-赖氨酸或者缬氨酸-丙氨酸。其它合适的可降解的接头包括，例如，pH敏感接头(例如pH小于 5.5时水解的接头，例如腙接头)和在还原条件下会降解的接头(例如二硫键接头)。不可降解的接头典型地在抗体被蛋白酶水解的条件下释放药物。

连接到抗体之前，接头具有能够和某些氨基酸残基反应的活性反应基团，连接通过活性反应基团实现。巯基特异性的活性反应基团是优选的，并包括：例如马来酰亚胺类化合物，卤代酰胺(例如碘、溴或氯代的)；卤代酯(例如碘、溴或氯代的)；卤代甲基酮(例如碘、溴或氯代)，苄基卤代物(例如碘、溴或氯代的)；乙烯基砜，吡啶基二硫化物；汞衍生物例如3,6-二-(汞甲基)二氧六环，而对离子是醋酸根、氯离子或者硝酸根；和聚亚甲基二甲基硫醚硫代磺酸盐。接头可以包括，例如，通过硫代丁二酰亚胺连接到抗体上的马来酰亚胺。

药物可以是任何细胞毒性，抑制细胞生长或者免疫抑制的药物。在实施方式中，接头连接抗体和药物，而药物具有可以和接头成键的功能性基团。例如，药物可以具有可以和连接物成键的氨基，羧基，巯基，羟基，或者酮基。在药物直接连接到接头的情况下，药物在连接到抗体之前，具有反应的活性基团。

有用的药物类别包括，例如，抗微管蛋白药物、DNA小沟结合试剂、DNA复制抑制剂、烷化试剂、抗生素、叶酸拮抗物、抗代谢药物、化疗增敏剂、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱等。特别有用的细胞毒性药物类的例子包括，例如，DNA小沟结合试剂、DNA烷基化试剂、和微管蛋白抑制剂、典型的细胞毒性药物包括、例如奥瑞他汀(auristatins)、喜树碱(camptothecins)、多卡霉素 /倍癌霉素(duocarmycins)、依托泊甙(etoposides)、美登木素(maytansines) 和美登素类化合物(maytansinoids)(例如DM1和DM4)、紫杉烷(taxanes)、苯二氮卓类(benzodiazepines)或者含有苯二氮卓的药物(benzodiazepinecontaining drugs)(例如吡咯并[1,4]苯二氮卓类(PBDs)，吲哚啉苯并二氮卓类(indolinobenzodiazepines)和噁唑烷并苯并二氮卓类 (oxazolidinobenzodiazepines))和长春花生物碱(vinca alkaloids)。

在本发明中，药物-接头可以用于在一个简单步骤中形成ADC。在其它实施方式中，双功能连接物化合物可以用于在两步或多步方法中形成ADC。例如，半胱氨酸残基在第一步骤中与接头的反应活性部分反应，并且在随后的步骤中，接头上的功能性基团与药物反应，从而形成ADC。

通常，选择接头上功能性基团，以利于特异性地与药物部分上的合适的反应活性基团进行反应。作为非限制性的例子，基于叠氮化合物的部分可以用于特异性地与药物部分上的反应性炔基基团反应。药物通过叠氮和炔基之间的 1,3-偶极环加成，从而共价结合于接头。其它的有用的功能性基团包括，例如酮类和醛类(适合与酰肼类和烷氧基胺反应)，膦(适合与叠氮反应)；异氰酸酯和异硫氰酸酯(适合与胺类和醇类反应)；和活化的酯类，例如N-羟基琥珀酰亚胺酯(适合与胺类和醇类反应)。这些和其它的连接策略，例如在《生物偶联技术》，第二版(Elsevier)中所描述的，是本领域技术人员所熟知的。本领域技术人员能够理解，对于药物部分和接头的选择性反应，当选择了一个互补对的反应活性功能基团时，该互补对的每一个成员既可以用于接头，也可以用于药物。

本发明还提供了制备ADC的方法，可进一步地包括：将抗体与药物-接头化合物，在足以形成抗体偶联物(ADC)的条件下进行结合。

在某些实施方式中，本发明方法包括：在足以形成抗体-接头偶联物的条件下，将抗体与双功能接头化合物进行结合。在这些实施方式中，本发明方法还进一步地包括：在足以将药物部分通过接头共价连接到抗体的条件下，将抗体接头偶联物与药物部分进行结合。

在一些实施方式中，抗体药物偶联物ADC如下分子式所示：

其中：

Ab是抗体，

LU是接头；

D是药物；

而且下标p是选自1到8的值。

本发明中的抗体偶联物还包括其药学上可接受的盐或溶剂化合物。

抗体-药物偶联物

本发明提供的抗体药物偶联物由抗体、连接子、连接子和药物组成，所述连接子是可断裂连接子组合或不可断裂连接子。

抗体是球状蛋白，含有一系列氨基酸位点可用于偶联药物-连接子。由于其三级和四级结构，只有溶剂可及的氨基酸可供偶联。事实上，高收率的偶联通常发生在赖氨酸残基的ε-氨基基团或半胱氨酸残基的巯基基团上。

抗体蛋白表面的大量赖氨酸侧链导致大量的位点可供药物偶联，从而导致生成的抗体药物偶联物是混合物，含有不同的药物偶联数量(药物/抗体比值， DAR)和偶联位点。

本发明提供的偶联产品，尽管仍然是混合物，但与传统方式偶联得到的抗体药物偶联物相比，其DAR分布范围很窄。其平均DAR值接近4，接近最佳抗体药物偶联物平均DAR值(2-4)范围。此外，偶联产品极少或不含有裸抗(DAR＝0)，这一组分对细胞毒杀不起作用。同时，偶联产品也不含有重度偶联产品(DAR＝8), 这一组分在体内的清除速度很快，相对于低DAR的组分而言。因此，本发明提供的抗体药物偶联物产品非均一性得到很大的改善。

在本发明中，一类优选的ADC中，抗体部分为GPC3的抗体。所述抗体选自：动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、或其组合。

优选地，所述的抗GPC3抗体为GPC3-6。对应的抗体-药物偶联物为： GPC3-6-BL20E。

本发明中的抗体-药物偶联物还包括其药学上可接受的盐或溶剂化合物。

抗体-药物偶联物的制备方法

抗体药物偶联物制备路线如下所示。抗体链间二硫键被还原，产生2n个(如 4个)巯基基团。本发明的取代马来酰亚胺类连接子-药物缀合物(式Ic化合物) 与还原后的抗体巯基交联，生成相应的抗体药物偶联物，其中该抗体药物偶联物存在如下所示中的一种或二种形式：

式中，R、Ar'、L1、L2和CTD如上所述。

一种典型的制备方法包括：将抗体原液用反应缓冲液稀释至2-10mg/mL，加入140-200倍过量摩尔比的二硫苏糖醇(DTT)，或加入6.0-20倍过量摩尔比的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)，反应液于10-35℃搅动2-48小时；在此所述反应缓冲液可以是按以下比例制备的缓冲液：50mM磷酸二氢钾-氢氧化钠 (KH₂PO₄-NaOH)/150mM氯化钠(NaCl)/1mM二乙基三胺五乙酸(DTPA)，pH 6-9； 50mM磷酸氢二钠-柠檬酸/150mM氯化钠(NaCl)/1mM二乙基三胺五乙酸(DTPA)， pH 6-9；50mM硼酸-硼砂/150mM氯化钠(NaCl)/1mM二乙基三胺五乙酸(DTPA)，pH 6-9；50mM组氨酸-氢氧化钠/150mM氯化钠(NaCl)/1mM二乙基三胺五乙酸 (DTPA)，pH 6-9和PBS/1mM二乙基三胺五乙酸(DTPA)，pH 6-9。

将上述反应液冷至0-10℃，若采用DTT还原，需在还原反应完成后过脱盐柱或超滤除去过量的DTT，再加入取代马来酰亚胺类化合物(预先10mg/ml溶在乙腈(ACN)、二甲亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)或二乙基乙酰胺(DMA)中)，并保证反应液中有机溶剂的体积占比不超过15％，偶联反应于0-37℃搅动2-4小时。若采用TCEP还原，也可不需除去剩余TCEP，直接加入取代马来酰亚胺类化合物进行偶联。

采用脱盐柱将偶联反应混合物用琥珀酸钠/NaCl缓冲液或组氨酸-醋酸/蔗糖凝胶过滤纯化，根据UV280紫外吸收值收集出峰样品。或超滤数遍。然后过滤除菌，所得产物低温保存。优选温度为-100—60℃，过滤装置的孔径优选 0.15-0.3微米。

所得抗体药物偶联物的药物抗体偶联比(DAR)较为均一。采用本发明不同取代马来酰亚胺连接头(连接子片断)时，ADC产物均一性非常高(通常DAR优势产物(如DAR约为4)占所有ADC的至少60％，至少70％，至少80％，至少90％或更高)。对于DAR有一定差别的ADC，如需要获得均一性更好的样品，可进一步利用但不限于以下方法进行分离纯化：疏水作用层析方法(HIC)、分子排阻色谱法(SEC)、离子交换层析(IEC)。

本发明提供的偶联方法，将毒素小分子通过特定连接物偶联到靶向GPC3抗体上，在不改变抗体亲和性的基础上大幅提高抗体对肿瘤细胞的杀伤力。

药物组合物和施用方法

由于本发明提供的抗体-药物偶联物，可以靶向瞄准特殊的细胞群体，与细胞表面特异蛋白(抗原)结合，从而通过结合物内吞或药物渗入使得药物以活性形式释放到细胞内，因此，本发明的抗体-药物偶联物可以用于治疗目标疾病，上面提到的抗体-药物偶联物可以以治疗有效量，通过合适的途径给予受试者(例如人)。需要治疗的受试者可以是有风险，或怀疑患有与特定抗原的活性或表达量有关病症的患者。这样的患者可以通过常规体检来鉴定。

常规方法，已知的医学领域的普通技术人员，可以用于施用药物组合物给受试者，这取决于疾病的要治疗的类型或疾病的部位。此组合物还可以通过其它常规途径，例如，口服，肠胃外给药，通过吸入喷雾，局部，直肠，经鼻，口腔，阴道或通过植入进行给药。本文所用的术语“肠胃外”包括皮下，皮内，静脉内，肌内，关节内，动脉内，滑膜内，胸骨内，鞘内，病灶内和颅内注射或输注技术。此外，它可以施用到通过施用可注射的贮库途径，例如使用1-， 3-，或6个月的贮库可注射或可生物降解的材料和方法的主题。

注射组合物可以含有各种载体如植物油，二甲基乙酰胺 (dimethylactamide)，二甲基甲酰胺，乳酸乙酯，碳酸乙酯，肉豆蔻酸异丙酯，乙醇，多元醇(甘油，丙二醇，液体聚乙二醇，等等)。对于静脉内注射，水溶性抗体可以通过点滴方法，由此含有抗体和生理上可接受的赋形剂的药物制剂输注给药。生理上可接受的赋形剂可以包括，例如，5％葡萄糖，0.9％盐水，林格溶液或其它合适的赋形剂。肌内制剂，例如，抗体的一个合适的可溶盐形式的无菌制剂，可以溶解和施用的药用赋形剂诸如水换注射液，0.9％盐水，或5％葡萄糖溶液。

当用本发明的抗体-药物偶联物治疗时，可以通过本领域常规的方法进行递送。例如，它可以通过使用脂质体，水凝胶，环糊精，生物可降解的纳米胶囊，或生物粘附性微球被引入到细胞中。或者，所述核酸或载体可在本地通过直接注射或通过使用输注泵递送。其它方法包括通过使用缀合物和生物可降解的聚合物的各种运输和载体系统。

本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的抗体-药物偶联物以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成溶液剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。

本发明所述的抗体-药物偶联物的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的抗体偶联物的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的抗体-药物偶联物每天以约0.0001mg-50mg/kg动物体重(较佳的 0.001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

用于局部给药的本发明化合物的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。

本发明化合物可以单独给药，或者与其他药学上可接受的治疗剂联合给药。

使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明抗体偶联物适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg 体重的人而言，日给药剂量通常为1～2000mg，优选5～500mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

检测用途和试剂盒

本发明的抗体或其ADC可用于检测应用，例如用于检测样本，从而提供诊断信息。

本发明中，所采用的样本(样品)包括细胞、组织样本和活检标本。本发明使用的术语“活检”应包括本领域技术人员已知的所有种类的活检。因此本发明中使用的活检可以包括例如肿瘤的切除样本、通过内窥镜方法或器官的穿刺或针刺活检制备的组织样本。

本发明中使用的样本包括固定的或保存的细胞或组织样本。

本发明还提供了一种指含有本发明的抗体(或其片段)的试剂盒，在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。在优选例中，本发明的抗体可以固定于检测板。

本发明的主要优点

(1)本发明提供的新型连接子，可通过简单的化学方法与靶向GPC3抗体偶联，与传统的偶联方式相比，应用这种连接子得到的GPC3抗体药物偶联物DAR 值分布非常窄，因此生成的产品均一性高，获得的交联物单一分布的组份(DAR 为4)占比80％以上。

(2)本发明提供的GPC3抗体药物偶联物，裸抗和低交联度的ADC占比几乎为零(质谱检测不出DAR为0和1的组份)。

(3)申请人通过大量的实验证明，本发明提供的GPC3抗体药物偶联物，在治疗肿瘤方面具有一定安全性和有效性。偶联后乙二醇所赋予的亲水性可以用来调节生物分子特性；交联物的体外肿瘤细胞增殖抑制活性较传统mcVC-PAB 交联生物学活性、药物代谢稳定性、安全性等成药性质方面有所提高或保持。

(4)本发明提供的偶联方法与现有偶联方法相比，本发明的基于马来酰亚胺的二硫链桥接交联试剂的优点包括：具有较快的交联速度，交联反应时间通常在2-4小时以内便可反应完毕。

下面的具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如(Sambrook和Russell等人，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning-A LaboratoryManual)(第三版)(2001)CSHL出版社) 中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应发理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。

实施例1、式Ic所示的化合物的合成与制备

本发明第一方面中列出的式Ia所代表的取代马来酰胺类连接子片断分子可通过方案一中的方法合成，通过n甘醇与溴乙酸叔丁酯反应获得中间体A，后与取代的硝基氟苯进行芳香亲核取代得到中间体B。此外，中间体B也可通过对甲苯磺酸酯保护的中间体F与取代的硝基氟酚反应获得。中间体B中硝基基团还原为氨基得到中间体C，后与2,3-二溴马来酸酐环合反应得中间体D，后再与芳基硫酚进行取代反应后获得连接子片断分子E。通过与带有二肽/三肽-PAB细胞毒药物连接子进行缩合，可获得系列分子F。反应路线与具体实例举例如下：

1.1化合物Ic-1的合成

1.1.1中间体A-1(步骤a)

将三甘醇(92g,613mmol)溶于tBuOH(200ml)中。冰浴下加入KOtBu (22.91g,204mmol)搅拌半小时，氩气保护下，滴加溴乙酸叔丁酯(39.8g,204 mmol)在tBuOH(40ml)的溶液，室温搅拌过夜。第二天，TLC检测反应结束。旋蒸除去叔丁醇后，剩余物加入400ml二氯甲烷，有机相用400ml水洗，该水相用300ml二氯甲烷萃取一次，合并有机相后用饱和食盐水洗一次，无水硫酸钠干燥，旋蒸蒸干。粗产物经石油醚：乙酸乙酯＝3:1-->1:1柱层析，得中间体A-1(24 g,44.5％yield)，为黄色油状物。

1.1.2中间体B-1(步骤b)

在250ml圆底瓶中将中间体A-1(4g,15.13mmol),三乙胺(2.53ml,18.16 mmol)和二甲胺基吡啶(0.370g,3.03mmol)溶于100毫升分子筛干燥二氯甲烷中搅拌，冰浴下分批加入对甲基苯磺酰氯(3.17g,16.65mmol)，移至室温氩气保护搅拌过夜。

将反应体系加入100ml二氯甲烷萃取，用200ml 1N稀盐酸洗一次，200ml水洗两次，200ml饱和盐水洗一次，无水硫酸钠干燥，旋蒸蒸干有机相。用200-300 目硅胶装柱，PE:EA＝5:1-2:1洗脱进行柱层析分离。旋蒸蒸干得中间体B-1(2.8g, 收率44.2％)。

1.1.3中间体C-1(步骤c)

将中间体B-1(3g,7.19mmol)，4-硝基苯酚(1g,7.19mmol)，溶于20ml DMF 中，加入K₂CO₃(1.9g,14.4mmol)，加热至100度搅拌5小时。旋蒸蒸干溶剂，加入200ml二氯甲烷溶解，萃取，分别用200ml 1N稀盐酸，200ml水和200ml饱和盐水洗各洗一次，无水硫酸钠干燥，旋蒸蒸干，用200-300目硅胶装柱，PE： EA＝5:1-3:1洗脱柱层析纯化，旋蒸蒸干得中间体C-1(2g,收率72％)。

1.1.4中间体D-1(步骤d)

将中间体B-1(6g,15.57mmol)溶于100毫升无水乙醇中并且将溶液，加入装有10％Pd-C 1.2g的反应瓶中。加氢反应6小时(1atm,38℃)，TLC检测反应完全。硅藻土过滤反应液，滤饼用乙醇淋洗，滤液旋蒸蒸干，得中间体D-1(4.8g, 87％yield)为黄色油状物。

1.1.5化合物E-1(步骤e)

称取中间体D-1(1.0g,2.81mmol)于平行反应管中，氮气保护下加入AcOH (3ml)，搅拌溶解。后慢慢加入3,4-二溴马来酸酐(0.72g,2.81mmol)。氮气保护下加热到110℃搅拌过夜。TLC检测反应。将反应液冷却到室温后，旋蒸蒸干溶剂，并加入甲苯旋蒸蒸干两次，得棕色油状化合物E-1。无需纯化直接用于下步反应。

1.1.6化合物F-1的合成(步骤f)

称取化合物E-1(2.0g,3.72mmol)于100毫升圆底瓶中,氮气保护下加入30ml 无水二氯甲烷搅拌溶解。称取4-(N-吗啉甲酰胺)苯硫酚(1.66g,7.45mmol)氮气保护下加入反应液中,溶解后在冰浴下慢慢滴加DIPEA(1.3mL ml,7.45 mmol)，完毕后搅拌5分钟，撤去冰浴。在氮气保护下室温搅拌2小时，TLC检测反应结束。

减压蒸干溶剂后，柱层析(200目～300目硅胶)分离纯化，二氯甲烷装柱和淋洗，然后慢慢加大极性从2％至10％甲醇淋洗，收集蒸干溶剂得橘黄色油状产物F-1(2.2g,72％yield)。LC-MS(M⁺)理论值:821.2，实测值:821.3(ESI,M+H⁺)。

1.1.7化合物G-1(Ic-1)的合成(步骤g)

向100毫升圆底瓶中称入化合物E-9(300mg,0.365mmol)，氮气保护下加入无水DMF(20mL)使其完全溶解后,依次称取HATU(166mg,0.438mmol) 和DIEA(0.127ml,0.730mmol)加入瓶中。室温搅拌15分钟后加入化合物VC- PAB-MMAE(416mg,0.365mmol),氮气保护下室温搅拌过夜。TLC与HPLC 跟踪反应过夜，原料F-1消失。减压蒸干溶剂，做定量分析，后经反相HPLC纯化，得产物为黄色无定形粉末G-1(0.420g,59.7％yield)。LC-MS(M+)理论值:1925.9，实测值:1926.7(ESI,M+H+)。

1.2化合物Ic-2的合成

化合物Ic-2的合成与例1.1中化合物Ic-1的合成步骤相同，只是将步骤c中的 4-硝基苯酚换为2,6-二氟-4-硝基苯酚，得到产物Ic-2为黄色无定形粉末。 LC-MS(M⁺)理论值:1961.9，实测值:1962.7(ESI,M+H⁺)。

1.3化合物Ic-3的合成

化合物Ic-3的合成与例1.1中化合物Ic-1的合成步骤相同，只是将步骤c和f 中的4-硝基苯酚与4-(N-吗啉甲酰胺)苯硫酚分别换为2,6-二氟-4-硝基苯酚与 4-(1,1-二氧化硫代吗啉甲酰胺)苯硫酚，得到产物Ic-3为黄色无定形粉末。 LC-MS(M⁺)理论值:2057.8，实测值:2058.8(ESI,M+H⁺)。

1.4化合物Ic-4的合成

化合物Ic-4的合成与例1.1中化合物Ic-1的合成步骤相同，只是将步骤c中的 4-硝基苯酚换为2-三氟甲基-4-硝基苯酚，得到产物Ic-4为黄色无定形粉末。 LC-MS(M⁺)理论值:1993.9，实测值:1994.9(ESI,M+H⁺)。

1.5化合物Ic-5的合成

化合物Ic-5的合成与例1.1中化合物Ic-1的合成步骤相同，只是将步骤a中的三甘醇换为六甘醇，得到产物Ic-5为黄色无定形粉末。LC-MS(M⁺)理论值: 2093.9，实测值:2094.0(ESI,M+H⁺)。

1.6化合物Ic-6的合成

化合物Ic-6的合成与例1.1中化合物Ic-1的合成步骤相同，只是将步骤c中的 4-硝基苯酚换为3-三氟甲基-4-硝基苯酚，得到产物Ic-6为黄色无定形粉末。 LC-MS(M⁺)理论值:1993.9，实测值:1994.7(ESI,M+H⁺)。

1.7化合物Ic-7的合成

化合物Ic-7的合成与例1.1中化合物Ic-1的合成步骤相同，只是将步骤c与步骤g中的4-硝基苯酚和VC-PAB-MMAE换为2,6-二氟-4-硝基苯酚和 VC-PAB-MMAF，得到产物Ic-7为黄色无定形粉末。LC-MS(M⁺)理论值:1989.9，实测值:1990.9(ESI,M+H⁺)。

实施例2、抗GPC3抗体的制备及其鉴定

本发明GPC3抗体通过下述方法制得：用噬菌体展示抗体库，针对GPC3进行筛选得到人抗GPC3抗体，对其中亲合力好的抗体进行测序鉴定，其序列信息如下：

表2人抗GPC3抗体GPC3-6重链可变区CDR和轻链可变区CDR

表3人抗GPC3抗体GPC3-6重链和轻链框架区(FR 1-4)的序列

注：上表中，aa表示氨基酸序列，nt表示核苷酸序列。

SEQ ID NO:30GPC3-6重链可变区(VH)氨基酸序列120aa

QVHLVQSGAEVQKPGSSVKVSCKASGGTFSSYGINWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGNTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGSGLLPRIGGYWGKGTMVTVSS

SEQ ID NO:29GPC3-6重链可变区(VH)核苷酸序列

CAGGTGCACCTGGTGCAGTCCGGAGCTGAGGTGCAGAAGCCAGGCTCCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCTTCTGGCGGCACATTCTCTTCCTACGGCATCAATTGGGTGAGGCAGGCTCCTGGACAGGGACTGGAGTGGATGGGCTGGATCAGCGCCTACAACGGCAATACAAACTATGCTCAGAAGCTGCAGGGCAGAGTGACCATGACCACAGACACCTCCACAAGCACCGCTTACATGGAGCTGAGGTCTCTGCGGTCCGACGATACCGCCGTGTACTATTGTGCTAGAGGATCTGGACTGCTGCCAAGGATCGGAGGATATTGGGGCAAGGGCACAATGGTGACCGTGAGCTCT

SEQ ID NO:32GPC3-6轻链可变区(VL)氨基酸序列110aa

LSSELTQDPAVSVPLGQTVRITCRGDSLRTFYATWYQQKPGQAPVRVIYRKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGDHLVFGTGTKLTVLG

SEQ ID NO:31GPC3-6轻链可变区(VL)核苷酸序列

CTGTCCAGCGAGCTGACCCAGGATCCTGCTGTGAGCGTGCCCCTGGGACAGACCGTGCGGATCACCTGTCGGGGCGACTCCCTGCGGACCTTCTACGCCACCTGGTACCAGCAGAAGCCTGGCCAAGCCCCCGTCAGGGTGATCTACAGGAAGAACAACCGGCCTAGCGGCATCCCTGACCGGTTCAGCGGCAGCAGCTCCGGCAACACCGCTAGCCTGACCATCACAGGCGCCCAGGCTGAGGACGAGGCTGACTACTACTGTAACTCCCGGGACAGCTCCGGCGACCACCTGGTGTTCGGAACCGGCACCAAGCTGACCGTGCTGGGA

SEQ ID NO:34抗体GPC3-6重链的氨基酸序列450aa

QVHLVQSGAEVQKPGSSVKVSCKASGGTFSSYGINWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGNTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGSGLLPRIGGYWGKGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:33抗体GPC3-6重链的核苷酸序列

CAGGTGCACCTGGTGCAGTCCGGAGCTGAGGTGCAGAAGCCAGGCTCCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCTTCTGGCGGCACATTCTCTTCCTACGGCATCAATTGGGTGAGGCAGGCTCCTGGACAGGGACTGGAGTGGATGGGCTGGATCAGCGCCTACAACGGCAATACAAACTATGCTCAGAAGCTGCAGGGCAGAGTGACCATGACCACAGACACCTCCACAAGCACCGCTTACATGGAGCTGAGGTCTCTGCGGTCCGACGATACCGCCGTGTACTATTGTGCTAGAGGATCTGGACTGCTGCCAAGGATCGGAGGATATTGGGGCAAGGGCACAATGGTGACCGTGAGCTCTGCTAGCACCAAGGGACCATCCGTGTTCCCACTGGCCCCCTCCAGCAAGTCCACCAGCGGAGGAACAGCCGCTCTGGGATGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCAGAGCCCGTGACAGTGAGCTGGAACTCTGGCGCCCTGACCAGCGGAGTGCACACATTTCCCGCCGTGCTCCAGTCTTCCGGCCTGTACTCTCTGAGCTCTGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCTCTCTGGGCACCCAGACATATATCTGCAACGTGAATCACAAGCCAAGCAATACAAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGTCTTGTGATAAGACCCATACATGCCCCCCTTGTCCTGCTCCAGAGCTGCTGGGAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCCAGGACCCCCGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTTAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCTAAGACCAAGCCTAGGGAGGAGCAGTACAACTCTACCTATCGGGTGGTGTCCGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCTAATAAGGCCCTGCCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGAGAGCCACAGGTGTACACACTGCCTCCATCTCGCGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACATGTCTGGTGAAGGGCTTCTATCCTTCCGACATCGCTGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCAGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGACTCCGATGGCAGCTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGATAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTTTCTTGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAATCATTATACACAGAAGAGCCTGTCTCTGTCCCCTGGCAAGTGA

SEQ ID NO:36抗体GPC3-6轻链的氨基酸序列215aa

LSSELTQDPAVSVPLGQTVRITCRGDSLRTFYATWYQQKPGQAPVRVIYRKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGDHLVFGTGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS

SEQ ID NO:35抗体GPC3-6轻链的核苷酸序列

CTGTCCAGCGAGCTGACCCAGGATCCTGCTGTGAGCGTGCCCCTGGGACAGACCGTGCGGATCACCTGTCGGGGCGACTCCCTGCGGACCTTCTACGCCACCTGGTACCAGCAGAAGCCTGGCCAAGCCCCCGTCAGGGTGATCTACAGGAAGAACAACCGGCCTAGCGGCATCCCTGACCGGTTCAGCGGCAGCAGCTCCGGCAACACCGCTAGCCTGACCATCACAGGCGCCCAGGCTGAGGACGAGGCTGACTACTACTGTAACTCCCGGGACAGCTCCGGCGACCACCTGGTGTTCGGAACCGGCACCAAGCTGACCGTGCTGGGACAGCCTAAGGCCGCCCCTAGCGTGACCCTGTTTCCTCCCAGCAGCGAAGAGCTGCAGGCTAACAAGGCCACCCTGGTGTGTCTGATCAGCGATTTCTATCCTGGCGCTGTGACAGTGGCCTGGAAAGCTGACAGCAGCCCCGTGAAGGCTGGCGTGGAGACCACCACACCTAGCAAACAGAGCAACAATAAGTACGCCGCCAGCTCCTACCTCAGCCTGACCCCCGAACAGTGGAAGTCCCATCGGTCCTACAGCTGTCAGGTGACCCACGAGGGCTCCACCGTGGAGAAGACCGTCGCCCCTACCGAGTGTTCCTGA

实施例3、抗GPC3抗体与人GPC3的特异性结合

应用ELISA方法测定抗GPC3抗体对重组人GPC3的相对结合活性。重组人 GPC3蛋白于96孔板中4℃孵育过夜，然后用含1％BSA的PBS于37℃封闭1小时，封闭后用PBST(PBS含0.05％Tween20)洗三次。将抗-GPC3抗体和对照抗体人 IgG1用结合缓冲液(PBS Tween20含0.05％和0.05％BSA)稀释成系列浓度，并与 96孔板中的蛋白37℃孵育1小时，PBST洗三次，然后与过氧化物酶标记的驴抗人(peroxidase-labeled donkey anti-human)IgG(1/20,000稀释，Jackson Immuno Research)37℃孵育1小时，再洗，加入TMB反应，2M H₂SO₄终止反应，酶标仪450nm-620nm测定OD值。图18显示抗GPC3抗体与人GPC3蛋白结合曲线及 EC50。

实施例4、抗GPC3人源化抗体亲和力

基于表面等离子体共振原理，应用Biacore X100系统(Biacore,GE Healthcare)，测定了抗GPC3抗体对人体GPC3的动力学结合活性。

大约6400RU的山羊抗人(Goat anti-human)Fcγ(Jackson Immuno Research，Catalog#109-005-098)通过胺耦合化学偶联到CM5芯片上。抗体被注入流经固定相山羊抗人(goat anti-human)IgG抗体表面。实验缓冲液为 HBS-EP+buffer。不同浓度的人GPC3蛋白(10nM-80nM)被注入到抗体表面。每一次注入循环后，CM5芯片表面再生条件为10mM甘氨酸溶液(pH 1.5)。样品信号减去背景结合信号以后，所得数据用Biacore X100分析软件使用1:1的 Langmuir结合模型，计算Ka、Kd和K_D值，结果见表4。

表4.GPC3-6与人GPC-3的亲和力和动力学参数

克隆#	K<sub>on</sub>(M<sup>-1</sup>S<sup>-1</sup>)	K<sub>off</sub>(S<sup>-1</sup>)	K<sub>D</sub>(M)
				GPC3-6	1.90E+5	7.19E-4	3.77E-9

实施例5、抗体偶联物制备

5.1GPC3-6-BL20E的制备

将靶向GPC3的人源化抗体GPC3-6原液用50mM磷酸二氢钾-氢氧化钠 (KH₂PO₄-NaOH)/150mM氯化钠(NaCl)/1mM二乙基三胺五乙酸(DTPA)，pH 7.4反应缓冲液稀释至5mg/mL，加入10倍过量摩尔比的三(2-羧乙基)膦盐酸盐 (TCEP)，反应液于10℃搅动4小时。

将上述反应液冷至5℃，未经纯化加入适量的二乙基乙酰胺(DMA)，再加入6倍过量摩尔比的化合物Ic-4(10mg/ml预先溶在DMA中)，保证反应体系中 DMA的体积占比不超过10％，于25℃搅动2.5小时进行偶联。

采用脱盐柱将偶联反应混合物用pH 6.0的组氨酸-醋酸/蔗糖凝胶过滤纯化，根据UV280紫外吸收值收集出峰样品。然后经由0.22微米孔径的过滤装置除菌，-80℃保存，所得抗体偶联物命名为GPC3-6-BL20E。

结果如裸抗与对应的抗体偶联物的质谱图谱图16和图17所示，经偶联反应后，形成了抗体偶联物GPC3-6-BL20E，偶联物的分子量与预期值相符，DAR 为约4.0。

实施例6、抗体偶联物生物学活性检测

以下实验中所用的实验材料来源于：MEM培养基、DMEM培养基、 DMEM/F12培养基、RPMI 1640培养基、0.25％胰蛋白酶-EDTA、胎牛血清、100 ×丙酮酸钠、100×青链霉素、购自Gibco公司。磺酰罗丹明B(Sulforhodamine B， SRB)购自Sigma公司。HepG2人肝癌细胞、Huh-7人肝癌细胞、SKOV-3人卵巢癌细胞和MDA-MB-231人乳腺癌细胞获自中国科学院昆明细胞库， MDA-MB-486人乳腺癌细胞、NCI-H1975人肺癌细胞和786-O人肾腺癌细胞获自南京科佰生物科技有限公司，SMMC-7721人肝癌细胞获自上海瑞鹿生物科技有限公司。其他试剂均是分析纯。96孔平底聚苯乙烯(Corning，产品目录号3599)。 Synergy 2酶标仪(Bio-Tek)。

6.1抗体GPC3-6、抗体偶联物GPC3-6-BL20E对肿瘤细胞增殖的作用

在本实施例中，研究了抗体GPC3-6、抗体偶联物GPC3-6-BL20E对肿瘤细胞增殖的作用。

本实施例使用磺酰罗丹明B(SRB)比色法来评价药物抗增殖作用。SRB是一种粉红色阴离子染料，易溶于水，在酸性条件下可特异性地与细胞内组成蛋白质的碱性氨基酸结合；在510nm波长下产生吸收峰，吸光值与细胞量成线性正相关，故可用作细胞数的定量检测。

本实施例选择的细胞系有：HepG2、Huh-7、SMMC-7721人肝癌细胞； MDA-MB-231、MDA-MB-486人乳腺癌细胞；NCI-H1975人肺癌细胞；SKOV-3 卵巢癌细胞和786-O人肾腺癌细胞。

HepG2细胞在含10％胎牛血清的MEM培养基中，SMMC-7721、SKOV-3、 MDA-MB-486细胞在含10％胎牛血清的DMEM培养基中，Huh-7、NCI-H1975、786-O细胞在含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中，MDA-MB-231细胞在含10 ％胎牛血清的DMEM/F12培养基中，于37℃，5％CO₂培养箱中培养至对数生长期，将处于对数生长期的上述细胞分别以2×10³～3×10³个细胞每孔的密度接种至96孔培养板，每孔100μL，培养24小时后，加入不同浓度的药物分别作用4 天或5天，分别以3或4倍稀释制备12个浓度，每个浓度设复孔，并设相应浓度的溶媒对照及无细胞培养基孔。作用结束后，贴壁细胞倾去培养液，加入4℃预冷的三氯乙酸溶液(30％，w/v)100μl，于4℃固定1小时，随后用去离子水冲洗5遍，室温干燥后，每孔加入0.4％(w/v)的SRB染液(Sigma，1％冰乙酸配制) 100μL，室温下孵育染色30min后，用1％冰乙酸冲洗4次，去除未结合的染料，室温晾干。每孔加入10mM Tris溶液100μL，室温下孵育染色15min后，用1 ％冰乙酸冲洗五次洗去未结合的SRB，室温干燥后，每孔加入10mM Tris缓冲液(pH＝10.5)溶解与细胞蛋白结合的染料，采用Synergy 2酶标仪(Bio-Tek)波长510nm和690nm处测定光吸收值(OD值)，并得到A＝OD₅₁₀-OD₆₉₀。

抑制率(％)＝(A对照-A给药)/A对照×100％。

本实验使用抗体GPC3-6和抗体偶联物GPC3-6-BL20E对多种表达GPC3受体的肿瘤细胞进行了体外细胞培养增殖作用的研究。图1-8所示，抗体偶联物 GPC3-6-BL20E处理均能产生抗肿瘤细胞增殖活性，且比未偶联的抗GPC3抗体 GPC3-6更为有效的抑制表达GPC3受体的细胞增殖。

6.2流式细胞术分析细胞表面GPC3受体的表达

通过流式细胞术分析细胞表面GPC3受体的表达，所用抗GPC3受体的抗体为GPC3-6、GPC3-6-BL20E，所用细胞为体外细胞增殖测定生物活性实验中的细胞系(具体见上述6.1中所述)。具体试验如下：GPC3-6(20μg/mL)、 GPC3-6-BL20E(20μg/mL)及人IgG(阴性对照)分别与细胞(每份样品2×10⁶个细胞)4℃孵育40分钟，细胞经过洗涤后，加入FITC标记的二抗，冰上避光放置40分钟，流式细胞仪测定荧光强度。图9-15所示，灰色为细胞与IgG结合的荧光值，实线为细胞与GPC3-6-BL20E结合的荧光值，虚线为细胞与抗GPC3抗体GPC3-6结合的荧光值。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海药物研究所

南京维立志博生物科技有限公司

<120> 靶向GPC3的抗体-药物偶联物及其制备方法和用途

<130> P2018-0834

<160> 36

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

tcctacggca tcaat 15

<210> 2

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

Ser Tyr Gly Ile Asn

1 5

<210> 3

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

tggatcagcg cctacaacgg caatacaaac tatgctcaga agctgcaggg c 51

<210> 4

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

ggatctggac tgctgccaag gatcggagga tat 33

<210> 6

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

Gly Ser Gly Leu Leu Pro Arg Ile Gly Gly Tyr

1 5 10

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 7

cggggcgact ccctgcggac cttctacgcc acc 33

<210> 8

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 8

Arg Gly Asp Ser Leu Arg Thr Phe Tyr Ala Thr

1 5 10

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 9

aggaagaaca accggcctag c 21

<210> 10

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 10

Arg Lys Asn Asn Arg Pro Ser

1 5

<210> 11

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 11

aactcccggg acagctccgg cgaccacctg gtg 33

<210> 12

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 12

Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asp His Leu Val

1 5 10

<210> 13

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 13

caggtgcacc tggtgcagtc cggagctgag gtgcagaagc caggctccag cgtgaaggtg 60

agctgcaagg cttctggcgg cacattctct 90

<210> 14

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 14

Gln Val His Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Gln Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser

20 25 30

<210> 15

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 15

tgggtgaggc aggctcctgg acagggactg gagtggatgg gc 42

<210> 16

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 16

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly

1 5 10

<210> 17

<211> 96

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 17

agagtgacca tgaccacaga cacctccaca agcaccgctt acatggagct gaggtctctg 60

cggtccgacg ataccgccgt gtactattgt gctaga 96

<210> 18

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 18

Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu

1 5 10 15

Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

20 25 30

<210> 19

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 19

tggggcaagg gcacaatggt gaccgtgagc tct 33

<210> 20

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 20

Trp Gly Lys Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 21

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 21

ctgtccagcg agctgaccca ggatcctgct gtgagcgtgc ccctgggaca gaccgtgcgg 60

atcacctgt 69

<210> 22

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 22

Leu Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Pro Leu Gly

1 5 10 15

Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys

20

<210> 23

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 23

tggtaccagc agaagcctgg ccaagccccc gtcagggtga tctac 45

<210> 24

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 24

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Arg Val Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 25

<211> 96

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 25

ggcatccctg accggttcag cggcagcagc tccggcaaca ccgctagcct gaccatcaca 60

ggcgcccagg ctgaggacga ggctgactac tactgt 96

<210> 26

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 26

Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser

1 5 10 15

Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 27

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 27

ttcggaaccg gcaccaagct gaccgtgctg gga 33

<210> 28

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 28

Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

1 5 10

<210> 29

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 29

caggtgcacc tggtgcagtc cggagctgag gtgcagaagc caggctccag cgtgaaggtg 60

agctgcaagg cttctggcgg cacattctct tcctacggca tcaattgggt gaggcaggct 120

cctggacagg gactggagtg gatgggctgg atcagcgcct acaacggcaa tacaaactat 180

gctcagaagc tgcagggcag agtgaccatg accacagaca cctccacaag caccgcttac 240

atggagctga ggtctctgcg gtccgacgat accgccgtgt actattgtgc tagaggatct 300

ggactgctgc caaggatcgg aggatattgg ggcaagggca caatggtgac cgtgagctct 360

<210> 30

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 30

Gln Val His Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Gln Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ser Gly Leu Leu Pro Arg Ile Gly Gly Tyr Trp Gly Lys

100 105 110

Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 31

<211> 330

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 31

ctgtccagcg agctgaccca ggatcctgct gtgagcgtgc ccctgggaca gaccgtgcgg 60

atcacctgtc ggggcgactc cctgcggacc ttctacgcca cctggtacca gcagaagcct 120

ggccaagccc ccgtcagggt gatctacagg aagaacaacc ggcctagcgg catccctgac 180

cggttcagcg gcagcagctc cggcaacacc gctagcctga ccatcacagg cgcccaggct 240

gaggacgagg ctgactacta ctgtaactcc cgggacagct ccggcgacca cctggtgttc 300

ggaaccggca ccaagctgac cgtgctggga 330

<210> 32

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 32

Leu Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Pro Leu Gly

1 5 10 15

Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Arg Gly Asp Ser Leu Arg Thr Phe Tyr

20 25 30

Ala Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Arg Val Ile

35 40 45

Tyr Arg Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asp

85 90 95

His Leu Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

<210> 33

<211> 1353

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 33

caggtgcacc tggtgcagtc cggagctgag gtgcagaagc caggctccag cgtgaaggtg 60

agctgcaagg cttctggcgg cacattctct tcctacggca tcaattgggt gaggcaggct 120

cctggacagg gactggagtg gatgggctgg atcagcgcct acaacggcaa tacaaactat 180

gctcagaagc tgcagggcag agtgaccatg accacagaca cctccacaag caccgcttac 240

atggagctga ggtctctgcg gtccgacgat accgccgtgt actattgtgc tagaggatct 300

ggactgctgc caaggatcgg aggatattgg ggcaagggca caatggtgac cgtgagctct 360

gctagcacca agggaccatc cgtgttccca ctggccccct ccagcaagtc caccagcgga 420

ggaacagccg ctctgggatg cctggtgaag gactacttcc cagagcccgt gacagtgagc 480

tggaactctg gcgccctgac cagcggagtg cacacatttc ccgccgtgct ccagtcttcc 540

ggcctgtact ctctgagctc tgtggtgacc gtgccctcca gctctctggg cacccagaca 600

tatatctgca acgtgaatca caagccaagc aatacaaagg tggacaagaa ggtggagccc 660

aagtcttgtg ataagaccca tacatgcccc ccttgtcctg ctccagagct gctgggagga 720

ccaagcgtgt tcctgtttcc acccaagcct aaggacaccc tgatgatctc caggaccccc 780

gaggtgacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaggacc ccgaggtgaa gtttaactgg 840

tacgtggatg gcgtggaggt gcataatgct aagaccaagc ctagggagga gcagtacaac 900

tctacctatc gggtggtgtc cgtgctgaca gtgctgcacc aggactggct gaacggcaag 960

gagtataagt gcaaggtgtc taataaggcc ctgcccgctc ctatcgagaa gaccatctcc 1020

aaggccaagg gccagcctag agagccacag gtgtacacac tgcctccatc tcgcgacgag 1080

ctgaccaaga accaggtgtc cctgacatgt ctggtgaagg gcttctatcc ttccgacatc 1140

gctgtggagt gggagagcaa cggccagcca gagaacaatt acaagaccac accccctgtg 1200

ctggactccg atggcagctt ctttctgtat agcaagctga ccgtggataa gtccaggtgg 1260

cagcagggca acgtgttttc ttgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa tcattataca 1320

cagaagagcc tgtctctgtc ccctggcaag tga 1353

<210> 34

<211> 450

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 34

Gln Val His Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Gln Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ser Gly Leu Leu Pro Arg Ile Gly Gly Tyr Trp Gly Lys

100 105 110

Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<210> 35

<211> 648

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 35

ctgtccagcg agctgaccca ggatcctgct gtgagcgtgc ccctgggaca gaccgtgcgg 60

atcacctgtc ggggcgactc cctgcggacc ttctacgcca cctggtacca gcagaagcct 120

ggccaagccc ccgtcagggt gatctacagg aagaacaacc ggcctagcgg catccctgac 180

cggttcagcg gcagcagctc cggcaacacc gctagcctga ccatcacagg cgcccaggct 240

gaggacgagg ctgactacta ctgtaactcc cgggacagct ccggcgacca cctggtgttc 300

ggaaccggca ccaagctgac cgtgctggga cagcctaagg ccgcccctag cgtgaccctg 360

tttcctccca gcagcgaaga gctgcaggct aacaaggcca ccctggtgtg tctgatcagc 420

gatttctatc ctggcgctgt gacagtggcc tggaaagctg acagcagccc cgtgaaggct 480

ggcgtggaga ccaccacacc tagcaaacag agcaacaata agtacgccgc cagctcctac 540

ctcagcctga cccccgaaca gtggaagtcc catcggtcct acagctgtca ggtgacccac 600

gagggctcca ccgtggagaa gaccgtcgcc cctaccgagt gttcctga 648

<210> 36

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 36

Leu Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Pro Leu Gly

1 5 10 15

Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Arg Gly Asp Ser Leu Arg Thr Phe Tyr

20 25 30

Ala Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Arg Val Ile

35 40 45

Tyr Arg Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asp

85 90 95

His Leu Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro

100 105 110

Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu

115 120 125

Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro

130 135 140

Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala

145 150 155 160

Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala

165 170 175

Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg

180 185 190

Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr

195 200 205

Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

Claims

1.一种抗体的重链可变区，其特征在于，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：

SEQ ID NO:2所示的VH-CDR1，

SEQ ID NO:4所示的VH-CDR2，和

SEQ ID NO:6所示的VH-CDR3；

2.一种抗体的重链，其特征在于，所述的重链具有如权利要求1所述的重链可变区。

3.一种抗体的轻链可变区，其特征在于，所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：

SEQ ID NO:8所示的VL-CDR1，

SEQ ID NO:10所示的VL-CDR2，和

SEQ ID NO:12所示的VL-CDR3；

4.一种抗体的轻链，其特征在于，所述的轻链具有如权利要求3所述的轻链可变区。

5.一种抗体，其特征在于，所述抗体具有：

(1)如权利要求1所述的重链可变区；和/或

(2)如权利要求3所述的轻链可变区；

或者，所述抗体具有：如权利要求2所述的重链；和/或如权利要求4所述的轻链，

6.如权利要求5所述的抗体，其特征在于，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQID No.30所示；和/或，所述的抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.32所示；

其中，上述重链可变区的氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并与SEQ ID No.30所示的氨基酸序列具有至少80％同源性或序列相同性的衍生序列；

其中，上述轻链可变区的氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并与SEQ ID No.32所示的氨基酸序列具有至少80％同源性或序列相同性的衍生序列。

7.一种重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白包括：

(i)如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5所述的抗体；以及

(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。

8.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码选自下组的多肽：

(1)如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5所述的抗体；以及

(2)如权利要求7所述的重组蛋白。

9.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求8所述的多核苷酸。

10.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求9所述的载体或基因组中整合有权利要求8所述的多核苷酸。

11.一种抗体偶联物，其特征在于，所述抗体偶联物含有：

(a)抗体部分，所述抗体部分含有选自下组的元件：如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链，或所述抗体部分为权利要求5所述的抗体；和

12.一种免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞表达或在细胞膜外暴露有权利要求5所述的抗体。

13.一种基于闭环或开环马来酰亚胺的抗体-药物偶联物，其特征在于，所述的偶联物具有式Ia和/或Ib所示的结构；

其中，

L₁为连接于Ar'基团上的-O(CH₂CH₂O)_n-，其中n选自1-20中任一整数，优选为1-10中任一整数；

14.如权利要求13所述的抗体-药物偶联物，其特征在于，所述的闭环或开环的马来酰亚胺基团连接于抗体铰链区的二硫链还原后的巯基上。

15.如权利要求13所述的抗体-药物偶联物，其特征在于，所述的闭环或开环的马来酰亚胺基团连接于完全还原后的抗体上，即铰链区的4对二硫链完全打开，优选m为3.8-4.2，更优选3.9-4.1，最优选4.0。

16.如权利要求13所述的抗体-药物偶联物，其特征在于，所述靶向GPC3的抗体选自下组：单克隆抗体、双特异性抗体、嵌合抗体、人源化抗体、全人抗体。

17.如权利要求13所述的抗体-药物偶联物，其特征在于，所述靶向GPC3的抗体为GPC3-6。

18.如权利要求13所述的抗体-药物偶联物，其特征在于，Ar'选自取代或未取代的亚苯基或吡啶基，所述的取代指基团上的氢原子被选自下组的一个或多个取代基所取代：卤素、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、三氟甲基、腈基、酰胺基。

19.如权利要求13所述的抗体-药物偶联物，其特征在于，所述的AA选自下组：Val-Cit(缬氨酸-瓜氨酸)、Val-Ala(缬氨酸-丙氨酸)、Phe-Lys(苯丙氨酸-赖氨酸)、Ala-Ala-Asn(丙氨酸-丙氨酸-天冬酰胺)、D-Ala-Phe-Lys(D型丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸)、Gly-Gly-Phe-Gly(甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸)。

20.如权利要求13所述的抗体-药物偶联物，其特征在于，所述的CTD为细胞毒类小分子药物，选自下组：微管蛋白抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、DNA结合剂。

21.如权利要求20所述的抗体-药物偶联物，其特征在于，所述的微管蛋白抑制剂选自下组：美登素(maytansine)衍生物、单甲基阿里他汀-E(MMAE)、单甲基阿里他汀-F(MMAF)、Monomethyl Dolastatin 10(MMAD)、Tubulysin类衍生物、Cryptophycin类衍生物、Taltobulin、或其组合。

22.如权利要求20所述的抗体-药物偶联物，其特征在于，所述的拓扑异构酶抑制剂选自下组：阿霉素(Doxorubicin)代谢产物PNU-159682衍生物、依沙替康(Exatecan、DX8951)、伊立替康(irinotecan,CPT-11)代谢产物SN38衍生物。

23.如权利要求20所述的抗体-药物偶联物，其特征在于，所述的DNA结合剂选自下组：PBD类衍生物、duocarmycin类衍生物、或其组合。

24.如权利要求13所述的抗体-药物偶联物，其特征在于，所述抗体-药物偶联物(ADC)选自下组：

偶联物ADC1结构如下：

偶联物ADC2结构如下：

偶联物ADC3结构如下：

偶联物ADC4结构如下：

偶联物ADC5结构如下：

偶联物ADC6结构如下：

m为3.5-4.5；优选3.8-4.2，更优选3.9-4.1，最优选4.0。

25.权利要求13所述的抗体-药物偶联物的制备方法，其特征在于，包括步骤：

26.一种药物组合物，其特征在于，它含有：

(i)活性成分，所述活性成分选自下组：如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5所述的抗体、如权利要求7所述的重组蛋白、如权利要求11所述的抗体偶联物、如权利要求12所述的免疫细胞、如权利要求13所述的抗体-药物偶联物、或其组合；以及

(ii)药学上可接受的稀释剂，载体(载剂)和/或赋形剂。

27.一种活性成分的用途，其特征在于，所述活性成分选自下组：如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5所述的抗体、如权利要求7所述的重组蛋白、如权利要求11所述的抗体偶联物、如权利要求12所述的免疫细胞、如权利要求13所述的抗体-药物偶联物、或其组合，其中所述活性成分被用于(a)制备诊断试剂或试剂盒；和/或(b)制备预防和/或治疗肿瘤的药物，其中，所述肿瘤为GPC3高表达的肿瘤。