JP2006522021A

JP2006522021A - 殺細胞分子およびその使用方法

Info

Publication number: JP2006522021A
Application number: JP2006503266A
Authority: JP
Inventors: スーザンシー．ライト; ジェイムスダブリュー．ラーリック; ステッフェンアール．ノック; デイビッドエス．ウィルソン
Original assignee: パロアルトインスティチュートオブモレキュラーメディシン
Priority date: 2003-02-03
Filing date: 2004-02-02
Publication date: 2006-09-28
Also published as: EP1590440A2; WO2004070012A3; AU2004209644A1; CA2514841A1; WO2004070012A2; EP1590440A4; US20040191843A1

Abstract

本発明は、殺細胞活性を有するアミノ酸配列、それらをコードする核酸配列、それらと特異的に結合する抗体を含む組成物、ならびに細胞死を増加および/または減少させるため、細胞死を検出するため、細胞死の変化に関連する疾患を診断するためのこれら組成物の使用方法、ならびに細胞死を変化させる試験物質を同定する方法に関する。

Description

本出願は、2003年2月3日に出願された米国仮特許出願第60/444,191号および2003年8月8日に出願された米国仮特許出願第60/460,855号の優先権を主張し、それぞれの内容は全体として本明細書に組み入れられる。
本発明は、一部、米国国立衛生研究所により与えられた助成金番号CA68223号を基に米国政府の支援により行われた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。

発明の分野
本発明は、アポトーシスおよび壊死を含む細胞死の分野に関する。詳細には、本発明は、殺細胞活性を有するアミノ酸配列、それらをコードする核酸配列、それらと特異的に結合する抗体を含む組成物、ならびに細胞死を増加および/または減少させるため、細胞死を検出するため、細胞死の変化に関連する疾患を診断するためのこれら組成物の使用方法、ならびに細胞死を変化させる試験物質を同定する方法に関する。本発明はまた、腫瘍生物学、医学的診断学、およびプロテオミクスに関する。

発明の背景
癌、腫瘍転移、血管新生、再狭窄、アテローム性動脈硬化症、線維症、血管腫、リンパ腫、白血病、乾癬、関節炎、自己免疫疾患、糖尿病、筋萎縮性側索硬化症、移植片拒絶、網膜症、黄斑変性症、および網膜裂傷等のいくつかの疾患は、望ましくない細胞増殖と関連がある。

望ましくない細胞増殖に関連する疾患の現在の治療は、主に、疾患に選択的ではなく、身体の他の器官に悪影響を及ぼす治療に依存している。例えば、化学療法薬および放射線は、正常細胞を含め、身体の増殖細胞をすべて死滅させるかまたは損なうため、重篤な副作用を有する。副作用は厄介であり、それ自体で患者の死亡率を増加させる健康問題を引き起こす場合が多い。

癌等のこれらの疾患を治療するための別のアプローチでは、免疫毒素の使用を採用する。しかし、癌細胞に対して選択的に細胞毒性があり、かつ患者の非癌性細胞に無害である免疫毒素の開発は、免疫毒素を含む外来タンパク質に対する患者の免疫応答の発生によって難航している。マウスモノクローナル抗体に対する免疫応答および抗毒素抗体が、免疫毒素で処置した動物およびヒトにおいて検出された。ヒト化技法における進歩によって免疫毒素の抗体部分に付随する免疫原性はいくらか緩和されたものの、毒素の標的部分のヒト化は毒素部分の免疫原性を阻止できない。

毒素の免疫原性を克服するため、分泌ヒトリボヌクレアーゼが免疫毒素の毒素部分として使用された。しかしながら、細胞死を誘導するために分泌ヌクレアーゼを使用することは、いくつかの主要な欠点を有する。第一に、これらのヌクレアーゼはそのような環境を許容するように進化しておらず、むしろ細胞外空間の酸化環境において進化したため、これらのジスルフィド結合を含む場合が多いヌクレアーゼは、極めて還元性の高い細胞内環境において不活性化される。ヌクレアーゼの別の欠点は、遊離のヌクレアーゼまたはヌクレアーゼ抗体複合体の細胞内発現によって細胞が死滅する可能性があり、分泌発現が低レベルである可能性があるため、形質転換細胞内でヌクレアーゼを高レベルで組換え産生することができない点である。

したがって、望ましくない細胞増殖に関連する疾患の症状を診断および軽減するための組成物および方法の必要性が依然として存在する。組成物は、関心対象の標的細胞に対する特異性を付与するように改変され得ることが好ましい。また、これら組成物の細胞毒性が免疫系によって不活化されず、組成物は容易に生産でき、関心対象の標的細胞に対する特異性を増すように改変され得ることが好ましい。

発明の概要
本発明は、配列番号：4の一部を含む単離されたアミノ酸配列を含む組成物を提供し、この一部は配列番号：6を含み、かつDNAヌクレアーゼ活性および殺細胞活性から選択される活性を有し、より好ましくは、この一部は、配列番号：7を含む。

また、本明細書において、ミトコンドリアタンパク質を含む複合体を含む組成物も提供し、このミトコンドリアタンパク質は、DNAヌクレアーゼ活性および殺細胞活性から選択される活性を有し、かつ細胞分子に特異的に結合する第一分子に機能的に連結される。1つの態様において、ミトコンドリアタンパク質は、配列番号：6および配列番号：7から選択される。別の態様において、ミトコンドリアタンパク質は、配列番号：8、配列番号：10、配列番号：12、配列番号：24、配列番号：72、配列番号：74、配列番号：76、および配列番号：78から選択されるアミノ酸配列を含む。

また、配列番号：14、配列番号：18、配列番号：20、配列番号：22、配列番号：26、配列番号：40、および配列番号：42から選択されるタンパク質を含む複合体を含む組成物もまた提供し、このタンパク質は、DNAヌクレアーゼ活性および殺細胞活性から選択される活性を有し、かつ細胞分子に特異的に結合する第一分子に機能的に連結されている。

任意に、本発明の複合体は、N末端シグナルペプチド、細胞内部移行ペプチド、および核局在化ペプチドの1つまたは複数をさらに含む。第一分子の性質または供給源を制限する意図はないが、1つの態様において、その分子は抗体を含み、好ましくは、非小細胞肺癌細胞、乳癌細胞、消化管癌細胞、腎臓癌細胞、肝臓癌細胞、B細胞リンパ腫細胞、骨髄性白血病細胞、腎臓癌細胞、結腸癌細胞、膵臓癌細胞、結腸直腸癌細胞、卵巣癌細胞、および前立腺癌細胞等であるがこれらに限定されない癌細胞に特異的に結合する抗体を含む。1つの態様において、癌細胞は、肝細胞癌細胞等の肝臓癌細胞を含む。別の態様において、肝臓癌細胞に結合する抗体は、Hepama-1、抗PLC1、抗PLC2、K-PLC1、K-PLC2、K-PLC3、49-D6、7-E10、34-A4、26-A10、34-B9、79-C8、16-E10、5D3、5C3、2C6、a-AFP、HP-1、hHP-1、mAb 95、YPC2/38.8、P215457、PM4E9917、HAb25、Hab27、KY-1、KY-2、KY-3、9403 Mab、KM-2、S1、9B2、IB1、A9-84、SF-25、AF-10、XF-8、AF-20、a-hIRS-1、FB-50、SF 31、SF 90、2A3D2、および2D11E2から選択される抗体を含む。特に好ましい態様において、肝臓癌細胞に結合する抗体はHepama-1抗体を含み、より好ましくはヒト化Hepama-1である。さらなる態様において、第一分子は、好ましくは増殖因子を含むリガンドによって例示される、細胞受容体のリガンドを含む。1つの態様において、増殖因子は、上皮増殖因子、インスリン様増殖因子、線維芽細胞増殖因子、および血管内皮増殖因子から選択される。

さらに、配列番号：4の一部を含む単離されたアミノ酸配列を含む組成物を本明細書において提供し、この一部は、配列番号：6を含み、かつDNAヌクレアーゼ活性および殺細胞活性から選択される活性を有する。1つの態様において、この一部は配列番号：7を含み、任意にN末端シグナルペプチド、細胞内部移行ペプチド、核局在化ペプチド、およびビオチンに特異的に結合する抗体の1つまたは複数をさらに含む。

本発明はまた、配列番号：4の一部を含むアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む発現ベクターを含む組成物を提供し、この一部は配列番号：6を含み、かつこのアミノ酸配列は、DNAヌクレアーゼ活性および殺細胞活性から選択される活性を有する。この一部は、配列番号：7を含むことが好ましい。

さらに、本発明は、配列番号：4の一部を含むアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む発現ベクターを含む細胞を含む組成物を提供し、この一部は配列番号：6を含み、かつこのアミノ酸配列は、DNAヌクレアーゼ活性および殺細胞活性から選択される活性を有する。この一部は、配列番号：7を含むことが好ましい。

本発明はまた、配列番号：7に特異的に結合する抗体を含む組成物を提供する。1つの態様において、配列番号：6および配列番号：7の1つまたは複数に対する抗体の結合親和性は、配列番号：4に対する抗体の結合親和性よりも高い。抗体の結合によって、DNAヌクレアーゼ活性および殺細胞活性から選択される配列番号：7の活性が減少することが好ましい。

本発明によって、以下の段階を含む、細胞死を増加させる方法もまた提供する：a) i)細胞；およびii) 配列番号：6、配列番号：7、配列番号：8、配列番号：10、配列番号：12、配列番号：24、配列番号：72、配列番号：74、配列番号：76、配列番号：78、配列番号：14、配列番号：18、配列番号：20、配列番号：22、配列番号：26、配列番号：40、および配列番号：42から選択されるアミノ酸配列を含む組成物を提供する段階；ならびにb) 細胞を組成物と接触させて接触細胞を生じ、接触により接触細胞の細胞死が増加する段階。1つの態様において、アミノ酸配列は、配列番号：7を含む。1つの態様において、アミノ酸配列は、細胞に特異的に結合する抗体に機能的に連結される。本方法は、接触細胞において細胞死の増加を検出する段階をさらに含むことが好ましい。1つの態様において、本方法は、段階b)の前に、アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を提供する段階、および細胞においてヌクレオチド配列を発現させる段階をさらに含む。本発明の方法において使用する細胞は、ヒト等の哺乳動物のインビトロ状態またはインビボ状態であってよい。ヒトは、癌を有するヒトおよび癌を発症し得る疑いがあるヒトから選択されることが好ましい。アミノ酸配列は、癌における癌細胞に特異的に結合する抗体に機能的に連結されることが好ましい。または、癌は、肝臓癌、胃癌(gastric cancer)、頭部癌、頚部癌、肺癌、乳癌、前立腺癌、子宮頸癌、膵臓癌、結腸癌、卵巣癌、胃癌(stomach cancer)、食道癌、口腔癌、舌癌、歯肉癌、皮膚癌、筋肉癌、心臓癌、気管支癌、軟骨癌、骨癌、精巣癌、腎臓癌、子宮内膜癌、子宮癌、膀胱癌、骨髄癌、リンパ腫癌、脾臓癌、胸腺癌、甲状腺癌、脳腫瘍、神経癌、胆嚢癌、眼癌、関節癌、グリア芽細胞腫、中皮腫、リンパ腫、白血病、黒色腫、扁平上皮癌、骨肉腫、およびカポジ肉腫から選択される。癌は肝臓癌であり、肝臓癌細胞に特異的に結合する抗体は、Hepama-1抗体を含むことが好ましい。

本発明はまた、細胞の細胞質において配列番号：6および配列番号：7から選択される配列を検出する段階を含み、好ましくは検出された配列のレベルを定量化する段階をさらに含む、細胞アポトーシスを検出する方法を提供する。

本発明によって、哺乳動物の血中の配列番号：6および配列番号：7を検出する段階を含む、哺乳動物細胞において、好ましくは細胞死（細胞死の増加および減少等）に関連する疾患を検出する方法もまた提供される。

定義
本発明の理解を容易にするため、多くの用語を以下に定義する。特記しない限り、本明細書で使用する専門用語および科学用語はすべて、Sambrook et al. (2001)「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」Cold Spring Harbor Press, 第3版；およびAusubel, F.M., et al. (1993)、「Current Protocols in Molecular Biology」における意味と同じ意味を有する。

「ペプチド」、「ペプチド配列」、「アミノ酸配列」、「ポリペプチド」、「ポリペプチド配列」、および「タンパク質」という用語は本明細書において互換的に用いられ、ペプチド結合または他の結合により連結された2つまたはそれ以上のアミノ酸またはアミノ酸類似体サブユニット、典型的には生物タンパク質中に見出される20個の共通L-アミノ酸のいくつかまたはすべてからなる生体高分子を指す。ペプチドという用語には、一般に約2個〜約20個のアミノ酸を含む、通常ペプチドと称される分子が含まれる。ペプチドという用語には、一般に約20個〜約50個のアミノ酸を含む、通常ポリペプチドと称される分子もまた含まれる。ペプチドという用語には、一般に約50個〜約3000個のアミノ酸を含む、通常タンパク質と称される分子もまた含まれる。ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、合成であっても、組換えであっても、または天然であってもよい。合成ペプチドは、インビトロで人工的手段によって産生される（例えば、インビボで産生されなかった）ペプチドである。

「プロテアーゼ」、「タンパク質分解酵素」、および「プロテイナーゼ」という用語は、アミノ酸残基間のペプチド結合の加水分解を触媒する酵素を指す。

本明細書で用いる「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖の産生に関与するDNAの部分を意味し、コード領域に先立つおよびコード領域の後に続く領域、例えば、5'非翻訳（5'UTR）または「リーダー」配列および3'UTRまたは「トレイラー」配列、ならびに個々のコード部分（エキソン）の間の介在配列（イントロン）を含んでも含まなくてもよい。

本明細書で用いる「発現」という用語は、遺伝子の核酸配列に基づいてポリペプチドが産生される過程を指す。その過程には、転写および翻訳の両方が含まれる。

「ポリメラーゼ連鎖反応法」（「PCR法」）という用語は、1つまたは複数のプライマー、および逆転写酵素またはDNAポリメラーゼ、特に熱安定性ポリメラーゼ酵素等の重合の触媒を用いた、標的ポリヌクレオチドのコピーが作製される反応を指す。PCRの方法は、米国特許第4,683,195号（Mullis）および米国特許第4,683,202号（Mullis et al.）において開示される。PCRまたは遺伝子クローニングのような、同じポリヌクレオチドの複製コピーを産生する過程はすべて、本明細書ではまとめて「複製」と称する。

「細胞内タンパク質」という用語は、細胞の細胞質および/または核内に存在するタンパク質を意味する。一般に、細胞内タンパク質は通常の生理条件下で分泌されず、特定の条件下において（細胞溶解、細胞死等）分泌小胞および/または細胞外空間に見出され得る。

本明細書において使用する「提供する段階」、「接触させる段階」、「混合する段階」、「広げる段階」、「位置する段階」、「観察する段階」、「伝達する段階」のような「段階（こと）」で終わる任意の動詞は、機能および/または結果よりもむしろ行為を表すことを意図する。

本明細書で用いる単数形「1つの（a）」、「1つの（an）」、および「その（the）」には、特記する場合を除き、その対象物の単数形および複数形の両方が含まれる。

AおよびBが組成物、疾患、産物等を指し、「AまたはB」という表現で用いられる場合、本明細書で用いる「または」という用語は、その一方もしくは他方または両方を意味する。

「A、B、およびCから選択される」および「A、B、およびCの1つまたは複数から選択される」という用語は、A、B、およびCのうちのいずれか1つ、またはA、B、およびCの任意の組み合わせを選択することを意味する同等の用語である。

本明細書で用いる「含む」という用語は、方法の段階の列挙の前に置かれた場合、その方法が明確に列挙した段階に加えてさらなる1つまたは複数の段階を包含すること、およびさらなる1つまたは複数の段階が列挙した段階の前、間、および/または後に行われ得ることを意味する。例えば、段階a、b、およびcを含む方法は、段階a、b、x、およびcの方法、段階a、b、c、およびxの方法、ならびに段階x、a、b、およびcの方法を包含する。さらに、「含む」という用語は、方法における段階の列挙の前に置かれた場合、特記しない限り、記載した段階の順次的な実行を（必要としてもよいが）必要としない。例えば、段階a、b、およびcを含む方法は、例えば段階a、c、およびbの順、段階c、b、およびaの順、ならびに段階c、a、およびbの順等で段階を行う方法を包含する。

特記しない限り、本明細書で用いる分子量、反応条件等の成分、特性の数量を示す数字はすべて、いずれの場合にも「約」という用語によって修飾されると理解されるべきである。したがって、特記しない限り、本明細書の数値パラメータは、本発明によって得ようとされる所望の特性に基づいて変動し得る近似である。最低限でも、特許請求の範囲の均等論の適用を制限することなく、各数値パラメータは、少なくとも報告される有効数字の数に照らして、通常の丸め技法を適用することにより解釈されるべきである。本発明の広範な範囲について説明する数値域およびパラメータは近似であっても、特定の実施例における数値はできる限り正確に報告される。しかし、いずれの数値も、数値の試験測定において見出される誤差に必然的に起因する標準偏差を本質的に含む。

「ではない（not）」という用語は、任意の具体的に指定される分子（例えば、MDH、MADF、ADF、Htra/Omi、アポトーシス誘導因子、Smac/DIABLO、EndoG、チトクロームC、Nix、Nip3、CIDE-B、ゲルソリン、Bcl-2、Bax、Bad、Bid、カスパーゼ活性化DNase、DNase I、DNase II、CADヌクレアーゼ阻害剤、上皮増殖因子、血管内皮増殖因子、水晶体タンパク質、アンテナペディアタンパク質、フィブロネクチン1型、ヒトHOXタンパク質、インスリン様増殖因子、線維芽細胞増殖因子、およびHIV Tatタンパク質等のアミノ酸配列、本明細書に記載のポリペプチドのいずれかをコードする核酸配列等の核酸配列）、および/または現象（例えば、細胞死、細胞アポトーシス、細胞生存度、細胞生存、分子に対する結合、核酸配列の発現、核酸配列の転写、酵素活性等）に先行し、これらに関して用いる場合、具体的に指定される分子または現象のみが除外されることを意味する。

任意の分子（例えば、MDH、MADF、ADF、Htra/Omi、アポトーシス誘導因子、Smac/DIABLO、EndoG、チトクロームC、Nix、Nip3、CIDE-B、ゲルソリン、Bcl-2、Bax、Bad、Bid、カスパーゼ活性化DNase、DNase I、DNase II、CADヌクレアーゼ阻害剤、上皮増殖因子、血管内皮増殖因子、水晶体タンパク質、アンテナペディアタンパク質、フィブロネクチン1型、ヒトHOXタンパク質、インスリン様増殖因子、線維芽細胞増殖因子、およびHIV Tatタンパク質等のアミノ酸配列、および本明細書に記載のポリペプチドのいずれかをコードする核酸配列等の核酸配列）、および/または現象（例えば、細胞死、細胞アポトーシス、細胞生存度、細胞生存、分子に対する結合、核酸配列の発現、核酸配列の転写、酵素活性等）のレベルに関して、本明細書で用いる「変更」という用語および文法上の相当語句は、量が客観的に決定されるかおよび/または主観的に決定されるかにかかわらず、分子および/または現象の量の増加および/または減少を指す。

分子および/または現象のレベルに関して特記しない限り、「増加させる」、「高める」、「上昇させる」という用語、および文法上の相当語句（「より高い」、「より大きい」等を含む）は、第二試料に対する第一試料中の任意の分子（例えば、MDH、MADF、ADF、Htra/Omi、アポトーシス誘導因子、Smac/DIABLO、EndoG、チトクロームC、Nix、Nip3、CIDE-B、ゲルソリン、Bcl-2、Bax、Bad、Bid、カスパーゼ活性化DNase、DNase I、DNase II、CADヌクレアーゼ阻害剤、上皮増殖因子、血管内皮増殖因子、水晶体タンパク質、アンテナペディアタンパク質、フィブロネクチン1型、ヒトHOXタンパク質、インスリン様増殖因子、線維芽細胞増殖因子、およびHIV Tatタンパク質等のアミノ酸配列、および本明細書に記載のポリペプチドのいずれかをコードする核酸配列等の核酸配列）、および/または現象（例えば、細胞死、細胞アポトーシス、細胞生存度、細胞生存、分子に対する結合、結合親和性、核酸配列の発現、核酸配列の転写、酵素活性等）のレベルに関する場合、当技術分野によって許容される任意の統計的解析法により、統計学的に有意な任意の量だけ、第一試料中の分子および/または現象の量が第二試料中の量よりも高いことを意味する。1つの態様において、増加は、例えば患者が、疼痛、呼吸困難、明視、嘔気、疲労等の病徴の主観的知覚に言及する場合等に、主観的に決定され得る。別の態様においては、第一試料中の分子および/または現象の量は、第二試料中の同じ分子および/または現象の量よりも少なくとも10％高い、少なくとも25％高い、少なくとも50％高い、少なくとも75％高い、および/または少なくとも90％高い。

分子および/または現象のレベルに関して特記しない限り、「減じる」、「阻害する」、「縮小させる」、「抑制する」、「減少させる」という用語、および文法上の相当語句（「より低い」、「より小さい」等を含む）は、第二試料に対する第一試料中の任意の分子（例えば、MDH、MADF、ADF、Htra/Omi、アポトーシス誘導因子、Smac/DIABLO、EndoG、チトクロームC、Nix、Nip3、CIDE-B、ゲルソリン、Bcl-2、Bax、Bad、Bid、カスパーゼ活性化DNase、DNase I、DNase II、CADヌクレアーゼ阻害剤、上皮増殖因子、血管内皮増殖因子、水晶体タンパク質、アンテナペディアタンパク質、フィブロネクチン1型、ヒトHOXタンパク質、インスリン様増殖因子、線維芽細胞増殖因子、およびHIV Tatタンパク質等のアミノ酸配列、および本明細書に記載の任意のポリペプチドをコードする核酸配列等の核酸配列）、および/または現象（例えば、細胞死、細胞アポトーシス、細胞生存度、細胞生存、分子に対する結合、結合親和性、核酸配列の発現、核酸配列の転写、酵素活性等）のレベルに関する場合、当技術分野によって許容される任意の統計的解析法により、統計学的に有意な任意の量だけ、第一試料中の分子および/または現象の量が第二試料中の量よりも低いことを意味する。1つの態様において、減少は、例えば患者が、疼痛、呼吸困難、明視、嘔気、疲労等の病徴の主観的知覚に言及する場合等に、主観的に決定され得る。別の態様においては、第一試料中の分子および/または現象の量は、第二試料中の同じ分子および/または現象の量よりも少なくとも10％低い、少なくとも25％低い、少なくとも50％低い、少なくとも75％低い、および/または少なくとも90％低い。

本明細書で使用されるような、特定のポリヌクレオチド配列を含むおよび/または特定のタンパク質配列を含む「組成物」は、列挙したポリヌクレオチド配列（ならびに/またはその等価な断片、相同体、および高度にストリンジェントおよび/または中程度にストリンジェントな条件下で、具体的に指定されるヌクレオチド配列とハイブリダイズする配列）および/または列挙したタンパク質配列（ならびに/またはその等価な断片、変種、および同じ分子量のタンパク質）それぞれを含む任意の組成物を広く指す。組成物は、例えば塩（例えばNaCl）、界面活性剤（例えばSDS）、および他の成分（例えばデンハルト溶液、ドライミルク、サケ精子DNA等）を含む水溶液を含んでよい。

「特定の核酸配列を含む」ヌクレオチド配列および「特定のアミノ酸配列を含む」タンパク質という用語、ならびにこれら用語の相当語句は、具体的に指定される核酸配列（ならびに/またはその等価な断片、相同体、および高度にストリンジェントおよび/または中程度にストリンジェントな条件下で、具体的に指定されるヌクレオチド配列とハイブリダイズする配列）および具体的に指定されるアミノ酸配列（ならびに/またはその等価な断片、変種、および同じ分子量のタンパク質）それぞれを含む、関心対象の任意のヌクレオチド配列および関心対象の任意のタンパク質それぞれを指す。本発明は、供給源（例えば、細胞種、組織、動物等）、性質（例えば、合成、組換え、細胞抽出物からの精製等）、ならびに/または関心対象のヌクレオチド配列および/もしくは関心対象のタンパク質を限定しない。1つの態様において、関心対象のヌクレオチド配列および関心対象のタンパク質には、構造遺伝子のコード配列（例えば、プローブ遺伝子、レポーター遺伝子、選択マーカー遺伝子、発癌遺伝子、薬剤耐性遺伝子、増殖因子等）が含まれる。

発明の簡単な説明
本発明は、殺細胞活性を有するアミノ酸配列、それらをコードする核酸配列、それらと特異的に結合する抗体を含む組成物、ならびに細胞死を増加および/または減少させるため、細胞死を検出するため、細胞死の変化に関連する疾患を診断するためのこれら組成物の使用方法、ならびに細胞死を変化させる試験物質を同定する方法に関する。

より詳細には、本発明は、アミノ酸配列

を有するDNA断片化活性化因子(ADF)、および「DNA断片化最小活性化因子」（「MADF」）配列

のようなその活性を媒介するADFの断片を提供する。本発明はまた、例えばアミノ酸置換によって得られるような、ADFおよびMADFの活性を媒介するADFおよびMADFの相同体を提供する。本発明はまた、ADFに実質的に等しい活性を有する分子もしくはADF相同体、またはこの活性の阻害剤の同定に適したADFアッセイ法を提供する。ADFをコードするヌクレオチド配列、および中程度のストリンジェンシーにおいてこの配列とハイブリダイズする任意の配列もまた提供する。ADFを阻害するために有用なADFに相補的なアンチセンス配列；ADFを阻害するために有用なADFに相補的なRNAi, 21 bp, RNA断片；診断目的のためのADFに結合する抗体；（例えばアポトーシスによる）細胞死を誘導するためのタンパク質としてのADFの使用；（例えばアポトーシスによる）細胞死を誘導するための導入遺伝子としてのADFの使用；（例えばアポトーシスによる）細胞死の調節因子をスクリーニングするためのADFの使用；治療または診断目的のための、酵素、増殖因子、抗体、および他のリガンドを含む融合タンパク質におけるADFの使用；ADFと結合/相互作用する、タンパク質-タンパク質相互作用トラップアッセイにおいて同定されるすべてのタンパク質；ならびにDFと任意の他のタンパク質との相互作用を阻害する分子もまた提供する。

したがって、1つの態様において、本発明は、細胞死誘導分子（ペプチド等）および細胞分子認識化合物（細胞マーカー認識化合物等）を含む複合体を提供する。細胞死誘導分子は、ミトコンドリアタンパク質またはタンパク質断片を含む。1つの態様において、細胞死誘導分子は、ヒトまたは霊長類起源のような哺乳動物起源のものである。細胞死誘導分子は、「DNA断片化活性化因子」(ADF)、ミトコンドリアリンゴ酸脱水素酵素(MDH)の断片を含んでもよい。1つの態様において、細胞死誘導分子はADFの断片を含み、断片は配列番号：7に由来する少なくとも8アミノ酸、好ましくは少なくとも10アミノ酸を含む。

細胞死誘導分子が、細胞死誘導分子の対応する配列において挿入または欠失を有するかまたは有さずに、配列番号：7の少なくとも10個の連続した残基のアミノ酸ストレッチにわたって、配列番号：7と配列が少なくとも80％同一であるアミノ酸ストレッチを含む、配列番号：7の派生物であるアミノ酸配列を含む、細胞死誘導分子と細胞分子認識化合物（細胞マーカー認識化合物等）の複合体もまた提供する。または、派生物は、細胞死誘導分子の対応する配列において挿入または欠失を有するかまたは有さずに、配列番号：7の少なくとも12個の連続した残基のアミノ酸ストレッチにわたって、配列番号：7と配列が少なくとも60％同一であるアミノ酸ストレッチを含む。別の場合には、派生物は、細胞死誘導分子の対応する配列において挿入または欠失を有するかまたは有さずに、配列番号：7の少なくとも15個の連続した残基のアミノ酸ストレッチにわたって、配列番号：7と配列が少なくとも40％同一であるアミノ酸ストレッチを含む。さらに別の場合には、細胞死誘導分子をコードするDNAは、60℃において1.5M、1.0M、0.75M、または0.5M塩で、配列番号：7をコードする任意のDNAとハイブリダイズし得る。

本発明はまた、好ましくはN末端シグナルペプチドをさらに含む本発明の複合体のいずれかをコードするDNA配列、およびこれらDNA配列を含むベクターを含む細胞を提供する。

本発明はさらに、細胞死誘導が、Htra2/Omi、AIF（アポトーシス誘導因子）、Smac/DIABLO、活性化ゲルソリン、AP24セリンプロテアーゼ、任意のアポトーシス促進性Bcl-2ファミリーメンバー、任意の細胞内ヌクレアーゼ、EndoG、チトクロームC、Nix、Nip3、CIDE-B、ならびに等価なそれらの断片、それらの変種、およびほぼ同じ分子量の配列を含む、細胞死誘導分子および細胞分子認識化合物（細胞マーカー認識化合物等）を含む複合体を提供する。細胞死誘導分子が、上記の第一群のペプチド内の任意のペプチドの派生物を含むアミノ酸配列を含む、細胞死誘導分子と細胞分子認識化合物（細胞マーカー認識化合物等）の複合体もさらに提供する。1つの態様において、派生物は、細胞死誘導分子の対応する配列において挿入または欠失を有するかまたは有さずに、少なくとも10個の連続した残基のアミノ酸ストレッチにわたって、本明細書に記載の任意の細胞死誘導分子と配列が少なくとも80％同一であるアミノ酸ストレッチを含む。または、派生物は、細胞死誘導分子の対応する配列において挿入または欠失を有するかまたは有さずに、少なくとも12個の連続した残基のアミノ酸ストレッチにわたって、本明細書に記載の任意の細胞死誘導分子と配列が少なくとも60％同一であるアミノ酸ストレッチを含む。別の場合には、派生物は、細胞死誘導分子の対応する配列において挿入または欠失を有するかまたは有さずに、少なくとも15個の連続した残基のアミノ酸ストレッチにわたって、本明細書に記載の任意の細胞死誘導分子と配列が少なくとも40％同一であるアミノ酸ストレッチを含む。さらに別の場合には、細胞死誘導分子をコードするDNAは、60℃において1.5M、1.0M、0.75M、または0.5M塩で、本明細書に記載の第一群のペプチドの任意の細胞死誘導分子をコードする任意のDNAとハイブリダイズし得る。別の場合には、アポトーシス促進性Bcl-2ファミリーメンバーは、Bax、Bad、およびBidの1つまたは複数を含む群から選択される。さらなる態様において、細胞内ヌクレアーゼは、EndoG、細胞内DNase I、DNase II、およびカスパーゼ活性化DNase(CAD)の1つまたは複数を含む。より好ましくは、ヌクレアーゼは、ICADによる阻害に対して全長CADよりも耐性が高いCADの断片を含み、複合体は各局在化シグナルもまた含む。さらにより好ましくは、ICADによる阻害に対して全長CADよりも耐性が高いCADの断片は、ヌクレアーゼドメインを含むが、CADドメインを含まないCADの断片である。

1つの態様において、複合体は、1コピーより多い細胞死誘導分子および/または細胞分子認識化合物（細胞マーカー認識化合物等）を含む。1つの態様において、細胞死誘導分子および/または細胞分子認識化合物の複合体は、化学的生物結合反応を用いて達成される。好ましくは、細胞死誘導分子と細胞分子認識化合物との間の結合は、複合体が細胞内に入った際に切断され得る切断可能な結合である。より好ましくは、切断可能な結合は、細胞内のエステラーゼによって切断され得るエステル結合であるか、または一方が細胞死誘導分子上に存在しもう一方が細胞分子認識化合物上に存在する2つのシステイン残基間のジスルフィド結合のようなジスルフィド結合である。または、切断可能な結合は、細胞内プロテアーゼによって切断され得るペプチド結合である。別の態様において、細胞死誘導分子と細胞分子認識化合物の結合は遺伝子的に行われ、融合タンパク質が形成される。1つの態様では、結合は細胞分子認識化合物のN末端および/またはC末端においてである。

1つの態様において、複合体の細胞分子認識化合物（細胞マーカー認識化合物等）は、抗体断片ライブラリー、ファージディスプレイ、またはファージミドディスプレイから同定されるような、モノクローナル抗体（抗体断片を含む）を含む。特定の態様において、細胞分子認識化合物は、肝細胞癌細胞を含め肝臓癌細胞を認識するような癌細胞特異的マーカーであり、より好ましくは抗体、抗体断片、F(ab)'2、Fab'、Fab、または一本鎖Fv (scFv)である。さらなる態様において、細胞分子認識化合物は肝臓癌細胞マーカーを特異的に認識し、Hepama-1、抗PLC1、抗PLC2、K-PLC1、K-PLC2、K-PLC2、49-D6、7-E10、34-A4、26-A10、34-B9、79-C8、16-E10、5D3、5C3、2C6、a-AFP、HP-1、hHP-1、mAb 95、YPC2/38.8、P215457、PMM4E9917、HAb25、Hab27、KY-1、KY-2、KY-3、9403 Mab、KM-2、S1、9B2、IB1、A9-84、SF-25、AF-10、XF-8、AF-20、a-hIRS-1、FB-50、SF 31、SF 90、2A3D2、および2D11E2の1つまたは複数を含むげっ歯類モノクローナル抗体の群より選択される抗体の重鎖可変領域を含む。これらの抗体のいずれかと同じ抗原を特異的に認識する細胞マーカー認識化合物もまた意図される。または、複合体の細胞死誘導分子はADFの断片を含めてADFを含み、細胞分子認識化合物は、Hepama-1モノクローナル抗体の断片、Hepama-1モノクローナル抗体のヒト化型、およびHepama-1モノクローナル抗体の断片のヒト化型のように、Hepama-1モノクローナル抗体と同じ抗原を特異的に認識する。細胞分子認識化合物および細胞死誘導分子は遺伝子的に融合されていることが好ましい。さらなる態様において、細胞分子認識化合物は、マウスモノクローナル抗体の上記群による任意の抗体と同じ抗原を特異的に認識する。または、細胞分子認識化合物は、上記抗体のいずれかと競合的に肝臓癌細胞に結合し得る。肝臓癌細胞の可溶化細胞タンパク質の存在下において、上記マウスモノクローナル抗体の群による任意の抗体によって細胞分子認識化合物が免疫沈降されることによって示されるように、細胞分子認識化合物およびマウスモノクローナル抗体の上記群による任意の抗体が同じ細胞分子に同時に結合する複合体もまた提供する。好ましくは、細胞分子認識化合物は、肝臓癌細胞タンパク質に特異的に結合する細胞マーカー認識化合物であって、タンパク質の分子量は約43,000ダルトンであり、より好ましくは肝臓細胞マーカーは糖タンパク質である。

別の態様において、本発明は、細胞分子認識化合物がHepama-1抗体よりも高い親和性でHepama-1モノクローナル抗体と同じ抗原に結合する、殺細胞物質と細胞分子認識化合物（細胞マーカー認識化合物等）の複合体を提供する。細胞分子認識化合物を、ウサギモノクローナル抗体技術等のモノクローナル抗体技術を用いて、mRNAディスプレイもしくはリボソームディスプレイを用いて、または、a. Hepama-1抗原の同一性を決定する段階、b. Hepama-1抗原またはその断片を精製する段階、およびc. 精製Hepama-1抗原またはその断片に対する結合剤を作製する段階により得ることができる。または、タンパク質結合剤を、a. Hepama-1抗原の同一性を決定する段階、b. Hepama-1抗原の細胞外ペプチド部分を含むペプチドを合成する段階、c. ペプチドに対する結合剤を作製する段階、およびd. ペプチドに対する細胞分子認識化合物がHepama-1抗体よりも高い親和性で肝細胞癌細胞上のHepama-1抗原を認識し得ることを確認する段階により得ることができる。1つの態様において、殺細胞物質は、1つまたは複数の放射性核種、およびADF等のタンパク質に基づく毒素を含む。抗体を含む本発明の複合体は、完全なもしくは部分的なヒト化または非免疫化過程に供するか、あるいはヒトとマウス抗体配列間のキメラであることが好ましい。

別の態様において、複合体の細胞分子認識化合物は、（表1および表2に記載のような）癌特異的細胞受容体等の細胞受容体のリガンドである。または、リガンドは、上皮増殖因子、インスリン様増殖因子、線維芽細胞増殖因子、または血管内皮増殖因子等の増殖因子である。

さらに別の態様において、複合体の細胞分子認識化合物（細胞マーカー認識化合物等）は、核酸アプタマー、ペプチド、制約されたペプチド、単一ドメイン抗体、二重特異性抗体（diabody）、および/または水晶体またはフィブロネクチンのドメインの構造上の既知構造モチーフに基づいた部分的ランダム化タンパク質を含む。好ましくは、細胞分子が細胞表面マーカーである場合、例えば複合体がポリカチオンペプチド（例えば、HIV Tatタンパク質、6〜9アルギニン成分、アンテナペディアタンパク質、およびヒトHOXタンパク質の1つまたは複数を含むポリカチオンペプチド等）によって例示されるような細胞内部移行シグナルを含む場合などに、本発明の複合体は、細胞上の対応する細胞表面マーカーに結合したならば、細胞の内部に取り込まれる。別の態様において、本発明の複合体は、アミノ酸配列（配列番号：62）PKKKRKVのような核局在化シグナルを含む。

本発明はまた、本明細書に記載の複合体のいずれかをヒト等の哺乳動物対象に投与することによる、疾患（癌、特に肝臓癌等）の症状を軽減する方法を提供する。

本発明はさらに、ADFに特異的に結合する抗体、好ましくはモノクローナル抗体、より好ましくはADFに対する親和性よりも実質的に低い親和性で非切断型ミトコンドリアリンゴ酸脱水素酵素に結合する抗体を提供する。

1つもしくは複数の抗体または他の特異的なADF結合剤を用いて細胞の細胞質内のADFのレベルを定量することによる等、細胞質内のADFの存在量を測定することにより、細胞のアポトーシス状態を特徴づける方法もまた提供する。さらに、血液由来試料（血漿、血小板等）を含め、血液中のADFの存在量に基づいた、患者を特徴づけるまたは診断する方法も提供する。

本発明はまた、以下の段階を含む、アポトーシス耐性または壊死耐性真核細胞において、細胞死を引き起こす生物試料中の因子を同定する方法を提供する：a.アポトーシス耐性細胞の細胞、細胞抽出物、または単離核を生物試料と共にインキュベートして、細胞死誘導因子の存在についてアッセイする段階（細胞、細胞抽出物、または単離核に曝露される異なる因子の数は100を超える）、およびb. 生物試料が細胞死誘導活性を有することが認められる場合に、細胞死誘導活性を有する試料の解析を行い、活性を有する成分の同一性を決定する段階。アポトーシス耐性または壊死耐性真核細胞はアポトーシス耐性であり、アポトーシス耐性はBcl-2の過剰発現の結果であることが好ましい。

1つの態様において、生物試料は生物成分の複雑な混合物を含み、細胞死誘導活性を有する成分の同一性を決定するための活性を有する試料の解析は、以下の段階を含む：a. 抽出物を分画する段階、およびb.分画した抽出物を細胞死誘導活性について試験する段階、およびc. 細胞死誘導活性を含む画分に関して、細胞死の誘導に関与する成分を決定する段階。さらなる態様において、生物試料は、細胞に導入されたDNA構築物からタンパク質が発現された細胞の細胞抽出物または培地を含み、細胞死誘導活性を有する成分の同一性を決定するための活性を有する試料の解析は、細胞死誘導活性を有する試料と関連するDNA構築物のDNA配列の決定を含む。または、本方法は以下の段階をさらに含む：a. DNA構築物のライブラリーを作製する段階、およびb. DNA構築物のライブラリーを細胞に導入する段階、およびc. DNA構築物が導入された細胞の抽出物または培地をスクリーニングし、スクリーニングが細胞死誘導に関するアッセイを含む段階、およびd. 細胞死を誘導する細胞抽出物または培地に対応する細胞内に存在するDNA構築物の配列を決定する段階。より好ましくは、DNA構築物が導入された細胞の各抽出物または培地は、単一のDNA構築物を有する細胞に由来する。または、DNA構築物が導入された細胞の各抽出物または培地は、DNA構築物の群を有する細胞に由来し、この場合、細胞死の誘導に関するアッセイ法を用いて細胞死を誘導するDNA構築物の群を同定し、細胞死を誘導するDNA構築物の群による単一のDNA構築物を有する細胞に対して、細胞死を誘導するDNA構築物の群のさらなるスクリーニングを行い、どのDNA構築物が細胞死の誘導に関与するタンパク質をコードするのかを同定する。本発明を任意の機構に限定することは意図しないが、1つの態様において、細胞死の機構はアポトーシス、壊死、アポネクローシス(aponecrosis)、および/または自己貪食変性である。別の態様において、真核細胞抽出物は、未処理細胞、UV照射または他のアポトーシス、壊死、アポネクローシス誘導物質で処理した細胞、ヒト細胞に由来し、および/またはミトコンドリア等の細胞小器官の成分が濃縮された抽出物である。本発明の方法に従って同定され得る生物試料中の因子は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、脂質、オリゴ糖、低分子等である可能性がある。細胞死誘導因子の存在に関するアッセイ法には、DNA断片化アッセイ法が含まれる。

別の態様において、本発明は以下の段階を含む、アポトーシス耐性細胞において細胞死を引き起こし得る遺伝子産物を同定する方法を提供する：a. アポトーシス耐性宿主細胞に、誘導系の調節下において遺伝子を発現するのに必要なシス作動性配列をすべて含むDNAを導入する段階、b. 遺伝子の発現を誘導する段階、およびc. 死の指標に関して宿主細胞をモニターする段階。本方法は以下の段階をさらに含むことが好ましい：d. DNA構築物のライブラリーを作製する段階、およびe. DNA構築物のライブラリーを宿主細胞に導入する段階、およびf. アポトーシス耐性宿主細胞において死を引き起こすDNA構築物の同一性を決定することにより、アポトーシス誘導遺伝子産物の同一性を決定する段階。

以下の段階を含む、細胞において（例えばアポトーシスによる）細胞死を抑制する化合物を同定する方法もまた提供する：a. ADFを含む分子を細胞または細胞抽出物に添加し、これらの抽出物をアポトーシスのマーカーについてアッセイする段階、およびb. 細胞または細胞抽出物に分子を添加することに加えて、さらに化合物を添加する段階、およびc. 化合物によるアポトーシスの阻害についてアッセイする段階。別の態様において、本発明は、以下の段階を含む、（例えばアポトーシスによる）細胞死を促進する化合物を同定する方法を提供する：a. 細胞においてADFに結合する相互作用分子を同定する段階、およびb. 相互作用分子と相互作用する化合物を同定する段階、およびc.相互作用分子と相互作用し得るこれらの化合物を、（例えばアポトーシスによる）細胞死を促進する能力に関してアッセイする段階。好ましくは、ADFに結合する分子の同定は、ツーハイブリッドシステム、ファージディスプレイもしくは他の組み合わせ生物学法を用いて、またはプルダウンアッセイおよびその後のプルダウンされた分子の質量分析により、または電気泳動で分離された細胞抽出物に対するADFのゲル内もしくはフィルター上での結合により達成される。

さらなる態様において、本発明は、以下の段階を含む、（例えばアポトーシスによる）細胞死を阻害する化合物を同定する方法を提供する：a. 細胞内でADFに結合する相互作用分子を同定する段階、およびb. 相互作用分子と相互作用する化合物を同定する段階、およびc. 相互作用分子と相互作用し得るこれらの化合物を、（例えばアポトーシスによる）ADF誘導性細胞死を阻害する能力に関してアッセイする段階。好ましくは、ADFに結合する分子の同定は、ツーハイブリッドシステム、ファージディスプレイもしくは他の組み合わせ生物学法を用いて、またはプルダウンアッセイおよびその後にプルダウンされた分子の質量分析により、または電気泳動で分離された細胞抽出物に対するADFのゲル内もしくはフィルター上での結合により達成される。

細胞死誘導分子が、細胞死誘導分子の対応する配列において挿入または欠失を有するかまたは有さずに、本発明の方法のいずれかに従って同定されるペプチドの配列内の少なくとも10個の連続した残基のアミノ酸ストレッチにわたって、本発明の方法のいずれかに従って同定される任意のペプチドと配列が少なくとも80％同一であるペプチドを含む、細胞死誘導分子と細胞分子認識化合物（細胞マーカー認識化合物等）の複合体もまた提供する。1つの態様において、本発明は、細胞死誘導分子が、細胞死誘導分子の対応する配列において挿入または欠失を有するかまたは有さずに、本発明の方法のいずれかに従って同定されるペプチドの配列内の少なくとも12個の連続した残基のアミノ酸ストレッチにわたって、本発明の方法のいずれかに従って同定される任意のペプチドと配列が少なくとも60％同一であるペプチドを含む、細胞死誘導分子と細胞マーカー認識化合物の複合体を提供する。さらに、細胞死誘導分子が、細胞死誘導分子の対応する配列において挿入または欠失を有するかまたは有さずに、本発明の方法のいずれかに従って同定されるペプチドの配列内の少なくとも15個の連続した残基のアミノ酸ストレッチにわたって、本発明の方法のいずれかに従って同定される任意のペプチドと配列が少なくとも40％同一であるペプチドを含む、細胞死誘導分子と細胞マーカー認識化合物の複合体も提供する。本発明はまた、細胞死誘導分子をコードするDNAが、60℃において1.5M、1.0M、0.75M、または0.5M塩で、本発明の方法のいずれかに従って同定される任意のポリペプチドをコードする任意のDNAとハイブリダイズし得る、細胞死誘導分子と細胞マーカー認識化合物の複合体もまた提供する。

本発明はまた、以下の段階を含む、ヒトまたは動物における、細胞マーカーを有する特定細胞を死滅させる方法を提供する：a. 細胞死誘導分子が、Htra2/Omi、AIF（アポトーシス誘導因子）、Smac/DIABLO、活性化ゲルソリン、AP24セリンプロテアーゼ、任意のアポトーシス促進性Bcl-2ファミリーメンバー、任意の細胞内ヌクレアーゼ、EndoG、チトクロームC、Nix、Nip3、CIDE-B、本発明の方法のいずれかに従って同定される任意の化合物、その群内の任意のペプチドの断片化に由来する任意のペプチド、またはその群に属する任意のペプチドの少なくとも10アミノ酸のストレッチにわたって少なくとも80％の配列同一性を有する任意のペプチドの1つまたは複数から選択されるペプチドを含む、細胞死誘導分子と細胞マーカー認識化合物の複合体を作製する段階、およびb. 複合体が細胞マーカー（細胞表面マーカー等）を提示する細胞に接近できるように、ヒトまたは動物に化合物を投与する段階、およびc. 細胞マーカーを提示する細胞に複合体を接触させ、その後、細胞マーカーを提示する細胞により複合体を内部に取り込ませる段階、およびd. 毒素化合物が、細胞マーカーを提示する細胞を死滅させることを可能にする段階。1つの態様において、投与は、ヒトまたは動物への複合体の注射、または、発現した複合体が細胞マーカーを提示する細胞に接近できるような、複合体の発現を引き起こすDNA構築物の投与を含む。1つの態様において、細胞マーカーは、肝細胞癌細胞等の癌細胞に特異的である。好ましくは、複合体は、ADFの断片を含めたADF、および本明細書に記載のマウスモノクローナル抗体の群より選択される抗体または抗体断片を含む。好ましくは、複合体は、ADFの断片を含めたADF、およびHepama-1モノクローナル抗体と同じ抗原を認識する細胞マーカー認識化合物を含み、より好ましくは、細胞マーカー認識化合物は、その断片も含めて、Hepama-1モノクローナル抗体のヒト化または非免疫化型である。1つの態様において、ヒトまたは他の動物はまた、抗癌化学療法薬、放射線治療、または抗体に基づく治療を含むタンパク質に基づく治療によっても処置される。1つの態様において抗癌化学療法薬は、5-フルオロウラシル、ロイコボリン、トムデックス(Tomudex)、マイトマイシンC、CPT-11、および3-ブロモピルビン酸の1つまたは複数を含む化合物群より選択される。

本発明はまた、以下の段階を含む、ヒトまたは動物における、細胞マーカー（細胞表面マーカー等）を有する特定細胞を死滅させる方法を提供する：a. ビオチン化細胞マーカー認識化合物が細胞マーカーを有する細胞に接近して、ビオチン化細胞マーカー認識化合物が細胞と接触できるように、ビオチン化細胞マーカー認識化合物をヒトまたは動物に送達する段階、b. 細胞死誘導分子が、Htra2/Omi、AIF（アポトーシス誘導因子）、Smac/DIABLO、活性化ゲルソリン、AP24セリンプロテアーゼ、任意のアポトーシス促進性Bcl-2ファミリーメンバー、任意の細胞内ヌクレアーゼ、EndoG、チトクロームC、Nix、Nip3、CIDE-B、本発明の方法のいずれかに従って同定される任意の化合物、またはその群内の任意のペプチドの断片化に由来する任意のペプチド、もしくはその群に属する任意のペプチドの少なくとも10アミノ酸のストレッチにわたって少なくとも80％の配列同一性を有する任意のペプチドの1つまたは複数から選択されるペプチドを含む、ビオチン結合タンパク質と細胞死誘導分子の毒素複合体を送達する段階、c. 細胞死誘導分子が細胞に間接的に結合できるように、毒素複合体を、細胞に結合したビオチン化細胞マーカー認識分子と接触させる段階、d. 細胞により、細胞に間接的に結合した毒素複合体を内部に取り込ませる段階、およびe. 毒素化合物が細胞を死滅させることを可能にする段階。

さらに、以下の段階を含む、ヒトまたは動物における、細胞マーカー（細胞表面マーカー等）を有する特定細胞を死滅させる方法を提供する：a. 細胞マーカー認識化合物が細胞マーカーを有する細胞に接近して、標的複合体が細胞と接触できるように、ビオチン結合タンパク質と細胞マーカー認識化合物の標的複合体をヒトまたは動物に送達する段階、b. 細胞死誘導分子が、Htra2/Omi、AIF（アポトーシス誘導因子）、Smac/DIABLO、活性化ゲルソリン、AP24セリンプロテアーゼ、任意のアポトーシス促進性Bcl-2ファミリーメンバー、任意の細胞内ヌクレアーゼ、EndoG、チトクロームC、Nix、Nip3、CIDE-B、本発明の方法のいずれかに従って同定される任意の化合物、またはその群内の任意のペプチドの断片化に由来する任意のペプチド、もしくはその群に属する任意のペプチドの少なくとも10アミノ酸のストレッチにわたって少なくとも80％の配列同一性を有する任意のペプチドの1つまたは複数から選択されるペプチドを含む、ビオチン化細胞死誘導分子を送達する段階、c. 細胞死誘導分子が細胞に間接的に接触できるように、ビオチン化細胞死誘導分子を、細胞に結合した標的複合体と接触させる段階、d. 細胞により、細胞に間接的に結合したビオチン化細胞死誘導分子を内部に取り込ませる段階、およびe. ビオチン化細胞死誘導分子が細胞を死滅させることを可能にする段階。

本発明はまた、本発明の方法のいずれかに基づいた治療的介入、および本発明の複合体のいずれかの薬学的有効量および許容される担体を含む、癌腫の治療に有用な薬学的組成物を提供し、さらに本発明の複合体のいずれかを含む薬学的有効量の組成物を患者に投与する段階を含む、インビボで癌腫を治療する方法を提供する。

発明の詳細な説明
本発明は、殺細胞活性を有するアミノ酸配列、それらをコードする核酸配列、それらと特異的に結合する抗体を含む組成物、ならびに細胞死を増加および/または減少させるため、細胞死を検出するため、細胞死の変化に関連する疾患を診断するためのこれら組成物の使用方法、ならびに細胞死を変化させる試験物質を同定する方法を提供する。

A. 本発明のアミノ酸配列、B. 本発明の配列を含む複合体、C. 本発明の核酸配列、D. ベクターおよび細胞、E. ADFに特異的な抗体、F. 細胞を死滅させる方法、G. 細胞死を減少させる方法、H. アポトーシスを検出する方法、I. 細胞死を変化させる物質を同定する方法、J. 細胞死を増加させる分子を同定する方法、ならびにK. 細胞死を減少させる分子を同定する方法という項目で、本発明をさらに説明する。

A. 本発明のアミノ酸配列
本発明は、DNA断片化最小活性化因子タンパク質配列番号：6を含む、配列番号：4（ヒトミトコンドリアリンゴ酸脱水素酵素）の部分の1つまたは複数を含むアミノ酸配列を含む組成物を提供する。1つの態様において、アミノ酸配列は、DNAヌクレアーゼ活性および殺細胞活性の1つまたは複数から選択される活性を有する。本発明の配列は、アポトーシス過程において放出され、核DNAの断片化を活性化するミトコンドリアリンゴ酸脱水素酵素の断片の発見を具体化するものである。

本発明のアミノ酸配列の利点は、ヒト由来の配列は免疫原性がなく、したがって免疫応答を減少させるためのPEG付加による修飾を（受けてもよいが）必要としない点である。PEG付加によりタンパク質が失活する可能性があり、またタンパク質の分子量が増加し、それによって細胞内への透過が減少して、結果的にやはり細胞内における生物活性（例えば、DNAヌクレアーゼ活性および/または殺細胞活性）が減少する可能性があるため、このことは有利である。

本発明のMDH部分、MADFおよびADFは殺細胞分子として有用である。「細胞の死滅」および「細胞死」という用語は、アポトーシス、壊死、アポネクローシス、自己貪食変性等によるような、任意の機構による細胞のプログラム死および/または非プログラム死を指す。したがって、「殺細胞」、「細胞死誘導」、「細胞死の増加」、「細胞死活性」、「細胞毒性」、および文法上の相当語句は、アポトーシスの増加、壊死の増加、アポネクローシスの増加、自己貪食変性の増加、生存度の減少、細胞分裂速度の減少等を含む（がこれらに限定されない）、死細胞数の増加ならびに/または生細胞数および/もしくは分裂細胞数の減少を指す。

細胞死を検出および定量化する方法は、例えばアポトーシスの検出に関する等、当技術分野において周知である。「アポトーシス」という用語は、後生動物細胞において固有の細胞自殺プログラムの活性化後に起こる非壊死細胞死を意味する。アポトーシスは、後生動物の発生および恒常性における正常な過程である。アポトーシスは、細胞収縮、形質膜のゼイオーシスまたは気泡形成、ならびに核の崩壊およびヌクレオソーム内部における核クロマチンの断片化を含む、特徴的な形態変化および生化学的変化を含む。アポトーシス過程において、細胞は様々な変化を起こし、最終的に細胞が溶解してアポトーシス小体を形成し、次いでアポトーシス小体は典型的に他の細胞によって貪食される。当業者は、アポトーシスレベルを減少させることにより、（細胞増殖を含んでもよいが）必ずしも細胞を増殖させることなく、細胞生存が増加することを理解する。したがって、本明細書で使用する「アポトーシスの増加」と「生存の減少」という用語は等価である。本明細書で使用する「アポトーシスの減少」と「生存の増加」という用語は等価である。アポトーシスは、細胞が示す形質膜におけるホスファチジルセリンに対するアネキシン-V結合の増加の測定、生細胞の顕微鏡観察によるアポトーシスの初期指標、またはトランスフェクション指標である緑色蛍光タンパク質およびアネキシン-Vに関する細胞選別解析(FACS)を含む、本明細書に記載するような、当技術分野において周知の方法により測定することができる。また、アポトーシスは、Hoechst 33342での核染色によって確認することもできる。本明細書で用いる「アポトーシス活性」という用語は、アポトーシスを引き起こすおよび/または増加させる能力を指す。

細胞死を検出および定量化する他の方法には、分裂細胞のDNAに取り込まれるブロモデオキシウリジン(BrdU)と共に細胞をインキュベートし、その後免疫組織化学法によってDNAに取り込まれたBrdUを検出することによるような、細胞増殖の検出および定量が含まれる。増殖指標は、試料中の全細胞に対するBrdU陽性標的細胞の割合として算出され得る。または、細胞増殖レベルは、細胞周期のS期にある細胞のマーカーである増殖性細胞核抗原(PCNA)に対する抗体を用いて組織切片を染色し、その後組織中のPCNA陽性細胞の数をカウントすることによって決定することもできる。

本発明のアミノ酸配列は、「内因性」であっても「異種性」（すなわち「外来性」）であってもよい。ペプチド配列およびヌクレオチド配列に関する場合の「内因性」および「野生型」という用語は、天然配列と比較して改変を含まない限り、それが導入される細胞において天然に見出される配列を指す。「異種性」という用語は、それが導入される細胞またはウイルスとって内因性ではない配列を指す。例えば、異種DNAには、天然では連結されていないかまたは天然では異なる位置において連結されている核酸配列に連結された、または連結されるように操作されたヌクレオチド配列が含まれる。異種DNAには、それが導入される細胞において天然に見出され、かつ天然配列と比較していくらかの改変を含むヌクレオチド配列もまた含まれる。必ずではないが一般に、異種DNAは、それが導入される細胞またはウイルスによって通常産生されない異種RNAおよび異種タンパク質をコードする。異種DNAの例には、レポーター遺伝子、転写および翻訳制御配列、選択マーカータンパク質（例えば、薬剤耐性を付与するタンパク質）をコードするDNA配列等が含まれる。

分子または組成物（ヌクレオチド配列、アミノ酸配列、細胞、アポトーシス気泡等）に適用する場合に本明細書で用いる「天然」および「野生型」という用語は、その分子または組成物が天然に見出され得り、かつヒトによって意図的に改変されていないことを意味する。例えば、天然ポリペプチド配列とは、ヒトによって意図的に改変されていない、天然源から単離され得る生物中に存在するポリペプチド配列を指す。

1つの態様において、本発明はまた、「DNA断片化最小活性化因子」(「MADF」)配列

を含む、例示的なヒトミトコンドリアリンゴ酸脱水素酵素(MDH)

の一部を含むアミノ酸配列を提供する。最も好ましい態様において、アミノ酸配列は、ヒト「DNA断片化活性化因子」(「ADF」)

を含む。

別の態様において、本発明はまた、「DNA断片化最小活性化因子」(「MADF」)配列

を含む、例示的なブタミトコンドリアリンゴ酸脱水素酵素(MDH)

の一部を含むアミノ酸配列を提供する。

本明細書における、任意の具体的に指定されるタンパク質および/またはその配列識別名（MDH、MADF、ADF、Htra/Omi、アポトーシス誘導因子、Smac/DIABLO、EndoG、チトクロームC、Nix、Nip3、CIDE-B、ゲルソリン、Bcl-2、Bax、Bad、Bid、カスパーゼ活性化DNase、DNase I、DNase II、CADヌクレアーゼ阻害剤、上皮増殖因子、血管内皮増殖因子、水晶体タンパク質、アンテナペディアタンパク質、フィブロネクチン1型、ヒトHOXタンパク質、インスリン様増殖因子、線維芽細胞増殖因子、HIV Tatタンパク質等）への言及は、ありとあらゆる等価なその断片、その変種、およびほぼ同じ分子量の配列を指す。1つの態様において、等価なタンパク質は、具体的に指定されるタンパク質の、任意の方法によって検出可能な（本明細書に記載のおよび/または当技術分野において周知のような）生物活性の少なくとも1つを有する。

本明細書における、任意の具体的に指定されるタンパク質またはその配列識別名への言及には、任意の具体的に指定されるタンパク質とほぼ同じ分子量を有する等価なポリペプチド配列もまた含まれる。「ほぼ同じ分子量」という用語は、問題のポリペプチドの分子量の+/-5％、+/-10％、+/-15％、および/または+/-20％である分子量を有することを意味する。分子量は、例えば変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって決定することができる。

タンパク質（MDH、MADF、ADF、Htra/Omi、アポトーシス誘導因子、Smac/DIABLO、EndoG、チトクロームC、Nix、Nip3、CIDE-B、ゲルソリン、Bcl-2、Bax、Bad、Bid、カスパーゼ活性化DNase、DNase I、DNase II、CADヌクレアーゼ阻害剤、上皮増殖因子、血管内皮増殖因子、水晶体タンパク質、アンテナペディアタンパク質、フィブロネクチン1型、ヒトHOXタンパク質、インスリン様増殖因子、線維芽細胞増殖因子、HIV Tatタンパク質等）に関する場合の「断片」および「部分」という用語は、例示的な4個、8個、10個、20個、30個および50個の連続したアミノ酸残基から全アミノ酸配列マイナス1アミノ酸残基の大きさのタンパク質の部分を指す。したがって、「アミノ酸配列の少なくとも一部」を含むポリペプチドは、アミノ酸配列の4つの連続したアミノ酸残基から全アミノ酸配列までを含む。

本発明の範囲内の例示的なペプチド配列断片には、これらに限定されないが、(1) N末端アミノ酸1個、(2) N末端アミノ酸2個、(3) N末端アミノ酸3個、(4) N末端アミノ酸4個、(5) N末端アミノ酸5個、(6) N末端アミノ酸6個、(6) N末端アミノ酸6個、(7) C末端アミノ酸1個、(8) C末端アミノ酸2個、(9) C末端アミノ酸3個、(10) C末端アミノ酸4個、(11) C末端アミノ酸5個、(12) C末端アミノ酸6個、(13) C末端アミノ酸7個、(13) N末端アミノ酸1個およびC末端アミノ酸1個、(14) N末端アミノ酸2個およびC末端アミノ酸1個、(15) N末端アミノ酸3個およびC末端アミノ酸1個、(16) N末端アミノ酸4個およびC末端アミノ酸1個、(17) N末端アミノ酸1個およびC末端アミノ酸2個、(18) N末端アミノ酸1個およびC末端アミノ酸3個、(19) N末端アミノ酸1個およびC末端アミノ酸4個、(20) N末端アミノ酸1個およびC末端アミノ酸5個、(21) N末端アミノ酸1個およびC末端アミノ酸6個、(22) N末端アミノ酸1個およびC末端アミノ酸7個、(23) N末端アミノ酸2個およびC末端アミノ酸2個、(24) N末端アミノ酸2個およびC末端アミノ酸3個、(25) N末端アミノ酸3個およびC末端アミノ酸4個、(26) N末端アミノ酸1個およびC末端アミノ酸4個、(27) N末端アミノ酸2個およびC末端アミノ酸6個、(28) N末端アミノ酸3個およびC末端アミノ酸2個、(29) N末端アミノ酸6個およびC末端アミノ酸5個、(30) N末端アミノ酸5個およびC末端アミノ酸7個を欠く、MDH（配列番号：1、4）、MADF（配列番号：2、6）、ADF（配列番号：3、7）、Htra/Omi（配列番号：8）、アポトーシス誘導因子（配列番号：10）、Smac/DIABLO（配列番号：12）、EndoG（配列番号：24）、チトクロームC（配列番号：72）、Nix（配列番号：74）、Nip3（配列番号：76）、CIDE-B（配列番号：78）、ゲルソリン（配列番号：14）、Bcl-2（配列番号：16）、Bax（配列番号：18）、Bad（配列番号：20）、Bid（配列番号：22）、カスパーゼ活性化DNase（配列番号：26）、DNase I（配列番号：40）、DNase II（配列番号：42）、CADヌクレアーゼ阻害剤（配列番号：28）、上皮増殖因子（配列番号：30）、血管内皮増殖因子（配列番号：32）、水晶体タンパク質（配列番号：34）、アンテナペディアタンパク質（配列番号：36）、フィブロネクチン1型（配列番号：38）、ヒトHOXタンパク質（配列番号：45）、インスリン様増殖因子（配列番号：46）、線維芽細胞増殖因子（配列番号：48）、およびHIV Tatタンパク質（配列番号：50）が含まれる。

タンパク質断片を、前駆体タンパク質の化学的断片化による等、当技術分野において周知の方法によって産生することができる。または、タンパク質断片を、所望のタンパク質断片をコードするDNA配列を作製する段階、および細胞においてこれを発現させる段階を含む組換え技法によって産生することができる。

本明細書に記載する配列（MDH部分、MADF、ADF、Htra/Omi、アポトーシス誘導因子、Smac/DIABLO、EndoG、チトクロームC、Nix、Nip3、CIDE-B、ゲルソリン、Bcl-2、Bax、Bad、Bid、カスパーゼ活性化DNase、DNase I、DNase II、CADヌクレアーゼ阻害剤、上皮増殖因子、血管内皮増殖因子、水晶体タンパク質、アンテナペディアタンパク質、フィブロネクチン1型、ヒトHOXタンパク質、インスリン様増殖因子、線維芽細胞増殖因子、およびHIV Tatタンパク質等）の1つまたは複数と等価であり、かつ本発明の範囲内である配列には、これらの配列の変種が含まれる。本明細書で用いるタンパク質の「変種」および「相同体」という用語は、変種のタンパク質の1つまたは複数のアミノ酸の挿入、欠失、および/または保存的置換によって異なるアミノ酸配列を指す。アミノ酸の「保存的置換」という用語は、類似の疎水性、極性、および/または構造を有する別のアミノ酸によるアミノ酸の置換を指す。

アミノ酸置換は、分子の生物活性を実質的に変化させないことが好ましい。典型的に、保存的アミノ酸置換は、1つのアミノ酸の、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する別のアミノ酸による置換を含む。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンである；脂肪族-水酸基側鎖を有するアミノ酸群は、セリンおよびスレオニンである；アミド含有側鎖を有するアミノ酸群は、アスパラギンおよびグルタミンである；芳香族側鎖を有するアミノ酸群は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンである；塩基性側鎖を有するアミノ酸群は、リジン、アルギニン、およびヒスチジンである；硫黄含有側鎖を有するアミノ酸群は、システインおよびメチオニンである。

以下の群は、相互に典型的な保存的置換であるアミノ酸を含む：i. アラニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T)；ii. アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)；iii. アスパラギン(N)、グルタミン(Q)；iv. アルギニン(R)、リジン(K)；v. イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V)；vi. フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)；およびvii. アラニン(A)、バリン(V)。

生物活性および/または免疫学的活性を損なわずに、どのアミノ酸残基およびいくつのアミノ酸残基が置換、挿入、または欠失され得るかの決定における手引きは、例えばDNAStar(商標)ソフトウェアといった当技術分野において周知のコンピュータ・プログラムを用いて見出すことができる。1つの態様において、変種の配列は、問題のタンパク質の配列と少なくとも95％、少なくとも90％、少なくとも85％、少なくとも80％、少なくとも75％、少なくとも70％、および/または少なくとも65％の同一性を有する。

上記および他の原則に基づき、ヒトMDH（配列番号：4）（GenGenBank: NP_005909）の例示的な変種には、例示的な核酸配列である配列番号：2によってコードされるブタMDH（配列番号：1）（GenBank: P00346）が含まれる。

ヒトMADFの例示的な変種には、これに限定されないが、ブタ最小MADF（配列番号：2）（GenBank: P00346）が含まれる。

ヒトADF 配列番号：7の例示的な変種には、これに限定されないが、ブタMDHの配列番号：3が含まれる。ADFの他の変種は、配列番号：7の少なくとも15個の連続した残基のアミノ酸ストレッチにわたる少なくとも40％の同一性、好ましくは少なくとも12個の連続した残基のアミノ酸ストレッチにわたる60％の同一性、最も好ましくは少なくとも10個の連続した残基のアミノ酸ストレッチにわたる80％の同一性を有する。ADF

のさらに他の例示的な変種には、アミノ酸5位、7位、17位、30位、33位、57位、60位、66位、68位、92位の一箇所または複数箇所におけるグリシンが、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、およびスレオニンのうちのいずれか1つで個々に置換された；アミノ酸2位、4位、6位、9位、14位、16位、18位、27位、81位、87位の一箇所または複数箇所におけるアラニンが、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、およびスレオニンのうちのいずれか1つで個々に置換された；アミノ酸21位、25位、34位、35位、40位、70位、96位の一箇所または複数箇所におけるバリンが、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、セリン、およびスレオニンのうちのいずれか1つで個々に置換された；アミノ酸11位、24位、54位、55位、56位、65位、85位、99位の一箇所または複数箇所におけるロイシンが、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、セリン、およびスレオニンのうちのいずれか1つで個々に置換された；アミノ酸61位、67位、78位、82位、89位の一箇所または複数箇所におけるイソロイシンが、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、セリン、およびスレオニンのうちのいずれか1つで個々に置換された；アミノ酸8位、12位、23位、38位、42位、51位、71位、72位、79位、88位の一箇所または複数箇所におけるセリンが、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、およびスレオニンのうちのいずれか1つで個々に置換された；アミノ酸10位、45位、48位、52位、98位の一箇所または複数箇所におけるスレオニンが、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、およびセリンのうちのいずれか1つで個々に置換された；アミノ酸20位、22位、39位、50位、73位、95位の一箇所または複数箇所におけるフェニルアラニンが、チロシンおよびトリプトファンのうちのいずれか1つで個々に置換された；アミノ酸15位、49位の一箇所または複数箇所におけるチロシンが、フェニルアラニンおよびトリプトファンのうちのいずれか1つで個々に置換された；アミノ酸37位、47位の一箇所または複数箇所におけるシステインがメチオニンで個々に置換された；アミノ酸13位、28位、77位の一箇所または複数箇所におけるメチオニンがシステインで個々に置換された；アミノ酸29位、64位の一箇所または複数箇所におけるアスパラギンがグルタミンで個々に置換された；アミノ酸43位のグルタミンがアスパラギンで個々に置換された；アミノ酸26位、80位、94位の一箇所または複数箇所におけるアスパラギン酸がグルタミン酸で個々に置換された；アミノ酸32位、36位、44位、46位、62位、74位、75位、84位、93位の一箇所または複数箇所におけるグルタミン酸がアスパラギン酸で個々に置換された；アミノ酸1位、3位、31位、41位、58位、59位、63位、69位、76位、86位、90位、91位、97位、100位の一箇所または複数箇所におけるリジンが、アルギニンおよびヒスチジンのうちのいずれか1つで個々に置換された；およびアミノ酸19位の一箇所または複数箇所におけるアルギニンが、リジンおよびヒスチジンのうちのいずれか1つで個々に置換された配列番号：7が含まれる。

したがって、配列番号：1（GenBank: P00346）、配列番号：2（GenBank: P00346）、配列番号：3（GenBank: P00346）、配列番号：4（GenBank: NP_005909）、配列番号：6（GenBank: NP_005909）、配列番号：7（GenBank: NP_005909）、配列番号：8（GenGenBank: NM_145074）、配列番号：10（GenBank: AF100928）、配列番号：12（GenBank : AF298770）、配列番号：14（GenBank : BC026033）、配列番号：16（Bcl-2 GenBank: M14745）、配列番号：18（GenBank: NM_138764）、配列番号：20（GenBank: AF031523）、配列番号：22（GenBank: AF250233）、配列番号：24（GenBank: NM_004435）、配列番号：26（GenBank: AB013918）、配列番号：28（GenBank: BC007112）、配列番号：30（GenBank: NM_001963）、配列番号：32（GenBank: AY047581）、配列番号：34（GenBank: NM_001885）、配列番号：36（GenBank : M20704）、配列番号：38（GenBank: BT006856）、配列番号：40（GenBank : AJ298844）、配列番号：42（GenBank: AF060222）、配列番号：44（GenBank: U10421）、配列番号：46（GenBank: NM_000612）、配列番号：48（GenBank: NM_033137）、配列番号：50（GenBank: AY463230）、配列番号：72（GenBank : AY339584）、配列番号：74（GenBank : AF452712）、配列番号：76（GenBank: AF002697）、および配列番号：78（GenBank: AF544398）等の本発明のアミノ酸配列に関して、本発明の範囲内である等価なアミノ酸配列相同体（すなわち変種）には、これらの配列の少なくとも15個の連続した残基のアミノ酸ストレッチにわたる少なくとも40％の同一性、好ましくは少なくとも12個の連続した残基のアミノ酸ストレッチにわたる少なくとも60％の同一性、最も好ましくは少なくとも10個の連続した残基のアミノ酸ストレッチにわたる少なくとも80％の同一性を有する配列もまた含まれる。

例えば、「HtrA2/Omi」の変種には、セリンプロテアーゼ活性を有するものを含め、配列番号：8（GenGenBank: NM_145074）の等価な断片、変種、ならびに配列番号：8を含むおよび/またはその等価物を含む融合タンパク質が含まれる。

「Smac/Diablo」の例示的な変種には、通常カスパーゼ-9と相互作用してアポトーシスを阻害するIAPタンパク質を阻害するものを含め、配列番号：12（GenBank: AF298770）の等価な断片、変種、ならびに配列番号：12を含むおよび/またはその等価物を含む融合タンパク質が含まれる。

「アポトーシス誘導因子」(AIF)の例示的な変種には、配列番号：10（GenBank: AF100928）の等価な断片、変種、ならびに配列番号：10を含むおよび/またはその等価物を含む融合タンパク質が含まれる。AIFは、細胞核においてクロマチン凝縮および大規模なDNA断片化を生じるカスパーゼ非依存的デスエフェクターとしての役割を含め、酸化還元生化学およびアポトーシスにおいて役割を担う。AIFには、細菌酸化還元酵素のファミリーに相同なフラボタンパク質、ならびにクロマチン凝縮および大規模なDNA断片化を含めた核の形態変化を誘導するタンパク質が含まれる。

「チトクロームc」の例示的な変種には、配列番号：72（GenBank: AY339584）の等価な断片、変種、ならびに配列番号：72を含むおよび/またはその等価物を含む融合タンパク質が含まれる。チトクロームcは、主要な脱水素酵素と、分子酸素を水に還元することにより基質を酸化する末端酸化酵素との間の電子伝達を媒介する成分である。この電子伝達反応は、ヘム鉄の酸化-還元に基づく。チトクロームcは、様々な刺激によるアポトーシスの誘導後、ミトコンドリアから放出される。チトクロームcは、Apaf-1、カスパーゼ-9、およびチトクロームcからなるアポトソームの一部である。チトクロームcの放出およびアポトソームの活性化により、カスパーゼ-9、続いてエフェクターカスパーゼカスケードの活性化が起こる。

「ゲルソリン」の例示的な変種には、配列番号：14（GenBank: BC026033）の等価な断片、変種、ならびに配列番号：14を含むおよび/またはその等価物を含む融合タンパク質が含まれる。ゲルソリンは、哺乳動物の細胞質および細胞外液から得られる多機能アクチン結合タンパク質である。血漿ゲルソリンは、分子のアミノ末端における25アミノ酸の付加により細胞ゲルソリンとは異なるが、どちらのゲルソリンも単一遺伝子の産物である。血漿ゲルソリンは3つのアクチン結合部位を有し、G-アクチンまたはF-アクチンに高親和性で結合する。血漿ゲルソリンは、第一アクチン分子に結合するよりも高い親和性で第二アクチン分子と結合し、よって1:1複合体よりも2:1複合体を優先的に形成し、単量体よりもむしろフィラメントと結合する。F-アクチンに添加した場合、血漿ゲルソリンは非タンパク質切断様式でフィラメントを切断し、新たに形成されたフィラメントの一端に結合した状態で残る。遊離のゲルソリン分子が存在する場合、これらは2:1アクチン-ゲルソリン複合体のみが存在するまで連続してアクチンフィラメントを切断し、フィラメントを迅速に脱重合することになる。遊離のゲルソリン分子と（アクチンと）複合体を形成したゲルソリン分子は、機能特性が異なる。遊離のゲルソリンはアクチンフィラメントを切断し得るが、アクチン-ゲルソリン複合体はこれを切断することができない。血漿中のゲルソリンの主な機能は、アクチンフィラメントを切断することである。ゲルソリンがアクチンよりも過剰に存在する場合、ゲルソリン-アクチン複合体のみが生じる；アクチンが過剰である場合には、遊離のアクチンオリゴマーおよびゲルソリン-アクチン複合体が存在する。アクチンの切断は、隣接したアクチン間の非共有結合の非タンパク質分解によって起こる。ゲルソリンの切断活性はマイクロモル濃度のCa2+によって活性化され、ホスファチジルイノシトールビスリン酸(PIP2)およびホスファチジルイノシトール一リン酸(PIP)によって阻害されることが示されている。細胞外のCa.sup.2++濃度はミリモル濃度レベルであり、細胞外液は通常、ゲルソリンを阻害する形態のPIPまたはPIP₂を含まないため、血漿ゲルソリンは細胞外液において構成的に活性化状態である。

「カスパーゼ」の例示的な変種には、ICEを含む酵素ファミリーのメンバーである酵素の等価な断片、変種、およびこの酵素を含む融合タンパク質が含まれる（H. Hara, Natl. Acad. Sci., 94, pp. 2007-2012 (1997)を参照のこと）。カスパーゼは、アポトーシスプログラムの中心である。カスパーゼは、基質切断部位のアスパラギン酸に対して特異性を有するシステインプロテアーゼである。これらのプロテアーゼは主に細胞タンパク質の分解に関与し、分解の結果としてアポトーシスを起こしている細胞で形態変化が見られる。例えば、ヒトで同定されたカスパーゼの1つは、以前、インターロイキン-1β(IL-1β)変換酵素(ICE)、プロIL-1βを活性のあるサイトカインにプロセシングする過程に関与するシステインプロテアーゼとして知られていた。Rat-1線維芽細胞におけるICEの過剰発現により、アポトーシスが誘導される（Miura et al., Cell 75:653 (1993)）。

本発明のミトコンドリアリンゴ酸脱水素酵素部分、DNA断片化最小活性化因子タンパク質およびDNA断片化活性化因子タンパク質の他の等価物には、さらに以下で説明するようなこれらのアミノ酸配列を含む複合体が含まれる。

特に好ましい態様において、本発明に提供されるDNA断片化最小活性化因子タンパク質を含むヒトミトコンドリアリンゴ酸脱水素酵素(MDH)の例示的な部分は、DNA断片化活性化因子タンパク質(「ADF」)配列である配列番号：7であって、ヒトMDHの9 kDa C末端断片であり、これを実施例2〜8で用いる。

「ミトコンドリアリンゴ酸脱水素酵素」および「MDH」という用語は、ヒト（配列番号：4）（GenGenBank: NP_005909）および/またはブタ（配列番号：1）（GenBank: P00346）由来の例示的なアミノ酸配列を互換的に指し、これには等価なその断片、その相同体、およびそれとほぼ同じ分子量を有する配列が含まれる。「リンゴ酸脱水素酵素」は、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼアイソザイムと協力して、リンゴ酸-アスパラギン酸シャトルおよびピルビン酸-リンゴ酸シャトルにおいて中心的な役割を果たすNAD(P)依存性脱水素酵素である。ミトコンドリアNADHまたはNADPHの再生は、リンゴ酸脱水素酵素によって触媒される内因性リンゴ酸からピルビン酸への変換により生じる。この酵素の4つのアイソフォームがヒト組織から単離されている。2つのヒトNAD(P)依存性リンゴ酸脱水素酵素が同定された；一方の形態は平滑筋および横紋筋細胞質中に存在し、もう一方は迅速に増殖する細胞および腫瘍細胞のミトコンドリア中に存在する（Tanaka, T. et al. (1996) Genomics 32:128-130；Loeber, G. et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:3016-3021）。2つのNAD(P)依存性アイソフォームは、ヒト乳癌細胞細胞質およびヒト海馬ミトコンドリアにおいても同定された（Chou, W. Y. (1996) J. Protein Chem. 15:272-279；Loeber, G. et al. Biocehm. J. 304:687-692）。

MDHは核DNAによってコードされる。この酵素は、より大きな前駆体分子として合成され、その後ミトコンドリアに輸送される。N末端領域はこの細胞小器官に標的化されるタンパク質の認識を媒介し、「輸送ペプチド」と称される。ミトコンドリアへの結合および移入時に、輸送ペプチドはタンパク質分解によって除去され、サブユニットが集合して活性のある複合体を形成する。

マウスリンゴ酸脱水素酵素アイソフォームをコードする2つの遺伝子が同定されている；一方は心臓および肝臓に由来するサイトゾルアイソフォームであり、もう一方は肝臓に由来するミトコンドリアアイソフォームである。タンパク質産物は23％の相同性を共有する。ミトコンドリアアイソフォームをコードするmRNAのレベルは、心臓、脳、および腎臓において高く、肝臓において比較的低い。

多形核細胞におけるミトコンドリアリンゴ酸脱水素酵素活性の減少は、7-モノソミー骨髄異形性症候群およびデュセンヌ型筋ジストロフィーの末梢血白血球(PBL)と関連づけられている（Muchi, H. and Ymamoto, Y (1983) Blood 62:808-814；Wisniewska, W. and Lukasiuk, M. (1985) Neurol. Neurochir. Pol. 19:318-322)。ミトコンドリアリンゴ酸脱水素酵素レベルの有意な増加は、ヒト乳癌組織、心筋梗塞後のPBL、ならびに肝細胞臓癌および急性循環障害と関連したPBLにおいて認められている（Balinsky, D. et al. (1984) J. Natl. Cancer Inst. 72:217-224；Wagenknecht, K. et al. (1988) Kardiologiia 28:55-57；Kawai, M. and Hosaki, S. (1990) Clin. Biochem. 23:327-334）。

1つの態様において、MADFおよび/またはADFを含むMDHの部分は、DNAヌクレアーゼ活性および殺細胞活性の1つまたは複数から選択される活性を有する。「DNAヌクレアーゼ活性」および「DNA断片化活性」という用語は、DNAエンドヌクレアーゼ活性および/またはDNAエキソヌクレアーゼ活性を指す等価な用語である。「DNAエンドヌクレアーゼ活性」は、（DNAヌクレアーゼ活性を有する他のタンパク質の活性化による等、直接的または間接的に）二本鎖および/または一本鎖DNA内のホスホジエステル結合の切断を起こす能力を指す。「DNAエキソヌクレアーゼ活性」は、二本鎖および/または一本鎖DNAの5'末端および/または3'末端から、（直接的または間接的に）連続的なヌクレオチド残基および/または短いオリゴヌクレオチドの切断を起こす能力を指す。DNAヌクレアーゼ活性を測定する方法は当技術分野において周知であり、本明細書では、³H-標識DNA断片の放出レベルの増加の測定により例証する（実施例2、図2および図3；実施例4、図5A；実施例5、図6；実施例6、図7；実施例、図7および図8）。例えば、本明細書のデータにより、例示的な配列ADF（配列番号：7）がDNAヌクレアーゼ活性を有することが実証される（実施例4および5）。

「DNA断片化最小活性化因子」タンパク質および「MADF」タンパク質という用語は、ブタ（配列番号：2）（GenBank: P00346）、ヒト（配列番号：6）（GenGenBank: NP_005909）由来の例示的なアミノ酸配列を指し、これには等価なその断片、その変種、およびほぼ同じ分子量の配列が含まれる。

「DNA断片化活性化因子」タンパク質および「ADF」タンパク質という用語は、ブタ（配列番号：3）（GenBank: P00346）、ヒト（配列番号：7）（GenGenBank: NP_005909）由来の例示的なアミノ酸配列を指し、これには等価なその断片、その変種、およびほぼ同じ分子量の配列が含まれる。

「Htra2/Omi」、「アポトーシス誘導因子」、「Smac/DIABLO」、「ゲルソリン」、「Bcl-2」、「Bax」、「Bad」、「Bid」、「EndoG」、「カスパーゼ活性化Dnase」、「CADヌクレアーゼ阻害剤」、「上皮増殖因子」、「血管内皮増殖因子」、「水晶体タンパク質」、「アンテナペディアタンパク質」、「フィブロネクチン1型」、「DNase I」、「DNase II」、「ヒトHOXタンパク質」、「インスリン様増殖因子」、「線維芽細胞増殖因子」、「HIV Tatタンパク質」、「チトクロームC」、「Nix」、「Nip3」、および「CIDE-B」という用語は、それぞれ例示的なアミノ酸配列である配列番号：8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、72、74、76、および78を指し、これには等価なその断片、その変種、およびほぼ同じ分子量の配列が含まれる。

本明細書のデータにより、MDHの例示的な9 kDa C末端ADFペプチド断片が細胞毒性活性を有し（実施例5、6、7および8）、Dnaseを活性化することができ、ICADの切断とは無関係に、単離核内でヌクレオソーム間のDNA切断を誘導する（実施例4および5）という驚くべき発見が示される。このことは、DNAヌクレアーゼ活性および/または殺細胞活性をもたないMDHと対照的である。したがって、CAD/DFF40および/またはカスパーゼ3を欠く細胞において、ADFはDNA断片化を活性化する別の経路を提供する可能性がある。

本明細書のデータにより、アポトーシス過程におけるADFの役割が実証される。例えば、本明細書のデータにより、アポトーシスを起こしているHL-60 neo細胞では、ADFがミトコンドリアからサイトゾルおよび核に移行したが、Bcl-2を過剰発現するアポトーシス耐性HL-60細胞では移行しなかったことが示される。第二に、アポトーシスを起こしている細胞のサイトゾルを、抗rADFを用いて免疫枯渇させることにより、大部分の核DNA断片化活性が排除された。第三の証拠は、細胞全体にrADF-Antを導入することにより、DNA断片化、ひいては細胞死が速やかにかつ強力に誘導されたことである。これには、迅速なDNA断片化を促進するが細胞死には必要でないDEVDaseの緩やかな活性化が関与し、高濃度のVAD-fmkの存在下でさえもなお20時間存在した。

MDHの断片（ADFおよび/またはMADF等）がアポトーシスにおいて役割を担うことは驚くべきことである。MDH（EC 1.1.1.37）は、NADHの存在下で、オキサロ酢酸のリンゴ酸への可逆的還元を触媒する。MDH前タンパク質がミトコンドリアに輸送された後、シグナル配列が切断されて成熟MDHが生じる。本発明者らの結果から、ADFが通常の細胞のミトコンドリアにおいて検出され得ること、およびBcl-2の過剰発現によりUV光に応答したADFの放出が抑制されることが示された。

本発明の機構の理解は必要ではなく、本発明を任意の特定の機構に限定することは意図しないが、ADFはヌクレアーゼではなく、通常の核内に存在するようなヌクレアーゼを直接的または間接的に活性化するというのが本発明者らの見解である。本明細書のデータにより、ICAD/DFF45がrADFで処理したU937核において切断されなかったことから、推定上のヌクレアーゼはおそらくCAD/DFF40ではないことが示される。通常の核内に存在することが報告されている、ADFの標的になり得る他のヌクレアーゼには、c-myc誘導性エンドヌクレアーゼ、DNase1L3およびDNaseγを含むDNaseI様酵素、ならびにミトコンドリアおよび核内に見出されるエンドヌクレアーゼGが含まれる。成熟MDHはアポトーシス過程においてミトコンドリアから放出されたが、アポトーシス過程における役割に関する証拠は報告されていない（Tafani et al. (2000) Am. J. Pathol. 156, 2111-2121）。本明細書のデータによって初めて、ADFがアポトーシスシグナルを核に伝達するいくつかの媒介物のうちの1つであることが実証される。

アポトーシスの機構の現在の理論では、サイトゾルから発生するシグナルによって、クロマチン凝縮ならびに高分子量断片およびヌクレオソーム間断片へのDNA断片化を含む特徴的なアポトーシス核変化が誘導されると提唱している。アポトーシス時には、ミトコンドリア機能の変化および媒介物の放出により、核DNAの断片化がもたらされる。ミトコンドリアから放出されるアポトーシスの媒介物には、ATPの存在下でサイトゾルのApaf-1タンパク質と複合体を形成してカスパーゼ9を活性化するチトクロームcが含まれる。次に、カスパーゼ9はカスパーゼ3を活性化する。しかし、カスパーゼ3単独では単離核においてDNA断片化を活性化することはできず、アポトーシスシグナルを核に伝達する下流の媒介物の研究が促進される。

DNA断片化因子40 (DFF40)と称されるカスパーゼ活性化DNase (CAD)の発見によって（Enari et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. 95:9123-9128）、カスパーゼカスケードとDNA断片化の誘導との間の関連性が提供された。カスパーゼ3はカスパーゼ活性化DNase阻害剤(ICAD)を切断および不活化し（Enari, 1998, 前記）、活性のあるCADを放出することが示された。このDNaseがアポトーシスのすべての形態に共通した媒介物であるかどうかは未知である。しかし、脳、肺、肝臓、骨格筋、胸腺、精巣、および小腸を含む多くの組織がCADを発現しないという事実から、核DNA断片化の他の媒介物が存在するらしいことが本発明者らに示唆される。さらに、DFF45 (ICAD)ノックアウトマウスは生存可能であり、正常な免疫系の発達を示し、主要な器官に明らかな異常は認められず、このことから、CADの非存在下において、さらなる予備的なエンドヌクレアーゼおよびシグナル系が、発生のプログラム細胞死を媒介し得ることが示唆される。

本発明の機構の理解は必要ではなく、本発明を任意の特定の機構に限定することは意図しないが、ADFおよびその標的ヌクレアーゼがカスパーゼ、AIF、CAD、または他のエンドヌクレアーゼ等の他の酵素と相乗的に作用して、細胞内で迅速なDNA断片化を誘導し得るというのが本発明者らの見解である。MDHは偏在的に発現されるため、ADFは、カスパーゼ依存的細胞死を含むアポトーシスにおける一般的なシグナル伝達分子である可能性があるというのが本発明者らの見解である。

1つの態様では、本発明のアミノ酸配列（MDH部分、MADF、ADF等を含むアミノ酸配列等）を単離する。本明細書で用いる「単離された」、「単離する」、「単離」、「精製された」、「精製する」、「精製」という用語、およびこれらの文法上の相当語句は、試料からの少なくとも1つの混入物（タンパク質および/または核酸配列等）の量の減少を指す。したがって、精製により、「濃縮」が起こる、すなわち試料中の所望のタンパク質および/または核酸配列の量が増加する。例えば、精製すべきポリペプチドを、リガンドに結合し得る別の分子に融合することができる。リガンドを固相支持体に固定化して、融合ポリペプチドの単離を容易にすることができる。ポリペプチドの単離に有用なリガンド結合系は市販されており、これには例えば、（ヒトポリクローナルIgGに結合する）ブドウ球菌プロテインAおよびその誘導体ZZ、（Ni²⁺に結合する）ヒスチジン尾部、（ストレプトアビジンに結合する）ビオチン、（アミロースに結合する）マルトース結合タンパク質(MBP)、（グルタチオンに結合する）グルタチオンS-トランスフェラーゼ、Ni²⁺クロマトグラフィーと組み合わせた6-8ヒスチジンタグが含まれる。本発明のポリペプチドプローブは、任意の特定の単離系に限定されないことが意図される。

1つの態様において、本発明のアミノ酸配列（MDH部分、MADF、ADF等を含むアミノ酸配列等）は組換え体である。核酸配列および/またはアミノ酸配列に適用する「組換え体」とは、その配列が分子生物学的技法（例えば、クローニング、酵素制限、および/または連結段階）を用いて産生されることを意味する。

B. 本発明の配列を含む複合体
本発明は、第二分子に機能的に連結される1つまたは複数コピーの殺細胞分子を含む複合体を提供する。「複合体」という用語は、共有結合によってであろうと非共有結合によってであろうと、共に（直接または間接的に）連結された2つまたはそれ以上の分子（ポリペプチド、核酸配列、有機分子、無機分子等）を指す。複合体の分子は、同じであっても異なってもよい。

殺細胞分子は、これらに限定されないが、ミトコンドリアタンパク質（MADF（配列番号：6）およびADF（配列番号：7）の1つまたは複数を含むMDH（配列番号：4）の部分、Htra/Omi（配列番号：8）、アポトーシス誘導因子（配列番号：10）、Smac/DIABLO（配列番号：12）、EndoG（配列番号：24）、チトクロームC（配列番号：72）、Nix（配列番号：74）、Nip3（配列番号：76）、およびCIDE-B（配列番号：78）等）および非ミトコンドリアタンパク質（ゲルソリン（配列番号：14）、Bax（配列番号：18）、Bad（配列番号：20）、Bid（配列番号：22）、カスパーゼ活性化DNase（配列番号：26）、DNase I（配列番号：40）、DNase II（配列番号：42）等）が含まれる。

本発明の殺細胞分子の利点は、薬剤耐性腫瘍細胞を含む腫瘍細胞に対して強い毒性があり、分子がヒト供給源に由来するかまたはヒト供給源の配列と相同である場合に、ヒト対象において免疫原性がない点である。

「複合体」という用語は、共有結合または非共有結合（ビオチン-アビジン相互作用、ビオチン-ストレプトアビジン相互作用、コイル-コイル相互作用における結合等）を介して、（例えば、組換えによりまたは化学的に）相互に直接または間接的に連結された2つの分子を含む分子と定義される。1つの態様において、連結された分子は別の機能（例えば、細胞毒性機能、細胞結合機能等）を有する。1つの態様において、複合体分子は、炭素-炭素結合を介するような、切断不可能な共有結合により連結され得る。または、複合体分子は、還元剤によって切断可能なジスルフィド結合、エステラーゼによって切断可能なエステル結合、またはプロテアーゼによって切断可能なペプチド結合等の、切断可能な結合により連結され得る。切断可能な結合は、複合体の2つの分子を分離するために望ましい場合がある。関心対象の分子は、本発明のアミノ酸配列（MDH部分、MADF、ADFを含むアミノ酸配列等）のN末端および/またはC末端アミノ酸に連結することができる。

1つの態様において、複合体の殺細胞分子は第二分子に機能的に結合されている。例示的な第二分子には、細胞マーカー認識分子が含まれる。例示的な細胞マーカー認識分子には、これらに限定されないが、本明細書においてさらに説明するような抗体、酵素、および細胞受容体のリガンドが含まれる。「細胞マーカー認識分子」および「細胞マーカー認識化合物」という用語は、細胞マーカー分子に特異的に結合する分子（タンパク質、糖タンパク質等）を指す。殺細胞分子および細胞マーカー認識分子を含む本発明の複合体は、本明細書において「免疫複合体」と称する。複合体において本発明の殺細胞分子と共に細胞マーカー認識分子を用いることの利点は、細胞マーカー認識分子が本発明の殺細胞分子を関心対象の細胞に特異的に標的化し、その結果非標的細胞に対する殺細胞分子の毒性を減少させる点である。

「細胞分子」および「細胞の分子」という用語は、細胞内に位置しようと、細胞上に位置しようと、または（例えば、細胞溶解、細胞死の後等に）細胞外に位置しようと、細胞によって産生される任意の分子（タンパク質、糖質、糖タンパク質、糖脂質、核酸配列等）を指す。

細胞分子には細胞マーカー分子が含まれる。「細胞マーカー分子」および「マーカー分子」という用語は、特定の細胞種（癌細胞、上皮細胞、線維芽細胞、筋細胞、滑膜細胞、幹細胞、胚細胞等）上に他の細胞種よりも高レベルで存在する、および/または特定の細胞種によって他の細胞種よりも高レベルで産生される細胞分子を指す。細胞マーカー分子を用いて、1つの細胞種を他の細胞種と識別することができる。

例示的な細胞マーカー分子は、以下でさらに説明する以下のタンパク質によって例示される：（PLC/PRF/5細胞によって産生されるような）PLC1、PLC2、およびPLC3、SM3（LacCer-II3-硫酸）およびSD1a（GgOse4CerII3,IV3-二硫酸）等の硫酸化糖脂質および強酸性糖脂質（Hiraiwa et al 1990 前記）、αフェトプロテイン(AFP)、見かけの分子量約40,000〜60,000ダルトンの膜タンパク質、インスリン、アンジオテンシンII、アデノシンI、-アドレナリン、およびラット脳ニコチンの受容体ならびにアヘン剤受容体（Carlsson and Glad (1989) Bio/Technology 7:567-73）、チロシンキナーゼ、Gタンパク質共役受容体、KM-2糖タンパク質抗原（Kumagai et al., 1992 前記）、AF-20抗原、（PLC/PRF/5細胞中に存在するような）ガングリオシド、B細胞受容体、CD22、CD33、腎臓γ-グルタミルトランスフェラーゼ、ムチン型糖タンパク質、トランスフェリン受容体、癌胎児性抗原、Lewis(y)抗原、p185^HER-2、erbB2、E-セレクチン、bFGF、bFGF受容体、黄体形成ホルモン放出ホルモン(LHRH)、LHRH受容体、IL-4受容体、ソマトスタチン、ソマトスタチン受容体、エンドグリン、血管内皮増殖因子(VEGF)、VEGF受容体等。

細胞分子には、細胞表面分子および細胞内分子が含まれる。「細胞表面分子」とは、少なくともその一部が形質膜に付着しているおよび/または形質膜を貫通している細胞分子を指す。好ましい態様において、細胞表面分子の少なくとも一部は、細胞の外側の分子に接近できるように形質膜の細胞外側に位置する。例えば、（例えば野生型細胞によりおよび/または遺伝子操作により）筋幹細胞の表面上で発現されるが、細胞集団の他の細胞では発現されないポリペプチドは、筋幹細胞のマーカータンパク質として役立つ。細胞表面分子には、（例えば、マーカー分子を発現する細胞について濃縮された細胞集団を生成するための細胞選別方法において）抗体が特異的に結合する抗原等の「細胞表面マーカー分子」が含まれる。

本発明の殺細胞分子に連結され得る第二分子の他の例には、これらに限定されないが、細胞種特異的殺細胞試薬を作製するために抗体または受容体結合リガンドに結合させたタンパク質、糖タンパク質、アミノ酸配列、ヌクレオチド配列、放射標識および蛍光標識等のレポーター分子、キレート剤、細胞毒素、およびデキストラン等の担体（米国特許第6,409,990号）、リポソーム（Hood et al., Science 296, 2402-2405 (2002)）、ポリエチレングリコール（Lee et al., Bioconjug Chem 10:973-81 (1999)）、アクリル酸、有機薬剤（メトトレキセート、アドリアマイシン、クロランブシル等）、化学療法薬（5-フルオロウラシル、ロイコボリン、トムデックス、マイトマイシンC、CPT-11、または3-ブロモピルビン酸等）、放射性核種、酵素、リボソーム阻害タンパク質、ならびにリシン、ジフテリア毒素、およびシュードモナス毒素によって例示されるような植物および動物に由来する毒素酵素が含まれる（Youle, et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA77:5483 (1980)；Gilliland et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA77:4539 (1980)；Krolick, et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA77:5419 (1980)）。

腫瘍においてインビトロおよびインビボで細胞死を引き起こすために複合体（免疫複合体等）を用いる方法は、当技術分野において周知である（Griffin, et al., IMMUNOTOXINS, p433, Boston/Dordrecht/Lancaster, Kluwer Academic Publishers, (1988)；Vitetta, et al., Science238:1098 (1987)；Fitzgerald, et al., J. Nat'l. Cancer Inst. 81:1455 (1989))。

本発明の配列を含む複合体は、例えば化学的結合反応および/または組換え技法を用いるもの等、周知である。本発明の配列（MDA部分、MADF、ADF等）を他の分子（多糖、タンパク質、脂質、リポソーム、核酸等）に化学的に連結する方法は、当技術分野において周知である。例えば、多糖をペプチドに結合する方法は、カップリング試薬としてスクアリン酸ジエステル（1,2-ジエトキシシクロブテン-3,4-ジオン）を用いる、α-またはε-アミノ基を介したNaIO4活性化オリゴ糖への結合、多糖が還元末端を有しカルボキシル基をもたない場合のペプチドリンカーを介した結合（米国特許第5,342,770号）、ヒト熱ショックタンパク質hsp65に由来する合成ペプチド担体を用いる結合（米国特許第5,736,146号）、および米国特許第4,639,512号の方法の使用によって例示されるが、これらに限定されない。タンパク質をタンパク質に結合する方法には、ヒト熱ショックタンパク質hsp65に由来する合成ペプチド担体を用いる結合（米国特許第5,736,146号）、ペプチドを抗体に結合するために用いられた方法（米国特許第5,194,254号；第4,950,480号）、ペプチドをインスリン断片に結合するために用いられた方法（米国特許第5,442,043号）、米国特許第4,639,512号の方法、およびEDAC（1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド）媒介アミド形成により環状デカペプチドポリミキシンB抗生物質をIgG担体に結合する方法（例えば、Drabick et al., Antimicrob. Agents Chemother., 42:583-588 (1998)を参照のこと）が含まれる。核酸をタンパク質に結合するアプローチもまた、例えば米国特許第5,574,142号；第6,117,631号；および第6,110,687号（それぞれその全体が参照として組み入れられる）に記載されているもの等、当技術分野において周知である。脂質をペプチドに結合する方法は、これらに限定されないが、還元的アミノ化ならびに2級アミンまたは3級アミンを含むエーテル結合の使用（米国特許第6,071,532号）、米国特許第4,639,512号の方法、ペプチドを単層リポソームに共有結合させるために用いられた方法（Friede et al., Vaccine, 12:791-797 (1994)）、ヘテロ二官能性試薬N-スクシニミジル-S-アセチルチオアセテート(SATA)を用いてヒト血清アルブミンをリポソームに結合する方法（Kamps et al. Biochim. Biophys. Acta, 1278:183-190 (1996)）、リン脂質-ポリ(エチレングリコール)-マレイミドアンカーを用いて抗体Fab'断片をリポソームに結合する方法（Shahinian et al., Biochim. Biophys. Acta, 1239;157-167 (1995)）、およびシステイン-セリンスペーサーアミノ酸を介してマラリア原虫CTLエピトープをパルミチン酸に結合する方法（Verheul et al,, J. Immunol. Methods, 182:219-226 (1995)）を含めて、当技術分野において記載されている。または、2つのタンパク質の複合体は、組換え技法により作製して融合タンパク質を形成してもよい。

1. N末端シグナルペプチドを含む複合体、2. 細胞内部移行ペプチドを含む複合体、3. 核局在化ペプチドを含む複合体、4. 核種を含む複合体、5. ビオチン結合タンパク質を含む複合体、6. タンパク質を含む複合体、および7. 抗体を含む複合体いう項目で、例示的な複合体を以下にさらに説明する。

1. N末端シグナルペプチドを含む複合体
1つの態様において、本発明の配列（MDH部分、MADF、ADF等）を含み、かつ本発明の範囲内である複合体は、1つまたは複数のN末端シグナルペプチドを含む。「N末端シグナルペプチド」、「N末端シグナル配列」、「シグナルペプチド」、および「シグナル配列」という用語は、（必ずとは限らないが）通常タンパク質のN末端部分内に位置し、タンパク質の細胞の外側への分泌を促進するアミノ酸の配列を指す。シグナル配列は分泌過程において切断されることがあり、したがってシグナル配列を欠くタンパク質が生じる。使用に適した分泌シグナルは幅広く入手可能であり、当業者には周知である（von Heijne, J. Mol. Biol. 184: 99-105, 1985）。シグナル配列は、これらに限定されないが、以下の大腸菌遺伝子：pelB（Lei et al., J. Bacterial. 169: 4379, 1987）、phoA、ompA、ompT、ompF、ompC、β-ラクタマーゼ、およびアルカリホスファターゼによってコードされる分泌シグナルを含む、大腸菌（または他の宿主）において機能的である原核生物および真核生物分泌シグナルによって例示されるが、これらに限定されない。

2. 細胞内部移行ペプチドを含む複合体
別の態様において、本発明のタンパク質（MDH部分、MADF、ADF等）を含み、かつ本発明の範囲内である複合体は、1つまたは複数の細胞内部移行ペプチドを含む。本発明の融合タンパク質に1つまたは複数の内部移行配列を含めることは、本発明のタンパク質（MADFおよびADFの1つまたは複数を含むMDHの部分、Htra/Omi、アポトーシス誘導因子、Smac/DIABLO、EndoG、チトクロームC、Nix、Nip3、CIDE-B、ゲルソリン、Bax、Bad、Bid、カスパーゼ活性化DNase、DNase I、およびDNase II）のDNAヌクレアーゼ活性および/または殺細胞活性をもたらすことを所望する場合に有利である。例えば、内部移行により、複合体が細胞膜の外側に存在することに関連し得る副作用を減少させつつ、複合体がその効果を発揮することが可能となる。さらに、本発明のタンパク質の内部移行は、（動物に投与した後等の）毒性副作用を減少させることが好ましい場合の適用において有利である。

「細胞内部移行ペプチド」という用語は、内部移行ペプチドに連結されたタンパク質の細胞質膜を通り抜けた細胞質内への移行を増加させるペプチドを指す。細胞内部移行ペプチドを含む融合タンパク質の内部移行は、細胞質内の融合タンパク質の存在および/またはその活性を測定する段階を含む、本明細書に記載するような（実施例5）、当技術分野において周知の方法により測定することができる。例示的な細胞内部移行ペプチドには、ペネトラチン

が含まれる。ペネトラチンは、ショウジョウバエホメオドメイン転写因子アンテナペディアに由来する16アミノ酸ペプチドである（Derossi et al., 1998, Trends Cell Biol 8:84-87に概説されている）。本発明のデータにより、ペネトラチンが効率的に融合タンパク質(rADF-Ant)内のrADFを正常細胞（実施例5）および腫瘍細胞（実施例6および7）に移行させることが実証される。細胞内部移行ペプチドの他の例には、HIV-1 Tat（アミノ酸37〜72）

；切断型Tat（アミノ酸48〜60）

；HIV-1 Rev（アミノ酸34〜50）

；HSV-1構造タンパク質VP22（アミノ酸#1〜367）（Elliot et al. 1997 Cell 88:223-233）を含む、6〜9個のアルギニン残基を含む配列；およびPep-1

が含まれる。他の上記ペプチドとは異なり、Pep-1は、カーゴに物理的に連結されることなく、細胞膜を通り抜けてカーゴを輸送することができる。

3. 核局在化ペプチドを含む複合体
さらなる態様において、本発明のタンパク質（MDH部分、MADF、ADF等）を含み、かつ本発明の範囲内である複合体は、1つまたは複数の核局在化ペプチドを含む。「核局在化ペプチド」という用語は、内部移行ペプチドに連結されたタンパク質の核膜を通り抜けた核内への移行を増加させるペプチドを指す。核局在化ペプチドを含む融合タンパク質の内部移行は、核内の融合タンパク質の存在および/またはその活性を測定する段階を含む、当技術分野において周知の方法により測定することができる。例示的な細胞内部移行ペプチドには、SV40Tに由来する（配列番号：62）PKKKRKV；c-Myc由来配列（配列番号：63）：PAAKRVKLD（Dang et al. 1988 Mol Cell Biol. 8:4048-4054）；HIV-1 Tat由来配列：（配列番号：64）：GRKKRRQRRRAP（Dang et al. 1989 J Biol Chem 264:18019-18023；c-Myb由来配列（配列番号：65）：PLLKKIKQ（Dang et al. 1989 前記）；N-myc由来配列（配列番号：66）：PPQKKIKS（Dang et al. 1989 前記）；P53由来配列（配列番号：67）：PQPKKKP（Dang et al. 1989 前記）；c-erb-A由来配列（配列番号：68）：SKRVAKRKL（Dang et al. 1989 前記）；およびラクトフェリン由来配列（配列番号：69）：GRRRR（Penco et al. 2001 Biotechnol Appl Biocehm 34:151-159）が含まれる。

4. 核種を含む複合体
さらなる態様において、本発明のタンパク質（MDH部分、MADF、ADF等）を含み、かつ本発明の範囲内である複合体は、アンチモン-124、アンチモン-125、ヒ素-74、バリウム-103、バリウム-140、ベリリウム-7、ビスマス-206、ビスマス-207、カドミウム-109、カドミウム-115m、カルシウム-45、セリウム-139、セリウム-141、セリウム-144、セシウム-137、クロム-51、152、ガドリニウム-153、金-195、金-199、ハフニウム-175、ハフニウム175-181、インジウム-111、イリジウム-192、鉄-55、鉄-59、クリプトン-85、鉛-210、マンガン-54、水銀-197、水銀-203、モリブデン-99、ネオジム-147、ネプツニウム-237、ニッケル-63、ニオブ-95、オスミウム-185+191、パラジウム-103、白金-195m、プラセオジム-143、プロメチウム-147、プロトアクチニウム-233、ラジウム-226、レニウム-186(Rhemum-186)、ルビジウム86、ルテニウム-103、ルテニウム-106、スカンジウム-44、スカンジウム46、セレン-75、銀-110m、銀-111、ナトリウム-22、ストロンチウム-85、ストロンチウム-89、ストロンチウム-90、硫黄-35、タンタル-182、テクネチウム-99m、テルル-125、テルル-132、タリウム-204、トリウム-228、トリウム-232、タリウム-170、スズ-113、チタン-44、タングステン-185、バナジウム-48、バナジウム-49、イッテルビウム-169、イットリウム-88、イットリウム-90、イットリウム-91、亜鉛-65、およびジルコニウム等の、1つまたは複数の「放射性核種」を含む。好ましい態様において、核種は、それ自体が本発明の殺細胞分子に結合された細胞分子に結合される。

5. ビオチン結合タンパク質を含む複合体
さらに別の態様において、本発明のタンパク質（MDH部分、MADF、ADF等）を含み、かつ本発明の範囲内である複合体は、1つまたは複数のビオチン結合タンパク質（ビオチンに特異的な抗体等）を含む。

6. タンパク質を含む複合体
1つの態様において、本発明の複合体には、1つまたは複数の殺細胞分子を含む融合タンパク質が含まれる。1つの態様において、殺細胞分子は、MADF（配列番号：6）およびADF（配列番号：7）の1つまたは複数を含むMDH（配列番号：4）の部分、Htra/Omi（配列番号：8）、アポトーシス誘導因子（配列番号：10）、Smac/DIABLO（配列番号：12）、EndoG（配列番号：24）、チトクロームC（配列番号：72）、Nix（配列番号：74）、Nip3（配列番号：76）、およびCIDE-B（配列番号：78）によって例示されるミトコンドリアタンパク質である。別の態様において、殺細胞分子は、ゲルソリン（配列番号：14）、Bax（配列番号：18）、Bad（配列番号：20）、Bid（配列番号：22）、カスパーゼ活性化DNase（配列番号：26）、DNase I（配列番号：40）、およびDNase II（配列番号：42）によって例示される非ミトコンドリアタンパク質である。

「融合タンパク質」という用語は、機能的に連結される2つまたはそれ以上のポリペプチドを指す。核酸配列間および/またはアミノ酸配列間の関係に関する場合の「機能的に連結される」という用語は、それらの目的とする機能を行えるような配列の連結を指す。例えば、プロモーター配列を関心対象のヌクレオチド配列に機能的に連結させることとは、プロモーター配列が関心対象のヌクレオチド配列の転写および/または関心対象のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドの合成を指示し得る様式における、プロモーター配列と関心対象のヌクレオチド配列との連結を指す。同様に、分泌リーダーをコードするDNAは、それが関心対象のポリペプチドの分泌に関与するポリペプチドとして発現される場合、関心対象のポリペプチドをコードするDNAに機能的に連結される；プロモーターまたはエンハンサーは、それが配列の転写をもたらす場合、コード配列に機能的に連結される；リボソーム結合部位は、それが翻訳を増大させるように位置づけられる場合、コード配列に機能的に連結される。必ずではないが一般に、「機能的に連結される」とは連結されるDNA配列が隣接していることを指し、分泌リーダーの場合には隣接していることおよび読み枠内にあることを指す。しかし、エンハンサーおよび他の配列は隣接する必要はない。連結は、簡便な制限部位における連結によって達成される。そのような部位が存在しない場合には、従来の慣習に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを用いる。この用語はまた、機能的なタンパク質が産生されるような様式における、アミノ酸配列の連結も指す。

例えば、本発明の複合体は、ミトコンドリアリンゴ酸脱水素酵素(MDH)部分、DNA断片化最小活性化因子タンパク質(MADF)、およびDNA断片化活性化因子タンパク質(ADF)の1つまたは複数の1つまたは複数のコピーを含む。本明細書のデータから、ペネトラチン（細胞内部移行ペプチド）に遺伝子的に融合され、融合タンパク質rADF-Antとして発現される組換えADFが、単離された腫瘍細胞の核においてヌクレオソーム間のDNA断片化を誘導したことが実証される。本明細書のデータから、AntまたはbFGF等の細胞透過ペプチドに遺伝子的に融合させた場合、ADFは種々の腫瘍細胞種を強力に死滅させたことが示される（実施例6）。本明細書のデータから、ADFを別のタンパク質に連結させてもその活性が消失しないことが実証されるため、rADFをscFvに融合することによりrADFの殺細胞活性および/またはヌクレアーゼ活性は減少しないであろうというのが本発明者らの見解である。本明細書のデータから、化学療法薬耐性細胞の7つの異なるモデル系の試験において、選択された細胞変異体のそれぞれが、例示的なrADF-Antによる死滅に対してやはり完全に感受性があることも示される（実施例7〜8）。FNへの接着によってより強力に耐性にした本質的に薬剤耐性である肝細胞癌（「HCC」）株でさえも、なおrADF-Antに対して感受性を示した。したがって、この非常に強力なヒトペプチドは、本明細書に記載する抗-HCC scFvを武装させる理想的な弾頭である。

別の態様において、本発明の複合体は、1つまたは複数の、Bax、Bad、およびBid等のBcl-2ファミリーメンバーを含み得る。「BCL-2」という用語には、配列番号：16（GenBank: M14745）の等価な断片および変種が含まれる。BCL-2は、染色体18に位置するヒト癌原遺伝子である。その産物は、小胞体(ER)膜、核膜、およびミトコンドリアの外膜内に位置する内在性膜タンパク質（Bcl-2と称する）である。その遺伝子は、B細胞白血病において転座した遺伝子座として発見された（よってこの名称がある）。Bcl-2はそれ自体、抗アポトーシスタンパク質であり、非ホジキンリンパ腫において染色体転座によって活性化され、また多くの固形腫瘍において不適切に過剰発現され、化学療法および放射線誘導性アポトーシスに対する耐性に寄与する。多くの他の既知ヒト発癌遺伝子と異なり、Bcl-2は、細胞分裂を促進するよりもむしろ細胞生存を増強することによりその作用を発揮する。Bcl-2タンパク質はアポトーシスを制御し、細胞死を阻害するかまたは促進する働きをする。Bcl-2およびBcl-xL等のメンバーの過剰発現により、アポトーシス過程が阻害される（Huang Z. 2000. Bcl-2 family proteins as targets for anticancer drug design. Oncogene 19(56): 6627-6631；Reed JC. 1997. Double identity for proteins of the Bcl-2 family. Nature 387(6635): 773-776）。Bcl-2ファミリーメンバーはまた、さらにアポトーシスを調節するために二量体化することを特徴とする。

BaxおよびBakは、ミトコンドリアからのチトクロームc放出において重要な役割を果たし、ひいてはアポトーシスを起こすことが示されている（Wei et al., 2001. Proapoptotic BAX and BAK: a requistite gateway to mitochondrial dysfunction and death. Science 292(5517): 624-626）。

別の態様において、本発明の複合体は1つまたは複数コピーのBadを含む。「Bad」という用語には、配列番号：20（GenBank:AF031523）の等価な断片および変種が含まれる。Badは、Bcl-xLと二量体化し、Baxの置換を引き起こすことにより、Bax媒介性アポトーシス経路において重要な役割を果たす。Baxの置換により、アポトーシスの進行が可能になる（Yang et al., 1995. Bad, a heterodimeric partner for Bcl-XL and Bcl-2, displaces Bax and promotes cell death. Cell 80(2); 285-291）。Bcl-xLの短い型であるBcl-xS（アミノ酸126〜188を欠く）は、明らかにBaxとは異なる経路を利用して細胞死を誘導する。いくつかの研究から、Bcl-xSはカスパーゼを制御する新規な機構を用いるか、または別の細胞死エフェクター経路を用い得ることが示唆される（Fridman et al. 2001. Cytochrome c depletion upon expression of Bcl-XS. J Biol Cehm 276(6): 4205-10；Lindenboim L, Yuan J. Stein R. 2000. Bcl-xS and Bax induce different apoptotic pathways in PC12 cells. Oncogen 19(14): 1783-1793）。

さらなる態様において、本発明の複合体は1つまたは複数コピーのBIDを含む。「BID」という用語には、配列番号：22（GenBank:AF250233）の等価な断片および変種が含まれる。BIDは、Fas受容体活性化カスパーゼ-8とミトコンドリアからのチトクロームcの放出との関連性を提供する因子として最近同定された（Luo et al., 1998, Cell, 94: 481-490、およびLi et al., 1998, Cell, 94: 491-501）。この因子は、BID、そのBH3ドメインを介してBcl-2およびBaxと相互作用することが知られているBH3サブファミリーのメンバーである（Wang et al., 1996, Genes Dev., 10: 2859-2869）。BID（26 kDa）は、カスパーゼ-8によって15 kDa（C末端）および11 kDa（N末端）に切断される。15 kDa断片tBID（＝切断型BID）はBH3ドメインを含み、実際にチトクロームcの放出に関するBIDの機能的部分である。カスパーゼ-8により切断された後、C末端BID断片（tBID）がミトコンドリアに移行することが示された。経時的な実験において、生細胞（Jurkat）のFas刺激後、カスパーゼ-8、BID、カスパーゼ-3、およびDFFの経時的な活性化が示された。

別の態様において、本発明の複合体は1つまたは複数コピーのBaxを含む。「Bax」という用語には、配列番号：18（GenBank: NM_138764）の等価な断片および変種が含まれる。NMRによって決定されたBIDの溶液構造から、2つのアポトーシス促進性作用機序が示唆される：(1) BIDはそのBH3ドメインにより抗アポトーシス性Bcl-XLと相互作用し、それによりBcl-XLとApaf1との間の抗アポトーシス複合体の形成を抑制し得る。カスパーゼによるBIDの切断は、Bcl-XLとのヘテロ二量体化を増強すると予想される；(2) BIDは孔形成の構造モチーフを含み、切断後、場合によってはそれがBAXに類似した選択的イオンチャネルを形成し得り、Bcl-2タンパク質を阻害する以外の方法で、およびそのBH3ドメインに非依存的にアポトーシスを促進する可能性がある（Chou et al., 1999, Cell, 96: 615-624；McDonnell et al., 1999, Cell, 96: 625-634）。

本発明の複合体は、EndoG、DNase I、DNase II、カスパーゼ活性化DNase (CAD)等の1つまたは複数の細胞内ヌクレアーゼを含み得る。複合体はまた、ICADによる阻害に対して全長CADよりも耐性が高いCADの断片を含み得る。

「EndoG」という用語には、配列番号：24（GenBank: NM_004435）の等価な断片および変種が含まれる。EndoGは、アポトーシスに関与するミトコンドリアタンパク質である。EndoGは核遺伝子によってコードされ、サイトゾル中で翻訳され、その後ミトコンドリアに輸送される。ミトコンドリアDNA合成を開始するためのRNAプライマーを形成することにより、ミトコンドリアの複製に関与することが提唱されている。EndoGがGCリッチなDNA基質を好み、これがミトコンドリアDNAの複製起点に似ているために、提唱された機能はその位置および基質特異性に基づいた。アポトーシス性ミトコンドリアからのEndoGの放出は、チトクロームcの放出と類似した割合で起こり、よってEndoGもやはりミトコンドリア膜間腔に存在することが示唆される。一度放出されると、EndoGはヌクレオソームのDNA断片化を誘導し得る。DFF/CAD（DNA断片化因子/カスパーゼ活性化デオキシリボヌクレアーゼ）、活性化のためにDFF45/ICAD（DFFの45-kDaサブユニット/CAD阻害剤）のカスパーゼ-3切断を必要とするアポトーシスヌクレアーゼとは異なり、EndoG活性はカスパーゼ活性化に非依存的である。さらに、EndoG活性は、紫外線および腫瘍壊死因子での処理によるアポトーシスの誘導後に、DFF45欠損マウス胚性線維芽細胞において見られるDNA断片化に関与している可能性がある。

「デオキシリボヌクレアーゼI」という用語には、配列番号：40（GenBank: AJ298844）の等価な断片および変種が含まれる。デオキシリボヌクレアーゼIは、好ましくはピリミジンヌクレオチドに隣接したホスホジエステル結合を開裂して、3'末端に遊離の水酸基を有する5'リン酸末端ポリヌクレオチドを生じるエンドヌクレアーゼである。限界消化の平均鎖は4ヌクレオチドである。DNase Iは、一本鎖DNAおよび二本鎖DNAおよびクロマチンに作用する。クロマチンの場合、ヒストンがヌクレアーゼ作用に対する感受性を制限するが、ある期間にわたってほぼすべてのクロマチンDNAが作用を受ける。

「デオキシリボヌクレアーゼII」(DNase II)という用語には、配列番号：42（GenBank: AF060222）の等価な断片および変種が含まれる。DNase IIは、アポトーシス細胞におけるDNA分解に関係づけられているリソソームDNaseである。

「カスパーゼ活性化DNase」(CAD)という用語には、配列番号：26（GenBank: AB013918）の等価な断片および変種が含まれる。CADは、DNAラダーアッセイで見られるような、DNAのヌクレオソーム単位への断片化を引き起こす。通常、CADはICAD（CADの阻害剤、DNA断片化因子45としても知られる）との不活性複合体として存在する。アポトーシス過程において、ICADがカスパーゼ-3を含むカスパーゼによって切断され、CADが放出される。CADは高い比活性を有する（DNase IおよびDNase IIと匹敵するかまたはそれよりも高い）DNaseであるため、核DNAの迅速な断片化が次に起こる。

7. 抗体を含む複合体
本発明のタンパク質（MADFおよびADFの1つまたは複数を含むMDHの部分、Htra/Omi、アポトーシス誘導因子、Smac/DIABLO、EndoG、チトクロームC、Nix、Nip3、CIDE-B、ゲルソリン、Bax、Bad、Bid、カスパーゼ活性化DNase、DNase I、およびDNase II）との例示的な融合パートナーには、抗体が含まれる。「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は互換的に用いられ、免疫原によって動物において誘発され、免疫原、より具体的には免疫原に含まれる1つまたは複数のエピトープに対する特異性を示す糖タンパク質またはその一部（一本鎖抗体を含む）を指す。「抗体」という用語には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、天然抗体、ならびに例えば一本鎖抗体、キメラ抗体、二機能性抗体、非免疫化(deimmunized)抗体、およびヒト化抗体を含む非天然抗体、ならびに例えば抗体のFab、F(ab')₂、Fab断片、Fd断片、およびEv断片を含むそれらの抗原結合断片、ならびにFab発現ライブラリーが含まれる。

「抗体」という用語は、任意の供給源（例えば、ヒト、げっ歯類、非ヒト霊長類、ヤギ、ウシ、ウマ、ヒツジ等）から得られる任意の免疫グロブリン（例えば、IgG、IgM、IgA、IgE、IgD等）を包含することが意図される。抗体をコードする遺伝子には、κ、λ、α、γ、δ、ε、およびμ定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖は、κまたはλとして分類される。重鎖は、それぞれ免疫グロブリンクラスIgG、IgM、IgA、IgD、およびIgEを規定するγ、μ、α、δ、またはεとして分類される。抗体のいくつかの異なる領域は、保存配列を含む。Kabat et al., Sequence of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987によって、例示的な保存配列を示す広範なアミノ酸および核酸配列データが蓄積されている。

1つの態様において、抗体は四量体を含む。四量体は、それぞれの対が1本の「軽」鎖（約25 kDa）および1本の「重」鎖（約50〜70 kDa）を有する、2つの同一なポリペプチド鎖の対からなる。各鎖のN末端は、主に抗原認識に関与する約100〜110またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を規定する。可変軽鎖(VL)および可変重鎖(VH)という用語は、それぞれこれらの軽鎖および重鎖を指す。1つの態様において、重鎖または軽鎖の可変領域は、それぞれ保存配列の程度を含めた可変性の程度が比較的低い4つのフレームワーク領域を含む。フレームワーク領域は典型的に、いくつかのまたはすべての免疫グロブリン種にわたって保存されており、したがってその中に含まれる保存配列は、いくつかの免疫グロブリン種を有するレパートリーを調製するために特に適している。

「ポリクローナル抗体」という用語は、形質細胞の2つ以上のクローンから産生される免疫グロブリンを指す；これに対して、「モノクローナル抗体」は、形質細胞の単一クローンから産生される免疫グロブリンを指す。モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体は、精製されてもされなくてもよい。例えば、粗製抗血清中に含まれるポリクローナル抗体は、この未精製状態で使用してもよい。

当業者は、所望のポリペプチドに特異的なポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を作製する方法を理解している。モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を作製するには、ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ等を含むがこれらに限定されない種々の宿主動物に、本発明の関心対象の任意の分子に相当するペプチドを注射により免疫し得る。モノクローナル抗体を調製するには、持続的な細胞株による抗体分子の産生を提供する任意の技法を用い得る（例えば、Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYを参照のこと）。これには、最初にKohlerおよびMilstein（Kohler and Milstein, Nature, 256:495-497 (1975)）によって開発されたハイブリドーマ法、無菌動物を用いるおよびPCT/US90/02545に記載されているような技術を利用する方法、ならびにトリオーマ(trioma)法、ヒトB細胞ハイブリドーマ法（例えば、Kozbor et al., Immunol. Today, 4:72 (1983)を参照のこと）、およびヒトモノクローナル抗体を作製するためのEBV-ハイブリドーマ法（Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp.77-96 (1985)）が含まれるが、これらに限定されない。本発明のいくつかの特に好ましい態様において、本発明はIgGクラスのモノクローナル抗体を提供する。

本発明はまた、ヒト化抗体を意図する。「ヒト化抗体」とは、抗原認識部位(CDR)または相補性決定超可変領域が非ヒト起源であり、可変ドメインのフレームワーク領域(FR)がヒト起源である抗体である。ヒト化抗体は、ヒト対象に用いる等、特定の適用において非ヒト抗体よりも好ましい。ヒト化抗体は、米国特許第5,545,806号、第5,569,825号、および第5,625,126号（その全内容は参照として組み入れられる）に記載されている方法を含む、当技術分野において周知の方法によって作製することができる。

動物のモノクローナル抗肝細胞癌抗体をヒト化する1つの方法では、RPASを、Daugherty et al., Nucl. Acids Res., 19:2471-2476, 1991に記載されるCDR移植法と組み合わせる。簡潔に説明すると、選択された動物の組換え抗肝細胞癌scFvの可変領域DNAを、参照として本明細書に組み入れられるClackson, T., et al., Nature , 352:624-688, 1991の方法により配列決定する。この配列を用いて、動物の可変遺伝子の既知配列内のCDRの位置に基づいて、動物のCDRを動物のフレームワーク領域(FR)と識別する。Kabat, H. A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第4版（U.S. Dept. Health and Human Services, Bethesda, Md., 1987）。動物のCDRおよびFRが同定された場合、合成オリゴヌクレオチドおよびポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)組換えを使用して、CDRをヒト重鎖可変領域フレームワークに移植する。動物の重鎖CDRのコドンおよび入手可能なヒト重鎖可変領域フレームワークを、4つの（それぞれ100塩基長）のオリゴヌクレオチドに構築する。PCRにより、組換え体動物CDR/ヒト重鎖FR保護をコードする400塩基の移植DNA配列が形成される。

元の抗体の抗原結合特性を保持するためには、ヒト化型おいてその結合部位の構造を忠実に再現する。これは、(a) 重要なフレームワーク残基を保持するかまたは保持せずに、非ヒトCDRのみをヒトフレームワークおよび定常領域に移植することにより（Jones et al., Nature , 321:522 (1986)；Verhoeyen et al., Science, 239:1539 (1988))；または(b) （リガンド結合特性を保存するために）非ヒト可変ドメイン全体を移植するばかりでなく、（抗原性を減少させるために）露出される残基の慎重な置換によりヒト様表面でそれらを「覆い隠す」ことにより（Padlan, Molec. Immunol., 28:489 (1991)）、非ヒト抗体の結合部位をヒトフレームワークに移植することによって達成され得る。

保存される必要のあるフレームワーク残基を同定する1つの方法は、コンピュータモデリングである。または、重要なフレームワーク残基は、既知抗体の結合部位構造を比較することによって同定できる可能性がある（Padlan, Molec. Immun., 31(3):169-217 (1994)）。

抗原結合に影響する可能性のある残基は、いくつかの群に分類される。第一群は、結合部位表面と隣接し、したがって抗原と直接接触し得る残基を含む。これには、アミノ末端残基およびCDRに隣接した残基が含まれる。第二群には、CDRまたは逆鎖と接触することによって、CDRの構造または相対的配置を変化させ得る残基が含まれる。第三群は、可変ドメインの構造完全性に影響を及ぼし得る埋没した側鎖を有するアミノ酸を含む。これらの群の残基は、通常、採用した番号づけシステムにより同じ位置に見出される。Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, NIH Pub. No. 91-3242（第5版、1991）（U.S. Dept. Health & Human Services, Bethesda, MD)およびGenbankを参照されたい。

ヒト化可変領域を形成するには、以下のカテゴリーの1つに入る場合、ヒトアクセプター配列のアミノ酸をドナー配列の相当するアミノ酸によって置換し得る：(1) アミノ酸がCDR内に存在する。アクセプター免疫グロブリン鎖のさらなるアミノ酸も、CDRドナー免疫グロブリン鎖のアミノ酸で置換してもよい。より具体的には、アクセプター免疫グロブリンのヒトフレームワークアミノ酸の、ドナー免疫グロブリンの相当するアミノ酸によるさらなる任意の置換は、以下のカテゴリーの1つまたは複数に分類される位置で行なわれることになる：(2) アクセプター免疫グロブリンのヒトフレームワーク領域のアミノ酸が、ヒト免疫グロブリン配列のその位置に関して稀であり、ドナー免疫グロブリンの相当するアミノ酸がその位置に関して一般的である；または(3) アミノ酸がCDRの1つに直接隣接している；または(4) アミノ酸が、三次元免疫グロブリンモデルにおいてCDRの約3オングストローム以内に存在し、抗原と、またはドナーもしくはヒト化免疫グロブリンのCDRと相互作用し得ることが予測される。さらに、(5) 他のヒト配列と比較して、アクセプター免疫グロブリンのアミノ酸がその位置に関して稀であり、ドナー免疫グロブリンの相当するアミノ酸もまた稀である場合、アクセプター配列のアミノ酸は、任意にその位置でヒト配列に典型的なアミノ酸と置換され得る。

ヒト化免疫グロブリン鎖は典型的に、CDRに加えてドナー免疫グロブリンに由来する少なくとも約3つのアミノ酸を含み、通常そのうちの少なくとも1つはドナー免疫グロブリンのCDRに直接隣接している。重鎖および軽鎖は、それぞれ位置基準のいずれか1つまたはすべてにより設計され得る。

原型抗体を組み合わせる場合、本発明のヒト化軽鎖および重鎖は、ヒトにおいて実質的に免疫原性がなく、抗原（タンパク質またはエピトープを含む他の化合物）に対して、ドナー免疫グロブリンと実質的に同じ親和性を保持する。これらの親和性レベルは、ドナー免疫グロブリンの約4倍以内、好ましくは約2倍以内であってよい。より好ましくは、ヒト化抗体は、抗原に対するドナー免疫グロブリンの元の親和性の少なくとも約60％〜約90％を示すことになる。

組換え体CDR移植免疫グロブリン遺伝子の発現は、完全に移植された抗体を分泌するヒト293細胞（American Type Culture Collection, Rockville, Md. 20852から入手可能な形質転換初代胚性腎臓細胞）にこれをトランスフェクションすることによって達成される。例えば、Daugherty, B. L., et al., Nucl. Acids Res., 19:2471-2476 (1991)を参照されたい。

本発明は抗体断片を意図する。「抗体断片」という用語は、抗体の一部を指す。抗体断片は、全長抗体の特異的結合能の少なくともかなりの部分を保持することが好ましい。抗体断片の例には、Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、Fv、dsFv二重特異性抗体、およびFc断片が含まれるが、これらに限定されない。抗体断片は、任意に一本鎖抗体断片であってもよい。または、断片は、例えばジスルフィド結合により互いに結合した複数の鎖を含んでもよい。断片はまた、任意に多分子複合体であってもよい。好ましい態様において、抗体断片は少なくとも約50アミノ酸、より好ましくは少なくとも約200アミノ酸を含む。

一本鎖抗体断片(「scFv」)の作製に関して記載された技法（米国特許第4,946,778号；参照として本明細書に組み入れられる）を、所望の特定の一本鎖抗体の産生に適合化することができる。本発明のさらなる態様では、所望の特異性を有するモノクローナルFab断片の迅速かつ簡便な同定を可能にするFab発現ライブラリー（Huse et al., Science, 246:1275-1281 (1989)）の作製に関する、当技術分野において周知の技法を利用する。例えば、選択された防御抗肝細胞癌抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を、組換え抗肝細胞癌抗体の作製において使用する。例えば、Pharmacia（Pharmacia LKB Biotechnology、スウェーデン）の「組換えファージ抗体システム」(RPAS)をこの目的で使用することができる。RPASでは、ハイブリドーマmRNAから抗体可変重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子を別々に増幅し、発現ベクターにクローニングする。可動性ペプチドをコードする短いリンカーDNAを用いて連結した後、重鎖および軽鎖ドメインを同じポリペプチド鎖状で同時発現させる。この構築により、抗体の完全な抗原結合ドメインを組み入れた一本鎖Fv断片(ScFv)が作製される。抗原駆動スクリーニング系を用いて、元のモノクローナル抗体に等しい結合特性を有するScFvを選択する（例えば、McCafferty, J. et al., Nature, 348:552-554, 1990；Clackson, T., et al., Nature, 352:624-688, 1991を参照のこと）。組換えScFvは原型モノクローナル抗体よりもかなり少ない数のエピトープを含み、よってヒトに注入した場合により弱い免疫原性刺激を示す。したがって、ヒトへのScFvの静脈内投与は、現在用いられているモノクローナル抗体全体と比較して、より効率が高くかつ免疫学的により許容されることが予測される（Norman, D. J., et al., Transplant Proc., 25, suupl. 1:89-93, 1993）。

本発明は、抗体分子のイディオタイプ（抗原結合領域）を含む抗体断片を意図する。そのような断片は、周知の技法によって作製され得る。例えば、そのような断片には：抗体分子のペプシン消化によって産生され得るF(ab')2断片；F(ab')2断片のジスルフィド結合を還元することによって作製され得るFab'断片、およびパパインおよび還元剤によって抗体分子を処理することによって作製され得るFab断片が含まれるが、これらに限定されない。抗原結合タンパク質をコードする遺伝子は、当技術分野において周知の方法により単離することができる。抗体の産生において、所望の抗体のスクリーニングは、当技術分野において周知の方法（例えば、放射性免疫測定法、ELISA法（酵素結合免疫吸着測定法）、「サンドイッチ」免疫測定法、免疫放射線測定法、ゲル拡散沈降反応法、免疫拡散アッセイ法、（例えばコロイド金、酵素、または放射性同位元素標識を用いた）インサイチュー免疫測定法、ウェスタンブロット法、沈降反応法、凝集アッセイ法（例えば、ゲル凝集アッセイ法、赤血球凝集アッセイ法等）、補体結合アッセイ法、免疫蛍光アッセイ法、プロテインAアッセイ法、および免疫電気泳動アッセイ法等）等によって達成され得る。

本発明はキメラ抗体を意図する。本明細書で用いる「キメラ抗体」は、典型的に2つの異なる種の2つの異なる抗体の部分を含む。一般に、そのような抗体は、ヒト定常領域および別の種の可変領域、典型的にマウス可変領域を含む。例えば、親のマウス抗体の結合特性およびヒト定常領域に関連したエフェクター機能を示す、いくつかのマウス/ヒトキメラ抗体が報告されている。例えば、Cabilly et al.の米国特許第4,816,567号；Shoemaker et al.の米国特許第4,978,745号；Beavers et al.の米国特許第4,975,369号；Boss et al.の米国特許第4,816,397号を参照されたい。一般に、これらのキメラ抗体は、既存のマウスハイブリドーマから抽出したDNAからゲノム遺伝子ライブラリーを調製することによって構築される（Nisimura et al., Cancer Res., 47:999 (1987)）。次いで、ライブラリーを、正しい抗体断片再構成パターンを示す重鎖および軽鎖の可変領域遺伝子についてスクリーニングする。または、ハイブリドーマから抽出したRNAからcDNAライブラリーを調製してスクリーニングするか、または可変領域をポリメラーゼ連鎖反応法により取得する。次に、クローニングした可変領域遺伝子を、適切な重鎖または軽鎖ヒト定常領域遺伝子のクローン化カセットを含む発現ベクターに連結する。次いで、選択した細胞株、通常はマウス骨髄腫株において、キメラ遺伝子を発現させる。そのようなキメラ抗体は、ヒト治療において用いられている。

本発明はまた、「非免疫化」抗体、すなわち配列を改変して、その改変した配列に対するT細胞結合を減少させた、より好ましくはT細胞結合を排除した抗体を意図する。非免疫化技術は、Frank Carr（欧州特許第AU1667600号）によって考案された。ペプチド-MHCクラスII複合体はT細胞によって認識されてもよく、ヘルパーT細胞の活性化および分化を誘発することができる。ヘルパーT細胞はB細胞との相互作用を介して免疫原性の誘発および維持に必要とされ、その結果、投与された生体分子（抗体等）に特異的に結合する抗体が分泌される。

生体分子（抗体等）を非免疫化するには、生体分子の配列内のヘルパーT細胞エピトープを同定し、これらの配列を主にアミノ酸置換によって改変し、T細胞による認識を回避する。非免疫化の結果として、生体分子はもはやT細胞の支持を誘発することができず、よってその後生体分子に対する抗体は産生され得ない。このようにして、改変生体分子は、T細胞エピトープを含む生体分子と関連する場合が多い免疫原性を回避することができる。

これらの代替物のうち、抗体またはタンパク質生体分子の治療作用を損なうリスクが最も低いと考えられる個々の置換を選択する。次いで、これらの置換を生体分子全体の中で試験して、改変した生体分子の活性を測定する。次に、個々のT細胞エピトープを除去するために必要な置換を生体分子内で組み合わせて、ヘルパーT細胞を活性化し得ない改変型の生体分子を産生する。

ヘルパーT細胞エピトープが生体分子内の重要な機能部位と一致する場合でさえ、通常は、活性を明らかに喪失することなくT細胞エピトープを除去するためのアミノ酸置換の機会が存在し、抗体の場合には、非免疫化の結果として結合活性が増加する場合もいくつかある。そのような置換を同定することが困難である場合には、MHC結合を維持するがT細胞認識を逃れる置換、またはT細胞エピトープ配列のプロテアーゼ切断を促進する置換ような、他の非免疫化戦略を用いる。

抗体のVH配列およびVL配列を非免疫化するには、ヒトT細胞エピトープ同定ツールボックスを用いてこれらの配列を解析する。その結果は、相補性決定領域(CDR)および配列内の他の重要な残基に関してエピトープの位置を示す、各V領域のヒトT細胞エピトープ「マップ」である。最終抗体の活性を変更するリスクが低い、代替的なアミノ酸置換を同定するために、T細胞エピトープマップによる個々のT細胞エピトープを解析する。アミノ酸置換の組み合わせを含めた一連の代替VH配列およびVL配列を「設計」し、その後これらの配列を一連の改変抗体に組み入れ、機能について試験する。典型的な抗体非免疫化プロジェクトでは、12〜24個の変種抗体を作製して試験する。

開始抗体のVH遺伝子およびVL遺伝子を、合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて1ラウンドまたはそれ以上のラウンドの変異に供する。次いで、得られたVH遺伝子およびVL遺伝子をプラスミドベクター内に、重鎖および軽鎖定常(C)領域遺伝子（それぞれCHおよびCL）に隣接してクローニングする。最終治療抗体の必要とされる特性に応じて、天然ヒトIgG1〜IgG4 C領域遺伝子を用いるか、またはFc受容体結合等の抗体エフェクター機能を変更するために、ヒト定常領域を改変する。

次に、改変したV領域およびヒトC領域を含む完全な重鎖および軽鎖遺伝子を哺乳動物発現ベクターにクローニングし、その後、抗体全体を産生させるためにプラスミドをげっ歯類骨髄腫細胞株に導入する。（VH配列およびVL配列内に種々の改変を含む）代替抗体を適切な生化学アッセイ法および生物アッセイ法で比較し、最適な変種を同定する。

抗体の産生において、所望の抗体のスクリーニングは、当技術分野において周知の方法（例えば、放射性免疫測定法、ELISA法（酵素結合免疫吸着測定法）、「サンドイッチ」免疫測定法、免疫放射線測定法、ゲル拡散沈降反応法、免疫拡散アッセイ法、（例えばコロイド金、酵素、または放射性同位元素標識を用いた）インサイチュー免疫測定法、ウェスタンブロット法、沈降反応法、凝集アッセイ法（例えば、ゲル凝集アッセイ法、赤血球凝集アッセイ法等）、補体結合アッセイ法、免疫蛍光アッセイ法、プロテインAアッセイ法、および免疫電気泳動アッセイ法等）等によって達成され得る。

1つの態様においては、一次抗体上の標識を検出することによって抗体結合を同定する。別の態様では、一次抗体への二次抗体または試薬の結合によって、一次抗体を検出する。さらなる態様では、二次抗体を標識する。免疫測定法において結合を検出する多くの手段が当技術分野において周知であり、これらは本発明の範囲内である。当技術分野において周知のように、免疫原性ペプチドは、任意の免疫化手順で使用される担体分子を含まずに提供されるべきである。例えば、ペプチドをKLHに結合してある場合、スクリーニングアッセイにおいてはそれをBSAに結合させ得るか、または直接使用し得る。

抗体は抗原決定基に特異的に結合する。本明細書で用いる「抗原決定基」および「エピトープ」という用語は、特定の抗体可変領域と接触する抗原の部分を指す。宿主動物の免疫化にタンパク質またはタンパク質の断片を用いる場合、タンパク質の多くの領域が、タンパク質の所与の領域または三次元構造に特異的に結合する抗体の産生を誘導し得る；これらの領域または構造を抗原決定基と称する。

「特異的結合」、「結合特異性」という用語、およびこれらの文法上の相当語句は、第一分子（ポリペプチド、糖タンパク質、核酸配列等）の第二分子（ポリペプチド、糖タンパク質、核酸配列等）への結合に関して用いる場合、第二分子と第三分子との相互作用と比較して第一分子と第二分子との相互作用が優先的であることを指す。特異的結合とは、結合の絶対的な特異性を必要としない相対的用語である；言い換えると、「特異的結合」という用語は、第二分子と第三分子との相互作用がない状態で、第二分子が第一分子と相互作用することを必要としない。むしろ、第一分子と第二分子との相互作用のレベルが、第二分子と第三分子との相互作用のレベルよりも高いことで十分である。第一分子と第二分子との「特異的結合」はまた、第一分子と第二分子との相互作用が、第一分子上または第一分子内の特定構造の存在に依存することを意味する；言い換えると、第二分子は、一般に核酸または分子よりもむしろ第一分子上または第一分子内の特定構造を認識し、これと結合している。例えば、第二分子が第一分子上または第一分子内の構造「A」に特異的で得ある場合、構造Aを含む第三核酸配列の存在により、第一分子に結合している第二分子の量が減少することになる。

抗体の別の分子への結合に関する場合の「結合親和性」という用語は、抗体のその分子への結合のレベルを指す。1つの態様において、本発明は、配列番号：7および/または配列番号：6への結合親和性が、配列番号：4に対する抗体の結合親和性よりも高い抗体を利用する。

固相ELISA免疫アッセイ法等の様々な免疫測定型式を用いて、抗体と抗原との結合親和性および結合特異性を決定することができる（Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York）。

1つの態様において、本発明のタンパク質（MADFおよびADFの1つまたは複数を含むMDHの部分、Htra/Omi、アポトーシス誘導因子、Smac/DIABLO、EndoG、チトクロームC、Nix、Nip3、CIDE-B、ゲルソリン、Bax、Bad、Bid、カスパーゼ活性化DNase、DNase I、およびDNase IIの1つまたは複数等）との融合パートナーとして用いられる抗体は、細胞分子、好ましくは細胞マーカー分子、より好ましくは細胞表面マーカー分子に特異的に結合する。

さらなる態様においては、本発明のタンパク質（MADFおよびADFの1つまたは複数を含むMDHの部分、Htra/Omi、アポトーシス誘導因子、Smac/DIABLO、EndoG、チトクロームC、Nix、Nip3、CIDE-B、ゲルソリン、Bax、Bad、Bid、カスパーゼ活性化DNase、DNase I、およびDNase II等）との融合パートナーとして用いられる抗体に、N末端シグナルペプチド、細胞内部移行ペプチド、放射性核種、ビオチン結合タンパク質（ビオチンに特異的な抗体等）が（直接または間接的に）さらに融合される。

さらなる態様において、本発明のタンパク質（MADFおよびADFの1つまたは複数を含むMDHの部分、Htra/Omi、アポトーシス誘導因子、Smac/DIABLO、EndoG、チトクロームC、Nix、Nip3、CIDE-B、ゲルソリン、Bcl-2、Bax、Bad、Bid、カスパーゼ活性化DNase、DNase I、およびDNase II等）との融合パートナーとして用いられる抗体は、血管新生過程において増殖する内皮細胞および血管平滑筋細胞；再狭窄過程において増殖する血管平滑筋細胞、アテローム性動脈硬化過程において増殖する血管平滑筋細胞、単球細胞、およびマクロファージ細胞；線維形成過程において増殖する心臓細胞、肺細胞、肝細胞；血管腫、乾癬、網膜症、黄斑変性症、および網膜裂傷において増殖する内皮細胞；リンパ腫、白血病、および移植片拒絶において増殖する白血球細胞（T細胞および骨髄性細胞等）、造血細胞、およびB細胞；筋萎縮性側索硬化症において増殖するB細胞；関節炎において増殖する内皮細胞、滑膜細胞、および線維芽細胞；関節リウマチおよび変形性関節症において増殖する骨細胞および滑膜細胞；乾癬および皮膚癌において増殖する皮膚細胞；アレルギーにおいて増殖するアレルゲン特異的抗体分泌細胞等の、増殖細胞に特異的に結合する。

さらなる態様において、本発明の融合分子内の抗体が結合する増殖細胞は癌細胞である。さらにより好ましい態様において、そのような融合タンパク質は、N末端シグナルペプチド、細胞内部移行ペプチド、および核局在化ペプチドの1つまたは複数をさらに含む。

癌細胞に結合する例示的な抗体には、これらに限定されないが、非小細胞肺癌に対するモノクローナル抗体（米国特許第4,737,579号）、ヒト乳癌に対するモノクローナル抗体（米国特許第4,753,894号）、ヒト消化管癌に対するモノクローナル抗体（米国特許第4,579,827号）、およびヒト腎臓癌に対するモノクローナル抗体（米国特許第4,713,352号）が含まれる。

より詳細には、抗体が特異的に結合する癌細胞は、肝細胞癌細胞等の肝臓癌細胞を含む。1つの態様において、肝臓癌細胞に結合する抗体は、表1の抗体、ならびに抗体Hepama-1、抗PLC1、抗PLC2、K-PLC1、K-PLC2、K-PLC2、49-D6、7-E10、34-A4、26-A10、34-B9、79-C8、16-E10、5D3、5C3、2C6、a-AFP、HP-1、hHP-1、mAb 95、YPC2/38.8、P215457、PM4E9917、HAb25、Hab27、KY-1、KY-2、KY-3、9403 Mab、KM-2、S1、9B2、IB1、A9-84、SF-25、AF-10、XF-8、AF-20、a-hIRS-1、FB-50、SF 31、SF 90、2A3D2、および2D11E2の1つまたは複数から選択される抗体を含み、これらについて以下でさらに説明する。

（表１）HCCの抗体療法

1つの態様において、本発明の配列の任意の1つまたは複数との融合タンパク質において用いられ得る抗体は、Hepama-1および/またはHepama-1抗体が特異的に結合するのと同じ抗原に特異的に結合する抗体である。本明細書のデータは、マウスモデル（実施例12）および臨床試験（実施例13）におけるHepama-1の使用を示す。Hepama-1は試験したすべてのHCC株に特異的に結合することが示され、他の腫瘍種とも、試験した正常な成体組織のいずれとも反応しなかった。さらに、放射標識したHepema-1は、中国での臨床試験において有望な結果を示した。したがって、この抗体は、本発明の分子を肝臓癌に標的化するための優れた候補である。

Hepama-1を調製する方法および癌細胞に対するその特異性を試験する方法は、当技術分野において周知である。Hepama-1は、マウスをヒトHCC細胞株BEL-7402で免疫することによって発見されたマウスモノクローナル抗体である（Xie et al, Acta Biol. Exp. Shinica 18:263-273, 1985）。この抗体は、HCC細胞株およびヒト初代肝細胞癌生検試料との非常に特異的かつほぼ独占的なインビトロ反応性を示した。この抗体は、他の腫瘍種には結合しなかった。Hepama-1抗原は、ウェスタンブロットにより同定される、約43,000ダルトン糖タンパク質である。Hepama-1は、トリコスタチン、リボソーム不活化毒素をこれに結合することによって、HCC特異的毒素に変換された（Wang et al., Cancer Research 51:3353-3355, 1991）。これにより、Hepama-1抗体は、その抗原に結合した場合に、HCC細胞によって取り込まれることが強く示唆される。

Hepama-1抗体は¹³¹Iに結合され、ヒトのHCCを治療する治療薬として用いられている（Zeng et al, J Cancer Res Clin Oncol 119:257-7, 1993）。外科的に確認された切除不能な肝細胞癌(HCC)を有する23名の患者を、肝動脈結紮と組み合わせた¹³¹I標識Hepama-1の肝臓内動脈投与により処置した。放射免疫画像診断から、5日目の平均腫瘍/肝臓比が2.1（1.1〜3.6）であることが示された。α-フェトプロテインレベルの減少および腫瘍の収縮が、患者のそれぞれ75％（12/16）および78％（18/23）で認められた。治療後、11名の患者（48％）において、その後の切除が行われた。外科標本から腫瘍の広範囲な壊死が明らかになったが、残存癌細胞が標本の端に認められた。¹³¹I-Hepama-1 mAbを投与してから2〜4週間後、43％（10/23）の患者において抗抗体が測定された。顕著な毒性効果は認められなかった。この研究から、¹³¹I-Hepama-1 mAbは、切除不能なHCCの多様式治療の1つとして価値のある可能性があることが示唆された。

Hepama-1はマウス起源であるため、ヒト抗マウスIgG抗体(HAMA)応答が数名の患者において検出された（Zeng et al, Cancer Immunol Immunother 39:332-6, 1994）。

Zengらの最初の臨床試験の後、より包括的な研究が試みられた（Zeng it al, J Cancer Res Clin Oncol 124:275-80, 1998）。放射免疫療法により治療したHCC患者の長期生存および予後因子が解析された。1990〜1992年に、外科的に確認された切除不能なHCCを有する65名の患者を、肝動脈結紮ならびに肝動脈カニューレ挿入および注入により処置した。32名の患者が、肝動脈を介した¹³¹I放射標識Hepama-1 mAbの注入による臨床試験第I〜II相に登録した（RIT群）。残りの33名の患者は、肝臓内動脈化学療法による治療群を形成した（非RIT群）。24名の患者においてT細胞サブセットが測定され、RIT群においてヒト抗-（マウスIg）抗体（HAMA）がモニターされた。5年生存率は、化学療法群よりもRIT群において有意に高く、9.1％に対して28.1％であった（P<0.05）；これは主に、より優れた細胞減少およびより高いその後の切除率（9.1％に対して53.1％）の結果であった。RIT群における顕著な予後因子は、腫瘍カプセル(capsule)状態および腫瘍小結節の数を含んだ。HAMAの発生およびCD4+ Tリンパ球は、短期生存に影響を及ぼしたが、長期生存には影響しなかった。したがって、肝動脈結紮と組み合わせたた、¹³¹I-Hepama-1 mAbを用いた肝臓内動脈RITは、切除不能なHCCを有する一部の患者において長期生存を改善する有効なアプローチである可能性があり、HCCは¹³¹I-Hepama-1 mAbの動脈内注入によりうまく切除される可能性がある。

Hepama-1モノクローナル抗体に加えて、本発明はまた、Hepama-1モノクローナル抗体の断片、ヒト化Hepama-1モノクローナル抗体、Hepama-1モノクローナル抗体のヒト化断片、および非免疫化Hepama-1モノクローナル抗体を明確に意図する。特に、ヒトに投与されたマウスモノクローナル抗体はこれらの分子に対するヒト免疫応答を誘発し得るため、用途によっては（ヒト免疫療法において等）、ヒト化モノクローナルHepama-1抗体が好ましい。ヒト抗マウス抗体(HAMA)応答は、2つの異なるドメインに向けられる。可変領域に対する応答はいわゆる抗イディオタイプ応答であり、マウス抗体の抗原結合活性を阻止し得る。定常領域に対する応答は抗アイソタイプ応答を示し、抗体のエフェクター機能を阻止し得る。HAMA応答は新たに投与された抗体の機能を阻止するばかりでなく、またマウス抗体との免疫複合体を形成し、これが何らかの副作用をもたらし、抗体の半減期を短縮し得る。第二に、免疫複合体形成が起こらなくとも、インビボにおいてマウス抗体の半減期はヒト抗体の半減期よりも非常に短い。第三に、マウス抗体のFc領域を介したエフェクター機能は、ヒト抗体のものと比較して弱いかまたは存在しない。

1つの態様において、本発明の配列の任意の1つまたは複数との融合タンパク質において用いられ得る抗体は、抗PLC1および抗PLC-2の1つまたは複数である。これらの抗体を調製する方法および癌細胞に対するそれらの特異性を試験する方法は、当技術分野において周知である。例えば、Shouvelら（Hepatology 5(3):347-56, 1985）は、Balb/cマウスを、PLC/PRF/5-NRと称する無傷のクローン化ヒト肝細胞癌細胞株で免疫した後、ヒト肝細胞癌細胞と反応するマウスモノクローナル抗体のライブラリーを作製した。抗PLC1と称する1つのそのようなIgG2a抗体は、親のPLC/PRF/5の細胞膜および培養で増殖させたSK-Hep 1およびMahlavuヒト肝細胞癌細胞の膜を特異的に染色した。胸腺欠損ヌードラットおよびマウスに皮下注射した3つの肝細胞癌細胞株に由来する固形腫瘍においても、膜染色の同様のパターンが認められた。モノクローナル抗PLC1と共に懸濁状態で37℃でインキュベートした場合、3つのヒト肝細胞癌細胞種の7％〜30％において、細胞表面上の自発的な被覆(capping)が認められた。細胞をトリプシンで処理しても、または培養液中で増殖を維持しても、膜染色の強度は影響を受けなかった。モノクローナル抗PLC1は特異的であると考えられ、この抗体は非肝臓起源の種々のヒト癌細胞株および初代腫瘍、またはいくつかの正常ヒトおよびマウス組織を染色しなかった。精製した¹²⁵I標識モノクローナル抗PLC1は、培養液中の3つの肝細胞癌細胞株に特異的に結合した。抗原-抗体反応の特異性は、非標識の相同な抗体を用いた実験における競合的結合阻害によって実証された。¹²⁵I-抗PLC1の結合は、HBsAgまたはα-フェトプロテインに対する非標識モノクローナル抗体によって阻害されなかった。2つの肝細胞癌細胞株は、細胞表面抗原決定基に対する¹²⁵I-抗PLC1抗体の結合を特異的に阻止するタンパク質を分泌する。本発表において、PLC2と称する別のHCC表面タンパク質に対する抗体もまた同定され、これを抗PLC2と称する。

さらなる態様において、本発明の配列の任意の1つまたは複数との融合タンパク質において用いられ得る抗体は、K-PLC1、K-PLC2、およびK-PLC3の1つまたは複数であってよい。これらの抗体を調製する方法および癌細胞に対するそれらの特異性を試験する方法は、当技術分野において周知である。例えば、Weidmauuら（Hepatology 7(3):543-50, 1987）は、マウスをHBsAgおよびα-フェトプロテイン分泌ヒト肝細胞臓癌PLC/PRF/5（「Alexander」）細胞株で免疫した後に、モノクローナル抗体を同定した。3つの抗体（K-PLC1、K-PLC2、およびK-PLC3）は、間接的な免疫蛍光法により、癌と関連した反応性の証拠を示した。抗体K-PLC2およびK-PLC3はPLC/PRF/5細胞とのみ反応し、Hep/G2肝細胞癌細胞株を含む、試験した他の正常または悪性細胞種のいずれとも反応しなかった。これらの抗体の反応性は、正常肝臓または初代肝細胞癌のホモジネートによる吸収によって除去されなかった。これらの結果から、K-PLC2およびK-PLC3が、PLC/PRF/5イディオ特異的決定基を識別することが示唆される。PLC/PRF/5細胞の表面ヨウ素化、免疫沈降、およびポリアクリルアミドゲルでの解析の後、これらの特異的決定基は、それぞれ200,000ダルトンおよび76,000ダルトンであることが判明した。一方、抗体K-PLC1は、リンパ系器官および骨髄肝細胞およびほとんどの上皮のものを含む、正常細胞種の大部分と免疫蛍光法により非反応性であるが、いくつかの正常な菅の分泌上皮に対して弱陽性であり、血管内皮に対して陽性であった。しかし、K-PLC1は、試験したすべての癌試料およびほとんどの癌由来細胞株と強く反応し、悪性形質転換の後、上皮細胞によって発現されるK-PLC1抗原が大幅に増加することが示される。正常肝臓ホモジネートによるK-PLC1の吸収は影響を及ぼさないが、肝細胞癌ホモジネートによる吸収ではその活性が消失した。K-PLC1抗原は免疫ブロットも免疫沈降もできず、ポリアクリルアミドゲルで分離した；さらに、この抗原は、リン脂質の特性、すなわちプロテアーゼに対する耐性、有機溶媒による抽出性、およびホスホリパーゼC対する感受性を示した。間接的免疫蛍光法により、この抗体は3つの肝細胞癌(HCC)細胞株の膜染色を生じ、11のヒトHCC生検試料のうち10を陽性に染色した（Dunk et al, J Hepatol 4(1):52-61, 1987）。インビトロにおいて、¹²⁵I標識K-PLC1は、競合阻害実験によって示されるように、PLC/PRF/5細胞に特異的に結合する。PLC/PRF/5細胞株に由来する腫瘍をヌードマウスで増殖させ、腫瘍を有する動物群に、(¹²⁵I)K-PLC1または(¹²⁵I)マウスIgGを注射し、注射から1日目、4日目、または7日目に屠殺した。結合した放射能を、種々の固形臓器においてカウントした。各時点において、K-PLC1に関する腫瘍:肝臓比はマウスIgGの比率よりも高く、その相違は4日目に最大であった（比率K-PLC1 4.4 +/- 0.93、比率マウスIgG 1.53 +/- 0.60、平均値+/- SD、P 0.05未満）。結合した(¹²⁵I)K-PLC1の量は、任意の他の固形臓器よりも腫瘍において高く、その相違はこの場合もやはり4日目に最大であった。しかし、血液プールの放射能は、実験期間を通して高いままであった。

別の態様において、本発明の配列の任意の1つまたは複数との融合タンパク質において用いられ得る抗体は、49-D6、7-E10、34-A4、26-A10、34-B9、79-C8、および16-E10の1つまたは複数であってよい。これらの抗体を調製する方法および癌細胞に対するそれらの特異性を試験する方法は、当技術分野において周知である。HCC特異的非タンパク質細胞マーカーに対する他のモノクローナル抗体もまた記載されている。Hiraiwaら（Cancer Res 50(10):2917-28, 1990）は、培養したヒト肝細胞癌細胞において、硫酸化され、かつ非常に複雑で、強酸性の糖脂質が蓄積することを見出した。試験した細胞のうち、PLC/PRF/5細胞は、非常に複雑な硫酸化酸性糖脂質をかなりの量含み、HepG2細胞は、大量の比較的単純な硫酸化糖脂質を有すると特徴づけられた。これらの硫酸化かつ強酸性糖脂質に対するいくつかのモノクローナル抗体（すべてIgM）が作製された。これらのうち、49-D6および7-E10はどちらも、比較的単純な硫酸化糖脂質であるSM3（LacCer-II3-硫酸）に対して作製され、34-A4はSD1a（GgOse4CerII3,IV3-二硫酸）およびより複雑な硫酸化糖脂質に対して作製された。他の4つの抗体、26-A10、34-B9、79-C8、および16-E10は、DEAEクロマトグラフィーにおいて0.9〜2.7 M酢酸アンモニウムで溶出される未知の強酸性糖脂質と反応し、これらの抗原糖脂質が、これまでに記載された通常の糖脂質よりも非常に酸性が強いことが示唆される。肝細胞癌組織および患者の硬変肝臓から、ならびに正常肝臓から抽出した糖脂質の、これらのモノクローナル抗体を用いた解析から、SM3のように単純な糖質構造を有する硫酸化糖脂質は、硬変肝臓（4症例のうち2症例）および肝細胞癌組織（17症例のうち15症例、88％）において有意に蓄積し、より複雑な硫酸化糖脂質および強酸性糖脂質は、硬変肝臓（4症例のうち0症例）と比較して肝細胞癌組織（17症例のうち10症例、59％）により特異的であることが示された。

さらに別の態様において、本発明の配列の任意の1つまたは複数との融合タンパク質において用いられ得る抗体は、5D3、5C3、および2C6の1つまたは複数であってよい。これらの抗体を調製する方法および癌細胞に対するそれらの特異性を試験する方法は、当技術分野において周知である。HCCとB型肝炎感染との関連性が存在し、よって「B型肝炎表面抗原」(HBsAg)とはいくつかのHCC細胞種の細胞表面マーカーである。したがって、HBsAgに対する抗体は、ヒト宿主においてHCC細胞を標的し得る。3つの既知HBsAg抗体の例は、5D3、5C3、および2C6である（Shouval et al, Proc Natl Acad Sci, USA 79:650-4, 1982）。

1つの態様において、本発明の配列の任意の1つまたは複数との融合タンパク質において用いられ得る抗体は、抗体a-AFPを含む。αフェトプロテイン(AFP)は、いくつかのHCC細胞の別の広く知られた細胞表面マーカーである。本明細書においてa-AFPと称する、このマーカーに結合する抗AFP抗体が同定されている（Tsung et al, J Immunol Methods 39(4):363-8, 1980）。

1つの態様において、本発明の配列の任意の1つまたは複数との融合タンパク質において用いられ得る抗体は、抗体HP1およびhHP-1の1つまたは複数を含む。HP-1は、いくつかのヒト肝細胞癌細胞株上の細胞表面マーカーに結合するマウスモノクローナル抗体である。hHP-1は、同じ抗体のヒト化型である。どちらの抗体も、Chan et al, Biochem. Biophys. Res. Commun 284, 157-167, 2001に記載されている。

別の態様において、本発明の配列の任意の1つまたは複数との融合タンパク質において用いられ得る抗体は、抗体mAb 95を含む。マウスモノクローナル抗体mAb 95は、マウスにヒト肝細胞癌細胞株SMMC-7221の粗製細胞膜を免疫することにより得られた（Hybridoma 17(5), 437-444, 1998）。この抗体は、HCC細胞上に存在するが、他の癌細胞または正常肝細胞上には存在しない、見かけの分子量約40,000および60,000ダルトンの膜タンパク質と反応する。

さらなる態様において、本発明の配列の任意の1つまたは複数との融合タンパク質において用いられ得る抗体は、UPC2/38.8を含む。ラットモノクローナル抗体、YPC2/38.8は、ラットを新鮮な結腸直腸癌で免疫することによって得られた一連の抗体から選択された（Markham et al, J Hepatol 2(1), 25-31, 1986）。この抗体は、正常結腸および肝臓の細胞表面上に存在する30,000ダルトンタンパク質に結合することが判明した。このタンパク質は、初代肝細胞癌(PHC)細胞において10倍増加していた。¹³¹Iで標識した後、YPC2/38.8は、免疫抑制マウスの異種移植片として増殖したヒトPHCに局在化することが示された。

本発明の配列の任意の1つまたは複数を含む融合タンパク質のさらなる態様は、抗体P215457およびPM4E9917の1つまたは複数を含む。モノクローナル抗体P215457およびPM4E9917は、マウスをトリプシン未処理ヒト肝細胞癌細胞の単一細胞懸濁液で免疫することにより産生された（Carlson et al, J Clin Invest 76 (1):40-51, 1985）。この抗体は、肝細胞癌関連抗原に対する特異性、ならびに放射性免疫測定法(RIA)およびインビボでの腫瘍局在化における試薬としての使用能に関して特徴づけられた。2つのそのような抗体、すなわちIgG2aアイソタイプのP215457およびPM4E9917は、4つのヒト肝細胞癌細胞株上の明確に異なる抗原決定基を認識するばかりでなく、化学的に誘導されたラット肝細胞癌細胞株上に存在するエピトープとも反応した。対照的に、他のヒト悪性および形質転換細胞株38のうち1つのみが、2つの抗体との反応性を示した；正常ヒト組織もまた非反応性であることが認められた。モノクローナル抗体P215457は、間接的免疫蛍光法により形質膜を濃染し、懸濁状態のHCC細胞への迅速な結合活性を示し、分子量50,000の細胞表面タンパク質を沈降させた；抗体PM4E9917もまた、形質膜を濃染し、分子量65,000のタンパク質を沈降させた。また、P215457のFab断片が、インビボでの腫瘍局在化において有用であることが認められた。

本発明の配列の任意の1つまたは複数を含む融合タンパク質のさらに別の態様において、融合タンパク質は抗体HAb25およびHab27の1つまたは複数を含む。HCC細胞に結合する2つの他のモノクローナル抗体は、HAb25（Hu et al, 7(2):101-3, 1999）およびHab27（Yang et al., 16(4):263-5, 1994）である。上記出版物に記載されているように、これらの抗体の可変領域の配列が決定された。

本発明の配列の任意の1つまたは複数を含む融合タンパク質のさらに別の態様において、融合タンパク質は、マウスモノクローナル抗体KY-1、KY-2、およびKY-3の1つまたは複数を含む。これらの抗体は、マウスをヒト肝細胞癌細胞株hu-H2で免疫することにより同定された（Ohzu et al., J Gastroenterol Hepatol 5(6):601-7, 1990；Kuwata et al, J Gastroenterol Hepatol 13 (2):137-44, 1998）。KY-1と称するこれらのうちの1つは、いくつかのHCC株および末梢血リンパ球の大部分と反応した。第二のモノクローナル抗体、KY-2は、HCC細胞株とのみ反応し、他とは反応しなかった。HCCに非常に特異的なこのKY-2を用いて、HCC組織が陽性に染色された。第三のモノクローナル抗体、KY-3は、HCC株および多くの他の悪性細胞株と反応したが、非悪性細胞とは反応しなかった。これらの結果から、少なくとも3つの異なる腫瘍関連分子がヒトHCC上に発現していることが示唆される。

本発明の配列の任意の1つまたは複数を含む融合タンパク質のさらなる態様において、融合タンパク質は、9403 Mabと称する、HCC表面マーカー反応性モノクローナル抗体を含む（Song et al., Cell Res 8(3), 241-7, 1998）。

別の態様において、本発明の配列の任意の1つまたは複数との融合タンパク質において用いられ得る抗体は、HCC細胞表面マーカーと反応し、Xie et al, Shi Yan Sheng Wu Xue Bao 18(2):263-70, 1985に記載されているモノクローナル抗体を含む。Tan（Ann Acad. Med. Singapore 19:147-151, 1990）もまた、マウスをヒトHCC細胞株PLC/PRF/5で免疫して得られたHCC特異的モノクローナル抗体について記載している。ヒトHCC細胞株SK-HEP-1と反応する7つのマウスモノクローナル抗体もまた記載された（Chang et al, Chung Hua Min Kuo Wei Sheng Wu Chi Mien I Hsueh Tsa Chi 22:1-20, 1989）。

さらに別の態様において、本発明の配列の任意の1つまたは複数との融合タンパク質において用いられ得る抗体は、モノクローナル抗体KM-2を含み、これはマウスをHCC細胞株PLC/PRF/5で免疫することにより発見された（Kumagai et al., Cancer Res 52 (18):4987-94, 1992）。この抗体を用いて、新たなHCC関連抗原（KM-2抗原）が特徴づけられた。KM-2抗原は、HCC細胞株の細胞表面上に強く発現されていた。種々の組織および腫瘍の凍結切片を免疫蛍光染色することにより、HCC群の細胞表面上でのその特異的発現が確認された。この抗原はまた、正常肝臓の毛細胆管においても検出された。その生化学的特徴づけから、KM-2モノクローナル抗体によって認識されるペプチドエピトープの近傍にN結合型糖鎖を有する、高分子量（M(r) 約900,000）糖タンパク質であることが明らかにされた。

別の態様において、本発明の配列の任意の1つまたは複数との融合タンパク質において用いられ得る抗体は、S1と称するHCC表面マーカー認識抗体（Fukuda et al., Cancer Immunol Immunother 27(1):26-32, 1988）を含み、これは糖質成分を認識するIgG2aであり、BALB/cマウスおよび胸腺欠損マウスのマウス脾細胞と協同して、抗体依存性細胞（またはマクロファージ）媒介性細胞障害（ADCCまたはADMC）を示す。インビボ実験により、抗体S1は、ヒト肝臓癌細胞株を接種した胸腺欠損マウスの生存を明らかに延長した。さらに、抗体S1は、ヌードマウスに皮下移植したヒト肝細胞癌株を有意に抑制した。¹²⁵I標識モノクローナル抗体S1は、抗体が腫瘤内に有意に蓄積することを明らかにした。抗体を添加した場合、腫瘍細胞の周囲に多くの単核細胞が観察された。このモデル系は、インビボにおけるADCC（またはADMC）機構を解析するのに有用である可能性がある。

さらなる態様において、本発明の配列の任意の1つまたは複数との融合タンパク質において用いられ得る抗体は、モノクローナル抗体IB1および9B2の1つまたは複数を含む。ヒト肝細胞癌細胞株に対する選択性を示すこれらの抗体は、BALB/cマウスをヒト肝細胞癌細胞株、HA22T/VGHまたはHep 3Bで免疫し、感作されたマウス脾細胞とマウス骨髄腫細胞を融合することにより作製された（Hu et al, Hepatology 6(6):1396-492, 1986）。ヒト肝細胞癌細胞株上にのみ存在する抗原を認識する2つのモノクローナル抗体が調べられた。モノクローナル抗体IB1は、肝細胞癌細胞株9つのうち3つと反応することが認められた。モノクローナル抗体9B2は、9つの肝細胞癌細胞株すべてと反応した。IB1および9B2は、試験した他の20の細胞株のいずれにも結合しなかった。同じ個体に由来する対の肝細胞癌肝組織および正常肝組織の凍結切片での、モノクローナル抗体の免疫ペルオキシダーゼ染色を試験した。抗体IB1は肝細胞癌組織13のうち3つと反応したが、正常な肝組織および他の組織とは反応せず、抗体9B2は肝細胞癌肝組織および正常肝組織の毛細胆管ドメイン上の抗原と反応した。抗体9B2は、腎臓の近位尿細管を除いて、正常組織を染色しなかった。放射免疫沈降試験により、9B2と反応する2つの抗原が同定された。主要な抗原は見かけの分子量140,000を有し、微量な方は見かけの分子量130,000を有した。したがって、抗体IB1はヒト肝細胞癌細胞群上に存在する抗原に特異的であるようであり、ヒト肝細胞癌の分類および診断に有用である可能性がある。抗体9B2はヒト肝細胞に極めて特異的であり、腫瘍細胞株の特徴づけ、肝細胞起源の転移性腫瘍の同定、ならびに毛細胆管の構造および機能の研究の手がかりを提供するために使用できる可能性がある。

さらに別の態様において、本発明の配列の任意の1つまたは複数との融合タンパク質において用いられ得る抗体は、肝細胞癌細胞株（PLC/PRF-5）に対するモノクローナル抗体A9-84を含む。この抗体もまた、免疫によって産生された（Shao, Zhonghua Zhong Liu Za Zhi 8(4):259-61, 1986）。酵素結合結合アッセイ法および免疫蛍光法によって、この抗体の特異性が調べられた。A9-84は8つの種々のヒト癌細胞株（肝臓癌細胞株4、食道癌細胞株1、胃癌細胞株1、多発性骨髄腫細胞株1、およびリンパ芽球細胞株細胞株1）、および正常対象91名の末梢単核細胞に反応しないことが示される。A9-84はIgG3サブタイプである。これは、補体を伴いまたは伴わずに、培養したPLC/PRF/5細胞の増殖を阻害し得る。

さらなる態様において、本発明の配列の任意の1つまたは複数との融合タンパク質において用いられ得る抗体は、SF-25を含む（Cancer Res 48(22):6573-9, 1988）。この抗体はヒト肝細胞癌細胞株（FOCUS）に対して産生され、6つの結腸腺癌細胞株すべてに共通である抗原と強く反応する。この細胞表面抗原は、手術時に得られたヒト結腸腺癌17例すべてに一様に発現していたが、隣接する正常な粘膜対応物では発現していなかった。免疫ペルオキシダーゼ染色および膜調製物への直接結合によって示されるように、他の正常組織は、腎臓の遠位尿細管内の細胞集団を除いて陰性であった。このMr 125,000抗原の抗体への結合は、界面活性剤、ドデシル硫酸ナトリウム、およびパラホルムアルデヒド固定によって阻害されたが、FOCUS細胞のトリプシン処理では阻害されなかった。SF-25抗体は¹²⁵Iで標識した場合、体内分布および放射性画像研究による、ヌードマウスにおいて固形腫瘍として増殖したヒト結腸腺癌に限局する著しい能力を示す。SF-25は、正常結腸と形質転換表現型の識別において有用である可能性がある。

さらなる態様において、本発明の配列の任意の1つまたは複数との融合タンパク質において用いられ得る抗体は、AF-10を含む（Takahashi et al. Cancer Res 49(6): 1349-56, 1989）。成熟抗原は、Nグリコシル化単位を有する分子量75,000のコアポリペプチドを含む細胞表面糖タンパク質である。このタンパク質は、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動において、還元条件下では見かけの分子量100,000〜115,000で移動し、非還元条件下ではMr 115,000〜130,000で移動する。モノクローナル抗体AF10が認識するエピトープは、コアタンパク質内に存在する。この抗原は肺腺癌にも発現する。

さらなる態様において、本発明の配列の任意の1つまたは複数との融合タンパク質において用いられ得る抗体は、試験した肝細胞癌の15/15に一様に存在するモノクローナル抗体XF-8およびAF-20の1つまたは複数を含む（Takahashi et al, Hepatology 9(4):625-34, 1989）。すべてとは言えないにしてもほとんどの腫瘍細胞が、これらの抗原を高度に発現する。そのような抗原は隣接する正常肝臓では明白でなく、XF-8エピトープは、他の正常ヒト組織において認められなかった。AF-20抗原の分布により、副腎の球状帯の細胞亜集団における、および小腸管の腺窩細胞上での、低レベルでの発現が明らかになった。放射標識XF-8およびAF-20モノクローナル抗体を単独でまたは組み合わせて投与した場合に、これらがヌードマウスの皮下腫瘍として増殖したB型肝炎ウイルス関連肝細胞癌細胞株（FOCUS）に局在する能力が調べられた。体内分布実験から、¹²⁵I標識抗体の注射用量の15〜22％が腫瘍に良好に局在することが実証された。実際に、XF-8とAF-20を組み合わせて使用することにより、¹²⁵Iの腫瘍細胞表面への送達が増強される。放射画像研究により腫瘍の鮮明な可視化が示され、これらのモノクローナル抗体が、免疫標的剤としてはっきりと見なされるべき十分な特異性および感受性を有することが実証される。

さらなる態様において、本発明の配列の任意の1つまたは複数との融合タンパク質において用いられ得る抗体はAF-20抗体を含み、これはアデノウイルス遺伝子送達ベクターによりHCC細胞を標的化するために用いられた（Yoon et al, Biochem Biophys Res Commun 272(2):497-504, 2000）。筆者らは、ヒト肝細胞癌(HCC)細胞上に高度に発現される180 kDa抗原に結合するモノクローナル抗体(mAb) AF-20を用いた、特異的なアデノウイルス遺伝子送達系を開発した。AF-20 mAbを抗ヘキソン抗体Fab断片に架橋することにより、二機能性Fab-抗体複合体（2Hx-2-AF-20）が作製された。高親和性mAb、AF-20は、HCCおよび他のヒト腫瘍上に大量に発現される、速やかに取り込まれる180-kd細胞表面糖タンパク質を認識する。免疫蛍光法により、FOCUS HCC細胞およびNIH 3T3細胞においてアデノウイルス粒子の取り込みおよび遺伝子発現が試験された；過剰なファイバーノブタンパク質によるアデノウイルスCAR受容体の競合阻害後に、β-ガラクトシダーゼ発現レベルが測定された。AF-20抗原陽性HCC細胞においては、キメラ複合体は37℃で速やかに取り込まれ、レポーター遺伝子発現のレベルの増加が認められたが、AF-20陰性NIH 3T3対照細胞ではこれが認められなかった。AF-20抗体はまた、免疫リポソームをHCC細胞に標的化するために用いられた（Moradpour et al, Hepatology 22(5):1527-37, 1995）。免疫リポソームは、カルボキシフルオレセインを含むリポソームにAF-20を共有結合することにより作製された。インビトロにおける免疫リポソームと種々のHCC細胞株との相互作用が、フローサイトメトリーにより定量的に評価され、蛍光顕微鏡観察により質的に解析された。アイソタイプの一致する非関連モノクローナル抗体(MAb)を有するリポソーム、およびAF-20抗原を発現しない細胞株を対照とした。AF-20-免疫リポソームは、HCCおよびAF-20抗原を発現する他のヒト癌細胞株に特異的に結合し、37℃で速やかに取り込まれた。AF-20結合リポソームとこれらの細胞株との相互作用は、非結合リポソームの場合の5〜200倍であったが、非関連抗体を有する対照リポソームと非結合リポソームとの間に相違は認められなかった。リポソーム-標的細胞相互作用の特異性は、競合阻害アッセイにより確認された。速度論的解析により、AF-20免疫リポソームと標的細胞との迅速な会合が示され、60分後に飽和状態に達した。このように、MAb AF-20はインビトロにおいて、ヒトHCCおよび他のヒト癌細胞株に対する免疫リポソームの高効率であり、特異的であり、かつ迅速な標的を指示する。この標的リポソーム送達系は、HCCに対する免疫標的診断および治療戦略を開発するための有望なアプローチであることを示す。

さらなる態様において、本発明の配列の任意の1つまたは複数との融合タンパク質において用いられ得る抗体は、HCC細胞表面上の抗原に結合するa-hIRS-1抗体を含む（Nishiyama and Wands, Biochem Biophys Res Commun 183(1):280-5, 1992）。この抗原はヒトインスリン受容体基質-1 (hIRS-1)であり、ヒト肝細胞癌(HCC)細胞株（FOCUS）に対して作製されたモノクローナル抗体（本明細書においてa-hIRS-1と称する）を用いて、λGT11発現ライブラリーからクローニングされた。この抗原は、この分子のインスリン作用に応答する固有の機能を示唆し、2つの種間で高度に保存される複数の潜在的リン酸化部位を有する。約180 kDaのhIRS-1タンパク質が免疫沈降され、HuH-7 HCC細胞のインスリン刺激後にチロシン残基がリン酸化されることが見出された。ノーザンブロット解析により、HCC細胞株および組織において単一の約5 kbの転写産物が示された。HCC腫瘍において、隣接する非関与正常肝臓よりも高いレベルのhIRS-1遺伝子転写産物が認められた。

さらなる態様において、本発明の配列の任意の1つまたは複数との融合タンパク質において用いられ得る抗体は、FB-50を含む（Lavaissiere et al, J Clin Invest 98(6）:1313-23, 1996）。FB-50は、初代肝細胞癌10例のうち4例、試験した20の胆管癌のすべて、および種々の形質転換細胞株において高度に発現される抗原と反応する。この抗原はまた、正常肝細胞および非腫瘍上皮細胞での発現が低レベルであるのとは対照的に、乳癌および結腸癌の腫瘍上皮細胞において高度に発現されていた。試験した正常成体組織のうち、胎盤の増殖栄養膜細胞および副腎においてのみ、高いレベルが観察された。HepG2ヒト肝芽腫細胞で作製したγGT11発現ライブラリーから単離された636-bpの部分的cDNA、および逆転写PCRによって作製された完全なcDNAは、抗原をアスパルチル（アスパラギニル）β-ヒドロキシラーゼのヒト型であると同定した。この酵素は、ある種のタンパク質のEGF様ドメイン内の特定のアスパルチル残基およびアスパラギニル残基のβ炭素の翻訳後水酸化を触媒する。いくつかのヒト腫瘍細胞株から調製した抽出物をそれらの正常組織対応物と比較して解析することにより、ヒドロキシラーゼの約10倍という増加は翻訳レベルで調節を受け、そのタンパク質は酵素活性のある形態で発現されることが示される。同様の解析において、患者5名の肝細胞癌を隣接する非関与肝臓と比較したところ、4名の患者の腫瘍組織において酵素活性が非常に高く、その免疫ブロットから悪性組織においてヒドロキシラーゼタンパク質の増加が明らかになった。

さらなる態様において、本発明の配列の任意の1つまたは複数との融合タンパク質において用いられ得る抗体は、SF31およびSF90の1つまたは複数を含む（Ozturk et al, 49(23): 6764-73, 1989）。これらの抗体を用いて、ヒト肝細胞癌由来細胞株（FOCUS）上のMr 50,000の細胞表面タンパク質抗原（p50）が同定された。続いて、この抗原が、インビボでヒト肝細胞癌において発現されることが示された。ウェスタン免疫ブロッティングによって試験した18の腫瘍すべてにおいて、高レベルのp50が示され、隣接する正常肝臓対応物では検出不可能な量であることが認められた。さらなる特徴づけにより、p50は中性pI（6.5〜7.2）を有する単量体ポリペプチドであり、グリコシル化されないらしいことが明らかになった。無傷細胞への直接的な抗体結合、¹²⁵I標識細胞表面タンパク質の免疫沈降、および細胞成分画分のウェスタン免疫ブロッティングにより、細胞局在性が決定された。P50は、細胞表面上および細胞質内に見出された。インビトロモノクローナル抗体結合試験により、このタンパク質が、元の胚組織および分化の程度にかかわらず、これまでに試験したヒト悪性細胞のすべて（n=34）において発現されることが示される。p50は、副腎での高発現を顕著な例外として、正常組織において非常に低レベルで存在していた。類似のタンパク質がウシ副腎においても認められたため、このタンパク質は哺乳動物進化において保存されている。P50の分子的特徴および発現パターンから、この正常な副腎のタンパク質が形質転換表現型と関連することが示唆される。

さらなる態様において、本発明の配列の任意の1つまたは複数との融合タンパク質において用いられ得る抗体は、2A3D2および2D11E2の1つまたは複数を含む。これらはHCCに対するマウスIgMであり（Hiraiwa et al. Cancer Res 50(17):5497-503, 1990）、稀な血液型抗原、Cadに関連するガングリオシドおよびシアロ糖タンパク質を対象とし、ヒト肝細胞癌細胞（PLC/PRF/5）から調製したガングリオシド混合物を免疫原として用いて得られた。これら2つのモノクローナル抗体は、PLC/PRF/5細胞に存在する複数のガングリオシド抗原を検出し、主要な抗原ガングリオシドは、糖質構造GalNAcβ1----4(NeuAcα2----3)Galβ1----3GalNAcβ1----4(NeuAcα2----3)Galβ1----Cerを有する、IV4GalNacβ-GD1aと特徴づけられた。2つの抗体はまた、IV4GalNacβ-GD1aと関連した糖質構造を有する、GM2（GalNacβ1----4(NeuAcα2----3)Galβ1----4Glcβ1----Cer)およびCad活性(Cad-active)ラクトシリーズガングリオシド（IV4GalNAcβ-シアロシルパラグロボシド、GalNacβ1----4(NeuAcα2----3)Galβ1----4GlcNAcβ1----3Galβ1----4Glcβ1----Cer）と反応した。いずれの抗体も、ガングリオシドに加えて、非常に稀なCad陽性ヒトRBC上のグリコホリンAの有する糖質決定基を認識した；その構造は、GalNacβ1----4（NeuAcα2----3）Galβ1----3(NeuAcα2----6)GalNAcα1----Ser/Thrである。これらの知見から、モノクローナル抗体2A3D2および2D11E2はどちらも、3つの糖残基、GalNacβ1----4(NeuAcα2----3)Galβ1----Rから構成される非還元糖質末端を認識し、細胞および組織においてCad関連抗原を検出するのに有用であることが明らかである。これらのモノクローナル抗体を用いることにより、多くの培養ヒト肝細胞癌細胞株および肝細胞癌を有する患者から摘出された癌組織はどちらもCad活性糖タンパク質抗原および関連ガングリオシドを含み、一方、正常肝組織はどちらの種の抗原もほとんど含まないことが明らかになった。培養ヒト肝細胞癌細胞のCad活性糖タンパク質抗原は、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動において、還元条件下でも非還元条件下でも、分子量92,000、75,000、および61,000の3本のバンドとして現れた。本質的に同じ3つのタンパク質が、肝細胞癌を有する患者の癌組織の9例のうち4例（44％）において認められたが、隣接する硬変組織または正常肝組織では認められなかった。

本発明は肝臓癌細胞に特異的な抗体に限定されず、B細胞リンパ腫、骨髄性白血病、腎臓癌、結腸癌、膵臓癌、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌等の任意の癌と特異的に結合する抗体（および他の分子）もまた含まれる。

本発明の複合体において用いられ得り、腫瘍細胞と特異的に結合することが示されている例示的な抗体には、Hellstrom et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)、Drebin et al., Oncogene 2:387-394 (1988)、Papsidero, Semin. Surg. Oncol. 1(4):171-81 (1985)；Schlom, et al., Important Adv. Oncol., 170-92 (1985)；Allum et al., Surg. Ann. 18:41-64 (1986)；およびHoughton et al., Semin. Oncol., 13(2):165-79 (1986)に記載されている抗体が含まれる。

さらなる例示的な癌、癌細胞上の標的分子およびこれらの標的に特異的に結合する分子（抗体を含む）の性質を、以下の表2に記載する。

（表２）本発明の分子を細胞に標的化するための抗体の例

本発明の配列の任意の1つまたは複数との融合タンパク質において使用可能な他の抗体は、具体的に列挙した抗体に加えて、上記の肝臓癌特異的マウスモノクローナル抗体、Hepama-1、抗PLC1、抗PLC2、K-PLC1、K-PLC2、K-PLC3、49-D6、7-E10、34-A4、26-A10、34-B9、79-C8、16-E10、5D3、5C3、2C6、a-AFP、HP-1、hHP-1、mAb 95、YPC2/38.8、P215457、PM4E9917、HAb25、Hab27、KY-1、KY-2、KY-3、9403 Mab、KM-2、S1、9B2、IB1、A9-84、SF-25、AF-10、XF-8、AF-20、a-hIRS-1、FB-50、SF 31、SF 90、2A3D2、および2D11E2のうちの任意の1つが特異的に結合する抗原と同じ抗原に特異的に結合する抗体を含む。

本発明の範囲内の他の抗体には、B細胞リンパ腫、骨髄性白血病、腎臓癌、結腸癌、膵臓癌、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌に特異的に結合する抗体が含まれる。これらは、B細胞受容体に特異的に結合する抗イディオタイプmAb、CD22に特異的に結合する抗CD22 mAb、CD33に特異的に結合する抗CD33 mAb、腎臓γ-グルタミルトランスフェラーゼに特異的に結合するmAb 138H11、ムチン型糖タンパク質に特異的に結合するmAb C242、トランスフェリン受容体に特異的に結合するmAb HB21のFv断片、癌胎児性抗原に特異的に結合するmAb hMN14、Lewis(y)抗原に特異的に結合するmAb BR96およびmAb B3、72 kD結腸癌抗原に特異的に結合するmAb 791T/36、p185^HER-2に特異的に結合するmAb TA1、erbB2に特異的に結合するmAb e23、前立腺幹細胞抗原に特異的に結合するmAb 8D11、ならびにE-セレクチンに特異的に結合する対E-セレクチンmAbによって例示される。

これらの抗体は、上記抗体の任意の抗体と競合的にまたは同時に癌細胞に結合し得る。同時結合は、癌細胞に由来する可溶化細胞表面タンパク質の存在下での、抗体群による任意の抗体による細胞表面マーカー認識化合物の免疫沈降によって示され得る。

好ましい態様において、肝臓癌細胞に特異的に結合する抗体（モノクローナル抗体、またはFab、Fab'、F(ab')2、もしくはscFvのような抗体断片）は、分子量約43,000ダルトンのタンパク質と特異的に結合する抗体である。この肝臓細胞表面タンパク質は、糖タンパク質であってよい。

より好ましい態様において、肝臓癌細胞に特異的に結合する抗体（モノクローナル抗体、またはFab、Fab'、F(ab')2、もしくはscFvのような抗体断片）は、Hepama-1モノクローナル抗体と同じ抗原に、好ましくはHepama-1抗体よりも高い親和性で結合する抗体である。そのような抗体は、マウスモノクローナルまたはウサギモノクローナル技術を含むモノクローナル抗体技術により、mRNAディスプレイおよび/またはリボソームディスプレイにより得ることができる。

タンパク質結合剤を取得する好ましい方法は、Hepama-1標的を同定する段階、Hepama-1標的を精製する段階、および精製Hepama-1標的に対する結合剤を作製する段階を介する。タンパク質結合剤を取得する別の好ましい方法は、Hepama-1標的を同定する段階、Hepama-1標的の細胞外ペプチド部分を含むペプチドを合成する段階、ペプチドに対する結合剤を作製する段階、およびペプチドに対する結合剤がHepama-1抗体よりも高い親和性で肝細胞癌細胞上のHepama-1抗原を認識し得ることを確認する段階を介する。

8. 細胞受容体のリガンドを含む複合体
さらに別の態様において、本発明のタンパク質（MADFおよびADFの1つまたは複数を含むMDHの部分、Htra/Omi、アポトーシス誘導因子、Smac/DIABLO、EndoG、チトクロームC、Nix、Nip3、CIDE-B、ゲルソリン、Bax、Bad、Bid、カスパーゼ活性化DNase、DNase I、およびDNase II）を含み、かつ本発明の範囲内である配列は、細胞受容体（細胞内受容体および細胞表面受容体、より好ましくは細胞表面受容体を含む）のリガンドを含む。本明細書で用いる「リガンド」という用語は、第二分子に結合する分子を指す。特定分子は、リガンドおよび第二分子の一方または両方と見なされ得る。第二分子の例には、リガンドの受容体およびリガンドに結合する抗体が含まれる。したがって、「細胞受容体のリガンド」という用語は、細胞受容体に結合する分子を指す。

1つの態様において、リガンドは、ペプチド（制約されたペプチドを含む）、抗体（単一ドメイン抗体、二重特異性抗体等を含む）、および水晶体またはフィブロネクチンの構造上の既知構造モチーフに基づいた部分的ランダム化タンパク質の1つまたは複数から選択される。別の態様において、細胞受容体のリガンドは、上皮増殖因子、インスリン様増殖因子、線維芽細胞増殖因子、および血管内皮増殖因子の1つまたは複数等の増殖因子を含む。特に好ましい態様において、増殖因子は、核酸配列（配列番号：71）（GenBenk No. J04513.1）のCDS467〜934によってコードされる塩基性線維芽細胞増殖因子である配列番号：70（GenBenk No. AAA52533）を含む。例示的な塩基性線維芽細胞増殖因子である配列番号：70は、融合タンパク質rADF-bFGFとして組換えADF (rADF)に融合させた18 kDヒト塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を表し、これは腫瘍細胞対して毒性があることが示された（実施例6）。

別の態様において、本発明のタンパク質（MADFおよびADFの1つまたは複数を含むMDHの部分、Htra/Omi、アポトーシス誘導因子、Smac/DIABLO、EndoG、チトクロームC、Nix、Nip3、CIDE-B、ゲルソリン、Bax、Bad、Bid、カスパーゼ活性化DNase、DNase I、およびDNase II）を含み、また細胞受容体のリガンドも含む複合体は、N末端シグナルペプチド、細胞内部移行ペプチド、核局在化ペプチド、放射性核種、ビオチン結合タンパク質（ビオチンに特異的な抗体）の1つまたは複数をさらに含む。

9. アプタマーを含む複合体
さらに別の態様において、本発明のタンパク質（MADFおよびADFの1つまたは複数を含むMDHの部分、Htra/Omi、アポトーシス誘導因子、Smac/DIABLO、EndoG、チトクロームC、Nix、Nip3、CIDE-B、ゲルソリン、Bax、Bad、Bid、カスパーゼ活性化DNase、DNase I、およびDNase II）を含み、かつ本発明の範囲内である複合体は、アプタマーを含む。本明細書で用いる「アプタマー」という用語は、低分子リガンドおよびタンパク質等の標的分子に結合する一本鎖オリゴヌクレオチド配列を指す。アプタマーを作製および使用する方法は、当技術分野において周知である（2003年1月28日に公表されたBaez et al.の米国特許第6,511,809号；2003年1月21日に公表されたBeigelman et al.の米国特許第6,509,460号；およびMol Diagn 1999 12月;4(4):381-8；Marshall et al, Current Biology, 5,729-734 (1997)）。

任意に、本発明のタンパク質（MADFおよびADFの1つまたは複数を含むMDHの部分、Htra/Omi、アポトーシス誘導因子、Smac/DIABLO、EndoG、チトクロームC、Nix、Nip3、CIDE-B、ゲルソリン、Bax、Bad、Bid、カスパーゼ活性化DNase、DNase I、およびDNase II）を含むことに加えてアプタマーを含む複合体は、N末端シグナルペプチド、細胞内部移行ペプチド、核局在化ペプチド、放射性核種、ビオチン結合タンパク質（ビオチンに特異的な抗体）の1つまたは複数をさらに含み得る。

C. 本発明の核酸配列
本発明は、MDH部分、MADF、ADF、Htra/Omi、アポトーシス誘導因子、Smac/DIABLO、EndoG、チトクロームC、Nix、Nip3、CIDE-B、ゲルソリン、Bax、Bad、Bid、カスパーゼ活性化DNase、DNase I、およびDNase IIを含むアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む組成物を提供する。「核酸分子」という用語には、RNAおよびDNA（cDNA等）が含まれる。

本発明の核酸配列は、例えば、本発明のタンパク質（MDH部分、MDAF、ADF等）をコードする核酸配列の存在を（例えばサザンブロットハイブリダイゼーションにより）検出するためのプローブとして有用である。本発明の核酸配列はまた、本発明のタンパク質をコードする核酸配列を増幅するための（例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)における）プライマーとしても有用である。本発明の核酸配列はまた、本発明のタンパク質を組換え発現させるためにも有用である。

例えば、様々な種類のcDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーを本発明の核酸の天然源としてスクリーニングすることができ、またはそのような核酸は例えばPCRによりゲノムDNAまたは他の天然源に存在する配列を増幅することにより提供することができる。cDNAライブラリーの選択は、通常、所望のタンパク質のmRNAが豊富である組織源に一致する。通常ファージライブラリーが好ましいが、他の種類のライブラリーを用いることも可能である。ライブラリーのクローンをプレート上に広げ、スクリーニング用の担体に転写し、変性させ、所望の配列の存在に関して探索する。

本発明の核酸断片を用いて、同じ種または他の種から相同タンパク質をコードするcDNAおよび遺伝子を単離することができる。配列依存的な手順を用いた相同遺伝子の単離は、当技術分野において周知である。配列依存的な手順の例には、これらに限定されないが、核酸ハイブリダイゼーション法、ならびに種々の核酸増幅技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応法、リガーゼ連鎖反応法）の使用によって例示されるDNAおよびRNA増幅法が含まれる。

例えば、cDNAまたはゲノムDNAとしてADF相同体をコードする遺伝子は、本発明の核酸断片のすべてまたは一部をDNAハイブリダイゼーションプローブとして使用し、当技術分野において周知の方法を用いて任意の所望の生物に由来するライブラリーをスクリーニングすることにより、直接単離することができる。本発明の核酸配列に基づいた特異的オリゴヌクレオチドプローブは、当技術分野において周知の方法により設計および合成することができる（Current Protocols in Molecular Biology, ed. F. Ausubel et al, John Wiley & Sons, New York 2000）。さらに、配列全体を直接用いて、ランダムプライマーDNA標識、ニックトランスレーション、または末端標識技法等の当業者に周知の方法によりDNAプローブを、または利用可能なインビトロ転写系を用いてRNAプローブを合成することもできる。また、特異的プライマーを設計および使用して、本発明の配列の一部またはすべてを増幅することができる。得られた増幅産物は、増幅反応中に直接標識するか、または増幅反応後に標識し、適切なストリンジェンシー条件下において全長cDNAまたはゲノム断片を単離するためのプローブとして用いることができる。

さらに、本発明の核酸断片の2つの短い部分をポリメラーゼ連鎖反応手順において使用し、DNAまたはRNAから相同遺伝子をコードするより長い核酸断片を増幅することもできる。ポリメラーゼ連鎖反応はまた、一方のプライマーは本発明の核酸断片に由来し、もう一方のプライマーの配列は植物遺伝子をコードするmRNAの3'末端のポリアデニル酸領域の存在を利用して、クローン化核酸断片のライブラリーにおいて用いることもできる。または、第二プライマー配列は、クローニングベクターに由来する配列に基づいてもよい。例えば、当業者は、RACE手順（Frohman et al., (1988) PNAS USA 85:8998）に従って、PCRを用いて転写産物内の一点と3'または5'末端との間の領域のコピーを増幅することにより、cDNAを作製することができる。3'および5'方向に配向したプライマーは、本発明の配列から設計し得る。市販の3'RACEまたは5'RACE系（BRL）を用いて、特定の3'または5'cDNA断片を単離することができる（Ohara et al., (1989) PNAS USA 86:5673；Loh et al., (1989) Science 243:217）。3'および5'RACE手順によって作製された産物を組み合わせて、全長cDNAを作製することができる（Frohman, M.A. and Martin G. R., (1989) Techniques 1:165）。

本発明のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列が利用可能であるために、cDNA発現ライブラリーの免疫学的スクリーニングが容易になる。本発明のアミノ酸配列の一部を表す合成ペプチドを合成し得る。これらのペプチドを用いて動物を免疫し、このアミノ酸配列を含むペプチドまたはタンパク質に対して特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を産生することができる。次いで、これらの抗体を用いてcDNA発現ライブラリーをスクリーニングし、関心対象の全長cDNAクローンを単離することができる（Lerner, R. A. (1984) Adv. Immunol. 36:1；Current Protocols in Molecular Biology, ed. F. Ausubel et al, John Wiley & Sons, New York, 2000）。

本明細書における、任意の具体的に指定されるヌクレオチド配列（本発明のタンパク質にうちの任意の1つをコードする（配列番号：5（GenBank: NP-005909）、配列番号：9（GenBank: NM_145074）、配列番号：11（GenBank: AF100928）、配列番号：13（GenBank: AF298770）、配列番号：15（GenBank: BC026033）、配列番号：17（Bcl-2 GenBank: M14745）、配列番号：19（GenBank: NM_138764）、配列番号：21（GenBank: AF031523）、配列番号：23（GenBank: AF250233）、配列番号：25（GenBank: NM_004435）、配列番号：27（GenBank: AB013918）、配列番号：29（GenBank: BC007112）、配列番号：31（GenBank: NM_001963）、配列番号：33（GenBank: AY047581）、配列番号：35（GenBank: NM_001885）、配列番号：37（GenBank: M20704）、配列番号：39（GenBank: BT006856）、配列番号：41（GenBank: AJ298844）、配列番号：43（GenBank: AF060222）、配列番号：45（GenBank : U10421）、配列番号：47（GenBank: NM_000612）、配列番号：49（GenBank: NM_033137）、配列番号：51（GenBank: AY463230）、配列番号：73（GenBank: AY339584）、配列番号：75（GenBank: AF452712）、配列番号：77（GenBank: AF002697）、および配列番号：79（GenBank: AF544398）等）への言及は、その範囲内に、ありとあらゆる等価なその断片、その相同体、および高ストリンジェントおよび/または中程度のストリンジェント条件下において、具体的に指定されるヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。1つの態様において、これらの等価物は、具体的に指定されるヌクレオチド配列の、任意の方法によって検出可能な（本明細書に記載のおよび/または当技術分野において周知のような）生物活性の少なくとも1つを有する。

ヌクレオチド配列の「断片」または「部分」は、例示的な5個、10個、20個、50個、または100個の連続したヌクレオチド残基から全核酸配列マイナス1核酸残基の大きさであってよい。したがって、ヌクレオチド配列の「少なくとも一部」を含む核酸配列は、ヌクレオチド配列の5個の連続したヌクレオチド残基から全ヌクレオチド配列までを含む。

例えば、ミトコンドリアリンゴ酸脱水素酵素部分、DNA断片化最小活性化因子タンパク質、およびDNA断片化活性化因子タンパク質に関して、配列番号：5（GenGenBank: NP_005909）のそのような部分は、これらのタンパク質をコードし、かつまた(1) 5'核酸1個、(2) 5'核酸2個、(3) 5'核酸3個、(4) 5'核酸4個、(5) 5'核酸5個、(6) 5'核酸6個、(6) 5'核酸6個、(7) 3'核酸1個、(8) 3'核酸2個、(9) 3'核酸3個、(10) 3'核酸4個、(11) 3'核酸5個、(12) 3'核酸6個、(13) 3'核酸7個、(13) 5'核酸1個および3'核酸1個、(14) 5'核酸2個および3'核酸1個、(15) 5'核酸3個および3'核酸1個、(16) 5'核酸4個および3'核酸1個、(17) 5'核酸1個および3'核酸2個、(18) 5'核酸1個および3'核酸3個、(19) 5'核酸1個および3'核酸4個、(20) 5'核酸1個および3'核酸5個、(21) 5'核酸1個および3'核酸6個、(22) 5'核酸1個および3'核酸7個、(23) 5'核酸2個および3'核酸2個、(24) 5'核酸2個および3'核酸3個、(25) 5'核酸3個および3'核酸4個、(26) 5'核酸1個および3'核酸4個、(27) 5'核酸2個および3'核酸6個、(28) 5'核酸3個および3'核酸2個、(29) 5'核酸6個および3'核酸5個、ならびに(30) 5'核酸5個および3'核酸7個を欠く。

別の例において、本発明はさらに、(1) 5'核酸1個、(2) 5'核酸2個、(3) 5'核酸3個、(4) 5'核酸4個、(5) 5'核酸5個、(6) 5'核酸6個、(6) 5'核酸6個、(7) 3'核酸1個、(8) 3'核酸2個、(9) 3'核酸3個、(10) 3'核酸4個、(11) 3'核酸5個、(12) 3'核酸6個、(13) 3'核酸7個、(13) 5'核酸1個および3'核酸1個、(14) 5'核酸2個および3'核酸1個、(15) 5'核酸3個および3'核酸1個、(16) 5'核酸4個および3'核酸1個、(17) 5'核酸1個および3'核酸2個、(18) 5'核酸1個および3'核酸3個、(19) 5'核酸1個および3'核酸4個、(20) 5'核酸1個および3'核酸5個、(21) 5'核酸1個および3'核酸6個、(22) 5'核酸1個および3'核酸7個、(23) 5'核酸2個および3'核酸2個、(24) 5'核酸2個および3'核酸3個、(25) 5'核酸3個および3'核酸4個、(26) 5'核酸1個および3'核酸4個、(27) 5'核酸2個および3'核酸6個、(28) 5'核酸3個および3'核酸2個、(29) 5'核酸6個および3'核酸5個、ならびに(30) 5'核酸5個および3'核酸7個を欠く、Htra/Omi（配列番号：9）、アポトーシス誘導因子（配列番号：11）、Smac/DIABLO（配列番号：13）、EndoG（配列番号：25）、チトクロームC（配列番号：73）、Nix（配列番号：75）、Nip3（配列番号：77）、CIDE-B（配列番号：79、GenBank: AF544398）、ゲルソリン（配列番号：15）、Bcl-2（配列番号：17）、Bax（配列番号：19）、Bad（配列番号：21）、Bid（配列番号：23）、カスパーゼ活性化DNase（配列番号：27）、DNase I（配列番号：41）、DNase II（配列番号：43）、CADヌクレアーゼ阻害剤（配列番号：29）、上皮増殖因子（配列番号：31）、血管内皮増殖因子（配列番号：33）、水晶体タンパク質（配列番号：35）、アンテナペディアタンパク質（配列番号：37）、フィブロネクチン1型（配列番号：39）、ヒトHOXタンパク質（配列番号：46）、インスリン様増殖因子（配列番号：47）、線維芽細胞増殖因子（配列番号：49）、およびHIV Tatタンパク質（配列番号：51）の例示的な部分をさらに包含する。

具体的に指定されるヌクレオチド配列または具体的に指定されるアミノ酸配列（MDH部分、MADF、ADF、Htra/Omi、アポトーシス誘導因子、Smac/DIABLO、EndoG、チトクロームC、Nix、Nip3、CIDE-B、ゲルソリン、Bcl-2、Bax、Bad、Bid、カスパーゼ活性化DNase、DNase I、DNase II、CADヌクレアーゼ阻害剤、上皮増殖因子、血管内皮増殖因子、水晶体タンパク質、アンテナペディアタンパク質、フィブロネクチン1型、ヒトHOXタンパク質、インスリン様増殖因子、線維芽細胞増殖因子、およびHIV Tatタンパク質等）に関する場合の「相同体」という用語は、具体的に指定されるヌクレオチド配列または具体的に指定されるアミノ酸配列それぞれと少なくとも50％の同一性、少なくとも65％の同一性、少なくとも70％の同一性、少なくとも75％の同一性、少なくとも80％の同一性、少なくとも85％の同一性、少なくとも90％の同一性、および/または少なくとも95％の同一性を示すヌクレオチド配列およびアミノ酸配列それぞれを指す。2つのヌクレオチド配列または2つのアミノ酸配列の相同性のレベル（すなわちパーセント同一性）を決定するには、最適な比較を目的として2つの配列をアラインする（例えば、最適アラインメントのために、2つのヌクレオチド配列および2つのアミノ酸配列の一方または両方にギャップを導入し、比較目的のために非相同配列を無視してもよい）。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第一配列内のある位置が第二配列内の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占有される場合、分子はその位置において同一である。2つの配列間のパーセント同一性は、2つの配列の最適アラインメントのために導入される必要のあるギャップの数、各ギャップの長さを考慮に入れた、配列が共有する同一位置数の関数である。比較のための配列の最適アラインメントは、周知のアルゴリズム（例えば、Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison WisのGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA、またはNational Center for Biotechnology Informationから利用可能なBlastNおよびBlastX）のコンピュータによる実行により、PAM120荷重残基表(weight residue table)、ギャップ長ペナルティ12、およびギャップペナルティ4を用いて、ALIGNプログラム（バージョン2.0）に組み入れられているE, Myers およびW. Miller（CABIOS, 4:11-17 (1989)）のアルゴリズムを用いることにより、または目視により行うことができる。配列は典型的に、初期設定パラメータを用いてBlastNまたはBlastXにより比較する。

本発明のヌクレオチド配列の等価な相同体はまた、プローブとして既知遺伝子の塩基配列を有するDNAを用いて、例えば、「Cloning and Sequence」（Itaru Watanabe監修、Masahiro Sugiura編集、Noson Bunka-shaにより1989年に出版）に記載されているサザンハイブリダイゼーションにより同定することもできる。遺伝子は、既知遺伝子の塩基配列を有するDNAであるか、または既知遺伝子のDNAの1つまたは複数の塩基が付加、欠失、もしくは置換された塩基配列を有するDNAである可能性がある。例えば、二本鎖DNAを、95℃で1分間の熱処理または0.5 M NaOH、1.5 M NaClによるアルカリ処理後に、氷上で1分間冷却するかまたは0.5 M Tris-HCl（pH 7.0）、3.0 M NaClによる中和に供することによって相補的な一本鎖DNA鎖に解離させると、上記の一本鎖DNAに相補的な一本鎖DNAまたは一本鎖RNAと会合して、再度二本鎖状態（すなわち、ハイブリダイズした状態）になり得る。そのようなDNAは通常、既知遺伝子の塩基配列との高い相同性（領域が活性部位または構造に密接に関連するかどうかによって変動し得るが、例えば、全体として約90％またはそれよりも高い相同性）を有する塩基配列を有する遺伝子である可能性がある。

本発明の核酸配列およびタンパク質配列はさらに、例えば他のファミリーメンバーまたは関連配列を同定するために、配列データベースに対して検索を行うための「問い合わせ配列」として用いることもできる。そのような検索は、Altschulら（J. Mol. Biol. 215:403-10 (1990)）のNBLASTおよびXBLASTプログラム（バージョン2.0）を用いて実行することができる。本発明の核酸分子と相同的なヌクレオチド配列を得るためには、NBLASTプログラム、スコア=100、ワード長=12を用いてBLASTヌクレオチド検索を行うことができる。本発明のタンパク質と相同的なアミノ酸配列を得るためには、XBLASTプログラム、スコア=50、ワード長=3を用いてBLASTタンパク質検索を行うことができる。比較目的でギャップの入ったアラインメントを得るためには、Altschul et al.（Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402 (1997)）に記載されているようにGapped BLASTを利用することができる。BLASATおよびgapped BLASTプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、XBLASTおよびNBLAST）の初期設定パラメータを用いることができる。

1つの態様において、具体的に指定されるヌクレオチド配列の「相同体」とは、1つまたは複数のトリプレットが、遺伝暗号の重複性（すなわち、RNAコドンに対応する61の異なるDNAトリプレットが、20の異なるアミノ酸をコードすることが知られている）に準拠して、同じアミノ酸をコードする異なるトリプレットで置換されたオリゴヌクレオチド配列を指す。そのような相同体は、異なる種によるコドン使用の偏りを利用し、それによりヌクレオチド配列の最適な翻訳効率を確実にするために望ましい場合がある。

以下に、異なるアミノ酸をコードするDNAトリプレットを要約する：フェニルアラニンはTTT、TTCによってコードされ、ロイシンはTTA、TTG、CTT、CTC、CTA、CTGによってコードされ、イソロイシンンはATT、ATC、ATAによってコードされ、メチオニンはATGによってコードされ、バリンはGTT、GTC、GTA、GTGによってコードされ、セリンはTCT、TCC、TCA、TCGによってコードされ、プロリンはCCT、CCC、CCA、CCGによってコードされ、スレオニンはACT、ACC、ACA、ACGによってコードされ、アラニンはGCT、GCC、GCA、GCGによってコードされ、チロシンはTAT、TACによってコードされ、ヒスチジンはCAT、CACによってコードされ、グルタミンはCAA、CAGによってコードされ、アスパラギンはAAT、AACによってコードされ、リジンはAAA、AAGによってコードされ、アスパラギン酸はGAT、GACによってコードされ、グルタミン酸はGAA、GAGによってコードされ、システインはTGT、TGCによってコードされ、トリプトファンはTGGによってコードされ、アルギニンはCGT、CGC、CGA、CGGによってコードされ、セリンはAGT、AGCによってコードされ、アルギニンはAGA、AGGによってコードされ、グリシンはGGT、GGC、GGA、GGGによってコードされ、終止コドンはTAA、TAG、TGAを含む。

例えば、ADFをコードするDNA配列の相同体は、対応するアミノ酸配列である配列番号：7の以下のアミノ酸をコードするトリプレットが次の通りである、ヌクレオチド配列である配列番号：5（GenGenBank: NP_005909）の対応する部分によって例示されるが、これらに限定されない：アミノ酸20位、22位、39位、50位、73位、95位の一箇所または複数箇所におけるフェニルアラニンが、TTT、TTCの任意の1つによって独立的にコードされる；アミノ酸11位、24位、54位、55位、56位、65位、85位、99位の一箇所または複数箇所におけるロイシンが、TTA、TTG、CTT、CTC、CTA、CTGの任意の1つによって独立的にコードされる；アミノ酸61位、67位、78位、82位、89位の一箇所または複数箇所におけるイソロイシンが、ATT、ATC、ATAの任意の1つによって独立的にコードされる；アミノ酸21位、25位、34位、35位、40位、70位、96位の一箇所または複数箇所におけるバリンが、GTT、GTC、GTA、GTGの任意の1つによって独立的にコードされる；アミノ酸8位、12位、23位、38位、42位、51位、71位、72位、79位、88位の一箇所または複数箇所におけるセリンが、TCT、TCC、TCA、TCGの任意の1つによって独立的にコードされる；アミノ酸53位、83位の一箇所または複数箇所におけるプロリンが、CCT、CCC、CCA、CCGの任意の1つによって独立的にコードされる；アミノ酸10位、45位、48位、52位、98位の一箇所または複数箇所におけるスレオニンが、ACT、ACC、ACA、ACGの任意の1つによって独立的にコードされる；アミノ酸2位、4位、6位、9位、14位、16位、18位、27位、81位、87位の一箇所または複数箇所におけるアラニンが、GCT、GCC、GCA、GCGの任意の1つによって独立的にコードされる;アミノ酸15位、49位の一箇所または複数箇所におけるチロシンが、TAT、TACの任意の1つによって独立的にコードされる；アミノ酸43位のグルタミンが、CAA、CAGの任意の1つによって独立的にコードされる;アミノ酸29位、64位の一箇所または複数箇所におけるアスパラギンが、AAT、AACの任意の1つによって独立的にコードされる；アミノ酸1位、3位、31位、41位、58位、59位、63位、69位、76位、86位、90位、91位、97位、100位の一箇所または複数箇所におけるリジンが、AAA、AAGの任意の1つによって独立的にコードされる；アミノ酸26位、80位、94位の一箇所または複数箇所におけるアスパラギン酸が、GAT、GACの任意の1つによって独立的にコードされる；アミノ酸32位、36位、44位、46位、62位、74位、75位、84位、93位の一箇所または複数箇所におけるグルタミン酸が、GAA、GAGの任意の1つによって独立的にコードされる；アミノ酸37位、47位の一箇所または複数箇所におけるシステインが、TGT、TACの任意の1つによって独立的にコードされる；アミノ酸19位のアルギニンが、CGT、CGC、CGA、CGGの任意の1つによって独立的にコードされる；アミノ酸8位、12位、23位、38位、42位、51位、71位、72位、79位、88位の一箇所または複数箇所におけるセリンが、AGT、AGCの任意の1つによって独立的にコードされる；アミノ酸5位、7位、17位、30位、33位、57位、60位、66位、68位、92位の一箇所または複数箇所におけるグリシンが、GGT、GGC、GGA、GGGの任意の1つによって独立的にコードされる。

別の態様において、具体的に指定されるヌクレオチド配列の「相同体」とは、1つのまたは複数のコドンが異なるアミノ酸をコードする異なるコドンで置換されたオリゴヌクレオチド配列を指す。例えば、具体的に指定されるヌクレオチド配列と50％を超える同一性を示す相同体を用いることが望ましい場合がある。

「ハイブリダイゼーション」とは、1つまたは複数のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合を介して安定化された複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソン-クリック塩基対形成、フーグスティーン（Hoogstein）結合、または任意の他の配列特異的様式によって起こり得る。複合体は、二本の鎖が形成する二本鎖構造、三本またはそれ以上の鎖が形成する複数鎖複合体、単一の自己ハイブリダイズ鎖、またはこれらの任意の組み合わせを含み得る。ハイブリダイゼーション反応は、PCRの開始、またはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素的切断等の、より広範囲な過程における段階を構成してもよい。

本明細書で用いる「ストリンジェンシー」という用語は、核酸ハイブリダイゼーションが行われる、温度、イオン強度、および有機溶媒等の他の化合物の存在の条件に関して用いられる。当業者は、「ストリンジェンシー」条件が、記載されるパラメータを個々にまたは協調して変動させることによって変更され得ることを理解すると考えられる。「高ストリンジェンシー」条件では、核酸塩基対形成は、高頻度の相補的塩基配列を有する核酸断片間でのみ起こることになる（例えば、「高ストリンジェンシー」条件下でのハイブリダイゼーションは、約85〜100％の同一性、好ましくは約70〜100％の同一性を有する相同体間で起こり得る）。中程度のストリンジェンシー条件では、核酸塩基対形成は、中程度の頻度の相補的塩基配列を有する核酸間で起こることになる（例えば、「中程度のストリンジェンシー」条件下でのハイブリダイゼーションは、約50〜70％の同一性を有する相同体間で起こり得る）。したがって、「弱い」または「低い」ストリンジェンシー条件は、相補的配列の頻度が通常低いことから、遺伝的に多様な生物に由来する核酸に必要とされる場合が多い。

核酸ハイブリダイゼーションに関して用いられる場合の「高ストリンジェンシー条件」は、約500ヌクレオチド長のプローブを用いる場合、5X SSPE（43.8 g/l NaCl、6.9 g/l NaH2PO4-H2O、および1.85 g/l EDTA、NaOHでpHを7.4に調整）、0.5％ SDS、5Xデンハルト試薬、および100 ig/ml変性サケ精子DNAの溶液中での42℃での結合またはハイブリダイゼーション、その後の0.1X SSPE、1.0％ SDSを含む溶液中での42℃での洗浄と等価な条件を含む。別の態様において、高ストリンジェンシー条件は、5X SSPE、1％ SDS、5Xデンハルト試薬、および100μg/ml変性サケ精子DNAを含む溶液中での68℃での結合またはハイブリダイゼーション、その後の0.1X SSPEおよび0.1％ SDSを含む溶液中での68℃での洗浄と等価な条件を含む。

核酸ハイブリダイゼーションに関して用いられる場合の「中程度のストリンジェンシー条件」は、5X SSPE（43.8 g/l NaCl、6.9 g/l NaH2PO4-H2O、および1.85 g/l EDTA、NaOHでpHを7.4に調整）、0.5％ SDS、5Xデンハルト試薬、および100 ig/ml変性サケ精子DNAの溶液中での42℃での結合またはハイブリダイゼーション、その後の1.0X SSPE、1.0％ SDSを含む溶液中での42℃での洗浄と等価な条件を含む。

核酸ハイブリダイゼーションに関して用いられる場合の「低ストリンジェンシー条件」は、5X SSPE（43.8 g/l NaCl、6.9 g/l、NaH₂PO₄.H₂O、および1.85 g/l EDTA、NaOHでpHを7.4に調整）、0.1％ SDS、5Xデンハルト試薬（50X デンハルト試薬は、500 ml当たり：フィコール（タイプ400、Pharmacia）5 g、BSA（フラクションV；Sigma）5 gを含む）、および100 Fg/ml変性サケ精子DNAの溶液中での42℃での結合またはハイブリダイゼーション、その後の5X SSPE、0.1％ SDSを含む溶液中での42℃での洗浄と等価な条件を含む。

「等価な」という用語は、関心対象のハイブリダイゼーション条件に関連する際のハイブリダイゼーション条件に関して用いる場合、ハイブリダイゼーション条件および関心対象のハイブリダイゼーション条件が同程度のパーセント(％)相同性を有する核酸配列のハイブリダイゼーションをもたらすことを意味する。例えば、関心対象のハイブリダイゼーション条件が第一核酸配列と第一核酸配列と50％〜70％の相同性を有する他の核酸配列とのハイブリダイゼーションをもたらす場合、別のハイブリダイゼーション条件は、この他のハイブリダイゼーション条件がやはり第一核酸配列と第一核酸配列と50％〜70％の相同性を有する他の核酸配列とのハイブリダイゼーションをもたらす場合に、関心対象のハイブリダイゼーション条件と等価であると称される。

したがって、配列番号：1（GenBank: P00346）、配列番号：2（GenBank: P00346）、配列番号：3（GenBank: P00346）、配列番号：4（GenBank: NP_005909）、配列番号：6（GenBank: NP_005909）、配列番号：7（GenBank: NP_005909）、配列番号：8（GenGenBank: NM_145074）、配列番号：10（GenBank: AF100928）、配列番号：12（GenBank : AF298770）、配列番号：14（GenBank : BC026033）、配列番号：16（Bcl-2 GenBank: M14745）、配列番号：18（GenBank: NM_138764）、配列番号：20（GenBank: AF031523）、配列番号：22（GenBank: AF250233）、配列番号：24（GenBank: NM_004435）、配列番号：26（GenBank: AB013918）、配列番号：28（GenBank: BC007112）、配列番号：30（GenBank: NM_001963）、配列番号：32（GenBank: AY047581）、配列番号：34（GenBank: NM_001885）、配列番号：36（GenBank : M20704）、配列番号：38（GenBank: BT006856）、配列番号：40（GenBank : AJ298844）、配列番号：42（GenBank: AF060222）、配列番号：44（GenBank: U10421）、配列番号：46（GenBank: NM_000612）、配列番号：48（GenBank: NM_033137）、配列番号：50（GenBank: AY463230）、配列番号：72（GenBank : AY339584）、配列番号：74（GenBank : AF452712）、配列番号：76（GenBank: AF002697）、および配列番号：78（GenBank: AF544398）等の本発明のアミノ酸配列に関して、本発明の範囲内である等価なアミノ酸配列には、好ましくは60℃、0.5 M塩で、より好ましくは60℃、0.75 Mまたは1 M塩で、さらにより好ましくは60℃、1.5 M塩で、これらの配列またはそれらの一部とハイブリダイズする配列が含まれる。

異なるレベルのハイブリダイゼーションストリンジェンシーにおいてハイブリダイズするさらなる等価な配列は、以下のようなハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーを増す既知の条件を用いて単離することができる（ストリンジェンシーが増加する順に）：インキュベーション温度25℃、37℃、50℃、および68℃；緩衝液濃度、10XSSC、6XSSC、1XSSC、0.1XSSC（1XSSCは0.15M NaClおよび15 mMクエン酸緩衝液である）、および他の緩衝液系を用いたそれらの等価物；ホルムアミド濃度、0％、25％、50％、および75％；インキュベーション時間、24時間〜5分；洗浄段階、1回、2回、またはそれ以上；洗浄インキュベーション時間、1分、2分、または15分；ならびに洗浄溶液、6XSSC、1XSSC、0.1XSSC、または脱イオン水。

したがって、1つの態様において、「ミトコンドリアリンゴ酸脱水素酵素をコードする核酸配列」という用語には、例示的なヒト（配列番号：4）（GenGenBank: NP_005909）および/またはブタ（配列番号：1）（GenBank: P00346）、それらの断片、およびそれらの変種をコードする配列が含まれる。そのような核酸配列は、ヒト配列番号：5（GenGenBank: NP_005909）、ならびに等価なその断片、その相同体、および高ストリンジェントおよび/または中程度のストリンジェント条件下で配列番号：5および/またはその一部とハイブリダイズする配列によって例示される。

別の態様において、「DNA断片化最小活性化因子をコードする核酸配列」という用語は、ヒト（配列番号：6）（GenGenBank: NP_005909）、ブタ（配列番号：2）（GenBank: P00346）、それらの断片、および/またはそれらの変種をコードする核酸配列を指す。そのような核酸配列は、配列番号：5の一部、ならびに等価なその断片、その相同体、および高ストリンジェントおよび/または中程度のストリンジェント条件下で配列番号：5および/またはその一部とハイブリダイズする配列によって例示される。

さらなる態様において、「DNA断片化活性化因子をコードする核酸配列」という用語は、ヒト（配列番号：7）（GenGenBank: NP_005909）、ブタ（配列番号：3）（GenBank: P00346）、それらの断片、および/またはそれらの変種をコードする核酸配列を指す。そのような核酸配列は、配列番号：5の一部、ならびに等価なその断片、その相同体、および高ストリンジェントおよび/または中程度のストリンジェント条件下で配列番号：5および/またはその一部とハイブリダイズする配列によって例示される。

さらに別の態様において、「コードする核酸配列」という用語は、例示的なタンパク質Htra/Omi、アポトーシス誘導因子、Smac/DIABLO、EndoG、チトクロームC、Nix、Nip3、CIDE-B、ゲルソリン、Bcl-2、Bax、Bad、Bid、カスパーゼ活性化DNase、DNase I、DNase II、CADヌクレアーゼ阻害剤、上皮増殖因子、血管内皮増殖因子、水晶体タンパク質、アンテナペディアタンパク質、フィブロネクチン1型、ヒトHOXタンパク質、インスリン様増殖因子、および線維芽細胞増殖因子をコードする核酸配列に関して用いる場合、それぞれ例示的な核酸配列である配列番号：9、11、13、25、73、75、77、79、15、17、19、21、23、27、41、43、29、31、33、35、37、39、45、47、および49、ならびに等価なそれらの断片、それらの相同体、および高ストリンジェントおよび/または中程度のストリンジェント条件下でこれらのヌクレオチド配列および/またはそれらの一部とハイブリダイズする配列を指す。

1つの態様において、本発明のヌクレオチド配列によってコードされるMDHの部分は、1つまたは複数のMADF配列を含み、より好ましくは1つまたは複数のADF配列を含む。好ましい態様において、コードされるアミノ酸配列は、DNAヌクレアーゼ活性および殺細胞活性の1つまたは複数から選択される活性を有する。このことは、本発明の方法において用いるため等、アポトーシスを増加させるタンパク質の発現が目的である場合に、望ましい場合がある。より好ましい態様において、DNAヌクレアーゼ活性および/または殺細胞活性を有するアミノ酸配列は、抗体、細胞受容体のリガンド、N末端シグナルペプチド、細胞内部移行ペプチド、核局在化ペプチド、およびビオチン結合タンパク質（抗ビオチン抗体等）の1つまたは複数をさらに含む。

D. ベクターおよび細胞
本発明は、MDHの1つまたは複数の部分をコードする核酸配列を含む発現ベクターを提供する。好ましくはMDH部分はMADFを含み、より好ましくはその部分はADFを含む。本発明はまた、Htra/Omi、アポトーシス誘導因子、Smac/DIABLO、EndoG、チトクロームC、Nix、Nip3、CIDE-B、ゲルソリン、Bax、Bad、Bid、カスパーゼ活性化DNase、DNase I、およびDNase II等の1つまたは複数をコードする核酸配列を含む発現ベクターを提供する。

本発明の発現ベクターは、本発明のタンパク質の産生において有用であり、その有用性について本明細書でさらに説明する。

本明細書で用いる「ベクター」および「媒体」という用語は、1つの細胞から別の細胞にDNA部分を伝達する核酸分子に関して互換的に用いられる。ベクターは、プラスミド、直鎖状DNA、キャプシド形成したウイルス等によって例示されるが、これらに限定されない。本明細書で用いる「発現ベクター」という用語は、所望のコード配列、および特定の宿主生物において、機能的に連結されるコード配列の発現（すなわち、転写および/または翻訳）に必要である適切な核酸配列を含む組換えDNA分子を指す。発現ベクターは、プラスミド、ファージミド、シャトルベクター、コスミド、ウイルス、染色体、ミトコンドリアDNA、色素体DNA、および核酸断片によって例示されるが、これらに限定されない。原核生物における発現に用いられる核酸配列には、プロモーター、任意にオペレーター配列、リボソーム結合配列、および場合により他の配列が含まれる。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー、ならびに終結およびポリアデニル化シグナルを利用することが知られている。

必要とはされないが、1つの態様において、発現ベクターによってコードされるアミノ酸配列は、DNAヌクレアーゼ活性および殺細胞活性の1つまたは複数から選択される活性を有する。別の態様において、コードされるアミノ酸は、抗体、細胞受容体のリガンド、N末端シグナルペプチド、細胞内部移行ペプチド、核局在化ペプチド、放射性核種、およびビオチン結合タンパク質（抗ビオチン抗体等）の1つまたは複数をさらに含む。

本発明の発現ベクターを作製する方法は、当技術分野において周知である。例えば、例示的なADFタンパク質のクローニングおよび発現では、以下の段階を行い得る：(1) ADFタンパク質のメッセンジャーRNA (mRNA)の単離および精製、(2) mRNAの二本鎖DNA (ds-cDNA)への変換、(3) オリゴdC末端を付加したds-cDNAの構築、(4) オリゴdC末端化ds-cDNAを、オリゴdG末端を付加したベクターに結合することによる、ハイブリッドプラスミドの構築、(5) 微生物の形質転換およびクローンの選択、(6) DNA配列の解析による、ADFタンパク質遺伝子領域の特徴の確認、ならびに(7) ADFタンパク質酵素活性の発現の確認。

ADFをコードする配列（配列番号：5の一部等）を、それぞれの宿主において機能するプロモーター領域の3'末端とターミネーター領域の5'末端との間に挿入することによって、種々の宿主（大腸菌、枯草菌、パン酵母等）内で複製可能なベクターに組み込むことができる。このようにして、ADFタンパク質の発現を可能にする組換えDNAプラスミドを構築することができる。

発現ベクターはプロモーターを含んでもよい。本明細書で用いる「プロモーター」という用語は、関心対象のヌクレオチド配列に連結された場合に、関心対象のヌクレオチド配列のmRNAへの転写を調節し得るヌクレオチド配列を指す。

プロモーター領域は、翻訳開始領域をさらに含み得る。例えば、宿主が大腸菌である場合、翻訳開始領域はシャイン・ダルガルノ配列またはリボソーム結合部位（すなわち、リボソームが結合可能なmRNAのヌクレオチド配列に相当する部位）から開始コドン（例えばATG）に及ぶ。シャイン・ダルガルノ配列と開始コドンとの距離は、約10塩基長であることが好ましい。

宿主が大腸菌等の原核生物である場合、ターミネーター領域は必ずしも必要ではない。しかし、ターミネーター領域の存在は、いくつかのさらなる効果を有することが知られている。したがって、大腸菌を宿主として用いる場合、ADFタンパク質の構造遺伝子は、プラスミド内に存在し大腸菌において機能するプロモーター領域の3'末端において、大腸菌内で複製可能なプラスミドに挿入し得る。好ましいプロモーター領域には、例えば、トリプトファン(trp)プロモーター、ラクトース(lac)プロモーター、tacプロモーター、PLλプロモーター等が含まれる。したがって、これらのプロモーター領域を含む種々のベクター（pBR322、pUC等）は、本発明において有用である。

実際には、そのようなベクターは、プロモーター領域の3'末端において適切な制限エンドヌクレアーゼで切断する。ADFタンパク質の構造遺伝子が同じ付着末端を有する場合には、ベクターに直接挿入することができる。ADFタンパク質遺伝子の付着末端が一致しないDNA配列を有する場合には、新たな末端を作製する。次いで、リガーゼを用いてADFタンパク質遺伝子をベクターに挿入し得る。

プロモーター領域の3'末端とターミネーター領域の5'末端との間にADFタンパク質遺伝子を挿入することによって構築された組換えDNAプラスミドを用いて、周知の方法に従って大腸菌を形質転換することができる。

本発明の発現ベクターは「選択マーカーをコードするヌクレオチド配列」を含んでよく、これは宿主細胞内で発現することができ、選択マーカーが発現した場合に、発現された遺伝子を含む細胞に、対応する選択剤の存在下で増殖する能力を付与するヌクレオチド配列を指す。選択マーカー遺伝子は、細胞内で薬剤G418に対する耐性を付与する細菌のアミノグリコシド3'ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（neo遺伝子とも称する）、(2) 抗生物質ハイグロマイシンに対する耐性を付与する細菌のハイグロマイシンGホスホトランスフェラーゼ(hyg)遺伝子、および(3) ミコフェノール酸の存在下で増殖する能力を付与する、細菌のキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（gpt遺伝子とも称する）によって例示される。

本発明はまた、本発明の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。「宿主」細胞には、ベクターまたは核酸分子および/またはタンパク質の取り込みのレシピエントとなり得る、またはレシピエントである、個々の細胞または細胞培養物が含まれる。宿主細胞には単一の宿主細胞の子孫が含まれ、子孫は、自然の、偶発的な、または意図的な変異によって、元の親細胞と（形態においてまたは全DNA相補物のゲノムにおいて）必ずしも完全に同一でなくてもよい。宿主細胞には、本発明のポリヌクレオチドを用いてインビボでトランスフェクションされた細胞も含まれる。

宿主細胞は、細胞株または細胞培養物に由来し得る。「細胞株」または「細胞培養物」とは、インビトロで増殖するまたは維持される細胞を示す。細胞の子孫は親細胞と（形態的に、遺伝子型で、または表現型で）完全に同一でなくてよいことが理解される。「無培養」と称される細胞は生体から直接得られ、一般に生体から離れて限られた時間のみ（すなわち、細胞が実質的な複製を行うのに十分長くないか、または細胞が実質的な複製を行うための条件下ではなく）維持される。

本発明のベクターを含む宿主細胞には、これらに限定されないが、大腸菌等の原核細胞、または酵母、植物、昆虫、両生類、もしくは動物等の真核細胞（B細胞、脾臓等のリンパ器官の間質細胞、マウス胚性線維芽細胞(MEF)を含む胚性線維芽細胞(EF)等の線維芽細胞、間質マクロファージ細胞等のマクロファージ細胞、樹状細胞、ニューロン細胞、形質細胞、リンパ球細胞、リンパ芽球様細胞、骨髄性細胞、ホジキンリンパ腫のリード・スタンバーグ(HRS)細胞、乳腺細胞、胃細胞(gastric cell)、肺細胞、前立腺細胞、頸部細胞、膵臓細胞、結腸細胞、卵巣細胞、直腸細胞、胃細胞(stomach cell)、食道細胞、口腔細胞、舌細胞、歯肉細胞、皮膚細胞、筋細胞、心臓細胞、肝細胞、気管支細胞、軟骨細胞、骨細胞、精巣細胞、腎臓細胞、子宮内膜細胞、子宮細胞、膀胱細胞、胃腸管細胞、甲状腺細胞、脳細胞、胆嚢細胞、胃腸管細胞、および眼細胞（角膜の細胞、ブドウ膜の細胞、脈絡膜の細胞、黄斑の細胞、硝子体液細胞等）等の上皮細胞等）が含まれる。本明細書で用いる「動物」とは、哺乳動物（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、およびモルモット等のげっ歯類、ヒツジ、ウシ、反芻動物、ウサギ目の動物、ブタ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、鳥類等）を含む任意の多細胞動物を指す。

発現ベクターを細胞に導入することができ、得られた形質転換体を、薬剤耐性（例えばアンピシリン耐性）、栄養要求性等の表現型形質に基づいて選択することができる。次いで、そのような表現型形質を表す細胞から、ADFタンパク質活性を有する細胞を選択する。上記の方法で選択された形質転換体を、周知の方法により培養することができる。このために使用する培地は、例えば、ブロスまたはグルコースおよび/または必要な栄養素を含む合成培地であってよい。

プロモーターをより効率的に機能させることが望ましい場合には、イソプロピル-β-チオガラクトシド（以下、IPTGと省略する）またはインドールアクリル酸（以下、IAAと省略する）等の化学物質を培地に添加してもよい。

形質転換体は通常、15〜43℃、好ましくは28〜42℃で、4〜48時間、好ましくは4〜20時間インキュベートする。必要に応じて、通気および/または撹拌を利用してもよい。

パン酵母（サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae））を宿主として使用する場合、その形質転換体を以下の方法で作製することができる：以前に記載されているようなYRp7またはpMA3等の大腸菌-酵母シャトルベクターに、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター領域、またはアルコールデヒドロゲナーゼI遺伝子のプロモーター領域等の、パン酵母において機能するプロモーター領域を挿入する。次いで、リガーゼを用いて、ADFタンパク質の構造遺伝子を含むDNA断片を、挿入されたプロモーター領域の3'に結合する。さらに、ターミネーターとしての、mRNAから転写されず、アルコールデヒドロゲナーゼI遺伝子に含まれる3'末端非翻訳領域、またはmRNAから転写されず、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子に含まれる3'末端非翻訳領域を選択し、リガーゼを用いてADFの構造遺伝子の3'末端に結合する。その後、選択された非翻訳領域の3'末端をシャトルベクターの5'末端に結合することにより、プラスミドを環化する。

この環化プラスミドを用いて、周知の方法に従って大腸菌を形質転換する。得られた形質転換体を、アンピシリン耐性等の表現型形質に基づいて選択することができる。アルカリ抽出法により、これらの大腸菌形質転換体の細胞から、プラスミドDNAを単離する。このプラスミドを用いて、周知の方法に従い、酵母の栄養要求株（S. セレビシエATCC 44771株の変異によって得られたMT-40391リジン依存株等）を形質転換する。宿主の栄養要求性の復帰に基づいて、形質転換酵母を選択することができる。形質転換酵母は、種々の周知の培地のいずれかで培養し得る。このために使用する培地は、例えば、グルコースおよび他の必要な栄養素をWickerhamのアミノ酸非含有培地に添加することによって調製される培地であってよい。

酵母は通常、15〜40℃で24〜72時間インキュベートする。必要に応じて、通気および/または撹拌を利用してもよい。

上記の方法で微生物を培養した後、得られた培養液から任意の従来法に従って細胞を回収し得り、細胞壁および他の細胞構造を破壊することによって、回収された細胞内に産生され蓄積されたたADFタンパク質を抽出することができる。このために、有機溶媒、界面活性剤等との接触；超音波処理、ガラスビーズ破壊等の機械的処理；ならびに適切な溶菌酵素による処理、自己溶菌等の生化学的手順を用い得る。

上記の方法で調製した粗製酵素、ポリアクリルアミドゲルもしくはアルギン酸ゲル等の固定化剤に、回収した細胞を包埋することによって得られた固定化細胞、または回収した細胞自体を用いて、アンモニア供与体と桂皮酸との酵素反応を行い、それによりL-Pheを生成することができる。この酵素反応は、例えば、反応混合物が桂皮酸に対して過剰のアンモニア供与体を含み、桂皮酸の濃度が酵素反応の阻害レベルを超えない、日本特許公報第044474/'86号の工程を含む、種々の従来の仮定に従って行うことができる。

E. ADFに特異的な抗体
本発明は、MDH部分に特異的に結合する抗体を提供する。1つの態様において、MDH部分は、1つまたは複数のMADF、より好ましくは1つまたは複数のADFを含む。これらの抗体は、例えば、以下にさらに記載するように、細胞質中のADFの存在を検出し、それにより細胞をアポトーシス性であると同定するおよび/または細胞におけるアポトーシスの程度を定量化するのに有用である。本発明の抗体はまた、以下にさらに記載するように、細胞のアポトーシスを減少させる試験物質の同定においても有用である。好ましい態様では、抗体のMDH部分（MADFおよびADF部分等）への結合により、MDH部分のDNAヌクレアーゼ活性および殺細胞活性の1つまたは複数が減少する。

本発明は、MDH部分（MADFおよびADF部分等）に特異的に結合する抗体が、FabおよびscFv等のファージディスプレイに由来する抗体断片を含め、モノクローナル、ポリクローナル、キメラ、非免疫化、および/またはヒト化抗体であることを明確に意図する。好ましい態様において、本発明の抗体は、ADFに対する親和性よりも低い親和性で非切断型ミトコンドリアリンゴ酸脱水素酵素(MDH)に特異的に結合する。

F. 細胞を死滅させる方法
本発明は、以下の段階を含む、細胞を死滅させる方法を提供する：a) i)細胞；およびii) MADF、ADF、Htra/Omi、アポトーシス誘導因子、Smac/DIABLO、EndoG、チトクロームC、Nix、Nip3、CIDE-B、ゲルソリン、Bax、Bad、Bid、カスパーゼ活性化DNase、DNase I、およびDNase IIの1つまたは複数を含むアミノ酸配列を提供する段階；およびb) 細胞をアミノ酸配列と接触させて接触細胞を生じ、接触細胞の（例えばアポトーシスによる）細胞死が増加する段階。

別の態様において、本発明は、以下の段階を含む細胞を死滅させる方法を提供する：a) i)細胞マーカー分子を含む細胞；ii) 細胞マーカー分子に特異的に結合する第一分子に機能的に連結される、ビオチンに特異的に結合する抗体を含む第一組成物；およびiii) MADF、ADF、Htra/Omi、アポトーシス誘導因子、Smac/DIABLO、EndoG、チトクロームC、Nix、Nip3、CIDE-B、ゲルソリン、Bax、Bad、Bid、カスパーゼ活性化DNase、DNase I、およびDNase IIの1つまたは複数から選択される第二分子に機能的に連結されるビオチンを含む第二組成物を提供する段階；b) 第一組成物の第一分子が細胞分子マーカーに特異的に結合して接触細胞を生じるように、第一組成物を細胞と接触させる段階；およびc) 第一組成物の抗体が第二組成物のビオチンに特異的に結合するように、第二組成物を接触細胞と接触させ、それにより接触細胞の（例えばアポトーシスによる）細胞死を増加させる段階。段階b)およびc)は、同時であっても、または任意の順に、すなわちb)の後にc)もしくはc)の後にb)という順に経時的であってもよい。好ましい態様において、第一組成物は、第一分子に機能的に連結される細胞内部移行ペプチドをさらに含む。別の好ましい態様において、第二組成物は、第二分子に機能的に連結される細胞内部移行ペプチドをさらに含む。

本発明の方法は、例えば、望ましくない細胞増殖と関連した疾患（例えば癌）の症状を軽減するのに有用である。さらなる用途は、その細胞の（例えばアポトーシスによる）細胞死が生物学的または臨床的現象（癌等）を変化させる（すなわち、増加させるまたは減少させる）かどうかを決定することにより、その現象の発生において細胞（内皮細胞等）が果たす役割を決定することにおいてである。

1つの態様において、細胞を本発明の組成物と接触させる段階は、アミノ酸配列を細胞と混合することによって達成し得る。動物の場合には、接触は、アミノ酸を動物に投与（静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、鼻腔内、局所、舌下経路等）
によって行う。別の態様においては、本発明のタンパク質をコードする発現ベクターを細胞に導入し、タンパク質の発現を起こす。特に好ましい態様において、本発明のアミノ酸配列は、その配列を関心対象の細胞（癌細胞等）に標的化する抗体と結合している。より好ましい態様において、これらの複合体は、1つまたは複数の細胞内部移行ペプチドをさらに含む。

一般に、（例えばアポトーシスによる）細胞死のレベルの増加は、対照を参照して決定する。本明細書で用いる、試料、細胞、組織、動物等に関する場合の「対照」という用語は、当業者が、ある1つの特定因子を除いて同じ条件を維持することによって、別の試料、細胞、組織、動物等の結果を調べ、ひいてはこの変更した因子が原因となる有意性を推測するために用い得る、任意の種類の試料、細胞、組織、動物等を指す。

1つの態様において、本方法は、接触細胞において（例えばアポトーシスによる）細胞死の増加を検出する段階をさらに含む。（例えばアポトーシスによる）細胞死の増加を検出する段階は任意であることに留意すべきである。これは、動物を本発明の組成物で処置し、測定の終点が、処置した動物の疾患症状の軽減のような、（例えばアポトーシスによる）細胞死の下流である場合に望ましい場合がある。

1つの態様において、細胞はインビトロ状態である。インビトロの細胞を用いることは、例えば、細胞内のDNAヌクレアーゼ活性および/または殺細胞活性に対する本発明の組成物の有効性を決定するのに有用である。

別の態様において、細胞は、哺乳動物内に存在するようなインビボ状態である。そのような用途は、細胞増殖の望ましくない増加に関連した疾患において本発明の組成物を使用する動物モデル、臨床試験、および治療的介入において有用である。1つの態様において、哺乳動物は、細胞増殖の増加と関連した疾患を有する動物、およびそのような疾患を発症し得る疑いがある動物の1つまたは複数から選択される。望ましくない細胞増殖に関連した例示的な疾患には、これらに限定されないが、血管新生、再狭窄、アテローム性動脈硬化症、癌、腫瘍転移、線維症、血管腫、リンパ腫、白血病、乾癬、関節炎、自己免疫疾患、糖尿病、筋萎縮性側索硬化症、移植片拒絶、網膜症、黄斑変性症、自己免疫疾患（狼瘡、クローン病、および多発性硬化症等）、および網膜裂傷の1つまたは複数が含まれる。いくつかの標的組織および細胞は、本発明の組成物の投与の影響を受けやすい。例えば、線維症の場合、組織には心臓、肺、および肝臓が含まれ、血管新生の場合、細胞には内皮細胞および血管平滑筋細胞が含まれ、再狭窄の場合、細胞には血管平滑筋細胞が含まれ、アテローム性動脈硬化症の場合、細胞には血管平滑筋細胞、単球細胞、およびマクロファージ細胞が含まれ、血管腫の場合、細胞には内皮細胞が含まれ、リンパ腫および白血病の場合、細胞には白血球細胞、造血細胞、およびB細胞が含まれ、乾癬の場合、細胞には内皮細胞が含まれ、関節炎の場合、細胞には内皮細胞、滑膜細胞、および線維芽細胞が含まれ、筋萎縮性側索硬化症の場合、細胞にはＢ細胞が含まれ、移植片拒絶の場合には、細胞には白血球細胞、造血細胞、およびB細胞が含まれ、アレルギーの場合、細胞には、アレルゲン特異的抗体分泌細胞が含まれ、網膜症、黄斑変性症、および網膜裂傷の場合、細胞には内皮細胞が含まれ、関節リウマチおよび変形性関節症の場合、細胞には骨細胞および滑膜細胞が含まれ、乾癬および皮膚癌の場合、細胞には皮膚細胞が含まれる。

別の態様において、本発明の組成物を投与する哺乳動物は、腫瘍を有するか、または腫瘍を発症し得る疑いがある。「腫瘍」および「新生物」という用語は、一つには細胞増殖の増加を特徴とする組織増殖を指す。

腫瘍は良性の場合があり、これらに限定されないが、血管腫、神経膠腫、奇形腫等によって例示される。腫瘍はまた、悪性の場合がある。「悪性新生物」および「悪性腫瘍」という用語は、少なくとも1つの癌細胞を含む腫瘍を指す。「癌細胞」とは、以前に記載されているような（H.C. Pitot (1978) 「Fundamentals of Oncology」、Marcel Dekker (Ed.), New York pp 15-28）多段階の腫瘍進行の初期、中期、または進行期を迎えている細胞を指す。癌細胞には、前癌細胞（過形成細胞および異型細胞等）、および浸潤性の可能性がある腫瘍細胞が含まれる。「癌」という用語は、本明細書において悪性腫瘍を指すために使用し、これは転移性であっても転移性でなくてもよい。本発明の組成物を用いた投与が有益であると考えられる悪性腫瘍には、例えば、肺癌、乳癌、前立腺癌、子宮頸癌、膵臓癌、結腸癌、卵巣癌、胃癌、食道癌、口腔癌、舌癌、歯肉癌、皮膚癌（例えば、黒色腫、基底細胞癌、カポジ肉腫等）、筋肉癌、心臓癌、肝臓癌、気管支癌、軟骨癌、骨癌、精巣癌、腎臓癌、子宮内膜癌、子宮癌、膀胱癌、骨髄癌、リンパ腫癌、脾臓癌、胸腺癌、甲状腺癌、脳腫瘍、神経癌、中皮腫、胆嚢癌、眼癌（例えば、角膜の癌、ブドウ膜の癌、脈絡膜の癌、黄斑の癌、硝子体液癌等）、関節癌（滑膜癌等）、グリア芽細胞腫、リンパ腫、および白血病等の癌腫が含まれる。悪性腫瘍は、さらに肉腫（骨肉腫およびカポジ肉腫等）によって例示される。本発明は、その範囲内に任意の悪性腫瘍を明確に意図する。好ましくは、悪性腫瘍は細胞増殖の増加を示す。

1つの態様においては、本発明の組成物を哺乳動物に投与することにより、疾患（癌等）に関連する少なくとも1つの症状が軽減される。

本発明の組成物は、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、鼻腔内、局所、および舌下経路等の任意の経路によって哺乳動物に投与し得る。

1つの態様において、疾患が癌である場合、本発明の組成物は、抗癌剤、放射線治療、およびタンパク質に基づく治療（5-フルオロウラシル、ロイコボリン、トムデックス、マイトマイシンC、CPT-11、および3-ブロモピルビン酸の任意の1つまたは複数を用いた、抗体に基づく治療等）の1つまたは複数と組み合わせて投与する。

化合物に関する場合の「抗癌」、「抗癌化学療法薬」、「抗腫瘍」、および「抗腫瘍化学療法薬」という用語は、腫瘍の進行速度を低下させる（遅延および/または完全な停止を含む）化合物を指す。この用語はまた、腫瘍の進行速度を変更することなく、癌細胞の数を減少させる化合物を指す。抗腫瘍化合物は、天然および合成であってよい。例示的な抗癌剤は、これに限定されないがGoodman and Gilman's「Pharmaceutical Basis of Therapeutics」、第9版、Eds. Hardman et al., 1996に記載されているもの等、当技術分野において周知である。抗癌剤の代表的な例には、以下のものが含まれる：タキサン（例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル）、エタニダゾール(Etanidazole)、ニモラゾール(Nimorazole)、高圧酸素を伴うパーフルオロ化合物、輸液、エリスロポエチン、BW12C、ニコチンアミド、ヒドララジン、BSO、WR-2721、IudR、DUdR、エタニダゾール(etanidazole)、WR-2721、BSO、一置換ケト-アルデヒド化合物、ニトロイミダゾール、5-置換-4-ニトロイミダゾール、SR-2508、2H-イソインドールジオン（米国特許第4,494,547号）、キラル(((2-ブロモエチル)-アミノ)メチル)- -ニトロ-1H-イミダゾール-1-エタノール（米国特許第5,543,527号；米国特許第4,797,397号；米国特許第5,342,959号）、ニトロアニリン誘導体（米国特許第5,571,845号）、DNA親和性低酸素選択的細胞毒（米国特許第5,602,142号）、ハロゲン化DNAリガンド（米国特許第5,641,764号）、1,2,4ベンゾトリアジン酸化物（米国特許第5,616,584号；米国特許第5,624,925号；米国特許第5,175,287号）、一酸化窒素（米国特許第5,650,442号）、2-ニトロイミダゾール誘導体（米国特許第4,797,397号；米国特許第5,270,330号；米国特許第5,270,330号；欧州特許第0 513 351 B1号）、フッ素含有ニトロアゾール誘導体（米国特許第4,927,941号）、銅（米国特許第5,100,885号）、組合せ様式癌治療（米国特許第4,681,091号）、5-CldCまたは(d)H.sub.4Uおよび/または5-ハロ-2'-ハロ-2'-デオキシ-シチジンおよび/または-ウリジン誘導体（米国特許第4,894,364号）、白金錯体（米国特許第4,921,963号；欧州特許第0 287 317 A3号）、フッ素含有ニトロアゾール（米国特許第4,927,941号）、ベンズアミド、オートバイオティクス(autobiotics) （米国特許第5,147,652号）、ベンズアミドおよびニコチンアミド（米国特許第5,215,738号）、アクリジン-インターカレーター（米国特許第5,294,715号）、フッ素含有ニトロイミダゾール（米国特許第5,304,654号、1994年4月19日）、ヒドロキシル化テキサフィリン(texaphyrins) （米国特許第5,457,183号）、ヒドロキシル化化合物誘導体（公開番号011106775 A（日本）、1987年10月22日；公開番号01139596 A（日本）、1987年11月25日；公開番号63170375 A（日本））、フッ素含有3-ニトロ-1,2,4-トリアゾール（公開番号02076861 A（日本）、1988年3月31日）、5-チオテトラゾール誘導体またはその塩（公開番号61010511 A（日本）、1984年6月26日）、ニトロチアゾール（公開番号61167616 A（日本）、1985年1月22日）、イミダゾール誘導体（公開番号6203767 A（日本）、1985年8月1日；公開番号62030768 A（日本）、1985年8月1日；公開番号62030777 A（日本）、1985年8月1日）、4-ニトロ-1,2,3-トリアゾール（公開番号62039525 A（日本）、1985年8月15日）、3-ニトロ-1,2,4-トリアゾール（公開番号62138427 A（日本）、1985年12月12日）、制癌作用調節剤（公開番号63099017 A（日本）、1986年11月21日）、4,5-ジニトロイミダゾール誘導体（公開番号63310873 A（日本）、1987年6月9日）、ニトロトリアゾール化合物（公開番号07149737 A（日本）、1993年6月22日）、シスプラチン、ドキソルビン、ミソニダゾール、マイトマイシン、チリパザミン(tiripazamine)、ニトロソ尿素、メルカプトプリン、メトトレキセート、フルオロウラシル、ブレオマイシン、ビンクリスチン、カルボプラチン、エピルビシン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンデシン、エトポシド（Tannock. Journal of Clinical Oncology 14(12):3156-3174, 1996）、カンプトセシン（Ewend et al. Cancer Research 56(22):5217-5223, 1996）、およびパクリタキセル（Tishler et al. Journal of Radiation Oncology and Biological Physics 22(3):613-617, 1992）。

シスプラチン、シクロホスファミド、ミソニダゾール、チリパザミン、ニトロソ尿素、メルカプトプリン、メトトレキセート、フルオロウラシル、エピルビシン、ドキソルビシン、ビンデシン、およびエトポシドを含むがこれらに限定されない上記の化学療法薬の多くはまた、多種多様な類似体および誘導体を有する。類似体および誘導体には、以下のものが含まれる；(CPA).sub.2Pt(DOLYM)および(DACH)Pt(DOLYM)シスプラチン、シス-(PtCl.sub.2(4,7-H-5-メチル-7-オキソ-)1,2,4(トリアゾロ(1,5-a)ピリミジン).sub.2)、（Pt(シス-1,4-DACH)(トランス-Cl.sub.2)(CBDCA)）.マルチドット.-1/2MeOHシスプラチン、4-ピリドキサートジアミンヒドロキシ白金、Pt(II).Pt(II)（Pt.sub.2(NHCHN(C(CH.sub.2)(CH.sub.3))).sub.4）254-Sシスプラチン類似体、O-フェニレンジアミンリガンド保有シスプラチン類似体、トランス,シス(Pt(OAc).sub.2I.sub.2(エン))、エストロゲン様1,2-ジアリールエチレンジアミンリガンド（硫黄含有アミノ酸およびグルタチオンを有する）保有シスプラチン類似体、シス-1,4-ジアミノシクロヘキサンシスプラチン類似体、シス-(Pt(NH.sub.3)(4-アミノTEMP-O){d(GpG)})の5'配向性アイソマー、キレートジアミン保有シスプラチン類似体、1,2-ジアリールエチレンアミンリガンド保有シスプラチン類似体、(エチレンジアミン)白金(II)複合体、CI-973シスプラチン類似体、シス-ジアミンジクロロ白金(II)およびその類似体シス-1,1-シクロブタンジカルボシレート(2R)-2-メチル-1,4-ブタンジアン-白金(butanediam-mineplatinum)(II)およびシス-ジアミン(グリコレート)白金、シス-アミン-シクロヘキシルアミン-ジクロロ白金(II)、gem-ジホスホン酸シスプラチン類似体（FR 2683529）、(メソ-1,2-ビス(2,6-ジクロロ-4-ヒドロキシプレニル)エチレンジアミン)ジクロロ白金(II)、つながれたダンシル基を含むシスプラチン類似体、白金(II)ポリアミン、シス-(3H)ジクロロ(エチレンジアミン)白金(II)、トランス-ジアミンジクロロ白金(II)およびシス-(Pt(NH.sub.3).sub.2(N.sub.3-シトシン)Cl)、3H-シス-1,2-ジアミノシクロヘキサンジクロロ白金(II)および3H-シス-1,2-ジアミノシクロヘキサン-マロネート白金(II)、ジアミノカルボキシレート白金（EPA 296321）、トランス-(D,1)-1,2-ジアミノシクロヘキサンキャリアリガンド保有白金類似体、アミノアルキルアミノアントラキノン由来シスプラチン類似体、スピロプラチン（spiroplatin）、カルボプラチン、イプロプラチン（iproplatin）およびJM40白金類似体、二座三級ジアミン含有シ白金誘導体、白金(II)、白金(IV)、シス-ジアミン(1,1-シクロブタンジカルボキシレート-)白金(II)（カルボプラチン、JM8）およびエチレンジアミン-マロネート白金(II)（JM40）、JM8およびJM9シスプラチン類似体、(NPr4)2((PtCL4).シス-(PtC12-(NH2Me)2))、脂肪族トリカルボン酸白金複合体（EPA 185225）、シス-ジクロロ(アミノ酸)(tert-ブチルアミン)白金(II)複合体；4-ヒドロペルオキシルコホスファミド、アシクロウリジンシクロホスファミド誘導体、1,3,2-ジオキサ-および-オキサザホスホリナンシクロホスファミド類似体、C5-置換シクロホスファミド類似体、テトラヒドロオキサジンシクロホスファミド類似体、フェニルケトンシクロホスファミド類似体、フェニルケトホスファミドシクロホスファミド類似体、ASTA Z-7557シクロホスファミド類似体、3-(1-オキシ-2,2,6,6-テトラメチル-4-ピペリジニル)シクロホスファミド、2-オキソビス(2-β-クロロエチルアミノ)-4-,6-ジメチル-1,3,2-オキサザホスホリナンシクロホスファミド、5-フルオロ-および5-クロロシクロホスファミド、シス-およびトランス-4-フェニルシクロホスファミド、5-ブロモシクロホスファミド、3,5-デヒドロシクロホスファミド、4-エトキシカルボニルシクロホスファミド類似体、アリールアミノテトラヒドロ-2H-1,3,2-オキサザホスホリン2-オキシドシクロホスファミド類似体、NSC-26271シクロホスファミド類似体、ベンゾ環状シクロホスファミド類似体、6-トリフルオロメチルシクロホスファミド、4-メチルシクロホスファミドおよび6-メチルシクロホスファミド類似体；FCE 23762ドキソルビシン誘導体、アナマイシン(annamycin)、ルボキシル(ruboxyl)、アントラサイクリン二糖ドキソルビシン類似体、N-(トリフルオロアセチル)ドキソルビシンおよび4'-O-アセチル-N-(トリフルオロアセチル)ドキソルビシン、2-ピロリノドキソルビシン、二糖ドキソルビシン類似体、4-デメトキシ-7-O-(2,6-ジデオキシ-4-O-(2,3,6-トリデオキシ-3-アミノ-α-L-リキソ-ヘキソピラノシル)-α-L-リキソ−ヘキソピラノシル)アドリアマイシノンドキソルビシン二糖類似体アナログ、2-ピロリノドキソルビシン、モルホリニルドキソルビシン類似体、エナミノマロニル-β-アラニンドキソルビシン誘導体、セファロスポリンドキソルビシン誘導体、ヒドロキシルビシン、メトキシモルホリノドキソルビシン誘導体、(6-マレイミドカプロイル)ヒドラゾンドキソルビシン誘導体、N-(5,5-ジアセトキシペント-1-イル)ドキソルビシン、FCE 23762メトキシモルホリニルドキソルビシン誘導体、N-ヒドロキシスクシンイミドエステルドキソルビシン誘導体、ポリデオキシヌクレオチドドキソルビシン誘導体、モルホリニルドキソルビシン誘導体（EPA 434960）、ミトキサントロンドキソルビシン類似体、ADl98ドキソルビシン類似体、4-デメトキシ-3'-N-トリフルオロアセチルドキソルビシン、4'-エピドキソルビシン、アルキル化シアノモルホリノドキソルビシン誘導体、デオキシジヒドロヨードオキソルビシン（EPA 275966）、アドリブラスチン(adriblastin)、4'-デオキシドキソルビシン、4-デメチルオキシ-4'-o-メチルドキソルビシン、3'-デアミノ-3'-ヒドロキシドキソルビシン、4-デメチルオキシドキソルビシン類似体、N-L-ロイシルドキソルビシン誘導体、3'-デアミノ-3'-(4-メトキシ-1-ピペリジニル)ドキソルビシン誘導体（4,314,054）、3'-デアミノ-3'-(4-モルソリニル)ドキソルビシン誘導体（4,301,277）、4'-デオキシドキソルビシンおよび4'-o-メチルドキソルビシン、アグリコンドキソルビシン誘導体、SM 5887、MX-2、4'-デオキシ-13(S)-ジヒドロ-4'-ヨードドキソルビシン（EP 275966）、モルホリニルドキソルビシン誘導体（EPA 434960）、3'-デアミノ-3'-(4-メトキシ-1-ピペリジニル)ドキソルビシン誘導体（4,314,054）、ドキソルビシン-14-吉草酸、モルフォリノドキソルビシン（5,004,606）、3'-デアミノ-3'-(3'-シアノ-4''-モルホリニルドキソルビシン；3'-デアミノ-3'-(3''-シアノ-4''-モルホリニル)-13-ジヒドキソルビシン；(3'-デアミノ-3'-(3''-シアノ-4''-モルホリニル)ダウノルビシン；3'-デアミノ-3'-(3''-シアノ-4''-モルホリニル)-3-ジヒドロダウノルビシン；および3'-デアミノ-3'-(4''-モルホリニル-5-イミノドキソルビシンおよび誘導体（4,585,859）、3'-deamino-3'-(4-メトキシ-1-ピペリジニル)ドキソルビシン誘導体（4,314,054）および3-デアミノ-3-(4-モルホリニル)ドキソルビシン誘導体（4,301,277）；4,5-ジメチルミソニダゾール、アゾおよびアゾキシミソニダゾール誘導体；RB90740；6-ブロモおよび6-クロロ-2,3-ジヒドロ-1,4-ベンゾチアジンニトロソ尿素誘導体、ジアミノ酸ニトロソ尿素誘導体、アミノ酸ニトロソ尿素誘導体、3',4'-ジデメトキシ-3',4'-ジオキソ-4-デオキシポドフィロトキシンニトロソ尿素誘導体、ACNU、三級ホスフィンオキシドニトロソ尿素誘導体、スルファメリジンおよびスルファメチゾールニトロソ尿素誘導体、チミジンニトロソ尿素類似体、1,3-ビス(2-クロロエチル)-1-ニトロソ尿素、2,2,6,6-テトラメチル-1-オキソピペリジウニウムニトロソ尿素誘導体（U.S.S.R.1261253）、2-および4-デオキシ糖ニトロソ尿素誘導体（4,902,791）、ニトロキシルニトロソ尿素誘導体（U.S.S.R. 1336489）、フォテムスチン（fotemustine）、ピリミジン(II)ニトロソ尿素誘導体、CGP 6809、B-3839、5-ハロゲノシトシンニトロソ尿素誘導体、l-(2-クロロエチル)-3-イソブチル-3-(β-マルトシル)-1-ニトロソ尿素、硫黄含有ニトロソ尿素、スクロース、6-((((2-クロロエチル)ニトロソアミノ-)カルボニル)アミノ)-6-デオキシスクロース(NS-1C)および6'-((((2-クロロエチル)ニトロソアミノ)カルボニル)アミノ)-6'-デオキシスクロース（NS-1D）ニトロソ尿素誘導体、CNCC、RFCNUおよびクロロゾトシン、CNUA、1-(2-クロロエチル)-3-イソブチル-3-(β-マルトシル)-1-ニトロソ尿素、コリン様ニトロソアルキル尿素、スクロースニトロソ尿素誘導体（JP 84219300）、サルファ剤ニトロソ尿素類似体、DONU、N,N'-ビス(N-(2-クロロエチル)-N-ニトロソカルバモイル)シスタミン（CNCC）、ジメチルニトロソ尿素、GANU、CCNU、5-アミノメチル-2'-デオキシウリジンニトロソ尿素類似体、TA-077、ゲンチアノースニトロソ尿素誘導体（JP 82 80396）、CNCC、RFCNU、RPCNUおよびクロロゾトシン（CZT）、チオコルヒチンニトロソ尿素類似体、2-クロロエチル-ニトロソ尿素、ACNU、(1-(4-アミノ-2-メチル-5-ピリミジニル)メチル-3-(2-クロロエチル)-3-ニトロソ尿素ヒドロクロライド）、N-デアセチルメチルチオコルヒチンニトロソ尿素類似体、ピリミジンおよびピペリジンニトロソ尿素誘導体、メチル-CCNU、フェンスジミド（phensuzimide）ニトロソ尿素誘導体、エルゴリンニトロソ尿素誘導体、グルコピラノースニトロソ尿素誘導体（JP 78 95917）、1-(2-クロロエチル)-3-シクロヘキシル-1-ニトロソ尿素、4-(3-(2-クロロエチル)-3-ニトロソウレイド-o)-シス-シクロヘキサンカルボン酸、RPCNU（ICIG 1163）、IOB-252、1,3-ビス(2-クロロエチル)-1-ニトロソ尿素（BCNU）、1-テトラヒドロキシシクロペンチル-3-ニトロソ-3-(2-クロロエチル)-尿素（4,039,578）、d-1-1-(β-クロロエチル)-3-(2-オキソ-3-ヘキサヒドロアゼピニル)-l-ニトロソ尿素（3,859,277）およびゲンチアノースニトロソ尿素誘導体（JP 57080396）；6-S-アミノアシルオキシメチルメルカプトプリン誘導体、6-メルカプトプリン（6-MP）、7,8-ポリメチレンイミダゾ-1,3,2-ジアザホスホリン、アザチオプリン、メチル-D-グルコピラノシドメルカプトプリン誘導体およびs-アルキニルメルカプトプリン誘導体；インドリン環および修飾オルニチンまたはグルタミン酸保有メトトレキセート誘導体、アルキル置換ベンゼン環Ｃ保有メトトレキセート誘導体、ベンズオキサジンまたはベンゾチチアジン部分保有メトトレキセート誘導体、10-デアザアミノプテリン類似体、5-デアザアミノプテリンおよび5,10-ジデアザアミノプテリンメトトレキセート類似体、インドリン部分保有メトトレキセート誘導体、親油性アミドメトトレキセート誘導体、L-スレオ-(2S,4S)-4-フルオログルタミン酸およびDL-3,3-ジフルオログルタミン酸含有メトトレキセート類似体、メトトレキセートテトラヒドロキナゾリン類似体、N-(ac-アミノアシル)メトトレキセート誘導体、ビオチンメトトレキセート誘導体、D-グルタミン酸またはD-エリトロ,スレオ-4-フルオログルタミン酸メトトレキセート類似体、β,γ-メタノメトトレキセート類似体、10-デアザアミノプテリン（10-EDAM）類似体、γ-テトラゾ−ルメトトレキセート類似体、N-(L-α-アミノアシル)メトトレキセート誘導体、アミノプテリンのメタおよびオルトアイソマー、ヒドロキシメチルメトトレキセート（DE 267495）、γ-フルオロメトトレキセート、ポリグルタミルメトトレキセート誘導体、gem-ジホスホネートメトトレキセート類似体（WO 88/06158）、α-およびγ-置換メトトレキセート類似体、5-メチル-5-デアザメトトレキセート類似体（4,725,687）、N.δ-アシル-Nα-(4-アミノ-4-デオキシプテロイル)-L-オルニチン誘導体、8-デアザメトトレキセート類似体、アシビシン（acivicin）メトトレキセート類似体、重合プラチノールメトトレキセート類似体、メトトレキセート類似体-γ-ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、メトトレキセートポリグルタミン酸類似体、ポリ-γ-グルタミルメトトレキセート誘導体、デオキシウリジレートメトトレキセート誘導体、ヨードアセチルリジンメトトレキセート類似体、2,.ω.-ジアミノアルカノイド酸含有メトトレキセート類似体、ポリグルタミン酸メトトレキセート誘導体、5-メチル-5-デアザ類似体、キナゾリ
ンメトトレキセート類似体、ピラジンメトトレキセート類似体、システイン酸およびホモシステイン酸メトトレキセート類似体（4,490,529）、γ-tert-ブチルメトトレキセートエステル、フッ素化メトトレキセート類似体、葉酸メトトレキセート類似体、ホスホノグルタミン酸類似体、ポリ(L-リジン)メトトレキセート複合体、ジリジンおよびトリリジンメトトレキセート誘導体、7-ヒドロキシメトトレキセート、ポリ-γ-グルタミルメトトレキセート類似体、3',5'-ジクロロメトトレキセート、ジアゾケトンおよびクロロメチルケトンメトトレキセート類似体、10-プロパルギルアミノプテリンおよびアルキルメトトレキセート同族体、メトトレキセートのレクチン誘導体、ポリグルタミン酸メトトレキセート誘導体、ハロゲン化メトトレキセート誘導体、8-アルキル-7,8-ジヒドロ類似体、7-メチルメトトレキセート誘導体およびジクロロメトトレキセート、親油性メトトレキセート誘導体および3',5'-ジクロロメトトレキセート、デアザアメトプテリン類似体、MX068およびシステイン酸およびホモシステイン酸メトトレキセート類似体（EPA 0142220）；5-フルオロウラシルのN3-アルキル化類似体、1,4-オキサヘテロエパン部分を有する5-フルオロウラシル誘導体、5-フルオロウラシルおよびヌクレオシド類似体、シス-およびトランス-5-フルオロ-5,6-ジヒドロ-6-アルコキシウラシル、シクロペンタン5-フルオロウラシル類似体、A-OT-フルオロウラシル、N4-トリメトキシベンゾイル-5'-デオキシ-5-フルオロシチジンおよび5'-デオキシ-5-フルオロウリジン、1-ヘキシルカルバモイル-5-フルオロウラシル、B-3839、ウラシル-l-(2-テトラヒドロフリル)-5-フルオロウラシル、1-(2'-デオキシ-2'-フルオロ-β-D-アラビノフラノシル)-5-フルオロウラシル、ドキシフルリジン、5'-デオキシ-5-フルオロウリジン、1-アセチル-3-O-トルイル-5-フルオロウラシル、5-フルオロウラシル-m-ホルミルベンゼン-スルホン酸（JP 55059173）、N'-(2-フラニジル)-5-フルオロウラシル（JP 53149985）および1-(2-テトラヒドロフリル)-5-フルオロウラシル（JP 52089680）；4'-エピドキソルビシン；N-置換デアセチルビンブラスチンアミド（ビンデシン）硫酸；およびCu(II)-VP-16(エトポシド)複合体、ピロールカルボキサミジノ保有エトポシド類似体、40-アミノエトポシド類似体、γ-ラクトン環修飾アリールアミノエトポシド類似体、N-グルコシルエトポシド類似体、エトポシドA環類似体、4'-デシドロキシ-4'-メチルエトポシド、ペンデュラム(pendulum)環エトポシド類似体およびE環デソキシエトポシド類似体。

抗癌化学療法薬は「担体」を伴いまたは伴わずに利用することができ、「担体」とは、化学療法薬と共有結合および/または非共有結合を形成し、それにより薬剤の細胞および/または組織への送達を促進し得る分子を意味する。例示的な担体には、デキストラン（米国特許第6,409,990号）、リポソーム、ポリエチレングリコールに基づいた複合体；アクリル酸に基づいた複合体、ポリマー、軟膏、および/または核酸ベクターが含まれるが、これらに限定されない。

G. 細胞死を減少させる方法
本発明は、以下の段階を含む、（アポトーシスを減少させるような）細胞死を減少させる方法を提供する：a) i)細胞；およびii) MADF、ADF、Htra/Omi、アポトーシス誘導因子、Smac/DIABLO、EndoG、チトクロームC、Nix、Nip3、CIDE-B、ゲルソリン、Bax、Bad、Bid、カスパーゼ活性化DNase、DNase I、およびDNase IIの任意の1つまたは複数のヌクレアーゼ活性を減少させる薬剤を提供する段階；およびb) 細胞を薬剤と接触させて接触細胞を生じ、接触細胞の（例えばアポトーシスによる）細胞死が減少する段階。

1つのの態様において、ヌクレアーゼ活性を減少させる薬剤は、MADF、ADF、Htra/Omi、アポトーシス誘導因子、Smac/DIABLO、EndoG、チトクロームC、Nix、Nip3、CIDE-B、ゲルソリン、Bax、Bad、Bid、カスパーゼ活性化DNase、DNase I、およびDNase IIの任意の1つまたは複数に特異的に結合する抗体を含む。別の態様において、本方法はさらに、接触細胞において（例えばアポトーシスによる）細胞死の減少を検出する段階を任意に含む。

本発明の方法は、例えば、ADH部分、MADF、ADF、Htra/Omi、アポトーシス誘導因子、Smac/DIABLO、EndoG、チトクロームC、Nix、Nip3、CIDE-B、ゲルソリン、Bax、Bad、Bid、カスパーゼ活性化DNase、DNase I、およびDNase IIの任意の1つまたは複数によって媒介される（例えばアポトーシスによる）細胞死を変更し得る（すなわち、増加させ得るまたは減少させ得る）化合物（例えば、環境化合物、化学物質、天然化合物、合成化合物等）を同定するのに有用である。そのような化合物は、これらのタンパク質によって媒介される（例えばアポトーシスによる）細胞死と関連した症状を軽減する治療薬として有用である可能性がある。別の態様において、本発明の方法はまた、細胞増殖の減少と関連した疾患の症状を軽減させるために用いることができる（例えば、火傷被害者の組織の再生を増大させるため、および瘢痕化を軽減するため）。

1つの態様において、接触させる段階は細胞を薬剤と混合する段階を含み、例えば混合段階はインビトロで行う。別の態様において、接触させる段階は、MDH部分、MADF、ADF、Htra/Omi、アポトーシス誘導因子、Smac/DIABLO、EndoG、チトクロームC、Nix、Nip3、CIDE-B、ゲルソリン、Bax、Bad、Bid、カスパーゼ活性化DNase、DNase I、およびDNase IIの任意の1つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を細胞内で発現させる段階を含む。

本発明の方法の細胞は、ヒト等の哺乳動物のインビトロ状態またはインビボ状態であってよい。

H. アポトーシスを検出する方法
本発明は、哺乳動物の細胞の細胞質内および/または血中（血漿、血小板等を含む）のMADFおよび/またはADFを検出する段階を含む、アポトーシスを検出する方法を提供する。この方法は、細胞アポトーシスの変化（増加および減少を含む）に関連した疾患を検出するおよび診断するのに有用である。

好ましい態様において、本方法は、検出されたMADFおよび/またはADFのレベルを定量化する段階をさらに含む。これは、アポローシスのレベルをさらに定量化するのに有用である場合がある。細胞質においてインサイチューで（例えば、免疫蛍光顕微鏡観察により）、または細胞抽出物においてインビトロで、MADFおよび/またはADFに特異的な抗体のタンパク質への結合を測定する等の、MADFおよび/またはADFを測定するいくつかの方法が当技術分野において周知である。検出に血液（血漿、血小板等を含む）を用いる場合、血液はインビボであっても、または血液試料を採取した後のエクスビボであってもよい。

I. 細胞死を変化させる物質を同定する方法
本発明はまた、以下の段階を含む、試験物質が細胞死（アポトーシス等）を変化させる（増加および減少を含む）と同定する方法を提供する：a) i) MDH部分、MADF、ADF、Htra/Omi、アポトーシス誘導因子、Smac/DIABLO、EndoG、チトクロームC、Nix、Nip3、CIDE-B、ゲルソリン、Bax、Bad、Bid、カスパーゼ活性化DNase、DNase I、およびDNase IIの1つまたは複数を含むアミノ酸配列；およびii) 試験物質を提供する段階；b) アミノ酸配列を試験物質と接触させる段階；およびc) 試験物質の非存在下に対して、試験物質の存在下におけるアミノ酸配列のDNAヌクレアーゼ活性の変化（増加および減少を含む）を検出し、それにより、試験物質が細胞死（アポトーシス等）を変化させる（増加および減少を含む）と同定する段階。

本明細書において用いる「試験化合物」、「化合物」、「物質」、「試験物質」、「分子」、および「試験分子」という用語は、任意の化学物質、薬剤、薬物等を指す。物質は、既知治療化合物および潜在的治療化合物の両方を含む。物質は、本発明のスクリーニング法を用いてスクリーニングすることにより、治療的であることを決定することができる。物質は、抗体、リボザイム配列等の核酸配列、有機分子、無機分子、および本発明の方法を用いてスクリーニングし得る任意の種類の分子のライブラリーによって例示されるが、これらに限定されない。これらの物質を作製する方法は、オリゴヌクレオチドライブラリー（参照として組み入れられるGold et al., 米国特許第5,270,163号）；ペプチドライブラリー（Koivunen et al. J. Cell Biol., 124: 373-380 (1994)）；ペプチド模倣体ライブラリー（Blondelle et al., Trends Anal. Chem. 14:83-92 (1995)）；オリゴ糖ライブラリー（York et al., Carb. Res. 285:99-128 (1996)；Liang et al., Science 274:1520-1522 (1996)；およびDing et al., Adv. Expt. Med. Biol. 376:261-269 (1995)）；リポタンパク質ライブラリー（de Kruif et al., FEBS Lett., 399:232-236 (1996)）；糖タンパク質または糖脂質ライブラリー（Karaoglu et al., J. Cell Biol. 130:567-577 (1995)）；または例えば薬物もしくは他の薬学的物質を含む化学ライブラリー（Gordon et al., J. Med. Chem. 37:1385-1401 (1994)；Ecker and Crook, Bio/Technology 13:351-360 (1995)、参照として組み入れられる米国特許第5,760,029号)を調製する方法等、当技術分野において周知である。多様な分子のライブラリーはまた、商業的供給源から入手することもできる。

J. 細胞死を増加させる分子を同定する方法
本発明は、好ましくはアポトーシス耐性および/または壊死耐性真核細胞において、細胞死（アポトーシス等）を引き起こす（例えば増加）生物試料中の因子を同定する方法を提供する。1つの局面において、本方法は、アポトーシス耐性細胞の細胞、細胞抽出物、または単離核を生物試料と共にインキュベートして、細胞死誘導因子の存在についてアッセイする段階を含む。1つの態様において、細胞、細胞抽出物、または単離核に曝露される異なる因子の数は、100を超える。この生物試料が細胞死誘導活性を有すると認められる場合、細胞死誘導活性を有する試料の解析を行い、活性を有する成分の同一性を決定することになる。

好ましい態様において、アポトーシス耐性または壊死耐性真核細胞は、Bcl-2の過剰発現に起因してアポトーシス耐性である。本発明の別の局面は、生物成分の複雑な混合物を含む生物試料の使用を含み、細胞死誘導活性を有する成分の同一性を決定するための活性を有する試料の解析は、抽出物を分画する段階、および分画した抽出物を細胞死誘導活性について試験する段階、および細胞死誘導活性を含む画分に関して、細胞死の誘導に関与する成分を決定する段階を含む。本発明の別の局面では、生物試料が、細胞に導入されたDNA構築物からタンパク質が発現された細胞の細胞抽出物または培地を含み、細胞死誘導活性を有する成分の同一性を決定するための活性を有する試料の解析が、細胞死誘導活性を有する試料と関連したDNA構築物のDNA配列の決定を含む方法を提供する。これは、DNA構築物のライブラリーを作製する段階、およびDNA構築物のライブラリーを細胞に導入する段階、その後の、DNA構築物が導入された細胞の抽出物または培地をスクリーニングする段階を含む。スクリーニングは、細胞死誘導に関するアッセイ、その後の、細胞死を誘導する細胞抽出物または培地に対応する細胞内に存在するDNA構築物の配列の決定を含み得る。DNA構築物が導入された細胞の抽出物または培地は、単一のDNA構築物を有する細胞に由来しても、または複数のDNA構築物を有する細胞に由来してもよい。複数のDNA構築物の場合には、次いで、細胞死を誘導するDNA構築物の群による単一のDNA構築物を有する細胞に対して、細胞死を誘導するDNA構築物の群のさらなるスクリーニングを行い、どのDNA構築物が細胞死の誘導に関与するタンパク質をコードするかを同定する。細胞死の機構は、アポトーシス、壊死、アポネクローシス、または自己貪食変性である。スクリーニングに用いる細胞抽出物は、未処理細胞、またはUV照射、もしくは他のアポトーシス、壊死、アポネクローシス誘導物質で処理した細胞に由来し得る。細胞死誘導分子は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、脂質、オリゴ糖、または低分子である可能性がある。

好ましい態様において、真核細胞抽出物はヒト細胞抽出物である。細胞抽出物はまた、ミトコンドリアのような細胞小器官の成分が濃縮された抽出物であってもよい。細胞死誘導因子の存在を決定するために用いる方法は、DNA断片化アッセイであってよい。

本発明の別の局面は、誘導系の調節下において遺伝子を発現するのに必要なシス作動性配列をすべて含むDNAをアポトーシス耐性宿主細胞に導入する段階、および遺伝子の発現を誘導し、次いで死の指標に関して宿主細胞をモニターする段階、およびアポトーシス耐性宿主細胞において死を引き起こすDNA構築物の同一性を決定することにより、アポトーシス誘導遺伝子産物の同一性を決定する段階を含む、アポトーシス耐性細胞において細胞死を引き起こし得る遺伝子産物を同定する方法を提供する。

K. 細胞死を減少させる分子を同定する方法
本発明は、MADFおよびADFの1つまたは複数を含む分子を細胞または細胞抽出物に添加し、これらの抽出物を（例えばアポトーシスによる）細胞死のマーカーについてアッセイする段階、および細胞または細胞抽出物に分子を添加することに加えて、さらに化合物を添加する段階、および化合物による（例えばアポトーシスによる）細胞死の阻害についてアッセイする段階を含む、細胞において細胞死（アポトーシス等）を減少させる化合物を同定する方法を提供する。（例えばアポトーシスによる）細胞死を促進する化合物は、細胞においてADFに結合する相互作用分子を同定し、その後、相互作用分子と相互作用する化合物を同定し、相互作用分子と相互作用し得るこれらの化合物を、（例えばアポトーシスによる）細胞死を促進する能力に関してアッセイすることによって同定し得る。ADFに結合する分子の同定は、ツーハイブリッドシステム、ファージディスプレイもしくは他の組み合わせ生物学法を用いて、またはプルダウンアッセイおよびその後のプルダウンされた分子の質量分析により、または電気泳動で分離された細胞抽出物に対するADFのゲル内もしくはフィルター上での結合により達成される。

（例えばアポトーシスによる）細胞死を減少させる化合物を同定する方法の1つの態様において、本方法は、細胞においてADFに結合する相互作用分子を同定する段階、および相互作用分子と相互作用する化合物を同定する段階、および相互作用分子と相互作用し得る化合物を、（例えばアポトーシスによる）ADF誘導性細胞死を阻害する能力に関してアッセイする段階を含む。ADFに結合する分子の同定は、ツーハイブリッドシステム、ファージディスプレイもしくは他の組み合わせ生物学法を用いて、またはプルダウンアッセイおよびその後のプルダウンされた分子の質量分析により、または電気泳動で分離された細胞抽出物に対するADFのゲル内もしくはフィルター上での結合により達成される。

さらなる態様において、本発明は、細胞死誘導分子が、細胞死誘導分子の対応する配列において挿入または欠失を有するかまたは有さずに、本発明の方法のいずれかに従って同定されるペプチドの配列内のそれぞれ少なくとも15、12、または10個の連続した残基のアミノ酸ストレッチにわたって、上記方法に従って同定される任意のペプチドと配列が少なくとも40％または60％または80％同一であるペプチドを含む、細胞マーカー認識化合物に機能的に連結される細胞死誘導分子の複合体を提供する。

本発明の別の態様において、本発明は、細胞死誘導分子をコードするDNAが、60℃で1.5M、1.0M、0.75M、および0.5M塩の1つまたは複数において、本明細書に記載する方法に従って同定される任意のポリペプチドをコードする任意のDNAとハイブリダイズし得る、細胞死誘導分子（ペプチド等）と細胞マーカー認識化合物の複合体を提供する。

実験
以下の実施例は、本発明の特定の好ましい態様および局面を例示するものであり、本発明の範囲を制限すると解釈されるべきでない。

実施例1
材料および方法
以下は次の実施例において使用した例示的な材料および方法の簡単な説明であり、これは本発明の他の態様においても用いることができる。

A. 細胞株
U937単球性白血病株およびMCF-7乳癌株は、ATCCから入手した。ヒト骨髄性白血病、（空ベクターをトランスフェクションした）HL-60 neoおよび（Bcl-2をトランスフェクションし、これを過剰発現する）HL-60 Bcl-2は、S. Knox博士（スタンフォード大学、カリフォルニア州、パロアルト）より分与されたものであり、以前に記載されている（Gilbert and Knox, 1997；Wright et al., 1998）。細胞株はすべて、抗生物質の非存在下で、RPMI 1640および10％ FCSで培養し、マイコプラズマは存在しなかった。

B. DNA断片化アッセイ法
U937細胞またはMCF-7細胞の細胞全体またはこれらの細胞から単離された標準的な核におけるDNA断片化は、以前に詳述されている通りに（Wright et al. (1994) J. Exp. Med. 180, 2113-2123）、(³H)チミジン-標識DNA断片の放出によりアッセイした。単離核を4時間rADF処理することによって誘導されるDNA断片化は、以前に詳述されている通りに（Wright et al. (1994) 前記）、アガロース電気泳動により解析した。単離核を用いる4時間のアッセイにおいて、緩衝液にはATP再生系（2 mM ATP、10 mMクレアチンリン酸、および50μg/mlクレアチンキナーゼ）を補充した。

C. 市販のMDHに由来するADFの精製およびアミノ酸配列決定
Worthington Enzymes、ニュージャージー州から入手したブタ心臓ミトコンドリアMDH 2.9 mgからADFを精製した。Tosohaas G2000SWXL 7.8mm x 300mm HPLCカラムでのゲルろ過によりタンパク質を分画し、各画分を、U937単離核でのDNA断片化（ADF活性）について、およびMDH酵素活性について試験した。活性のある画分をプールし、H₂O + 0.0075％トリフルオロ酢酸 pH 6.5で平衡化した逆相C4 Brownlee 2.1mm x 220mmカラムに供し、40％アセトニトリルへの直線勾配により溶出した。

活性のある画分を、10〜20％トリス-トリシンSDS PAGE（Novex）での電気泳動により分離した。タンパク質をSequi-Blot PVDF膜（Bio-Rad）に電気泳動的に転写し、0.2％クマシーブルーで染色し、切り出したペプチドのN末端配列を、ABI Procise 494シーケンサーにおいてエドマン分解により決定した。

D. MDH酵素活性
このアッセイ法では、以前に記載されている通りに（Williamson, and Corkey, 1996）、NADHのMDH媒介性酸化を測定する。結果は、1分間当たりの340 nmにおける吸光度の減少として報告される。

E. ヒトrADFのクローニング、発現、および精製
10 x 10⁶個のU937細胞から、全RNAを調製した、RNA（5 ug）をオリゴdTでプライミングし、供給業者の手順に従って、逆転写酵素（Life Technologies、ニューヨーク州、グランドアイランド）を用いて逆転写した。次いで、得られたcDNAを、遺伝子特異的プライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により増幅した。18 kDaペプチド（MDHアミノ酸66〜238）をコードするヒトMDH配列を増幅するために用いたプライマーは、（MDHコドン66〜73に相補的な）

および（MDHコドン229〜238に相補的な）

であった。9 kDa ADF（MDHアミノ酸239〜339）をコードする配列を増幅するために用いたプライマーは、（MDHコドン239〜247に相補的な）

および（MDHコドン329〜339に相補的な）

であった。PCR産物を、供給業者の取扱説明書に従って、pBAD TOPO TAベクター（Invitrogen、カリフォルニア州、カールズバッド）にクローニングした。次いで、EcoRIおよびSalI酵素を用いてベクターから挿入物を切り出し、発現ベクターpGEX（Amersham Biosciences、ニュージャージー州、ピスカタウェイ）のグルタチオン-s-トランスフェラーゼ(GST)融合パートナーの下流にクローニングした。DNA配列決定により、PCR増幅の忠実度およびフレーム内のクローニングを確認した。タンパク質を発現させるため、得られたpGEX-ADF構築物を大腸菌BL21株（Stratagene、カリフォルニア州、ラホーヤ）に形質転換した。

rADFおよび空ベクター対照を、同一の方法で精製した。rADF構築物またはベクター対照を有する細菌を標準的な条件下で培養し、以前に記載されている通りに（Ausubel et al., 1995）GST融合タンパク質の発現を誘導した。

製造業者の使用法に従って、グルタチオン-セファロースビーズ（Pharmacia Biotech）を用いてrADFおよびベクター対照を精製した。溶出されたタンパク質をトロンビンで切断し、GST-ADF融合タンパク質からrADFを遊離させた。典型的に、この計画により、大腸菌溶解液による全開始タンパク質を精製された9 kDA rADFペプチドと比較して、精製度16,750倍という結果が得られた。

F. rADFによる核の処理およびDNase活性の抽出
U937細胞をペレット化し、1.0 ml中に100 x 10⁶細胞の濃度となるように、氷冷溶解緩衝液（50 mM Tris、pH 7、NP-40 0.01％）を添加した。350 x gで10分間遠心分離することにより核をペレット化し、核アッセイ緩衝液（50 mM Tris、250 mMショ糖、10 mM MgCl、pH 7）0.1 mlに再懸濁した。rADFを添加し、試料を37℃で20時間インキュベートした。対照として、rADFまたは標準的な核を単独でインキュベートした。混合液を14,000 x gで5分間遠心分離し、上清を除去した。氷冷核抽出緩衝液（50 mM Tris pH 8.3、20 mM EDTA）0.1 mlをペレットに添加し、氷上で30〜60分間インキュベートした。混合液を14,000 x gで15分間遠心分離し、上清を採取してDNaseアッセイ法にて試験した。DNaseは、U937から単離された(³H)チミジン-標識DNAを基質として使用し、以前に詳述されている通りに(Wright et al., 1994)アッセイした。

G. ICADのウェスタンブロット
rADFが核においてICAD切断を起こすかどうかを判定するため、DNase活性の促進に関して上記した通りに、U937単離核をrADFありおよびなしで処理した。U937細胞全体は、アポトーシス過程においてICAD切断を起こすことが知られているため、これを陽性対照として含めた。U937細胞（10 x 10⁶個/処理）をUV光(0.08J/cm²)またはTNF 5 ng/mlおよびシクロヘキシミド0.5μg/mlのありおよびなしで処理し、4時間インキュベートしたが、この時点で、処理細胞の50％を超える細胞がアポトーシス形態を示していたものの、トリパンブルー排除により>95％がなお生存可能であった。アポトーシス形態は、以前に記載されている通りに（Wright et al., 1992）、2つまたはそれ以上の膜気泡を示す細胞の割合をカウントすることにより、顕微鏡的に評価した。細胞を溶解した後、等量のタンパク質を、10〜20％ SDSポリアクリルアミド勾配ゲルの各レーンに供した。膜に転写した後、ウサギポリクローナル抗DFF45 1:100（Affinity BioReagens, Inc、コロラド州、ボルダー）でブロットをプロービングした。次いで、ブロットを西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ウサギIgG 1:20,000（Pierce）と共にインキュベートし、製造業者の取り扱い説明書に従ってSuperSignal West Pico基質（Pierce）を用いて発色させた。

H. ADFの移行に関するウェスタンブロット
正常またはアポトーシス性HL-60細胞、200 x 10⁶細胞/試料において、ADFを検出した。アポトーシスを誘導するため、0.2 J/cm²のStratalinkerで細胞にUV光を照射し、次いで少なくとも50％の細胞が形態的にアポトーシス性になるまで4時間インキュベートした。細胞を、氷冷抽出緩衝液（50 mM Tris-HCl pH 7.5、1 mM EDTA、10 mM KH₂PO₄、0.2％ BSA、5 mM 2-ME、0.25 Mショ糖、0.01％ジギトニン）中で溶解した。500 x g、10分間にて、直ちに核をペレット化した。上清を12,000 x gで10分間遠心分離し、ペレットをミトコンドリア画分として、上清をサイトゾルとして使用した。各試料についてレーン当たり300μgのタンパク質をゲルに添加した。1.5 mm 8〜16％ SDSポリアクリルアミド勾配ゲルで試料を分離し、免疫ブロットし、ウサギ抗rADF IgG（20μg/ml）でプロービングした、この抗体は、ゲル精製したrADFを用いて免疫化し、その後プロテインAカラムを用いて精製することによって調製した。IgGを含む画分をMDH結合セファロースで吸収して、36 kDa MDHとの交差反応性を部分的に減じた。ブロットを二次抗体と共にインキュベートし、ICADブロットについて記載した通りに発色させた。

I. 組換えカスパーゼ3の発現、精製、およびアッセイ
カスパーゼ3発現プラスミドpET-23b-カスパーゼ3は、Guy Salvesen博士の分与による。pET23b-カスパーゼ3を大腸菌BL21(DE3)pLySに形質転換し、以前に記載されている通りに（Stennicke and Salvessen, 1999）、ニッケルアフィニティーカラムを用いて活性のあるカスパーゼ3の発現および精製を行った。

カスパーゼ3のタンパク質分解活性は、以前に詳述されている通りに（Wright et al, 1997）、DEVD-p-ニトロアニリド合成基質を用いて測定した。

J. サイトゾル抽出物の免疫枯渇
アポトーシスを誘導するため、U937細胞をUV光0.08 J/cm²に曝露し、3時間インキュベートし、その後50 mM Tris pH 7.5および0.05％ NP-40中で1 x 10⁹細胞/mlで溶解した。溶解液を10,000 x g で10分間遠心分離し、上清を免疫枯渇に使用した。プロテインA/Gアガロースビーズ（Pierce）の50％スラリーの40μl分割量を、PBS中で4℃で20時間混合することにより、抗rADF、抗カスパーゼ3（Santa Cruz Biotechnology、カリフォルニア州、サンタクルーズ）、または標準IgG対照20μgでコーティングした。コーティングしたビーズをPBSで2回洗浄し、サイトゾル100μlを添加して、4℃で1.5時間混合した。ビーズをペレット化し、同じ抗体でコーティングしたビーズを用いて上清の2度目の吸収を行い、次いで、最終濃度1:5で、2 mM ATP、10 mMクレアチンリン酸、および50μg/mlクレアチンキナーゼを補充したU937単離核でのDNA断片化の4時間アッセイにおいて試験した。

K. アンテナペディアペプチド(Ant)に融合されたrADFのクローニング
pGEX-ADFを鋳型として使用し、PCRによりrADF-Ant融合物を増幅した。5'プライマーは、

であった。rADFのC末端にAntを導入する3'プライマーは、

であった。PCR産物をpGEX-4T-1ベクター（Amersham Biosciences、ニュージャージー州、ピスカタウェイ）のEcoRI部位およびSalI部位にクローニングした。DNA配列を確認した後、pGEX-rADF-Ant構築物を大腸菌BL21(DE3)株（Novagen、ウィスコンシン州、マディソン）に形質転換し、rADFと同じ方法を用いてタンパク質の発現および精製を行った。

ADF-Antの活性を試験する実験においては、ADF-Ant構築物においてrADFに融合させたアミノ酸配列と同じ配列を有する市販のペプチド、ペネトラチン（Qbiogene、カリフォルニア州、カールズバッド）を用いた。ペネトラチンは遊離チオール基で結合できるように修飾されているため、製造業者の指示に従って、まずDTTで処理して不活化した。

実施例2
ADFがミトコンドリアMDHのC末端断片であることの同定
本発明者らは予備研究において、培養細胞またはインビトロでインキュベートした新たに単離された肝臓細胞に由来する標準的なミトコンドリアの上清が、U937単離核においてヌクレオソーム間のDNA切断を誘導する活性を含むことを観察した。この活性を肝臓ミトコンドリアから精製することにより、ヌクレアーゼ活性を有することが知られていない酵素であるミトコンドリアリンゴ酸脱水素酵素(MDH)の部分的アミノ酸配列が明らかになった。さらなる研究により、ブタ心臓ミトコンドリアに由来するMDHの調製品（Worthington Enzymes）は、2〜10μg/mlの濃度で核DNA断片化を用量依存的に誘導し得るが、異なるタンパク質である、心臓サイトゾルから精製されたMDHアイソフォーム（Sigma）は、200μg/mlの濃度でさえも不活性であることが示された。MDHのDNA断片化活性が混入するヌクレアーゼに起因しないことを確認するため、本発明者らは、市販の酵素を精製してADF活性の源を決定した。

ゲルろ過によりMDHを分画し、各画分をMDH酵素活性および単離核におけるDNA断片化の誘導の両方について試験した。結果から、MDH酵素活性の主要なピーク（画分2）は、わずかに遅れて画分4に溶出された最大ADF活性と相関しないことが示される。最大ADF活性を有する画分を、第二のゲルろ過カラム、次にC4逆相クロマトグラフィーでさらに精製した。ADF活性は、MDH酵素活性を欠く単一ピークに溶出された。SDS PAGE解析から、この画分は原型MDHの大きさである36 kDaのバンドを欠くが、18 kDaおよび9 kDaの2つのペプチドを含むことが明らかになった。ゲル精製した両ペプチドをN末端アミノ酸配列決定により解析したところ、いずれのペプチドもブタミトコンドリアMDHの断片であることが明らかになった。18 kDaおよび9 kDaペプチドのN末端配列は、それぞれMDHのアミノ酸42位および215位で開始していた。

組換え9kDaペプチドの調製品は、4時間アッセイにおいて、U937単球性白血病細胞またはMCF-7乳癌細胞から単離された核において核DNA断片化の用量依存的な活性化を示した（図2A）。MCF-7はカスパーゼ3を発現しないことから、rADFの活性はこの酵素を必要としないと考えられる。対照的に、空ベクターのみを形質転換した大腸菌から同じ方法で精製した対照試料は不活性であった。9 kDa rADF（以後、rADFと称する）はまた、U937単離核においてヌクレオソーム間のDNA断片化を誘導した（図2B）。同程度の濃度のrADFが裸のDNAを切断しなかったことから、この活性は混入するDNaseに起因していなかった。したがって、ADFは直接または間接的に、単離核内に存在するエンドヌクレアーゼを活性化すると考えられる。

この可能性を調べるため、rADFのありおよびなしでインキュベートしたU937核の抽出物を、DNaseアッセイにおいて試験した。示された結果から、rADF処理した核の抽出物は裸のDNAを切断するが、ベクター対照で処理した核の抽出物または核なしでインキュベートしたrADFは活性がほとんどないことが実証される。

実施例3
アポトーシス過程におけるミトコンドリアからサイトゾルおよび核へのADFの移行は、Bcl-2の過剰発現により阻止される
ADFがアポトーシス過程において動員されるか否かを判定するため、本発明者らは、空ベクター対照（neo）またはBcl-2をトランスフェクションした正常またはアポトーシス性HL60細胞に由来する種々の細胞成分画分を解析した。HL60 neo細胞をUV光で処理し、4時間インキュベートすると、この時点で、ほとんどの細胞はアポトーシス形態を示し、死滅方向に向かっていたが、トリパンブルー排除によれば>90％がなお生存可能であった。同様の方法で処理したHL-60 Bcl-2細胞は、UV光で処理してから4時間後、予想通り、有意な数の、形態的にアポトーシス性である細胞を示さなかった。この時点で細胞を溶解し、分画遠心法により分画して核、ミトコンドリア、およびサイトゾルを取得し、免疫ブロットした（図4）。結果から、UV光なしの対照細胞の標準的なミトコンドリア（Mito）において、抗rADFと反応する9 kDaバンドが示され、サイトゾル画分または核画分には対応するペプチドは認められなかった。アポトーシス性HL60 neo細胞から調製した試料では、9 kDaバンドはミトコンドリアから消失し、核画分およびサイトゾル画分において明らかに認められた。一方、UV光処理したHL60 Bcl-2細胞のミトコンドリアには、9 kDaペプチドがすべて残存した。全体から見て、これらのデータは、感受性細胞のアポトーシス過程では、ADFがミトコンドリアから核に移行するが、Bcl-2を過剰発現するアポトーシス耐性細胞では移行しないという仮説を支持するものである。したがって、Bcl-2の抗アポトーシス特性は、ミトコンドリアからのADFの放出の抑制に一部起因する可能性がある。

実施例4
アポトーシス性サイトゾル抽出物における核DNA断片化活性は、抗rADF抗体によって免疫枯渇される
アポトーシス死を起こしている細胞から調製したサイトゾルは、標準的な単離核においてDNA断片化を引き起こし得ることが示されている（Shimizu, et al., 1997, Leukemia 11:1238-1244；Samejima, et al., 1998, J Cell Biol 143:225-239）。移行実験の結果に基づき、本発明者らは、この活性の少なくともいくらかはADFに起因すると予測した。そのため、ゲル精製したrADFをウサギに免疫し、その後プロテインG-セファロースを用いて抗血清を精製することにより調製した抗体を用いて、免疫枯渇実験を行った。図5Aの結果から、抗rADFはrADFの対照試料から50％の活性を除去するが、標準IgGまたは抗カスパーゼ3はADF活性を枯渇させないことが示される。UV光で処理したU937細胞から調製したアポトーシス性サイトゾルの核DNA断片化活性の大部分は、抗rADFによって枯渇された。

抗カスパーゼ3でコーティングしたビーズは、この処理がDEVD-pNa合成基質で測定されるカスパーゼタンパク質分解活性を枯渇させたものの、核DNA断片化活性を枯渇させなかった（図5B）。活性化サイトゾルからのADF活性の枯渇は、活性化サイトゾルの免疫ブロットにおける、抗ADF抗体と反応する9 kDaバンドの消失と相関した（図5B）。一方、活性化サイトゾルにおいて抗CADと反応する40 kDaバンドは、抗rADFにより免疫枯渇されなかった（図5C）。このブロットはまた、予想通り（Lechardeur. et al., 2000, J Cell Biol 150: 321-334）、CADは正常なまたはUV光処理した細胞の核の抽出物中に存在するが、正常サイトゾルには見出されないことを示す。これらの知見は、ADFがアポトーシス性サイトゾルにおける核DNA断片化の媒介物であるという仮説を支持する。アポトーシス性サイトゾル中にADFが存在することは、カスパーゼ阻害剤がアポトーシス性サイトゾルの核DNA断片化活性を阻止し得ないということを示す以前の報告（Shimizu, et al., 1997, Leukemia 11:1238-1244）、およびカスパーゼ活性がアポトーシス細胞のサイトゾルにおいて核DNA断片化活性から物理的に分離され得るという報告（Samejima, et al., 1998, J Cell Biol 143:225-239）を説明し得る。

実施例5
正常細胞へのrADFの導入により、DNA断片化、ひいては細胞死が誘導される
アポトーシスにおけるADFの考えられ得る役割をさらに評価するため、正常細胞へのrADFの導入により、これらの細胞のDNA断片化が誘導されるか否かを判定するための実験を行った。いくつかの細胞種におけるrADFをトランスフェクションしこれを発現させる試みは、理由は不明であるが成功しなかった。したがって、本発明者らは、内部移行ペプチドに融合させた外因性高分子を生細胞内に送達するために用いられるアプローチを利用した。rADFを遺伝子的にペネトラチンに融合させ、発現させた融合物（rADF-Ant）を、U937細胞での活性について試験した。

図6Aの結果により、2.25〜9 nMの濃度のrADF-Antが、4時間アッセイにおいて高レベルのDNA断片化を誘導したことが示される。一方、遊離のペネトラチンペプチドと組み合わせた同じ濃度の非結合rADF（rADF + Pen）、またはそれぞれの物質単独では、活性はほとんどなかった。DNAゲル解析により、典型的なDNAラダーは、ADF-Antで処理した無傷のU937細胞において誘導されるが、ペネトラクチンでは誘導されないことが明らかになった（図6B）。

実施例6
rADF-Antおよび塩基性線維芽細胞増殖因子に融合させたrADF（rADF-bFGF）はどちらも、種々の腫瘍細胞種に対して細胞毒性を示す
アンテナペディアペプチドが細胞内に取り込まれる機構は完全には理解されていないが、膜受容体と相互作用することなく、細胞膜を直接通過し、細胞質に入ると考えられている。rADFが受容体-リガンド内部移行系を介して細胞に送達され得るかどうかを判定するため、本発明者らは、18 kDヒト塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)に融合させたrADFをクローニングした。bFGFの受容体は多くの腫瘍細胞株上に発現されており、植物由来毒素に融合させたbFGFは、実験系において腫瘍細胞を標的化するために用いられている。両融合タンパク質を、トリパンブルー排除によって細胞死を測定する20時間アッセイにおいて、いくつかの異なるヒト腫瘍細胞株に対する細胞毒性について試験した。結果を表3に示す。

（表３）rADF-AntおよびrADF-bFGFはどちらも、種々の腫瘍細胞種に対して強い毒性を有する

細胞を種々の濃度の融合タンパク質と共に20時間培養し、トリパンブルー排除により少なくとも全部で100個の細胞をカウントして％生存度を測定した。結果は、3〜4回の別個のアッセイで測定した、50％細胞毒性を媒介する最低濃度の平均として報告する。

表3の結果から、rADF-bFGFは、rADF-Antとほぼ同程度に腫瘍細胞に対して毒性を有し、IC₅₀値はそれぞれ1.8〜11 nMおよび1.2〜6.7 nMであることが示される。MCF-7はカスパーゼ3を欠くにもかかわらず、融合タンパク質に対して高い感受性があるという事実に留意すべきであり、これは、広域カスパーゼ阻害剤がrADF-Ant誘導性細胞死を抑制しなかったことを示す本発明者らの以前の結果（原稿投稿中）と一致する。本発明者らはまた、rADF-Antが正常マウス脾臓細胞に対して毒性を有することを見出したが、このことは、正常組織に対する障害を回避するためにrADFを癌細胞に特異的に標的化する必要があることを示す。これは、試験した正常細胞または正常組織のいずれとも反応しない一本鎖Hepama-1にADFを融合させることによって達成されることになる（Fuhrer et al., 1991, Cancer Res. 51:2158-2163）。

実施例7
rADF-Antは、種々の薬剤耐性癌細胞株に対して強い毒性を有する
Bcl-2の過剰発現はアポトーシスを阻害することが知られており、ほとんどすべての形態の治療から癌細胞を保護し得る（Coultas et al., 2003, Semin Cancer Biol 13:115 123）。したがって、本発明者らは、Bcl-2または空ベクターneo対照をトランスフェクションしたヒト骨髄性白血病HL-60細胞の感受性を、ADF-Antおよびエトポシド誘導性DNA断片化に対する感受性に関して試験した。用量反応アッセイから、IC₅₀ 26μMを有するHL-60 neoと比較して、HL-60 Bcl-2細胞はエトポシドに対する耐性が高い（IC₅₀は380μM）ことが示された（図7）。これとは対照的に、HL-60 Bcl-2細胞は、HL-60 neoと比較して、ADF-Antに対して同程度の感受性を示した（IC₅₀はそれぞれ1.8 nMおよび1.4 nM）。ADFはアポトーシス線量のUV光に曝露したHL-60 Bcl-2細胞から放出されないという本発明者らの前の知見（図4）を考慮すると、これらのデータから、ADFの動因が通常のアポトーシス経路においてBcl-2の下流で機能することが示唆される。

癌細胞がアポトーシスに抵抗する別の機構は、ほとんどの腫瘍細胞生検試料において高レベルで見出される熱ショック(HS)タンパク質の過剰発現を介する（Jaattela, et al., 1999, Exp Cell Res 248:30-43）。本発明者らは、U937細胞をHS処理することにより、腫瘍壊死因子a(TNF)およびUV光によって誘導されるDNA断片化に対する耐性が誘導されるが、rADF-Antに対してなお同様に感受性があることを見出した（図8）。本発明者らは、U937細胞株に由来するいくつかの変異株を用いて、アポトーシス耐性の機構について研究した。TNFの存在下での増殖の延長によって（U9-TR）、または細胞内NAD含量の栄養欠乏によって（U9-NAD-）作製された変異株が、これまでに文献に記載されている（Wright, et al., 1992, Cancer Immunol Immunother 34:399-406；Wright, et al., 1996b, J. Exp. Med. 183: 463-477）。これらの変異株はどちらも、化学療法薬、UV光、およびTNF等の多様な物質によって誘導されるアポトーシスに対して耐性であった。データを表4に示す。

（表４）アポトーシスに対する耐性に関して選択されたU937変異株は、rADF-Antに対してなお感受性がある

種々の細胞毒性薬によって誘発されるDNA断片化は、³H-標識DNA断片の放出による4時間アッセイで測定した。結果は、50％DNA断片化を生じる誘導剤の最低濃度として報告する。

表4のデータから、U9-TRおよびU9-NADはどちらもエトポシドおよびTNFに対する耐性が高く、IC₅₀値はエトポシドおよびTNFについてそれぞれ>41倍および>7倍増加したことが実証される。一方、どちらの変異株も、rADF-Antに対して親のU937細胞と同程度の感受性を示した。フォルボールミリスチン酸酢酸(PMA)と共に3〜5日間培養することによって、より成熟した単球性表現型に分化したU937細胞は、アポトーシスに対する耐性が高くなり（Sorbet, et al., 1999, Cell Death Differ 6:351-361）、これはNF-kBの活性化に依存し得ること（Pennington, et al., 2001, Mol Cell Biol 21:1903-1941）が実証されている。

（表５）PMA誘導性分化またはフィブロネクチン(FN)への接着によって作製された薬剤耐性U937変異株は、rADFに対してなお感受性がある

¹通常のU937細胞およびPMA処理したU937細胞の生存度は、種々の濃度の細胞毒性薬で4時間処理した後、トリパンブルー排除によって測定した。BSAコーティングプレート（対照）またはFN-コーティングプレートにプレーティングしたU937細胞のアポトーシスは、先に詳述した通り、³H-標識DNA断片の放出による4時間のDNA断片化アッセイで測定した。
²U937細胞は、フォルボールミリスチン酸酢酸(PMA) 10 nMと共に3日間培養した。
³BSA（非特異的タンパク質対照）またはFNでコーティングしたプレートにU937細胞を添加して3時間付着を誘導し、その後、種々の濃度の細胞毒性薬を添加し、4時間後にDNA断片化を測定した。

表5のデータから、PMA処理細胞は、エトポシドおよびTNF誘導性アポトーシスに対して、それぞれ127倍および>50倍耐性が高いことが確認される。しかし、PMA処理細胞は、rADF-Antに対して通常のU937細胞と同程度に感受性がある。

インテグリン受容体を介した細胞外基質(ECM)への細胞の接着もまた、アポトーシス耐性を誘導し得る。インテグリンはaおよびbサブユニットからなる細胞表面接着受容体であり、ECM-細胞および細胞-細胞相互作用を媒介する。b1インテグリンは、増殖、分化、悪性細胞の浸潤および転移性性状の制御に関与する、細胞外環境からのシグナルを伝達する。細胞とECMとの相互作用を破壊することによりアポトーシスが生じ得り、インテグリンのECMへの結合が抗アポトーシスシグナルを送達し得る（Ruoslahti, et al., 1994, Cell 77:477-478）。フィブロネクチン(FN)等の固定化ECMタンパク質へのU937細胞の接着（Hazlehurst et al., 2001, Blood 96:1897-1903）は、化学療法薬に対する耐性を誘導することが示されている。したがって、本発明者らは、以前に公表された方法に従って、陰性対照としてのBSAまたはFNでコーティングしたプレートに播種したU937細胞について試験した。表5に示した結果から、FNに接着している細胞は、BSA上にプレーティングした細胞と比較して、50％ DNA断片化を誘導するのに5倍高い濃度のエトポシドまたはTNFを必要とすることが実証される。しかし、FNと相互作用している細胞は、rADF-Antに対して対照細胞と同程度に感受性があった。

最も頻繁に報告される多剤耐性に関連する変化の1つは、MDR1遺伝子によってコードされるP-糖タンパク質と称される170 kDa膜タンパク質の発現の増加である。これは細胞内の薬剤蓄積を減少させるエネルギー依存性薬物排出ポンプとして機能し、その結果、多くの構造的に関係のない薬剤に対する耐性を生じる（Roninson, et al., 1986, Proc Natl Acad Sci 83:4538-4542）。MDR1遺伝子を過剰発現する細胞がrADFに対して感受性を示すかどうかを判定するため、本発明者らは、親の薬剤感受性子宮肉腫、MES-SAを、以前に記載されている、ドキソルビシン中での培養によって選択された変異体、MES-SA/Dx5（Chen et al., 1997）と比較して試験した。この変異体は高レベルのP-糖タンパク質を発現し、種々の化学療法薬に対して交差耐性を示した。MES-SA/Dx5はエトポシドに対して高い耐性を示したが、rADF-Antに対して親株と同程度の感受性を示した（表6）。

（表６）MDR1過剰発現薬剤耐性変異株は、rADF-Antに対してなお感受性がある

種々の濃度の細胞毒性薬によって媒介される％細胞毒性は、以前に記載されている通りに、48時間のMTT色素減少アッセイで測定した（Wright, et al., 1992, Cancer Immunol Immunother 34:399-406）。結果は、50％細胞毒性を誘発する最低薬剤濃度、またはさもなければ、50％未満の細胞毒性を起こした、試験した中で最も高い濃度（>500μM）として報告する。

実施例8
rADF-AntはHCC細胞株に対して、標準的な化学療法薬よりも強い毒性を示す
一連の3つのHCC細胞株において、rADF-Antの細胞毒性活性をいくつかの化学療法薬と比較した。各細胞を3〜5回試験して、48時間のMTT色素減少アッセイによりIC₅₀値を決定した。結果を表7に示す。

（表７）rADFおよび化学療法薬に対するHCC細胞株の感受性

細胞毒性は、以前に記載されている通りに、48時間のMTT色素減少アッセイで測定した（Wright, et al., 1992, Cancer Immunol Immunother 34:399-406）。

上記の表7の結果から、rADF-Antは5-フルオロウラシル(5-FU)、エトポシド(Etop)、またはドキソルビシン(Dox)よりも約1000〜10,000倍毒性が高いことが示される。

ほとんどのHCCは、おそらくは複数の機構に起因して、化学療法薬に対する耐性が高いことが知られている。HCCはMDR1遺伝子発現のレベルが高いこと（Goldstein et al., 1988, J Natl Cancer Inst 81:116-124）、および化学療法に対する反応がp-糖タンパク質発現のレベルと反比例し得ること（Ng, et al., 2000, Am J Clin Pathol 113:355-363；Chou et al. 1997, J Gastroenterol Hepatol 12:569-575）が示されている。Hep3B（Park, et al., 1994, J Natl Cancer Inst 86:700-705）およびHepG2（Takeuchi, et al., 1999, J Gastroenterol 34:351-358）が非常に高レベルのMDR1遺伝子を発現するのに対して、SK Hep-1はいくぶん低いレベルのMDR1を発現する（Takeuchi, et al., 1999, J Gastroenterol 34:351-358）。

HCC株はまた、MDR1遺伝子発現とは無関係の多剤耐性を示し得る（Shen, et al., 1991, J Cell Sci 98:317-322）。本発明を任意の特定の機構に限定することはないが、耐性の考えられ得る別の機構は多剤耐性関連タンパク質(MRP)の発現である。このタンパク質は、p-糖タンパク質と類似の機構を発揮すると考えられており、HepG2およびSK Hep-1細胞株において高レベルで発現される（Takeuchi, et al., 1999, J Gastroenterol 34:351-358）。酸化ストレスに対する細胞の防御機構として機能するチオレドキシンの発現の増加もまた、いくつかの化学療法薬からHCCを保護し得る（Kawahara, et al., 1996, Cancer Res 56:5330-5333）。種々の異物代謝酵素（例えば、チトクロームP-450およびグルタチオンS-トランスフェラーゼ）の発現もまた、HCCの固有の薬剤耐性に寄与し得る（Murray, et al., 1993, Cancer 71:36-43）。さらなる研究によって、HCC株における薬剤耐性の高い固有レベルが、ECMタンパク質への接着によってさらに増大し得るかどうかが探索された。b1インテグリンの過剰発現およびHCCの進行におけるその役割が報告されている（Patriarca, et al., 1993, J Pathol 171:5-11）。いくつかのHCC株（HepG2を含む）おいてb1-インテグリンを過剰発現させることにより、MAPキナーゼ依存性経路を介して、それらの細胞が化学療法薬誘導性アポトーシス細胞から保護された（Zhang, et al., 2002, Cancer 95:896-906）。a6b1-インテグリン発現をノックアウトすると、HepG2細胞の形質転換表現型が逆転した（Carloni et al., 1998, Gastroenterology. 115:433-442）。外科的に切除した非線維層板(non-fibrolamellar)HCCのほとんどすべてが、フィブロネクチン(FN)の過剰発現または異常な発現を示すという事実から（Torbenson, et al., 2002, Mod Pathol 15:826-830）、これが異常な細胞-細胞または細胞-ECM相互作用を引き起こし、ひいては腫瘍発症に寄与し得ることが示唆される。さらに、HepG2およびHep3B等のHCC株は、筋線維芽細胞においてコラーゲン合成を促進する媒介物を分泌することが示されている（Faouzi et al., 1999, J Hepatol 30:275-284）。HCCのこれらの特性は、正常肝臓と比較した場合にHCCの間質で認められるECM成分の量および分布の顕著な変化に寄与する可能性がある（Jaskiewicz, et al., 1993, Anticancer Res 13:2229-2238）。したがって、HCCにおけるインテグリンの発現の増加と周囲のECMの異常との組み合わせが、腫瘍増殖を促進し、かつアポトーシスを阻害する環境を生み出す可能性がある。よって、本発明者らは、U937細胞について上記したように、対照としてのBSAまたはFNでコーティングしたプレートでアッセイした場合の、HepG2およびHep3Bの薬剤感受性について試験した。結果を表8に示す。

（表８）FNへの接着によって化学療法薬に対して耐性にしたHCC細胞は、rADF-Antに対してなお感受性がある

以前に記載されている通りに、マイクロタイタープレートをBSAまたはFNでコーティングし、乾燥させ（Hazlehurst et al., 2001, Blood 96:1897-1903）、その後、細胞および種々の濃度の薬剤を添加した。％細胞毒性は、以前に記載されている通りに、48時間のMTT色素減少アッセイで測定した（Wright, et al., 1992, Cancer Immunol Immunother 34:399-406）。

表8により、FN上にプレーティングしたHepG2細胞およびHep3B細胞は、BSA対照と比較して、5-フルオロウラシル(5FU)、ドキソルビシン(Dox)、およびエトポシド(Etop)に対する耐性が高いことが示される。対照的に、FNとの相互作用は、rADF-Antに対する細胞の感受性に変化を及ぼさなかった。

実施例9
HCC特異的抗体の作製
Hepama-1抗体は、腫瘍形成ヒトHCC細胞株、BEL-7402に由来する粗製細胞膜をマウスに免疫することによって作製された（Fuhrer et al., 1991, Cancer Res. 51:2158-2163）。標準的な技術によってハイブリドーマが調製され、BEL-7402膜調製品に対する一次ELISAにより、クローンの培養上清がスクリーニングされた。二次スクリーニングでは、1つのクローン（Hepama-1、IgG2b）が、BEL-7402に結合し、正常肝細胞には結合しなかった。Hepama-1抗体をサブクローニングし、腹水を調製し、さらなる研究のためにプロテインAアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。

実施例10
抗体結合の特徴づけ
間接的免疫蛍光法により、Hepama-1は、試験した6つのヒトHCC細胞株のうち5つと結合するが（Fuhrer et al., 1991, Cancer Res. 51:2158-2163）、ヒト結腸細胞株（HT29、Calu 1）または乳癌細胞株（MCF-7、BT-20、BT549）とは結合しないことが示された。パラフィン包埋したヒト腫瘍生検試料および正常組織の薄切片において、Hepama-1による免疫ペルオキシダーゼ染色が行われた。8つの肝臓癌はすべて陽性であったが、リンパ腫、または肺癌、乳癌、網癌、気管支癌、もしくは結腸癌では染色は認められなかった。一連の正常組織において、Hepama-1は胎児肝臓に結合し（正常成体肝組織には結合しない）、胎児肺への微量な結合を示し（正常成体肺組織には結合しない）、成体腎臓および胆嚢に弱い反応性を有するが、任意の他の胎児または成体組織（結腸、胃、気管、筋肉等）には本質的に結合しなかった。免疫細胞化学解析により、Hepama-1は固定した細胞の表面に結合するが、細胞質結合の証拠はないことが示された。最も重要なことには、Hepama-1は腫瘍細胞に取り込まれ、毒素、トリコサンチンを送達し、細胞を死滅させることが示されている（Wang, et al., 1991, Cancer Res 51:3353-3355）。

実施例11
抗原の特徴づけ
抗原は細胞表面上に位置し、Hepama-1抗体でのウェスタンブロッティングによって可視化される、見かけの分子量43 kDを有する。この抗体はすべてのHCC生検試料、胎児肝臓および肺と結合するものの、正常成体組織（例えば、肝臓、乳房、結腸、または胃）とは反応しなかったことから、抗原は癌胎児性タンパク質であると考えられる。抗原の分子同一性は未知である。

実施例12
異種移植データ
Hepama-1は¹³¹Iに結合され、Song（Song, et al., 1998, Cell Res. 8:241-247）によるマウスHCC異種移植モデルにおいて試験されたが、抗体が腫瘍に特異的に局在化することが示され、また処理によって細胞減少および生存期間の有意な増加が起こることが報告された。

実施例13
ヒト試験の概要
Hepama-1は、上海医科大学のチョンシャンホスピタル（Zhongshan hospital）の肝臓癌研究所において、100名を超える患者で評価された。マウス¹³¹I-Hepama-1を用いたヒトでの最初の臨床試験により、特異的な腫瘍局在化、細胞減少、および生存期間の改善が示された。

¹³¹I-標識Hepama-1を用いた放射免疫療法(RIT)は、上海、蘇州、杭州、河南、広州、および北京の病院を含む、中国の多くの病院において、この13年間にわたって行われてきた。初期の臨床試験では、肝動脈を介した送達が結紮と組み合わせて利用され、有意な腫瘍の細胞減少がもたらされた。

チョンシャンホスピタルにおける1つの公表された研究では（Zeng, et al., 1998, J Cancer Res Clin Oncol 124:275-280）、切除不能なHCCを有する65名の患者を、同じ方法により送達した¹³¹I-標識Hepama-1または化学療法（5-フルオロウラシル、シスプラチン、またはドキソルビシン）で処置して試験した。¹³¹I-Hepama-1は十分に許容され、化学療法とは対照的に、最も高い用量（100 mCi/患者）でさえも副作用の徴候は見られなかった。¹³¹I-Hepama-1で処置したほとんどの患者において、腫瘍の細胞減少が認められた。化学療法処置患者では9.1％の患者のみが切除可能となったのに対し、RIT群では53％の患者が切除可能となった。おそらくRIT群における高い切除率が寄与して、以下の表9に示すように5年での生存が上昇した：

（表９）肝臓内動脈を介して送達した¹³¹I-Hepama-1(RIT)または化学療法（非RIT）による患者の治療および生存

* P<0.01、** P<0.05

過去対照によれば、処置を行わない場合の切除不能なHCCの5年生存率は、5〜10％である（Venook, et al., Curr Treat Options Oncol. 2000 Dec;1(5):407-15）。

最近終了した研究では、32名の切除不能HCC患者において、様々な用量の¹³¹I-Hepama-1の静脈内送達の効果を試験した。この臨床試験第I/IIa相の詳細な報告は、中華人民共和国の国家薬品監督管理局に提出された。この報告から、100 mCi（比活性6〜7 mCi/mg抗体）という最も高い用量で処置した患者においても、副作用の徴候がないことが示される。全身線量測定により、患者の78％（25/32）において、抗体の特異的腫瘍結合が示される。

実施例14
例示的なscFv構築物およびADFに融合させたscFvの合成
以下の実施例の目的は、毒性ADFペプチドに遺伝子的に融合させた一本鎖Hepama-1がHCC株を選択的に死滅させるかどうかを判定することにある。scFvは、Hepama-1ハイブリドーマの配列に基づいて、遺伝子アセンブリにより調製する。陽性対照としてのHepama-1に対するscFvの結合特異性および内部移行を、細胞に基づいたELISAによって評価する。scFv-ADF構築物（TH101）を調製し、やはりHCC結合および内部移行について試験する。次いで、HCC株、ならびに非関連腫瘍種および正常細胞に対する毒性について試験する。放射標識TH101を、マウスHCC異種移植モデルにおいて、正常肝臓に対するHCC選択的蓄積について評価する。この研究の結果により、今後の研究においてマウスHCCモデルでTH101を評価することへとつながる基礎が提供される。

一本鎖Hepama-1をコードする配列は、標準的な遺伝子アセンブリ法によって作製する（Stemmer et al., 1995, Gene 16:49-53）。発現させるタンパク質のアミノ酸配列は、

である。

最初および最後のブロックは、それぞれ重鎖および軽鎖の可変領域であり、これらは(GGGS)₃リンカーによって分離されている。

好ましい大腸菌コドンを用いてこの配列を逆翻訳し、pETベクターにクローニングするための適切な制限部位を添加することにより（以下を参照のこと）、5'から3'方向に示す以下のDNA配列（配列番号：81）が得られる（上鎖を示す、開始ATGはイタリックの太字で示し、下線の配列はscFvである；他の配列はクローニング/発現のために存在する）：

それぞれ約40ヌクレオチドの、この分子の全上鎖および下鎖をコードするプライマーであって、上鎖および下鎖上のオリゴが相互に自己プライミングできるように互い違いに配列されるプライマーを設計した。プライマーの全セットをそれぞれ50 nM濃度で混合し、taqポリメラーゼを用いて伸長させ、55サイクルのサーマルサイクリングを行った。続いて、得られた増幅混合物を40倍に希釈し、全長構築物を増幅する2つのプライマー（それぞれ1 uM）を用いてPCR反応を行った（20サイクル）。本発明者らの実験では、この手順により、予想される大きさの単一のDNAバンドが確実に得られた。

次いで、ペリプラズム発現させるために、DNA断片をpET22aにクローニングする。一般に、不完全な化学合成に起因する誤りがないクローンを見出すために、いくつかのクローン（約10個）を配列決定する必要がある。pET22aは、ペリプラズム発現を指示する大腸菌シグナルペプチドを有する、scFvの変形をコードする。このベクターはまた、C末端ヘキサヒスチジンタグをコードする。これは、細菌において、適切に形成されたジスルフィド結合を有する、正しく折りたたまれた活性のある抗体断片を産生するための標準的なアプローチであり、すでに、XieらによりこのscFvに関して用いられ成功している（私信）。

場合によっては、scFvのペリプラズムの収率は低い可能性があり、したがって、scFvコード配列はまた、異なる5'制限部位以外は同じベクターを用いてクローニングし、細胞質発現のためにシグナルペプチドを欠失させる。これらの抗体断片は、おそらく封入体中に発現される。発現後、封入体を単離して洗浄し、6MグアニジンHCl中でタンパク質を可溶化する。この変性条件下において、Ni-NTAアガロースを用いてscFvを精製し、イミダゾールで溶出し、次いで持続的に透析して変性剤濃度を徐々に下げることによって再折りたたみさせ、同時にジスルフィド結合の自発的酸化を可能にする。再折りたたみ中の過剰な沈殿を回避するため、開始タンパク質濃度は0.1 mg/mlとし、また、最終透析緩衝液は0.1％ Tween-20および10％グリセロールを添加したPBSである。この種類の手順は、文献にも頻繁に記載されている。この透析手順後のタンパク質の可溶性画分を、HCC細胞および対照としての他の細胞株に対するELISAにより、活性について解析する。固定化細胞へのscFv結合の検出は、（市販の）抗hisタグ抗体-HRP複合体を用いて行う。

scFv-ADF融合タンパク質を発現させるための構築物を作製するため、ADFコード配列（上記）を、ADFがGSGリンカーに分離されてscFvのC末端に付加されるように、好ましいpET-HCC-scFvベクター（発現およびHCC結合に関してどの構築物がうまく機能するかに依存する）にクローニングする。この理論的根拠は、scFvのC末端が、抗体断片の抗原結合部位（結合領域）と逆側に位置することである。ヘキサヒスチジンタグは、精製/免疫検出のために維持され得る。scFv単独の場合と同じ方法で、この融合タンパク質を産生し精製する。次いで、このキメラタンパク質を、非HCC対照に対してHCC細胞株を死滅させる能力に関して試験する。

実施例15
細胞結合研究
最初に、3つのHCC細胞株、HepG2、Hep3B、およびSMMC-7721の細胞表面に対する、Hepama-1、scFv、scFv-ADF、および標準マウスIgG対照の結合を測定する。氷上で、種々の濃度の抗体を細胞と共に0.5、1、2、および3時間インキュベートし、その後洗浄して非結合の抗体を除去し、ELISAアッセイにおいて発色させる。これにより、細胞表面への最大結合を得るための至適条件（抗体濃度および時間）が決まる。これらの条件を用いて、本発明者らの新たな構築物の結合特異性を評価する。

結合特異性は、非放射性競合により、および種々の細胞種を用いて評価する。Hepama-1および対照モノクローナル抗トランスフェリン受容体抗体を、scFvおよびTH101に対して、100倍過剰濃度で競合試験する。これらのモノクローナルはHisタグをもたないため、ELISAで使用する二次抗Hisタグ-HRP抗体でシグナルを生成しない。Hepama-1はscFvおよびTH101のHCC細胞株への結合を阻害するが、抗トランスフェリン受容体抗体は阻害しないことが予測される。

次いで、上記で決定した至適条件下で、scFvおよびTH101結合の腫瘍細胞特異性を評価する。非HCCヒト腫瘍細胞株への結合は、MCF-7乳癌、OVCAR-3卵巣癌、DU145前立腺癌、およびAsPC-1膵臓癌（株はすべてATCCから入手）で試験する。また、HUVEC（ヒト臍帯静脈内皮細胞）、初代肝細胞株、および正常皮膚線維芽細胞細胞株（すべてClonetics、サンディエゴから購入）を含む、いくつかの非形質転換ヒト細胞株についても試験する。Hepama-1を用いた以前の結果に基づいて（Fuhrer et al., 1991, Cancer Res. 51:2158-2163）、本発明者らは、本発明者らの構築物は非肝臓腫瘍細胞にも正常細胞にもほとんど結合しないと予測する。

scFvおよびTH101が内部に取り込まれる能力を、ELISAアッセイによりHepG2、Hep3B、およびSMMC-7721で試験する。最初に、上記で決定した至適条件を用いて、構築物を細胞と共に氷上でインキュベートする。次いで、細胞を37°に加温し、様々な時間で内部取り込みを可能にする。その後、低pH緩衝液で細胞を洗浄して残存した表面の抗体を除去し、固定化し、ELISAで発色させる。以下に記載する、HCCに対するTH101の細胞毒性はまた、細胞の内部取り込みの間接的測定でもある。

使用し得る、例示的な細胞に基づくELISAアッセイ法は、以下の通りである。アッセイは、平底マイクロタイタープレートで三つ組で設定する。細胞を完全培地200 ml中に50〜100,000細胞/ウェルでプレーティングし、コンフルエントになるまで24時間培養する。加温したPBS + 1％ FCS + 0.02％ NaN₃で、細胞を2回洗浄する。PBS + 2％ドライスキムミルクに溶解した1〜50 mg/mlの種々の濃度の一次抗体50 ml（Hepama-1、scFv、またはTH101）を添加し、氷上で1時間インキュベートする。標準マウスIgGを陰性対照として用いる。PBS + 0.05％ Tween 20で3回洗浄した後、1 mg/mlの西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合二次抗体50 mlを添加し、氷上で1時間インキュベートする。PBS + 0.05％ Tween 20でプレートを3回洗浄し、50 ml/ウェルのTMB基質を添加し、室温で5〜10分間、またはバックグラウンド対照がわずかに黄色になるまでインキュベートする。1N H₂SO₄を添加して反応を停止し、吸光度を450 nmで測定する。このアッセイの有効性を評価する予備研究では、トランスフェリン受容体に対するモノクローナル抗体のSKHep-1生細胞への良好な結合が実証された。

内部取り込みを測定するため、最初に、予め決定した至適条件において、氷上で抗体を細胞に結合させる。次いで、冷PBSで2回洗浄することにより、非結合の抗体を除去する。培地を添加し、細胞を37℃に加温して、様々な時間（1〜4時間）で内部取り込みを可能にする。その後、以前に記載されている通り、細胞溶解を最低限に抑えるため、比較的穏やかな酸性洗浄緩衝液を用いて、残存する表面の抗体を除去する（Yao, et al., 2001, J Nucl Med 42:1538-1544）。培地を除去し、冷却した0.028M 酢酸ナトリウム、0.12 M NaCl、0.02 Mバルビタールナトリウム pH3.0を100 ml添加し、氷上で6分間インキュベートする。上清を除去し、細胞をPBSで洗浄し、次いで、内部に取り込まれた免疫毒素の検出について以前に記載された通りに、PBSに溶解した0.5％グルタルアルデヒドを用いて室温で30分間固定する（Di Lazzaro et al., 1994, Cancer Immunol Immunother 39:318-324）。固定液を除去し、細胞をPBSで洗浄し、二次抗体を添加し、上記のようにELISAを発色させる。

実施例6
インビトロでの、細胞株に対するTH101の毒性試験
HCCおよび非HCC腫瘍ならびに非形質転換細胞株を含む、結合試験で用いるのと同じ細胞株において、TH101の毒性活性およびその特異性を評価する。細胞毒性は、48時間のMTT色素減少アッセイ法により評価する。このアッセイ法は当研究室において日常的に使用しており、予備研究ではこれを用いてHCC細胞株についてのIC₅₀を得た。このアッセイでは、色素、3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-臭化ジフェニルテトラゾリウム(MTT)の減少能を測定する。これは壊死およびアポトーシス形態の死を両方検出するものであり、以前に詳述された通りに実施する（Wright, et al., 1992, Cancer Immunol Immunother 34:399-406）。MTTアッセイ法は細胞死の間接的測定法であり、すなわち細胞の代謝を測定するものであり、したがって精選したアッセイにおいては、トリパンブルーの存在下で顕微鏡観察によって確認する。

実施例17
TH101のインビボ急性毒性試験、およびヒトHCCのマウス異種移植モデルにおける腫瘍への優先的蓄積
これらの研究の目的は、正常マウスにおけるTH101の潜在的毒性、およびHCC異種移植片を有するマウスの腫瘍へのTH101の優占的蓄積を評価することにある。この結果により、マウスのHCC異種移植の治療モデルにおいてTH101を試験する今後の研究の基礎が提供される。

A. 急性単回投与毒性試験
これらの予備研究の目的は、正常Balb/cマウスにおいてTH101の最大耐量(MTD)を測定することにある。最初に、「ステップアップステップダウン」試験を行い、およその致死量を決定する。

10mg/kgから開始し、TH101の単回静脈注射をマウス（2匹/群）に行う。臨床的徴候または死亡率について、マウスを24時間観察する。およその致死量は、一晩の観察期間中に少なくとも1匹のマウスが死亡する最も低い用量と定義する。最初の用量が過度に毒性が強いかまたは十分に毒性がない場合には、用量を2倍減らすかまたは増やし、これを繰り返して、およその致死量を測定する。この用量に基づき、5匹のマウス群に段階的に減らした用量を与えてMTDを測定する。MTDは、観測可能な臨床的徴候を生じ得るが重篤な臨床症状を生じ得ず、一晩の観察期間中に偶発的死亡が起こらない用量と定義する。測定されたMTDをマウスに与えてから1日、2日、および3日後に、末梢血試料を採取し、Sigmaから入手したキットを用いて、肝臓酵素、アラニンアミノトランスフェラーゼおよびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼについてアッセイする。

B. 腫瘍特異的TH101蓄積を評価するための異種移植モデル
マウスHepama-1抗体がSMMC-7721ヒト肝細胞癌細胞株に結合することが以前に示されており(Fuhrer et al., 1991, Cancer Res. 51:2158-2163)、またこの抗体がSMMC-7721異種移植モデルにおいて治療的であったことから（Song et al., 1998, Cancer Res. 8:241-247）、異種移植したSMMC-7721ヒト肝細胞癌の増殖において放射標識hu-Hepama-1抗体の効果を試験する。製造業者（Pierce）の取扱説明書に従って、ヨードゲン（Iodogen）を用いてTH101を¹²⁵Iで標識する。これらの研究は、確立されたSMMC-7721腫瘍を有する雌の胸腺欠損ヌードマウス（6〜8週齢）で行う。この異種移植モデルは十分に特徴づけられており、以前に記載された通りに実施する（Yang et al., 2001, World J Gastroenterol. 7:216-221）。2.5 x 10⁶細胞を皮下注射することにより、腫瘍細胞をマウスの右側腹部に移植する。腫瘍が直径5〜10 mmの大きさに到達した時点で、¹/₂ MTDの放射標識TH101をマウス（各時点について5匹の群）に静脈注射する。腫瘍を有さない対照マウスもまた試験する。注射後1日、2日、3日、および7日目に、マウスを屠殺し、腫瘍、肝臓、脾臓、腎臓、肺、骨、および血液の試料を採取し、重さを量る。放射能を測定し、注射した用量(ID)の％ / g組織として表す。

scFv-ADF融合構築物の発現および/または再折りたたみを最適化するため、構築物がN末端にADFを有し、その後(GGSG)₃リンカーが続き、その後scFvが続くように、2つの断片の順番を逆転させることができる。リンカーを延長することにより、抗体結合部位は、ADFによる干渉を最小限に抑えて抗原に結合できるようになるはずである。

細菌内で発現されるscFvは封入体内に存在する可能性があるが、Mab95配列に基づく類似のscFv構築物が封入体の抽出物からの再折りたたみに成功したため、活性のあるscFvが封入体から得られ得るというのが本発明者らの見解である（Xie, et al., 2003、原稿投稿中）。

scFvのADFへの融合により、今日までに産生された中で最も小さい（34 kDa）免疫毒素が得られるというのが本発明者らの見解である。この特性は、大きな分子が遭遇する固形腫瘍における輸送障害を克服するのに役立つと考えられる（Jain, et al., 1994, Sci Am 271:58-65）。

細胞に基づくELISAアッセイでは、抗His-HRP二次抗体を用いて、Hisタグ化scFvおよびTH101構築物を検出する。結果をさらに最適化するためには、ビオチン化構築物およびストレプトアビジン-HRPを使用してもよい。または、構築物をヨードゲンによりヨウ素化し、これにより二次抗体の段階が除かれる。

原型抗体が内部に取り込まれ、また一価の腫瘍特異的scFvもなお内部に取り込まれ得るという前例があるため、scFvも容易に内部に取り込まれるであろうというのが本発明者らの見解である（Gao et al., 2003, J Immunol Methods 274:185-197）。また、シュードモナス属（Pseudomonas）外毒素Aに遺伝子的に融合させたLe^y抗原に対する抗体が、原型抗体と同程度に効率的に腫瘍細胞に取り込まれ得ることが以前に示された（Siegall, et al., 1994, J Immunol 152:2377-2384）。

リガンドおよび受容体に応じて内部取り込みの種々の経路が存在し、よって本発明者らはいかにしてTH101が内部に取り込まれるのかを予測し得ない。TH101はリソソームに送達され、そこで低pHによって不活化される可能性がある。しかし、本発明者らは、rADF-AntをインビトロでpH 4.8、37℃で3時間インキュベートしても活性が喪失しないことを既に明らかにしている。

scFv構築物がHCCに対して元のHepama-1よりも低い親和性を有することが見出されたとしても、やはり効果的な治療法であり得るというのが本発明者らの見解である。または、後の研究で、例えば二重特異性抗体、ミニボディ(minibody)等のより高い親和性およびより優れた有効性を有する異なる構築物を作製してもよい（Reff, et al., 2001, Crit Rev Oncol/Hematol 40:25-35に概説されている）。

TH101構築物のクローニングおよび発現の成功（実施例14）、非形質転換細胞に対して最小限の毒性を有する、HCC細胞株に対するTH101媒介性細胞毒性の実証（実施例15）、ならびに正常マウスの肝臓に対してTH101の毒性がほとんどまたは全くないこと、およびHCC異種移植片を有するマウスの腫瘍への優先的蓄積の実証（実施例16）を受けて、さらなる臨床的開発が望まれる。

上記明細書において言及した出版物および特許はすべて、参照として本明細書に組み入れられる。本発明の範囲および精神に反することなく、本発明で記載した方法および系に様々な修正および変更が行われ得ることは当業者に明白であろう。本発明を特定の好ましい態様に関して説明したが、主張される本発明は特定の態様に過度に限定されるべきではないことを理解すべきである。実際に、本発明を実施するための上記形態の様々な修正は当業者および関連分野の業者には自明であり、特許請求の範囲の範囲内であることを意図する。

成熟ブタミトコンドリアMDHのアミノ酸配列（配列番号：1）を示す。18 kDaペプチドから得られる配列に点線で下線を引き、9 kDaペプチドから得られる配列に実線で下線を引く。 rADFが標準的な単離核においてDNA断片化を誘導することを示す。(A) U937細胞またはMCF-7細胞から単離した標準的な核を、示した濃度のrADFと共に4時間インキュベートし、³H-標識DNA断片の放出によりDNA断片化を測定した。(B) U937核をrADFまたはベクターのみをトランスフェクションした大腸菌から調製した対照試料と共に4時間インキュベートし、アガロースゲル電気泳動によりDNAを解析した。 rADFが、標準的な核にとって内因性のヌクレアーゼを活性化することを示す。U937核をrADFありおよびなしで20時間インキュベートし、次いで、核抽出物を調製し、以前に詳述されている通りに、裸のDNA基質に対するDNase活性に関して種々の希釈で試験した（Wright, et al., 1994, 1996）。 HL-60細胞における、UV光によって誘導されるミトコンドリア(Mito)からサイトゾルおよび核へのADFの移行が、Bcl-2の過剰発現によって阻止されることを示す。細胞をUV光ありおよびなしで処理し、4時間インキュベートし、ウェスタンブロッティングにより、細胞成分画分およびrADF（陽性対照）をADFについて解析した。抗rADFは9 kD ADFおよび核DNA断片化活性を免疫枯渇させるが、アポトーシス性サイトゾルのCADを免疫枯渇しないことを示す。(A) 明らかにアポトーシス性であるUV光処理U937細胞のサイトゾルまたはrADF 50 nMのみ（陽性対照として）を、対照IgG、抗rADF、または抗カスパーゼ3でコーティングしたビーズで吸収し、次いで、³H-標識断片の放出を測定する4時間アッセイで、単離核におけるDNA断片化の誘導について試験した。カスパーゼ3も同じ試薬で吸収し、合成基質、DEVD-pNaに対するタンパク質分解活性について試験した。(B) (A)のように吸収したアポトーシス性サイトゾルを、ウェスタンブロットによりADFの存在について評価した。(C) 対照サイトゾルおよび核抽出物、アポトーシス細胞の核の抽出物、ならびに(A)のように吸収したアポトーシス性サイトゾルを、ウェスタンブロットによりCADの存在について評価した。 rADF-Ant融合タンパク質が、無傷のU937細胞において、ヌクレオソーム間のDNA断片化を誘導することを示す。U937細胞を、示した濃度のrADF-Ant、rADFのみ、遊離のペネトラチン(Pen)のみ、または遊離のPenと組み合わせたrADFと共に4時間インキュベートし、³H-標識断片の放出により(A)、またはアガロースゲル電気泳動により(B)、DNA断片化を測定した。 Bcl-2を過剰発現するHL-60細胞が、rADF-Antによって誘導されるDNA断片化に対してなお感受性があることを示す。HL-60 neoまたはHL-60 Bcl-2を示した濃度の誘導剤で処理し、4時間後に³H-標識断片の放出によりDNA断片化を測定した。熱ショック処理したU937細胞が、rADF-Antによって誘導されるDNA断片化に対してなお感受性があることを示す。U937細胞を42℃で30分間熱処理し、次いで回復できるように3時間培養し、対照U937細胞と共に、示した誘導剤に応答したDNA断片化について、³H-標識DNA断片の放出を測定する4時間アッセイで試験した。

Claims

配列番号：4の一部を含む単離されたアミノ酸配列を含む組成物であって、該一部が、配列番号：6を含み、かつDNAヌクレアーゼ活性および殺細胞活性から選択される活性を有する、組成物。
前記一部が配列番号：7を含む、請求項1記載の組成物。
ミトコンドリアタンパク質を含む複合体を含む組成物であって、該ミトコンドリアタンパク質が、DNAヌクレアーゼ活性および殺細胞活性から選択される活性を有し、かつ細胞分子に特異的に結合する第一分子に機能的に連結される、組成物。
ミトコンドリアタンパク質が配列番号：6を含む、請求項3記載の組成物。
ミトコンドリアタンパク質が配列番号：7を含む、請求項4記載の組成物。
ミトコンドリアタンパク質が、配列番号：8、配列番号：10、配列番号：12、配列番号：24、配列番号：72、配列番号：74、配列番号：76、および配列番号：78から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項3記載の組成物。
DNAヌクレアーゼ活性および殺細胞活性から選択される活性を有し、細胞分子に特異的に結合する第一分子に機能的に連結される、配列番号：14、配列番号：18、配列番号：20、配列番号：22、配列番号：26、配列番号：40、および配列番号：42から選択されるタンパク質を含む複合体を含む組成物。
タンパク質がN末端シグナルペプチドをさらに含む、請求項3〜7のいずれか一項記載の組成物。
タンパク質が細胞内部移行ペプチドをさらに含む、請求項3〜7のいずれか一項記載の組成物。
タンパク質が核局在化ペプチドをさらに含む、請求項3〜7のいずれか一項記載の組成物。
第一分子が抗体を含む、請求項3〜7のいずれか一項記載の組成物。
抗体が癌細胞に特異的に結合する、請求項11記載の組成物。
癌細胞が、非小細胞肺癌細胞、乳癌細胞、消化管癌細胞、腎臓癌細胞、および肝臓癌細胞から選択される、請求項12記載の組成物。
癌細胞が肝臓癌細胞を含む、請求項13記載の組成物。
肝臓癌細胞が肝細胞癌細胞を含む、請求項13記載の組成物。
肝臓癌細胞に結合する抗体が、Hepama-1、抗PLC1、抗PLC2、K-PLC1、K-PLC2、K-PLC3、49-D6、7-E10、34-A4、26-A10、34-B9、79-C8、16-E10、5D3、5C3、2C6、a-AFP、HP-1、hHP-1、mAb 95、YPC2/38.8、P215457、PM4E9917、HAb25、Hab27、KY-1、KY-2、KY-3、9403 Mab、KM-2、S1、9B2、IB1、A9-84、SF-25、AF-10、XF-8、AF-20、a-hIRS-1、FB-50、SF 31、SF 90、2A3D2、および2D11E2から選択される抗体を含む、請求項14記載の組成物。
肝臓癌細胞に結合する抗体がHepama-1抗体を含む、請求項14記載の組成物。
Hepama-1抗体を含む抗体がヒト化された、請求項17記載の組成物。
癌細胞が、B細胞リンパ腫細胞、骨髄性白血病細胞、腎臓癌細胞、結腸癌細胞、膵臓癌細胞、結腸直腸癌細胞、卵巣癌細胞、および前立腺癌細胞から選択される、請求項12記載の組成物。
第一分子が細胞受容体のリガンドを含む、請求項3〜7のいずれか一項記載の組成物。
リガンドが増殖因子を含む、請求項20記載の組成物。
増殖因子が、上皮増殖因子、インスリン様増殖因子、線維芽細胞増殖因子、および血管内皮増殖因子から選択される、請求項21記載の組成物。
配列番号：4の一部を含むアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む組成物であって、該一部が配列番号：6を含み、かつ該アミノ酸配列が、DNAヌクレアーゼ活性および殺細胞活性から選択される活性を有する、組成物。
前記一部が配列番号：7を含む、請求項23記載の組成物。
アミノ酸配列が、N末端シグナルペプチド、細胞内部移行ペプチド、核局在化ペプチド、およびビオチンに特異的に結合する抗体の1つまたは複数をさらに含む、請求項23記載の組成物。
配列番号：4の一部を含むアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む発現ベクターを含む組成物であって、該一部が配列番号：6を含み、かつ該アミノ酸配列が、DNAヌクレアーゼ活性および殺細胞活性から選択される活性を有する、組成物。
前記一部が配列番号：7を含む、請求項26記載の組成物。
配列番号：4の一部を含むアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む発現ベクターを含む細胞を含む組成物であって、該一部が配列番号：6を含み、かつ該アミノ酸配列が、DNAヌクレアーゼ活性および殺細胞活性から選択される活性を有する、組成物。
前記一部が配列番号：7を含む、請求項28記載の組成物。
配列番号：7に特異的に結合する抗体を含む組成物。
配列番号：7に対する抗体の結合親和性が、配列番号：4に対する抗体の結合親和性よりも高い、請求項30記載の組成物。
配列番号：6に対する抗体の結合親和性が、配列番号：4に対する抗体の結合親和性よりも高い、請求項30記載の組成物。
結合によって、DNAヌクレアーゼ活性および殺細胞活性から選択される配列番号：7の活性が減少する、請求項30記載の組成物。
以下の段階を含む、細胞死を増加させる方法：
a) i) 細胞；および
ii) 配列番号：6を含むアミノ酸配列を含む組成物
を提供する段階；ならびに
b) 該細胞を該組成物と接触させて接触細胞を生じ、該接触により該接触細胞の細胞死が増加する段階。
アミノ酸配列が配列番号：7を含む、請求項34記載の組成物。
以下の段階を含む、細胞死を増加させる方法：
a) i) 細胞；および
ii) 配列番号：8、配列番号：10、配列番号：12、配列番号：24、配列番号：72、配列番号：74、配列番号：76、および配列番号：78から選択されるミトコンドリアアミノ酸配列を含む組成物
を提供する段階；ならびに
b) 該細胞を該組成物と接触させて接触細胞を生じ、該接触により該接触細胞の細胞死が増加する段階。
以下の段階を含む、細胞死を増加させる方法：
a) i) 細胞；および
ii) 配列番号：14、配列番号：18、配列番号：20、配列番号：22、配列番号：26、配列番号：40、および配列番号：42から選択されるアミノ酸配列を含む組成物
を提供する段階；ならびに
b) 該細胞を該組成物と接触させて接触細胞を生じ、該接触により該接触細胞の細胞死が増加する段階。
アミノ酸配列が、細胞に特異的に結合する抗体に機能的に連結される、請求項34〜37のいずれか一項記載の方法。
接触細胞において細胞死の増加を検出する段階をさらに含む、請求項34〜37のいずれか一項記載の方法。
段階b)の前に、アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を提供する段階、および細胞において該ヌクレオチド配列を発現させる段階をさらに含む、請求項34〜37のいずれか一項記載の方法。
細胞がインビトロ状態である、請求項34〜37のいずれか一項記載の方法。
細胞が哺乳動物のインビボ状態である、請求項34〜37のいずれか一項記載の方法。
哺乳動物がヒトである、請求項42記載の方法。
ヒトが、癌を有するヒトおよび癌を発症し得る疑いがあるヒトから選択される、請求項43記載の方法。
アミノ酸配列が、癌における癌細胞に特異的に結合する抗体に機能的に連結される、請求項44記載の方法。
癌が、肝臓癌、胃癌(gastric cancer)、頭部癌、頚部癌、肺癌、乳癌、前立腺癌、子宮頸癌、膵臓癌、結腸癌、卵巣癌、胃癌(stomach cancer)、食道癌、口腔癌、舌癌、歯肉癌、皮膚癌、筋肉癌、心臓癌、気管支癌、軟骨癌、骨癌、精巣癌、腎臓癌、子宮内膜癌、子宮癌、膀胱癌、骨髄癌、リンパ腫癌、脾臓癌、胸腺癌、甲状腺癌、脳腫瘍、神経癌、胆嚢癌、眼癌、関節癌、グリア芽細胞腫、中皮腫、リンパ腫、白血病、黒色腫、扁平上皮癌、骨肉腫、およびカポジ肉腫から選択される、請求項44記載の方法。
癌が肝臓癌である、請求項46記載の方法。
肝臓癌細胞に特異的に結合する抗体がHepama-1抗体を含む、請求項47記載の方法。
細胞の細胞質において配列番号：7を検出する段階を含む、細胞アポトーシスを検出する方法。
検出された配列のレベルを定量化する段階をさらに含む、請求項49記載の方法。
哺乳動物の血中の配列番号：7を検出する段階を含む、哺乳動物において疾患を検出する方法。
疾患が細胞死と関連がある、請求項51記載の方法。