HU221341B1 - Use of met-ase and mta for selective methionine starvation of malignant cells in mammals - Google Patents

Use of met-ase and mta for selective methionine starvation of malignant cells in mammals Download PDF

Info

Publication number
HU221341B1
HU221341B1 HU9601695A HU9601695A HU221341B1 HU 221341 B1 HU221341 B1 HU 221341B1 HU 9601695 A HU9601695 A HU 9601695A HU 9601695 A HU9601695 A HU 9601695A HU 221341 B1 HU221341 B1 HU 221341B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
metase
leu
gly
mtase
cells
Prior art date
Application number
HU9601695A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9601695D0 (en
HUT75070A (en
Inventor
Dennis A Carson
Tsutomu Nobori
Original Assignee
Univ California
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ California filed Critical Univ California
Publication of HU9601695D0 publication Critical patent/HU9601695D0/hu
Publication of HUT75070A publication Critical patent/HUT75070A/hu
Publication of HU221341B1 publication Critical patent/HU221341B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/51—Lyases (4)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/527—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving lyase

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

A találmány tárgya eljárás egy – a rákos és a nem rákos (azaznormális) sejtek közötti metabolikus különbségeken ala- puló hatású –gyógyászati készítmény előállítására emlősráksejtek szelektívelpusztítására. A találmány tárgya közelebbről eljárás a metil-tio-adenozint metioninná konvertáló enzimben (MTA-áz) hiányos rákos sejtekéheztetésére alkalmas készítmény előállítására, a plazmában találhatómetionin és homocisztein lebontása útján. A találmány tárgyát képeziktovábbá katalitikusan aktív rekombináns metionin- és homociszteinbontó(MET-áz) poli- peptidek és az ezeket kódoló DNS-molekulák. ŕ

Description

A találmány tárgya eljárás emlősráksejtek szelektív elpusztítására alkalmas gyógyászati készítmény előállítására, mely készítmény hatása a rákos és a nem rákos (azaz normális) sejtek közötti metabolikus különbségeken alapul. A találmány tárgya közelebbről eljárás a metil-tio-adenozint metioninná konvertáló enzimben (MTA-áz) hiányos rákos sejtek éheztetésére alkalmas készítmény előállítására, a plazmában található metionin és homocisztein lebontása útján.
A találmány tárgyát képezik továbbá katalitikusán aktív rekombináns metionin- és homociszteinbontó (METáz) polipeptidek s az ezeket kódoló DNS-molekulák.
A találmány szerinti megoldás előnyösen alkalmazható bizonyos rákos elváltozások kezelésére.
A normális és a rákos sejtek növekedéséhez egyaránt metioninaminosav (MET) szükséges. Egyes rákos sejtekben ez abszolút követelmény, azaz megfelelő MET-utánpótlás nélkül a sejtek elpusztulnak.
Emlőssejtek három forrásból nyernek MET-et. Felvehető egyrészt táplálékként, másrészt hozzájuthat a sejt biokémiai szintézissel L-homociszteint (homociszteint) vagy metil-tio-adenozint (MTA) (utóbbi a poliamin bioszintetikus reakcióút terméke) használva kiindulási anyagként. Ebben a harmadik esetben az MTA-t a metil-tio-adenozin-foszforiláz (MTA-áz) alakítja át MET-té.
Az elmúlt évtizedben a kutatók sok rákos sejtvonalat azonosítottak, amelyek MTA-áz-hiányosak voltak, és így nem tudták az MTA-t MET-té átalakítani. Például Katamari és munkatársai [Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA, 78, 1219-1223 (1981)] közölték, hogy 3 emberi rákos sejtvonal 23%-ában nem lehetett kimutatni MTA-ázt, míg a vizsgált 16 nem rákos sejtvonal mindegyikében találtak MTA-áz aktivitást. Az MTA-ázhiányos sejtek elméletileg kielégítik szükségleteiket azáltal, hogy homociszteint alakítanak át MET-té. Abban az esetben azonban, ha a homocisztein nem hozzáférhető, a sejtek rendszerint elpusztulnak.
Az L-metionin-L-deamino-y-merkapto-metán-liázról (EC 4.4.1.11; MET-áz) ismert, hogy nem csupán a METet, hanem a homociszteint is lebontja. Ilyenformán tehát elméletileg az MTA-áz-hiányos rákos sejteket (vagy másképp: MTA-áz-negatív sejtek) ki lehet éheztetni azáltal, hogy a plazma-MET-et és homociszteint MET-ázzal lebontjuk. Azt várjuk, hogy a normális MTA-áz-pozitív sejtek MET-szükségletüket az MTA MET-té való folyamatos átalakításával elégítik ki.
Ezen megközelítés kezdeti változatát először Kreis javasolta 1972-ben [Cancer Treat. Rprts. 63, 1069-1072 (1972)]. MET-mentes kultúrákban 11 rákos sejtvonalat fenntartva Kreis gátolni tudta egyes rákos sejtek növekedését MET-ázt adva a kultúrákhoz. Kreis azt is megfigyelte, hogy két normális sejtvonal részlegesen „megmenekült” a MET-éheztetés hatása alól, amikor homociszteint adott a kultúrához. Azonban míg az in vitro vizsgálatok biztatóak voltak, maga Kreis több akadályt írt le, melyek a MET-áz kemoterápia sikeres in vivő alkalmazásának útjában állnak. Ide tartoztak például a normális sejtek in vivő túlélésének biztosítására alkalmas eljárás hiánya, a tisztított vagy részlegesen tisztított enzim lehetséges immunogenitása, és hogy az enzimnek proteolitikus enzimek támadásával szemben ellenállónak kell lennie in vivő [Kreis, „Chemotherapy”, szer.: Muggia, FM, The Hague, Boston és London: Martinus-Nijihoff, 219-248 (1983)].
Egy másik akadály annak útjában, hogy a rákos sejtek MET-éheztetésére sikeres megközelítést dolgozzunk ki az, hogy azonosítani kell, mely malignanciák alkalmas célok a terápia számára, azaz melyek MTAáz-negatívak. Ebből a célból egy vizsgálati eljárást fejlesztettek ki, amely megmondja, hogy egy malignancia MTA-áz-negatív-e, azáltal, hogy meghatározza, van-e aktivitás a sejtkultúrában [Seidenfeld és munkatársai., Biochem. Biophys. Rés. Commun.,, 95, 1861-1866 (1980)]. Azonban, mivel az aktivitás méréséhez szükséges radioaktívan jelzett szubsztrát kereskedelmi forgalomban nem hozzáférhető, rutinmeghatározásra ez a módszer jelenleg nem alkalmas. Továbbá az aktivitásmérési eljárás nem veszi figyelembe, hogy az MTA-áz in vitro katalitikusán labilis, és nem azt méri, hogy a sejtkultúrában jelen van-e enzim függetlenül attól, hogy a mérés időpontjában az enzim katalitikusán aktív-e vagy sem.
Az aktivitásmérési eljárás eme hiányossága megkerülhető azáltal, hogy egy olyan immunológiai vizsgálati eljárást fejlesztünk ki, amely elég érzékeny az enzim viszonylag kis mennyiségeinek detektálására. Azonban az MTA-áz immunológiai detektálására szolgáló antitestek készítéséhez szükséges természetes eredetű MTA-áz tisztítása munkaigényes és csekély kitermelést adó eljárásnak bizonyult [Rangione és munkatársai, J. Bioi. Chem. 261,12324-12 329 (1986)].
De még ha az MTA-áz-negatív sejtek detektálására alkalmas módszert fejlesztenénk is ki, a természetes forrásból származó MET-áz megfelelő mennyiségben történő biztosítása éppolyan nehéz, mint az MTA-áz termelése. MET-áz előállítása másként, mint a natív enzim tisztítása útján, mindeddig nem volt megoldott részben azért, mivel a MET-áz-gént eddig csupán részlegesen szekvenálták meg [Nakayama és munkatársai, Biochem. 27, 1587-1591 (1988)].
Mindezen okokból az MTA-áz hiányos ráksejtek in vivő MET-éheztetésének hatékony módszerét mind ez ideig nem dolgozták ki. A találmány szerinti megoldás ezt a szükséget hivatott betölteni.
MTA-áz-negatív sejtek detektálására alkalmas módszerekkel kombinációban a találmány tárgyát képezi egy, az MTA-áz-negatív sejtek szelektív éheztetésére szolgáló továbbfejlesztett módszer. E szerint a módszer szerint egy rákos sejtvonalat, amit MTA-áznegatívként határoztunk meg, terápiásán hatásos mennyiségű MET-ázzal kezelünk, előnyösen rekombináns MET-ázzal, legelőnyösebben pedig olyan rekombináns MET-ázzal, melyet polietilénglikolhoz vagy azzal ekvivalens molekulához konjugáltunk. Pontosabban kifejtve a MET-ázt olyan dózisban adjuk be az emlősnek (előnyösen embernek), amely olyan mértékben csökkenti annak plazma-MET-szintjét, hogy az MTAáz-negatív sejtek metionin szempontjából éhezzenek.
HU 221 341 Β1 (Ez a MET terápia előtti szintjének körülbelül 10%ánál, vagy annál kisebb aránynál következik be.) Normális (MTA-áz-pozitív) sejteket azáltal látjuk el metioninnal, hogy lényegében egyidejűleg MTA-t adunk be.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy, az MTAáz-negatív rákos sejtek detektálására szolgáló módszer. Részletesebben kifejtve, a találmány tárgyát képezi egyfelől az anti-MTA-áz antitestek termelése (monoklonális antitesteket is beleértve), valamint felhasználásuk MTA-áz kimutatására szolgáló immunológiai vizsgálati eljárás során. Másfelől tárgyát képezi az MTA-ázt kódoló gén jelenlétének nukleinsavamplifikációs technikákon, előnyösen polimeráz láncreakción (PCR) alapuló kimutatása.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy rekombináns MET-áz, amit a MET-ázt kódoló gén izolálásával és klónozásával készítettünk el. A klónozás jelentős mennyiségű MET-áz termeltetését teszi lehetővé, melyet a találmány szerinti módszerekben használtunk fel.
Az alábbiakban röviden ismertetjük a leíráshoz csatolt ábrákat.
Az 1. ábrán a poliaminszintézis és az MTA MTAáz általi lebontásának anyagcsere-reakcióútjai láthatók vázlatosan.
A 2. ábrán az immunobiot analízissel detektált humán és nem humán MTA-áz-pozitív és MTA-áz negatív sejtvonalak összehasonlítása látható.
A 3. ábrán az immunobiot analízissel detektált MTA-áz-pozitív és MTA-áz-negatív humán sejtvonalak és elsődleges tumorok összehasonlítása látható.
A 4. ábrán a MET-ázzal kezelt MTA-áz-negatív humán sejtek észlelt növekedésének összehasonlítása látható azokkal, melyeket metioninban gazdag környezetben növesztettünk.
I. Módszerek MTA-áz-negatív sejtek kimutatására
Az 1. ábra sematikusan ábrázolja a MET MTA-ból kiinduló in vivő szintézisének, és a MET MET-áz általi lebontásának anyagcsere-reakcióútjait. Mint azt fent jeleztük, annak érdekében, hogy a metioninéheztetést alkalmazó rákterápia előnyeit teljes mértékig kihasználhassuk, az MTA-negatív sejteket ki kell mutatni a célba vett malignanciában. Ebből a célból az MTA-áz kimutatásának olyan, alternatív módjait írjuk le az alábbiakban, melyek alkalmasak arra, hogy a találmány szerinti módszerekben használjuk őket.
A. Immunológiai vizsgálati eljárások MTA-áz kimutatására
1. Antigén sajátságú MTA-áz és MTA-áz peptidek termelése
MTA-ázra specifikus antitesteket állati szervezetek antigén sajátságú MTA-ázzal vagy MTA-áz peptidekkel való immunizációval állítottunk elő. Általánosságban az antigén sajátságú MTA-áz peptideket emlősszövetekből lehet izolálni és tisztítani a Rangione és munkatársai által leírt módszer alapján [J. Bioi. Chem. 265, 6241-6246 (1990)]. Az alábbiakban következő példák közül több ezen módszer gyakorlatát szemlélteti. Referenciaként megadjuk a teljes hosszúságú MTAáz aminosavszekvenciáját az 1. azonosító számon, a szekvencialistában.
2. Immunizálás antigén sajátosságú MTA-áz peptidekkel anti-MTA-áz antitestek előállítása végett Ha már az antigén sajátságú MTA-áz vagy MTA-áz peptidek a birtokunkban vannak, az immunizáló peptidet az antitest termeltetése céljából emlősbe juttatjuk (például nyúlba, egérbe vagy patkányba). Szemléltetés kedvéért, két antigén sajátságú MTA-áz peptid aminosavszekvenciáját a szekvencialistában a 2. és a 3. azonosító számon mutatjuk be. Az ezekkel a peptidekkel immunizált nyúlban termelt antitestek a maximális immunválasz 50%-át sorrendben 1:1500, illetve 1:4000 hígításban adták.
Egy többszörös injektálást tartalmazó immunizálási eljárás bizonyult a használat során előnyösnek állatok immunizálására antigén sajátságú MTA-áz peptidekkel [például Langone és munkatársai „Production of Antisera with Small Doses of Immunogen: Multiple Intradermal Injections” Methods of Enzymology (1981)]. Például nyúlban jó antitestválasz érhető el 1 mg a komplett Freund-adjuvánsban emulgeált antigén sajátságú MTA-áz intradermális befecskendezésével, majd néhány hét elteltével egy vagy több ráimmunizálással ugyanazon antitest emulziójával nem komplett Freundadjuvánsban.
Ha célszerűnek látszik, az immunizáló peptidet hordozófehérjéhez kapcsolhatjuk konjugáció segítségével, a technika állása szerint jól ismert eljárásokat alkalmazva. Ilyen közönségesen használt hordozók, melyeket kémiailag a peptidhez lehet kötni, például a kulcslyukkagyló („keyhole limpet”) hemocianin (KLH), a thyroglobulin, marhaszérum-albumin, (BSA) és a tetanusz toxoid. A kapcsolt peptidet azután az állat (egér vagy nyúl) immunizálására használhatjuk. Mivel az emlős fajokban előforduló MTA-ázról jelenleg úgy tudjuk, hogy konzerválódott enzim, az MTA-ázok immunogenitásának növelésére hordozófehérje használata előnyös.
Az immunizált állatokban termeltetett antitesteket tovább tisztíthatjuk például olyan mátrixhoz való kötéssel, majd onnan való elúcióval, mely mátrixhoz hozzákötöttük a peptideket, melyek ellen az antitesteket termeltettük. A szakemberek az immunológiában elterjedt számos eljárást ismernek poliklonális és monoklonális antitestek tisztítására és töményítésére egyaránt [például Coligan és munkatársai, „Current Protocols in Immunology”, Unit 9, Wiley Interscience (1991)].
Az MTA-áz-negatív sejtek kimutatására a monoklonális antitestek az előnyösebbek, mivel specifíkusabbak, és könnyebb őket termeltetni. Monoklonális antitestek készítésére egér vagy patkány immunizálása előnyös. A leírásban használt „antitest” kifejezés vonatkozik az ép molekulára és fragmenseire egyaránt, például az Fab-re és az F(ab’)2-re, melyek mindketten képesek az epitópot alkotó molekularészlethez való kötődésre. Ugyanígy, a leírásban használt értelemben a „találmány szerinti mAt-ek” kifejezés az MTA-ázra specifikus monoklonális antitesteket jelenti.
A monoklonális antitesteket szekretáló hibridómák előállítására szolgáló általános módszer jól ismert [Kohler és Milstein, Natúré 256, 495, (1975)]. Röviden,
HU 221 341 BI amint azt Kohler és Milstein közli, az eljárás tartalmazta öt különböző rákos beteg regionálisan nedvedző nyirokmirigyeiből limfociták izolálását. A rákos betegek melanómában, teratokarcinómában, méhnyakrákban, gliómában és tüdőrákban szenvedtek. A limfocitákat sebészetileg eltávolított szövetmintákból nyertük, összegyűjtöttük, majd SHFP-1-sejtekkel fuzionáltattuk. A hibridómákat rákos sejtvonalakhoz kötődő antitesttermelésre szkríneltük. Ezzel lényegében azonos eljárást használhatunk MTA-áz elleni specifitású mAt-ek termeltetésére és azonosítására.
Arra, hogy megbizonyosodjunk a találmány szerinti mAt-ek MTA-áz elleni specifitásáról, viszonylag bevett szkrínelési eljárások állnak rendelkezésre (ilyen például az enzimkapcsolt immunszorbens vizsgálati eljárás vagy „ELISA”), melyek alkalmasak a vizsgált mAt elemi reakciómintázatának felderítésére.
Az is lehetséges, hogy túlzott mértékű kísérletezés nélkül megállapítsuk egy mAt-ről, hogy ugyanaz-e a specifitása, mint a találmány szerinti mAt-nek azáltal, hogy megvizsgáljuk, vajon a vizsgált mAt megakadályozza-e a találmány szerinti mAt-nek az MTA-ázhoz való kötődését. Ha a vizsgált mAt kompetíciót mutat a találmány szerinti mAt-vel, ami a találmány szerinti mAt kisebb mértékű kötődéséből látszik, ez esetben valószínű, hogy a két monoklonális antitest ugyanazokhoz, vagy egymáshoz nagyon hasonló epitópokhoz köt.
Újabb lehetőség annak meghatározására, hogy egy mAt-nek a találmány szerinti mAt-vel azonos-e a specifitása az, hogy a találmány szerinti mAt-t előzetesen együtt inkubáljuk egy vele normális esetben kölcsönható antigénnel, és meghatározzuk, hogy a vizsgált mAt ehhez az antigénhez való kötődési képessége gátlódik-e. Ha a vizsgált mAt kötése gátolt, akkor epitópspecifitása minden valószínűség szerint ugyanaz, vagy nagyon hasonló, mint a találmány szerinti mAt epitópspecifitása.
3. Immunológiai vizsgálati eljárás leírása az MTAάζ-negatív sejtek kimutatására
Ha már a fent leírt módon megfelelő antitesteket nyertünk, ezeket arra használjuk, hogy rákos sejtekben kimutassuk az MTA-ázt. Az erre a célra megfelelő immunológiai vizsgálati eljárást (azaz az „immunobiot” módszert) a későbbiekben leírt 1. példa tartalmazza. Az immunológiában jártas szakemberek számára azonban kézenfekvő, hogy a fent leírt antitesteket használva az MTA-ázt másféle immunológiai vizsgálati eljárásokkal is ki lehet mutatni akár folyadék, akár szilárd fázisban (hordozóhoz kötve).
Anti-MTA-áz antitesteket használva az MTA-áz kimutatását végre lehet hajtani olyan immunológiai vizsgálati eljárásokkal, melyeket akár előrefelé, akár visszafelé, akár szimultán módon futtatunk le, beleértve az immunhisztokémiai vizsgálati eljárásokat is, fiziológiai mintákon. Megfelelő immunológiai vizsgálati eljárások leírásai tartalmaznak egyaránt kompetitív és nem kompetitív módszereket, melyeket meg lehet valósítani akár direkt, akár indirekt formában. Ezekre az immunológiai vizsgálati eljárásokra példák a „radioimmunoassay” (RIA) és a szendvics (immunometriás) vizsgálati eljárások. Szakember számára ismeretesek, vagy könnyen kifej leszthetők egyéb immunológiai vizsgálati eljárási formák is felesleges kísérletezés nélkül.
Ezekhez járul még az, hogy az antitesteket, melyeket az immunológiai vizsgálati eljárások során alkalmazunk, kimutatható módon meg lehet jelölni. A jelző („label”) olyan anyag, melyet kovalensen vagy más módon, de erősen kötünk egy nukleinsavpróbához, ami a próbát detektálhatóvá teszi. A jelölő lehet például radioizotóp, enzim szubsztrát vagy inhibitor, enzim, „radiopaque” anyag (sugárzás számára átlátszatlan anyag, amely kolloid fémet tartalmaz), fluoreszkáló vagy kemilumineszkáló molekula, liposzómák, melyek a fenti jelölők bármelyikét tartalmazzák, vagy egy specifikusan kötődő pár tagja. A megfelelő jelölő nem veszti el a kimutathatóságért felelős tulajdonságát amplifikáció során.
Azok számára, akik szakemberek a diagnosztikai technikák területén, ismertek azok a megfelelő kimutatható jelzők, melyeket az in vitro detektálási mérési eljárások során használhatunk. Például megfelelő radioizotópok a 3H, 125I, I31I, 32P, 14C, 35S. Amplifikált ffagmenseket, melyeket radioizotóppal jelöltünk, közvetlenül detektálhatunk egy gammaszámlálóval, vagy autoradiogram denzitometrálásával, az amplifikált fragmens-denzitometrálással kombinált Suthernblotolásával. Megfelelő kemilumineszcens molekulák például az akridin és a luminol. Célszekvenciákat, melyek akridium-észterrel jelzett próbával hibridizálnak, interkaláció védi meg a hidrolízistől. Megfelelő fluoreszcens például a fuloreszcein, a phycobiliprotein, ritkafoldfém-kelátok, dansil vagy a rodamin.
Megfelelő enzim szubsztrátok vagy inhibitorok például olyan vegyületek, amelyek specifikusan kötnek torma-peroxidázhoz, glükóz-oxidázhoz, glükóz-6-foszfát-dehidrogenázhoz, β-galaktozidázhoz, piruvát-kinázhoz, lúgos foszfatázhoz vagy acetil-kolin-észterázhoz. „Radiopaque” anyag például a kolloid arany, vagy mágneses részecskék.
Egy specifikusan kötődő pár két különböző molekulát jelent, ahol egyikük felületén vagy üregében olyan terület van, amelyik specifikusan köt egy másik molekula térbelileg és polárisán egyedileg szervezett régiójához. A specifikusan kötődő pár tagjaira gyakran hivatkoznak úgy, mint ligandumra és receptorra, vagy ligandumra és antiligandumra. Például a receptor lehet egy antitest, a ligandum pedig egy megfelelő antigén. Egyéb specifikusan kötődő párok például a hormonreceptor párok, enzimszubsztrát párok, biotin-avidin vagy glikoprotein-receptor párok. Fragmensek és specifikusan kötődő párok olyan részletei, melyek megtartják kötődésük specifitását, például immunglobulinok fragmensei, mint az Fab-fragmens és hasonlók. Az antitestek monoklonálisak vagy poliklonálisak lehetnek. Amennyiben egy specifikusan kötődő pár egy tagját használjuk jelölőként, az affmitási kromatográfia része az előnyös tisztítási eljárásnak.
Az antitesteket szintén hordozóhoz köthetjük. Jól ismert hordozók például az üveg, polisztirol, polipropilén, polietilén, dextrán, nejlon, amilózok, természetes
HU 221 341 Β1 és módosított cellulózok, poliakrilamidok, agarózok és a magnetit. A találmány szerinti megoldásra alkalmas hordozó természete szerint lehet oldható vagy oldhatatlan. Szakember számára egyéb, antitestek kötésére alkalmas hordozók is ismeretesek, vagy képes ilyeneket 5 kifejleszteni a technika állása szerinti kísérleti technikák felhasználásával.
B. MTA-áz-negatív sejtek kimutatása PCR-alapú kimutatási eljárás segítségével Mivel az MTA-áz specifikus antitesteket hasznosító immunológiai vizsgálati eljárás segítségével a detektálás viszonylag gyors és könnyű, az immunológiai vizsgálati eljárás az előnyös eszköz az MTA-áznegatív sejtek kimutatására. A szakember tudatában van azonban, hogy annak kimutatása, hogy egy MTA- 15 áz-negatív sejt jelen van-e egy malignanciában, más módon is lehetséges. Például az 1. azonosító számon megadott nukleinsavszekvencia alapján a szakember oligonukleotidpróbát tud készíteni, amely hibridizál a sejtben jelen lévő MTA-áz DNS-sel. Fordítva, mivel 20 úgy gondoljuk, hogy az MTA-áz-hiány oka az MTAáz fehérjét kódoló gén deléciója a genomból, feltételezhetjük, hogy ha nem tudjuk az MTA-ázt kódoló gént kimutatni a sejtben, a sejtek MTA-áz-negatívok.
Az MTA-áz gén amplifíkálására és kimutatására 25 szolgáló módszer leírása megtalálható a függőben levő 08/176,855 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben (benyújtva 1993. december 10-én).
A 08/176,855 számú függőben lévő bejelentésben található erre az eljárásra vonatkozó feltárást a jelen kitanítás részeként kell tekinteni.
C. Feltételezhetően MTA-áz-negatív rákos elváltozások, MTA-áz éheztetésen alapuló terápiára Egy malignancia, melyen a találmány szerinti terápiát (azaz a MET-éheztetésen alapuló terápiát) szándékoznak végrehajtani, nem tartalmaz kimutathatóan sem katalitikusán aktív, sem inaktív MTA-ázt. Minden eddig 10 vizsgált rákos sejtvonalban az MTA-áz-negatív tulajdonság (ha egyáltalán megvan) konzisztens jellemvonás a sejtpopuláció egészében. Más szavakkal, ha egy malignancia néhány sejtje MTA-áz-negatív, azt várhatjuk, hogy minden sejtje MTA-áz-negatív lesz. Ez összhangban van a technika állása szerinti azon elgondolással, hogy az MTA-áz-hiány inkább géndeléció, mint mutáció következménye. A malignancia homogenitása MTA-áz-hiány szempontjából szignifikánsan növeli a MET-éheztetés mint rákterápia hatásosságát olyan, heterogén tulajdonságot célba vevő terápiákkal szemben, mint például az a terápia, amikor tumorantigéneket célzunk monoklonális antitestekkel. A találmány szempontjából szükséges azonban, hogy a maglinancia „lényegileg hiányos” legyen MTA-ázban, azaz, hogy ne tartalmazza az MTA-áz fehérjedetektálható mennyiségét.
Az alább felsorolt emberi eredetű malignanciák olyanok, melyeket jelenleg MTA-ázban lényegileg hiányosnak tartunk.
1. táblázat
Malignancia MTA-áz-hiány kimutatására használt vizsgálati eljárás
Nem kissejtes tüdőrákok: Immunológiai®
A-549 (adenoszarkóma)
Sk-Lu-1 (adenoszarkóma)
H322 („bronchoalvedor”)
H1334 (nagysejtes karcinóma)
H1437 (adenoszarkóma)
H1581 (nagysejtes karcinóma)
* Agytumor sejtvonalak: Immunológiai®
A172
U-87MG
U-138MG
Hs683
Elsődleges agytumorok Immunológiai®
Asztrocitóma
Többalakú glioblasztóma
Oligosztrocitóma
Limfómák és leukémiák Immunológiai®
CEM (akut limfocitás leukémia)
K-T-l (akut limfocitás leukémia)
NALL-1 (akut limfocitás leukémia)
K562 (krónikus mielogén leukémia)
DHL-9 (malignus limfóma)
HBS2 (akut limfocitás leukémia)
HU 221 341 Bl
1. táblázat (folytatás)
Malignancia MTA-áz-hiány kimutatására használt vizsgálati eljárás
Egyéb:
Walker 156 szarcinoszarkóma Klinikai bizonyíték**
Jurkat Immunológiai***
K562 Immunológiai***
Capain-1 (hasnyálmirigy-adenoszarkóma) Immunológiai****
Megjegyzések * az amerikai típusú kultúragyűjtemény, Rockevillc, MD.
** közölték Kreis és munkatársai [Cancer Rés., 33, 1866-1869 (1973)] *** közölték Ragione és munkatársai [Biochem. J. 281, 533-538 (1992)] **** közölték Kreis és munkatársai [Cancer Trmt. Rpts. 63, 1069-1072 (1979)] ®MTA-áz-hiányt az összes többi malignanciában Nobori és munkatársai azonosították és közölték [Cancer Research, 53, 1098-1101 (1993), valamint Cancer Research, 51,3193-3197 (1991)].
Az itt leírt kimutatási technikákat felhasználva a szakemberek képesek lesznek felesleges kísérletezés nélkül kimutatni az MTA-áz-hiányt egyéb malignanciákban is.
II. MET-éheztetésen alapuló terápia
A. MET-άζ termeltetése
A találmány szerinti eljárásokban történő felhasználásra MTA-áz- és MET-áz-forrásra egyaránt szükségünk van. Az MTA-hoz való hozzájutás lehetőségeit az előzőekben leírtuk. A találmány szerinti módszerekhez használt MTA-ázt olyan mikroorganizmusokból tisztítottuk, mint például a Trichomonas vaginalis [Lockwood és munkatársai, J. Biochem. 279, 675-682 (1991)], Clostridium sporogenes (lásd például Kreis és munkatársai, fenti hivatkozás 1867. old., EC 4.4.1.11.) és Pseudomonas putida [Nakayama és munkatársai, Biochem. 27, 1587-1591 (1988)].
A P. putidából készített cDNS-könyvtárt használva a MET-áz teljes hosszúságú nukleotidszekvenciáját azonosítottuk. Ez a nukleotidszekvencia megegyezik a szekvencialistában a 4. azonosító számon megadott szekvenciával, míg a megfelelő aminosavszekvencia megegyezik az 5. azonosító számon megadott szekvenciával.
Ezek ismeretében a MET-ázt nem nehéz szintetizálni vagy expresszáltatni egy DNS-klón segítségével, jól ismert technikákat alkalmazva, melyeket az MTAázzal kapcsolatban már leírtunk. A MET-áz klónozására és expresszáltatására E. coliban az alábbiakban részletes példákat adunk meg a 2. és a 3. példában.
Noha a tisztított, részlegesen tisztított, szintetizált, vagy rekombináns MET-ázt egyaránt használhatjuk a találmány szerinti terápiás módszer alkalmazása során, könnyebb tisztíthatósága és viszonylag alacsony immunogenitása miatt a rekombináns MET-áz az előnyös. Az enzim immunogenitása tovább csökkenthető - és előnyösen csökkentendő is - azáltal, hogy polietilénglikolhoz (PEG), vagy azzal egyenértékű biológiailag kompatibilis molekulához kötjük. Várható, hogy a PEG-hez való kötés a MET-áz konjugátum in vivő féléletidejét is megnöveli.
A PEG-MET-áz-konjugátumot kialakíthatjuk úgy, hogy a PEG-et az enzimhez kovalensen hozzákötjük. Ezt a kötést aszparaginon keresztül például Benedich és munkatársai közölték [Clin. Exp. Immunoi. 48, 273-278 (1982)]. Módszerek a PEG fehéijékhez való kötésére jól ismertek a technika állása szerint, ezért a továbbiakban nem írjuk le őket részletesen. A nonhodgkins limfómának a klinikai gyakorlatban PEGkapcsolt L-aszparaginázzal való kezelése során tett megfigyelések alapján nem várjuk, hogy a MET-áz PEG-hez való kapcsolása jelentősen csökkenti annak in vivő aktivitását [Muss és munkatársai, Invest. New Drugs, 8, 125-130 (1990)]. A szakemberek tudnak más lehetőségekről is, melyek alkalmasak a fehérjék in vivő féléletidejének növelésére, és megfelelőek lehetnek a MET-áz esetében. Ilyenek például (de nem kizárólag) a glikozilálás és a szukcinilálás.
B. Terápiás módszerek
MTA-ázban lényegileg hiányos malignanciákat a találmány szerinti megoldásban részben MET-áz beadásával kezelünk. A találmány szerinti megoldásban előnyösen azok a malignanciák kezelhetők így, melyek esetében helyi kemoterápiát alkalmazhatunk; azaz ahol a malignancia lokalizálva van, és a testnek intraartériás infúzióval, vagy más módon a MET-áz beadása szempontjából hozzáférhető területén található. A MET-áz bejuttatásának ilyen más módja lehet az, amikor a MET-ázt helyileg, bőrön keresztül, vagy ezekkel egyenértékű úton közvetlenül a malignancia helyére juttatjuk. Helyi kemoterápiának alávethető malignanciák például a melanómák, méhrák (hasfalon keresztül bevezetett katéter útján) és a húgyhólyagrák (húgycsőkatéter útján). A találmány szerinti regionális kemoterápiával egyéb, MTA-áz-negatív malignanciák esetleg szintén kezelhetők lesznek. Az onkológiában járatos szakemberek ismernek ilyen malignanciákat.
Szakember számára nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti terápiás készítmények beadhatók szisztémásán. A dózisokat azonban a készítmények kiürülésének kompenzálása és a normális sejtek számára tolerálható toxicitást figyelembe véve kell beállítani. Különösen a nor6
HU 221 341 Β1 mális sejtek metioninéheztetésének klinikai tüneteit kell figyelemmel kísérni, és ha szükséges, megfelelő mennyiségű MT A-val kell kompenzálni a hiányt.
MTA-ázban lényegében hiányos malignanciákat a találmány szerint előnyösen kezelhetünk az alábbiakban leírtak szerint.
A MET-ázt emlősnek (előnyösen embernek) parenterálisan adjuk be, az adagolás előnyösen intraarteriális infúzió útján történik. A MET-áz gyógyászatilag elfogadható formában kerül beadásra, ami lehet vizes, vagy nemvizes oldat, szuszpenzió vagy emulzió. Szerves oldószerre példa a propilénglikol, polietilénglikol, növényi olajok, mint például az olívaolaj, valamint injektálható szerves észterek, mint például az etil-oleát. Vizes közeg lehet a víz, alkoholtartalmú vizes oldatok, emulziók vagy szuszpenziók, sót tartalmazó és puffereit közegeket is beleértve. Mint azt fent megjegyeztük, a találmány szerinti megoldásban a MET-ázt előnyösen PEG-hez kötjük, hogy csökkentsük immunogenitását.
Parenterális hordozó lehet például nátrium-kloridoldat, Ringer-féle D-glükóz-oldat, D-glükóz és nátrium-klorid, laktózzal készült Ringer-oldat vagy kötött olajok. Intravénás hordozók lehetnek folyadék- vagy tápanyag-kiegészítők, elektrolit kiegészítők (Ringerféle D-glükóz-oldaton alapulók) és hasonlók. Tartósítok és más additívok szintén jelen lehetnek, mint például antimikrobiális szerek, antioxidánsok, kelátképzők, inért gázok és hasonlók.
A MET-áz dózisa 10 egység/m2-től 20 000 egység/m2-ig terjedhet, a találmány szerinti megoldásban előnyösen 5 000 és 6 000 egység/m2 között van (bár intraarteriális infúzió esetén értéke ennél alacsonyabb is lehet). Egy dózist hetente egy vagy két alkalommal adunk be, egy vagy néhány napra elosztva. A MET-áz emlősből beadása után várhatóan 24 órával általában kiürül; az enzim féléletidejét növelő eszközök használatával (mint például a PEG-hez való kötés) a féléletidőt néhány órától néhány napig terjedő időtartammal meghosszabbíthatjuk. Ezért az emlős plazmametioninszintjét folyamatosan mérni kell, és szükség esetén újabb adag MET-ázt kell beadni, hogy az emlős plazmametionin-koncentrációját terápiás szempontból jelentős mértékben csökkentsük. Ez a csökkenés elegendő ahhoz, hogy észlelhető változást okozzon az MTA-áz-negatív sejtek mennyiségében, azaz az emlős ráksejtjeinek mennyiségében, illetve a tumorterhelésben. A dózist, amellyel ezt az eredményt érhetjük el, „terápiásán hatásos” dózisnak nevezzük. Rágcsálókon részlegesen tisztított MET-ázzal végzett in vivő vizsgálatok alapján általában azt várhatjuk, hogy az a dózis, ami a betegben a plazma metioninszintjét a terápia előtti szintnek 10%-ára, vagy annál kisebb értékre csökkenti, terápiásán hatásos dózis.
A plazmametionin-szintet (és változásait) folyamatosan követhetjük vérminták periodikus, előnyösen napi in vitro vizsgálatával, mely vérmintákat a METázt kapó betegekből nyerjük a teljes időtartam alatt, amíg a MET-ázt kapják. Rágcsálókon végzett vizsgálatok alapján általában azt várhatjuk, hogy a plazma metioninszintje a terápia előtti szintnek nem több, mint 10%-ára a MET-áz beadását követő körülbelül egy órán belül csökken le. Eljárások plazmametionin mérésére jól ismertek a technika állása szerint; például a metionin koncentrációját a vérplazmában meghatározhatjuk észterezett aminosavak (n-butil-észter) gáz-folyadék kromatográfíájával [Roach és munkatársai, J. Chromatog. 44, 269-278 (1969)]. Szakember plazmametionin mérésére más, ezzel ekvivalens eljárásoknak is birtokában van, vagy könnyen elsajátít ilyen eljárásokat.
Meg kell jegyeznünk, hogy a MET-áz nem tudja lebontani a sejten belüli metionint. Ezért, ha az intracelluláris metionin keletkezéséhez megfelelő MTAforrás áll a sejt rendelkezésére, az MTA-áz-pozitív sejtek általában túl tudják élni a MET-áz exogén metioninmennyiséget csökkentő hatását. Exogén metioninforrás nélkül azonban (vagy L-homocisztein nélkül, amiből metionin keletkezhetne, és amit a MET-áz szintén lebont), a metionint előállítani teljesen képtelen MTA-áz-negatív sejtek általában nem élik túl a plazmametionin hiányát.
A terápia hatékonyságát nyomon követhetjük, és arról meggyőződhetünk bármely, a malignancia sejttömegének csökkenésére érzékeny klinikai mennyiség mérésével, melyre a technikában jól ismert módszereket alkalmazhatunk. Másik lehetőség a malignancia MTAáz-negatív sejtjei tömegének meghatározása az itt leírt meghatározási mód segítségével. Emberben végzett Laszparagináz-terápia klinikai adatai alapján várható, hogy a MET-áz-terápia toxicitása meglehetősen alacsony lesz, és elsődlegesen allergiás reakciókat fog jelenteni, melyek szakemberek által jól ismert módszerekkel, mint például epineffin adása, jól kezelhetők.
Ezért a MET-áz adásával lényegében párhuzamosan MTA-t adunk be az emlősnek. A találmány szerinti megoldásban előnyösen egy időben adjuk be az MTA-t és a MET-ázt. Mivel az MTA nem szubsztrátja a METáznak, ezért együttesen alkalmazhatók gyógyászatilag elfogadható hordozóban. Másik lehetőség, hogy az MTA-t a MET-áz beadásához képest 24 órán belül adjuk be (előnyösen nem a MET-áz beadása előtt), hogy megmentsük az MTA-áz-pozitív sejteket, melyek endogén metioninforrása kimerülőben van.
A normális sejtek megmentéséhez szükséges MTA-adag nagysága számos klinikai tényezőn múlik, mint például a malignancia elhelyezkedése, az MTAáz-negatív sejtek mennyisége a malignanciában, a MET-áz-terápia hossza és az, hogy a páciens mennyi MET-t vesz magához a táplálékkal. Általában azonban az MTA-t körülbelül 1-10 μΜ közötti plazmametioninszint fenntartására elegendő adagokban adjuk be.
Most, hogy a találmány szerinti megoldást ismertettük, példák segítségével részletezzük gyakorlati megvalósítási módjait. Az ismertetett példák azonban semmi esetre sem korlátozzák szabadalmi igényünket, melyet a csatolt szabadalmi igénypontok definiálnak.
A „h” órát vagy órákat jelent, az egyéb mértékegységekre a szabványos rövidítéseket (mint például ml) alkalmazzuk.
HU 221341Β1
1. példa
Immunológiai vizsgálati eljárás MTA-áz kimutatására
A. MTA-áz elleni antitestek előállítása
Az MTA-ázt marhamájból tisztítottuk Rangione és munkatársai leírása (lásd fent) alapján. Az izolált enzim tripszines emésztése után keletkezett peptidek közül jó néhányat megszekvenáltunk hagyományos technikával. A kapott szekvenciák alapján a 40. peptidet (18. aminosav hosszú, a 2. azonosító számon mutatjuk be) és az 51. peptidet (14 aminosav hosszú, a 3. azonosító számon mutatjuk be) megszintetizáltuk a jól ismert Merrifield-féle szilárdfázisú módszer egy módosított változatával [Chen és munkatársai, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA, 81, 1784-1788 (1984)]. Mindkét peptid ciszteinaminosavat tartalmazott a karboxiterminálisán, hogy elősegítse a hordozófehérjéhez, a KLH-hoz való kémiai kapcsolást, melyet m-maleimido-benzoil-N-hidroxi-szukcinimid-észter segítségével végeztünk el.
Új-zélandi fehér nyulakat (két nyulat peptidenként) immunizáltunk kéthavonta a peptid-KLHkonjugátumokkal. Az első injekciók 1 mg szintetikus peptid-KLH-konjugátumot tartalmaztak, komplett Freund-adjuvánsban emulgeálva. A fokozó injekciók 1 mg antigént tartalmaztak a nem komplett Freundadjuvánsban. 3-4 injekció után a szérumokat részlegesen tisztítottuk 50%-ig telítve azokat ammónium-szulfáttal, majd antipeptid- és anti-MTA-áz-reaktivitásra szkríneltük őket ELISA-val.
Részletesebben kifejtve, a mikrotitertálcákat peptidekkel, vagy MTA-ázzal burkoltuk egy éjszakán át inkubálva 4 °C-on, koncentrációjuk 10 pg/ml volt BBSben (azaz 0,15 M NaCl-ot tartalmazó pH 8,5, 0,2 nátrium-borát-pufferben). A lemezeket egyszer mostuk 0,05% Tween 20-at tartalmazó BBS-sel, majd 4 órán keresztül 1% marhaszérum-albumint tartalmazó BBSsel inkubáltuk, hogy a nem specifikus kötőhelyeket blokkoljuk. A kontrollszérum és a peptiddel indukált antiszérum néhány hígítását 0,1 ml-es adagokban felvittük a lemezre, amit egy éjszakán keresztül inkubáltunk. Másnap a lemezeket kétszer mostuk 0,05% Tween 20at tartalmazó BBS-sel, majd 1 órán keresztül lúgos foszfatázzal jelölt, kecskében nyúl ellen termeltetett F(ab’)2-immunoglobulinnal (forgalmazza a Jackson Laboratories, Inc., West Grove, PA), 1:1000-hez hígítva, BBS-ben. Miután a lemezeket mostuk, 0,2 ml 0,1 M dinátrium-(p-nitro-fenil)-foszfátot tettünk mindegyik kútba, pH 9,0 0,1 M NaHCO3-pufferben. Az abszorbanciát 30 perccel később mértük, 405 nm-en.
B. Immunoreaktiv MTA-áz immunobiot analízisének leírása
Néhány emberi sejtvonalat és tumorbiopsziát értékeltünk MTA-áz-negatív sejtek jelenléte szempontjából (lásd az 1. táblázatot, az MTA-áz-negatív sejtekről, az „immunológiai”-ként jelölt részeket). Egyéb minták, amik MTA-áz-pozitívnak bizonyultak, a következők voltak: BV-173 (krónikus mielogén leukémia, „CML”), Molt-16 (akut limfocita leukémia, ALL), MOLT-4 (ALL), U397 (hisztocitikus limfóma), SUP-T8 (ALL), U-373MG (glioblasztóma), T98G (glioblasztóma).
Az enzimpozitív sejtekből készített sejtkivonatokat 0,1% nátrium-dodecil-szulfát-tartalmú 12,5%-os poliakrilamidgélen elektroforetizáltuk, különböző mennyiségű MTA-ázzal együtt, melyet a fent leírt módon tisztítottunk marhamájból.
Részletezve, a nyers sejtkivonatokat (10-150 pg/sáv) nátrium-dodecil-szulfát-tartalmú 12,5%-os poliakrilamidgélen elektroforézissel elválasztottuk. Nitrocellulózmembránra (0,45 mm; forgalmazza a Bio-Rad, Richmond, CA) történő elektrotranszfer után a nem specifikus kötőhelyeket BBS-ben oldott 3% tejporral blokkoltuk. A fehérjéket ezután szobahőmérsékleten 16 órán keresztül inkubáltuk antiszérummal, melyet előzőleg 1:500 arányban hígítottunk 3% tejport tartalmazó BBS-sel. Miután a fehérjéket alaposan mostuk BBS-sel, a reaktív sávokat 125I-jelzett protein-A (forgalmazza az ICN Radiochemicals, Irvine, CA) kötésével azonosítottuk, 1 órás inkubálás után. A membránokat ezután mostuk, majd papírtörülközővel biotoltuk, és Kodak XAR-5 (tm) filmre exponáltuk 70 °C-on.
Az autoradiogramon található sávokat denzitométerrel (Bio-Rad) analizáltuk, és a tisztított enzim immunreaktív sávjaiból nyert kalibrációs görbe segítségével végeztük a mennyiségi kiértékelést.
C. Eredmények
A nem tüdőből származó sejtvonalakban és a biopsziákban (azaz a gliómákban) 67%-a (6 körül 4) teljesen hiányos volt az immunreaktív enzimben (2. ábra). Humán gliómákból származó hat egymást követő biopsziaminta közül, melyek szövettani jellemzői különbözők voltak (1. táblázat), öt teljesen enzimhiányosnak bizonyult (3. ábra). Kontrollkísérletek azt mutatták, hogy a normális emberi agy MTA-ázaktivitása elég nagy (3. ábra, 7. sáv). így tehát a teljes MTA-áz-hiány az emberi gliómák közös és jellegzetes anyagcsere-rendellenessége.
A 19 vizsgált nem kissejtes tüdőráksejtvonalból az MTA-áz 6 sejtvonalból hiányzott teljesen (1. táblázat és 4. ábra).
2. példa
MET-áz klónozása Pseudomonas putidából
A rendelkezésre álló részleges aminosavszekvencia alapján [Wakayama és munkatársai, Biochem., 27, 1587-1591 (1988)] degenerált oligonukleotidláncindítót terveztünk és használtunk a MET-áz-gén amplifikálására PCR-eljárással.
A PCR-eljárással amplifikált fragmens körülbelül 300 bp hosszú volt. Ezt a 300 bp PCR-terméket pBluescript-II-KS-plazmidba (forgalmazza a Stratagene, San Diego, CA) szubklónoztuk. A PCRtermékhez belső oligonukleotidpróbát használva a szubklónozott PCR-termék Southem-blot-analízise igazolta, hogy a fragmens a MET-áz-gén egy szakasza. További Southem-blot-analízis megmutatta, hogy a PCRrel készített fragmens a Pseudomonas putida DNSének 5,0 kb hosszú Sg/II-fragmensével hibridizál.
Ezen eredmények alapján a Pseudomonas putida genomi DNS-éből egy genomi DNS-könyvtárat készítettünk bakteriofágban. A Sg/II-vel emésztett
HU 221 341 Bl
Pseudomonasputida DNS-t 0,8% alacsony olvadáspontú agarózgélen elektroforetizáltuk. A 4 kb-tól 6 kb-ig terjedő őg/II-fragmenseket kivágtuk és a gélből tisztítottuk. A Klenow-fragmens segítségével ezeket a fragmenseket részlegesen feltöltöttük és yFixII bakteriofágvektorba szubklónoztuk. Ezt a vektort azután Xholgyel emésztettük és részlegesen feltöltöttük Klenowfragmenssel. A könyvtárat bakteriofág részecskékbe csomagoltuk a Stratagene által forgalmazott gigapack DNS-csomagolókivonat segítségével. Csomagolás után a könyvtárat amplifikáltuk, és meghatároztuk a titerét.
Ezt a könyvtárat a PCR-rel készített fragmenssel szkríneltük, hogy izolálhassuk a teljes MET-áz-gént. 200 000 klón szkrínelése után 8 független elsődleges kiónt izoláltunk. Ebből a nyolc klónból csak kettő volt valóban pozitív és egyedi. Az egyik klón egy 5,1 kb hosszú, a másik egy 5,9 kb hosszú inszertet tartalmazott. Ezeket az inszerteket pBluescript-II-KS-vektorba szubklónoztuk, majd feltérképeztük és szekvenáltuk. Meghatároztuk, hogy a MET-áz-gén 1615 bp hosszú. Szekvenciáját a 4. azonosító számon mutatjuk be.
3. példa
Rekombináns MET-áz expresszáltatása
A rekombináns MET-áz-gént C5-vektorban expresszáltattuk. Ez ugyanaz a vektor, amit az MTA-áz expresszáltatására használtunk (7. példa, valamint a 08/175,855 számú függőben levő amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés, benyújtva: 1993. december 29.). Rekombináns C5-tel transzformált E. coli egyetlen kolóniáját használtuk egy 50 ml-es kultúra leoltására. Kis és nagy léptékű bakteriális kultúrákhoz egyaránt LB-táptalajt használtunk, 50 yg/ml ampicillinnel kiegészítve. A leoltott 50 ml-es kultúrát 37 °Con inkubáltuk egy éjszakán át. Másnap a tenyészetet 100-szorosára hígítottuk friss LB-táptalajjal. A sejteket nagy tenyészetekben (1 1-es) növesztettük 1,5 órán át, élénken rázatva őket 37 °C-on. A MET-áz-expresszió indukálására izopropil-tio-p-D-galaktozidot (IPTG) adtunk a nagy kultúrákhoz, 0,01, 0,1 és 1 mM-os végkoncentrációban. A kultúrákat ezután még 4 órán keresztül rázattuk. Az optimális IPTG-koncentrációnak az 1 mM bizonyult.
Négy órával az IPTG hozzáadása után a sejteket
000 g-vel, 10 perc alatt 4 °C-on lecentrifugáltuk. A felülúszót eltávolítottuk, a sejteket felszuszpendáltuk és mostuk hideg sós oldatban, majd újra lecentrifugáltuk. Az újra felszuszpendált sejteket 100-200 ml pH 7,5, 20 mM kálium-foszfát-pufiferrel mostuk, 15 μΐ 2merkaptoetanol jelenlétében. 1 μΜ EDTA és 30 μΜ piridoxál-5’-foszfát (A-puffer) hozzáadása után a csapadékot ismét felkavartuk. A megmosott és pufferben felszuszpendált sejtszuszpenziót sejtfeltáró bombába helyeztük. A sejtek összetörését 2200 PSI (azaz körülbelül 15,2 MPa) nyomású nitrogénnel végeztük 20 percig. A lizált sejteket lecentrifugáltuk 43 000 g-vel, percig 4 °C-on. A sejtkivonat felülúszóját tovább tisztítottuk festékligandum-affinitási oszlopon.
A sejtkivonatot egy „DYEMATRIX” gél („Orange A”) (forgalmazza az Amicon Inc., Beverly, MA) oszlopra (12 χ 2,6 cm) vittük fel. Az oszlopot a gyártó utasításai alapján töltöttük meg és ekvilibráltuk. A mintafelvitel után az oszlopot 5 oszloptérfogat A-pufferrel mostuk, hogy a nem kötött anyagot eltávolítsuk. Ezután a lépés után a kötött terméket 0-1,5 M KC1 lineáris gradiensével (A-pufferben) eluáltuk. A gyűjtött frakciók térfogata 10 ml volt, ezeken elvégeztük az y-liáz enzim aktivitásmérését. A jelentősebb metionin-y-liázaktivitást mutató frakciókat összegyűjtöttük, és 2-3 mire töményítettük be „CENTRICON 30”-cal (forgalmazza az Amicon Inc.).
A töményített frakciókhoz szilárd (NH4)2SO4-ot adtunk (0,314 g/ml-t), hogy a végső koncentráció 2,4 M legyen, a mintát 13 000 g-vel centrifugáltuk 10 percig, majd a felülúszót 0,45 μ „acrodis” szűrővel (forgalmazza az Amicon Inc.) szűrtük, majd alkil-„SUPEROSE” (agaróz) Hr 5/5 hidrofób FPLC-oszlopra (forgalmazza a Pharmacia) vittük fel, melyet előzőleg A-pufiferben oldott 2,4 M (NH4)2SO4-tal ekvilibráltunk (ezt használtuk a korábbi lépésekhez is). Az (NH4)2SO4 koncentráióját lineárisan csökkentettük, ennek során a kötött fehéije eluálódott. Az áramlási sebesség 0,5 ml/perc volt. A METáz-tartalmú frakciókat összegyűjtöttük, és a fent leírt módon betöményítettük. A fehérjekoncentrációt Bradford módszerével mértük meg.
Az előállított enzim tisztaságát 1 mm vastag SDS 10% glicin-tris-gélen (forgalmazza a Nowex, San Diego, CA) ellenőriztük. A MET-áz-aktivitást 2-keto-vajsav keletkezését mérve vizsgáltuk Esaki és Skoda által közölt módon [Meth. Enzymol. 143, 459-465 (1987)], mely publikációt a kitanítás részeként kell tekinteni. A kész enzim specifikus aktivitása 300 egység/mg volt, ahol 1 egység =1 perc alatt keletkezett 1 μΜ termék.
4. példa
MET-áz-negativ sejtek szelektív éheztetése nem kissejtes tüdőráksejtekben
Az MTA-áz-negatív nem kissejtes tüdőráksejtvonalakat, melyeket az 1. példában azonosítottunk, in vitro sejtkultúrában MET-ázzal és MET-tel kezeltünk, a találmány szerinti terápiás módszerrel. Részletesebben kifejtve, az enzimpozitív (SK-MES-1) és -negatív (A549) sejteket 4 napig növesztettük (a) 10% dializált lószérummal kiegészített metionintartalmú táptalajon, (b) 10% dializált lószérummal kiegészített metioninhiányos táptalajon, és (c) 10% dializált lószérummal és 16 μΜ MeSAdo-nal kiegészített metioninhiányos táptalajon. Mindkét sejtvonal szaporodása, de különösen az enzimnegatív A-549 sejteké, jelentősen csökkent metionint nem tartalmazó közegben. Az SK-MES-1 sejteké 27%-a, míg az A-549 sejteké 3,3%-a volt a kontroll szaporodási sebességének. Ugyanahhoz a táptalajhoz MTA-t adva az enzimpozitív SK-MES-1 sejtek növekedési sebessége megnőtt (77%-ára a kontroliénak). Az enzimnegatív A-549 sejtek növekedési sebességét azonban az MTA nem növelte meg (a kontroll növekedési sebességének 4,3%-a maradt). (2. táblázat)
Ezek az adatok azt jelzik, hogy a MeSAdo foszforiláz-negatív sejtek növekedését szelektíven gátolhatjuk metioninhiányos, MeSAdo-t tartalmazó közegben.
HU 221 341 Β1
2. táblázat
Növekedési sebesség (a kontroll %-ában)b Metioninmentes
Sejtvonal Enzim3 MeSAdo-val MeSAdo nélkül
SK-MES-1 + 27±2,6 77±4,7
A-549 - 3,3±0,6 4,3±1,1
a +, MTA-áz-pozitív sejtek; MTA-áz-negatív sejtek b A kontroll növekedésének százalékos aránya=100* (a sejtnövekedés sebessége a metioninhiányos közegben MTA-val vagy anélkül)/(sejtnövekedés a metionint tartalmazó közegben)
5. példa
Emberi ráksejtek metioninéheztetése rekombináns
MET-ázzal
Emberi SK-MES-1 és A-549 sejteket MET-hiányos DMEM-táptalajban növesztettünk, valamint 10% dializált boíjúszérum és 0,06 egység/ml rekombináns 20 MET-áz jelenlétében (melyet a 2. és a 3. példákban leírt módon állítottunk elő) abból a célból, hogy a rekombináns MET-áz sejtszaporodást gátló hatását tanulmányozzuk. Három nap múlva meghatároztuk a sejtproliferációt. A MET-áz hatását mint az enzimet nem tártál- 25 mazó táptalajon való sejttömeg-növekedés %-át fejezzük ki.
Amint azt a 4. ábra mutatja, az enzimpozitív (SKMES-1) és az enzimnegatív (A-549) sejtek növekedése a MET-ázt tartalmazó közegben sorrendben 26,6%, il- 30 letve 2,96%. Azonban, ha 20 μΜ MTA-t adunk a táptalajhoz alternatív metioninforrásként a sejt számára, a sejtnövekedés a kontrollérték 61,4%-ára áll vissza az enzimpozitív sejtek esetén, míg az enzimnegatív sejtek növekedési sebessége 2,0%-ra csökken.
Az alábbiakban röviden ismertetjük a szekvencialistában felsorolt szekvenciákat.
1. azonosító számon a teljes hosszúságú MTA-áz aminosavszekvenciáját adjuk meg.
2. azonosító számon egy antigén hatású MTA-ázpeptid aminosavszekvenciáját adjuk meg.
3. azonosító számon egy olyan antigén hatású MTA-áz-peptid aminosavszekvenciáját adjuk meg, melynek aminosavszekvenciája különbözik a 2. azonosító számon megadott peptidétől.
4. azonosító számon a MET-ázt kódoló polinukleotid nukleotidszekvenciáját adjuk meg.
5. azonosító számon a MET-áz aminosavszekvenciáját adjuk meg, melyet a 4. azonosító számon megadott nukleotidszekvencia alapján következtettünk ki.
SZEKVENCIALISTA
AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 2763 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: genomiDNS KÖZVETLEN FORRÁS:
KLÓN: metil-adenozin foszfatáz SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: CDS
ELHELYEZKEDÉS: 1...2763
AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TTTATACAGA GCATGACAGT GGGGTCCTCA CTAGGGTCTG TCTGCCACTC TACATATTTG 60
AAACAGGAGT GGCTTCTCAG AATCCAGTGA ACCTAAATTT TAGTTTTAGT TGCTCACTGG 120
ACTGGGTTCT AGGAGACCCC CTGTGTTAGT CTGTGGTCAT TGCTAGSAGA ATCACTTAAT 180
TTTTTCTAGA CTCTAGGAGA AAACAGTTGG TGGTGTACTC ATCACGGGTT AACAATTTCT 240
TCTCTCCTTC CATAGGCATG GAAGGCAGCA CACCATCATG CCTTCAAAGG TCAACTACCA 300
HU 221 341 Bl
GGCGAACATC TGGGCTTTGA AGGAAGAGGG CTGTACACAT GTCATAGTGA CCACAGCTTG 360
TGGCTCCTTG AGGGAGGAGA TTCAGCCCGG CGATATTGTC ATTATTGATC AGTTCATTGA 420
CANNNNNNNN NNNNNNNNNN GAGGTCGACG GTATCGATAA GCTTTGTAAA CAATTGTCTT 480
TAGCTTATCC AGAGGAATTG AGTCTGGAGT AAAGACCCAA ATATTGACCT AGATAAAGTT 540
GACTCACCAG CCCTCGGAGG ATGGAAAGAT GGCCTTAAAA TAAAACAAAC AAAAACCTTT 600
TTTGCTTTAT TTTGTAGGAC CACTATGAGA CCTCAGTCCT TCTATGATGG AAGTCATTCT 660
TGTGCCAGAG GAGTGTGCCA TATTCCAATG GCTGAGCCGT TTTGCCCCAA AACGAGAGAG 720
GTGTGTAGTC TTTCTGGAAG GTGTACCAGA ATAAATCATG TGGGCTTGGG GTGGCATCTG 780
GCATTTGGTT AATTGGCAGA CGGAGTGGCC CCATACCCTC ACTCAAGTTT GCTTTGTATT 840
ATGCAAGTTT ATGGAGAGTT ATTTCCTGTT GCTAATAATT TNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 900
AAGTGCAGCC TTAAGTTGTG CATGTGCTAG TATGTTTTGA AGTTTCTGGT TTTTCTTTTC 960
TAGGTTCTTA TAGAGACTGC TAAGAAGCTA GGACTCCGGT GCCACTCAAA GGGGACAATG 1020
GTCACAATCG AGGGACCTCG TTTTAGCTCC CGGGCAGAAA GCTTCATGTT CCGCACCTGG 1080
GGGGCGGATG TTATCAACAT GACCACAGTT CCAGAGGTGG TTCTTGCTAA GGAGGCTGGA 1140
ATTTGTTACG CAAGTATCGC CATGGGCACA GATTATGACT GCTGGAAGGA GCACGAGGAA 1200
GCAGTAGGTG GAATTCTTTT CTAAGCACAT ATAGCATGGG TTTCTGGGTG CCAATAGGGT 1260
GTCTTAACTG TTTGTTTCTA TTACGTTAGT TTCAGAAAGT GCCTTTCTAC AAGGTTTTGA 1320
AGTTGTTAAT ATTTTCTGTA GTTCCATTGG AAGGTAAGAA CAAAGATCAA AAGAAAGAAA 1380
GAGACACTTT TACCCAAGGA TCAGTAGTGA AAATAGTACA TTGTAGGCAT GTAGATGTGT 1440
TGAGAATCAT ACTAAGACTT GGGCCTTANN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNTACCCTAC 1500
ATTGAGGATT CGGTTTCAGC AGATAAATTT GAGGGACACA AACATTTAGG CTGTAGCAAG 1560
GCTGGAGCTC AGAAAAATGT TTTATGACAA GCAGTGGAAT TTTAAGTTCT AGTAACCTCC 1620
AGTGCTATTG TTTCTCTAGG TTTCGGTGGA CCGGGTCTTA AAGACCCTGA AAGAAAACGC 1680
TAATAAAGCC AAAAGCTTAC TGCTCACTAC CATACCTCAG ATAGGGTCCA CAGAATGGTC 1740
AGAAACCCTC CATAACCTGA AGGTAAGTGC AGCCATGGAC AATCAGGCAT GTCTGTAGAC 1800
TCTCTATTGT CTTCTTTTCT TACTTGCATT TCACCTTTGG TCCTCATGTA TTTTTTGCCA 1860
GCCTACATCT TTTCAACAAG TTTTTGTGAC ATCTACTACT ACCATACCAA CCACTTGTGA 1920
HU 221 341 Β1
AACTGACTAfi TCTTATTTTC TTGGCTGGTA GTGCAGANNN NNNNNNNNNN NNAATAAACA 1980
ATAATCCAGC CTGGGCTGGT ATCGCAATAA GTGATTATCA GAACAATGCT CTGAGATAAG 2040
CATTATTAAC CTCACTTTAC AGGAAAGGGA GGTGAGGAAC CAAGAGTTTA GAGTACCCGA 2100
AGTTCCACAT CTGGTTAGTG AACTTGAAAA TTTTCTGTAG AATTTATTTA AAGTGTATGT 2160
TTCCTGCGTC CTCACTTTGA TCTAGAAAAT CAAAATCTGT TTTTTTTTTT AACAAACATC 2220
TCA6TAATTA CGCCAACATG TGAATATCAC TGCCTCCTTT CTTCCTTTCA GAATATGGCC 2280
CAGTTTTCTG TTTTATTACC AAGACATTAA AGTAGCATGG CTGCCCAGGA GAAAAGAAGA 2340
CATTCTAATT CCAGTCATTT TGGGAATTCC TGCTTAACTT GAAAAAAATA TGGGAAAGAC 2400
ATGCAGCTTT CATGCCCTTG CCTATCAAAG ÁGTATGTTGT AAGAAAGACA AGACATTGTG 2460
TGTATAGAGA CTCCTCAATG ATTTAGACAA CTTCAAAATA CAGAAGAAAA GCAAATGACT 2520
AGTAACATGT GGGAAAAAAT ATTACATTTT AAGGGGGAAA AAAAACCCCA CCATTCTCTT 2580
CTCCCCCTAT TAAATTTGCA ACAATAAAGG GTGGAGGGTA ATCTCTACTT TCCTATACTG 2640
CCAAAGAATG TGAGGAAGAA ATGGGACTCT TTGGTTATTT ATTGATGCGA CTGTAAATTG 2700
GTACAGTATT TCTGGAGGGC AATTTGGTAA AATGCATCAA AAGACTTAAA AATACGGACG 2760
TAC 2763
A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 17 aminosav
TÍPUSA: aminosav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: peptid
KÖZVETLEN FORRÁS:
KLÓN: metil-adenozin foszfatáz peptidek
SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: peptid
ELHELYEZKEDÉS: 1...17
A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Ile Gly Ile Ile Gly Gly Thr Gly Leu Asp Asp Pro Glu Ile Leu Glu 1 5 10 15
A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 13 aminosav
TÍPUSA: aminosav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: peptid
KÖZVETLEN FORRÁS:
KLÓN: metil-adenozin foszfatáz peptidek
SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: CDS
ELHELYEZKEDÉS: 1...13
HU 221 341 Bl
A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Leu Leu Leu Thr Thr Ile Pro Gin Ile Gly Ser Met Glu 1 5 10
A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 1615 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: genomi DNS
KÖZVETLEN FORRÁS:
KLÓN: metionin-gamma-liáz
SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: CDS
ELHELYEZKEDÉS: 304...1497
A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
ATAGGATGCC CTGGTAGCCA GTGATATAGC CGTTGTCTTC CAG CA GCTTG ACCCGGCGCC 60
AGCAGGGGCG AGGTGGTCAA TGCCACCTGG TCGGCAAGTT CGGCGACGGT TAGGCGGGCG 120
TTGTCCTGCA AGGCGGCGAG CAGGGCGCGG TCGGTGCGGT CGAGGCTTGA AGGCATGTTT 180
TGCCCTCCTG GTCCGTTAAT TATTGTTTTT GTTCCAGCAA GCACGCAGAT GCGTGGGCAA 240
TTTTGGAAAA AATCGGCCAG CTCGGTGGCA TAAGCTTATA ACAAACCACA AGAGGCTGTT 300
GCC ATG CGC GAC TCC CAT AAC AAC ACC GGT TTT TCC ACA CGG GCC ATT 348
Met Arg Asp Ser His Asn Asn Thr Gly Phe Ser Thr Arg Alá Ile
1 5 10 15
CAC CAC GGC TAC GAC CCG CTT TCC CAC GGT GGT GCC TTG GTG CCA CCG 396
His His Gly Tyr Asp Pro Leu Ser His Gly Gly Alá Leu Val Pro Pro
20 25 30
CTG TAC CAG ACC GCG ACC TAT GCC TTC CCG ACT GTC GAA TAC GGC GCT 444
Val Tyr Gin Thr Alá Thr Tyr Alá Phe Pro Thr Val Glu Tyr Gly Alá
35 40 45
GCG TGC TTC GCC GGG GAG GAG GCG GGG CAC TTC TAC AGC CGC ATC TCC 492
Alá Cys Phe Alá Gly Glu Glu Alá Gly His Phe Tyr Ser Arg Ile Ser
50 55 60
AAC CCC ACC CTG GCC TTG CTC GAG CAA CGC ATG GCC TCG TTG GAG GGT 540
Asn Pro Thr Leu Alá Leu Leu Glu Gin Arg Met Alá Ser Leu Glu Gly
65 70 75
GGT GAG GCG GGA TTG GCG CTG GCG TCG GGG ATG GGA GCC ATT ACT TCG 588
Gly Glu Alá Cly Leu Alá Leu Alá Ser Gly Met Gly Alá He Thr Ser
80 85 90 95
HU 221 341 Bl
ACC CTC Thr Leu TGG Trp ACC CTG CTG CGG CCT GGT GAT GAG CTG ATC GTG GGG CGC 636
Thr Leu Leu 100 Arg Pro Gly Asp Glu 105 Leu ile Val Gly Arg 110
ACC TTG TAT GGC TGC ACC TTT GCG TTC CTG CAC CAT GGC ATT GGC GAG 684
Thr Leu Tyr Gly Cys Thr Phe Ala Phe Leu His His Gly Ile Gly Glu
115 120 125
TTC GGG GTC AAG ATC CAC CAT GTC GAC CTT AAC GAT GCC AAG GCC CTG 732
Phe Gly Val Lys Ile His His Val Asp Leu Asn Asp Ala Lys Ala Leu
130 135 140
AAA GCG GCG ATC AAC AGC AAA ACG CGG ATG ATC TAC TTC GAA ACA CCG 780
lys Ala Ala He Asn Ser Lys Thr Arg Met Ile Tyr Phe Glu Thr Pro •
145 150 155
ccc AAC CCC AAC ATG CAA CTG GTG GAT ATA GCG GCG GTC GTC GAG GCA 828
Ala Asn Pro Asn Met Gin Leu Val Asp He Ala Ala Val Val Glu Ala
160 165 170 175
GTG CGG GGG AGT GAT GTG CTT GTG CTG GTC GAC AAC ACC TAC TGC ACG 876
Val Arg Gly Ser Asp Val Leu Val Val Val Asp Asn Thr Tyr Cys Thr
180 185 190
ccc TAC CTG CAG CGG CCA CTG GAA CTG GGG GCA GAC CTG GTG GTG CAT 924
Pro Tyr Leu Gin Arg Pro Leu Glu Leu Gly Ala Asp Leu Val Val His
195 200 205
TCG GCA ACC AAG TAC CTC AGT GGC CAT GGC GAC ATC ACT GCG GGC CTG 972
Ser Ala Thr Lys Tyr Leu Ser Gly His Gly Asp Ile Thr Ala Gly Leu
210 215 220
GTG GTG GGG CGC AAG GCT TTG GTC GAC CGC ATT CGG CTG GAA GGG CTG 1020
Val Vai uiy Arg lys Ala Leu Val Asp Arg He Arg Leu Glu ciy Leu
225 230 235
AAA GAC ATG ACC GGG GCA GCC TTG TCA CCG CAT GAC GCT GCG TTG TTG 1068
lys Asp Met Thr Gly Ala Ala Leu Ser Pro His Asp Ala Ala Leu Leu
240 245 250 255
ATG CGC GGC ATC AAG ACC CTG GCG CTG CGC ATG GAC CGG CAT TGC GCC 1116
Met Arg Gly He lys Thr leu Ala leu Arg Met Asp Arg HiS Cys Ala
260 265 270
AAC GCC CTG GAG GTC GCG CAG TTC CTG GCC GGG CAG CCC CAG GTG GAG 1164
Asn Ala Leu Glu Val Ala Gin Phe Leu Ala Gly Gin Pro Gin Val Glu
275 280 285
CTG ATC CAC TAC CCG GGC TTG CCU iCG TTT GCC CAG TAC GAA CTG GCA 1212
Leu Ile His Tyr Pro Gly Leu Pro Ser Phe Ala Gin Tyr Glu Leu Ala
290 295 300
HU 221 341 Bl
CAG CGG CAG ATG CGT TTG CCG GGC GGG ATG ATT GCC TTT GAG CTC AAG 1260
Gin Arg Gin Met Arg Leu Pro Gly Gly Met lle Alá 315 Phe Glu Leu Lys
305 310
GGC GGT ATC GAG GCC GGG CGC GGC TTC ATG AAT GCC CTG CAG CTT TTT 1308
Gly Gly lle Glu Alá Gly Arg Gly Phe Met Asn Alá Leu Gin Leu Phe
320 325 330 335
GCC CGT GCG GTG AGC CTG GGG GAT GCC GAG TCG CTG GCA CAG CAC CCG 1356
Alá Arg Alá Val Ser Leu Gly Asp Alá Glu Ser Leu Alá Gin His Pro
340 345 350
GCG AGC ATG ACG CAC TCC AGT TAC ACG CCA CAA GAG CGG GCG CAT CAC 1404
Alá Ser Met Thr His Ser Ser Tyr Thr Pro Gin Glu Arg Alá His His
355 360 365
GGG ATA TCA GAG GGG CTG GTG AGG T7G TCA GTG GGG CTG GAG GAT GTG 1452
Gly lle Ser Glu Gly Leu Val Arg Leu Ser Val ciy Leu Glu Asp Val
370 375 380
GAG GAC CTG CTG GCA GAT ATC GAG TTG GCG TTG GAG GCG TGT GCA 1497
Glu Asp Leu Leu Alá Asp lle Glu Leu Alá Leu Glu Alá Cys Alá
385 390 395
TGAACTTGCC TTGCAGGATC GGGAACACTT GCCCAATGCC TCACGGGATC AGGCGATGGC 1557
ACTTTGGATG AGCTGGTGAA TTGGCCGGCT TATCCAAGAG GAGTTTAAAA TGACCGTA 1615
AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 398 bázispár TÍPUSA: aminosav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: protein
AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA
Met Arg Asp Ser His Asn Asn Thr Gly Phe Ser Thr Arg Alá lle His
1 5 10 15
His ciy Tyr Asp Pro Leu Ser His Gly Gly Alá Leu Val Pro Pro Val
20 25 30
Tyr Gin Thr Alá Thr Tyr Alá Phe Pro Thr Val Glu Tyr Gly Alá Alá
35 40 45
Cys Phe Alá Gly Glu Glu Alá Gly His Phe Tyr Ser Arg lle Ser Asn
50 55 60
Pro Thr Leu Alá Leu Leu Glu Gin Arg Met Alá Ser Leu Glu Gly Gly
65 70 75 80
Glu Alá Gly Leu Alá Leu Alá Ser Gly Met Gly Alá lle Thr Ser Thr
85 90 95
HU 221 341 Β1
Leu Trp Thr Leu Leu Arg Pro Gly Asp Glu Leu Ile Val Gly Arg Thr 100 105 110
Leu Tyr Gly Cys Thr Phe Alá Phe Leu His His Gly Ile Gly Glu Phe 115 120 125
Gly Val Lys Ile His His Val Asp Leu Asn Asp Alá Lys Alá Leu Lys 130 135 140
Alá Alá Ile Asn Ser Lys Thr Arg Met Ile Tyr Phe Glu Thr Pro Alá 145 150 155 160
Asn Pro Asn Met Gin 165 Leu Val Asp I le Alá Alá Val Val Glu Alá Val
.<0 175
Arg Gly Ser Asp Val Leu Val Val Val Asp Asn Thr Tyr Cys Thr Pro
180 185 190
Tyr Leu Gin Arg Pro Leu Glu Leu Gly Alá Asp Leu Val Val His Ser
195 200 205
Alá Thr Lys Tyr Leu Ser Gly His Gly Asp Ile Thr Alá Gly Leu Val
210 215 220
Val Gly Arg Lys Alá Leu Val Asp Arg Ile Arg Leu Glu Gly Leu Lys
225 230 235 240
Asp Met Thr Gly Alá Alá Leu Ser Pro His Asp Alá Alá Leu Leu Met
245 250 255
Arg Gly He Lys Thr Leu Alá Leu Arg Met Asp Arg His Cys Alá Asn
260 265 270
Alá Leu Glu Val Alá Gin Phe Leu Alá Gly Gin Pro Gin Val Glu Leu
275 280 285
Ile His Tyr Pro Gly Leu Pro Ser Phe Alá Gin Tyr Glu Leu Alá Gin
290 295 300
Arg Gin Met Arg Leu Pro Gly Gly Met Ile Alá Phe Glu Leu Lys Gly
305 310 315 320
Gly Ile Glu Alá Gly Arg Gly Phe Met Asn Alá Leu Gin Leu Phe Alá
325 330 335
Arg Alá Val Ser Leu Gly Asp Alá Glu Ser Leu Alá Gin His Pro Alá
340 345 350
Ser Met Thr His Ser Ser Tyr Thr Pro Gin Glu Arg Alá His His Gly
355 360 365
Ile Ser Glu Gly Leu Val Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Val Glu
370 375 380
Asp Leu Leu Alá Asp Ile Glu Leu Alá Leu Glu Alá Cys Alá
385 390 395
HU 221 341 BI

Claims (8)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. MET-áz terápiásán hatásos mennyisége és MTA terápiásán hatásos mennyisége keverékének alkalmazása gyógyászatilag elfogadható hordozóban, abszolút 5 metioninfüggő, de metil-tio-adenozin-foszforilázhiányos malignus emlőssejtek kemoterápiás kezelésére alkalmas gyógyászati készítmény előállítására.
  2. 2. Katalitikusán aktív MET-áz polipeptid, melynek aminosavszekvenciája megegyezik az 5. azonosító szá- 10 mon megadott aminosavszekvenciával.
  3. 3. A 2. igénypont szerinti MET-áz polipeptid, amely rekombináns polipeptid.
  4. 4. Polipeptid, melynek aminosavszekvenciája megegyezik az 5. azonosító számon megadott aminosavszekvenciával.
  5. 5. A 3. igénypont szerinti MET-áz polipeptid, melyet a 4. azonosító számon bemutatott szekvenciájú polinukleotid kódol.
  6. 6. Az 5. igénypont szerinti MET-áz polipeptid, amely prokariótában lett expresszáltatva.
  7. 7. Polinukleotid, amely a 2. igénypont szerinti katalitikusán aktív MET-áz polipeptidet kódol, melynek nukleotidszekvenciája megegyezik a 4. azonosító számon megadott nukleotidszekvenciával.
  8. 8. Polinukleotid, melynek nukleotidszekvenciája megegyezik a 4. azonosító számon megadott nukleo15 tidszekvenciával.
HU9601695A 1993-12-29 1994-12-22 Use of met-ase and mta for selective methionine starvation of malignant cells in mammals HU221341B1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/176,413 US5571510A (en) 1993-12-29 1993-12-29 Method for selective methionine starvation of malignant cells in mammals
PCT/US1994/014919 WO1995017908A1 (en) 1993-12-29 1994-12-22 Method for selective methionine starvation of malignant cells in mammals

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9601695D0 HU9601695D0 (en) 1996-08-28
HUT75070A HUT75070A (en) 1997-04-28
HU221341B1 true HU221341B1 (en) 2002-09-28

Family

ID=22644262

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9601695A HU221341B1 (en) 1993-12-29 1994-12-22 Use of met-ase and mta for selective methionine starvation of malignant cells in mammals

Country Status (17)

Country Link
US (1) US5571510A (hu)
EP (1) EP0805690B1 (hu)
JP (1) JPH09507754A (hu)
CN (1) CN1143325A (hu)
AT (1) ATE221785T1 (hu)
AU (1) AU694161B2 (hu)
CA (1) CA2180262A1 (hu)
CZ (1) CZ291281B6 (hu)
DE (1) DE69431167T2 (hu)
HU (1) HU221341B1 (hu)
NO (1) NO962714L (hu)
NZ (1) NZ278271A (hu)
PL (1) PL182298B1 (hu)
RO (1) RO117542B1 (hu)
RU (1) RU2153885C2 (hu)
TJ (1) TJ294B (hu)
WO (1) WO1995017908A1 (hu)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5891704A (en) * 1992-11-19 1999-04-06 Anticancer, Inc. Method to produce high levels of methioninase
US6461851B1 (en) 1992-11-19 2002-10-08 Anticancer, Inc. High expression modules containing two or more tandem copies of a methioninase encoding sequence
US6911309B2 (en) * 1993-12-29 2005-06-28 The Regents Of The University Of Californnia Nucleic acids encoding MTAse
US6870037B1 (en) * 1995-07-03 2005-03-22 Arch Development Corporation Methylthioadenosine phosphorylase compositions and methods of use in the diagnosis and treatment of proliferative disorders
US5861154A (en) * 1995-10-30 1999-01-19 Shionogi & Co., Ltd. Recombinant L-methionine γ-lyase
AU2001280155A1 (en) * 2000-09-05 2002-03-22 Shionogi And Co., Ltd. L-methionine gamma-lyase with modified function
US20030129262A1 (en) * 2001-08-30 2003-07-10 Epner Daniel E. Methionine restriction for cancer therapy
US20040127435A1 (en) * 2002-08-02 2004-07-01 Regents Of The University Of California Uses for inhibitors of inosine monophosphate dehydrogenase
CA2516191A1 (en) * 2003-02-14 2004-09-02 Salmedix, Inc Compositions and methods for the detection and treatment of methylthioadenosine phosphorylase deficient cancers
US20110002978A1 (en) 2003-06-17 2011-01-06 Harrison Roger G Enzyme prodrug cancer therapy selectively targeted to tumor cells or tumor vasculature and methods of production and use thereof
WO2009032057A2 (en) 2007-08-29 2009-03-12 Adam Lubin Method for the selective therapy of disease
WO2009140007A2 (en) * 2008-04-14 2009-11-19 Ats Medical, Inc. Tool for implantation of replacement heart valve
US9987241B2 (en) 2014-09-25 2018-06-05 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Enzyme conjugate and prodrug cancer therapy
WO2020032951A1 (en) 2018-08-09 2020-02-13 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Antimalarial enzyme conjugates, kits containing same, and methods of producing and using same

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US5122614A (en) * 1989-04-19 1992-06-16 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides

Also Published As

Publication number Publication date
RO117542B1 (ro) 2002-04-30
CA2180262A1 (en) 1995-07-06
EP0805690A4 (en) 1999-05-12
ATE221785T1 (de) 2002-08-15
HU9601695D0 (en) 1996-08-28
CN1143325A (zh) 1997-02-19
DE69431167D1 (de) 2002-09-12
PL182298B1 (pl) 2001-12-31
AU1445995A (en) 1995-07-17
DE69431167T2 (de) 2003-04-17
TJ294B (en) 2001-03-30
NO962714L (no) 1996-08-26
AU694161B2 (en) 1998-07-16
NO962714D0 (no) 1996-06-27
US5571510A (en) 1996-11-05
JPH09507754A (ja) 1997-08-12
EP0805690A1 (en) 1997-11-12
HUT75070A (en) 1997-04-28
WO1995017908A1 (en) 1995-07-06
CZ291281B6 (cs) 2003-01-15
EP0805690B1 (en) 2002-08-07
NZ278271A (en) 2001-07-27
CZ186996A3 (en) 1996-12-11
RU2153885C2 (ru) 2000-08-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11285128B2 (en) Homogenous antibody drug conjugates via enzymatic methods
HU221341B1 (en) Use of met-ase and mta for selective methionine starvation of malignant cells in mammals
JP2002062295A (ja) ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子レセプター
JPH05500944A (ja) トランスフエリンレセプタに特異的な抗体―神経薬剤の接合体
EP0382796A1 (en) Method for the preparation of antibody-fragment conjugates
US7695923B2 (en) CFTR polypeptides methods to overcome biosynthetic misprocessing
JP2016528920A (ja) 抗新生剤としての改変霊長類シスチン／システイン分解酵素
EP0607408A1 (en) Transvascular and intracellular delivery of lipidized proteins
van Es Pathogenesis of IgA nephropathy
JP2000505300A (ja) 組換えリボヌクレアーゼタンパク質
JPS61122224A (ja) 部位選択性プラスミノ−ゲン活性化因子及びその製造方法
JP2010535166A (ja) 治療組織における滞留時間の長い酸化型アビジン
JPH11514223A (ja) 複数のジスルフィド結合を有する組換えタンパク質およびそのチオール置換複合体
JPH10502814A (ja) 哺乳動物の肝臓から得られるタンパク質、および腫瘍学におけるそれらの用途
JP2002322093A (ja) 化合物
JP2006522021A (ja) 殺細胞分子およびその使用方法
Chen et al. Characterization of 5-oxo-L-prolinase in normal and tumor tissues of humans and rats: a potential new target for biochemical modulation of glutathione.
PT1360208E (pt) Anticorpos anti cancerígenos individualizados
US20060153825A1 (en) Use of protein histidine phosphatase
CZ186896A3 (en) Detection method of methylthioadenosine phosphorylase deficiency in mammal cells
AU2002253092A1 (en) Use of protein histidine phosphatase
US6180379B1 (en) Cyclin-selective ubiquitin carrier polypeptides
US7205272B1 (en) CFTR polypeptides, fragments thereof and methods of use to overcome biosynthetic misprocessing
JP2003047479A (ja) ビタミンｄ３水酸化酵素
JPH11139984A (ja) 抗腫瘍剤、抗肥満剤、及び悪疫質の検出方法

Legal Events

Date Code Title Description
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee