RO117542B1 - Metodă pentru privarea selectivă de metionină a celulelor maligne la mamifere - Google Patents

Metodă pentru privarea selectivă de metionină a celulelor maligne la mamifere Download PDF

Info

Publication number
RO117542B1
RO117542B1 RO96-01324A RO9601324A RO117542B1 RO 117542 B1 RO117542 B1 RO 117542B1 RO 9601324 A RO9601324 A RO 9601324A RO 117542 B1 RO117542 B1 RO 117542B1
Authority
RO
Romania
Prior art keywords
leu
ala
gly
mtase
metase
Prior art date
Application number
RO96-01324A
Other languages
English (en)
Inventor
Tsutomu Nobori
Dennis A. Carson
Original Assignee
The Regents Of The University Of California
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by The Regents Of The University Of California filed Critical The Regents Of The University Of California
Publication of RO117542B1 publication Critical patent/RO117542B1/ro

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/51—Lyases (4)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/527—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving lyase

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Invenţia se referă la o metodă pentru privarea selectivă de metionină a celulelor de la un mamifer care sunt suspectate de a fi MTAză negative şi constă în aceea că se determină dacă celulele sunt substanţial MTAză negative, utilizând mijloace pentru detectarea prezenţei sau absenţei MTAzei atât catalitic activă, cât şi catalitic inactivă, într-o probă de celulele, cuprinzând: a) obţinerea unor probe analizabile de celule care sunt suspecte de a fi MTAză negative, b) adăugarea sondelor oligonucleotidice care vor hibridiza specific la un acid nucleic care codifică pentru MTAză, în condiţii care vor permite sondelor să hibridizeze detectabil la oricare astfel de acid nucleic prezent în probă, şi c) detectarea acidului nucleic care este prezent în probă, indicând astfel care dintre celule sunt MTAză negative, şi se administrează o cantitate eficientă terapeutic de METază şi MTA mamiferului cu celule ce sunt MTAză negative.

Description

RO 117542 B
Invenția se referă la o metodă pentru privarea selectivă de metionină a celulelor maligne, la mamifere care sunt suspectate de a fi MTAză negative și prezintă aplicabilitate în domeniul medical și anume chimioterapia celulelor maligne.
Aminoacidul metionină (MET) este necesar pentru creșterea celulelor normale și ma5 ligne. în anumite celule maligne, această cerință este absolută, cu alte cuvinte, fără o alimentare adecvată cu MET, celulele mor.
în celulele mamifere, MET se obține din trei surse. Ea poate fi obținută din alimentație sau prin sinteza biochimică a MET din L-homocisteină (homocisteină) sau metiltioadenozină (MTA) (un produs al ciclului biosintetic al poliaminei). în ultimul caz, MTA se transformă la 10 MET, prin metiltioadenozin fosforilază (MTAză).
Studii recente au demonstrat că există numeroase linii celulare maligne cărora le lipsește MTAză și prin urmare nu pot converti MTA la MET. De exemplu, Katamari și col., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 78:1219-1223 (1981), a raportat că 23% din 3 linii celulare tumorale maligne, umane, au pierdut MTAză detectabilă, în timp ce activitatea MTAză a fost prezentă 15 în fiecare dintre cele 16 linii celulare nemaligne studiate. Celulele MTAză negative își îndeplinesc în principal necesitatea lor pentru MET prin conversia homocisteinei. Cu toate acestea, când homocisteină nu este accesibilă, în general celulele mor.
L-metionin-L-deamino-y-mercaptometan liaza (ED 4.4.1.11; MTAză) este cunoscută a degrada nu numai MET, ci de asemenea homocisteină. Prin urmare, teoretic, s-ar putea 20 priva celulele maligne, cărora le lipsește MTAză (adică celulele MTAză negative) prin degradarea MET și homocisteine plasmatice cu METază. Celulele normale MTAză pozitive ar fi de așteptat să-și asigure necesitatea lor pentru MET prin conversia continuă a MTA la MET.
Se cunoaște o metodă de privare selectivă de metionină a celulelor maligne propusă prima oară în 1972 de către Kreis în Cancer Treat Rprts., 63: 1069-1072(1972). Folosind 11 25 linii celulare maligne în culturi lipsite de MET, Kreis a fost capabil să inhibe creșterea anumitor celule maligne, prin aplicarea MTAzei la culturi. Kreis a observat, de asemenea, că 2 linii celulare normale au fost parțial “salvate” de la efectele privării de MET când s-a adăugat la culturi homocisteină. Totuși, în timp ce aceste studii in vitro au fost încurajatoare, s-au descris unele obstacole de către Kreis ca fiind în calea utilizării cu succes in vivo a MTAzei în 30 chimioterapie, inclusiv inaccesibilitatea mijloacelor care asigură supraviețuirea celulelor normale in vivo, imunogenitatea potențială a enzimei purificate sau parțial purificate și necesitatea ca enzima să fie rezistentă la degradarea proteolitică in vivo (Kries, Chemoterapy, Muggia, FM, ed.The Hague, Boston, și London; Martinus-Nijihoff, 1983), p.219-248).
Alt obstacol pentru dezvoltarea unei abordări reușite prin privare MET a celulelor ma35 ligne a fost necesitatea identificării acelor celule maligne, care sunt ținte adecvate pentru terapie; cu alte cuvinte, care celule maligne sunt MTAză negative. în final, s-a obținut un test prin care se determină dacă o celulă malignă este MTAză negativă determinând dacă este prezentă vreo activitate catalitică într-o cultură de celule (Seidenfeld, și col., Biochem.Biophys.Res. Commun., 95: 1871-1866, 1980). Totuși, datorită inaccesibilității comer40 ciale a substratului radiochimic necesar pentru testul de activitate, utilizarea sa în evaluări de rutină nu este în prezent fezabilă. Mai mult decât atât, testul de activitate nu ia în considerare labilitatea catalitică a MTAzei in vitro prin detectarea dacă orice enzimă este prezentă în cultura celulară considerând dacă ea este activă catalitic la momentul la care se realizează testul.
Această limitate a testului de activitate ar putea fi evitată prin utilizarea unui imunotest care este suficient de sensibil pentru a detecta cantitățile relativ mici de enzimă. Totuși, purificarea enzimei MTAză din surse naturale pentru dezvoltarea anticorpilor utilizabili în detecție imunologică a MTAză s-a dovedit a fi un proces laborios care dă randamente relativ scăzute (Rangione, și colab. J.Biol.Chem., 261: 12324-12329, 1986).
RO 117542 B
Chiar dacă s-au dezvoltat mijloace adecvate pentru detectarea celulelor MTAză negative, producerea unei cantități adecvate a MTAză din surse naturale a fost la fel de dificilă ca și producerea de MTAză. Producerea MTAzei prin mijloace, altele decât purificarea enzimei naturale, nu a fost încă obținută, în parte deoarece gena pentru MTAză a fost (până în prezent) numai parțial secvențiată (Nakayama, și colab., Biochem., 27: 1587-1591 (1988)).
Metoda conform invenției înlătură dezavantajele metodelor cunoscute, prin aceea că se determină dacă celulele sunt substanțial MTAză negative, utilizând mijloace pentru detectarea prezenței sau absenței MTAzei atât catalitic activă cât și catalitic inactivă într-o probă de celule cuprinzând: a) obținerea unor probe analizabile de celule care sunt suspecte de a fi MTAză negative, b) adăugare sondelor oligonucleotidice care vor hibridiza specific la un acid nucleic care codifică pentru MTAză, în condiții care vor permite sondelor să hibridizeze detectabil la oricare astfel de acid nucleic prezent în probă; c) detectarea acidului nucleic care este prezent în probă indicând astfel care dintre celule sunt MTAză negative, și se administrează o cantitate eficientă terapeutic de METAză și MTAză.
Avantajele acestei metode constau în aceea că este o metodă îmbunătățită și mult mai eficientă pentru privarea selectivă a celulelor MTAză negative în continuare, se prezintă, pe scurt, fig. 1...4 care însoțesc descrierea și rezumatul secvențelor.
- fig. 1, schemă a căii metabolice, pentru sinteza poliaminei și reducerea MTA prin MTAză;
'55
- fig.2, comparație a liniilor celulare MTAză pozitive și MTAză negative umane și nonumane detectate prin analiză imunoblot;
- fig.3, comparație a liniilor celulare umane MTAză pozitive și MTAză negative și tumorile inițiale detectate prin analiză imunoblot;
- fig.4, comparație a creșterii celulelor umane MTAză negative tratate cu METAză experimentate față de cele crescute într-un mediu bogat în metionină.
SECV.ID NR:1
SECV.ID NR:2
SECV.ID NR:3
SECV.ID NR:4
SECV.ID NR:5 este secvența aminoacidă pentru METAză de lungime întreagă, este secvența aminoacidă a unei peptide antigenice METAză. este secvența aminoacidă a unei peptide antigenice METAză care diferă în secvența aminoacidă de peptida SECV.ID NR.2.
este secvența nucleotidică a unei polinucleotide care codifică METAză.
este secvența aminoacidă a METAzei prezise din secvența nucleotidică a SECV.ID NR:4.
Conform metodei o malignitate care s-a determinat a fi MTAză negativă se tratează 85 cu o cantitate eficientă terapeutic de MTază, de preferință, MTAză recombinantă și cel mai preferat, METAză recombinantă conjugată la polietilenglicol sau o moleculă echivalentă. Mai precis, MTAza se administrează la un mamifer (de preferință un om) într-un dozaj care va reduce nivelurile MET plasmatice la o mărime suficientă pentru a priva celule MTAză negative de metionină (care în general se vor întâlni la circa < 10% din nivelul preterapiei metioni- .90 nei). Celule normale (MTAză pozitive) sunt alimentate cu MET prin administrarea în principal în același timp a MTA.
Ca mijloc pentru detectarea prezenței sau absenței MTAzei catalitic active și inactive se utilizează un imunotest. Se produc anticorpi anti-MTAză (inclusiv anticorpi monoclonali) și se folosesc într-un imunotest pentru MTAză. Un alt mijloc de detectare se referă la detec- 95 tarea prezenței genei care codifică MTAză prin utilizarea unui test bazat pe tehnicile de amplificare a acidului nucleic, în special, reacția polimerazică de lanț (PCR). Conform invenției, METAză este o proteină microbiană recombinantă care va degrada specific metionină
RO 117542 B
de mamifer in vivo, iar MET așa are substanțial aceeași secvență aminoacidă cu cea prezen100 tată în SECV.ID NR:5 sau SECV.ID NR:4.
I. Metodă pentru detectarea celulelor MTAză negative
Fig. 1 prezintă schematic căile metabolice pentru sinteza in vivo a MET din MTA și degradarea MET prin METAză. Așa cum s-a arătat mai sus pentru a câștiga în întregime beneficiile terapiei cancerului, prin privarea de metionină, celulele MTAză negative trebuie 105 să fie detectate în malignitatea țintă. Mai jos sunt descrise mijloace alternative pentru detectarea MTAzei, care sunt potrivite pentru utilizare în metodele invenției.
A. Imunotest pentru MTAză
1. Producerea MTAzei antigenice și peptidelor MTAză
Anticorpii care sunt specifici pentru MTAză sunt produși prin imunizarea unui non110 uman cu MTAză antigenică sau peptide MTAză. în general, peptidele MTAză antigenice se pot izola și purifica din țesut de mamifer conform metodei descrise de către Ragnione, și colab., J.Biol.Chem., 265:6241-6246(1990). Un exemplu care ilustrează practica acestei metode este dat mai jos în exemple. Pentru referință secvența aminoacidă pentru MTA de lungime întreagă este inclusă aici ca SECV. ID NR:1.
115 2. Imunizare cu peptide MTAză antigenice pentru a produce anticorpi anti-
MTAză
După ce s-au obținut MTAză antigenică sau peptide MTAză, se produc anticorpi față de peptida de imunizare prin introducerea peptide! într-un mamifer (cum ar fi iepure, șoarece sau șobolan). în scopurile ilustrării, secvențele aminoacide a două peptide MTA antigenice 120 sunt date în lista de secvențe anexată aici ca SECV. ID NR:2 și 3. Anticorpii produși de către iepuri imunizați cu aceste peptide au prezentat un răspuns de maxim 50% la MTA purificat la diluție de 1:1500 și respectiv, 1:4000. Pentru imunizarea animalelor cu peptide MTAză antigenice este preferat un protocol de imunizare prin injectare multiplă Langone și colab., ed., “Production of Antisera with Small Doses of Immunogen: Multiple Intradermal Injec125 tions”, Method of Enzymology (Acad.Press, 1981)). De exemplu, un răspuns anticorp bun se poate obține la iepuri prin injectarea intradermală a 1 mg de peptidă MTAză antigenică emulsionatăîn anjuvant. Freund complet urmat câteva săptămâni mai târziu de unul sau mai multe rapeluri ale aceluiași antigen în adjuvant Freund incomplet.
Peptida de imunizare se poate cupla la o proteină purtătoare prin conjugare folosind 130 tehnici care sunt binecunoscute în domeniu. Asemenea purtători folosiți de obicei care sunt chimic cuplați la peptidă includ KLH (Keyhole limpet hemocyanin), tiroglobulină, albumină serică bovină (BSA), și toxoidul tetanic. Peptida cuplată se folosește apoi pentru imunizarea animalului (de exemplu, un șoarece sau un iepure). Deoarece MTAză se crede a fi prezentă conservată la speciile de mamifere, se preferă utilizarea unui purtător proteic pentru crește135 rea imunogenicității proteinelor MTAză.
Anticorpii policlonali produși de către animalele imunizate pot fi purificați suplimentar, de exemplu, prin legare la și eluție dintr-o matrice la care peptida pentru care sunt produși anticorpii se leagă. Pentru specialiștii în domeniu, sunt cunoscute diverse tehnici comune în domeniile imunologiei pentru purificarea și/sau concentrarea anticorpilor policlonali pre140 cum și a celor monoclonali (vezi, de exemplu, Coligan și colab., Unit 9, Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 1991).
Pentru utilizare în detectarea celulelor MTAză negative, sunt preferați anticorpi monoclonali, datorită specificității lor și ușurinței producerii. Pentru prepararea anticorpilor monoclonali, se preferă imunizarea unui șoarece sau șobolan. Termenul anticorp, așa cum s-a 145 folosit în această invenție, include de asemenea molecule intacte precum și fragmente ale lor cum ar fi, de exemplu, Fab și F(ab’)2. care sunt capabili de legare determinantului epitopic. De asemenea, în acest context termenul 2mAb’-uri” și invenției” se referă la anticorpi monoclonali cu specificitate pentru MTAză.
RO 117542 Β
Confirmarea specificității MTAză printre mAb-urile invenției poate fi realizată folosind tehnici de căutare relativ de rutină (ca testul enzimei legate la imunosorbent, sau “ELISA”) 150 pentru a determina imaginea reacției elementare a mAb-ului de interes. De asemenea, este posibil să se evalueze un mAb pentru a determina dacă el are aceiași specificitate ca un mAb al invenției fără experimentare exagerată prin determinarea dacă mAb-ul de testat împiedică un mAb al invenției să se lege la MTAză. Dacă mAb-ul de testat concurează mAbul invenției așa cum s-a arătat printr-o descreștere în legare de către mAb-ul invenției, atunci 155 probabil că cei 2 anticorpi monoclonali se leagă la același epitop sau un epitop apropiat.
încă un mod de a determina dacă un mAb are specificitatea mAb-ului invenției este preincubarea mAb-ului invenției cu un antigen cu care în mod normal este reactiv și determină dacă mAb-ul de testat este inhibat în capacitatea sa de a lega antigenul. Dacă mAb-ul ’ț de testat este inhibat, atunci, în toate probabilitățile el are aceiași sau o specificitate epito- 160 pică strâns înrudită cu mAb-ul invenției.
v 3. Protocolul imunotestului pentru detectarea celulelor MTAză negative
Odată ce s-au obținut anticorpi corespunzători, așa cum s-a descris mai sus, ei se folosesc pentru detectarea MTAzei într-o malignitate. Un exemplu de imunotest adecvat acestui scop (adică o metodă imunoblot) se va descrie în continuare în Exemplul I. Cu toate 165 acestea, specialiștii în domeniul imunologiei pot detecta MTAză folosind anticorpii descriși mai sus în alte formate de imunotest fie în fază lichidă fie în fază solidă (când se leată la un purtător).
Detectarea MTAzei folosind anticorpi anti-MTAză se poate face, utilizând imunoteste care se desfășoară în moduri fie înainte, inverse sau simultane, inclusiv analize imunohisto- 170 chimice sau probe fiziologice. Protocoale de imunotest adecvate includ protocoale competitive și necompetitive realizate fie într-un format direct fie unul indirect. Exemple de astfel de imunoteste sunt radioimunotestu! (RIA) și testul imunometric (sandwich).
Suplimentar, anticorpii utilizați în imunoteste pot fi marcați detectabili. Un marcaj este o substanță care poate fi atașată covalent sau atașată strâns unei sonde de acid nucleic 175 care va crea posibilitatea detectării sondei. De exemplu, un marcaj poate fi radioizotopic, un substrat enzimatic sau inhibitor enzimatic, o enzimă, o substanță radio opacă (incluzând metalele coloidale), o substanță fluorescentă, o moleculă chemîluminiscentă, lipozomi care conțin oricare dintre marcajele de mai sus sau un membru pereche care se leagă specific.
Un marcaj corespunzător nu-și va pierde calitatea de a rămâne detectabil în timpul amplifică- 180 rii. Cea mai utilizată marcă este un radioizotopi adecvați ce includ 3H, 125l, 131l, 32P, 14C, 35S. Fragmente amplificate marcate prin intermediul unui radioizotop pot fi detectate direct printrun numărător Gamma sau prin densitometria autoradiografiilor, prin bloting-ul Southern al i fragmentelor amplificate combinat cu densitometria. Exemple de molecule chemilumîniscente corespunzătoare sunt acridinele, sau luminolul. Secvențele țintă hibridizate cu sonde 185 derivate cu ester acridium sunt protejate de la hidroliză prin intercalare. Exemple de substanțe fluorescente adecvate sunt fluoresceina, ficobiliproteina, chelații metalelor alcalinopământoase rare, dansilul sau rodamina.
Exemple de substraturi sau inhibitori enzimatic! corespunzători sunt compușii care vor lega specific peroxidaza de hrean, giucozooxidaza, glucoză-6-fosfatdehidrogenaza, β- 190 galactozidaza, piruvatchinază sau alcalinfosfatază acetilcolinesterază. Exemple de substanțe radioopace sunt aurul coloidal, sau particulele magnetice. O pereche de legare specifică cuprinde două molecule diferite în care una dintre molecule are o zonă pe suprafața sa sau se leagă specific într-o cavitate la un spațiu anume sau organizarea polară a altei molecule.
Membrii unei perechi de legare specifică sunt adesea cunoscuți ca un ligand și receptor sau 195 ligand și antiligand. De exemplu, dacă receptorul este un anticorp, ligandul este antigenul corespunzător. Alte perechi de legare specifică includ perechile hormon-receptor, perechile
RO 117542 B ; enzimă-substrat, perechile biotină-avidină, și perechile glicoproteină-receptor. Sunt incluse fragmente și porțiuni ale perechilor de legare specifică care mențin specificitatea de legare .; 200 cum ar fi fragmente ale imunoglobulinelor, inclusiv fragmente Fab și altele asemenea. Anticorpii pot fi, fie monoclonali, fie policlonali. Dacă un membru al unei perechi de legare specifică se folosește ca marcaj, procedura preferată de separare va implica cromatografia de afinitate.
Anticorpii se pot lega de asemenea, la un purtător. Exemple de purtători binecunos205 cuți includ sticla, polistirenul, polipropilena, polietilena, dextranul, nailonul amilozele, celulozele naturale și modificate, poliacrilamidele, agarozele și magnetita. Natura purtătorului, pentru scopul invenției, poate fi, fie solubilă, fie insolubilă.
,. B. Detectarea celulelor MTAză negative folosind un test bazat pe PCR ,, Pentru ușurința relativă, și viteza detectării asigurată prin imunotest folosind anticorpii ;; 210 MTAză specifici descriși aici, mijlocul preferat pentru detectarea celulelor MTAză negative
Țj este imunotestul. Cu toate acestea, pot fi folosite și alte mijloace de detecție pentru detectati rea celulelor MTAză negative într-o malignitate. De exemplu, folosind secvența de acid nucleic descrisă în SECV.ID NR:1 un specialist în domeniu ar putea construi sonde oligonucleotidice care vor hibridiza la ADN MTAză prezent într-o probă de celule. Invers, deoarece 215 se crede că deficiența MTAză rezultă din deleția genomică a genei care ar codifica proteina MTAză se poate aprecia că dacă nu se detectează nici o genă care să codifice MTAză într-o probă de celule, acele celule sunt MTAză negativă.
O descriere detaliată a unui protocol pentru amplificarea și detecția genei MTAză este dat în cererea de brevet US 08176855. Descrierea cererii.
220 C, Candidați MTAză negativi pentru terapia de privare MTAză
O malignitate care este candidat pentru terapia prezentei invenții (cu alte cuvinte, terapia prin privare MET) este una în care proteina MTAză fie catalic activă sau catalitic inac; tivă, nu este detectabil prezentă. în toate liniile celulare maligne studiate până în prezent, negativitatea MTAză (dacă este prezentă) este o caracteristică constantă în populația celu225 Iară. Cu alte cuvinte, dacă celulele unei malignități sunt MTAză negative, este de așteptat că toate celulele vor fi MTAză negative. Aceasta este consecvență cu actuala considerație din domeniu că deficiența MTAză este rezultatul deleției unei gene mai degrabă decât o mutație. Omogenitatea unei malignități pentru negativitate MTAză va spori semnificativ eficitatea privării MET ca o terapie a cancerului comparativ cu terapiile orientate spre caracteris230 tici heterogene cum ar fi antigenele tumorale țintite în terapia de anticorpi monoclonali. Totuși, pentru scopurile invenției este suficient ca malignitatea să fie “substanțial deficientă” în MTAză; cu, alte cuvinte, ca ea să nu conțină cantități detectabile de proteină MTAză.
Malignitățile umane care sunt considerate în prezent a fi substanțial deficiente în MTAză includ:
RO 117542 B
Tabelul 1 235
Mlignitate Deficiență MTAză determinată prin
Cancere pulmonare celule non-mici A-549 (adenosarcom) SK-Lu-1 (adenosarcom) H322 (bronhoalveolar) H1334 (carcinom al celulei mari) H1437 (adenosarcom) H1581 (carcinom celule mari) Imunotest*
*Linii celulare de tumori cerebrale Al 72 U-87MG U-138MG Hs683 Imunotest*
Tumori cerebrale primare: Astrocitom Glioblastom multiform Oligostrocitom Imunotest*
Limfoame și leucemii CEM (leucemie limfocitică acută) K-T-1 (leucemie limfocitică acută) NALL-1 (leucemie limfocitică acută) K562 (leucemie mielogenă cronică) DHL-9 (limfom malign) HSB2 (leucemie limfocitică acută) Imunotest*
Altele: Sarcinosarcom Walker 256 Jurkat K562 I Capan-1 (adenosarcom al pancreasului) Dovadă clinică** Imunotest*** Imunotest*** Imunotest****
LEGENDA:
‘obținut de la Colecția Americană de Culturi Tip (ATCC), Rockville, MD “Raportat de către Kries, și colab., Cancer Res., 33: 1866-1869(1973) ‘“Raportatde către Rangione, și colab., Biochem.J., 281:533-538(1992) 270 ““Raportat de către Kries, și colab., Cancer Trmt. Rpts., 63; 1069-1072(1979)
Deficiență MTAză în toate celelalte malignități s-a detectat și s-a raportat de către
Noborî, și colab. în CancerRes. 53: 1098-1101 (1993) și în Cancer Res., 51: 31933197(1991).
Folosind tehnicile de detecție descrise aici cei specializați în domeniu vor fi capabili 275 să detecteze deficiențe MTAză în alte malignități fără a mai face apoi la experimentare.
II. Terapia prin privare met
A. Producerea MTAzei
Pentru utilizare în metodele invenției, sunt necesare surse de MTA și METază. Mijloacele pentru obținerea MTA sunt descrise mai sus. Pentru utilizare în metodele invenției, 280 METază s-a purificat din microorganisme incluzând Trichomonas vaginalis (Lockwood, și
RO 117542Β colab., J.Biochem.279; 675-682,1991), Clostridium sporogenes (vezi de exemplu, Kries, și colab., de mai sus la 1867, EC 4.4.1.11), și Pseudomonas putida (Nakayama, și colab., Biochem., 27:1587-1591, 1988).
285 Folosind o bancă cADN construită de la P.putida s-a identificat secvența nucleotidică de lungime întreagă pentru METază și este conținută în Lista de secvențe anexată aici ca SECV.ID NR: 4; secvența aminoacidă este conținută în SECV.ID NR: 5.
Cu această informație, METaza poate fi sintetizată sau exprimată de la o clonă ADN, folosind tehnici binecunoscute, așa cum s-a descris mai sus pentru MTAză. Un exemplu 290 detaliat de cum poate fi METaza donată și exprimată în E.coli este dat suplimentar mai jos în Exemplele II și III.
METaza odată purificată, parțial purificată, sintetizată sau METază recombinantă se poate folosi în metoda terapeutică a invenției, ultima fiind preferată datorită ușurinței cu care se produce și imunogenității relativ scăzute. Imunogenicitatea enzimei poate fi, și de prefe295 rință va fi, redusă în continuare prin cuplarea ei la polietilenglicol (PEG) sau o moleculă biologic compatibilă echivalentă. Cuplarea la PEG poate fi așteptat de asemenea să reducă timpul de înjumătățire in vivo al conjugatului METază.
Conjugatul PEG-METază se poate forma prin atașarea covalentă a PEG la enzime așa cum s-a descris pentru L-asparagină (vezi de exemplu, Benedich, și colab., Clin. 300 xp.lmmunol. 48: 273-278, 1982). Metode pentru cuplarea PEG sunt cunoscute în domeniu. Pe baza rezultatelor observate în experimente clinice umane pentru tratamentul limfomului non-hodgkins cu L-asparaginază cuplată la PEG, cuplarea METazei la PEG nu va fi de așteptat să reducă semnificativ activitatea sa in vivo (vezi, rezultatele obținute in vivo cu PEG-L-asparaginază, Muss, și colab., Invest.New Drugs, 8:125-130 (1990)). Specialiștii în 305 domeniu vor recunoaște totuși că sunt cunoscute alte mijloace pentru mărirea timpului de înjumătățire al proteinelor in vivo și pot fi potrivite cu METază inclusiv dar fără se se limiteze la glicozilarea și succinilarea.
B. Metode terapeutice
Malignitățile care sunt substanțial deficiente în MTAză vor fi tratate în parte conform 310 invenției prin administrare de METază. De preferință, aceste malignități vor fi cele care pot fi tratate prin chimioterapie regională; cu alte cuvinte, acolo unde malignitatea este localizată și conținută într-o zonă a corpului care este accesibilă prin infuzie intraarterială sau prin introducere prin căi topice, transdermale sau echivalente pentru administrarea METazei direct la locul malignității. Exemple de malignități care sunt accesibile pentru chimioterapie regio315 nală sunt melanoamele, cancerul ovarian (prin intermediul unui cateter peritoneal) și cancerul vezicii urinare (prin intermediul unui cateter uretral). Alte malignități care dacă sunt MTAză negative se pot trata prin chimioterapie regională conform invenției vor fi bine cunoscute specialiștilor oncologi.
Se va aprecia de specialiștii în domeniu că compozițiile terapeutice ale invenției se 320 pot administra de asemenea sistemic. Totuși, dozajele vor trebui să fie ajustate pentru a compensa eliminarea compozițiilor și toxicitatea potențială pentru celulele normale. în particular, evidența clinică a privării de metionină a celulelor normale va trebui să fie monitorizată foarte strict și compensată dacă este necesar prin administrarea cantităților suplimentare de MTA.
325 Malignitățile care sunt substanțial deficiente în MTAză se vor trata de preferință conform invenției după cum urmează.
C. METaza se va administra la un mamifer (de preferință un om) perenteral, ruta preferată de administrare fiind infuzarea intraarterială. METaza se va administra într-un purtător acceptabil farmaceutic care poate include soluții apoase sterile sau
RO 117542 Β neapoase, suspensii și emulsii. Exemple de solventii neapoși sunt propilenglicolul, polietilen- 330 glicolul, uleiurile vegetale ca uleiul de măsline și esteri organici injectabili ca oleatui de etil. Purtătorii apoși includ apă, soluții alcoolice/apoase, emulsii sau suspensii incluzând medii saline și tamponate. Așa cum s-a remarcat mai sus, METaza va fi de preferință conjugată la PEG pentru reducerea imunogenicității sale.
Vehiculele parenterale includ soluție clorură de sodiu, dextroză Ringer, dextroză și 335 clorură de sodiu, uleiuri lactate Ringer sau uleiuri fixate. Vehiculele intravenoase includ fluid și nutrienți de completare, electroliți de completare (precum cel bazat pe dextroză Ringer) și altele asemenea. De asemenea, pot fi prezenți conservanți și alți aditivi, ca de exemplu, antimicrobieni, antioxidanți, agenți de chelare, gaze inerte și altele asemenea.
Dozajele METazei pot varia de la circa 10 unități/m2 până la 20000 unități/m2, de pre- 340 ferință, de la circa 5000 până la 6000 unități/m2 (sau mai scăzute când se administrează prin infuzie intraarterială) în una sau mai multe doze de administrare săptămânală timp de una sau câteva zile. METaza poate fi de așteptat în general, să fie eliminată de către mamifer în circa 24 h după administrarea sa; prin utilizarea mijloacelor pentru mărimea duratei de înjumătățire a enzimei cum ar fi prin conjugare PEG, timpul de înjumătățim al acesteia poate 345 fi mărit prin câteva ore până la câteva zile. Prin urmare, nivelurile metioninei plasmatice ale mamiferului vorfi urmărite și se vor administra doze METază suplimentare pentru a obține o reducere terapeutică semnificativă a concentrației metioninei plasmatice a mamiferului. Aceasta va fi o reducere suficientă pentru a induce o descreștere detectabilă în volumul celulelor; cu alte cuvinte, o descreștere în volumul celulelor maligne sau încărcării tumorale 350 din mamifer. Un dozaj care atinge acest rezultat va fi considerat o doză “terapeutic eficientă”. Pe baza studiilor in vivo la rozătoare, folosind METază parțial purificată poate fi de așteptat ca o doză eficientă terapeutic să fie una care reduce nivelele metioninei plasmatice la un pacient până la circa mai puțin sau egal cu 10% din nivelul său anterior terapiei.
Nivelurile metioninei plasmatice (și schimbările din acestea) pot fi urmărite prin ana- 355 lize periodice (și de preferință zilnice) in vitro ale probelor de sânge prelevate de la pacientul care primește METază pe durata administrării sale. în general, pe baza studiilor făcute la rozătoare poate fi de așteptat ca nivelurile metioninei plasmatice să fie scăzute până la mai puțin sau egal cu 10% din nivelurile lor anterior terapiei în circa 1 oră de administrare a METazei. Analizele pentru metionină plasmatică sunt bine cunoscute în domeniu; de exem- 360 piu, concentrația metioninei într-o probă de sânge poate fi determinată folosind metoda cromatografie gaz-lichid a aminoacizilor esterificațî (Ester n-butil) descrisă în Roach și colab., J.Chromatog. 44: 269-278 (1969). Alte proceduri echivalente pentru detectarea metioninei din plasmă vorfi cunoscute sau identificate cu ușurință de cei cu pregătire obișnuită în domeniu. 365
Ar fi de remarcat că METaza nu poate degrada metionină intracelulară. Prin urmare, cu o furnizare adecvată de MTA pentru formarea metioninei intracelulare, celulele MTAză pozitive în general vor fi apte să supraviețuiască reducerii metioninei exogene prin METază. Cu toate acestea, fără o furnizare de metionină exogenă (sau substrat L-homocisteină pentru metionină care de asemenea este degradat prin METază), celulele MTAză negative 370 care au o necesitate absolută de metionină în general, nu vor supraviețui pierderii metioninei plasmatice.
Eficacitatea terapiei se poate confirma și monitoriza prin orice dovadă clinică indicatoare a unei reduceri în volumul celular a malignității (determinată prin mijloace cunoscute în domeniu) și/sau detectarea periodică a volumului celulelor METAză negative în malignitate 375 folosind mijloacele de detecție descrise aici. Pe baza datelor clinice considerând utilizarea terapiei L-asparaginazei la oameni, se poate aștepta ca toxicitatea terapiei METAză va fi cât se poate de scăzută și poate consta inițial din reacții alergice tratabile binecunoscute pecialiștilor în domeniul clinic cum ar fi administrarea epinefrinei.
RO 117542 B
380 Prin urmare, MTA se va administra mamiferului substanțial concurențial cu METază.
De preferință, MTA și METaza vor fi administrate la același moment. Deoarece MTA nu acționează ca substrat pentru METază, cele două pot fi combinate împreună într-un purtător acceptabil farmaceutic. Alternativ, MTA se poate administra în circa 24 h de la administrarea METazei (și de preferință mai devreme) pentru “salvarea” celulelor METază pozitive a căror 385 alimentare endogenă cu metionină este eliminată.
Doza de MTA necesară pentru salvarea celulelor normale va depinde în funcție de numărul factorilor clinici, incluzând localizarea malignității, volumul celulelor MTAză negative din malignitate, durata terapiei METazei și accesibilitatea pacientului a dietei MET. în general, totuși, MTA se va administra în dozaje suficiente pentru a menține nivelul metioninei 390 plasmatice la circa 1-10 μΜ.
în continuare, se dau mai multe exemple de realizare a invenției. Abrevierile și unitățile de măsură folosite sunt abrevierile standard.
Exemplul 1.
Imunotest pentru MTAză
395 A. Producerea anticorpilor MTAză
Se purifică MTAză din ficat bovin așa cum s-a descris de către Rangione și colab. S-au secvențiat câteva peptide triptice din enzima izolată folosind tehnici convenționale. Pe baza secvențelor obținute, peptidele 40 (lungime 18 aminoacizi; vezi SECV.ID NR: 2 și 51 (lungime 14 aminoacizi; vezi SECV.ID NR: 3) s-au sintetizat printr-o modificare a 400 binecunoscutei metode Merrifield în fază solidă modificată (vezi, de exemplu, Chem, și colab., Proc. Natl. Acad. Sci. SUA, 81:1784-1788,1984). Toate peptidele au conținut un rest cisteină la terminusul carboxi pentru a facilita cuplarea chimică la proteina purtător, KLH, cu esterul m-maleidobenzoil-N-hidroxisuccinimidă.
Se imunizează n iepuri albi de Noua Zeelandă (2 iepuri per peptidă) pe bază bilunară 405 cu conjugate peptidă-KLH. injecțiile inițiale au conținut 1 mg de conjugat sintetic peptidă-KLH emulsionată în adjuvant Freund complet. Injecțiile de rapel au avut 1 mg de antigen în adjuvant Freund incomplet. După 3-4 injecții, se purifică parțial serurile cu sulfat de amoniu saturat 50% și se analizează pentru antipeptidă și reactivități anti-MTAză prin metoda ELISA.
Mai precis, plăcile de microtitrare se preacoperă cu peptide sau MTAză la 10 /zg/ml 410 în BBS (0,2 M borat de sodiu-O,15 M NaCI, pH 8,5) peste noapte la 4°C. Plăcile se spală apoi o dată în BBS conținând 0,05% Tween 20 și apoi se incubează 4 h cu BBS conținând 1% albumină serică bovină pentru blocarea siturilor de legare nespecifice. Apoi, se aplică câteva diluții ale unui ser de control sau antiseruri induse peptidă în alicote de 0,1 ml și se incubează peste noapte. Plăcile se spală apoi de 2 ori cu BBS conținând 0,05% Tween 20 415 și apoi se expun 1 oră la F(ab')2 de capră anti-imunoglobulină de iepure marcat fosfatază alcalină (Jackson Laboratories, Inc., West Grove, PA) la o diluție de 1:1000 în BBS. După ce plăcile s-au spălat; se adaugă 0,2 ml de 0,1 M p-nitrofenil fosfat disodic în 0,1 M NaHCO3, pH 9,0, la fiecare godeu. Se măsoară apoi absorbanta la 405 nm 30 de minute mai târziu.
B. Protocolul pentru analiza imunoblot pentru imunoreactivitate MTAză
420 S-au evaluat câteva linii celulare umane și biopsii tumorale pentru prezența celulelor
MTAză negative (vezi, celulele MTAză negative, Tabel I, paragrafele marcate imunotest”). Alte probe care s-au testat MTAză pozitive au fost BV-173 (o leucemie mielogenă cronică, “CML”), Molt-16 (o leucemie limfocitică acută, “ALL”), Molt-4 (ALL), U397 limfom histiocitic), SUP-T8 (ALL), U-373MG (glioblastom) și T98G (glioblastom).
425 Extractele celulare preparate de la celule enzimo-pozitive s-au supus electroforezei pe un gel poliacrilamidic 12,5% conținând 0,1% dodecilfosfat de sodiu alături de cantități diferite de MTAză care s-a purificat din ficat bovin așa cum s-a descris mai sus.
RO 117542 B
Mai precis, extractele celulare brute (10-150 /zg/bandă) s-au separat prin electroforezăîn geluri poliacrilamidice 12,5% conținând 0,1% dodecii fosfat de sodiu. După electrotransfer la membrane microcelulozice (0,45 mm; Bio-Rad, Richmond, CA), siturile de legare 430 nespecifice s-au blocat cu 3% lapte praf în BBS. Apoi, proteinele s-au sondat timp de 16 h, ia temperatura camerei cu antiseruri diluate 1:500 în BBS conținând 3% iapte praf. După ce proteinele s-au spălat extensiv cu BBS, s-au detectat benzi reactive prin legarea proteinei A-125l (ICN Radiochemicals, Irvine, CA) timp de 1 oră. Membranele s-au spălat și s-au blotat pe șervețele de hârtie și s-au expus la film Kodak XAR-5 (tm) la -70°C. 435
Benzile de pe autoradiografii s-au scanat cu un densitometru (Bio-Rad) și s-au cuantificat folosind o curbă de calibrare obținută de la benzile imunoreactive ale enzimei purificate.
C. Rezultate în liniile celulare nepulmonare și biopsii (adică în giioame) 67% (4 din 6) au fost în 440 întregime deficiente în enzimă imunoreactivă (Figura 2). Din șase specimene succesive de biopsie din giioame umane, cu diferite caracteristici histologice (Tabel I), cinci au fost în întregime deficiente (Figura 3). Experimentele de control au arătat că creierul uman normai a fost abundent în activitate MTAză (fig. 3, banda 7). Astfel, deficiența MTAză completă este o anormalitate metabolică comună și specifică în giioame umane. 445
Din 19 linii celulare de cancer pulmonar al celulelor non-mici testate, MTAză a lipsit în întregime în șase linii celulare (vezi, Tabelul I și fig. 4).
Exemplul 2.
Clonarea METazei DIN Pseudomonas putida
Cu referire ia secvența aminoacidă parțială pentru METază publicată de către Waka- 450 yama, și colab., Biochem., 27:1587-1591, 1988) s-au desemnat primeri oligonucleotidici degenerați și s-au folosit într-o analiză PCR pentru gena pentru METază.
Această analiză PCR a amplificat un fragment de aproximativ 300 bp. Produsul PCR de 300 bp s-a subclonat în plasmidul p-Bluescript II KS (Stratagene, San Diego). Folosind o sondă oligonucleotidică internă pentru produsul PCR, analiza Southern blot a acestui pro- 455 dus PCR subclonat a verificat identitatea acestui fragment ca fiind gena METază. Analiza Southern blot ulterioară a arătat că acest fragment generat PCR a hibridizat la un fragment de 50 kb Bglll în ADN Pseudomonas putida.
Pe baza acestor rezultate s-a construit o bancă ADN genomic bacteriofagică conținând ADN genomic Pseudomonas putida. Pseudomonas putida digerată Bglll s-a supus 460 electroforezei pe un gel de agaroză 0,8% cu punct de topire scăzut. Fragmentele Bglll au fost în mărime în domeniul 4 kb până la 6 kb și s-au excizat și purificat din gel. Folosind fragment Klenow, aceste fragmente Bglll au fost parțial completate și s-au subclonat în bacteriofagul vector vFIxll. Acest vector s-a digerat cu Xhol și s-au completat parțial cu Klenow.
Banca s-a împachetat în particule bacteriofagîce folosind extract de împachetare gigapack 465 de la Stratagene. După împachetare, banca s-a amplificat și titrat.
Pentru izolarea genei METază complete, această bancă s-a cercetat folosind fragmentul generat PCR. După căutarea a 200000 de clone, s-au izolat 8 clone inițial independente. Din aceste 8 clone numai 2 clone au fost într-adevăr pozitive și unice. Una dintre clone a conținut un insert de 5,1 kb și alta a conținut un insert de 5,9 kb. Aceste inserte s-au 470 subclonat în pBluescriptll KS și în continuare au fost configurate și secvențate. Noi am determinat că secvența pentru gena METază a fost de 1615 bp (vezi, SECV.ID Nr: 4).
Exemplul 3.
Expresia METazei recombinante
Gena METază recombinantă s-a exprimat în vectorul C5. Acesta este același vector 475 folosit pentru expresia MTAzei (US 08176855). Pentru a inocula o cultură de 50 ml s-a folosit o singură colonie de C5 recombinantă donată în E.coli. S-a folosit mediu Lb standard
RO 117542 Β
480
485
490
495
500
505
510
515
520 suplimentat cu 50 μg/ml ampicilină pentru ambele și culturile bacteriene la scară mare. Cultura de 50 ml inoculată s-a incubat peste noapte la 37°C. Pentru inducerea expresiei METazei s-a adăugat (IPTG) la o concentrație finală de 0,01, 0,1 și 1 mM pentru cultura mare și culturile s-au incubat pentru încă izopropiltio-p-D-galactozidă 4 h. Concentrația optimă a IPTG pentru expresia proteinei s-a găsit a fi 1 mM.
La 4 h după adăugarea IPTG, celulele s-au colectat și recoltat prin centrifugare la 19000 x g, 10 minute la 4°C. Supernatantul s-a îndepărtat și peletul s-a suspendat și spălat în soluție salină rece, apoi s-a centrifugat din nou. Peletul celular resuspendat s-a spălat în 100-200 ml tampon fosfat de potasiu 20 mM, pH 7,5 care conține 15 μΜ 2-mercaptoetanol. S-au adăugat 1 mM EDTA și 30 μΜ piridoxal 5'-fosfat (tampon A), apoi peletul s-a rotit din nou. Suspensia celulară spălată resuspendată (în tampon) s-a plasat într-o bombă de distrugere celulară. Ruperea celulară s-a făcut folosind presiune de 2200 PSI N2 timp de 20 minute. Celulele lizate s-au centrifugat 43000 x g 20 de minute la 4°C. Supernatantul de la extractul celular s-a purificat suplimentar prin afinitate de coloană colorant-ligand.
Extractul celular (10 ml) s-a plasat pe un gel “DYEMATRIX” (Orange A) (Amicon Inc., Beverly, MA), în coloană de 12 x 2,6 cm. (Coloană s-a împachetat și echilibrat urmând instrucțiunile producătorului. După încărcarea probei prin coloană s-au trecut 5 volume de coloană de tampon A pentru îndepărtarea materialului nelegat. După această etapă, produsul legat s-a eluat cu un gradient linear 0-1,5 M KCI în tampon A. S-au colectat 10 ml de fracții și s-au supus la analiză enzimă y-liază. Fracțiile care au conținut maximul principal de activitate metionină y-liază s-au strâns și s-au concentrat până la 2-3 ml prin “CENTRICON 30 (Amicon Inc.).
S-a adăugat (NH4) 2SO4 la fracțiile concentrate (0,314 g/ml) pentru a da o concentrație finală de 2,4 M, și probele s-au centrifugat 13000 x g timp de 10 minute și supernatantul s-a filtrat cu un filtru acrodis 0,45 μ (Amicon, Inc.) înaintea injectării într-o coloană Alkyl “SUPEROSE” (agaroză) Hr 5/5 hydrophobic-interaction-FPLC (Pharmacia), care a fost echilibrată cu 2,4 M (HN4) 2SO4 dizolvat în tamponul A folosit pentru etapele anterioare. Proteina legată s-a eluat prin descreșterea lineară a concentrației (NH4) 2SO4 (rată de curgere 0,5 ml/minut). Fracțiile care conțin activitate METază s-au colectat și concentrat așa cum s-a descris mai devreme. Concentrația proteinei s-a măsurat prin metoda descrisă de către Bradford.
Puritatea preparatului enzimatic s-a verificat prin gel SDS 10% cu 1 mm glicină-Tris (Novex, San Diego, CA). Activitatea METază s-a testat prin măsurarea producerii acidului 2-cetobutiric așa cum s-a descris de către Esaki & Skoda (Meth.Enzymol. 143:459-465 (1987)), descrierea care este încorporată aici. Enzima finală a avut o activitate specifică de 300 U/mg unde 1U = 1 μΜ produs generat pe minut.
Exemplul 4.
Privarea selectivă a celulelor MTAză negative în linii de celule canceroase pulmonare non-mici
Linii de celule canceroase pulmonare non-mici MTAză negative identificate în exemplul I s-au tratat in vitro într-o cultură de celule cu METază și MTA conform metodei terapeutice a invenției. în mod specific, liniile celulare enzimo-pozitive (SK-MES-1) și negative (A549) s-au cultivat patru zile (a) mediu care conține metionină suplimentat cu 10% ser dializat de cal, (b) mediu epuizat de metionină suplimentat cu 10% ser dializat de cal și (c) mediu epuizat de metionină suplimentat cu 10% ser dializat de cal și 16 μΜ MeSAdo. Proliferarea ambelor linii celulare, în special a celulelor A-549 enzimo-negative, a fost întârziată pronunțat în mediu lipsit de metionină (27 și 3,3% creșterea controlului pentru celule SK-MES-1 și respectiv, A-549). Când s-a adăugat MTA la același mediu el a mărit creșterea celulelor SKMES-1 enzimo-pozitive (77% creșterea controlului). Cu toate acestea, proliferarea celulelor
525
RO 117542 B
A-549 enzimo-negative nu a sporit în prezența MTA (4,3% creșterea controlului) (Tabel II).
Aceste date arată că, creșterea celulelor MeSAdo fosforilazo negative poate fi blocată selectiv în mediu epuizat metionină, suplimentat MeSAdo.
Tabeluill 530
Creșterea (% a controlului)b Lipsit de metionină
Linie celulară Stare enzimăa Fără MeSAdo Cu MeSAdo
SK-MES-1 + 27 ±2,6 77 ±4,7
A-549 - 3,3 ± 0,6 4,3 ± 1,1
a+, prezent; absent.
b procentul creșterii controlului = 100 x (creștere celulară în mediu epuizat metionină cu sau fără MTA)/(creștere celulară în mediu care conține metionină).
540
Exemplul 5.
Privarea de metionină a celulelor maligne umane cu METAză recombinantă
Pentru studiul efectelor antiproliferative ale METazei recombinante produse așa cum s-a descris în exemplele II și III, s-au cultivat celule umane SK-MES-1 și A-549 în mediu DMEM și 10% ser fetal bovin dializat suplimentat cu 0,66 U/ml METază recombinantă. După 545 3 zile, s-a determinat proliferarea celulară. Efectele METazei s-au exprimat ca un procent al creșterii celulare în mediu lipsit de enzimă adăugată.
Așa cum s-a arătat în fig.4, în mediu suplimentat METază celulele enzimo-pozitive (SK-MES-1) și enzimo-negative (A-549) au crescut prin 26,6 și respectiv, 2,96%. Totuși, dacă s-a adăugat 20 μ MTA ca o ca o sursă alternativă de metionină celulară, creșterea 550 celulară s-a refăcut la 61,4% din valoarea controlului la celulele enzimo-pozitive, în timp ce creșterea la celulele enzimo-negative a scăzut până la 2,0%.
LISTA SECVENȚELOR
555 (1) INFORMAȚIE GENERALĂ:
(i) SOLICITANT: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFORNIA (ii) TITLUL INVENȚIEI: METODĂ PENTRU PRIVAREA SELECTIVĂ DE METIONINĂ
A CELULELOR MALIGNE LA MAMIFERE (iii) NUMĂR DE SECVENȚE: 5 560 (iv) ADRESA PENTRU CORESPONDENȚĂ:
(A) ADRESANT: Robbins, Berliner& Carson (B) STRADĂ: 201N, Figueroa Street, 5th floor (C) ORAȘ: LOS ANGELES (D) STAT:CALIFORNIA 565 (E) TARA: SUA (F) COD: 90012 (v) FORMĂ CITIBILĂ PE COMPUTER:
(A) TIPUL MEDIULUI: FLOPPY DISK 570 (B) COMPUTER: PC compatibil IBM (C) SISTEM DE OPERARE: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: patentln Release NR.1.0, Versiune NR.1.25
RO 117542 B
(vi) DATE CURENTE ALE CERERII:
575 (A)NUMĂRUL CERERII:US (B)DATA DEPOZITULUI: (C)CLASIFICARE:
580 'Wt (vii) INFORMAȚIE MANDATER/AGENT: (A) NUME: Robbins, Berliner & Carson (B)NUMĂRUL DE ÎNREGISTRARE: 20121 (C)REFERINȚA/NUMĂR DOSAR: 5555-286
585
Ț 7 (ix) INFORMAȚIE PENTRU TELECOMUNICARE: (A)TELEFON: 231-977-1001
(B)TELEFAX: 231-677-1003
ii 590 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECV ID NR: 1 (i) CARACTERISTICI SECVENȚĂ: (A) LUNGIME: 2763 BAZE PERECHI (B) TIP: ACID NUCLEIC
. 595 (C) CATENARITATE:simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP DE MOLECULĂ: ADN (genomic)
600 (vii) SURSA IMEDIATĂ: (A) CLONA: METILADENOZIN FOSFATAZĂ
(xi) CARACTERISTICA:
(A) NUME/COD: CDS 605 (B) LOCALIZARE: 1...2763 (xi) DESCRIERE SECVENȚĂ: SECV ID NR:1:
TTTATACAGA GCATGACAGT GGGGTCCTCA CTAGGGTCTG TCTGCCACTC 610 TACATATTTG 60
AAACAGGAGT GGCTTCTCAG AATCCAGTGA ACCTAAATTT TAGTTTTAGT
TGCTCACTGG 120
615 ACTGGGTTCT AGGAGACCCC CTGTGTTAGT CTGTGGTCAT TGCTAGSAGA
ATCACTTAAT 180
TTTTTCTAGA CTCTAGGAGA AAACAGTTGG TGGTGTACTC ATCACGGGTT
AACAATTTCT 240 620
TCTCTCCTTC CATAGGCATG GAAGGCAGCA CACCATCATG CCTTCAAAGG TCAACTACCA 300
RO 117542 B
GGCGAACATC TGGGCTTTGA AGGAAGAGGG CTGTACACAT GTCATAGTGA
CCACAGCTTG 360 625
TGGCTCCTTG AGGGAGGAGA AGTTCATTGA 420 TTCAGCCCGG CGATATTGTC ATTATTGATC
CANNNNNNNN NNNNNNNNNN CAATTGTCTT 480 GAGGTCGACG GTATCGATAA GCTTTGTAAA 630
TAGCTTATCC AGAGGAATTG AGATAAAGTT 540 AGTCTGGAGT AAAGACCCAA ATATTGACCT
GACTCACCAG CCCTCGGAGG AAAAACCTTT 600 ATGGAAAGAT GGCCTTAAAA TAAAACAAAC 635
GACTCACCAG CCCTCGGAGG AAAAACCTTT 660 ATGGAAAGAT GGCCTTAAAA TAAAACAAAC 640
TGTGCCAGAG GAGTGTGCCA AACGAGAGAG 720 TATTCCAATG GCTGAGCCGT TTTGCCCCAA
GTGTGTAGTC TTTCTGGAAG GTGGCATCTG 780 GTGTACCAGA ATAAATCATG TGGGCTTGGG 645
GCATTTGGTT AATTGGCAGA GCTTTGTATT 840 CGGAGTGGCC CCATACCCTC ACTCAAGTTT
ATGCAAGTTT ATGGAGAGTT NNNNNNNNNN 900 ATTTCCTGTT GCTAATAATT TNNNNNNNNN 650
AAGTGCAGCC TTAAGTTGTG TTTTCTTTTC 960 CATGTGCTAG TATGTTTTGA AGTTTCTGGT 655
TAGGTTCTTA TAGAGACTGC GGGGACAATG 1020 TAAGAAGCTA GGACTCCGGT GCCACTCAAA
GTCACAATCG AGGGACCTCG CCGCACCTGG 1080 TTTTAGCTCC CGGGCAGAAA GCTTCATGTT 660
GGGGCGGATG TTATCAACAT GGAGGCTGGA 1140 GACCACAGTT CCAGAGGTGG TTCTTGCTAA
ATTTGTTACG CAAGTATCGC GCACGAGGAA 1200 CATGGGCACA CATTATGACT GCTGGAAGGA 665
GCAGTAGGTG GAATTCTTTT CCAATAGGGT 1260 CTAAGCACAT ATAGCATGGG TTTCTGGGTG 670
GTCTTAACTG TTTGTTTCTA AAGGTTTTGA 1320 TTACGTTAGT TTCAGAAAGT GCCTTTCTAC
RO 117542 Β
AGTTGTTAAT ATTTTCTGTA AAGAAAGAAA 1380 GTTCCATTGG AAGGTAAGAA CAAAGATCAA
675 GAGACACTTT TACCCAAGGA GTAGATGTGT 1440 TCAGTAGTGA AAATAGTACA TTGTAGGCAT
TGAGAATCAT ACTAAGACTT GGGCCTTANN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN
680 NNTACCCTAC 1500
ATTGAGGATT CGGTTTCAGC CTGTAGCAAG 1560 AGATAAATTT GAGGGACACA AACATTTAGG
685 GCTGGAGCTC AGAAAAATGT TTTATGACAA GCAGTGGAAT TTTAAGTTCT
AGTAACCTCC 1620 AGTGCATTG TTTCTCTAGG TTTCGGTGGA CCGGGTCTTA AAGACCCTGA
690 AAGAAAACGC 1680
TAATAAAGCC AAAAGCTTAC CAGAATGGTC 1740 TGCTCACTAC CATACCTCAG ATAGGGTCCA
AGAAACCCTC CATAACCTGA AGGTAAGTGC AGCCATGGAC AATCAGGCAT
695 GTCTGTAGAC 1800
TCTCTATTGT CTTCTTTTCT TACTTGCATT TCACCTTTGG TCCTCATGTA
1 1 11 1 1GCCA 1860
700 GCCTAGATGT TTTCAACAAG CCACTTGTGA 1920 TTTTTGTGAC ATCTACTACT ACCATACCAA
705 AACTGAGTAG TCTTATTTTC NNAATAAACA 1980 TTGGCTGGTA GTGCAGANNN NNNNNNNNNN
ATAATCCAGG CTGGGCTGGT CTGAGATAAG 2040 ATGGCAATAA GTGATTATCA GAACAATGCT
710 CATTATTTAAC CTCACTTTAC GAGTACCCGA2100 AGGAAAGGGA GGTGAGGAAC CAAGAGTTTA
AGTTCCACAT CTGGTTAGTG AAGTGTATGT 2160 AACTTGAAAA TTTTCTGTAG AATTTATTTA
715 TTCCTGCGTC CTCACTTTGA AACAAACATC 2220 TCTAGAAAAT CAAAATCTGT TTTTTTTTTT
720 TCAGTAATTA CGCCAACATG GAATATGGCC 2280 TGAATATCAC TGCCTCCTTT CTTCCTTTCA
CAGTTTTCTG TTTTATTACC GAAAAGAAGA 2340 AAGACATTAA AGTAGCATGG CTGCCCAGGA
RO 117542 B
CATTCTAATT
TGGGAAAGAC
ATGCAGCTTT
AGACATTGTG
TGTATAGAGA CTCCTCAATG
GCAAATGACT 2520
AGTAACATGT GGGAAAAAAT
CCATTCTCTT 2580
CTCCCCCTAT TAAATTTGCA
TCCTATACTG 2640
CCAAAGAATG TGAGGAAGAA
CTGTAAATTG 2700
GTACAGTATT TCTGGAGGGC
AATACGGACG 2760
CCAGTCATTT 2400
CATGCCCTTG 2460
TGGGAATTCC
CCTATCAAAG
ATTTAGACAA
ATTACATTTT
ACAATAAAGG
ATGGGACTCT
AATTTGGTAA
TGCTTAACTT
AGTATGTTGT
CTTCAAAATA
AAGGGGGAAA
GTGGAGGGTA
TTGGTTATTT
AATGCATCAA
GAAAAAAATA
AAGAAAGACA
CAGAAGAAAA
AAAAACCCCA
ATCTCTACTT
ATTGATGCGA
AAGACTTAAA
725
730
735
740
TAC
2763
745 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECV ID NR: 2 (i) CARACTERISTICI SECVENȚĂ:
(A) LUNGIME: 17AMINOACIZI (B) TIP: AMINOACID (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP DE MOLECULĂ: peptidă (vii) SURSA IMEDIATĂ:
(A) CLONA: peptide METILADENOZIN FOSFATAZĂ (xi) CARACTERISTICA:
(A) NUME/COD: peptidă (B) LOCALIZARE: 1...17 (xi) DESCRIERE SECVENȚĂ: SECV ID NR:2 lle Gly lle lle Gly Gly Thr Gly Leu Asp Asp Pro Glu lle Leu Glu
10 15
750
755
760
765
770
RO 117542 B
(2) INFORMAȚIE PENTRU SECV ID NR: 3 (i) CARACTERISTICI SECVENȚĂ: (A) LUNGIME: 13AMINOACIZI
775 (B) TIP: AMINOACID (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP DE MOLECULĂ: peptidă
, 780 (vii) SURSA IMEDIATĂ:
«Λζ (A) CLONA: peptide METILADENOZIN FOSFATAZĂ
n β 785 (xi) CARACTERISTICA: (A) NUME/COD: peptidă (B) LOCALIZARE: 1...13 (xi) DESCRIERE SECVENȚĂ: SECV ID NR:3
790 Leu Leu Leu Thr Thr lle Pro Gin lle Gly Ser Met Glu 1 5 10 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECV. ID NR.4
795 (i) CARACTERISTICI SECVENȚĂ: (A) LUNGIME: 1615 BAZE PERECHI (B) TIP: ACID NUCLEIC
800 (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP DE MOLECULĂ: ADN(genomic)
805 (vii) SURSA IMEDIATĂ: (A) CLONA:metionin-gama-liază (xi) CARACTERISTICA: (A) NUME/COD: CDS
810 (B) LOCALIZARE: 304...1497 (xi) DESCRIERE SECVENȚĂ: SECV ID NR:4 ATAGGATGGC CTGGTAGCCA GTGATATAGC CGTTGTCTTC CAGCAGCTTG
815 ACCCGGCGCC 60 10 AGCAGGGGCG AGGTGGTCAA TGCCACCTGG TCGGCAAGTT CGGCGACGGT TAGGCGGGCG 120 TTGTCCTGCA AGGCGGCGAG CAGGGCGCGG TCGGTGCGGT CGAGGCTTGA AGGCATGTTT 180
RO 117542 Β
TGCCCTCCTG GTCCGTTAAT TATTGTTTTT GTTCCAGCAA GCAGGCTTGA 820 GCGTGGGCAAA 240
TTTTGGAAAA AATCGGGCAG CTCGGTGGCA TAAGCTTATA ACAAACCACA AGAGGCTGTT 300
GCC ATG CGC GAC TCC CAT AAC AAC GGT TTT TCC ACA CGG GCC ATT 348825
Met Arg Asp Ser His Asn Thr Gly Phe Ser Thr Arg Ala lle 1 5 1015
CAC CAC GGC TAC GAC CCG CTT TCC CAC GGT GGT GCC TTG GTG CCA CCG 396
His His Gly Tyr Asp Pro Leu Ser His Gly Gly Ala Leu Val Pro Pro830
2530
GTG TAC CAG ACC GCG ACC TAT GCC TTC CCG ACT GTC GAA TAC GGC GCT 444
Val Tyr Gin Thr Ala Thr Tyr Ala Phe Pro Thr Val Glu Tyr Gly Ala
35 4045
GCG TGC TTC GCC GGG GAG GAG GCG GGG CAC TTC TAC AGC CGC ATC TCC 835
492
Ala Cys Phe Ala Gly Glu Glu Ala Gly His Phe Tyr Ser Arg lle Ser
5560
AAC CCC ACC CTG GCC TTG CTC GCG CAA CGC ATG GCC TCG TTG GAG GGT
540840
Asn Pro Thr Leu Ala Leu Leu Glu Gin Arg Met Ala Ser Leu Glu Gly
7075
GGT GAG GCG GGA TTG GCG CTG GCG TCG GGG ATG GGA GCC ATT ACT TCG
588
Gly Glu Ala Gly Leu Ala leu Ala Ser Gly Met Gly Ala lle Thr Ser845
85 9095
ACC CTC TGG ACC CTG CTG CGG CCT GGT GAT GAG CTG ATC GTG GGG CGC
636
Thr Leu Trp Thr leu Leu Arg Pro Gly Asp Glu Leu lle Val Gly Arg
100 105 110850
ACC TTG TAT GGC TGC ACC TTT GCG TTC CTG CAC CAT GGC ATT GGC GAG
684
Thr Leu Tyr Gly Cys Thr Phe Ala Phe Leu His His Gly lle Gly Glu
115 120125
TTC GGG GTC AAG ATC CAC CAT GTC GAC CTT AAC GAT GCC AAG GCC CTG 855 732
Phe Gly Val Lys lle His His Val Asp Leu Asn Asp Ala Lys Ala Leu
130 135140
AAA GCG GCG ATC AAC AGC AAA ACG CGG ATG ATC TAC TTC GAA ACA CCG
780860
Lys Ala Ala lle Asn Ser Lys Thr Arg Met lle Tyr Phe Glu Thr Pro
145 150155
GCC AAC CCC AAC ATG CAA CTG GTG GAT ATA GCG GCG GTC GTC GAG GCA
828
Ala Asn Pro Asn Met Gin Leu Val Asp lle Ala Ala Val Val Glu Ala865
160 165 170175
GTG CGG GGG AGT GAT GTG CTT GTG GTG GTC GAC AAC ACC TAC TGC ACG
876
RO 117542 Β
Val Arg Gly Ser Asp Val Leu Val Val Val Asp Asn Thr Tyr Cys Thr
T 870 65 180 185190 ' J CCC TAC CTG CAG CGG CCA CTG GAA CTG GGG GCA GAC CTG GTG GTG CAT
924
Pro Tyr Leu Gin Arg Pro Leu Glu Leu Gly Ala Asp Leu Val Val His . J 195 200205
875 70 TCG GCA ACC AAG TAC CTC AGT GGC CAT GGC GAC ATC ACT GCG GGC CTG
972
Ser Ala Thr Lys Tyr Leu Ser Gly His Gly Asp lle Thr Ala Gly Leu 210 215220
GTG GTG GGG CGC AAG GCT TTG GTC GAC CGC ATT CGG CTG GAA GGG CTG 8801020
Val Val Gly Arg Lys Ala Leu Val Asp Arg lle Arg Leu Glu Gly Leu 225 230235
AAA GAC ATG ACC GGG GCA GCC TTG TCA CCG CAT GAC GCT GCG TTG TTG 1068 , 885 Lys Asp Met Thr Gly Ala Ala Leu Ser Pro His Asp Ala Ala Leu Leu
J 240 245 250255
ATG CGC GGC ATC AAG ACC CTG GCG CTG CGC ATG GAC CGG CAT TGC GCC
T1116
Met Arg Gly lle Lys Thr Leu Ala Leu Arg Met Asp Arg His Cys Ala
890 260 265270
AAC GCC CTG GAG GTC GCG CAG TTC CTG GCC GGG CAG CCC CAG GTG GAG
1164
Asn Ala Leu Glu Val Ala Gin Phe Leu Ala Gly Gin Pro Gin Val Glu 275 280285
895 CTG ATC CAC TAC CCG GGC TTG CCG TCG TTT GCC CAG TAC GAA CTG GCA 1212
Leu lle His Tyr Pro Gly Leu Pro Ser Phe Ala Gin Tyr Glu Leu Ala 290 295300
CAG CGG CAG ATG CGT TTG CCG GGC GGG ATG ATT GCC TTT GAG CTC AAG 9001260
Gin Arg Gin Met Arg Leu Pro Gly Gly Met lle Ala Phe Glu Leu Lys 305 310315
GGC GGT ATC GAG GCC GGG CGC GGC TTC ATG AAT GCC CTG CAG CTT TTT 1308
905 Gly Gly lle Glu Ala Gly Arg Gly Phe Met Asn Ala Leu Gin Leu Phe
320 325 330335
GCC CGT GCG GTG AGC CTG GGG GAT GCC GAG TCG CTG GCA CAG CAC CCG 1356
Ala Arg Ala Val Ser Leu Gly Asp Ala Glu Ser Leu Ala Gin His Pro / 910 340 345350
GCG AGC ATG ACG CAC TCC AGT TAC ACG CCA CAA GAG CGG GCG CAT CAC
1404
Ala Ser Met Thr His Ser Ser Tyr Thr Pro Gin Glu Arg Ala His His
355 360365
915 GGG ATA TCA GAG GGG CTG GTG AGG TTG TCA GTG GGG CTG GAG GAT GTG 1452
RO 117542 Β
Gly lle Ser Glu Gly Leu Val Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Val 370 375 38025
GAG GAC CTG CTG GCA GAT ATC GAG TTG GOG TTG GAG GCG TGT GCA 1497920
Glu Asp Leu Leu Ala Asp lle Glu Leu Ala Leu Glu Ala Cys Ala 385 390395
TGAACTTGCC TTGCAGGATC GGGAACACTT GCCCAATGCC TCACGGGATC AGGCGATGGC 1557
925 ACTTTGGATG AGCTGGTGAA TTGGCCGGCT TATCCAAGAG GAGTTTAAAA
TGACCGTA 1615 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECV. ID NR.5 930 (i) CARACTERISTICI SECVENȚĂ:
(A) LUNGIME: 398 AMINOACIZI (B) TIP: AMINOACIZI 935 (C) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP DE MOLECULĂ: PROTEINĂ
940 (xi) DESCRIERE SECVENȚEI: SECV ID NR:5
Met Arg Asp Ser His Asn Asn Thr Gly Phe Ser Thr Arg Ala lle His
510
His Gly Tyr Asp Pro Leu Ser His Gly Gly Ala Leu Val Pro Pro Val
2025
Tyr Gin Thr Ala Thr Tyr Ala Phe Pro Thr Val Glu Tyr Gly Ala Ala
3540
Cys Phe Ala Gly Glu Glu Ala Gly His Phe Tyr Ser Arg lle Ser Asn
5560
Pro Thr Leu Ala Leu Leu Glu Gin Arg Met Ala Ser Leu Glu Gly Gly
7075
Glu Ala Gly Leu Ala Leu Ala Ser Gly Met Gly Ala lle Thr Ser Thr
8590
Leu Trp Thr Leu Leu Arg Pro Gly Asp Glu Leu lle Val Gly Arg Thr
100 105110
Leu Tyr Gly Cys Thr Phe Ala Phe Leu His His Gly lle Gly Glu Phe
115 120125
Gly Val Lys lle His His Val Asp Leu Asn Asp Ala Lys Ala Leu Lys
130 135140
Ala Ala lle Asn Ser Lys Thr Arg Met lle Tyr Phe Glu Thr Pro Ala
945
950
955
960
Asn Pro Asn Met Gin Leu Val Asp lle Ala Ala Val Val Glu Ala Val
165
170 175 965

Claims (13)

RO 117542 Β Arg Gly Ser Asp Val Leu Val Val Val Asp Asn Thr Tyr Cys Thr Pro
1. Metodă pentru privarea selectivă de metionină a celulelor de la un mamifer care
1000 sunt suspectate de a fi MTAză negative, caracterizată prin aceea că se determină dacă celulele sunt substanțial MTAză negative, utilizând mijloace pentru detectarea prezenței sau absenței MTAzei atât catalitic activă, cât și catalitic inactivă, într-o probă de celule cuprinzând:
a) obținerea unor probe analizabile de celule, care sunt suspecte de a fi MTAză 1005 negative,
b) adăugarea sondelor oligonucleotidice care vor hibridiza specific la un acid nucleic, care codifică pentru MTAză, în condiții care vor permite sondelor să hibridizeze detectabil la oricare astfel de acid nucleic prezent în probă, și
c) detectarea acidului nucleic, care este prezent în probă indicând astfel care dintre
1010 celule sunt MTAză negative, și se administrează o cantitate eficientă terapeutic de METază și MTA mamiferului cu celule ce sunt MTAză negative.
2. Metodă conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că proba este supusă, suplimentar, la condiții care vor favoriza amplificarea selectivă a oricărui acid, care codifică MTAză prezentă în probă.
RO 117542 Β
3. Metodă conform revendicării 1r caracterizată prin aceea că mijloacele pentru 1015 detectarea prezenței sau absenței MTAzei catalitic activă și catalitic inactivă cuprind un imunotest.
4. Metodă conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că METaza și MTA sunt administrate mamiferului, substanțial, în același timp.
5. Metodă conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că METaza și MTA sunt 1020 amestecate împreună în același purtător acceptabil farmaceutic.
5 180 185190
Tyr Leu Gin Arg Pro Leu Glu Leu Gly Ala Asp Leu Val Val His Ser
195 200205
970 10 Ala Thr Lys Tyr Leu Ser Gly His Gly Asp lle Thr Ala Gly Leu Val
210 215220
Val Gly Arg Lys Ala Leu Val Asp Arg lle Arg Leu Glu Gly Leu Lys
225 230 235 24015
Asp Met Thr Gly Ala Ala Leu Ser Pro His Asp Ala Ala Leu Leu Met
975 245 250255
Arg Gly lle Lys Thr Leu Ala Leu Arg Met Asp Arg His Cys Ala Asn '' 20 260 265270 ‘' Ala Leu Glu Val Ala Gin Phe Leu Ala Gly Gin Pro Gin Val Glu Leu
275 280285 i Ϊ 980 25 lle His Tyr Pro Gly Leu Pro Ser Phe Ala Gin Tyr Glu Leu Ala Gin d 290 295300 z Arg Gin Met Arg Leu Pro Gly Gly Met lle Ala Phe Glu Leu Lys Gly
305 310 315320
30 Gly lle Glu Ala Gly Arg Gly Phe Met Asn Ala Leu Gin Leu Phe Ala
985 325 330335
Arg Ala Val Ser Leu Gly Asp Ala Glu Ser Leu Ala Gin His Pro Ala 340 345350
35 Ser Met Thr His Ser Ser Tyr Thr Pro Gin Glu Arg Ala His His Gly
355 360365
990 40 lle Ser Glu Gly Leu Val Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Val Glu
370 375380
Asp Leu Leu Ala Asp lle Glu Leu Ala Leu Glu Ala Cys Ala 385 390395 45
995
Revendicări
6. Metodă conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că nivelul metioninei plasmatice a mamiferului se determină înainte și după administrarea la mamifer a METazei.
7. Metodă conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că METaza este o proί teină microbiană, recombinantă care va degrada specific metionina mamaliană in vivo. 1025
8. Metodă conform revendicării 7, caracterizată prin aceea că METaza are substan- * t țial aceeași secvență aminoacidă cu cea prezentată în SEQ ID NR.5.
9. Metodă conform revendicării 7, caracterizată prin aceea că METaza este exprimată de o polinucleotidă, care are substanțial aceeași secvență nucleotidică cu cea prezenS tată în SEQ ID NR.4. 1030
10. Metodă conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că METaza este cuplată la polietilen glicol.
11 .Metodă conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, cantitatea eficientă terapeutic a METazei este între 10 unități/m2 și 20.000 unități/m2, administrată cel puțin o dată într-o cantitate totală suficientă să reducă numărul celulelor MTAză negative detectate 1035 la mamifer.
12. Metodă conform revendicării 11, caracterizată prin aceea că, cantitatea eficientă terapeutic a METazei este acea cantitate care va reduce nivelurile metioninei plasmatice ale mamiferului, până la circa <10% din nivelul său anterior administrării METazei.
13. Metodă conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, cantitatea eficientă 1040 terapeutic de MTA este acea cantitate care va suficientă să mențină concentrația de MTA plasmatică la mamifer de circa 1-1 ΟμΜ.
Președintele comisiei de examinare: biochim. Crețu Adina
Examinator: biol. Țenea Gabriela
RO96-01324A 1993-12-29 1994-12-22 Metodă pentru privarea selectivă de metionină a celulelor maligne la mamifere RO117542B1 (ro)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/176,413 US5571510A (en) 1993-12-29 1993-12-29 Method for selective methionine starvation of malignant cells in mammals
PCT/US1994/014919 WO1995017908A1 (en) 1993-12-29 1994-12-22 Method for selective methionine starvation of malignant cells in mammals

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RO117542B1 true RO117542B1 (ro) 2002-04-30

Family

ID=22644262

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RO96-01324A RO117542B1 (ro) 1993-12-29 1994-12-22 Metodă pentru privarea selectivă de metionină a celulelor maligne la mamifere

Country Status (17)

Country Link
US (1) US5571510A (ro)
EP (1) EP0805690B1 (ro)
JP (1) JPH09507754A (ro)
CN (1) CN1143325A (ro)
AT (1) ATE221785T1 (ro)
AU (1) AU694161B2 (ro)
CA (1) CA2180262A1 (ro)
CZ (1) CZ291281B6 (ro)
DE (1) DE69431167T2 (ro)
HU (1) HU221341B1 (ro)
NO (1) NO962714L (ro)
NZ (1) NZ278271A (ro)
PL (1) PL182298B1 (ro)
RO (1) RO117542B1 (ro)
RU (1) RU2153885C2 (ro)
TJ (1) TJ294B (ro)
WO (1) WO1995017908A1 (ro)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5891704A (en) * 1992-11-19 1999-04-06 Anticancer, Inc. Method to produce high levels of methioninase
US6461851B1 (en) 1992-11-19 2002-10-08 Anticancer, Inc. High expression modules containing two or more tandem copies of a methioninase encoding sequence
US6911309B2 (en) * 1993-12-29 2005-06-28 The Regents Of The University Of Californnia Nucleic acids encoding MTAse
US6870037B1 (en) * 1995-07-03 2005-03-22 Arch Development Corporation Methylthioadenosine phosphorylase compositions and methods of use in the diagnosis and treatment of proliferative disorders
US5861154A (en) * 1995-10-30 1999-01-19 Shionogi & Co., Ltd. Recombinant L-methionine γ-lyase
AU2001280155A1 (en) * 2000-09-05 2002-03-22 Shionogi And Co., Ltd. L-methionine gamma-lyase with modified function
US20030129262A1 (en) * 2001-08-30 2003-07-10 Epner Daniel E. Methionine restriction for cancer therapy
US20040127435A1 (en) * 2002-08-02 2004-07-01 Regents Of The University Of California Uses for inhibitors of inosine monophosphate dehydrogenase
CA2516191A1 (en) * 2003-02-14 2004-09-02 Salmedix, Inc Compositions and methods for the detection and treatment of methylthioadenosine phosphorylase deficient cancers
US20110002978A1 (en) 2003-06-17 2011-01-06 Harrison Roger G Enzyme prodrug cancer therapy selectively targeted to tumor cells or tumor vasculature and methods of production and use thereof
WO2009032057A2 (en) 2007-08-29 2009-03-12 Adam Lubin Method for the selective therapy of disease
WO2009140007A2 (en) * 2008-04-14 2009-11-19 Ats Medical, Inc. Tool for implantation of replacement heart valve
US9987241B2 (en) 2014-09-25 2018-06-05 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Enzyme conjugate and prodrug cancer therapy
WO2020032951A1 (en) 2018-08-09 2020-02-13 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Antimalarial enzyme conjugates, kits containing same, and methods of producing and using same

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US5122614A (en) * 1989-04-19 1992-06-16 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides

Also Published As

Publication number Publication date
CA2180262A1 (en) 1995-07-06
EP0805690A4 (en) 1999-05-12
ATE221785T1 (de) 2002-08-15
HU9601695D0 (en) 1996-08-28
CN1143325A (zh) 1997-02-19
DE69431167D1 (de) 2002-09-12
PL182298B1 (pl) 2001-12-31
AU1445995A (en) 1995-07-17
DE69431167T2 (de) 2003-04-17
TJ294B (en) 2001-03-30
NO962714L (no) 1996-08-26
AU694161B2 (en) 1998-07-16
NO962714D0 (no) 1996-06-27
US5571510A (en) 1996-11-05
JPH09507754A (ja) 1997-08-12
EP0805690A1 (en) 1997-11-12
HUT75070A (en) 1997-04-28
WO1995017908A1 (en) 1995-07-06
CZ291281B6 (cs) 2003-01-15
HU221341B1 (en) 2002-09-28
EP0805690B1 (en) 2002-08-07
NZ278271A (en) 2001-07-27
CZ186996A3 (en) 1996-12-11
RU2153885C2 (ru) 2000-08-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6812403B2 (ja) 標的化剤としてのＧｌａドメイン
Rouzer et al. MK886, a potent and specific leukotriene biosynthesis inhibitor blocks and reverses the membrane association of 5-lipoxygenase in ionophore-challenged leukocytes.
KR101022577B1 (ko) 항원성이 감소한 중합체 콘쥬게이트, 이의 제조방법 및용도
RO117542B1 (ro) Metodă pentru privarea selectivă de metionină a celulelor maligne la mamifere
JP2573927B2 (ja) 物質の部位−特異的活性化方法及びその用途
Söderström et al. Leukotriene C synthase in mouse mastocytoma cells. An enzyme distinct from cytosolic and microsomal glutathione transferases
De Gunzburg et al. Identification of a protein associated with p21ras by chemical crosslinking.
EP0752872B1 (en) Nadh oxidase as a target in diagnosis and therapy
CA2116359A1 (en) Anti-hiv proteins gap 31, dap 30, and dap 32, dna coding therefor and therapeutic uses thereof
Akyüz et al. Effects of some antibiotics on human erythrocyte 6-phosphogluconate dehydrogenase: an in vitro and in vivo study
Iwaki-Egawa et al. CD26/dipeptidyl peptidase IV does not work as an adenosine deaminase-binding protein in rat cells
CA2244733A1 (en) Method for inhibiting adenylosuccinate synthetase activity in methylthioadenosine phosphorylase deficient cells
US10865403B2 (en) Engineered primate cystine/cysteine degrading enzymes for therapeutic uses
JP3475042B2 (ja) アンギオゲニンの抑制剤
US5256413A (en) Method and use for site-specific activation of substances
US20060153825A1 (en) Use of protein histidine phosphatase
Becker et al. Purification of pyruvate kinase isoenzymes type M1 and M2 from dog (Canis familiaris) and comparison of their properties with those from chicken and rat
US20210380962A1 (en) Engineered primate cystine/cysteine degrading enzymes for therapeutic uses
JPH11139984A (ja) 抗腫瘍剤、抗肥満剤、及び悪疫質の検出方法
JPH03173899A (ja) 生体由来のタンパク質
Cooney Enzymes as Therapeutic Agents David A. Cooney and Richard J. Rosenbluth Laboratory of Toxicology, National Cancer Institute, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland
WO1992016203A1 (en) Palytoxin-related prodrugs and a method for their administration