CN110582514A - 纤溶酶可切割的抗不溶性纤维蛋白的抗体与药物的偶联物 - Google Patents

纤溶酶可切割的抗不溶性纤维蛋白的抗体与药物的偶联物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及抗体药物偶联物(ADC)以及包含该偶联物的用于治疗癌症的组合物。本发明提供在针对不溶性纤维蛋白的特异性抗体与药物的ADC中，连接抗体与药物的接头具有纤溶酶切割序列的ADC以及包含该ADC的用于治疗癌症的药物组合物。

Description

纤溶酶可切割的抗不溶性纤维蛋白的抗体与药物的偶联物
技术领域
本发明涉及抗体药物偶联物及包含该偶联物的用于治疗癌症的组合物。
背景技术
已经明确，如果存在血管发生损伤、血液与受伤血管壁、血管内皮下组织接触、组织因子向血中流入，则使凝血反应开始，血液中的纤维蛋白原变为不溶性纤维蛋白，纤维蛋白的网以坚固的止血栓形式将伤口硬化。
很早之前已经提示了血液凝固与癌症存在密切的关系(记载于1800年代的法国的外科医生陶瑟(Trousseau)的“在胃癌患者中的基于四肢的血栓的水肿”)。根据最近的临床流行病学数据也明确了以胰腺癌、胃癌、脑瘤为首，在几乎所有的癌症中，由凝固亢奋造成的血栓症的频率与健康人相比显著更高(非专利文献1)。另外，认为在癌症组织的内部中也伴随凝固异常，不溶性纤维蛋白的蓄积、凝固坏死、血管生成与癌症的发展一起反复发生。
与前体的纤维蛋白原在活体中广泛可见不同，不溶性纤维蛋白在正常生理条件下的组织中并不存在。对不溶性纤维蛋白而言，通过向血管外漏出而活化的凝血酶对纤维蛋白原进行切割，由此使纤维蛋白单体形成，该纤维蛋白单体发生聚合、交联而使纤维蛋白纤维形成而由此产生。因此，不溶性纤维蛋白在出血、炎症等病理性的状态的组织中特异性存在，在发生了癌症、心肌梗死、脑梗死等伴随凝固的病情时形成。因此，不溶性纤维蛋白为该血栓相关疾病的标记分子，特别是可以说在没有心肌梗死、脑梗死等脑心血管疾病的情况下的癌症组织中存在的不溶性纤维蛋白正是癌症特异性的分子。
在这样的技术性背景下，提出了针对不溶性纤维蛋白的特异性的抗体及使用了该抗体的抗体药物偶联物(ADC)(专利文献1)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO2014/133093
发明内容
本发明人开发了在针对不溶性纤维蛋白的特异性抗体和与药物的ADC中，连接抗体与药物的接头具有纤溶酶切割序列的ADC。本发明人发现：得到的ADC被递送至不溶性纤维蛋白，及在被递送的部位被纤溶酶切割，在该处将药物放出。进一步，本发明人发现，使用肿瘤模型动物，得到的ADC能够靶向肿瘤周围的不溶性纤维蛋白的蓄积部位，且在该处放出药物，发挥针对肿瘤的抗癌作用。另外，本发明人获得了新的不溶性纤维蛋白特异性的抗体。本发明是基于以上见解的发明。
即，根据本发明，提供以下发明。
(1)抗体-药物偶联物(ADC)，其中，
抗体为结合纤维蛋白的抗体，其对于不溶性纤维蛋白的亲和性比对于纤维蛋白原的亲和性更高，
药物为细胞毒性剂，
抗体与药物以能够被纤溶酶切割的方式利用具有纤溶酶切割位点的接头连接。
(2)上述(1)所述的ADC，其中，
接头具有缬氨酸-亮氨酸-赖氨酸的肽序列作为纤溶酶切割位点。
(3)用于治疗癌症的药物组合物，其包含上述(1)或(2)所述的ADC。
(4)上述(3)所述的药物组合物，其中，癌为浸润性癌。
(5)结合纤维蛋白的抗体，或与该抗体竞争结合纤维蛋白的抗体，或它们的抗原结合片段，
所述结合纤维蛋白的抗体具备：
具有SEQ ID NO：1所示的CDR1、SEQ ID NO：2所示的CDR2和SEQ ID NO：3所示的CDR3的重链可变区，和
具有SEQ ID NO：5所示的CDR1、SEQ ID NO：6所示的CDR2和SEQ ID NO：7所示的CDR3的轻链可变区。
(6)结合纤维蛋白的抗体或其抗原结合片段，所述抗体具有SEQ ID NO：4所示的重链可变区和SEQ ID NO：8所示的轻链可变区。
(7)结合纤维蛋白的抗体，或与该抗体竞争结合纤维蛋白的抗体，或它们的抗原结合片段，
所述结合纤维蛋白的抗体具备：
具有SEQ ID NO：9所示的CDR1、SEQ ID NO：10所示的CDR2和SEQ ID NO：11所示的CDR3的重链可变区，和
具有SEQ ID NO：13所示的CDR1、SEQ ID NO：14所示的CDR2和SEQ ID NO：15所示的CDR3的轻链可变区。
(8)结合纤维蛋白的抗体或其抗原结合片段，所述抗体具有SEQ ID NO：12所示的重链可变区和SEQ ID NO：16所示的轻链可变区。
(9)上述(1)或(2)所述的ADC，其中，抗体为上述(5)～(8)中任一项所述的抗体。
(10)药物组合物，其包含上述(9)所述的ADC。
(11)上述(10)所述的药物组合物，其用于治疗癌症。
附图说明
[图1]图1示出根据本发明得到的抗体为不溶性纤维蛋白特异性抗体。
[图2]图2示出根据本发明得到的不溶性纤维蛋白特异性单克隆抗体蓄积于肿瘤形成部。
[图3]图3示出根据本发明制备的抗体药物偶联物的特别是药物部位及接头部位。
[图4]图4示出使用了根据本发明制备的抗体药物偶联物的在体外的抗癌作用的验证结果。
[图5]图5示出根据本发明制备的抗体药物偶联物的相对于胰腺癌自然产生模型的Kaplan-Meier曲线。
[图6A]图6A示出根据本发明制备的抗体药物偶联物相对于皮下移植肿瘤小鼠的肿瘤体积的增加的抑制效果。
[图6B]图6B示出图6A中观察的小鼠的体重的经时变化。
[图7]图7示出不具有含有纤溶酶切割位点的纤溶酶接头和纤溶酶切割位点，取而代之具有含有组织蛋白酶切割位点的组织蛋白酶接头的ADC的细胞增殖抑制作用。
[图8]图8示出根据本发明制备的抗体药物偶联物的推定的作用机制。
发明详述
在本发明中，“对象”指哺乳动物，具体可以为人。
在本说明书中，“处理”以包括治疗(治疗性处理)和预防(预防性处理)的含义使用。在本说明书中，“治疗”是指疾病或障碍的治疗、治愈、防止，或缓解的改善，或疾病或障碍的发展速度的降低。在本说明书中，“预防”是指使疾病或者病情的发病的可能性降低，或使疾病或者病情的发病推迟。
在本说明书中，“疾病”是指治疗有用的症状。在本说明书中，“癌”是指恶性肿瘤。
在本说明书中，“抗体”是指免疫球蛋白，包括多克隆抗体及单克隆抗体。优选的抗体为单克隆抗体。抗体的来源没有特别限定，可列举例如：非人动物的抗体、非人哺乳动物的抗体及人抗体。另外，抗体也可以为嵌合抗体、人化抗体或人抗体。另外，抗体可以为双特异性抗体。
在本说明书中，“治疗的有效量”是指用于处理(预防或治疗)疾病、状态而有效的药品的量。治疗的有效量的药品能够使疾病或状态的病情的恶化速度降低，使上述病情的恶化停止，将上述病情改善，将上述病情治愈，或抑制上述病情的发病或发展。
在本说明书中，“不溶性纤维蛋白”是指利用第XIII因子进行交联而成的纤维蛋白。在活体中，例如在发生出血时，纤维蛋白原由于凝血酶的作用而被转换为纤维蛋白单体，纤维蛋白原单体进行聚合而使难溶性的纤维蛋白聚合物形成。纤维蛋白聚合物利用第XIII因子而交联，成为不溶性纤维蛋白。
在本说明书中，“不溶性纤维蛋白特异性的抗体”是指与不溶性纤维蛋白结合的抗体，具有与对于纤维蛋白原相比，对于不溶性纤维蛋白更高的亲和性的抗体。这样的不溶性的纤维蛋白特异性的抗体，能够容易地利用相对于不溶性纤维蛋白的亲和性、和相对于纤维蛋白原的亲和性进行筛选而获得。对纤维蛋白而言，具有在不溶性纤维蛋白中产生立体结构转换，变为不溶性由此第一次露出的表位位点。因此，“不溶性纤维蛋白特异性的抗体”可以通过将该露出的结构域，即D结构域(下文也称为“D-domain”)作为免疫原进行免疫而得到。另外，也能够使用线性肽而获得。例如，如果对与纤维蛋白Bβ链(例如：人纤维蛋白Bβ链可具有SEQ ID NO：25表示的氨基酸序列)的氨基酸序列的231～246位相对应的纤维蛋白Bβ链的部分肽进行免疫，则可以得到“不溶性纤维蛋白特异性的抗体”。此外，将SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：27的肽作为免疫原进行免疫，也可以得到“不溶性纤维蛋白特异性的抗体”。这样的不溶性纤维蛋白特异性的抗体可能为与相对于针对纤维蛋白原、纤维蛋白单体及纤维蛋白聚合物中的任一种相比，对不溶性纤维蛋白的亲和性更高的抗体。可以将相对于不溶性纤维蛋白的亲和性与相对于纤维蛋白原的亲和性的比为例如：超过1、1.5以上、2以上、3以上、4以上或5以上的抗体作为不溶性纤维蛋白特异性的抗体得到。亲和性是指结合亲和性(KD)，可以通过ELISA、结合平衡排除法等众所周知的方法确定。
在本说明书中，“竞争”是指与其它结合抗体争夺对抗原的结合。对竞争而言，可能产生针对某抗原，2个抗体的结合部位发生重复的情况。这样的抗体可以通过如上述那样使用了表位的免疫得到，和/或也可以通过竞争测定而对一个抗体相对于抗原的结合是否被另一个抗体所减少进行确认而得到。
在本说明书中，“抗体-药物偶联物”(下文也称为“ADC”)是指抗体与细胞毒性剂连接而成的物质。在ADC中，抗体与细胞毒性剂可以经由适当的接头被连接。作为细胞毒性剂，可以使用化疗剂、放射性同位素及毒素。在ADC中，也包括抗体的抗原结合片段与药物的偶联物。
在本说明书中，“抗原结合片段”是指保持向抗原的结合性的抗体的一部分。抗原结合片段可包含本发明的抗体的重链可变区或轻链可变区或这两者。抗原结合片段可以被嵌合化或人源化。作为抗原结合片段，可列举例如：Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv(单链Fv)、双抗体(diabody)、sc(Fv)2(单链(Fv)2)。对这样的抗体的片段没有特别限定，例如可以将抗体用酶进行处理而得到。例如，如果将抗体用木瓜蛋白酶进行消化，则可以得到Fab。或者，如果将抗体用胃蛋白酶进行消化，则可以得到F(ab′)2，可以将其其进一步还原则得到Fab’。在本发明中，能够使用这样的抗体的抗原结合片段。
在本发明中，在抗体-药物偶联物中，抗体与细胞毒性剂经由接头进行连接。作为细胞毒性剂，可列举化疗剂(例如：市售的抗癌剂等抗癌剂、例如：澳瑞他汀(澳瑞他汀E、澳瑞他汀F亚苯基二胺(AFP)、单甲基澳瑞他汀E、单甲基澳瑞他汀F及它们衍生物)、美登素DM1及DM4及它们的衍生物)、喜树碱(Camptothecin)(SN-38、依立替康、勒托替康(Lurtotecan)、DB67、BMP1350、ST1481、CKD602、托泊替康及依沙替康(Exatecan)、及它们的衍生物)、DNA小沟结合剂(烯二炔、Lexitropsin、倍癌霉素(Duocarmycin)及它们的衍生物)、紫杉烷(紫杉醇及多西他赛及它们的衍生物)、聚酮(polyketide)(淅皮海绵内酯(Discodermolide)和其衍生物)、蒽醌类(米托蒽醌和其衍生物)、苯二氮(吡咯并苯二氮吲哚苯并二氮及唑烷酮苯并二氮及它们的衍生物)、长春花生物碱(长春新碱、长春碱、长春地辛、及长春瑞滨及它们的衍生物)、阿霉素类(阿霉素、吗啉代-阿霉素、及氰基吗啉代-阿霉素及它们的衍生物)、强心苷(洋地黄毒苷、其衍生物)、卡奇霉素(Calicheamicin)、埃博霉素、念珠藻素(Cryptophycin)、西马多丁(Cemadotin)、西马多丁(Cemadotin)、根瘤菌素(rhizoxin)、纺锤霉素(netropsin)、康普瑞汀(Combretastatin)、艾榴素(Eleutherobin)、依托泊苷、T67(Tularik)、及诺考达唑(Nocodazole))、放射性同位素(例如：32P、60C、90Y、111In、131I、125I、153Sm、186Re、188Re、及212Bi)、及毒素(例如：白喉毒素A、假单胞菌内毒素、蓖麻毒素(ricin)、皂草素(Saporin)等)、可以作为本发明的ADC中的细胞毒性剂使用。作为本发明的ADC中的细胞毒性剂，优选可以使用例如喜树碱，特别是SN-38或依沙替康。对细胞毒性剂而言，任一种都可以使用在癌的治疗中使用的那些。作为细胞毒性剂，可以使用上述细胞毒性剂的药学上允许的盐、溶剂合物(例如：水合物)、酯或前药。
在本发明中，ADC的接头包含纤溶酶切割序列，在纤溶酶的存在下能被切割。在本发明中，对ADC的接头而言，其除了纤溶酶切割序列以外的部位在施用后递送至不溶性纤维蛋白为止的过程中由稳定的化学键形成。通过这样的构成，本发明的ADC在施用后在递送至不溶性纤维蛋白为止是稳定的，且使得在与不溶性纤维蛋白结合后被纤溶酶切割，仅在不溶性纤维蛋白附近放出细胞毒性剂。纤溶酶切割序列为氨基酸序列，具体而言可以为包含选自：缬氨酸-亮氨酸-赖氨酸、甘氨酸-脯氨酸-赖氨酸、谷氨酸-赖氨酸-赖氨酸、赖氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸、去甲缬氨酸-氯己基丙氨酰基-赖氨酸、及正亮氨酸-六氢酪氨酸-赖氨酸中的纤溶酶切割序列等氨基酸序列的肽链。这样的接头在ADC的制备中只要是本领域技术人员就能够适当选择、合成。在某实施方式中，对接头而言，例如：可以在抗体和纤溶酶切割序列之间导入第1间隔区，可以将例如聚乙二醇(PEG)，例如将每一分子为重复单元5～40个左右的PEG作为第1间隔区使用。也可以在纤溶酶切割序列与细胞毒性剂之间导入第2间隔区，可以将例如对氨基苄氧基羰基(PABC)作为第2间隔区使用。
在某实施方式中，接头包含第1间隔区及纤溶酶切割序列。在某实施方式中，接头包含第1间隔区、纤溶酶切割序列及第2间隔区。在某特定的对象中，接头包含PEG、纤溶酶切割序列及PABC。
在某实施方式中，接头不包含除了纤溶酶切割序列以外的开裂性部分。
抗体与接头的结合可以通过例如在抗体的巯基上经由马来酰亚胺基而进行连接。
在某实施方式中，抗体经由该巯基，利用具有马来酰亚胺-PEG-纤溶酶切割序列的接头与抗癌剂连接。在某实施方式中，抗体经由该巯基，利用具有马来酰亚胺-PEG-纤溶酶切割序列-PABC的接头与抗癌剂连接。
在任一种中，在本发明的ADC中，抗癌剂均利用与具有能够被纤溶酶切割的纤溶酶切割位点的接头而被连接至抗癌剂，该ADC在到达不溶性纤维蛋白发生了蓄积的部位时，利用在其周围存在的纤溶酶，接头在纤溶酶切割位点被切割，向不溶性纤维蛋白的周围放出抗癌剂。认为在癌组织的周围，存在许多基于由于癌的浸润带来的出血而不溶性纤维蛋白发生了蓄积的部位(参考图8)，考虑本发明的抗体(即，不溶性纤维蛋白特异性的抗体)对于在药物递送系统中靶向癌症有用，本发明的ADC作为癌症的治疗药是有用的。
在本发明中提供以下抗体：
结合纤维蛋白的抗体，及与该抗体竞争结合纤维蛋白的抗体，
所述结合纤维蛋白的抗体具备：
具有SEQ ID NO：1所示的CDR1、SEQ ID NO：2所示的CDR2和SEQ ID NO：3所示的CDR3的重链可变区，和
具有SEQ ID NO：5所示的CDR1、SEQ ID NO：6所示的CDR2和SEQ ID NO：7所示的CDR3的轻链可变区。这些抗体可以作为不溶性纤维蛋白特异性的抗体使用。
在本发明中，另外提供以下抗体：
结合纤维蛋白的抗体，其为具有SEQ ID NO：4所示的重链可变区和SEQ ID NO：8所示的轻链可变区的抗体。该抗体可以作为不溶性纤维蛋白特异性的抗体使用。
也可以说该抗体为具备：
具有SEQ ID NO：1所示的CDR1、SEQ ID NO：2所示的CDR2和SEQ ID NO：3所示的CDR3重链可变区，和
具有SEQ ID NO：5所示的CDR1、SEQ ID NO：6所示的CDR2和SEQ ID NO：7所示的CDR3的轻链可变区的抗体。
在本发明中，提供以下抗体：
结合纤维蛋白的抗体，及与该抗体竞争结合纤维蛋白的抗体，
所述结合纤维蛋白的抗体具备：
具有SEQ ID NO：9所示的CDR1、SEQ ID NO：10所示的CDR2和SEQ ID NO：11所示的CDR3的重链可变区，和
具有SEQ ID NO：13所示的CDR1、SEQ ID NO：14所示的CDR2和SEQ ID NO：15所示的CDR3的轻链可变区。这些抗体可以作为不溶性纤维蛋白特异性的抗体使用。
在本发明中，另外提供以下抗体：
结合纤维蛋白的抗体，其为具有SEQ ID NO：12所示的重链可变区和SEQ ID NO：16所示的轻链可变区的抗体。该抗体可以作为不溶性纤维蛋白特异性的抗体使用。
也可以说该抗体为具备：
具有SEQ ID NO：9所示的CDR1、SEQ ID NO：10所示的CDR2和SEQ ID NO：11所示的CDR3的重链可变区，和
具有SEQ ID NO：13所示的CDR1、SEQ ID NO：14所示的CDR2和SEQ ID NO：15所示的CDR3的轻链可变区的抗体。
上述抗体、及不溶性纤维蛋白特异性的抗体、及它们的抗原结合片段可以作为本发明的ADC中的抗体部分而使用。
根据本发明提供包含治疗的有效量的上述ADC(也称为“本发明的ADC”)的药物组合物。根据本发明，本发明的ADC及上述药物组合物可以分别用于治疗癌症。
作为成为本发明的ADC或药物组合物的治疗对象的癌症，没有特别限定，可列举癌症，例如：肺癌、胰腺癌、头颈癌、前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌、食道癌、胃癌、大肠癌、子宫癌、卵巢癌、皮肤癌、甲状腺癌、胸腺癌、肾脏癌、睾丸癌、阴茎癌、肝癌、胆管癌、脑瘤、骨软组织肿瘤、腹膜后肿瘤、血管·淋巴管肉瘤、及它们的转移性的癌症。
作为本发明的对象，可以为没有罹患血栓性障碍或伴随血栓性障碍的疾病的对象、或没有被作出为血栓性障碍或伴随血栓性障碍的疾病的诊断的对象。由此，可以期待减轻对除了癌以外的组织的副作用。因此，也可以对具有癌的对象确定是否罹患血栓性障碍或伴随血栓性障碍的疾病之后，对没有罹患血栓性障碍或伴随血栓性障碍的疾病的对象施用本发明的ADC。是否罹患血栓性障碍或伴随血栓性障碍的疾病可以由医生进行适当判断。
在本发明的某实施方式中，药物组合物包含本发明的ADC和赋形剂。本发明的药物组合物能够通过：静脉内施用、皮下施用、肿瘤内施用、腹膜内施用、脑室内施用，肌内施用等施用方法施用。用量可以考虑患者的年龄、性别、体重、疾病的严重程度等而医生适当确定。
本发明的ADC将在这些癌的间质中蓄积的不溶性纤维蛋白靶向化，使细胞毒性剂在该靶向化部位蓄积，不仅如此，进一步具有在不溶性纤维蛋白的存在部位被活化的能够被纤溶酶切割的接头，在靶向化部位使细胞毒性剂游离。由此，能够将游离部位周围的癌进行部位特异性伤害。
根据本发明，提供不溶性纤维蛋白特异性的抗体的在用于治疗癌症的药物的制造中的用途。根据本发明提供ADC在用于治疗癌症的药物的制造中的用途，所述ADC为不溶性纤维蛋白特异性的抗体与细胞毒性剂的ADC，抗体和细胞毒性剂具有能够被纤溶酶切割的纤溶酶切割位点。
根据本发明提供在具有该需要的对象中治疗癌的方法，所述方法包括：对上述对象施用治疗的有效量的本发明的ADC。根据本发明提供在具有该需要的对象中治疗癌的方法，其包括：确定具有癌的对象是否罹患血栓性障碍或伴随血栓性障碍的疾病之后，对没有罹患血栓性障碍或伴随血栓性障碍的疾病的对象施用治疗的有效量的本发明的ADC。
根据本发明提供本发明的ADC的用途，其用于在治疗癌的方法中使用。
实施例
实施例1：不溶性纤维蛋白特异性的抗体的制备
在本实施例中，制备了与相对于纤维蛋白原相比，相对于不溶性纤维蛋白的亲和性选择地更高的抗体(下文称为“不溶性纤维蛋白特异性的抗体”)。
(1)免疫原的说明
在本实施例中，将具有SEQ ID NO：26的氨基酸序列的肽及具有SEQ ID NO：27的氨基酸序列的肽作为免疫原对动物进行免疫而得到了抗体。
(2)免疫方法
对于小鼠的免疫如下进行。对于小鼠的免疫进行6次，每隔2周进行。
免疫第1次和第4次的免疫原的准备如下所述。将具有SEQ ID NO：26的氨基酸序列的肽及具有SEQ ID NO：27的氨基酸序列的肽分别作为免疫原使用。制备了用经灭菌的PBS调整为0.5mg/ml的免疫原，进入1ml的进样针中。将与该免疫原为等量的弗氏完全佐剂(Difco公司)进入另外的1ml的进样针，将各个进样针利用接合器相连在一起，互相挤压至感觉到阻力为止。在免疫第1次和第4次中，将免疫原对腹腔施用了200μl。
免疫第2、3、5、6次的免疫原的准备如下所述。制备利用经灭菌的PBS调整为0.5mg/ml的免疫原，将与该免疫原为等量的GERBU佐剂100(Nacalai Tesque公司)在1.5ml管内混合，进入1ml的进样针中。在免疫第2、3、5、6次中，将免疫原对腹腔施用了100μl。对最终免疫而言，制备了利用经灭菌的PBS调整为0.1mg/ml的免疫原，进入1ml的进样针中。将免疫原首先对腹腔施用100μl，10分钟后向尾静脉施用了400μl。
(3)抗体效价的测定
小鼠在最终免疫的1周前从尾静脉进行了采血。于4,000×g，10分钟，4℃进行离心，回收上清，作为样品。抗体效价测定使用了从100倍稀释至12800倍稀释的每2倍逐步稀释的样品，通过ELISA进行。进行ELISA的时候，提前进行了抗原固定化板的准备。利用TBS(pH 8.5)溶解了人血浆中的纤维蛋白原(SIGMA公司)，制备了20μg/ml的纤维蛋白原溶解液。将向96孔免疫板中各添加50μl/每孔而于4℃过夜静置的板作为纤维蛋白原板。将向该纤维蛋白原板在各孔中各添加100μl利用凝血酶稀释液[7mM L-Cystein(Wako公司)，1mMCaCl2(Wako公司)，TBS(pH 8.5)]稀释为0.05NIH U/ml的凝血酶，于37℃培养了2小时的板作为纤维蛋白板。将已将各抗原固定化的板利用200μl的PBS-T(PBS，0.5％(v/v)Tween20)洗涤3次，在各孔中加入200μL的封闭溶液[PBS-T，1％(w/v)BSA]，于室温静置1小时进行了封闭。将进行了梯度稀释的样品各以50μl/孔进行添加，于室温静置1小时。弃去溶液，利用PBS-T洗涤3次，将利用封闭溶液稀释为0.3μg/ml的二次抗体在各孔中各添加50μl，于室温静置30分钟。对二次抗体而言，根据样品不同而分开使用了多克隆兔抗小鼠免疫球蛋白/HRP(Dako公司)和多克隆兔抗大鼠免疫球蛋白/HRP(Dako公司)。弃去溶液，利用PBS-T洗涤3次，在各孔中各添加100μl生色底物溶液(一步TM慢TMB-ELISA底物溶液，Thermo FisherScientific公司)，于室温使其反应10分钟。在各孔中各添加30μl 2N H2SO4，使反应停止。利用Spectra Max paradigm(Molecular Devices公司)测定了450nm的波长的吸光度。
(4)杂交瘤的准备
以外科方式从小鼠摘出脾脏，浸于在RPMI1640中添加了200单位/ml青霉素-200μg/ml链霉素-500ng/ml两性霉素B而成的培养基中。使用进样针10ml(TERUMO公司)和注射针22G(TERUMO公司)将RPMI1640注入脾脏，取出脾细胞，通过EASY strainer 70μm筛网(Greiner公司)。回收的细胞悬浊液利用270×g，5分钟，室温的条件进行了离心，除去上清之后，悬浊于10ml的RPMI1640中。将该基于RPMI1640的洗涤重复2次，悬浊于5ml的RPMI1640中，如使用了小鼠的髂骨淋巴结的细胞融合那样进行了细胞融合。
(5)杂交瘤的筛选
从进行细胞融合10日后起通过ELISA开始了筛选。在1次筛选中，从全部孔移液了培养上清液50μl，作为第一抗体使用。准备了将免疫中使用了的肽进行固定化的板。将肽利用磷酸缓冲液稀释为20μg/ml，在96孔免疫板(Maxi Breakapart Nunc-Immuno Module，nunc公司)的各孔中各加入50μl，于室温静置1小时进行了固定化。固定化后通过与抗体效价测定同样的方法进行了ELISA。由此确认了存在产生抗体的细胞的孔。
在2次筛选中，仅从在1次筛选中为阳性的孔移液培养上清液50μl作为第一抗体使用。使用纤维蛋白板及纤维蛋白原板通过与抗体效价测定同样的方法进行了ELISA。由此确认了存在产生不溶性纤维蛋白特异性抗体的细胞的孔。关于在2次筛选中为阳性的孔，使用具有200μl刻度的黄枪头(Chip yellow)(Watson公司)进行了集落挑选。将枪头推压至菌落而吸取5μl，接种至新的Costar 96孔细胞培养板。
在3次筛选中从接种了菌落的孔移液培养上清液50μl，作为第一抗体使用。使用纤维蛋白板及纤维蛋白原板通过与抗体效价测定同样的方法进行了ELISA。将在3次筛选中为阳性的孔的细胞进行了极限稀释。
在4次筛选中，仅从单一细胞的孔移液培养上清液50μl，作为第一抗体使用。使用纤维蛋白板及纤维蛋白原板通过与抗体效价测定同样的方法进行了ELISA。由此选择了产生不溶性纤维蛋白特异性抗体的细胞。
从免疫了具有SEQ ID NO：26的氨基酸序列的肽的小鼠得到了99-5克隆。另外，从免疫了具有SEQ ID NO：27的氨基酸序列的肽的小鼠得到了1101克隆。下文中有将该“99-5克隆”简称为“99克隆”的情况。
实施例2：得到的单克隆抗体的特性分析
在本实施例中，通过ELISA及表面等离子共振(SPR)验证了抗体的亲和性。
(1)基于ELISA的亲和性的验证
进行ELISA的时候，提前进行了抗原固定化板的准备。利用TBS(pH 8.5)溶解了人血浆中的纤维蛋白原(SIGMA公司)，制备了20μg/ml的纤维蛋白原溶解液。将向96孔免疫板中各添加50μl/每孔而于4℃过夜静置的板作为纤维蛋白原板。将向该纤维蛋白原板在各孔中各添加100μl利用凝血酶稀释液[7mML-Cystein(Wako公司)，1mMCaCl2(Wako公司)，TBS(pH 8.5)]稀释为0.05NIH U/ml的凝血酶，于37℃培养了2小时的板作为纤维蛋白板。将已将各抗原固定化的板利用200μl的PBS-T(PBS，0.5％(v/v)Tween20)洗涤3次，在各孔中加入200μL的封闭溶液[PBS-T，1％(w/v)BSA]，于室温静置1小时进行了封闭。将利用PBS进行了阶梯稀释的样品各以50μl/孔进行添加，于室温静置了1小时。弃去溶液，利用PBS-T洗涤3次，将利用封闭溶液稀释为0.3μg/ml的二次抗体在各孔中各添加50μl，于室温静置30分钟。对二次抗体而言，根据样品不同而分开使用了多克隆兔抗小鼠免疫球蛋白/HRP(Dako公司)和多克隆兔抗大鼠免疫球蛋白/HRP(Dako公司)。弃去溶液，利用PBS-T洗涤3次，在各孔中各添加100μl生色底物溶液，于室温使其反应10分钟。在各孔中各添加30μl 2N H2SO4，使反应停止。利用Spectra Max paradigm(Molecular Devices公司)测定了450nm的波长的吸光度。
结果如图1所示那样。如图1所示那样，从在上述实施例中新得到的99克隆及1101克隆得到的抗体，为与相对于纤维蛋白原相比，相对于不溶性纤维蛋白更强地结合的不溶性纤维蛋白特异性的抗体。另外，与从在WO2016/167227中得到的102-10克隆得到的抗体相比，相对于纤维蛋白也更强地发生了反应。
(2)基于SPR的亲和性的验证
在抗原为不溶性的情况下，不适于基于SPR的亲和性的验证，但为了对抗体之间的相对亲和性的强度进行比较而作为参考进行了测定。
抗体的相对于不溶性纤维蛋白的亲和性使用Biacore T200(GE Healthcare公司)由表面等离子共振(Surface plasmon resonance：SPR)分析算出，进行了抗体的分子间相互作用的评价。在流路中使用的缓冲液使用了HBS-N缓冲液(GE Healthcare公司)。利用10mM乙酸钠，pH 5.5(GE Healthcare公司)将102-10的表位部分的肽(参考WO2016/167227)稀释为1μg/ml，固定化于传感器芯片(Biacore sensor chip CM5，GE Healthcare公司)。对固定化而言，使用胺偶联试剂盒(BR-1000-50，GEHeathcare公司)将固定化量设定为90RU而进行。接着将利用1×HBS-N缓冲液稀释为48.875、93.75、187.5、375、750、1500nM的抗体，通过多循环动力学方法利用表1的条件进行了抗原抗体反应。测定后，为了求出KD值、kd值、ka值，使用BIA evaluation(GE Healthcare公司)进行了分析。
[表1]
表1：SPR的条件
结果如表2所示那样。
[表2]
表2：基于SPR的各克隆产生抗体的相对于表位的亲和性
实施例3：使用胰腺癌的皮下移植模型的抗体向癌的蓄积性的验证
在本实施例中，由于将由Y.Kawaguchi，C.Wright，D.Tuveson提供的LSL-KrasG12D/+和由Ptfla-Cre，National Cancer Institute at Frederick提供的LSL-Trp53R172H/+杂交制备了p53、p48及K-Ras的三重突变小鼠(胰腺癌模型小鼠)，已经建立了来自三重突变小鼠的胰腺癌细胞株，因此使用其细胞株进行了体内成像。已报告了该三重突变小鼠模仿人胰腺癌的发生。胰腺癌细胞株利用在500ml的RPMI1640(Wako公司)中添加了经灭活的100ml胎牛血清(FBS，Gibco公司)和10ml的100单位/ml青霉素-100μg/ml链霉素-250ng/ml两性霉素B(Wako公司)而成的培养基中进行了培养。然后，除去培养上清液，使用PBS(Invitrogen公司)进行洗涤，添加2ml的胰酶-EDTA[0.25％(w/v)Trypsin-1.0mmol/l乙二胺四乙酸4钠溶液(含酚红)，和光纯药工业公司]，利用吹打而剥落细胞，放入15ml管(corning公司)。以270×g，3分钟，4℃的条件，使用离心机(Universal离心机5800，KUBOTA公司)进行离心，除去了上清。利用10ml的PBS进行再悬浮，以270×g，3分钟，4℃的条件进行离心。将其重复三次，利用PBS调整为2×106细胞/50μl，向5周龄的BALB/c Slc nu/nu小鼠(日本SLC公司)的左腿的大腿根进行了皮下注射，每1只各50μl。1个月后，尾静脉施用了Alexa647标记的抗不溶性纤维蛋白抗体和对照抗体，每1只300μg。在对照中，使用了体内MAb小鼠IgG1同型对照(InVivoMAb Mouse IgG1 Isotype control)(BioXCell公司)。在施用后1小时后、第1天、第3天、第5天、第7天，利用体内活体观察系统OV110(奥林巴斯公司)进行了拍摄。
结果如图2所示那样。如图2所示那样，从成像可知，得到的不溶性抗不溶性纤维蛋白抗体(特别是1101及99)向癌的蓄积性高。
然后，将外科方式摘出的肿瘤包埋于OCT复合物(日本樱花精细技术公司)中进行冷冻，制备了6μm的薄层切片。利用吹风机风干45分钟之后，用冷丙酮(Wako公司)固定了10分钟。利用PBS洗涤之后，利用迈耶苏木精(武藤化学公司)进行核染色2分钟。用流水进行了10分钟洗涤之后，利用用100％乙醇稀释3倍的曙红醇(武藤化学公司)将细胞质染色。用流水洗涤之后，在100％乙醇中浸3次，各3分钟，在二甲苯(Wako公司)浸3次各3分钟而进行了脱水和透明。最后利用Mount-Quick(大道产业公司)封装。
将外科方式摘出的肿瘤包埋于OCT复合物(日本樱花精细技术公司)中进行冷冻，制备了6μm的薄层切片。利用吹风机风干45分钟之后，用冷丙酮(Wako公司)固定了10分钟。利用PBS洗涤之后，在0.3％(v/v)H2O2中浸20分钟而进行内源性过氧化物酶抑制。利用PBS进行3次5分钟的洗涤后，利用封闭溶液[5％(w/v)脱脂牛乳(Difco公司)，PBS]封闭30分钟。滴加利用封闭溶液稀释为1μg/ml的HRP标记抗体200μl，于4℃使其反应过夜。利用PBS进行3次5分钟洗涤之后，利用3，3′-二氨基联苯胺四盐酸盐(Dako公司)进行了酶底物反应。之后，用灭菌蒸馏水进行了3分钟洗涤，利用迈耶苏木精(武藤化学公司)进行核染色2分钟。用流水进行了10分钟洗涤之后，在100％乙醇中浸3次各3分钟，在二甲苯(Wako公司)钟浸3次各3分钟而进行了脱水和透明。最后利用Mount-Quick(大道产业公司)封装。
实施例4：体外抗癌作用
在本实施例中，制备了得到的不溶性纤维蛋白特异性的抗体与单甲基澳瑞他汀E(MMAE)连接而成的抗体药物偶联物(ADC)，验证了其抗癌作用。
作为ADC，合成而使用了具有图3所示的结构的ADC。该ADC为作为抗癌剂使MMAE与单克隆抗体(mAb)连接而成。在该ADC中，经由聚乙二醇(PEG)间隔区和作为纤溶酶切割位点的Val-Leu-Lys，使抗体与MMAE连接，使在存在纤溶酶的环境中进行切割，使MMAE从抗体游离。
上述ADC具体而言如下所述地合成。
[化学式1]
向Fmoc-Val-Leu-Lys(Mmt)-氨基苄醇(0.74g，0.773mmol)的DMF(2mL)溶液中于0度加入DIPEA(0.54mL，3.10mmol)和对硝基苯氯甲酸酯(472mg，1.55mmol)，于室温搅拌12小时。将反应液利用饱和氯化铵水溶液进行停止，利用氯仿进行了提取。将提取层用饱和食盐水洗涤，利用Na2SO4进行干燥后，减压下浓缩。残留物通过硅胶色谱法(CHCl3/MeOH95/5-9/1)进行了纯化。以无色非晶体形式得到了Fmoc-Val-Leu-Lys(Mmt)-OPABC-对-硝基苯基碳酸酯。
1HNMR(400MHz，CDCl3)：d 8.01(br，1H)，7.76(br，1H)，7.05-7.60(m，13H)，6.78(d，J＝6.8Hz，2H)，5.49(br，1H)，5.25(br，1H)，4.94(br，1H)，4.77(s，2H)，4.04(s，3H)，4.00-4.85(m，3H)，3.75(s，3H)，3.55-3.90(m，2H)，3.26(d，J＝19.6Hz，1H)，3.00(d，J＝19.6Hz，1H)，2.32(br，1H)，1.26(s，3H)，1.05-2.25(m，15H)，0.70-1.05(m，12H)；HRMS(ESI-MS)：C72H85N6O17：计算值1305.5971[M+H]+；实验值1305.5935。
[化学式2]
向对硝基苯基碳酸酯体(33.2mg，0.0296mmol)、HOBt(0.5mg，0.0039mmol)的吡啶(80mL)-DMF(0.4mL)溶液中于0度加入了MMAE(14.1mg，0.0197mmol)。将反应液于室温搅拌10小时后，将反应液直接利用LH20(氯仿/甲醇1/1)进行纯化，以无色非晶体形式得到了Fmoc-Val-Leu-Lys(Mmt)-OPABC-MMAE(22.7mg，68％)。
MS(MALDI-TOFMS)[C99H132N10O15+K]+计算值1739.95；实验值1741.37。
[化学式3]
向Fmoc-Val-Leu-Lys(Mmt)-OPABC-MMAE(626mg，0.368mmol)的DMF(3mL)溶液中加入哌啶(110mL，1.10mmol)，于室温搅拌40分钟。将反应液利用LH20(氯仿/甲醇1/1)和HPLC(YMC T4000 10.0mL/min，CHCl3∶MeOH 4∶1，254nm)进行纯化，以无色非晶体形式得到了H-Val-Leu-Lys(Mmt)-OPABC-MMAE(458mg，84％)。
MS(MALDI-TOFMS)[C94H122N10O13+K]+计算值1519.02；实验值1519.65。
[化学式4]
向H-Val-Leu-Lys(Mmt)-OPABC-MMAE(458mg，0.309mmol)的二氯甲烷溶液(2mL)中，于0度加入了DIPEA(160mL，0.927mmol)和Mal-PEG12-OSu(295mg，0.340mmol)的二氯甲烷溶液(1mL)。将反应液于室温搅拌22小时之后，利用LH20(氯仿/甲醇1/1)和分子筛回收利用HPLC(YMC T4000 10.0mL/min，CHCl3，254nm)进行纯化，以无色非晶体形式得到了Mal-PEG12-Val-Leu-Lys(Mmt)-OPABC-MMAE(498mg，72％)。
MS(MALDI-TOFMS)[C118H180N12O29+K-Mmt]+计算值1997.51；实验值1999.49。
[化学式5]
将Mal-PEG12-Val-Leu-Lys(Mmt)-OPABC-MMAE(498mg，0.223mmol)溶解于5％TFA二氯甲烷溶液(2mL)中，加入甲醇(50mL)，于室温搅拌1小时。将反应液直接利用LH20(氯仿/甲醇1/1)，接着，利用HPLC(YMC T4000 10.0mL/min，CHCl3，254nm))进行纯化，以无色非晶体形式得到了Mal-PEG12-Val-Leu-Lys-OPABC-MMAE(440mg，90％)。
MS(MALDI-TOFMS)[C98H164N12O28+K]+计算值1997.51；实验值1998.31。
接着，制备了纤维蛋白板。向细胞培养用96孔板向壁面添加了25mg/ml纤维蛋白原溶液5μL。在各孔中添加凝血酶溶液1μl，以40×g，4℃的条件离心1分钟。于37℃使其反应2小时，之后保存于4℃直至使用。
将5-11细胞株(源自TG小鼠的胰腺癌细胞)以2000细胞/孔接种至得到的纤维蛋白包被板，于37℃过夜培养。作为培养液，制成了包含10％FBS的RPMI培养基。
使得ADC以终浓度计为0～25nM(以MMAE换算)的方式调整了稀释系列。
以使得纤溶酶原、tPA、α2-抗纤溶酶的终浓度与正常血浆中的浓度为同程度，即，分别为约1500nM、约0.3nM、约1000nM的方式进行了调整。
从纤维蛋白板除去培养液，添加了包含纤溶酶原、tPA、α2-抗纤溶酶的上述溶液90μl，之后，添加了ADC(图中称为“Fbn-ADC”)的稀释系列10μl。作为对照，使用了作为不溶性纤维蛋白抗体单体(图中，称为“IgG”)及作为图3的抗体使用了抗4M-Tag抗体(对照IgG)的ADC(图中，称为“对照-ADC”)。于37℃培养72小时，之后，除去培养液，添加以CCK-8(同仁化学)∶培养液＝1∶10的比例混合而成的反应液，于37℃培养3小时。从根据A450求出的光学密度曲线算出IC50。
结果如图4所示那样。不溶性纤维蛋白特异性的抗体的ADC显示了癌细胞的增殖抑制效果，而在对照中未观察到有意义的肿瘤的增殖抑制效果。这显示了不溶性纤维蛋白特异性的抗体-ADC与将板包被的纤维蛋白发生了结合，及之后，接头被纤溶酶切割而使MMAE放出，杀伤了肿瘤。不溶性纤维蛋白特异性的抗体-ADC的IC50为19nM。
实施例5：体内的上述不溶性纤维蛋白特异性的抗体-ADC的抗癌作用
本发明人假设，在体内癌发生增殖时损伤环抱癌的血管而产生出血，由此为了止血，不溶性纤维蛋白在肿瘤附近蓄积，如果使用与蓄积的不溶性纤维蛋白结合的抗体则能够将抗癌剂递送至癌周围。本发明人另外创造出如下新抗癌剂的概念：通过在ADC的接头导入纤溶酶切割位点，使到达不溶性纤维蛋白的ADC被切割，进一步利用在不溶性纤维蛋白基础上被活化的纤溶酶而不溶性纤维蛋白依赖性地放出抗癌剂的新抗癌剂。本发明人假设，通过由此不溶性纤维蛋白依赖性地蓄积ADC且放出抗癌剂，能够提高癌特异性。
对于在上述的P53、K-ras、P48的3重突变小鼠中具有自然产生的胰腺癌的模型(胰腺癌自然产生模型)，验证了上述基于ADC的治疗效果。将不溶性纤维蛋白特异性的抗体-ADC以0.3mg(以MMAE换算)/kg体重/3～4天(即，20mg(以ADC换算)/kg体重/3～4天将ADC施用于模型，求出了Kaplan-Meier曲线。将时序检验的显著性水平设为0.05。作为对照ADC(图中，称为“对照-ADC”)使用了抗4M-Tag抗体。
结果如图5所示那样。如图5所示那样，ADC(图中，称为“αFbn-ADC”)相对于对照显著改善了胰腺癌自然产生模型的生存率。由此验证了上述假说是正确的。
实施例6：具有纤维蛋白沉积的皮下肿瘤模型中的上述不溶性纤维蛋白特异性的 抗体-ADC的抗癌作用
在本实施例中，使用从由上述3重突变体自然产生的胰腺癌建立细胞株，将该细胞株皮下移植而得到的皮下肿瘤模型，验证了不溶性纤维蛋白特异性的抗体-ADC的抗癌作用。
从由上述3重突变体自然产生的胰腺癌建立细胞株而命名为5-11。向BALB/C裸小鼠的皮下移植5×105个5-11而制备了皮下移植模型。该皮下移植模型在皮下具有纤维蛋白的沉积。对于得到的皮下肿瘤模型，将不溶性纤维蛋白特异性的抗体-ADC以0.3mg(MMEA换算)/kg体重/3～4天(即，20mg(以ADC换算)/kg体重/3～4天进行施用，观察了肿瘤体积增加率的推移。将ANOVA的比较的显著性水平设为0.01。
结果如图6A所示那样。如图6A所示那样，ADC(图中，称为“αFbn-ADC”)相对于对照显著抑制了肿瘤体积的增加。
皮下移植模型的体重变化的经时推移如图6B所示的那样。如图6B所示那样，对于体重而言没有有意义的增减，明确了本发明的ADC可以副作用较少的治疗药。
接下来，与接头不具有纤溶酶切割序列的情况比较了抗肿瘤效果。
将44As3以3000细胞/孔接种至得到的纤维蛋白包被及非包被板，于37℃过夜培养。作为培养液，制成了包含10％FBS的RPMI培养基。
以使得使用了组织蛋白酶接头(具有缬氨酸-瓜氨酸)的ADC以及使用了纤溶酶接头的ADC分别以终浓度计为0～3nM(以MMAE换算)的方式调整了稀释系列。
以使得纤溶酶原、tPA、α2-抗纤溶酶的终浓度与正常血浆中的浓度为同程度，即，分别为约150nM、约0.03nM、约100nM的方式进行了调整。
从各板除去培养液，添加了包含纤溶酶原、tPA、α2-抗纤溶酶的上述溶液90μl，之后，将ADC的稀释系列向各自的板添加10μl。于37℃培养72小时，之后，除去培养液，添加以CCK-8(同仁化学)∶培养液＝1∶10的比例混合而成的反应液，于37℃培养2小时。从根据A450求出的光学密度曲线算出IC50。
结果如图7所示那样。如图7所示那样，在具有纤溶酶切割位点的上述ADC(图中，称为“纤溶酶接头”)中，明确示出了对于肿瘤细胞的细胞增殖抑制效果，与此相对，在取代具有纤溶酶切割位点的接头的而替换为具有组织蛋白酶切割位点的接头的ADC(图中，称为“组织蛋白酶接头”)中，对于肿瘤细胞的细胞增殖抑制效果几乎未发现。
根据上述结果，如图8所示那样，具备具有纤溶酶切割位点的接头的抗不溶性纤维蛋白抗体-细胞毒性剂偶联物，从血流被递送至不溶性纤维蛋白蓄积的癌周围部，在纤维蛋白附近，接头部分被纤溶酶切割，将细胞毒性剂向癌周围放出。由此，实现癌与细胞毒性剂接触。认为这是本发明的ADC的作用机制。
癌的恶性程度越高对组织浸润性越高。在浸润至血管的情况下产生出血，这样则在出血部位形成不溶性纤维蛋白。可认为本发明的ADC对这样的恶性程度高的癌有效性特别高。另外，认为只要是不溶性纤维蛋白特异性的抗体，在使用了其它抗体的情况下，ADC也同样地发挥抗癌作用。
实施例7：抗体的序列解读
将5×105个细胞从100mm皿(Corning公司)移至15ml管，利用270×g，3分钟，4℃的条件进行离心。除去上清之后，加入RNAiso Plus(TAKARA Bio公司)1ml，移至EP管，进行了涡旋。之后，于室温静置了5分钟。使用RNeasy Mini Kit(Qiagen公司)从该细胞悬浊液提取了总RNA。向细胞悬浊液中加入氯仿(Wako公司)200μl，涡旋30秒，静置了3分钟。之后以20,400×g，15分钟，4℃的条件进行了离心，回收了500μl的上清。向回收的上清中加入500μl的70％乙醇，将该溶液转移至RNeasy Mini spin column。以15,000×g，1分钟，室温的条件进行离心，弃去流过液，加入700μl的缓冲液RW1(Qiagen公司)，以8,000×g，1分钟，室温的条件进行了离心。弃去流穿液，加入500μl的缓冲液RPE(Qiagen公司)，以8,000×g，1分钟，室温的条件进行了离心。将该洗涤重复3次，最后加入50μl的灭菌蒸馏水，以20,400×g，1分钟，室温的条件离心，提取了RNA。
使用SMAR TerRACE cDNA扩增试剂盒(TAKARABio公司)，从提取的RNA合成了cDNA。预先调整了缓冲液混合物(Buffer Mix)(5×第一链缓冲液2μl，20mM DTT 1μl，10mM dNTPMix 1μl)，置于室温。在PCR用8连管(Thermo Scientific公司)中取5′-CDS引物-A 1μl，加入总RNA 300ng之后，使用无核酸酶的水混合至3.75μl。使用Pro Flex PCR系统，将该样品于72℃进行了3分钟反应后，于42℃进行了2分钟反应。悬降之后，加入了SMAR Ter IIAoligo 1μl。向该样品中加入4μl的缓冲液混合物，0.25μl的RNase抑制剂，1μl的SMARTScribe反转录酶混合溶液。使用Pro Flex PCR系统，于42℃进行了90分钟反应之后，于72℃进行了10分钟反应，合成cDNA，之后解读了cDNA的序列。得到的抗体的序列如下所述。
从99克隆(99-5克隆)得到的mAb(小鼠IgGl)的重链可变区
[化学式6]
从99克隆(99-5克隆)得到的mAb(小鼠IgG1)的轻链可变区
[化学式7]
从1101克隆得到的mAb(小鼠IgG1)的重链可变区
[化学式8]
从1101克隆得到的mAb(小鼠IgG1)的轻链可变区
[化学式9]
从0211克隆得到的mAb(小鼠IgG2b)的重链可变区
[化学式10]
从0211克隆得到的mAb(小鼠IgG2b)的轻链可变区
[化学式11]
序列表
SEQ ID NO：1～3 分别与99抗体的重链CDR1～3对应
SEQ ID NO：4 与抗体99的重链可变区对应(氨基酸编号1～19为信号序列)
SEQ ID NO：5～7 分别与99抗体的轻链CDR1～3对应
SEQ ID NO：8 与99抗体的轻链可变区对应(氨基酸编号1～19为信号序列)
SEQ ID NO：9～11 分别与1101抗体的重链CDR1～3对应
SEQ ID NO：12 与1101抗体的重链可变区对应(氨基酸编号1～19为信号序列)
SEQ ID NO：13～15 分别与1101抗体的轻链CDR1～3对应
SEQ ID NO：16 与1101抗体的轻链可变区对应(氨基酸编号1～27为信号序列)
SEQ ID NO：17～19 分别与0211抗体的重链CDR1～3对应
SEQ ID NO：20 与0211抗体的重链可变区对应(氨基酸编号1～19为信号序列)
SEQ ID NO：21～23 分别与0211抗体的轻链CDR1～3对应
SEQ ID NO：24 与0211抗体的轻链可变区对应(氨基酸编号1～20为信号序列)
SEQ ID NO：25 人纤维蛋白Bβ链
SEQ ID NO：26 作为99的免疫原使用的人纤维蛋白Bβ链片段
SEQ ID NO：27 作为1101的免疫原使用的人纤维蛋白Bβ链片段
SEQ ID NO：28 可以作为免疫原使用的人纤维蛋白Bβ链片段(第2号肽)。

Claims (11)

1.抗体-药物偶联物(ADC)，其中，
抗体为结合纤维蛋白的抗体，其对于不溶性纤维蛋白的亲和性比对于纤维蛋白原的亲和性更高，
药物为细胞毒性剂，
抗体与药物以能够被纤溶酶切割的方式利用具有纤溶酶切割位点的接头连接。
2.根据权利要求1所述的ADC，其中，接头具有缬氨酸-亮氨酸-赖氨酸的肽序列作为纤溶酶切割位点。
3.用于治疗癌症的药物组合物，其包含权利要求1或2所述的ADC。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，其中，癌为浸润性癌。
5.结合纤维蛋白的抗体，其具有重链可变区和轻链可变区，
所述重链可变区具有SEQ ID NO：1所示的CDR1、SEQ ID NO：2所示的CDR2和SEQ ID NO：3所示的CDR3，和
所述轻链可变区具有SEQ ID NO：5所示的CDR1、SEQ ID NO：6所示的CDR2和SEQ ID NO：7所示的CDR3，
或与该抗体竞争结合纤维蛋白的抗体，或它们的抗原结合片段。
6.结合纤维蛋白的抗体或其抗原结合片段，所述抗体具有SEQ ID NO：4所示的重链可变区和SEQ ID NO：8所示的轻链可变区。
7.结合纤维蛋白的抗体，其具有重链可变区和轻链可变区，
所述重链可变区具有SEQ ID NO：9所示的CDR1、SEQ ID NO：10所示的CDR2和SEQ IDNO：11所示的CDR3，和
所述轻链可变区具有SEQ ID NO：13所示的CDR1、SEQ ID NO：14所示的CDR2和SEQ IDNO：15所示的CDR3，
或与该抗体竞争结合纤维蛋白的抗体，或它们的抗原结合片段。
8.结合纤维蛋白的抗体或其抗原结合片段，所述抗体具有SEQ ID NO：12所示的重链可变区和SEQ ID NO：16所示的轻链可变区。
9.根据权利要求1或2所述的ADC，其中抗体为权利要求5～8中任一项所述的抗体。
10.药物组合物，其包含权利要求9所述的ADC。
11.根据权利要求10所述的药物组合物，其用于治疗癌症。
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