JP2022546387A - 細胞間接着分子１（ｉｃａｍ１）抗体薬物抱合体およびそれらの使用 - Google Patents

細胞間接着分子１（ｉｃａｍ１）抗体薬物抱合体およびそれらの使用 Download PDF

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Abstract

本開示は、細胞間接着分子1(ICAM1)抗体を含む組成物、ならびに治療への応用、例えば、膵臓がんの処置および薬物応答の予測のために同組成物を使用するための方法を提供する。

Description

関連出願
本出願は、2019年8月23日に出願された「細胞間接着分子1(ICAM1)抗体薬物抱合体およびそれらの使用」との表題の米国仮出願第(Serial No.)62/891,170号(この内容全体は参照により本明細書に組み込まれる)の35 U.S.C.§119(e)の下、利益を主張するものである。
背景
膵臓がん(PC)は依然として最も致死率の高い疾患の1つであり、2019年内の合衆国において56,770名の死因を構成し、すべてのがん死亡率のうち7％に相当する。免疫治療およびナノ医療による治療の研究が近年高まっているにもかかわらず、PC患者の予後は5年生存が8％未満と著しく不良である。
概要
本開示は、膵臓がんの処置を改善しかつ精密医療(precision medicine)へむけて患者集団を階層化するために細胞間接着分子1(ICAM1)が標的になり得るとの驚くべき知見に、少なくとも一部、基づく。膵臓がん腫瘍の免疫抑制性の微小環境は、有効な処置にとって幾つかの課題(challenges)を提示する。例えば、膵臓がん腫瘍の腫瘍微小環境はしばしば、線維形成性の間質(desmoplastic 間質)および不十分な血管新生(poor vascularization)によって特徴付けられるが、これらはT細胞または薬物が効率的に腫瘍へ浸透するのを防ぐ物理的な障壁を創出する。これらの限界は、本開示によって、少なくとも一部は対処される。
本明細書に提供されるのは、いくつかの側面において、膵臓がんの処置に有用である細胞間接着分子1(ICAM1)を含む抗体-薬物抱合体(ADC)である。下に記載されるとおり、ICAM1抗体を含むADCの使用は、非がん性細胞より優先的に膵臓がん細胞を標的化するのを可能にするが、このことによって薬物の治療濃度域が改善させ得かつ毒性が限定され得る。膵臓がんの高い遺伝的異質性を考慮すると、患者集団同士の間で治療感度を予測することもまた、難易度が高い(challenging)。結果的に、さらなる本開示の側面は、膵臓がんの対象におけるICAM1抗体またはICAM1抗体を含むADCでの処置のための患者集団を同定する方法を提供する。
本開示の側面は、薬物へ抱合された細胞間接着分子1(ICAM1)抗体を含む、有効量の抗体薬物抱合体(ADC)を、これを必要とする対象へ投与することを含む、膵臓がんを処置する方法を提供する。
いくつかの態様において、薬物は、以下:N2'-デアセチル(Deacetyl)-N2'-(3-メルカプト-1-オキソプロピル)メルタンシン(DM1)、モノメチルアウリスタチンE(MMAE)、モノメチルアウリスタチンF(MMAF)、およびデュオカルマイシンからなる群から選択される。いくつかの態様において、薬物は、DM1である。
いくつかの態様において、ICAM1抗体および薬物は、リンカーを介して抱合されている。
いくつかの態様において、リンカーは、切断可能なリンカーである。いくつかの態様において、切断可能なリンカーは、以下:N-スクシニミジル4-(2-ピリジルジチオ)ペンタノアート(SPP)、N-スクシニミジル3-(2-ピリジルジチオ)ブタノアート(butanoate)(SPDB)、Sulfo-SPDB、バリン-シトルリン(Val-cit)、アセチルブチラート(acetyl butyrate)、およびCL2Aからなる群から選択される。いくつかの態様において、切断可能なリンカーは、Val-citである。
いくつかの態様において、リンカーは、切断不能なリンカーである。いくつかの態様において、切断不能なリンカーは、N-スクシニミジル4-(Nマレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシラート(SMCC)、およびマレイミドメチルシクロヘキサン-1-カルボキシラート(MCC)からなる群から選択される。いくつかの態様において、切断不能なリンカーは、N-スクシニミジル4-(Nマレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシラート(SMCC)リンカーである。
いくつかの態様において、ICAM1抗体は、IgG、Ig単量体、Fabフラグメント、F(ab')2フラグメント、Fdフラグメント、scFv、scAb、dAb、Fv、アフィボディ、二重特異性抗体、単一ドメイン重鎖抗体、および単一ドメイン軽鎖抗体からなる群から選択される。
いくつかの態様において、ICAM1抗体は、エンリモマブまたはHCD54である。
いくつかの態様において、ADC中のICAM1抗体と薬物との比率は、1:1～1:10である。いくつかの態様において、ADC中のICAM1抗体と薬物との比率は、1:4である。
いくつかの態様において、ADCは、注射を介して投与される。いくつかの態様において、注射は、静脈内注射または腫瘍内注射である。
さらなる本開示の側面は、N-スクシニミジル4-(Nマレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシラート(SMCC)リンカーを介してN2'-デアセチル-N2'-(3-メルカプト-1-オキソプロピル)メルタンシン(DM1)へ抱合された細胞間接着分子1(ICAM1)抗体を含む、有効量の抗体薬物抱合体(ADC)を、これを必要とする対象へ投与することを含む、膵臓がんを処置する方法を提供する。
さらなる本開示の側面は、膵臓がんを有する対象におけるICAM1抗体または薬物へ抱合された細胞間接着分子1(ICAM1)抗体を含む抗体薬物抱合体(ADC)での処置の応答性を予測する方法を提供するが、方法は以下:(i)イメージング剤(imaging agent)で標識された有効量のICAM1抗体を対象へ投与すること;および(ii)イメージングを介して腫瘍を視覚化すること;(iii)腫瘍上のICAM1のレベルを決定することを含み、ここでより高レベルのICAM1は、対象が、より低レベルのICAM1を有する対象と比較してICAM1抗体またはADCでの処置へより応答することを指し示す(例として、ICAM1のレベルが、より低レベルのICAM1を有する腫瘍をもつ対象と比較して、より高い場合に、処置へより応答するとして対象を同定すること)。
いくつかの態様において、(i)におけるICAM1抗体は、DTPA-Gdで標識されている。
いくつかの態様において、(ii)における視覚化は、磁気共鳴画像法(magnetic resonance imaging)(MRI)を介する。
いくつかの態様において、方法は、膵臓がんを処置する処置へ応答することが予測される対象へ、有効量のICAM1抗体またはADCを投与することをさらに含む。
いくつかの態様において、薬物は、以下:N2'-デアセチル-N2'-(3-メルカプト-1-オキソプロピル)メルタンシン(DM1)、モノメチルアウリスタチンE(MMAE)、モノメチルアウリスタチンF(MMAF)、およびデュオカルマイシンからなる群から選択される。いくつかの態様において、薬物は、DM1である。
いくつかの態様において、ICAM1抗体および薬物は、リンカーを介して抱合されている。
いくつかの態様において、リンカーは、切断可能なリンカーである。いくつかの態様において、切断可能なリンカーは、以下:N-スクシニミジル4-(2-ピリジルジチオ)ペンタノアート(SPP)、N-スクシニミジル3-(2-ピリジルジチオ)ブタノアート(SPDB)、Sulfo-SPDB、バリン-シトルリン(Val-cit)、アセチルブチラート、およびCL2Aからなる群から選択される。いくつかの態様において、切断可能なリンカーは、Val-citである。
いくつかの態様において、リンカーは、切断不能なリンカーである。いくつかの態様において、切断不能なリンカーは、N-スクシニミジル4-(Nマレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシラート(SMCC)、およびマレイミドメチルシクロヘキサン-1-カルボキシラート(MCC)からなる群から選択される。いくつかの態様において、切断不能なリンカーは、N-スクシニミジル4-(Nマレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシラート(SMCC)リンカーである。
いくつかの態様において、ICAM1抗体は、IgG、Ig単量体、Fabフラグメント、F(ab')2フラグメント、Fdフラグメント、scFv、scAb、dAb、Fv、アフィボディ、二重特異性抗体、単一ドメイン重鎖抗体、および単一ドメイン軽鎖抗体からなる群から選択される。
いくつかの態様において、ICAM1抗体は、エンリモマブまたはHCD54である。
いくつかの態様において、ADC中のICAM1抗体と薬物との比率は、1:1～1:10である。
いくつかの態様において、ADC中のICAM1抗体と薬物との比率は、1:4である。
さらなる本開示の側面は、薬物へ抱合された細胞間接着分子1(ICAM1)抗体を含む抗体薬物抱合体(ADC)を提供する。
いくつかの態様において、薬物は、以下:N2'-デアセチル-N2'-(3-メルカプト-1-オキソプロピル)メルタンシン(DM1)、モノメチルアウリスタチンE(MMAE)、モノメチルアウリスタチンF(MMAF)、およびデュオカルマイシンからなる群から選択される。いくつかの態様において、薬物は、DM1である。
いくつかの態様において、ICAM1抗体および薬物は、リンカーを介して抱合されている。
いくつかの態様において、リンカーは、切断可能なリンカーである。いくつかの態様において、切断可能なリンカーは、以下:N-スクシニミジル4-(2-ピリジルジチオ)ペンタノアート(SPP)、N-スクシニミジル3-(2-ピリジルジチオ)ブタノアート(SPDB)、Sulfo-SPDB、バリン-シトルリン(Val-cit)、アセチルブチラート、およびCL2Aからなる群から選択される。いくつかの態様において、切断可能なリンカーは、Val-citである。
いくつかの態様において、リンカーは、切断不能なリンカーである。いくつかの態様において、切断不能なリンカーは、N-スクシニミジル4-(Nマレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシラート(SMCC)、およびマレイミドメチル シクロヘキサン-1-カルボキシラート(MCC)からなる群から選択される。いくつかの態様において、切断不能なリンカーは、N-スクシニミジル4-(Nマレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシラート(SMCC)リンカーである。
いくつかの態様において、ICAM1抗体は、IgG、Ig単量体、Fabフラグメント、F(ab')2フラグメント、Fdフラグメント、scFv、scAb、dAb、Fv、アフィボディ、二重特異性抗体、単一ドメイン重鎖抗体、および単一ドメイン軽鎖抗体からなる群から選択される。
いくつかの態様において、ICAM1抗体は、エンリモマブまたはHCD54である。
いくつかの態様において、ADC中のICAM1抗体と薬物との比率は、1:1～1:10である。いくつかの態様において、ADC中のICAM1抗体と薬物との比率は、1:4である。
さらなる本開示の側面は、N-スクシニミジル4-(Nマレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシラート(SMCC)リンカーを介してN2'-デアセチル-N2'-(3-メルカプト-1-オキソプロピル)メルタンシン(DM1)へ抱合された細胞間接着分子1(ICAM1)抗体を含む抗体薬物抱合体(ADC)を提供する。
図面の簡単な記載
添付の図面は、縮尺どおりに描画することを意図していない。図面中、様々な図中で説明されている同一のまたは大体同一の各構成要素は、同様の数字によって表される。明確さを目的とするため、全ての構成要素が全ての図面に表示されていないこともある。
図面中:
図1A～1Hは、ICAM1が、ヒトPC組織および細胞において異なって過剰発現されていることを示す。図1Aは、膵臓の正常な上皮細胞と比較した、ヒトPC細胞における膜タンパク質発現のヒートマップである。図1Bは、PC細胞について選択された標的セット間の重複を示すベン図である。 図1Cは、PC細胞において上方調節された上位10の表面タンパク質、およびヒトPC細胞株におけるICAM1発現レベルを示す。図1Dは、ヒトPCおよび正常な膵臓の上皮細胞におけるICAM1のIF染色を示すイメージを含有する。 図1Eは、種々のステージのヒトPC腫瘍組織および正常な膵臓組織におけるICAM1のIHC染色の代表的なイメージを含有する。図1Fは、PCと正常組織との間のICAM1 IHC染色スコアの比較を示す。 図1Gは、TNMステージで補正された腫瘍マイクロアレイの病理学的スコア(pathological scores)を示す。図1Hは、種々のICAM1レベルに従う84名のPC患者の全生存のカプラン・マイヤー分析を示す。*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001。
図2A～2Gは、ICAM1抗体がin vivoでPC腫瘍を選択的に認識かつ標的にすることを示す。図2Aは、第0日にてPANC-1-LUCが注射され、腫瘍接種から28日後にICAM-AFまたはIgG-AFを受け(群あたりn=6)、第29日にて蛍光イメージングが実施された、同所性PCモデルの概略図表である。図2Bは、正常な膵臓組織を取り囲むPC腫瘍のex vivoでの蛍光イメージングを示す。図2Cは、腫瘍における蛍光強度の、対応する定量化を示す。 図2Dは、PANC-1細胞、BxPC-3細胞、およびHPNE細胞におけるICAM1 AbのPC特異的内在化を示す代表的なイメージングフローサイトメトリーのイメージを含有する。図2Eは、ICAM1抗体媒介細胞内在化に係るシグナル強度分析を示す。 図2Fは、ICAM1 AbまたはIgGの処置でのPANC-1およびBxPC-3の細胞増殖を示す。 図2Gは、ICAM1 Abの処置から24h後のPANC-1およびBxPC-3の応答を示す細胞運動軌跡を説明する。*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001。
図3A～3Lは、ICAM1-DM1がin vitroおよびin vivoで選択的にPC細胞を取り除くことを示す。図3Aは、ICAM1-DM1 ADCの概略図である。 図3Bは、ICAM1 Abへ抱合された種々のリンカーをもつ細胞傷害性ペイロードのスクリーニングの結果を示す。図3C～3Eは、IgG-DM1およびGEMと比較した、PANC-1(図3C)およびBxPC-3(図3D)、ならびに正常なHPNE(図3E)に対するICAM1-DM1の抗腫瘍活性を測定する細胞生存率アッセイの結果を示す。 図3C～3Eは、IgG-DM1およびGEMと比較した、PANC-1(図3C)およびBxPC-3(図3D)、ならびに正常なHPNE(図3E)に対するICAM1-DM1の抗腫瘍活性を測定する細胞生存率アッセイの結果を示す。図3Fは、第0週にてLUC-PANC-1-GFPが注射され、腫瘍接種から2週後にICAM1-DM1、IgG-DM、ゲムシタビン、またはPBSを受けた(群あたりn=5,6)、同所性PCモデルの概略図表である。IVISを隔週で実施した。図3Gは、GFP発現PC腫瘍のex vivoでの蛍光イメージングを示す。 図3Hは、対応する腫瘍直径を示す。図3Iは、種々の処置群における腫瘍の生物発光のトータルフラックス(total flux)を示す。 図3Jは、ICAM1-DM1 ADCの処置が腫瘍細胞増殖を阻害することを示すイメージを含有する。図3Kは、Ki67+細胞のパーセンテージの、対応する定量化を示す。 図3Lは、ICAM1-DM1 ADCの処置が転移を阻害することを示す。*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001。
図4A～4Cは、ICAM1発現PC腫瘍をin vivoで査定する非侵襲MRIの結果を示す。図4Aは、第0日にてPANC-1-LUCが注射され、腫瘍接種から28日後にICAM-GdまたはIgG-Gdを受け(群あたりn=3)、第29日にてMRIが実施された、同所性PCモデルの概略図表である。 図4Bは、ICAM1-GdおよびIgG-Gdを受けた同所性PC腫瘍を担持するマウスの代表的なin vivoでのT1-およびT2-強調MRイメージを示す。腫瘍を丸で囲み、挿入図において拡大した。図4Cは、PC腫瘍におけるMRIシグナル-対-ノイズ比の定量的な変化を示す。バーグラフは平均値±SDとして示す。*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001。
図5は、種々の処置群からのマウス臓器の代表的なH&E染色を示す。スケールバー、100μm。微小転移部位は大きな星印によって指し示す。脾臓中の増量した(Escalated)リンパ球は小さい星印によって指し示す。 図6は、ICAM1-DM1処置がPDAC転移を低減したことを示す。 図7は、ICAM1-DM1が処置を受けたマウスにおいて長期にわたり毒性を有さないことを示す。
ある態様の詳細な記載
今日まで、膵臓がん(PC)は依然として最も致死率の高い疾患であって、2019年内の合衆国において56,770名の死因を構成し、すべてのがん死亡率のうち7％に相当する。免疫治療およびナノ医療による治療の研究が近年高まっているにもかかわらず、PC患者の予後は5年生存が8％未満と著しく不良である。これらの望ましくない結果は、線維形成性の間質および不十分な血管新生によって特徴付けられるPC腫瘍の免疫抑制性の腫瘍微小環境(TME)に大きく起因する。かかるTMEは、T細胞またはナノ医療が効率的に腫瘍へ浸透するのを、かつPC細胞と直接相互作用するのを防ぐ物理的な障壁を創出し、このことが好ましくない効き目に繋がる。強力な腫瘍特異的な効き目を維持しつつ浸潤したPC腫瘍を良くし得る新規な標的化治療剤を開発することが、不可欠なニーズを浮き彫りにする。
抗体薬物抱合体(ADC)は、T細胞免疫治療への応答が不十分な乳がん等の浸潤性(aggressive)固形腫瘍を包含する数種のがんに対して、有望な臨床治療の効き目を示している。従来のPC標的(例として、EGFR、EpHA2、およびメソテリン)を利用する幾つかのPC標的化ADCが開発されてきたが、未だ、確立されたPC標的およびその他の候補の、それら細胞表面タンパク質レベルでの系統的かつ定量的な比較が足りていない。
本明細書に提供されるのは、いくつかの側面において、より最適なPC免疫治療標的を発見してPC標的化ADCの開発を促進するための、細胞表面タンパク質の公正かつ定量的なスクリーニングである。ICAM1は、潜在的なPC免疫治療標的として同定された。本明細書に記載のICAM1 ADCは、in vivoでの強力かつ持続的な(durable)PC腫瘍退縮を誘導した。本開示はまた、膵臓がんのための免疫治療(限定せずに、CARTなどのT細胞ベースの免疫治療、およびチェックポイント遮断を包含する)の標的としてのICAM1の使用も想定している。
さらに、本開示は、ICAM1標的化免疫治療に好適なICAM1発現腫瘍を同定する非侵襲MRIアプローチを提供する。かかる患者は、いくつかの態様において、PCの処置のためのICAM1 ADCが投与される。
本開示の側面は、細胞間接着分子1(ICAM1)および薬物を含む抗体-薬物抱合体(ADC)、膵臓がんの処置において同抱合体を使用する方法、ならびにICAM1抗体またはICAM1抗体-薬物抱合体(ADC)での処置の応答性を予測する方法を提供する。
抗体-薬物抱合体(ADC)
I. ICAM1抗体
抗体-薬物抱合体(ADC)は、薬物へ抱合された抗体を含む免疫治療剤の類である。本開示のADCは、ICAM1を発現する細胞を標的にし得る。ICAM1は、タイプCD11a/CD18またはCD11b/CD18のインテグリンに結合することが示されている細胞表面糖タンパク質であって、細胞-細胞相互作用を媒介し白血球の内皮への移動(leukocyte endothelial transmigration)を促進することに関係している。ICAM1はまた、ICAM-1、BB2、表面抗原分類54(CD54)、およびP3.58とも称される。
ICAM1をコードするアミノ酸配列の非限定例は、UniProtKB受入番号P13597およびP05362を包含する。
UniProtKB受託番号P13597は、Mus MusculusからのICAM1をコードし、以下の配列を有する:
MASTRAKPTLPLLLALVTVVIPGPGDAQVSIHPREAFLPQGGSVQVNCSSSCKEDLSLGLETQWLKDELESGPNWKLFELSEIGEDSSPLCFENCGTVQSSASATITVYSFPESVELRPLPAWQQVGKDLTLRCHVDGGAPRTQLSAVLLRGEEILSRQPVGGHPKDPKEITFTVLASRGDHGANFSCRTELDLRPQGLALFSNVSEARSLRTFDLPATIPKLDTPDLLEVGTQQKLFCSLEGLFPASEARIYLELGGQMPTQESTNSSDSVSATALVEVTEEFDRTLPLRCVLELADQILETQRTLTVYNFSAPVLTLSQLEVSEGSQVTVKCEAHSGSKVVLLSGVEPRPPTPQVQFTLNASSEDHKRSFFCSAALEVAGKFLFKNQTLELHVLYGPRLDETDCLGNWTWQEGSQQTLKCQAWGNPSPKMTCRRKADGALLPIGVVKSVKQEMNGTYVCHAFSSHGNVTRNVYLTVLYHSQNNWTIIILVPVLLVIVGLVMAASYVYNRQRKIRIYKLQKAQEEAIKLKGQAPPP(配列番号1)。
UniProtKB受託番号P05362は、Homo SapiensからのICAM1をコードし、以下の配列を有する:
MAPSSPRPALPALLVLLGALFPGPGNAQTSVSPSKVILPRGGSVLVTCSTSCDQPKLLGIETPLPKKELLLPGNNRKVYELSNVQEDSQPMCYSNCPDGQSTAKTFLTVYWTPERVELAPLPSWQPVGKNLTLRCQVEGGAPRANLTVVLLRGEKELKREPAVGEPAEVTTTVLVRRDHHGANFSCRTELDLRPQGLELFENTSAPYQLQTFVLPATPPQLVSPRVLEVDTQGTVVCSLDGLFPVSEAQVHLALGDQRLNPTVTYGNDSFSAKASVSVTAEDEGTQRLTCAVILGNQSQETLQTVTIYSFPAPNVILTKPEVSEGTEVTVKCEAHPRAKVTLNGVPAQPLGPRAQLLLKATPEDNGRSFSCSATLEVAGQLIHKNQTRELRVLYGPRLDERDCPGNWTWPENSQQTPMCQAWGNPLPELKCLKDGTFPLPIGESVTVTRDLEGTYLCRARSTQGEVTRKVTVNVLSPRYEIVIITVVAAAVIMGTAGLSTYLYNRQRKIKKYRLQQAQKGTPMKPNTQATPP(配列番号2)。
いくつかの態様において、ICAM1タンパク質は、配列番号1もしくは配列番号2と、少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一の配列を含む。追加のICAM1タンパク質も周知であり、公的に入手可能なデータベース(例として、GenBankを包含する)を使用して同定されてもよい。ICAM1タンパク質は、homo sapiensを包含するいずれの種からのものであってもよい。
本開示の抗体は、ICAM1に結合することが可能である。いくつかの態様において、ICAM1抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの態様において、ICAM1抗体は、ポリクローナル抗体である。いくつかの態様において、ICAM1抗体は、マウス抗体である。いくつかの態様において、ICAM1抗体は、ヒト化抗体である。
ICAM1抗体の非限定例は、クローンHCD54(BioLegendにて市販の「HCD54」、カタログ# 322702)、UV3、RR1.1、R6.5(Thermo Fisher Scientificにて市販のBIRR-1またはエンリモマブ、カタログ# BMS1011)、およびBI-505を包含する。R6.5(エンリモマブ)は、例として、合衆国特許第5,324,510号(これは参照により本明細書に組み込まれる)に記載されるとおり、ATCC HB-9580ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナルマウス抗体である。
UV3はモノクローナル抗体であり、骨髄腫細胞上ICAM-1へ結合することが示されている。いくつかの態様において、ICAM1抗体は、UV3のF(ab)'2フラグメントである。例として、Huang et al.,Hybridoma.1993 Dec;12(6):661-75;およびColeman et al.,J Immunother.2006 Sep-Oct;29(5):489-98(これらは各々、参照により本明細書に組み込まれる)を見よ。RR1.1は、モノクローナルICAM1抗体である。例として、Rothlein and Springer,1986 J.Exp.Med.163,1132-1149(これは参照により本明細書に組み込まれる)を見よ。HCD54は、モノクローナルICAM1抗体である。BI-505は、完全ヒトICAM1モノクローナル抗体である。例として、Hansson et al.,Clin Cancer Res.2015 Jun 15;21(12):2730-6(これは参照により本明細書に組み込まれる)を見よ。
用語「結合する(bind)」は、2つの実体(例として、2つのタンパク質)の結び付き(association)を指す。2つの実体(例として、2つのタンパク質)は、これらの間の親和性(KD)が、＜10-4M、＜10-5M、＜10-6M、＜10-7M、＜10-8M、＜10-9M、＜10-10M、＜10-11M、または＜10-12Mであるとき、互いへ結合すると見なされる。当業者は、2つの実体(例として、2つのタンパク質)の親和性を査定する仕方を熟知している。
用語「抗体」は、全抗体(2つの重鎖および2つの軽鎖を有する免疫グロブリン)、抗体模倣薬、および抗体フラグメントを網羅する。「免疫グロブリン(Ig)」は、外来性物質(例として、細菌およびウイルスなどの病原体)を中和する免疫系によって使用される形質細胞によって主に産生される大きなY形状のタンパク質である。抗体は、IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMに分類されてもよい。「抗体フラグメント」は、いずれの抗原結合性フラグメント(すなわち、「抗原結合部」)またはそれらの単一鎖も包含する。いくつかの態様において、「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも2つの重(H)鎖および2つの軽(L)鎖を含む糖タンパク質、またはその抗原結合部を指す。各重鎖は、重鎖可変領域(本明細書中VHと略される)および重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、CH1、CH2、およびCH3の3ドメインから構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域(本明細書中VLと略される)および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、CLの1ドメインから構成される。VH領域およびVL領域はさらに、フレームワーク領域(FR)と称されるより保存された領域とともにちりばめられた、相補性決定領域(CDR)と称される超可変性の領域に細分され得る。VHおよびVLの各々は3CDRおよび4FRから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4で配置される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞(例として、エフェクター細胞)および古典的な補体系の第1成分(C1q)を包含する宿主の組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介することもある。いくつかの態様において、抗体は、免疫グロブリン(Ig)単量体である。抗体は、ポリクローナル抗体であっても、またはモノクローナル抗体であってもよい。
いくつかの態様において、抗体は、2つの同一なL鎖および2つのH鎖から構成されるヘテロ四量体の糖タンパク質である(IgM抗体は、塩基性ヘテロ四量体単位と、J鎖と呼ばれる追加のポリペプチドとの5つからなり、したがって10の抗原結合部位を含有する一方、分泌されたIgA抗体は重合して塩基性4鎖単位とJ鎖との2～5つを含む多価集合体を形成し得る)。IgGについて言えば、4鎖単位は一般に、約150,000ダルトンである。各L鎖は、1つの共有結合のジスルフィド結合によってH鎖へ連結されている一方、2つのH鎖は、H鎖アイソタイプに応じ、1以上のジスルフィド結合によって互いに連結されている。H鎖およびL鎖の各々はまた、規則的に間をおいた(spaced)鎖内ジスルフィド架橋も有する。各H鎖はN末端にて、可変ドメイン(VH)と、これに続く3つの定常領域(CH)をα鎖およびγ鎖の各々につき有し、μおよびεのアイソタイプについては4つのCHドメインを有する。各L鎖はN末端にて可変ドメイン(VL)と、これに続く定常領域(CL)をその他の末にて有する。VLはVHとともに配列され、CLは重鎖(CH1)の第1定常領域とともに配列される。特定のアミノ酸残基は、軽鎖と重鎖との可変ドメイン間の界面を形成するものと考えられる。VHとVLとの対形成は一緒に、単一の抗原結合部位を形成する。種々のクラスの抗体の非限定例の構造および特性については、例として、Basic and Clinical Immunology,8th edition,Daniel P.Stites,Abba I.Terr and Tristram G.Parslow(eds.),Appleton & Lange,Norwalk,Conn.,1994,page 71 and Chapter 6(参照により本明細書に組み込まれる)を見よ。いくつかの態様において、抗体は、IgGである。
いずれの脊椎動物種からのL鎖も、それらの定常領域のアミノ酸配列に基づき、カッパおよびラムダと呼ばれる2つの明確に別個のタイプのうち1つに割り当てられ得る。それら重鎖の定常領域(CH)のアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは、種々のクラスまたはアイソタイプに割り当てられ得る。免疫グロブリンには5つのクラス:IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMがあり、夫々α、δ、ε、γ、およびμと指定される重鎖を有する。γおよびαのクラスはさらに、CHの配列および機能における相対的にわずかな相違に基づきサブクラスに分かれ、例として、ヒトは以下のサブクラス:IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2を発現する。
Vドメインは抗原結合を媒介し、具体的な抗体の特異性をその具体的な抗原について定義する。しかしながら、可変性は、可変ドメインの110アミノ酸の長さ(span)にわたって均等には分配されていない。代わりに、V領域は、各9～12アミノ酸長(long)の「超可変領域」と呼ばれる極度の可変性のより短い領域によって分離された15～30アミノ酸のフレームワーク領域(FR)と呼ばれる相対的に不変の範囲(stretches)からなる。ネイティブな重鎖および軽鎖の可変ドメインは各々、3つの超可変領域によって接続された、4つのFR(大部分がβシート立体配置を導入する)を含むが、前記FRは、βシート構造に接続するループを形成し、いくつかのケースにおいてはβシート構造の一部を形成する。各鎖中の超可変領域は、他の鎖からの超可変領域と、FRにごく接近して一緒に保持されており、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する(例として、Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)(参照により本明細書に組み込まれる)を見よ)。定常ドメインは、抗体が抗原へ結合することには直接関与し(involved)ないが、抗体依存性の細胞の細胞傷害性(ADCC)における抗体の関与(participation)などの様々なエフェクター機能を呈する。
いくつかの態様において、抗体は、モノクローナル抗体である。「モノクローナル抗体」は実質的に均一な抗体集団から得られる抗体である、すなわち、個々の抗体を含むその集団は、少量存在することもある天然に存在する起こり得る突然変異を除き、同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であって、単一の抗原部位に対して向けられる。さらにまた、種々の決定基(エピトープ)に対して向けられる種々の抗体を包含するポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して向けられる。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、これらが他の抗体によって汚染されずに合成され得る点で有利である。修飾語句「モノクローナル」は、いずれか具体的な方法による抗体の産生を要するものとして解釈されるべきではない。例えば、本発明において有用なモノクローナル抗体は、Kohler et al.,Nature,256:495(1975)によって初めて記載されたハイブリドーマ方法論によって調製されてもよく、または細菌細胞、真核細胞、動物細胞、もしくは植物細胞において組換えDNA方法を使用してなされてもよい(例として、米国特許第4,816,567号を見よ)。モノクローナル抗体はまた、例として、Clackson et al.,Nature,352:624-628(1991)およびMarks et al.,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)(参照により本明細書に組み込まれる)に記載の技法を使用して、ファージ抗体ライブラリから単離されてもよい。
本明細書に記載のモノクローナル抗体は、「キメラ」抗体ならびにかかる抗体のフラグメント(これらが所望される生物活性を呈する限り)を網羅するが、前記抗体における重鎖および/または軽鎖の一部が、具体的な種に由来する抗体または具体的な抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一であるかあるいはこれと相同である一方、その鎖(単数または複数)の残りは、別の種に由来する抗体または別の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一であるかあるいはこれと相同である(米国特許第4,816,567号;およびMorrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984)を見よ)。本明細書中関心のあるキメラ抗体は、霊長目の非ヒト動物(例として、旧世界ザル、類人猿等々)に由来する可変ドメイン抗原結合配列およびヒト定常領域配列を含む「霊長類化(primatized)」抗体を包含する。
いくつかの態様において、抗体は、ポリクローナル抗体である。「ポリクローナル抗体」は、1より多くの免疫原性の抗原決定基と反応する異なる抗体分子の混合物である。ポリクローナル抗体は、哺乳動物の血液、分泌、もしくは他の体液から、または卵から、単離あるいは精製されてもよい。ポリクローナル抗体はまた、組換えであってもよい。組換えポリクローナル抗体は、組換え技術の使用によって生成されたポリクローナル抗体である。組換えで生成されたポリクローナル抗体は大抵、高濃度の異なる抗体分子を含有しており、これらのすべてまたは大多数(例として、80％超、85％超、90％超、95％超、99％超、またはこれを超える)が、1より多くのエピトープから構成される抗原に対して所望される結合活性を発揮している。
いくつかの態様において、抗体は、ヒトにおける(例として、治療剤としての)使用のために「ヒト化され」る。「ヒト化された」形態の非ヒト(例として、齧歯類の動物)抗体は、非ヒト抗体に由来する最小限の配列を含有するキメラ抗体である。ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域からの残基が、所望される抗体の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、ウサギ、または霊長目の非ヒト動物などの非ヒト種(ドナー抗体)の超可変領域からの残基によって置き換えられているヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(FR)残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられている。さらにまた、ヒト化抗体は、レシピエント抗体からもドナー抗体からも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は、抗体性能をさらに精密化させる(refine)ためになされる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも1つの可変ドメイン、典型的には2つの可変ドメインの実質的にすべてを含んでいるが、前記可変ドメインにおける高可変ループのすべてまたは実質的にすべてが、非ヒト免疫グロブリンの高可変ループに相当し、FRのすべてまたは実質的にすべてが、ヒト免疫グロブリン配列のFRである。ヒト化抗体はまた任意に、少なくとも一部の免疫グロブリン定常領域(Fc)、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域も含んでいるであろう。さらなる詳細については、Jones et al.,Nature 321:522-525(1986);Riechmann et al.,Nature 332:323-329(1988);およびPresta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)を見よ。
いくつかの態様において、抗体は、完全長ICAM1抗体の抗原結合部を含有する「抗体フラグメント」である。いくつかの態様において、抗体は、単一ドメイン重鎖抗体である。いくつかの態様において、抗体は、単一ドメイン軽鎖抗体である。抗体の抗原結合部は、抗原への特異的結合能を保持する、抗体の1以上のフラグメントを指す。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体のフラグメントによって実施され得ることが示されている。抗体の用語「抗原結合部」内に網羅される結合フラグメントの例は、(i)VLドメイン、VHドメイン、CLドメイン、およびCH1ドメインからなる一価フラグメントである、Fabフラグメント;(ii)ヒンジ領域にてジスルフィド架橋によって連結された2つのFabフラグメントを含む二価フラグメントである、F(ab')2フラグメント;(iii)VHドメインおよびCH1ドメインからなる、Fdフラグメント;(iv)抗体の単一腕のVLドメインおよびVHドメインからなる、Fvフラグメント;(v)VHドメインからなる、dAbフラグメント(例として、Ward et al.,(1989)Nature 341:544-546(参照により本明細書に組み込まれる)に記載のとおり);ならびに(vi)単離された相補性決定領域(CDR)を包含する。さらにまた、Fvフラグメントの2つのドメインであるVLおよびVHは、別々の遺伝子によってコードされるが、これらは、組換え方法を使用し、合成リンカーによって結び合わされ得るが、前記合成リンカーはこれらを、VL領域とVH領域とを一組にさせる単一タンパク質鎖として一価の分子を形成することを可能にさせる(単一鎖Fv(scFv)として知られている;例として、Bird et al.(1988)Science 242:423-426;およびHuston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(参照により本明細書に組み込まれる)を見よ)。かかる単一鎖抗体はまた、抗体の用語「抗原結合部」内に網羅されることも意図される。これらの抗体フラグメントは、当業者に知られている従来の技法を使用して得られ、前記フラグメントは、完全長抗体と同じやり方で実用性についてスクリーニングされる。
いくつかの態様において、抗体フラグメントは、Fcフラグメント、Fvフラグメント、または単一変化(single-change)Fvフラグメントであってもよい。Fcフラグメントは、ジスルフィドによって一緒に保持された両H鎖のカルボキシ末部を含む。抗体のエフェクター機能はFc領域中の配列によって決定されるが、その領域はまた、あるタイプの細胞上に見出されるFc受容体(FcR)によって認識される部分でもある。
Fvフラグメントは、抗原を認識かつ結合する完全な部位を含有する最小限の抗体フラグメントである。このフラグメントは、緊密な非共有結合の結び付きで、1つの重鎖および1つの軽鎖の可変領域ドメインの二量体からなる。これらの折り畳みから、2つのドメインが、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与しかつ抗体へ抗原結合特異性を付与する6つの高可変ループ(H鎖およびL鎖の各々から3ループ)を生む。しかしながら、単一の可変ドメイン(または抗原に特異的な3つのCDRしか含まないFvの半分)でさえも抗原への認識能および結合能を有するが、親和性が結合部位全体より低い。
「sFv」もしくは「scFv」ともまた略される単鎖Fvは、接続されると単一ポリペプチド鎖になるVH抗体ドメインおよびVL抗体ドメインを含む抗体フラグメントである。好ましくは、sFvポリペプチドはさらに、VHとVLとのドメイン間に、sFvに抗原結合にとって所望される構造を形成することを可能にさせるポリペプチドリンカーを含む(例として、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994);Borrebaeck 1995(参照により本明細書に組み込まれる)に記載のとおり)。いくつかの態様において、抗体は、二量体化scFV(二重特異性抗体)、scFV三量体(三重特異性抗体)、またはscFV四量体(四重特異性抗体)である。
本開示の抗体は、アフィボディ分子を包含する抗体模倣薬を包含する。アフィボディは、抗原結合分子(例として、抗体模倣薬)として機能する3つのヘリックス束を含む小さいタンパク質である。一般に、アフィボディは、長さがおよそ58アミノ酸であり、およそ6kDaのモル質量を有する。結合特性がユニークなアフィボディ分子は、親タンパク質ドメインの結合活性に関与する2つのアルファ-ヘリックス中に位置付けられる13アミノ酸のランダム化によって取得される。所望される標的タンパク質に結合する特定のアフィボディ分子は、ファージディスプレーなどの方法を使用し、数十億の異なるバリアントを含有するプール(ライブラリ)から単離され得る。
いくつかの態様において、ICAM1抗体は、ICAM1の細胞外部分に存在するエピトープへ結合する。ICAM1の「細胞外部分」は、サイトゾルの外側であって(サイトゾル内側にある部分とは対照的に)細胞表面上にあるICAM1の部分を指す。ICAM1の細胞外部分は典型的には、含む。
抗体(例として、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体)を産生する方法は、当該技術分野において知られている。例えば、ポリクローナル抗体は、選んだアレルゲンで動物(好ましくは、哺乳動物)を免疫し、これに続き血液、骨髄、リンパ節、または脾臓から抗体産生Bリンパ球を単離することによって調製されてもよい。代替的に、抗体産生細胞は、動物から単離されてin vitroでアレルゲン(これに対し抗体がもたらされることになる)へ曝露されてもよい。次いで抗体産生細胞は、任意に骨髄腫などの不死化細胞株への融合後、抗体産生細胞集団を得るために培養されてもよい。いくつかの態様において、出発材料としてのBリンパ球は、完全ヒトポリクローナル抗体を生成するために、アレルギー患者の組織から単離されてもよい。抗体は、完全ヒトポリクローナル抗体を生成するために、出発材料としてマウス、ラット、ブタ(pigs)(豚(swine))、ヒツジ、ウシ(bovine)の材料、またはヒト免疫グロブリン遺伝子の他のトランスジェニック動物において産生されてもよい。いくつかの態様において、ヒト免疫グロブリン遺伝子のトランスジェニックマウスまたは他の動物(例として、米国特許第5,939,598号に開示されるとおり)は、Bリンパ球の抽出またはポリクローナル血清の精製によって動物からポリクローナル抗体を調製する前に、免疫されることで特定の抗体および抗体産生細胞のin vivoでの生成を刺激してもよい。
モノクローナル抗体は、典型的には、骨髄腫細胞を所望される抗原で免疫されたマウス脾臓細胞と融合すること(すなわち、ハイブリドーマ技術)を伴う細胞培養によって作製される。細胞の混合物は希釈されて、クローンが、マイクロタイターウェル上の単一の親細胞から成長させられる。異なるクローンによって分泌された抗体は、次いで、それらの抗原への結合能について(ELISAもしくは抗原マイクロアレイアッセイなどの試験で)アッセイされるか、または免疫ドットブロットされる。最も産生能がありかつ安定したクローンは、次いで、今後の使用について選択される。
II. 薬物
ADCにおける使用に好適な薬物は、膵臓がんに対して治療活性のある剤を包含する。薬物の非限定例は、化学治療剤を包含する。いくつかの場合において、薬物は、小分子である。いくつかの態様において、薬物は、細胞傷害性小分子である。いくつかの態様において、薬物は、細胞増殖抑制性の小分子である。
ADCにおける使用に好適な薬物の非限定例は、N2'-デアセチル-N2'-(3-メルカプト-1-オキソプロピル)メルタンシン(DM1)、モノメチルアウリスタチンE(MMAE)、モノメチルアウリスタチンF(MMAF)、およびデュオカルマイシン、パクリタキセル、エベロリムス、フルオロウラシル(5-FU)、ゲムシタビン、ゲムシタビン塩酸塩、マイトマイシンC、ならびにそれらの誘導体を包含する。いくつかの態様において、薬物は、マイタンシンまたはその類似体である。いくつかの態様において、薬物は、DM1である。DM1は、チューブリン重合を阻害することが示されている細胞傷害性マイタンシン類似体である。いくつかの態様において、マイタンシン類似体は、DM4である。
用語「小分子」は、天然に存在するかまたは人工的に(例として、化学合成を介して)創出されるかにかかわらず、相対的に低い分子量を有する分子を指す。典型的には、小分子は、有機化合物である(例として、炭素を含有する)。小分子は、複数の炭素-炭素結合、立体中心、および他の官能基(例として、アミン、ヒドロキシル、カルボニル、および複素環式の環等々)を含有していてもよい。ある態様において、小分子の分子量は、約1,000g/mol以下、約900g/mol以下、約800g/mol以下、約700g/mol以下、約600g/mol以下、約500g/mol以下、約400g/mol以下、約300g/mol以下、約200g/mol以下、または約100g/mol以下である。ある態様において、小分子の分子量は、少なくとも約100g/mol、少なくとも約200g/mol、少なくとも約300g/mol、少なくとも約400g/mol、少なくとも約500g/mol、少なくとも約600g/mol、少なくとも約700g/mol、少なくとも約800g/mol、または少なくとも約900g/mol、または少なくとも約1,000g/molである。また上の範囲の組み合わせ(例として、少なくとも約200g/molおよび約500g/mol以下)もあり得る。
いずれの知られている化学治療薬も、本明細書に記載のADC中の薬物として使用されてもよい。非限定的な例示化学治療薬は、以下:アクチノマイシン、オールトランス型レチノイン酸、アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、カルボプラチン、カペシタビン、シスプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、シタラビン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エポチロン、エトポシド、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イマニチブ、イリノテカン、メクロレタミン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、テニポシド、チオグアニン、トポテカン、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビノレルビンを包含する。
III. リンカー
1以上の薬物は、当該技術分野において知られている技法を使用してICAM1抗体へ抱合されてもよい。いくつかの態様において、複数の(例として、例として、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれ以上の)薬物が、ICAM1抗体へ抱合されている。ADC中のICAM1抗体と薬物との比率は、1:1～1:10(例として、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、または1:10)であってもよい。いくつかの態様において、ADC中のICAM1抗体と薬物との比率は、1:4である。
ICAM1抗体は、直接かまたはリンカーを介してかのいずれかで、第2の実体へ抱合されていてもよい。本明細書に使用されるとき、「抱合された(されている)」または「付着された(されている)」は、好ましくは2つの実体間での結び付きの治療上または診断上の利益が実現されるのに充分な親和性で、2つの実体が結び付けられていることを意味する。いくつかの態様において、リンカーは、ADC中、ICAM1抗体を薬物へ抱合させる。ICAM1抗体のN末端またはC末端は、薬物へ抱合されていてもよい。いくつかの態様において、リンカーは、ICAM1抗体をイメージング剤へ抱合されるのに使用され得る。ICAM1抗体のN末端またはC末端は、イメージング剤へ抱合されていてもよい。
いくつかの態様において、リンカーは、切断可能なリンカーである。本明細書に使用されるとき、切断可能なリンカーは、抱合された部分を、刺激に応えて放出することが可能である。いくつかの態様において、刺激は、生理学的な刺激である。刺激の非限定例は、酵素の存在、酸性条件、塩基性条件、または還元条件を包含する。例えば、切断可能なリンカーは、ペプチドリンカー、β-グルクロニドリンカー、グルタチオン感受性リンカー(またはジスルフィドリンカー)、およびpH感受性リンカーを包含する。いくつかの態様において、pH感受性リンカーは、5.0と6.5との間のpH、または4.5と5.0とのpHの間にて切断される。いくつかの態様において、pH感受性リンカーは、pHが7と7.5との間にあるときは切断されない。いくつかの態様において、pH感受性リンカーは、pHが7.3と7.5との間にあるときは切断されない。いくつかの態様において、切断可能なリンカーは、プロテアーゼ感受性リンカーである。
切断可能なリンカーの例は、N-スクシニミジル4-(2-ピリジルジチオ)ペンタノアート(SPP)、N-スクシニミジル3-(2-ピリジルジチオ)ブタノアート(SPDB)、Sulfo-SPDB、バリン-シトルリンジペプチド(Val-cit)、アセチルブチラート、およびCL2Aを包含する。いくつかの態様において、切断可能なリンカーは、Val-citである。また例として、Donaghy,MAbs.2016 May-Jun;8(4):659-71も見よ。
いくつかの態様において、リンカーは、切断不能である。いくつかの態様において、切断不能なリンカーは、対象における体循環内では切断されないリンカーである。いくつかの態様において、切断不能なリンカーは、プロテアーゼ切断に耐性があるリンカーである。切断不能なリンカーは、N-スクシニミジル4-(Nマレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシラート(SMCC)、およびマレイミドメチルシクロヘキサン-1-カルボキシラート(MCC)を包含する。いくつかの態様において、切断不能なリンカーは、N-スクシニミジル4-(Nマレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシラート(SMCC)リンカーである。
抗体-薬物抱合体のいずれも、当該技術分野において知られている方法を使用して合成されてもよい。例として、Yao et al.,Int J Mol Sci.2016 Feb 2;17(2).pii:E194を見よ。
薬物へ抱合されたICAM1抗体を含むADCはまた、1つには薬物(例として、化学治療薬)に毒性があり重度の副作用を引き起こすとの理由から、治療に使用することも有利である。薬物(例として、DM1)をICAM1抗体へ抱合させることによって、ADCの毒性は、その遊離形態の薬物と比較して、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも99％まで低減させられてもよい。
他のICAM1抗体抱合体
ICAM1抗体および/または本開示のADCのいずれも、膵臓がん対象の治療感度を予測するのに有用なこともあるイメージング剤へ抱合されていてもよい。例えば、コンピュータ断層撮影法(CT)、陽電子放射断層撮影(PET)、磁気共鳴画像法(MRI)、および内視鏡的検出(例として、超音波内視鏡検査)用のイメージング剤が使用されてもよく、これらは造影剤(contrast agents)を包含し得る。例として、Bird-Lieberman et al.,Nat Med.2012;18(2):315-21;Van den Brande et al.,Gut.2007;56(4):509-17(これらは各々、参照により本明細書に組み込まれる)を見よ。いくつかの態様において、造影剤は、塩として投与される。いくつかの態様において、イメージング剤はガドリニウム-ベースのMRI造影剤である。例えば、イメージング剤は、ガドリニウム-ジエチレントリアミンペンタ酢酸(Gd-DTPAまたはDTPA-Gd)であってもよい。例として、Carr et al.,AJR Am J Roentgenol.1984 Aug;143(2):215-24を見よ。
1以上のイメージング剤は、当該技術分野において知られている技法を使用して、ICAM1抗体または本明細書に記載のADCへ抱合されてもよい。いくつかの態様において、複数の(例として、例として、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれ以上の)イメージング剤が、ICAM1抗体へ抱合されている。ICAM1抗体またはADCとイメージング剤との比率は、1:1～1:10(例として、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、または1:10)であってもよい。いくつかの態様において、ICAM1抗体またはADCとイメージング剤との比率は、1:4である。本明細書に開示のリンカーのいずれも、イメージング剤をICAM1抗体へまたは本明細書に記載のADCへ抱合するために使用されてもよい。
イメージング剤は、好適な検出方法で(例として、CT、ペット、MRI、超音波、および/または内視鏡的検出によって)視覚化されてもよい。
医薬組成物およびそれらの使用
本明細書に開示のADCまたは他のICAM1抗体抱合体のいずれかを含む組成物は、本開示によって網羅される。いくつかの態様において、組成物は、対象への投与のために医薬組成物として製剤化されている。
対象は、膵臓がんを有し得るか、膵臓がんを有すると疑われ得るか、または膵臓がんのリスクがあり得る。膵臓がんは、腫瘍が始まる細胞型に基づき分類される。最も一般的なタイプの膵臓がんは、膵外分泌腺のがんである膵臓腺癌である。対照的に、膵神経内分泌腫瘍(NET)または島細胞腫瘍は、神経内分泌細胞で始まる。
膵臓がんはまた、がんが転移したか否かにに基づき階層化されてもよい。膵臓がんは、ステージ0(in situの癌)、ステージI、ステージII(例として、ステージIIAもしくはステージIIB)、ステージIII、またはステージ(IV)であってもよい。非限定的な病期分類(staging)方法は、腫瘍の程度(T)、がんのすぐ近くのリンパ節への広がり(N)、およびがんが遠位部位まで広がっているかどうか(M)を評価するTNM系である。次いでT、N、およびMの様々なレベル(例として、表1)が使用されて、膵臓がんのステージ(例として、表2)が決定されてもよい。表1～2は、AJCC/UICC TNM病期分類系の第8版に基づきかつCong et al.Sci Rep.2018 Jul 10;8(1):10383によって記載されるとおりの膵臓の腫瘍分類を示す。
表1.TNM病期分類定義の非限定例
Figure 2022546387000002
表2.膵臓の病期分類レベル
Figure 2022546387000003
いくつかの態様において、イメージング剤を含む本明細書に開示の医薬組成物のいずれも、有効量で対象へ投与されることで、膵臓がん対象の腫瘍中のICAM1のレベルが決定される(例として、CT、ペット、MRI、および内視鏡的検出(例として、超音波内視鏡検査))。本明細書に記載のICAM1のレベルを決定するためのイメージング方法は、従来の方法(例として、生検、および生検から得られた組織の分析)と比較して有利である。イメージング方法(例として、MRI)は非侵襲性であって、ICAM1レベルについて腫瘍の総合的な視点を提供し、これによって腫瘍処置(例として、ICAM1抗体またはICAM1抗体を含むADCでの処置)への成果および/または応答性の予測のためのより正確な査定が提供される。
いくつかの態様において、ICAM1のレベルは、ICAM1抗体およびイメージング剤を含む本開示の医薬組成物が投与された膵臓がん対象において検出される。いくつかの態様において、対象の腫瘍において検出されるICAM1レベルは、対照より、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも100％、少なくとも200％、少なくとも300％、少なくとも400％、少なくとも500％、少なくとも600％、少なくとも700％、少なくとも800％、少なくとも900％、または少なくとも1,000％高い。いくつかの態様において、対象の腫瘍において検出されるICAM1レベルは、実質的に対照と同様である。
いくつかの態様において、対照は、ICAM1の知られているレベルを有する腫瘍をもつ対象である。いくつかの態様において、対照は、腫瘍を有さない対象の膵臓におけるICAM1のレベルである。いくつかの態様において、対照は、低レベルのICAM1を有する腫瘍をもつ対象である。いくつかの態様において、低レベルのICAM1は、検出不能である。いくつかの態様において、対照は、高レベルのICAM1を有する腫瘍をもつ対象である。いくつかの態様において、高レベルのICAM1は、健常対象の膵臓において検出されるICAM1のレベルより、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも100％、少なくとも200％、少なくとも300％、少なくとも400％、少なくとも500％、少なくとも600％、少なくとも700％、少なくとも800％、少なくとも900％、または少なくとも1,000％高い。
いくつかの態様において、本明細書に開示の方法を使用し腫瘍において検出されるICAM1のレベルは、ICAM1抗体または薬物へ抱合された細胞間接着分子1(ICAM1)抗体を含む抗体薬物抱合体(ADC)での処置に応答する膵臓がんをもつ対象を示唆する。いくつかの態様において、腫瘍において検出されるより高いレベルのICAM1は、ICAM1がより低レベルの対象の腫瘍と比較して、ICAM1抗体または本明細書に開示のADCでの処置により応答するとして同定される。いくつかの態様において、腫瘍中のICAM1がより高いレベルの対象は、腫瘍中のICAM1がより低いレベルの対象と比較して、ICAM1抗体(例として、ICAM1 ADC、および/または薬物へ抱合されていないICAM1抗体)を含む組成物での処置に、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも100％、少なくとも200％、少なくとも300％、少なくとも400％、少なくとも500％、少なくとも600％、少なくとも700％、少なくとも800％、少なくとも900％、または少なくとも1,000％、より応答する。いくつかの態様において、本明細書に開示の方法は、対象を応答するとして同定した後、ICAM1抗体または本明細書に開示のADC抗体を投与することを含む。
いくつかの態様において、本明細書に開示の方法を使用し腫瘍において検出されるICAM1のレベルは、膵臓がんのステージを示唆する。いくつかの態様において、腫瘍において検出されるICAM1のレベルは、ステージ0、ステージI、ステージII、ステージIII、またはステージIVを示唆する。
具体的な理論に拘泥されないが、いくつかの態様において、イメージング剤へ抱合されたICAM1抗体またはイメージング剤へ抱合されたICAM1 ADCの投与は、膵臓の腫瘍を視覚化することと腫瘍を処置することとの二重の目的を果たすこともある。
いくつかの態様において、ICAM1抗体および/またはICAM1抗体を含むADC、あるいはその医薬組成物の投与は、腫瘍の成長を阻害する。いくつかの態様において、ICAM1抗体および/またはICAM1抗体を含むADC、あるいはその医薬組成物の投与は、腫瘍の退行をもたらす。いくつかの態様において、ICAM1抗体および/またはICAM1抗体を含むADC、あるいはその医薬組成物の投与は、腫瘍のサイズを、対照と比較して、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも100％、少なくとも200％、少なくとも300％、少なくとも400％、少なくとも500％、少なくとも600％、少なくとも700％、少なくとも800％、少なくとも900％、または少なくとも1,000％まで減少させる。いくつかの態様において、対照は、ICAM1抗体を含む組成物で処置されていない対象である。
いくつかの態様において、ICAM1抗体および/またはICAM1抗体を含む本明細書に開示のADC、あるいはその医薬組成物の投与は、増殖を、対照より少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも100％、少なくとも200％、少なくとも300％、少なくとも400％、少なくとも500％、少なくとも600％、少なくとも700％、少なくとも800％、少なくとも900％、または少なくとも1,000％まで高く減少させる。いくつかの態様において、増殖は、Ki67染色を使用して測定される。いくつかの態様において、対照は、ICAM1抗体を含む組成物で処置されていない対象である。
いくつかの態様において、ICAM1抗体および/またはICAM1抗体を含む本明細書に開示のADC、あるいはその医薬組成物の投与は、腫瘍の転移を、対照と比較して、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも100％、少なくとも200％、少なくとも300％、少なくとも400％、少なくとも500％、少なくとも600％、少なくとも700％、少なくとも800％、少なくとも900％、または少なくとも1,000％まで減少させる。いくつかの態様において、対照は、ICAM1抗体を含む組成物で処置されていない対象である。
いくつかの態様において、ICAM1抗体および/またはICAM1抗体を含む本明細書に開示のADC、あるいはその医薬組成物の投与は、健常な細胞の生存率を減少させない。いくつかの態様において、本明細書に開示のADCまたはADCを含む医薬組成物の投与は、薬物の有効量(例として、濃度)を、薬物がICAM1抗体へ抱合されなかった場合より低くさせ得る。いくつかの態様において、薬物の有効量は、薬物の単独投与と比較して、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも100％、少なくとも200％、少なくとも300％、少なくとも400％、少なくとも500％、少なくとも600％、少なくとも700％、少なくとも800％、少なくとも900％、または少なくとも1,000％まで低くさせられる。
いくつかの態様において、医薬組成物は、薬学的に許容し得る担体をさらに含む。「薬学的に許容し得る」は、正当な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激状態(irritation)、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症もなく、合理的なベネフィット/リスク比に見合う、人間および動物の組織との接触における使用に好適な、それらの化合物、材料、組成物、および/または剤形を指す。「薬学的に許容し得る担体」は、対象とする薬剤をある臓器(もしくは体のある部分)から別の臓器(もしくは体の別の部分)へ運搬または輸送することに関与する、液体もしくは固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、または封入材料などの、薬学的に許容し得る材料、組成物、あるいはビヒクルであってもよい。各担体は、製剤の他の成分に適合しかつ患者の組織に対して傷害性がないという意味において(例として、生理学的な適合性、滅菌、生理学的なpH等々)、「許容し得る」ものでなければならない。用語「担体」は、活性成分と組み合わされることでその適用が容易になる、天然もしくは合成の、有機または無機の成分を示す。医薬組成物の構成要素はまた、所望される医薬の効き目を実質的に損なうであろう相互作用が何らないようなやり方で、本開示の分子と、および互いと、混蔵される(co-mingled)ことも可能である。薬学的に許容し得る担体として働き得る材料のいくつかの例は、以下:(1)ラクトース、グルコース、およびスクロースなどの、糖;(2)コーンスターチおよびジャガイモデンプンなどの、デンプン;(3)ナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、微結晶性セルロース、および酢酸セルロースなどの、セルロースおよびその誘導体;(4)粉末状トラガカント;(5)麦芽;(6)ゼラチン;(7)ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、およびタルクなどの、平滑剤;(8)カカオバターおよび坐薬ワックスなどの、賦形剤;(9)落花生油、綿実油、紅花油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、および大豆油などの、油;(10)プロピレングリコールなどの、グリコール;(11)グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコール(PEG)などの、ポリオール;(12)オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどの、エステル;(13)寒天(agar);(14)水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの、緩衝剤;(15)アルギン酸;(16)パイロジェンフリー水;(17)等張生理食塩水;(18)リンガー溶液;(19)エチルアルコール;(20)pH緩衝溶液;(21)ポリエステル、ポリカーボネート、および/またはポリ酸無水物;(22)ポリペプチドおよびアミノ酸などの、増量剤;(23)血清アルブミン、HDL、およびLDLなどの、血清の構成要素;(22)エタノールなどの、C2～C12アルコール;ならびに(23)医薬製剤に採用される、他の非毒性の相溶性物質を包含する。湿潤剤、着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤、芳香剤、保存料、および抗酸化剤もまた、製剤中に存在し得る。
医薬組成物は、便宜上単位剤形で存在していてもよく、薬学分野において周知である方法のいずれによっても調製されてもよい。用語「単位用量」は、本開示の医薬組成物に関して使用されるとき、単位投薬量として対象に好適な、物理的に不連続なユニットを指し、各ユニットは、要される希釈剤;すなわち、担体またはビヒクルとの関連において活性材料の所望される治療効果を産生するよう算出され予め決められた分量を含有している。
医薬組成物の製剤は、投与ルートに依存していてもよい。非経口投与、または腫瘍内の、腫瘍周辺の、病巣内のもしくは病変部周辺の投与に好適な、注射可能な調製物は、例えば、滅菌された注射可能な水性または油性の懸濁液を包含し、好適な分散剤または湿潤剤と懸濁化剤とを使用する公知技術に従って製剤化されていてもよい。滅菌された注射可能な調製物はまた、非経口的に許容し得る非毒性の希釈剤もしくは溶媒中の、滅菌された注射可能な溶液、懸濁液、またはエマルション(例えば、1,3プロパンジオールまたは1,3ブタンジオール中の溶液など)であってもよい。採用されてもよい許容し得るビヒクルおよび溶媒のなかでも、水、リンガー溶液(U.S.P.)、および等張の塩化ナトリウム溶液である。加えて、滅菌された固定油も、溶媒または懸濁化媒体として従来採用されている。このために、合成モノ-またはジ-グリセリドを包含する、いずれの無菌性固定油も、採用されてよい。加えて、オレイン酸などの脂肪酸も、注射剤の調製において用いられる。注射可能な製剤は、例えば、細菌保持フィルターに通す濾過によって、あるいは滅菌固体組成物の形態の滅菌剤(これは、使用に先立ち、滅菌水中もしくは他の注射可能な滅菌媒体中に溶解または分散され得る)を組み込むことによって、滅菌され得る。
経口投与に好適な組成物は、カプセル、錠剤、トローチなどの不連続ユニットとして提示されていてもよく、各々は予め決められた量の抗炎症剤を含有している。他の組成物は、シロップ、エリキシル剤、もしくはエマルションなどの水性液体または非水性液体中の懸濁液を包含する。
いくつかの態様において、治療的投与に使用される医薬組成物は、滅菌されていなければならない。無菌状態は、滅菌濾過膜(例として、0.2ミクロン膜)に通す濾過によって容易に達成される。代替的に、保存料が、微生物の成長または作用を防止するために使用され得る。様々な保存料が周知であり、例えば、フェノールおよびアスコルビン酸を包含する。医薬組成物は通常なら、熱変性および酸化変性に対して高度に安定な場合、凍結乾燥形態で、または水性溶液として保管されるであろう。調製物のpHは典型的には、約6から8までであろうが、より高いまたはより低いpH値もまた、ある場合には適切であり得る。
「治療的に有効な量」または「有効量」は、本明細書に使用されるとき、対象に対して治療効果をもたらすのに要される本開示の各治療剤(例として、本明細書に記載の脳疾患のいずれも処置するための治療剤)の量(単独かまたは1以上の他の治療剤と組み合わせてかのいずれか)を指す。有効量は、当業者によって認識されているとおり、処置されている具体的な疾病、疾病の重症度、個々の対象のパラメータ(齢(age)、体調、サイズ、性、および重量を包含する)、処置の期間、併用治療(もしあれば)の性質、特定の投与ルート、ならびに医療関係者の知識および専門技術(expertise)の範囲内の同種の因子に応じて変動する。これらの因子は当業者に周知であって、わずかな定型的実験で対処され得る。個々の構成要素またはそれらの組み合わせの最大用量、つまり、正当な医学的判断に従う最高安全用量が使用されることが、一般に好ましい。しかしながら、対象が、医療上の理由、心理的理由から、もしくは事実上のいずれか他の理由から、より低い用量または許容(tolerable)用量を求めることもあることは、当業者によって理解されるであろう。
半減期などの経験的考察は一般に、投薬量の決定に寄与するであろう。例えば、ヒト化抗体または完全ヒト抗体からの領域を含むポリペプチドなどの、ヒト免疫系に適合する治療剤が、ポリペプチドの半減期を延長するために、かつポリペプチドが宿主の免疫系によって攻撃されるのを防止するために使用されてもよい。投与の頻度は、治療経過とともに決定かつ調整されてもよく、一般に、疾患の処置および/または抑制および/または回復および/または遅延に基づく(しかし必ずしもこれらに基づくわけではない)。代替的に、ポリペプチドの持続的な連続放出製剤も、適切なことがある。持続放出を達成するための様々な製剤およびデバイスは、当該技術分野において知られている。
いくつかの態様において、投薬は、毎日、隔日、3日毎、4日毎、5日毎、または6日毎である。いくつかの態様において、投薬頻度は、毎週、2週毎、4週毎、5週毎、6週毎、7週毎、8週毎、9週毎、もしくは10週毎に一度;または毎月、2カ月毎、もしくは3カ月毎、またはそれより長い期間毎に一度である。この治療の進行は、従来の技法およびアッセイによって容易に監視される。投薬レジメン(使用される抗がん剤を包含する)は、経時的に変動し得る。
いくつかの態様において、正常な重量の成体対象について、約0.01から1000mg/kgまでに及ぶ用量が投与されてもよい。いくつかの態様において、用量は、1～200mgの間にある。具体的な投薬レジメン、すなわち、用量、タイミング、および頻度(repetition)は、具体的な対象およびその対象の医療歴(medical history)、ならびに抗がん剤の特性(抗がん剤の半減期、および当該技術分野において周知である他の検討事項など)に依存するであろう。
本開示の目的上、本明細書に記載のとおりの治療剤の適切な投薬量は、採用される特定の薬剤(またはその組成物)、投与の製剤およびルート、疾患のタイプおよび重症度、抗がん剤が予防目的または治療目的で投与されるのか、先の治療、対象の病歴(clinical history)およびアンタゴニストへの応答、ならびに主治医の裁量に依存するであろう。典型的には、臨床医は、抗がん剤を、所望される結果を達成する投薬量に達するまで投与するであろう。1以上の抗がん剤の投与は、連続的または断続的であって、例えば、レシピエントの生理学的状態、投与の目的が治療的または予防的であるか、および当業者に知られている他の因子に依存し得る。抗がん剤の投与は、予め選択された期間にわたり本質的に連続的であってもよく、または例として、疾患を発症する前、その間、もしくはその後のいずれかに、間をおいた一連の用量であってもよい。
本明細書に使用されるとき、用語「処置すること」は、抗がん剤の適用または投与を、これを必要とする対象へすることを指す。「これを必要とする対象」は、疾患、疾患の症状、もしくは疾患への素因を療養する(cure)、治癒する(heal)、軽減する(alleviate)、緩和する(relieve)、変更する(alter)、矯正する(remedy)、向上させる(ameliorate)、改善する(improve)、または影響を及ぼす(affect)目的で、疾患、疾患の症状、または疾患への素因を有する個体を指す。
投与が企図される「対象」は、ヒト(すなわち、いずれの年齢群の男性もしくは女性、例として、小児対象(例として、未成年者、子ども、もしくは青年期の若者(adolescent))、または成人対象(例として、若年の成人、中年の成人、もしくは年長の成人))、あるいは非ヒト動物を指す。いくつかの態様において、非ヒト動物は、哺乳動物(例として、齧歯類の動物(例として、マウスもしくはラット)、霊長目の動物(例として、カニクイザルもしくは赤毛猿)、商業的に関係のある哺乳動物(例として、畜牛(cattle)、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、もしくはイヌ)、または鳥類(例として、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、もしくはシチメンチョウなどの、商業的に関係のある鳥類))である。非ヒト動物は、いずれの発生段階でのオスまたはメスであってもよい。非ヒト動物は、トランスジェニック動物または遺伝子学的に改変された動物であってもよい。
いくつかの態様において、対象は、伴侶動物(ペット)である。「伴侶動物」は、本明細書に使用されるとき、ペットおよび他の飼育動物を指す。伴侶動物の非限定例は、イヌおよびネコ;ウマ、畜牛、ブタ、ヒツジ、ヤギ、およびニワトリなどの家畜;ならびにマウス、ラット、モルモット、およびハムスターなどの他の動物を包含する。いくつかの態様において、対象は、研究動物である。研究動物の非限定例は、以下:齧歯類の動物(例として、ラット、マウス、モルモット、およびハムスター)、ウサギ、または霊長目の非ヒト動物を包含する。
疾患(例として、がん)を軽減することは、疾患の発症もしくは進行を遅延すること、または疾患重症度を低減することを包含する。疾患を軽減することは、根治した結果を必ずしも要しない。そこに使用されるとき、疾患の発症を「遅延すること」は、疾患の進行を延ばす(defer)、妨げる(hinder)、遅くする(slow)、遅らせる(retard)、安定化させる(stabilize)、および/または先延ばしにする(postpone)ことを意味する。この遅延は、疾患の既往歴(history)および/または処置されている個体に応じて、変動する時間の長さであり得る。疾患の発症を「遅延する」かもしくは軽減する方法、または疾患の発病を遅延する方法は、方法を使用しない場合と比較したとき、所定の時間枠の中で疾患の1以上の症状を発症する確率を低減させる方法、および/または所定の時間枠の中で症状の程度を低減させる方法である。かかる比較は、典型的には、統計的に有意な結果を与えるのに充分数多の対象を使用する臨床研究に基づく。
疾患の「発症」または「進行」は、初期兆候および/またはその後に続く疾患の進行を意味する。疾患の発症は、当該技術分野において周知のとおりの標準的な臨床技法を使用し検出可能であって、かつ査定され得る。しかしながら、発症はまた、検出不能なことがある進行も指す。本開示の目的上、発症または進行は、症状の生物学的な経過を指す。「発症」は、発生、再発、および発病を包含する。本明細書に使用されるとき、疾患の「発病」または「発生」は、初期の発病および/または再発を包含する。
医学の当業者に知られている従来の方法は、処置されるべき疾患のタイプまたは疾患の部位に応じて医薬組成物を対象に投与するために使用され得る。医薬組成物はまた、他の従来のルートを介しても投与され得、例として、経口的に、非経口的に、吸入スプレーによって、局所的に、経直腸的に、経鼻的に、口腔内に、膣内に、または植込み型リザーバを介して投与され得る。用語「非経口の」は、本明細書に使用されるとき、皮下の、皮内の、静脈内の、筋肉内の、関節内の、動脈内の、滑液嚢内の、胸骨下の、髄腔内の、病巣内の、および頭蓋内の注射または注入の技法を包含する。いくつかの態様において、医薬組成物は、静脈内の注射または注入を介して投与される。加えて、それは、1カ月、3カ月、もしくは6カ月のデポー注射可能なまたは生分解性の材料および方法などを使用し、投与の注射可能なデポールートを介して対象へ投与され得る。いくつかの態様において、医薬組成物は、注射を介して投与される。いくつかの態様において、注射は、静脈内注射または腫瘍内注射である。
例
導入
今日まで、膵臓がん(PC)は依然として最も致死率の高い疾患の一つであり、2019年内の合衆国において56,770名の死因を構成し、すべてのがん死亡率のうち7％に相当する。免疫治療およびナノ医療による治療の研究が近年高まっているにもかかわらず、PC患者の予後は5年生存が8％未満と著しく不良である。実例として、細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4(CTLA4)インヒビターまたはプログラム死リガンド1(PD-L1)抗体を包含する免疫チェックポイント遮断治療は今日まで、PC患者を処置するのに充分な臨床治療の効き目を示すには至っていない。革新的なナノ医療製剤(例として、EphA2を標的にしたリポソーム型ドセタキセル)もまた、進行したPCの処置において臨床治療の利益をもたらし損ねた。これらの望ましくない結果は、線維形成性の間質および不十分な血管新生によって特徴付けられるPC腫瘍の免疫抑制性の腫瘍微小環境(TME)に大きく起因する。かかるTMEは、T細胞またはナノ医療が効率的に腫瘍へ浸透するのを、かつPC細胞と直接相互作用するのを防ぐ物理的な障壁を創出し、このことが好ましくない効き目に繋がる。強力な腫瘍特異的な効き目を維持しつつ浸潤したPC腫瘍を良くし得る新規な標的化治療剤を開発することが、不可欠なニーズを浮き彫りにする。
抗体-薬物抱合体(ADC)は、T細胞免疫治療への応答が不十分な乳がん等の浸潤性固形腫瘍を包含する数種のがんに対し有望な臨床治療の効き目を示している、急速に成長しつつあるクラスの免疫治療薬である。従来の化学治療とは違って、ADCは、細胞毒性薬を腫瘍ホーミング(tumor-homing)抗体へ抱合させる化学リンカー(chemical linkers)を利用するが、ADCは、腫瘍表面抗原の認識、続く標的にされた腫瘍細胞中への細胞毒性薬の内在化かつ送達を介して正常組織を温存しつつ、選択的に腫瘍をホーミングする(horming)ことが可能である。T細胞免疫治療(例として、キメラ抗原受容体-T細胞(CAR-T)もしくは免疫チェックポイント遮断)またはナノ医療(例として、リポソームもしくはエキソソーム)と比較すると、ADCは、その超小型サイズ(＜10nm)に起因した、秀でた腫瘍組織浸透を特色とするが、これはT細胞のサイズより～1,000倍小さく、間質密性(stroma dense)PC腫瘍中への薬物送達を増大する絶好の機会を創出する。
しかしながら、PC標的ADCの開発における重大なハードルは、PCと正常組織とを有効に区別するのに好適な免疫治療標的を同定することである。最適なADCにとっての安全性および効き目の基準を満たすため、かかる標的は、正常組織においては検出不能なレベルであるが、PC腫瘍の細胞表面上には豊富に提示されていることが必要であり、このことによってADCの腫瘍ホーミング抗体に対し査定可能になる。その一方で、ADC上に抱合された細胞傷害性ペイロードの迅速かつ確固たる細胞内在化を容易にさせることも要される。従来のPC標的(例として、EGFR、EpHA2、およびメソテリン)を利用する数種のPC標的ADCが開発されたが、確立されたPC標的および他の候補の、それら細胞表面タンパク質レベルでの系統的かつ定量的な比較は未だなされていない。本開示は、かかる公正かつ定量的な細胞表面タンパク質のスクリーニングを実施することが、より最適なPC免疫治療標的の発見に繋がり、かつPC標的ADCの開発を促進することを示す。
ICAM1は、またCD54とも呼ばれ、複数タイプのがん(例として、トリプルネガティブ乳がん)において異常に過剰発現され、かつ浸潤性の表現型およびより悪い予後にしばしば関連する、免疫グロブリンスーパーファミリーの膜貫通型糖タンパク質である。PCにおいて、ICAM1は、KRASG12D突然変異(70～95％のPC患者における最も一般的な発がん性の突然変異)によって膵腺房細胞上に直接誘導され、膵臓の新生物病変の形成を推進し、PC発がんイニシエーション(tumor initiation)へ繋がる。本開示は、公正かつ定量的なスクリーニングアルゴリズムに基づき、潜在的なPC免疫治療標的としてICAM1を同定かつ適用したことを記載する。そのため、in vivoで強力かつ持続的なPC腫瘍退縮を誘導するICAM1 ADCを開発した。精密医療を開発するため、ICAM1標的化免疫治療に好適なICAM1発現腫瘍を同定する非侵襲MRIアプローチを設計した。
結果および考察
ICAM1はヒトPCにとって、合理的に同定された細胞表面タンパク質標的である。
悪性PC腫瘍を正常組織から区別する好適なタンパク質標的を同定するため、合理的に設計された細胞表面タンパク質標的発見アルゴリズムを開発した(図1A)。最初に、4種の確立されたヒトPC細胞株(PANC-1、BxPC-3、Capan-1、およびCapan-2)において、がんに関する72の表面抗原一団の公正かつ定量的なスクリーニングを、正常な対照としての2種の正常なヒト膵管上皮細胞(HPDEおよびHPNE)と比較しながら実施した(図1B)。スクリーニングされた68の標的のうち、31の候補が、4種すべてのPC細胞株において一般的に過剰発現されていることが見出され、さらなる評価のために選択した。それらのレベルをヒトPC細胞と正常な膵臓細胞とにおいて比較することによって、ICAM1が、上位10候補のなかでも最も過剰発現されたPC標的として浮上した。対して非新生物のHPNE細胞およびHPDE細胞においてはほとんど発現がなかった(図1C)。ICAM1の細胞表面密度は、4種のPC細胞株上3×105から1×106分子/細胞までに及び、確立されたPC標的(例として、EGFR、MUC1、またはEphA2)のそれより有意に高い。加えて、ICAM1は、試験された4種すべてのヒトPC細胞株にわたって遍在的に過剰発現されており、PC患者において広く標的集団になることを暗示している。ヒトPC細胞におけるICAM1の過剰発現はさらに、免疫蛍光(IF)染色を使用して確認された。ICAM1は、4種のPC細胞株(PANC-1、BxPC-3、Capan-1、およびCapan-2)の原形質膜上に主として発現されているが、正常なHNPE細胞およびHPNE細胞にはない(図1D)。このICAM1のヒトPC細胞上の強い細胞表面発現は、ICAM1標的免疫治療(例として、ADCまたはCAR-T細胞)にとって容易に査定可能にさせる。
ICAM1高発現がヒトPCにおいて臨床的に関係のある知見であるか調査するために、ICAM1の免疫組織化学(IHC)染色を80のヒトPC腫瘍組織および20の正常な膵臓組織において行った。図1Eおよび図1Fにおいて、ICAM1は、種々の疾患ステージでの腫瘍組織からのPC細胞の原形質膜上および細胞質中で絶えず過剰発現されていたが、ICAM1は正常なヒト膵臓組織においては完全に存在しない。ICAM1の染色の程度および病理学的スコアは、ICAM1レベルが疾患TNMステージと正の相関があったことを示した(図1G)。ICAM1標的免疫治療のために、正常組織中の標的にはなる(on-target)が腫瘍ではない(off-tumor)部位もまた評価した。ICAM1のタンパク質レベルを、Human Protein Atlasデータベース(proteinatlas.org)に問い合わせることによって45の正常ヒト臓器の包括的なコホートにおいて調べた。ICAM1発現はIHC分析によってほとんどの正常組織になかったこと、および正常組織の4％(2/45、肺および腎臓)のみがICAM1高陽性染色を示すことが夫々見出された。これは、肺および腎臓が、ICAM1標的免疫治療にとって、標的にはなるが腫瘍ではない潜在的な部位であることを暗示した。その上、先の研究(work)は、ICAM1標的T細胞免疫治療が、進行した甲状腺がんモデルのオスマウスとメスマウスとの両方において急性毒性または遅延毒性のいずれも誘導しないことを示している。
PC患者の臨床成果に対するICAM1過剰発現の影響を、R2:Genomics Analysis and Visualization Platformデータベース(hgserver1.amc.nl/,Datasheet:Mixed Pancreas Tumor-Zhang)に問い合わせることによって調査した。ICAM1発現が高いPC患者の全生存は、ICAM1発現が低いPC患者のそれより有意に悪かったが(図1H、P=0.021、ログランク検定)、これはICAM1がPC患者の不良予後の臨床バイオマーカーとして働き得ることを暗示する。
ICAM1抗体はPC腫瘍をin vivoで認識し標的にする。
ICAM1を潜在的な免疫治療標的として査定するため、in vivoでのICAM1抗体の腫瘍特異性を同所性PC腫瘍モデルにおいて最初に決定した(図2A)。ICAM1モノクローナル抗体を赤色蛍光色素のAF-647で蛍光標識し、PANC-1担腫瘍マウス中へ静脈内注射した。AF-647標識IgG(IgG-AF)を非標的化の対照として使用した。in vivoでの蛍光シグナルが同所性PC腫瘍の腹腔内での場所と腹部皮膚吸収とによって妨害されることから、動物を注射から24時間後に安楽死させ、PC腫瘍およびそれらを取り囲む膵臓組織を摘出した。次いで、ICAM1-AF抗体の腫瘍蓄積を決定するためにex vivoでのイメージングを実施した。図2Bに観察されるとおり、ICAM1抗体は、非標的化IgG対照と比較して高い親和性をもって、同所性PC腫瘍を選択的に認識し標的にした。PC腫瘍に隣接した正常な膵臓組織はICAM1抗体によって標的にされなかった。さらにそのPC腫瘍特異性を確認した。定量化された蛍光シグナル(図2C)は、1単回用量の尾静脈投与後のICAM1抗体の腫瘍蓄積が、非標的化IgG-AFのそれよりおよそ6倍高かったことを確認した。これらin vivoでの知見は、PCが標的にされた治療用のICAM1抗体ベースの免疫治療が開発されたことを強くサポートするものである。
細胞への侵入活性がADC設計において不可欠な因子であると仮定して、ヒトPC細胞におけるICAM1抗体の細胞内在化を、イメージングフローサイトメトリーアッセイを使用して調査した。図2Dに示されるとおり、フィコエリトリン(PE)抱合ICAM1抗体は、ICAM1抗原媒介エンドサイトーシスを介しPANC-1細胞とBxPC-3細胞との両方によって堅固に内在化された一方、ほとんどのPE-ICAM1抗体は、ICAM1抗原発現が有意に不足していることに起因して正常なHPNE細胞によって内在化されなかった。ヒトPC細胞によるPE-ICAM1抗体の内在化量は、HPNE細胞のそれよりおよそ300倍高いとして定量化された(図2E)。
次に、ヒトPC細胞においてICAM1シグナリングカスケードを遮断する治療的な因果関係を、その中和抗体を使用して調査した。図2Fにおいて、ICAM1中和抗体(2μg/mL)での処置は、PANC-1細胞の増殖もBxPC-3細胞の増殖も明らかには変更しなかった。しかしながら、ICAM1中和抗体は、IgG対照との比較において、PANC-1細胞およびBxPC-3細胞の遊走を強力に阻害し、PANC-1細胞およびBxPC-3細胞の細胞遊走を夫々39％および44％まで低減させた(図2G)。相関的に、ICAM1中和抗体はまた、PC発がんイニシエーションをin vivoで強力に阻害することも報告されている。これらの知見は、ICAM1がPC腫瘍ホーミング標的として働き得ることを指し示している。それらはまた、ICAM1シグナリングカスケードを標的にするそれもまた疾患進行を妨げ得ることも指し示している。
ICAM1抗体-薬物抱合体の合理的設計
ICAM1標的をPC治療に変えるため、合理的に設計されたICAM1 ADCを、PCを標的にした治療のための免疫治療として設計した(図3A)。化学リンカーおよび細胞傷害性ペイロードが実質的にADCの効き目に影響を及ぼすことを考慮すると、最初のステップは、公正かつ定量的なスクリーニングアプローチを使用してPC処置に最適なADC製剤を選択することであった。一連のICAM1 ADCを、臨床試験された4種のADCリンカーおよび細胞傷害性ペイロード(SMCC-DM1、Vc-MMAE、Mc-MMAF、デュオカルマイシン)を使用し、等しく1の薬物-対-抗体比率(DAR)にて改変し、非標的化IgG ADC対照との比較において、ヒトPC細胞に対するそれらの細胞傷害性を比較した。図3Bに示されるとおり、ICAM1-SMCC-DM1は、PANC-1細胞の処置において、試験された4種のADC製剤の中で最も低いIC50(38.1nM)を示した(他はIC50:83.9～240.4nM)。ICAM1-SMCC-DM1のIC50は、PDAC治療のための第一選択化学治療剤であるGem(89.1μM)より2,000倍以上低い。SMCC-DM1は、切断不能な化学リンカーおよび強力な微小管インヒビターであるメルタンシン(DM1)からなる臨床的に有効なADC製剤である。よって、SMCC-DM1を最適化されたADC製剤として選択し、続いてPCを標的にした治療のために最適化されたICAM1 ADCとしてICAM1-SMCC-DM1(ICAM1-DM1)を合成した。IgG-SMCC-DM1(IgG-DM1)もまた、非標的化対照と同じ実験条件下で調製した。ICAM1-DM1およびIgG-DM1に係る薬物-対-抗体比率(DAR)を、DM1と抗体との投入量によって制御し、UV/VIS分光アッセイを使用して決定されたとおり、ICAM1-DM1については3.4を、IgG-DM1については3.2を達成した。
ICAM1-DM1はPC細胞をin vitroおよびin vivoで選択的に取り除く。
ICAM1-DM1のPC特異的細胞傷害性を、2種のヒトPC細胞(PANC-1およびBxPC-3)と正常なHPNE細胞とにおいて決定した(図3C～3E)。第一選択化学薬(chemodrug)GEMおよび非標的化IgG-DM1を対照として使用した。図3Dおよび図3Eに観察されるとおり、ICAM1-DM1は、PANC-1細胞およびBxPC-3細胞に対して強力な細胞傷害性を示した。ICAM1-DM1のIC50を、PANC-1については9.8nMおよびBxPC-3については4.0nMとして決定したが、GEMおよびIgG-DM1のそれより有意に低かった(30nM～88μm)。その上、ICAM1-DM1は、正常なHPNE細胞においては、それらのICAM1発現が不足していることに起因して細胞傷害性を示さない(図3E)。これらin vitroでの結果は、PCモデルのin vivoでの設定においてICAM1-DM1の抗腫瘍活性を評価することを強くサポートする。
ICAM1-DM1の抗腫瘍活性を、同所性PC腫瘍成長のin vivoでの抑制において調べた(図3F)。ICAM1-DM1またはIgG-DM1(非標的化対照)を、PANC-1-Luc担腫瘍マウスの静脈内に15mg/kgにて3週毎に投与した。比較において、GEMを、その短い循環半減期(0.28hr)に起因して、毎週5mg/kgの用量にて静脈内に投与した。2種のADC注射後、ICAM1-DM1処置群は、他の群と比較して強力かつ持続的な腫瘍退縮を呈した(図3G～3H)。定量化された腫瘍量は、ICAM1-DM1がPC腫瘍成長を有意に、PBS(偽の)群との比較において49％まで低減したことを示した(図3I)。ICAM1-DM1が毒性を誘導する機序を、PC腫瘍組織における細胞増殖マーカーKi67の発現を測定することによってさらに調べた。図3Kおよび図3Lに観察されるとおり、強力かつ持続する腫瘍抑制に寄与するICAM1-DM1処置群のKi67陽性細胞集団は、他の群と比較して有意に低減された。このICAM1-DM1の強力な抗腫瘍活性はまた、正常な臓器(肺、肝臓、および脾臓を包含する)への自発的なPC転移も有効に阻害した(図3Mおよび図5)。ICAM1-DM1処置群から収集された正常な重要臓器(vital organ)に対して組織病理学的損傷があったとの証拠はなかった。
MRIによって腫瘍のICAM1発現を非侵襲的に評価する。
精密医療を築くMRIベースの分子イメージングアプローチを、ICAM1標的免疫治療から利益を得られるPC患者を非侵襲的かつ迅速に同定するために開発した。臨床診療において、針生検は一般的に、標的にされた治療に先立ち、腫瘍組織における標的発現の十分性(adequacy)を調べるために導入されるが、このアプローチは、腫瘍内の複雑性および不均一性に起因し、その侵襲性および的確さ不足(＜50％)によって限定されている。これらの障害を克服するため、ICAM1標的化MRIプローブを、MRIを使用して同所性PCモデルにおける腫瘍のICAM1発現をマッピングするために開発して使用した(図4A)。ICAM1標的化MRIプローブを最初に、ICAM1抗体をDTPA-Gd(臨床的に使用されるMRI造影剤)と共有結合的に抱合させることによって改変した。IgG-Gdを非標的化対照として調製した。次いでICAM1-GdまたはIgG-Gdを、ICAM1発現PANC-1担腫瘍マウス中の静脈内に5mg/kgマウス重量の投薬量にて投与した。MRIプローブの注射前およびその注射から24時間後にて、in vivoでのMRIを、T1、T2強調スピンエコーイメージングを包含する一連のMRI系列(sequences)でPC担腫瘍マウスに対して実施した。図4B中、高分解能T2強調MRIイメージを分析することで腹膜腔中のPC腫瘍(黄色円)を突き止めた。一旦PC腫瘍が位置付けられたら、T1強調MRIイメージを使用して、投与されたMRIプローブからのガドリニウムの腫瘍内蓄積の関数としてPC腫瘍(黄色円)のエリア中のMRIシグナル変化を定量的に測定した。図4C中、腫瘍のT1 MRIシグナルはICAM1-Gd群において～50％増大した一方、非標的化IgG-Gd群(n=3/群)においてはMRIシグナル変化がなかった。これらのMRIシグナル変化は、標的にされた腫瘍上の抗原発現のレベル(これは、ICAM1標的化免疫治療から利益が得られるICAM1陽性患者を同定するのに使用され得る)と正に相関する。
要約すれば、本開示は、ICAM1がヒトPCへの好適なADC標的であるという実験的証拠を提供する。この標的の実用性は、ICAM1へ指向するCAR T細胞または二重特異性抗体を包含する他の免疫治療剤の開発にも拡大され得る。
材料および方法
材料。
精製された抗ヒトCD54抗体(Clone:HCD54)、フィコエリトリン(PE)抱合マウス抗ヒトICAM-1抗体(PE-ICAM1)、およびPE抱合マウスIgGアイソタイプ(PE-IgG)は、BioLegend(San Diego,CA,USA)から購入した。ADCをプレスクリーニングするG-DM1、G-MMAE、G-MMAF、G-Duocaは、Levena Biopharma(San Diego,CA)から購入した。SMCC-DM1はMedkoo(Morrisville,NC,USA)から購入した。Zeba(商標)Spin Desalting Columns、(7K MWCO)、Alexa Fluor 647 NHSエステル、Lab-Tek II Chamber Slide System、ProLong Gold Antifade Mountantは、Thermo Fisher Scientificから得た。ゲムシタビン塩酸塩(GEM)、塩化ガドリニウム(III)六水和物(GdCl3・6H2O)、ジエチレントリアミンペンタ酢酸二無水物(DTPAA)、重炭酸ナトリウム、クエン酸三ナトリウム二水和物は、Sigma-Aldrich (St.Louis,MO)から購入した。ダルベッコPBS、DAPI、Quant-iT RNA Assay Kit、0.25％トリプシン/2.6mM EDTA溶液、Gibco DMEM、Gibco DMEM/F12(1:1)、ロズウェルパーク記念研究所(Roswell Park Memorial Institute)(RPMI)-1640培地、およびマッコイ(McCoy's)5A培地は、Invitrogen(Carlsbad,CA)から購入した。MEGM乳腺上皮細胞成長培地(Mammary Epithelial Cell Growth Medium)はLonza(Basel,Switzerland)から購入した。Quantum Simply CellularマイクロビーズはBangs Laboratory(Fishers,IN)から購入した。Dojindo細胞計数キットCCK-8はDojindo Molecular Technologies(Rockville,MD,USA)から購入した。ヒト膵臓がん組織および正常組織アレイ(PA1002a)はUS Biomax(Derwood,MD)から購入した。
細胞培養。
PANC-1細胞、BxPC-3細胞、Capan-1細胞、Capan-2細胞、およびHPNE細胞は、ATCC(Manassas,VA)から購入した。HPDE細胞はKerafast(Boston,MA)から購入した。PANC-1、10％FBSありダルベッコ改変イーグル培地;BxPC-3、10％FBSありRPMI-1640培地;Capan-1、20％FBSありイスコフ改変ダルベッコ培地;Capan-2、10％FBSありマッコイ改変5a培地;HPNE、75％DMEM(グルコースなし、追加の2mM L-グルタミンおよび1.5g/L重炭酸ナトリウムあり)、25％Medium M3 Base(FBS 5％、10ng/mlヒト組換えEGF、5.5mM D-グルコース(1g/L)、750ng/mlピューロマイシン);HPDE、角化細胞用基礎培地(Keratinocyte Basal Medium)+付属の補給剤(supplied supplements)(Lonza,Clonetics KBM,Cat#CC-3111)。すべての細胞を、5％(vol/vol)CO2ありの加湿インキュベーター中37℃にて維持した。
ICAM-1表面発現の定量化。
膵臓がん細胞ICAM1表面タンパク質発現を、これまでに記載のとおりのBD FACSCaliburフローサイトメーター(BD Biosciences)によって評価した。細胞表面上ICAM-1の密度の定量化を、製造業者によって提供されるとおりのプロトコルを使用してQuantum Simply Cellularマイクロビーズを参照し決定した。106細胞を収集し、懸濁液脱水サイクルに通して2度濯いだ。細胞を氷浴中、PBS中1％BSAによって30minブロッキングした。BSAのブロッキングの後、細胞をフィコエリトリン(PE)抱合ICAM1抗体とともに室温にて1時間インキュベートした。細胞をPBS中1％BSAで3回濯ぎ、PBSに再懸濁してフローサイトメトリーによって評価した。
免疫組織学染色。
免疫組織化学研究をパラフィン包埋ヒトPDACおよび正常組織のマイクロアレイ(PA1002a,US Biomax)上で行った。40ケースのヒトPDAC組織および10ケースのヒト正常組織のマイクロアレイ試料を、これまでに記載されたとおりのICAM-1発現について評価した。マイクロアレイにおける個々の組織スコアを、試料の同一性についての自覚がない外科病理医によって採点した(scored)。免疫染色を、Hスコアを算出することによって採点した。Hスコアにおいて、細胞染色のパーセント 強い(3+)、中程度(2+)、および弱い(1+)を、式:Hスコア=3×(細胞染色の％ 3+)+2×(細胞染色の％ 2+)+1×(細胞染色の％ 1+)に従って乗じた。Olympus Q- Color5デジタルカメラ(Olympus America Inc.)を使用することによってOlympus BX41顕微鏡上で顕微鏡写真を撮った。
ICAM-1 AbのIn vitroでの結合および内在化
ICAM1抗体のヒト膵臓がん細胞株へのin vitroでの特異的な結合を、PE-ICAM1抗体を使用して査定した。IgGを対照として使用した。細胞を8ウェルチャンバースライド中5×103細胞/ウェルの密度にて播種した。24時間回復させた後、全培地を、PE-ICAM1抗体を含有する1％FBSありのものに置き換えた。細胞をPE-ICAM1含有培地で37℃にてさらに4時間インキュベートした。次いで細胞単層を冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で濯ぎ、PBS溶液中4％パラホルムアルデヒドで固定した。細胞核を、ProLong Gold Antifade Mountantを使用し4',6'-ジアミジノ-2-フェニルインドール塩酸塩(DAPI)で対比染色した。蛍光イメージを、Zeiss LSM 880共焦点顕微鏡(Oberkochen,Germany)を使用し取得して分析した。
イメージングフローサイトメトリー研究において、細胞を6ウェルチャンバースライド中1×106細胞/ウェルの密度にて播種した。24時間の細胞回復後、全培地を、PE-ICAM1抗体を含有する1％FBSありのものに置き換えた。細胞をPE-ICAM1含有培地で37℃にて1時間インキュベートした。次いで細胞単層を収集し、冷PBSで2度濯いで再懸濁し、Amnis imagestreamX Mark IIイメージングフローサイトメトリー(Luminex,Austin,TX,USA)を使用し評価した。
ICAM-1 Abの治療効果
ICAM1抗体のヒト膵臓がん細胞株に対するin vitroでの治療効果を、定量的位相差イメージングを使用して査定した。IgGを対照として使用した。細胞を6ウェルプレート中5×104細胞/ウェルの密度にて播種した。24時間回復させた後、全培地を、ICAM1抗体またはIgGを2μg/mLの投薬量にて含有するものに置き換えた。細胞をICAM1またはIgG含有培地で37℃にて24時間インキュベートした。その後、プレートをインキュベーター中に設けた定量的位相差イメージング顕微鏡(Holomonitor M4,Phase Holographic Imaging Phi AB,Lund,Sweden)の下に置き、さらに24時間 5min間隔でイメージ化した。次いで細胞運動、形態学、および増殖を、Hstutio4を使用して分析した。
ADC Ab-Gdの調製および特徴付け。
IgG-DM1、ICAM1-DM1を、リン酸緩衝液(pH7.2)中IgGまたはICAM1 Ab(2.4mg、16nmol)をSMCC-DM1(1.2mg、1.1umol)と室温にて1h回転させながら混合することによって調製した。遊離のSMCC-DM1をUltra-4 Centrifugal Filter(30K MWCO)によって除去した。IgG-DM1、ICAM1-DM1をPBS(pH7.4)で数回洗浄し、PBSに再分散させた。
ADCをUV/Vis分光法によって特徴付けし、抗体薬物比率を方程式:
ADR=C薬物/CAb
=(A280ελ(D)mAb-Aλ(D)ε280mAb)(A280ελ(D)薬物-Aλ(D)ε280薬物)
/[(ε280薬物ελ(D)mAb-ελ(D)薬物ε280mAb)(ε280mAbελ(D)薬物-ελ(D)mAbε280薬物)]
に従って算出した。
IgG-DTPA-Gd、ICAM1-DTPA-Gdを、これまでに報告されたとおりに調製した。DTPAA(0.4mg、1.1μmol)をNaHCO3緩衝剤(pH9.0、0.1M)中のIgGまたはICAM1 Ab(0.2mg、1.3nmol)へゆっくり加え、混合物を室温にて終夜回転させた。DTPA抱合IgGまたはICAM1 AbをUltra-4 Centrifugal Filter(30K MWCO)によって精製し、クエン酸塩緩衝剤(pH6.5、0.1M)に再分散させた。次いで0.1Mクエン酸塩緩衝剤(pH6.5)中GdCl3(0.1mg、0.27μmol)を、室温にて24h回転させてDTPA抱合IgGまたはICAM1 Abと混合した。遊離のGd3+をUltra-4 Centrifugal Filter(30K MWCO)によって除去し、IgG-またはICAM1-DTPA-Gdを、これに続く使用のためPBSに再分散させた。Ab-Gdを液体クロマトグラフィーエレクトロスプレイイオン化質量分析LC-MSによって特徴付けした。
細胞傷害性アッセイ。
ヒト膵臓がん細胞株を96ウェルプレートに5×103細胞/ウェルの密度にて播種し、終夜接着させた。次いで培養培地を、遊離のGEM、IgG、またはICAM1抱合DM1、Duo、MMAE、MMAFを種々の薬物濃度にて含有する培地に置き換えた。細胞をもう72時間培養した後、細胞傷害性を供給業者提供のプロトコルに倣いCCK-8アッセイによって決定した。薬物含有培地を除去した後、細胞を慎重にPBSで濯ぎ、これに続きCCK-8含有培地溶液を加えた。次いで細胞をCCK-8培地で4時間インキュベートした。プレートを、マイクロプレートリーダー(Synergy2;BioTek,Winooski,VT,USA)を使用し450nmの吸光度波長にて読み取った。細胞生存率を、薬物とインキュベートされた細胞の吸光度を、薬物を存在させずにインキュベートされた対照細胞の吸光度と比較することによって決定した。
同所性PDACマウスモデル。
すべての動物実験を、Boston Children's Hospitalでの動物実験委員会(Institutional Animal Care and Use Committee)(IACUC)によって承認されたプロトコルに倣って行った。製造業者の指示(MGH,Boston)に従ってPANC-1細胞にルシフェラーゼおよびGFP遺伝子を発現するプラスミドをトランスフェクトした。遺伝子導入の成功を、蛍光顕微鏡法上GFPの可視化によって感染から72時間後に確認した。安定的にトランスフェクトされた細胞を、FACSAria IIフローサイトメトリー(BD Biosciences)を使用し、GFPシグナルにつきフローサイトメトリーによって2度選別し(sorted)、DMEM-10％FBS中で維持した。同所性膵臓がんモデルを、確立された手術法を使用し、PANC-1細胞を8-週齢オス胸腺欠損ヌードマウス(Charles River;各群につきn=6)の膵臓中へ注射することによって調製した。マウスを、外科手術の最中イソフルラン(O2ありの5％)によって麻酔した。膵臓が典型的には脾臓中央の裏側に位置付けられる左脇腹の腹部領域に対し切開をした。次いで膵臓を、鉗子を使用して穏やかに引き出し、50μL 1×106 PANC-1細胞を膵臓中へ慎重に注射した。注射後、膵臓を腹腔中の背部かつ腹部筋肉の前に置き、皮膚を4-0 Polysorb縫合糸および外科用ステープルで閉じた。処置を2週間の回復後に開始した。動物を無作為に4つの群(n=6):PBS対照、ゲムシタビン(GEM)での処置、非標的化IgG-DM1での処置、およびICAM1-DM1での処置に分けた。マウスを、IgG-DM1およびICAM1-DM1については3週間当り12mg/kgマウス重量の用量にて、GEMについては週に2度80mg/kgマウス重量にて、静脈内の尾静脈注射を通して処置した一方、対照群はPBS注射のみを受けさせた。合計で、ADC処置群および対照群については3週間隔で2回の注射、GEMについては3日または4日間隔で12回の注射であった。体重を週に2度測定し、マウスがD-ルシフェリンのi.p.注射を受けた後の腫瘍成長を、IVIS Spectrum Imaging System(PerkinElmer)を使用して監視した。
In VivoでのMRI。
In vivoでのMRIを、IgG-GdおよびICAM-Gd(5mg/kgマウス重量の投薬量にて)を夫々静脈内に注射した2つの群の担腫瘍マウスに対し実施した。イメージを、T1-およびT2-強調MRIにつき高速スピンエコー配列での9.4 T Bruker Horizontal Bore MRIで注射前および注射から24時間後にて得た。イメージングパラメータは以下のとおりであった:T2強調イメージングについては、1,523msの繰り返し時間(TR)、33msのTE、340×220マトリックス、40×28-mm2視野、180°フリップ角、および0.6-mm薄片厚さ;T1強調イメージングについては、700msのTRおよび22msのTE。腫瘍のシグナル強度を定量化するため、関心のある領域(ROI)を、同じイメージング深度で同じ薄片での腫瘍全体を囲むように描いた。画素強度を、ImageJソフトウェアによって算出し、ROIの面積に対し正規化した。
組織学。
臓器(肝臓、脾臓、腎臓、膵臓、心臓、肺、および筋肉)、ならびに腫瘍試料をエンドポイントにて収集した。ICAM-DM1、IgG-DM1、GEM、およびPBSで処置された同所性PANC-1腫瘍の病理を、H&E染色、Ki67染色、およびICAM1免疫組織学的染色によって調査した。すべての染色を、標準的なプロトコルに倣い腫瘍薄片について実施した。
統計分析。
定量的なデータを平均値±SDとして提示する。差異を、対応のないt検定を使用して比較した。統計を、Microsoft Excelソフトウェアを使用して実施した。P値≦0.05を統計的に有意と見なした。
ADC中のリンカーおよび薬物の構造の例
本開示において使用されるリンカーおよび薬物の構造を下に提供する。
名称:SMCC-DM1
化学名:N2'-デアセチル-N2'-[3-[[1-[[4-[[(2,5-ジオキソ-1-ピロリジニル)オキシ]カルボニル]シクロヘキシル]メチル]-2,5-ジオキソ-3-ピロリジニル]チオ]-1-オキソプロピル]-マイタンシン
化学構造:
Figure 2022546387000004
名称:VC-MMAE(MC-VC-PAB-MMAE)
化学名:4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-5-ウレイドペンタンアミド)ベンジル((S)-1-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-ヒドロキシ-1-フェニルプロパン-2-イル)アミノ)-1-メトキシ-2-メチル-3-オキソプロピル)ピロリジン-1-イル)-3-メトキシ-5-メチル-1-オキソヘプタン-4-イル)(メチル)アミノ)-3-メチル-1-オキソブタン-2-イル)アミノ)-3-メチル-1-オキソブタン-2-イル)(メチル)カルバマート
化学構造:
Figure 2022546387000005
名称:MC-MMAF
化学名:((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチルヘキサンアミド)-3-メチルブタンアミド)-N,3-ジメチルブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)ピロリジン-2-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパノイル)-L-フェニルアラニン
化学構造:
Figure 2022546387000006
名称:Mal-PEG4-VC-PAB-DMEA-Seco-デュオカルマイシン
化学名:メチル(8S)-4-[2-[[4-[[(2S)-5-(カルバモイルアミノ)-2-[[(2S)-2-[3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソピロール-1-イル)プロパノイルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロパノイルアミノ]-3-メチルブタノイル]アミノ]ペンタノイル]アミノ]フェニル]メトキシカルボニル-メチルアミノ]エチル-メチルカルバモイル]オキシ-8-(クロロメチル)-6-(5,6,7-トリメトキシ-1H-インドール-2-カルボニル)-7,8-ジヒドロ-3H-ピロロ[3,2-e]インドール-2-カルボキシラート
化学構造:
Figure 2022546387000007
等価物および範囲
当業者は、本明細書に記載の態様の多くの等価物を認識し、またはわずかな定型的実験法を使用しこれを確かめることができるであろう。本開示の範囲は上の記載に限定されることを意図しないが、むしろ添付のクレームで表されるとおりである。
「a」、「an」、および「the」などの冠詞は、1もしくは1より多いことを、それと反対なことが指し示されていない限り、または文脈から別様に明白である限り、意味してもよい。群の2以上のメンバー間に「または(もしくは/あるいは)」を包含するクレームまたは記載は、群のメンバーの1つ、1つより多く、またはそれらすべてが存在する場合を、それと反対なことが指し示されていない限り、または文脈から別様に明白である限り、満たすものと見なされる。2以上の群のメンバー間に「または(もしくは/あるいは)」を包含する群の本開示は、群のメンバーが厳密に1つ存在する態様、群のメンバーが1つより多く存在する態様、および群のメンバーがすべて存在する態様を提供する。簡潔にするため、それらの態様は本明細書中、個々に詳しくは説明されていないが、これら態様の各々が本明細書に提供されており、かつ具体的にクレームされてもまたは放棄され(disclaimed)てもよいことは理解されるであろう。
本開示が、1以上のクレームからのもしくは1以上の関係のある記載箇所からの1以上の限定、要素、節、または記述用語が別のクレーム中へ取り入れられるすべてのバリエーション、組み合わせ、および順列を網羅することは、理解されるべきである。例えば、あるクレーム(別のクレームに従属する)は、同じ基礎クレームに従属するいずれか他のクレームに見出される限定の1以上を包含するように修飾され得る。さらにまた、クレームが組成物を記載する場合、本明細書に開示の作製もしくは使用する方法のいずれかに従うか、または当該技術分野において知られている方法(もしあれば)に従う、組成物を作製または使用する方法も、別様に指し示されていない限り、あるいは不一致または不整合が生じるであろうことが当業者に明白でない限り、包含されることは理解されるべきである。
要素が列記として(例として、マーカッシュ群の形式において)提示されている場合、あり得るどの要素の下位群もまた開示されていること、およびいずれの要素または要素のいずれの下位群が群から除去され得ることは、理解されるべきである。用語「含むこと(comprising)」がオープンであることを意図し、追加の要素またはステップの包含を許すことにもまた留意すべきである。一般に、態様、産物、または方法が、具体的な要素、特色、またはステップを含むとして言及される場合、かかる要素、特色、もしくはステップからなるかまたは本質的にこれらからなる態様、産物、あるいは方法も提供されることは理解されるはずである。簡潔にするため、それらの態様は本明細書中、個々に詳しくは説明されていないが、これら態様の各々が本明細書に提供されており、かつ具体的にクレームされてもまたは放棄されてもよいことは理解されるであろう。
範囲が与えられている場合、エンドポイントも包含される。さらにまた、別様に指し示されていない限り、あるいは別様に文脈および/または当業者の理解から明白でない限り、範囲として表現される値が、規定された範囲内のいずれの特定の値も、いくつかの態様において、文脈が別様に明確に指示しない限り、範囲の下限の単位の10分の1まで想定し得ることは理解されるべきである。簡潔にするため、各範囲中の値は本明細書中、個々に詳しくは説明されていないが、これら値の各々が本明細書に提供されており、かつ具体的にクレームされてもまたは放棄されてもよいことは理解されるであろう。別様に指し示されていない限り、あるいは別様に文脈および/または当業者の理解から明白でない限り、範囲として表現される値が、所定の範囲内のいずれの部分範囲(ここで部分範囲のエンドポイントは、範囲の下限の単位の10分の1として、同じ的確さ度で表現される)も想定し得ることもまた理解されるべきである。
ウェブサイトが提供されている場合、URLアドレスは、ブラウザ実行不能なコードとして提供され、夫々のウェブアドレスのピリオドは丸括弧で示される。実際のウェブアドレスは丸括弧を含有していない。
加えて、本開示の具体的ないずれの態様も、いずれか1以上のクレームから明示的に排除されてもよいことは理解されるべきである。範囲が与えられている場合、範囲内のいずれの値も、いずれか1以上のクレームから明示的に排除されてもよい。本開示の組成物および/または方法のいずれの態様、要素、特色、適用、あるいは側面は、いずれか1以上のクレームから排除され得る。簡潔にするため、1以上の要素、特色、目的、または側面が排除される態様のすべては本明細書中、明示的に表されていない。

Claims (34)

  1. 膵臓がんを処置する方法であって、方法が、薬物へ抱合された細胞間接着分子1(ICAM1)抗体を含む、有効量の抗体薬物抱合体(ADC)を、これを必要とする対象へ投与することを含む、前記方法。
  2. 薬物が、以下:N2'-デアセチル-N2'-(3-メルカプト-1-オキソプロピル)メルタンシン(DM1)、モノメチルアウリスタチンE(MMAE)、モノメチルアウリスタチンF(MMAF)、およびデュオカルマイシンからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
  3. 薬物が、DM1である、請求項2に記載の方法。
  4. ICAM1抗体および薬物が、リンカーを介して抱合されている、請求項1～3のいずれか一項に記載の方法。
  5. リンカーが、切断可能なリンカーである、請求項4に記載の方法。
  6. 切断可能なリンカーが、以下:N-スクシニミジル4-(2-ピリジルジチオ)ペンタノアート(SPP)、N-スクシニミジル3-(2-ピリジルジチオ)ブタノアート(SPDB)、Sulfo-SPDB、バリン-シトルリン(Val-cit)、アセチルブチラート、およびCL2Aからなる群から選択される、請求項5に記載の方法。
  7. 切断可能なリンカーが、Val-citである、請求項6に記載の方法。
  8. リンカーが、切断不能なリンカーである、請求項4に記載の方法。
  9. 切断不能なリンカーが、N-スクシニミジル4-(Nマレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシラート(SMCC)、およびマレイミドメチルシクロヘキサン-1-カルボキシラート(MCC)からなる群から選択される、請求項8に記載の方法。
  10. 切断不能なリンカーが、N-スクシニミジル4-(Nマレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシラート(SMCC)リンカーである、請求項8に記載の方法。
  11. ICAM1抗体が、IgG、Ig単量体、Fabフラグメント、F(ab')2フラグメント、Fdフラグメント、scFv、scAb、dAb、Fv、アフィボディ、二重特異性抗体、単一ドメイン重鎖抗体、および単一ドメイン軽鎖抗体からなる群から選択される、請求項1～10のいずれか一項に記載の方法。
  12. ICAM1抗体が、エンリモマブまたはHCD54である、請求項1～11のいずれか一項に記載の方法。
  13. ADC中のICAM1抗体と薬物との比率が、1:1～1:10である、請求項1～12のいずれか一項に記載の方法。
  14. ADC中のICAM1抗体と薬物との比率が、1:4である、請求項13に記載の方法。
  15. ADCが、注射を介して投与される、請求項1～14のいずれか一項に記載の方法。
  16. 注射が、静脈内注射または腫瘍内注射である、請求項15に記載の方法。
  17. 膵臓がんを処置する方法であって、方法が、N-スクシニミジル4-(Nマレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシラート(SMCC)リンカーを介してN2'-デアセチル-N2'-(3-メルカプト-1-オキソプロピル)メルタンシン(DM1)へ抱合された細胞間接着分子1(ICAM1)抗体を含む、有効量の抗体薬物抱合体(ADC)を、これを必要とする対象へ投与することを含む、前記方法。
  18. 膵臓がんを有する対象における、ICAM1抗体、または薬物へ抱合された細胞間接着分子1(ICAM1)抗体を含む抗体薬物抱合体(ADC)での処置の応答性を予測する方法であって、方法が、以下:
    (ｉ)イメージング剤で標識された有効量のICAM1抗体を対象へ投与すること;
    (ii)イメージングを介して腫瘍を視覚化すること;および
    (iii)腫瘍上のICAM1のレベルを決定すること
    を含み、
    ここでより高レベルのICAM1は、対象が、より低レベルのICAM1を有する対象と比較して、ICAM1抗体またはADCでの処置により応答することを指し示している、前記方法。
  19. (i)におけるICAM1抗体が、DTPA-Gdで標識されている、請求項18に記載の方法。
  20. (ii)における視覚化が、磁気共鳴画像法(MRI)を介する、請求項18または請求項19に記載の方法。
  21. 有効量のICAM1抗体またはADCを、膵臓がんを処置するための処置に対して応答することが予測される対象へ投与することをさらに含む、請求項18～20のいずれか一項に記載の方法。
  22. 薬物が、以下:N2'-デアセチル-N2'-(3-メルカプト-1-オキソプロピル)メルタンシン(DM1)、モノメチルアウリスタチンE(MMAE)、モノメチルアウリスタチンF(MMAF)、およびデュオカルマイシンからなる群から選択される、請求項18～21のいずれか一項に記載の方法。
  23. 薬物が、DM1である、請求項22に記載の方法。
  24. ICAM1抗体および薬物が、リンカーを介して抱合されている、請求項18～23のいずれか一項に記載の方法。
  25. リンカーが、切断可能なリンカーである、請求項24に記載の方法。
  26. 切断可能なリンカーが、以下:N-スクシニミジル4-(2-ピリジルジチオ)ペンタノアート(SPP)、N-スクシニミジル3-(2-ピリジルジチオ)ブタノアート(SPDB)、Sulfo-SPDB、バリン-シトルリン(Val-cit)、アセチルブチラート、およびCL2Aからなる群から選択される、請求項25に記載の方法。
  27. 切断可能なリンカーが、Val-citである、請求項24に記載の方法。
  28. リンカーが、切断不能なリンカーである、請求項24に記載の方法。
  29. 切断不能なリンカーが、N-スクシニミジル4-(Nマレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシラート(SMCC)、およびマレイミドメチルシクロヘキサン-1-カルボキシラート(MCC)からなる群から選択される、請求項28に記載の方法。
  30. 切断不能なリンカーが、N-スクシニミジル4-(Nマレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシラート(SMCC)リンカーである、請求項29に記載の方法。
  31. ICAM1抗体が、IgG、Ig単量体、Fabフラグメント、F(ab')2フラグメント、Fdフラグメント、scFv、scAb、dAb、Fv、アフィボディ、二重特異性抗体、単一ドメイン重鎖抗体、および単一ドメイン軽鎖抗体からなる群から選択される、請求項18～30のいずれか一項に記載の方法。
  32. ICAM1抗体が、エンリモマブまたはHCD54である、請求項18～30のいずれか一項に記載の方法。
  33. ADC中のICAM1抗体と薬物との比率が、1:1～1:10である、請求項18～32のいずれか一項に記載の方法。
  34. ADC中のICAM1抗体と薬物との比率が、1:4である、請求項33に記載の方法。
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