CZ20004536A3 - Nové poly(ADP-ribóza) polymerázové geny - Google Patents

Abstract

Řešení se týká homologů poly(ADP-ribóza)polymerázy (PARP), které sestávají z aminokyselinové sekvence, která má a) funkční NAD+ vazebnou doménu a b) neobsahuje sekvenci motivu zinkového prstu obecného vzorce CX2CXmHX2C, ve kterém m je celé číslo od 28 nebo 30 a X jsou zbytky, kterými > jsou, nezávisle jeden na druhém, jakékoli aminokyseliny; funkčních ekvivalentů homologů poly(ADPribózajpolymerázy (PARP); nukleových kyselin kódujících homology poly(ADP-ribóza)polymeázy (PARP); protilátek se specificitou pro nový protein; farmaceutických kompozice a kompozice genové terapie, které obsahují produkty podle předloženého řešení; způsobů pro analytické určování proteinů a nukleových kyselin podle předloženého řešení; způsobů pro identifikaci efektorů a vazebných partnerů proteinů podle předloženého řešení; nových PARP efektorů; a způsobů pro určení aktivity takových efektorů.

Description

Oblast techniky

Předložený vynález se týká nových póly(ADP-ribóza) polymerázových (PARP) genů a z nich odvozených proteinů; protilátek specifických k novým proteinům; kompozic farmaceutické a genové terapie, které obsahují produkty podle předloženého vynálezu; způsobů pro analytické určování proteinů a nukleových kyselin podle předloženého vynálezu; způsobů pro identifikaci efektorů a vazebných partnerů proteinů podle předloženého vynálezu; způsobů pro určení aktivity takových efektorů a jejich použití v diagnóze nebo terapii patologických stavů.

Dosavadní stav techniky

Je známo, že v roce 1966, Chambon a spolupracovníci objevili enzym velikosti 116kD, který byl v následujících letech detailně popsán a nyní se jmenuje PARP (EC 2,4.2,30) (póly(adenozin-5'-difosforibóza)polymeráza), PARS (póly(adenozin-5'-difosforibóza)syntáza) nebo ADPRT (adenozin-5'-difosforibóza transferáza). V rostlinné říší (Arabidopsis thaliana) 72kD (637 aminokyselin) byl PARP nalezen v roce 1995 (Lepiniec L. a kol., FEBS Lett 1995; 364(2): 103-8). Nebylo jasné, zda tato kratší forma PARP je individuálně specifická pro rostliny nebo je artefaktem (naroubovaná varianta nebo něco podobného). Enzym velikosti 116 kD PARP byl do současnosti jedinečný u zvířat a u člověka ve své aktivitě, která je níže popsaná. Je • · · · · ♦ · · • · · ··· «·· ···· · · · · · · • · ···· · · · ···· · · · • · · · · · · · · · · uváděn jako PARP1, čímž se předejde nejednoznačnosti.

Primární fyziologickou funkcí enzymu PARP 1 se zdá být jeho účast v kompexním reparačním mechanismu, který si buňky vytvořily pro opravu zlomů vlákna DNA. Primární buněčnou odpovědí na zlom vlákna DNA se kromě toho zdá být PARP1katalyzovaná syntéza póly(ADP-ribózy) z NAD⁺ (viz De Murcia, G. a kol. (1994) TIBS, 19, 172).

PARP 1 má modulární molekulární strukturu. Do současnosti byly identifikovány tři hlavní funkční prvky: N-terminální vazebná doména DNA velikosti 46 kD; centrální automodifikační doména velikosti 22 kD ke které se póly(ADP-ribóza) váže, s aktivitou PARP 1 enzymu klesající se zvyšující se elongací; C-terminální NAD⁺ vazebná doména velikosti 54 kD. Oblast leucinových zipů byla nalezena v automodifikační doméně, což poukazuje na možné proteinproteinové interakce, ale pouze u enzymu PARP z Drosofily. Všechny do současnosti známé PARP jsou pravděpodobně aktivní jako homodimery.

Vysoký stupeň organizace molekuly se odráží v silné konzervaci aminokyselinové sekvence. 62 % konzervace aminokyselinové sekvence byla nalezena pro PARP 1 pocházející z člověka, myši, skotu a kuřat. 0 PARP z Drosofily jsou větší strukturální rozdíly. Individuální domény mají samy jedna po druhé oblasti zvýšené konzervace. DNA vazebná oblast takto obsahuje dva tak zvané zinkové prsty jakožto subdomény (obsahující motivy typu CX2CX28/30HX2C) , které jsou zapojené do Zn²⁺ závislého rozpoznání zlomů jednovláknové DNA nebo přečnívajících ··· · · · ··

9 9 ··· · · ·

9 9 9 ···· ·· • 9······ 99999*9 9 konců jednovláknové DNA (tj. na koncích chromozomů, telomer). C-terminální katalytická doména obsahuje blok o délce asi 50 aminokyselin (zbytky v polohách 859 až 908), který je asi ve 100 % konzervován mezi obratlovci (PARP podpis). Tento blok váže přirozený substrát NAD⁺ a takto řídí syntézu póly(ADP-ribózy) (viz de Murcia, loc.cit.). GX3GKG motiv je zvláště charakteristický pro enzymy PARP v tomto bloku.

Res.	Comm.	in Molecular
, 3,	241) .	PARP aktivace
byla	také	pozorovaná	u
kol.	(1997)	1, Journal	of
723) .	V těchto případech	je

Výše popsaná prospěšná funkce je v kontrastu s patologickou funkcí, kterou je možné nalézt u řady nemocí (mrtvice, infarkt myokardu, sepse atd.). PARP je zapojena do buněčné smrti mozkové tkáně, která vznikne po ischemii (Choř, D.W., (1997) Nátuře Medicín, 3, 10, 1073), dále srdeční tkáně (Zingarelli, B. a kol. (1997), Cardiovaskular Research, 36, 205) a oka (Lam, T.T. (1997),

Pathology and Pharmacology, 95, 3, indukovaná mediátory zánětu byla septického šoku (Szabo, C. a

Clinical Investigation, 100, 3, 723). V těchto pi aktivace PARP spojená s rozsáhlou spotřebou NAD⁺. Jelikož pro biosyntézu jednoho molu NAD⁺ jsou spotřebované čtyři moly ATP, je tak buněčná dodávka energie drasticky snížena. Důsledkem je buněčná smrt.

Inhibitory PARP1 popsané ve výše uvedené odborné literatuře jsou nikotinamid a 3-aminobenzamid. 3,4-Dihydro-5-[4-(1piperidinyl)butoxy]-1(2H)-isochinolon byl popsán v Takahashi, K. a kol. (1997), Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism 17, 1137. Další inhibitory jsou popsané například v Banasik, M. a kol. (1992) J. Biol. Chem., 267,

ΦΦΦ φ · φ ·· · φ · φ · · · · · φ φ • ΦΦΦ φφφφ ·· · φ φφφφφφφ φφφφφφφ φ φ • ΦΦ ΦΦΦ ·ΦΦ

Φ· φ φφ φ φφ ···

3, 1569 a Griffin, R.J. a kol. (1995), Anti-Cancer Drug Design, 10, 507.

Vysokomolekulární vazební partneři popsaní pro lidskou PARP1 obsahují protein XRCC1 (X-ray repair crosscomplementing 1), který je zapojen do opravy odstraňující báze vystřižením (base excision repair) (BER), který váže cestou motivu zinkového prstu a BRCT (BRCA1 C-konec) modulu (aminokyseliny v poloze 372-524) (Masson, M. a kol., (1998) Molecular and Cellular Biology, 18,6, 3563).

Podstata vynálezu

Vzhledem k různým fyziologickým a patologickým funkcím PARP se předložený vynález se týká nových homologů PARP. Důvod pro získání homologních enzymů PARP by spočíval v důležitosti pro vývoj nových cílů pro působení léků a nových léků, za účelem zlepšení diagnózy a/nebo terapie patologických stavů ve kterých se účastní PARP, homology PARP nebo z nich odvozené látky.

Shledali jsme, že se předmětu vynálezu docílí získáním homologů PARP, s výhodou odvozených z člověka a jiných savců, které mají aminokyselinovou sekvenci, která

a) obsahuje funkční NAD⁺ vazebnou doménu, tj . PARP podpisovou sekvenci mající charakteristický GX3GKG motiv; a

b) v N-koncové oblasti sekvence, tj. v oblasti prvních 200, obzvláště například v oblasti prvních 100, N-koncových aminokyselin, nemá PARP sekvenci motivů zinkových prstů obecného vzorce

9

9 9 9

9 9 • · 9 · 9

CX₂CX_mHX₂C ve kterém m je celé číslo od 28 nebo 30 a X jsou zbytky, kterými jsou, nezávisle jeden na druhém, jakékoli aminokyseliny; a jejich funkční ekvivalenty.

Vzhledem k tomu, že molekuly PARP podle předloženého vynálezu, představují obzvláště funkční homology, vykazují také přirozeně póly(ADP-ribóza)-syntetizující aktivitu. Této aktivitě hlavně odpovídá NAD vazebná doména, která je umístěna na C-konci.

Hlavní charakteristikou enzymů PARP podle předloženého vynálezu, je takto přítomnost funkční NAD⁺ vazebné domény (PARP podpis), která je umístěná v C-terminální oblasti aminokyselinové sekvence (tj. přibližně v oblasti posledních 400, jako například posledních 350 nebo 300, Cterminálních aminokyselin) , v kombinaci s N-terminální sekvencí, která nemá motivy zinkových prstů. Vzhledem k tomu, že motivy zinkových prstů ve známých PARP enzymech pravděpodobně přispívají k rozpoznání DNA zlomů, mělo by se předpokládat, že proteiny podle předloženého vynálezu nejsou v interakci DNA nebo k tomu jinou cestou nepřispívají. Příslušnými biochemickými testy bylo prokázáno, že enzym PARP2 podle předloženého vynálezu může být aktivován 'aktivovanou DNA' (tj. DNA po parciálním natrávení enzymem DNázal). Z toho může být dále shrnuto, že PARP2 podle předloženého vynálezu má DNA vazebné vlastnosti. Nicméně mechanismus DNA vazby enzymu a enzymové ··· 4 4 4 ·· 4

4·· 444 · 4 4 4

4444 4444 44 4

4444444 4444444 4 4

444 444 444

4 4 44 4 44 444 aktivace se liší mezi enzymy PARP podle předloženého vynálezu a PARP1. Jeho vazba DNA a enzymová aktivace je, jak již bylo uvedeno, zprostředkovaná charakteristickým motivem zinkového prstu. Takové motivy nejsou přítomné v enzymech PARP podle předloženého vynálezu. Pravděpodobně jsou tyto vlastnosti zprostředkované kladně nabitými aminokyselinami v N-koncové oblasti enzymů PARP podle předloženého vynálezu. Vzhledem k tomu, že 'aktivovaná DNA' (tj. například DNA po parciálním natrávení enzymem DNázal) obsahuje velmi početné defekty (jednovláknové zlomy, jednovláknové mezery, jednovláknové překrývající se konce, dvouvláknové zlomy atd.), je možné, že přestože PARP1 a enzymy PARP podle předloženého vynálezu jsou aktivované nějakou z 'aktivaných DNA', tak je to jinou subpopulací defektů (například jednovláknovými mezerami namísto jednovláknových zlomů).

Funkční NAD⁺ vazebná doména (tj . katalytická doména) váže substrát pro syntézu póly-(ADP-ribózy). Ve shodě se známými enzymy PARP je zvláště přítomná sekvence motivu GX¹X²X³GKG, ve kterém G je glycin, K je lysin a X¹, X² a X³ jsou, nezávisle jeden na druhém, jakékoli aminokyseliny. Nicméně, jak bylo ukázáno, srovnáním aminokyselinových sekvencí NAD⁺ vazebných domén PARP molekul podle předloženého vynálezu, s před tím odhaleným lidským PARP1, se sekvence podle předloženého vynálezu překvapivě významně liší od známých sekvencí pro NAD⁺ vázající doménu.

Výhodná skupina PARP molekul podle předloženého vynálezu má s výhodou následující společný obecný sekvenční motiv v katalytické doméně:

·· · ·· · • · · «·· · · · · ···· · · · · ·· · • · ···· · · · ···· · · · · ··· · · · · · · ·· · ·· · ·· ···

PX_n(S/T) GX3GKGIYFA (SEQ ID NO:11), obzvláště (S/T) XGLR (I/V) XPX_n (S/T) GX3GKGIYFA (SEQ ID N0:12), s výhodou LLWHG(S/T)X7IL(S/T)XGLR(I/V) XPX_n (S/T) GX3GKGIYFAX3SKSAXY (SEQ ID NO:13) ve kterém (S/T) popisuje alternativní obsazení této sekvenční pozice S nebo T, (I/V) popisuje alternativní obsazení této sekvenční pozice I nebo V a n je celé číslo od 1 do 5 a X jsou zbytky, kterými jsou, nezávisle jeden na druhém, jakékoli aminokyseliny. Poslední motiv je také nazýván jako motiv PARP podpisu.

Automodifikační doména je s výhodou přítomna podobně jako v enzymech PARP podle předloženého vynálezu. Může být umístěna například v oblasti přibližně od polohy 100 do 200 aminokyseliny protisměrně vzhledem k N-terminálnímu konci NAD⁺ vazebné domény.

Homology PARP podle předloženého vynálezu mohou navíc obsahovat, protisměrně vzhledem k N-koncové NAD⁺ vazebné doméně (tj . od asi 30 do asi 80 aminokyselin blíže k Nkonci), sekvenci motivu leucinového zipu obecného vzorce (L/V)X₆LX₆LX₆L (SEQ ID NO: 14), ve kterém (L/V) představuje alternativní obsazení této sekvenční pozice L nebo V a X jsou zbytky, kterými jsou, nezávisle jeden na druhém, jakékoli aminokyseliny. Motivy leucinového zipu podle předloženého vynálezu se liší ve své pozici od motivů leucinového zipu popsaných u PARP z φ φ φ φφφφ · φ • φ · φ · φ φ

- 8 Drosofily. Leucinové zipy mohou vést k homodimerům (dvě PARP molekuly) nebo heterodimerům (jedna PARP molekula s molekulou vazebného partnera, který se od ní liší).

Homology PARP podle předloženého vynálezu s výhodou navíc obsahují, směrem k N-konci od výše uvedených sekvencí leucinovým zipům podobných motivů, t j. asi od 10 do 250 aminokyselinových zbytků blíže k N-konci, alespoň ještě jeden z následujících motivů částečné sekvence:

LX₉NX₂YX₂QLLX (D/E) XbWGRVG, (motiv 1; SEQ ID NO: 15)

AX3FXKX4KTXNXWX5FX3PXK, (motiv 2; SEQ ID NO: 16)

QXL (I/L) X₂IX9MX_1OPLGKLX3QIX6L, (motiv 3; SEQ ID NO: 17) FYTXIPHXFGX3PP, (motiv 4; SEQ ID NO:18) a

KX₃LX₂LXDIEXAX₂L (motiv 5; SEQ ID NO:19), ve kterém (D/E) popisuje alternativní obsazení této sekvenční polohy D nebo E, (I/L) popisuje alternativní obsazení této sekvenční polohy I nebo L, b je integrální hodnota nabývající hodnoty 10 nebo 11 a X jsou zbytky, kterými jsou, nezávisle jeden na druhém, jakékoli aminokyseliny. Nejvýhodněji jsou tyto motivy 1 až 5 všechny přítomné na stanovené sekvenci, s tím, že motiv 1 je nejblíže N-konci.

Výše uvedený PARP podpisový motiv je následován v proteinové sekvenci podle předloženého vynálezu alespoň ještě jedním z následujících motivů:

GX3LXEVALG (motiv 6; SEQ ID NO:20)

GX2SX₄GX₃PXaLXGX₂V (motiv 7; SEQ ID NO: 21) a ·

• · • · ·

9 9 9 9 9 · · · ·

9 9 9 9 · 9 · ·· 9

9 9··· 9 9 9 9999 9 9 9 9

999 999 999

9 99 9 99 999

- 9 E (Y/F) X2YX3QX4YLL (motiv 8; SEQ ID NO: 22) ve kterém (Y/F) popisuje alternativní obsazení této sekvenční polohy Y nebo F a je rovno hodnotám od 7 do 9 a X je v každém případě nějaká aminokyselina. Nejvýhodněji jsou tři C-terminální motivy všechny přítomné a na stanovené sekvenci je motiv 8 nejblíže konci.

Výhodná struktura PARP podle předloženého vynálezu je níže schematicky popsána:

Motivy 1 až 5/PARP podpis/motivy 6 až 8 nebo motivy 1 až 5/leucinový zip/PARP podpis/motivy 6 až 8 další z aminokyselinových zbytků, jako například až 40 aminokyselinových zbytků, mohu být uspořádány mezi individuálními motivy a další z aminokyselinových zbytků, jako například až 80 aminokyselinových zbytků 80, uspořádány na N-konci a/nebo na C konci.

Homology PARP podle předloženého vynálezu, které jsou obzvláště výhodné, jsou lidský protein PARP2, lidský protein PARP3, myší protein PARP3 a jejich funkční ekvivalenty. Protein označovaný jako lidský protein PARP2 obsahuje 570 aminokyselin (viz SEQ ID NO:2). Protein označovaný jako lidský protein PARP3 může existovat ve dvou formách. Typ 1 obsahuje 533 aminokyselin (SEQ ID NO:4) a typ 2 obsahuje 540 aminokyselin (SEQ ID NO:6). Formy mohou vznikat různou iniciací translace. Protein označovaný jako myší protein PARP3 existuje ve dvou formách, který, které se liší jedna od druhé delecí 5 aminokyselin (15 párů

φ φ · φφφφ φ φ φφφφφ φ φφ φ bází). Typ 1 obsahuje 533 aminokyselin (SEQ ID NO: 8) a typ 2 obsahuje 528 aminokyselin (SEQ ID NO:10). Homology PARP podle předložené přihlášky vynálezu se liší významně v jejich sekvenci vzhledem k PARP proteinu z Arabídopsis thaliana (viz výše). Například, PARP2 a PARP3 neobsahují pro rostliny specifickou PARP peptidovou sekvenci AAVLDQWIPD, odpovídající aminokyselinovým zbytkům v polohách 143 až 152 u proteinu z Arabídopsis.

Předložený vynález se dále týká vazebných partnerů homologů PARP podle předloženého vynálezu. Tyto vazebné partnery jsou s výhodou vybrány z

a) protilátek a fragmentů protilátek jako například Fv, Fab, F(ab')2,

b) proteinům podobných sloučenin, které interagují, například cestou výše uvedené oblasti leucinového zipu nebo jinou sekvenční sekcí, s PARP, a

c) nízkomolekulárních efektorů, které modulují biologickou funkci PARP jako například katalytickou aktivitu PARP, tj . NAD⁺ konzumující ADP ribozylaci nebo vazbu na aktivační protein nebo na DNA.

Předložený vynález se dále týká nukleových kyselin sestávajících z

a) nukleotidové sekvence kódující alespoň jeden PARP homolog podle předloženého vynálezu nebo její komplementární nukleotidovou sekvenci;

b) nukleotidové sekvence,, která hybridizuje se sekvencí, jak je upřesněno v bodě a), s výhodou s výhodou za stringentních podmínek; nebo • 0 ·

0 0 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 0 · • 0 0000 0 · · ···· * · ·

000 000 0· 00 0 00 · 0 0

c) nukleotidových sekvencí, které jsou odvozené z nukleotidových sekvencí definovaných v bodech a) a b) degenerací genetického kódu.

Nukleové kyseliny, které jsou vhodné podle předloženého vynálezu obsahují obzvláště alespoň jednu z parciálních sekvencí, které kódují výše uvedené motivy aminokyselinové sekvence.

Nukleové kyseliny, kterým je dávána přednost podle předloženého vynálezu, obsahují nukleotidovou sekvenci, jak je ukázáno v SEQ ID NO: 1 a 3 a obzvláště jejich částečné sekvence, které jsou charakteristické pro homology PARP podle předloženého vynálezu, jako například nukleotidové sekvence sestávající z

a)	nukleotidů	v	polohách	+3	do	+ 1715	ukázané	v
b)	SEQ ID NO:1; nukleotidů	v	polohách	+242	do	+1843	ukázané	v
c)	SEQ ID NO: 3; nukleotidů	v	polohách	+221	do	+ 1843	ukázané	v
d)	SEQ ID NO: 5; nukleotidů	v	polohách	+ 112	do	+ 1710	ukázané	v

SEQ ID NO:7; nebo

e) nukleotidů v polohách +1 do +1584 ukázané v SEQ ID NO:9 nebo částečné sekvence podle bodů a) , b) , c) , d) a e) , které kódují výše uvedené charakteristické motivy aminokyselinových sekvencí homologů PARP podle předloženého vynálezu.

• · 0 • · • 0 · · 0·

0000000 0

0 0 0 ·

• ·

0 0 0

Předložený vynález se dále týká kazet exprese, které obsahují alespoň jednu z výše popsaných nukleotidových sekvencí podle předloženého vynálezu, pod genetickou kontrolou regulačních nukleotidových sekvencí. Tyto mohou být použity pro přípravu rekombinantních vektorů podle předloženého vynálezu, jako například virových vektorů nebo plazmidů, které obsahují alespoň jednu kazetu exprese podle předloženého vynálezu.

Rekombinantní mikroorganismy podle předloženého vynálezu, jsou transformované alespoň jedním výše uvedeným vektorem.

Předložený vynález se také týká transgenních savců, u nichž byla provedena transfekce vektorem podle předloženého vynálezu.

Předložený vynález se dále týká způsobů in vitro detekce PARP inhibitorů, která může být provedena homogenně nebo heterogenně a která sestává z

a) inkubace poly-ADP-ribózilovatelného cíle na nosiči nebo bez nosiče s reakční směsí, která sestává z al) PARP homologů podle předloženého vynálezu;

a2) PARP aktivátoru; a a3) PARP inhibitoru nebo analytu, ve kterém se předpokládá přítomnost alespoň jednoho PARP inhibitoru;

b) provedení polyADP ribozylační reakce; a

c) kvalitativního nebo kvantitativního určení polyADP ribozylace cíle.

·· · • · «

4 4 · • ·»·« · · • · ·

Způsob detekce se s výhodou provádí preinkubací PARP homologu s PARP aktivátorem a PARP inhibitorem nebo analytem, ve kterém se předpokládá přítomnost alespoň jednoho PARP inhibitoru, například po dobu 1 až 30 minut, před·provedením poly-ADP ribozylační reakce.

Po aktivaci prostřednictvím DNA s jednovláknovými zlomy (označované jako aktivovaná DNA podle předloženého vynálezu), PARP poly-ADP ribozyluje velký počet jaderných proteinů v přítomnosti NAD. Tyto proteiny obsahují, na jednu stranu PARP jako takovou, ale také histony atd.

Poly-ADP-ribozylovatelný cíl, který je s výhodou používán v způsobu detekce je protein histonu v jeho přirozené formě nebo z něho odvozený ekvivalent, který je možné poly-ADPribozylovat. Histonový preparát, dodávaný firmou Sigma (SIGMA, katalogové číslo. H-7755; histon typu II-AS z ovčího brzlíku, Luck, J. M. a kol., J. Biol. Chem., 233, 1407 (1958), Satake K. a kol., J. Biol. Chem, 235, 2801 (1960)), byl použit jako příklad. V principu je možné použít všechny typy proteinů nebo jejich části, u kterých je možné provést poly-ADP-ribozylaci za pomoci PARP. Tyto jsou s výhodou jaderné proteiny, tj . histony, DNA polymeráza, telomeráza nebo samotná PARP. Syntetické peptidy odvozené z odpovídajících proteinů mohou také účinkovat jako cíl.

Pro ELISA detekci podle předloženého vynálezu možné použít množství histonů v rozmezí od okolo 0,1 pg/jamku do množství okolo 100 pg/jamku, s výhodou množství okolo 1 pg/jamku do okolo 10 pg/jamku. Množství PARP enzymu jsou v

9 n · • « · • 9 · · • · 9999 • · 9 • 9 ·

9 9 »99 ♦ 9 99*9· *99 99 9

9 9 * 9 99 • 9 9

9 9 ·

9 9

99 9 rozmezí od okolo 0,2 pmol/jamku do množství okolo 2 nmol/jamku, s výhodou od okolo 2 pmol/jamku do okolo 200 pmol/jamku, reakční směs sestává v každém případě z množství 100 pg/jamku. Snížení na menší jamky a reakční objemy, které jsou odpovídacím způsobem menší, je možné.

Při HTRF detekci podle předloženého vynálezu jsou použita stejná množství PARP a množství histonu nebo modifikovaných histonů je v rozmezí od okolo 2 ng/jamku do okolo 25 pg/jamku, s výhodou od okolo 25 ng/jamku do okolo 2,5 pg/jamku, reakční směs sestává v každém případě z množství 50 pl/jamku. Snížení na menší jamky a reakční objemy, které jsou odpovídacím způsobem menší, je možné.

Používaný PARP aktivátor podle předloženého vynálezu je s výhodou aktivovaná DNA.

Různé typy poškozené DNA mohou fungovat jako aktivátor. DNA poškození může být vytvořeno natrávením DNázami nebo jinými DNA-modifikujícími enzymy (tj . restrikčními endonukleázami), iradiací nebo jinými fyzikálními způsoby nebo chemickým působením na DNA. Dále je možné simulovat situaci DNA poškození cíleným způsobem za použití syntetických oligonukleotidů. V pokusech uvedených jako příklad byla použita aktivovaná DNA z ovčího brzlíku (Sigma, produkt Číslo D4522; CAS: 91080-16-9, získaná způsobem, který popsali Aposhian a Kornberg za použití DNA z ovčího brzlíku (SIGMA D-1501) a deoxyribonukleázy typu I (D-4263). Aposhian Η. V. a Kornberg A., J. Biol. Chem., 237, 519 (1962)). Aktivovaná DNA byla použita v oblasti koncentrací jdoucích od 0,1 do 1000 pg/ml, s výhodou • 0

0 0 · · · • · · 0 0 0 · • 0 0 0 · 0 0 0 · • 0000000 0000000

4 94 0 ·0 0 jdoucích od 1 do 100 pg/ml, na reakční krok.

PolyADE? ribozylační reakce v způsobu podle předloženého vynálezu, začne přidáním NAD⁺. Koncentrace NAD byly v oblasti množství od okolo 0,1 μΜ do okolo 10 mM, s výhodou v oblasti množství od okolo 10 μΜ do okolo 1 mM.

PolyADP ribozylace cíle na nosiči je určena ve variantě výše uvedeného způsobu, která může být provedena heterogenně, za použití anti-poly(ADP-ribóza) protilátek. Aby toto bylo provedeno, je reakční směs oddělena od cíle na nosiči, protilátka alternativa promývana a může sama pro určení inkubována s protilátkou. Tato být označená. Nicméně, jako navázané anti-poly(ADP-ribóza) protilátky, může být použita sekundární označená protilátka nebo odpovídající označený fragment protilátky. Vhodná značení jsou například radioznačení, chromoforové značení nebo fluoroforové značení, navázání biotinu, chemiluminescenční značení, značení za pomoci paramagnetického materiálu nebo s výhodou enzymové značení, tj. křenovou peroxydázou. Odpovídající techniky detekce jsou známy odborníkům v oboru.

Ve variantě výše uvedeného procesu, který může být proveden homogenně je cíl, který není na nosiči, označen akceptorem fluoroforu. Cíl, který je s výhodou použit v tomto případě je histon, na který je navázán biotin, akceptor fluoroforu je navázán prostřednictvím avidinu nebo streptavidinu na biotinové skupiny histonu. Obzvláště vhodnými akceptory fluoroforu jsou fykobiliproteiny (tj. fykokyaniny, fykoerytriny) , například R-fykokyanin (R-PC), alofyko- 16 • · · · · 4 ·· <·· · 4 4 444 • 444 4444 44 • 4 444· 44 4 ···· 4 4 <

··· 44 · · · •4 · ·· 4 44 4 kyanin (APC), R-fykoerytrin (R-PE), C-fykokyanin (C-PC), Bfykoerythrin (B-PE) nebo jejich kombinace s nějakým dalším z nich nebo s fluorescenčními barvivý jako jsou Cy5, Cy7 nebo Texasská červeň (Texas Red) (Tandem systém) (Thammapalerd, N. a kol., Southeast Asian Journal of Tropícal Medicíně & Public Health, 27(2): 297-303 (1996); Kronick, Μ. N. a kol., Clinical Chemistry, 29(9), 1582-1586 (1986); Hicks, J. Μ. , Human Pathology, 15(2), 112-116 (1984)). Barvivo XL665 použité v příkladech je navázáno na alofykokyanin (Glazer, A. N., Rev. Mikrobiol., 36, 173-198 (1982); Kronick, Μ. N., J. Imm. Met., 92, 1-13 (1986); MacColl, R. a kol·., FycobiliProteins, CRC Press, lne., Boča Raton, Florida (1987); MacColl, R. a kol., Arch. Biochem. Biophys., 208(1), 42-48 (1981)).

V homogenním způsobu je navíc dávána přednost určení polyADP ribozylace cíle, který není na nosiči, za použití anti-poly(ADP-ribóza) protilátek, které jsou označené donorem fluoroforu, který je schopný přenosu energie na akceptor fluoroforu, když jsou si donor a akceptor blízko v prostoru díky vazbě označené protilátky na polyADPribozylovaný histon. Europium kryptát je s výhodou použit jako donor fluoroforu pro anti-poly(ADP-ribóza) protilátku.

Kromě použitého europium kryptátu je také možné použít jiné sloučeniny jako potenciálních donorů molekul. Toto může ale vyžadovat modifikaci kryptátové mřížky. Je také možné si představit nahrazení europia jiným lantanidem jako je terbium. Je nutné, aby fluorescence trvala dlouho pro dosažení časového zpoždění (Lopez, E. a kol.,

39/2, 196-201 (1993); US Patent 5,534,622).

Clin. Chem.

• · • · » ♦ · · · · · • · · · ···· ·· • ······· ······· · » · · ··· · · •· · v· · ·· ·

Výše popsané způsoby detekce jsou založené na principu, spočívajícím na existující korelaci mezi PARP aktivitou a množstvím ADP-ribózových polymerů vytvořených na histonech. Zde popsaný pokus umožňuje kvantifikovat ADP-ribózové polymery za použití specifických protilátek při detekci pomocí ELISA a HTRF (homogenous time-resolved fluorescence). Specifické provedení testů s detekcí ELISA a HTRF je popsané podrobněji v následujících příkladech.

Vyvolaný detekční systém HTRF (homogeneous time-resolved fluorescence) měří tvorbu póly(ADP-ribóz) na histonech za použití specifických protilátek. Na rozdíl od detekce pomocí ELISA je tato detekce provedena v homogenní fázi bez kroků separace a mytí. Tím se dojde k vyšší výkonnosti a menší možnosti vzniku chyb. HTRF je založeno na přenosu fluorescenční rezonanční energie (fluorescence resonance energy transfer) (FRET) mezi dvěma fluorofory. Ve FRET detekci může přenášet excitovaný donor fluoroforu svoji energii na akceptor fluoroforu, když jsou si jsou oba blízko jeden druhému v prostoru. V HTRF technologii je donor fluoroforu europium kryptát [(Eu)K] a akceptor je XL665, stabilizovaný alofykokyaninem. Použití europium kryptátu je založeno na studii Jean Marie Lehn (Strasbourg) (Lopez, E. a kol., Clin. Chem. 39/2, 196-201 (1993); US Patent 5,534,622) .

V homogenní detekci jsou všechny komponenty také přítomny během měření. Zatímco toto představuje výhody pro provedení detekce (rychlost, komplexita), je nutné předem zamezit interferenci komponent detekce (inherentní fluorescence, • · φ φφφφ φ ·

- 18 φ φ φ

ΦΦΦ · •φφφφ φ · zhášeni barvivý atd.). HTRF předem zamezí takové interferenci měřením s časovou prodlevou při dvou vlnových délkách (665 nm, 620 nm) . HTRF se vyznačuje velmi dlouhým poločasem a měření s časovou prodlevou je proto možné. Není zde žádná interference pocházející z fluorescence pozadí s krátkou životností (tj. z detekčních komponent nebo inhibitorů knihovny látek). Navíc je měření vždy provedeno při dvou vlnových délkách za účelem kompenzace zhášecích efektů barevných látek. HTRF detekce může být provedena například v 96 nebo 384 jamkovém formátu mikrotitrační destičky a je vyhodnocena za použití detekčního analyzátoru HTRF mikrodestičky (Canberra Packard).

Vynález se také týká následujících in vitro prováděných screeningových způsobů na vazebné partnery PARP, obzvláště na PARP homolog podle předloženého vynálezu.

První varianta je provedena al) imobilizací alespoň jednoho PARP homologů na nosič; bl) uvedením v kontakt imobilizovaného PARP homologů s analytem, ve kterém se předpokládá přítomnost alespoň jednoho vazebného partnera; a cl) určení, tam, kde je to vhodné po inkubační periodě, složek analytu navázaných k imobilizovanému PARP homologů.

Druhá varianta je provedena a2) imobilizací analytu na nosič, který sestává z alespoň jednoho možného vazebného partnera pro PARP homolog; b2) uvedením v kontakt imobilizovaného analytu s alespoň jedním PARP homologem pro který je nalezen vazebný partner; a • · · · · · • · · * · · fl· ······· fl c3) prohlédnutí imobilizovaného analytu, tam, kde je to vhodné po inkubační periodě, za účelem zjištění vazby PARP homologů.

Předložený vynález se také týká způsobů pro kvalitativní nebo kvantitativní určení nukleové kyseliny kódující PARP homolog, která sestává z

a) inkubace biologického vzorku s definovaným množstvím exogenní nukleové kyseliny podle předloženého vynálezu (například o délce okolo 20 do 500 baží nebo delší) , hybridizace, s výhodou za stringentních podmínek, určení hybridizace nukleových kyselin a tam, kde je to vhodné, porovnání se standartem; nebo

b) inkubace biologického vzorku s párů oligonukleotidových primerů nukleovou kyselinu kódující PARP nukleové kyseliny, určení amplifikačního produktu a kde je to vhodné, porovnání se standartem.

definovaným množstvím se specificitou pro homolog, amplifikace tam,

Předložený vynález se dále týká způsobu pro kvalitativní nebo kvantitativní určení PARP homologů podle předloženého vynálezu, která sestává z

a) inkubace biologického vzorku s alespoň jedním vazebným partnerem specifickým pro PARP homolog,

b) detekce komplexu vazebného partneru/PARP a tam, kde je to vhodné,

c) srovnání výsledku se standartem.

Vazebný partner je v tomto případě s výhodou anti-PARP * ····· · · • 9 · 9 ·· 9

protilátka nebo jeho vazebný fragment, na který je navázaná detekovatelná značka, tam, kde je to vhodné.

Způsoby podle předloženého vynálezu pro určení PARP, obzvláště homologů PARP a sekvencí nukleových kyselin kódujících PARP, jsou vhodné a výhodné pro diagnózu poškození tkáně spojených se sepsí nebo s ischémií, jako jsou obzvláště mrtvice, srdeční infarkty, diabetes nebo septický šok.

Předložený vynález se dále týká způsobu určení účinnosti PARP efektorů, která sestává z

a) inkubace PARP homologů podle předloženého vynálezu s analytem, který obsahuje efektor fyziologické nebo patologické PARP aktivity; opětovného odstranění efektorů, tam, kde je to vhodné; a

b) určení aktivity PARP homologů, je-li to vhodné, tak po přidání substrátů a kosubstrátů.

Předložený vynález se dále týká kompozic genové terapie, které obsahují ve vehikulu přijatelném pro genovou terapii konstrukt nukleové kyseliny, který

a) obsahuje nukleovou kyselinu opačné polarity vzhledem ke kódující nukleové kyselině podle předloženého vynálezu; nebo

b) ribozym proti nekódující nukleové kyselině podle předloženého vynálezu; nebo

c) kuje specifický PARP inhibitor.

Předložený vynález se dále týká farmaceutické kompozice • · • · ···· · • · · • · · · · · obsahující, ve farmaceuticky přijatelném vehikulu, alespoň jeden PARP protein podle předloženého vynálezu, alespoň jeden PARP vazebný partner podle předloženého vynálezu nebo alespoň jednu kódující nukleotidovou sekvenci podle předloženého vynálezu.

Konečně se předložený vynález týká použití vazebných partnerů PARP homologů pro diagnózu nebo terapii patologických stavů, při jejichž vývoji a/nebo postupu se účastní alespoň jeden PARP protein, s výhodou PARP homolog podle předloženého vynálezu nebo z něho odvozený polypeptid. Používaným vazebným partnerem může být například nízkomolekulární vazebný partner jehož molekulární hmotnost může být například menší než asi 2000 daltonů nebo menší než asi 1000 daltonů.

Předložený vynález se navíc týká použití PARP vazebných partnerů pro diagnózu nebo terapii patologických stavů, které mají původ v nedostatku energie. Nedostatek energie je pro účel předložené přihlášky vynálezu obzvláště deficit buněčné energie, který může být pozorován u pacienta nemocného systémově nebo v dané oblasti lidského těla, v orgánech nebo v oblastech orgánů nebo v tkáních nebo v oblastech tkání. Nedostatek energie je charakterizován NAD a/nebo ATP deplecí jdoucí za (nad nebo pod) fyziologické rozmezí rozptylu množství NAD a/nebo ATP a mediovanou proteinem s PARP aktivitou, obzvláště PARP homologem podle předloženého vynálezu nebo z něho odvozeným polyptidem.

Termín nemoci mediované nedostatkem energie sestává pro účel předložené přihlášky vynálezu navíc z nemocí, ve • · · •··· · · ·· 9 99

9 9 · ·

9 9 9 9 9

9 9999 9 9 9

9 9 9 9

9 99

9

9 kterých je poškození tkáně možné spojit s buněčnou smrtí, která má původ v nekróze nebo apoptóze. Způsoby podle předloženého vynálezu jsou vhodné pro léčbu a prevenci poškození tkáně, které vznikne z buněčného poškození, které má původ v nekróze nebo apoptóze; poškození nervové tkáně, které má původ v ischemii a/nebo reperfuzí; neurologické nemoci; neurodegenerativní nemoci; cévní mrtvici; pro léčbu a prevenci kardiovaskulárních nemocí; pro léčbu jiných nemocí nebo případy jako například s věkem spojená svalová degenerace, AIDS nebo jiné imunodeficity; artritida; ateroskleróza; kachexie; rakovina; degenerativní nemoci kosterních svalů; diabetes; lebeční trauma; zánětlivé onemocnění gastrointestinálního traktu jako například Crohnova choroba; svalová dystrofie; osteoartritída; osteoporóza; chronická a/nebo akutní bolest; selhání ledvin; ischemie sítnice; septický šok (jako například endotoxický šok); stárnutí kůže nebo povšechné stárnutí; obecné manifestace stárnutí. Způsoby podle předloženého vynálezu mohou být navíc použity pro prodloužení života a proliferativní kapacity buněk těla a pro senzitizaci nádorových buněk ve spojení s radiační terapií.

Předložený vynález se obzvláště týká použití vazebného partneru PARP tak, jak je výše definováno pro diagnózu nebo terapii (akutní nebo profylaktickou) patologických stavů, které mají původ v nedostatku energie a jsou vybrány z neurodegenerativních nemocí nebo poškození tkáně, které vzniklo sepsí nebo ischemii, obzvláště neurotoxických poruch, mrtvicí, srečních infarktů, poškození, které vzniklo během nebo po lýze infarktu (například s TPA, Reteplase nebo mechanicky laserem nebo Rotablatorem) a

- 23 9« · mikroinfarktů, které vznikly během a po výměně srdeční chlopně, aneuryzmatických transplantátů, traumat hlavy (akutní selhání ledvin, akutní renální nedostatečnost nebo poškození během a po transplantaci ledvin), poškození kosterního svalstva, infarktů jater (jaterní selhání, poškození během nebo po transplantaci jater), periferních neuropatií, s AIDS spojené demence, septických šoků, diabetů, neurodegenerativních nemocí, které nastanou po ischémii, traumtech (kraniocerebrální trauma), masivních krvácení, subarachnoidálních krvácení a mrtvici, jakož i resekcí a srdečních a míchy, infarktů ledvin neurodegenerativních nemocí multi-infarktová demence, jako je Alzheimerova nemoc, Huntingtonova choroba,

Parkinsonova nemoc, amyotrofická laterální skleróza, epilepsie, hlavně z celkových epileptických záchvatů jako jsou petit mal a tonoklonické záchvaty a parciálních epileptických záchvatů, jako jsou záchvaty temporálního laloku a komplexních parciálních záchvatů, selhání ledvin, také v chemoterapii nádorů a prevenci metastáz a pro léčbu zánětů a reumatických nemocí, například rheumatoidní artritidy; dále pro léčbu revaskularizace kriticky zúžených koronárních tepen a kriticky zúžených periferních tepen, například tepen dolních končetin.

Termínem ischemie se pro účely předložené přihlášky vynálezu myslí lokalizovaná nedostatečná dodávka kyslíku tkáni, která vznikla zábranou v toku tepenné krve. Celková ischemie vzniká, když je tok krve k celému mozku přerušen po omezenou dobu. Celková ischemie může být způsobena například srdeční zástavou. Fokální ischemie vzniká, když je část mozku odříznuta od svého normálního krevního ·· · • Φ φ

φ φ φφφφ φ φ φ φ φ φ

φ

• φ φφφ zásobení. Fokální ischemie může být způsobena tromboembolickým uzávěrem cévy, mozkovým traumatem, edémy nebo nádory mozku. I přechodná ischemie má široký rozsah neuronálního poškození. Přestože poškození nervové tkáně může vzniknout až za dny nebo týdny po začátku ischemie, jisté permanentní poškození (například buněčná smrt nekrózou) vzniká v prvních několika minutách po zastavení krevního zásobení. Tato poškození je způsobeno například neurotoxicitou glutamátu a následující druhotnou reperfuzí, jako například tvorbou volných radikálů (například volných radikálů kyslíku, volných radikálů NO) . Ischemie mohou podobně vzniknout v jiných orgánech a tkáních jako například v srdci (srdeční infarkt a jiná kardiovaskulární onemocnění, která vznikla okluzí koronárních tepen) nebo v oku (ischemie sítnice).

Předložený vynález se navíc týká použití účinného terapeutického množství PARP vazebného partnera pro ovlivnění neuronální aktivity. Neuronální aktivita je pro účely předložené přihlášky vynálezu může sestávat ze stimulace poškozených neuronů, promoce neuronální regenerace nebo léčby neuronálních nemocí.

Termín neuronální poškození pro účely předložené přihlášky vynálezu má význam každého typu poškození nervové tkáně a každého fyzikálního nebo mentálního poškození nebo smrti, které vzniknou z tohoto poškození. Příčina poškození může být například ve svém charakteru příčina metabolická, příčina toxická, příčina chemická nebo příčina tepelná a u příkladů je tvořena ischemiemií, hypoxiemií, traumaty, cerebrovaskulárním poškozením,

9 • ·

9999 iradiací, infekcemi, metabolizmem způsobeny.

• ·

9 99

9 9 9 9 9 • · 9 · 9 9 •9 9999999 9 • 9 9 9 9 9 operacemi, tlakem, neurodegenerativními percepčními nemocemi, krvácením, nemocemi, poškozeným vazospazmy, epilepsií, glutamátu a druhotnými efekty, které jsou jimi

Termín nervová tkáň pro účely předložené přihlášky vynálezu má význam různých komponent tvořících nervový systém, skládajících se mimo jiné z neuronů, buněk glie, astrocytů, Schwannových buněk, cévního systému, který je uvnitř a který zásobuje centrální nervový systém, mozek, mozkový kmen, míchu, periferní nervový systém atd.

Termín neuroprotektivní pro účely předložené přihlášky vynálezu má význam redukce, zastavení, zpomalení nebo zlepšení neuronálního poškození a ochrany, obnovy a regenerace nervové tkáně, která byla exponovaná neuronálnímu poškození.

Termín prevence neurodegenerativních nemocí má význam možnosti prevence, zpomalení a zlepšení neurodegenerativní nemocí u lidí, u kterých taková nemoc byla diagnostikovaná nebo kteří spadají do rizikové skupiny těchto neurodegenerativních nemocí. Léčby u lidí, kteří již trpí symptomy těchto nemocí je obdobně brána na zřetel.

Termín léčba pro účely předložené přihlášky vynálezu má význam (i) prevence nemoci, poruchy nebo stavu u lidí s predispozicí k uvedenému;

(ii) prevence nemoci, poruchy nebo stavu zpomalením postupu

9

· • 9 ♦ 9 9 nemoci, poruchy nebo stavu; a (iii) zlepšení nemoci, poruchy nebo stavu.

Příklady neurologických nemocí, které mohou být léčeny způsoby podle předloženého vynálezu jsou neuralgie (trigeminální, glosofaryngeální), myastenia gravis, svalové dystrofie, amyorofická laterální skleróza (ALS), progresivní svalová atrofie, periferní neuropatie, které vznikly otravou (například otravou olovem), GuillainBarrého syndrom, Huntingtonova choroba, Alzheimerova nemoc, Parkinsonova nemoc nebo nemoci plexu. Způsoby podle předloženého vynálezu jsou s výhodou vhodné pro léčbu neurologických nemocí vybráných z periferních neuropatií, které vznikly fyzikálním poraněním nebo chorobou; lebečních traumat jako například traumatického poranění mozeku; fyzikálního poškození míchy; mrtvice spojené s poškozením mozku, jako jsou cévní mrtvice spojené s hypoxií a poškozením mozku a mozkovým reperfuzním poškozením; demyelinizačních onemocnění (myelopatie, Alzheimerova nemoc, Parkinsonova nemoc, Huntingtonova choroba, amyotrofická lateralní skleróza).

Způsoby podle předloženého vynálezu mohou být navíc použity pro léčbu kardiovaskulárních nemocí. Termín kardiovaskulární nemoc je pro účely předložené přihlášky vynálezu použit u nemocí, které působí ischememii nebo které jsou způsobeny ischémií nebo ischémií/reperfuzí srdce. Příklady jsou nemoci koronárních cév (například ateroskleróza), angína pectoris, srdeční infarkt, kardiovaskulární poškození, které je způsobeno srdeční

0

0 00 0 0 0 0 0 0 ···· 0000 0 0 • 0 0000 0 0 0 0000 0 0 0 •00 000 0* zástavou nebo operací přemostění koronární tepny (bypassu).

Způsoby podle předloženého vynálezu mohou být použity pro léčbu rakoviny nebo pro senzitizaci rakovinných buněk na radiační terapii. Termín rakovina by měl být vykládán ve svém nej širším rozsahu. Modulátory proteinů podle předloženého vynálezu mohou být použity jako protirakovinné terapeutické činidlo. Způsoby mohou být použity například pro léčbu typů rakoviny nebo nádorových buněk, jako jsou ACTH-produkující nádory, akutní lymfatické nebo lymfoblastické leukemie; akutní nebo chronická lymfocytární leukemie; akutní nelymfocytární leukemie; rakovina močového měchýře; nádory mozku; rakovina prsu; karcinom cervixu; chronická myelocytární leukemie; rakovina tlustého střeva; lymfom T dependentní zóny; endometrióza; rakovina jícnu; rakovina žlučníku; Ewingův sarkom; rakovina hlavy a krku; rakovina jazyka; Hodgkinův lymfom; Kaposiho sarkom; rakovina ledvin; rakovina jater; rakovina plic; mezoteliom; mnohočetný myelom; neuroblastom; ne-Hodgkinský lymfom; Hodgkinský lymfom; osteosarkom; karcinom ovárií; glioblastom; karcinom mléčné žlázy; karcinom cervixu; rakovina prostaty; rakovina; rakovina penisu, rakovina slinivky břišní; retinoblastom; rakovina kůže; rakovina žaluku; rakovina štítné žlázy; karcinom dělohy; karcinom pochvy; Wilmsův nádor; nebo trofoblastom.

Termíny radiosenzitizátor nebo radiační senzitizátor se pro účely předložené přihlášky vynálezu vztahují k molekulám, které zvyšují senzitivitu buněk v těle na záření elektromagnetickou radiací (například rentgenový paprsky) nebo urychlují tuto radiační léčbu. Radiační senzitizátory • · • · · • »··*

- 28 ·* · ·· • · · · « · • · · · β » • · ····*·· · • · · · · ♦· · ·· · zvyšují senzitivitu rakovinných buněk k toxickým efektům elektromagnetické radiace. Ty, které jsou uvedené v literatuře sestávají z mitomycinu C, 5-bromo-deoxyuridinu a metronidazolu. Je možné použít záření vlnových délek v oblasti od 1O”²⁰ do 10 metrů, s výhodou gama paprsků (1O~²⁰ do 10“¹³ m) , rtg-paprsků (10^-11 do 10’⁹ m) , ultrafialového záření (10 nm do 400 nm), viditelného světla (400 nm do 700 nm) , infračerveného záření (7 00 nm do 1 mm) a mikrovlného záření (1 mm do 30 cm).

Nemoci, které mohou být léčeny takovou terapií, jsou obzvláště neoplastické choroby, benigní nebo maligní nádory a rakovina. Léčba jiných nemocí za použití elektromagnetického záření je také možná.

Předložený vynález bude nyní popsán detailně s odvoláním na přiložené obrázky, které znázorňují:

Obr. 1 sekvence lidského PARP (lidský PARP1) a dvou enzymů PARP, kterým je dáván přednost podle předloženého vynálezu (lidský PARP2, lidský PARP3, myší PARP3). Shody sekvencí mezi lidským PARP1 a lidským PARP2, lidským PARP3 nebo myším PARP3 jsou vyznačeny v rámečcích. Majoritní sekvence je vyznačena nad jednotlivými sekvencemi. Motivy zinkových prstů lidského PARP1 jsou umístěny v oblastech sekvencí odpovídajících aminokyselinovým zbytkům v polohách 21 až 56 a polohách 125 až 162;

Obr. 2 Northern bloty provedené s různými lidskými tkáněmi, aby ilustrovaly tkáňové rozložení PARP2 a PARP3 molekul podle předloženého vynálezu. Pruh 1: mozek; pruh 2: srdce;

·* 4 49 4 94 • * S 9 4 4 4 4 4

9 4 9 9 4 4 4 4 4

4 9 444 9 9 4 4444 9 4 4

9 4 ··* · » ·· · ·» · ·· ·

- 29 pruh 3: kosterní sval; pruh 4: tlusté střevo; pruh 5: brzlík; pruh 6: slezina; pruh 7: ledviny; pruh 8: játra; pruh 9: tenké střevo; pruh 10: placenta; pruh 11: plíce; pruh 12: leukocyty pocházející z periferní krve; odpovídající pozice standartu délky nukleových kyselin (kb) jsou vyznačeny.

Obr. 3 Northern blot provedený s dalšími lidskými tkáněmi, aby ilustroval tkáňové rozložení PARP3 molekuly podle předloženého vynálezu. Pruh 1: srdce; pruh 2: mozek; pruh 3: placenta; pruh 4: plíce; pruh 5: játra; pruh 6: kosterní sval; pruh

-177: ledviny; pruh 8: slinivka břišní; odpovídající pozice standartu délky nukleových kyselin (kb) jsou vyznačeny.

Obr. 4 Western blot provedený s různými lidskými tkáněmi, aby ilustroval tkáňové rozložení PARP3 molekuly podle předloženého vynálezu na úrovni proteinů. Pruh 1: srdce; pruh 2: plíce; pruh 3: játra; pruh 4: slezina; pruh 5: ledvin; pruh 6: tlusté střevo; pruh 7: sval; pruh 8: mozek; odpovídající pozice standartu délky proteinů (kD) jsou vyznačeny.

Obr. 5 Western, blot provedený s různými lidskými tkáněmi, aby ilustrovaly tkáňové rozložení PARP3 molekuly podle předloženého vynálezu. Pruh 1: frontální kůra mozková; pruh 2: zadní kůra mozková; pruh 3: mozeček; pruh 4: hipokampus; pruh 5: bulbus olfactorius; pruh 6: striatum; pruh 7:

• ·

4 4

9

9 talamus; pruh 8: mezencefalon; pruh 9: entorinální kůra; pruh 10: most; pruh 11: medulla; pruh 12: mícha.

Obr. 6 je diagramatické vyobrazení PARP detekce (ELISA).

Obr. 7 je diagramatické vyobrazení PARP detekce (HTRF).

Další výhodná provedení předložené přihlášky vynálezu jsou popsané v následující sekci.

Homology PARP a funkční ekvivalenty

Pokud nebude uvedeno jinak, jsou pro účely předloženého popisu aminokyselinové sekvence uvedeny ve směru od Nkonce. Pokud je používán jednopísměnkový kód pro aminokyseliny, potom G je glycin, A je alanin, V je valin, L je leucin, I je isoleucin, S je serín, T je threonin, D je asparagová kyselina, N je asparagin, E je glutamová kyselina, Q je glutamin, W je tryptofan, H je histidin, R je arginin, P je prolin, K je lysin, Y je tyrosin, F je fenylalanin, C je cystein a M je methionin.

Předložený vynález se neomezuje na homology PARP, které jsou výše specificky popsané. Naopak, ty homology, které jsou funkčními ekvivalenty jsou do předmětu vynálezu také zahrnuty. Funkční ekvivalenty sestávají jak z přirozených, jako například druhovš-specifických nebo orgánověspecifických, tak uměle vytvořených variant proteinů, které jsou zde specificky popsané. Funkční ekvivalenty podle předloženého vynálezu se liší přidáním, substitucí, inverzí, inzercí a/nebo delecí jednoho nebo více • · · · · · « · · · · · · * · · · · · · · · · • ·····«· ······· · ··· · · · · * • · * · · · · · ·

- 31 aminokyselinových zbytků lidského PARP2 (SEQ ID NO:2), lidského PARP3 (SEQ ID NO: 4 a 6) a myšího PARP3 (SEQ ID:8 a 10) , je zde alespoň zachovaná NAD-vazebná funkce proteinu, která je zprostředkovaná funkční katalytickou Cterminální doménou. Póly(ADP-ribóza)-syntetizující katalytická aktivita by měla podobně být s výhodou zachována. Funkční ekvivalenty také obsahují, tam, kde je to vhodné, ty varianty, ve kterých je v zásadě zachována oblast podobná leucinovému zipu.

Navíc je například možné, vycházejíce ze sekvence lidský PARP2 nebo lidský PARP3, aby se nahradily některé aminokyseliny těmi, které mají podobné fyzikálně-chemické vlastnosti (objem, bazicitu, hydrofobicitu, atd.). Je například možné, aby zbytky argininu byly nahrazeny zbytky lyzinu, aby zbytky valinu byly nahrazeny zbytky isoleucinu nebo aby zbytky asparágové kyseliny byly nahrazeny zbytky glutámové kyseliny. Nicméně je také možné jednu nebo více aminokyselin vyměnit v sekvenci, přidat v sekvenci nebo odstranit ze sekvence nebo několik těchto kroků může být zkombinováno dohromady. Proteiny, které byly pozměněny touto cestou z lidských PARP2 nebo lidských PARP3 sekvencí mají alespoň 60 %, s výhodou alespoň 75 %, velmi výhodně alespoň 85 % homologie s počáteční sekvencí, vypočteno za použití algoritmu Pearson a Lipman, Proč. Nati. Acad. Sci (USA) 85(8), 1988, 2444-2448.

Následující homologie byly určeny na úrovni aminokyselin a na úrovni DNA mezi lidským PARPl, PARP 2 a PARP 3 (FastA program, Pearson a Lipman, loc. cit.):

• · · · · · • · · · · ··« • ·····«· ··»··· • · · · · · ·« « ·· ·

Aminokyselinová homologie:

	Procentuální shoda	Procentuální shoda v PARP podpisu
PARP1/PARP2	41,97 % (517)	86 % (50)
PARP1/PARP3	33,81 % (565)	53,1 % (49)
PARP2/PARP3	35,20 % (537)	53,1 % (49)

Čísla v závorkách ukazují počet překrývajících seaminokyselin.

DNA homologie:

	Procentuální shoda	Procentuální shoda v PARP podpisu
PARP1/PARP2	60,81 % (467)	77,85 % (149)
PARP1/PARP3	58,81 % (420)	59,02 % (61)
PARP2/PARP3	60,22 % (269)	86,36 % (22)

Čísla v závorkách poukazují na počet překrývajících se nukleotidů.

Polypeptidy podle předloženého vynálezu mohou být seřazeny jako homologní póly(ADP-ribóza) polymerázy na základě vysoké míry shody v oblasti katalytické domény.

Pro předložený vynález je také důležité, že nové homology. PARP nemají konvenční motivy zinkových prstů. Tato znamená, že tyto enzymy nejsou nutně účastny v DNA opravě nebo jsou · · 4 4 4 · · 4 • 44 4 4 · 4 · 4 · • 444 4444 44 4 • 4444444 4444444 · 4

4 · 444 444 «4 * 44 444 do té míry, že se liší od PARP1, ale jsou ještě schopné provésb jejich patologický mechanizmus (NAD⁺ spotřebu a tak spotřebou energie, která je způsobena spotřebou ATP). Silná exprese proteinu, obzvláště PARP3, kterou je možno pozorovat na Western blotu vypovídá o významné roli v NAD spotřebě. Tato je obzvláště důležitá pro vývoj léku. Potenciální nové inhibitory polymeráz podle předloženého vynálezu mohou takto inhibovat patologické funkce bez toho, že by měly nepříznivé účinky na žádoucí fyziologické vlastností. Toto nebylo možné s inhibitory proti enzymům PARP známými do současnosti vzhledem k tomu, že zde byla vždy také inhibice DNA opravné funkce. Potenciálně mutagennímu účinku známých PARP inhibitorů je takto velmi lehké porozumět. Je také možné si vytvořit PARP inhibitory takové, že účinně inhibují všechny PARP homology s vysokou afinitou. V tomto případě je potenciovaný účinek představitelný, tam, kde je to vhodné.

PARP homolog, kterému je dáván přednost podle předloženého vynálezu a který je ukázán v SEQ ID N0:2 (lidský PARP2), může být s výhodou izolován z lidského mozku, srdce, kosterního svalu, ledvin a jater. Exprese lidského PARP2 v jiných tkáních nebo orgánech je o poznání menší.

PARP homolog, kterému je dáván přednost podle předloženého vynálezu a který je ukázán v SEQ ID NO: 4 a 6 (lidský PARP3) může být s výhodou izolován z lidského mozku (v tomto případě velmi výhodně z hipokampu), ze srdce, z kosterního svalu, z jater nebo z ledvin. Exprese lidského PARP3 v jiných tkáních nebo orgánech, jako jsou sval nebo jater, je o poznání menší.

4 4 4 4 4 • 9 · · · ·

4 9 9 9 ··· • 4 4 4 4 9 9 · 99949

4.9 9 99 4

444

Zkušený pracovník, který je seznámen s izolací proteinů, bude používat kombinaci preparativních způsobů, které jsou nej vhodnější v každém případě pro izolaci přirozených enzymů PARP podle předloženého vynálezu, z tkání nebo rekombinantně připravených enzymů PARP podle předloženého vynálezu. Vhodný standart preparativních způsobů je popsaný například v Cooper, T.G., Biochemische Arbeitsmethoden, Walter de Gruyter, Berlin, New York nebo v Scopes, R. Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin.

Předložený vynález se navíc týká PARP2 a PARP3 homologů, které, přestože mohou být izolovány z jiných eukaryotických druhů, například bezobratlých nebo obratlovů, hlavně jiných savců jako například myší, krys, koček, psů, prasat, ovcí, dobytka, koní nebo opic nebo z jiných orgánů jako jsou, například srdeční sval, mají hlavní strukturální a funkční vlastnosti určené enzymy PARP podle předloženého vynálezu.

Obzvláště lidský PARP2, který může být izolován z lidského mozku a jeho funkční ekvivalenty, jsou činidla, kterým je dáván přednost pro vývoj inhibitorů neurodegenerativních nemocí jako například mrtvic. Je jim dáván přednost pro vývoj inhibitorů neurodegenerativních nemocí, protože může být předpokládáno, že vývoj léku založený na PARP2 jako indikátoru umožňuje vývoj inhibitorů, které jsou optimalizovány pro použití na lidském mozku. Nicméně, nemůže být vyloučeno, že inhibitory vyvinuté na základě PARP2 mohou také být použity pro léčbu PARPzprostředkovaných patologických stavů v jiných orgánech, • φ φ φ φ φφφφφφφ φ • φ φ · φ φ φ φ φ φ

ΦΦΦΦ φ φ «φ φφ · (viz tkáňové rozložení proteinů podle předloženého vynále zu).

PARP2 a pravděpodobně PARP3 jsou také, podobně jako PARP1, aktivované poškozením DNA, přestože asi pravděpodobně jiným mechanismem. Je možné si představit význam v DNA opravě. Zablokování enzymů PARP podle předloženého vynálezu by také bylo vhodné pro indikace jako jsou indikace na rakovinu (například u radiosenzitizace pacientů, kteří trpí nádorovým onemocněním).

Jiná hlavní biologická vlastnost enzymů PARP podle předloženého vynálezu a jejich funkčních ekvivalentů může být spatřena v jejich schopnosti vazby interagujícího partnera. Lidský PARP2 a 3 se liší od předtím objevených enzymů PARP vyšších eukaryotů, jako jsou obzvláště savci, obsahem potenciálních, tak zvaných motivů leucinových zipů. Tento je typickým motivem pro interakce protein-protein. Je možné, že tyto motivy dovolují pozměnění PARP aktivity interagujícího partnera. Tento dodatečný strukturální prvek takto také vytváří možný výchozí bod pro vývoj PARP efektorů jako například inhibitorů.

Předložený vynález se takto dále týká proteinů, které interagují s PARP2 a/nebo 3, s výhodou těch, které způsobují jejich aktivaci nebo inaktivaci.

Předložený vynález se dále týká proteinů, které mají ještě výše uvedenou ligand-vazebnou aktivitu a které mohou být připraveny cílenými modifikacemi ze specificky objevených aminokyselinových sekvencí.

9 ·

• 9 · «99 9

999· 9999 99 • 9999999 9999999 9

999 9 9 9 99 • 9 · 99 9 99 9

Je možné, počínaje z peptidové sekvence proteinů podle předloženého vynálezu, aby se vytvořily syntetické peptidy, které jsou použity, jako samotné nebo v kombinaci, jako antigeny pro tvorbu polyklonálních nebo monoklonálních protilátek. Také je možné použít PARP protein nebo fragmenty PARP proteinu pro tvorbu protilátek. Předložený vynález se takto také týká peptidových fragmentů PARP proteinů podle předloženého vynálezu, které obsahují charakteristické částečné sekvence, obzvláště těch oligopeptidů nebo polypeptidů, který obsahují alespoň jeden z výše uvedených sekvenčních motivů. Fragmenty tohoto typu mohou být získány například proteolytickým natrávením PARP proteinů nebo chemickou syntézou peptidů.

Nové specifické PARP2 a PARP3 vazebné partnery

Aktivní a s výhodou selektivní inhibitory proti proteinům podle předloženého vynálezu, byly vyvinuté za použití systému specifické detekce výše popsaném pro vazebné partnery PARP2 a PARP3. Tyto inhibitory mohou být také aktivní vzhledem k PARP 1.

Inhibitory získané podle předloženého vynálezu mají silnou inhibiční aktivitu vzhledem k PARP2. Hodnoty Ki mohou v tomto případě být menší než asi 1000 nM, jako menší než asi 700 nM, menší než asi 200 nM nebo menší než asi 30 nM, například okolo 1 do 20 nM.

Inhibitory podle předloženého vynálezu mohou mít také překvapivou selektivitu na PARP2. Toto je ukázáno pomocí • 0 • * • ·

0 0

0 0 0

00000 0 0

0·0 0

0 0 0 0

Ki(PARPl): Ki(PARP2) poměru pro takové inhibitory podle předloženého vynálezu, který je například vyšší než 3 nebo vyšší než 5, jako například vyšší než 10 nebo vyšší než 20.

Příklad, který by měl být zmíněn je 4-(N-(4hydroxyfenyl)aminometyl)-(2H)-dihydroftalazin-l-on.

Příprava tohoto a jiných analogů sloučenin může být provedena ve shodě s Puodzhyunas a kol., Pharm. Chem. J. 1973, 7, 566 nebo Mazkanowa a kol., Zh. Obsahch. Khim. ,

1958, 28, 2798 nebo Mohamed a kol., Ind. J. Chem. B., 1994, 33, 769 které jsou zahrnuty jako reference.

Výše uvedená sloučenina ukazuje hodnotu Ki 113 nM pro PARP2 a je osmkrát selektivnější pro PARP2 než pro PARP3.

Nukleové kyseliny kódující homology PARP:

Dokud nebude uvedeno jinak, nukleotidové sekvence jsou uvedeny v předloženém popisu ve směru od 5' do 3' konce.

Předložený vynález se dále týká sekvencí nukleových kyselin, která kódují výše uvedené proteiny, obzvláště ty, které obsahují aminokyselinovou sekvenci zobrazenou v SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 a 10, ale bez toho, že by na ni byla přihláška vynálezu omezena. Sekvence nukleové kyseliny, které mohou být použity podle předloženého vynálezu, také obsahují alelické varianty, které, jak je výše uvedeno pro aminokyselinovou sekvenci, je možné získat deleci, inverzí, inzercí, přidáním a/nebo substitucí nukleotidů, s výhodou nukleotidů zobrazených v SEQ ID NO: 1, 3, 7 a 9, ale s hlavním zachováním biologických vlastností a biologické #99

9

9 9 « 9 9

9 9 9

9

9999 ·

9

9 9· aktivity odpovídajících genových produktů. Nukleotídové sekvence, které mohou být použity jsou získány například nukleotidovou substitucí, která vytváří tiché (bez alterace aminokyselinové sekvence) nebo konzervativní změny aminokyseliny (výměna aminokyselin stejné velikosti, náboje, polarity nebo rozpustnosti).

Sekvence nukleové kyseliny podle předloženého vynálezu také zahrnují funkční ekvivalenty genů, jako jsou eukaryotické homology například z bezobratlých, jako jsou Caenorhabditis nebo Drosofila nebo obratlovů, s výhodou ze savců, které jsou výše popsané. Geny, kterým je dáván přednost, jsou geny obratlovců, které kódují genový produkt, který má vlastnosti důležité pro předložený vynález, jak je výše uvedeno.

Nukleové kyseliny podle předloženého vynálezu mohou být získány konvenční cestou různými cestami:

Například u genomické nebo cDNA knihovny může být proveden screening na DNA, která kóduje PARP molekulu nebo její část. Například, u cDNA knihoven získaných z lidského mozku, ze srdce nebo z ledvin může být proveden screening vhodnou sondou, jako například označeným jednovláknovým DNA fragmentem, který odpovídá částečné sekvenci vhodné délky vybrané z SEQ ID NO: 1 nebo 3 nebo sekvenci, která je k nim komplementární. Pro tento účel je možné například, aby fragmenty DNA knihovny, které byly přeneseny do vhodného klonujícího vektoru byly, po transformaci bakterie, která jimi byla provedena, naneseny na agarové plotny. Klony mohou potom být přeneseny na nitrocelulózové filtry a po

- 39 • ΦΦΦ·· • · φ φφ · ·« · ·· • ♦ Φφφ • φ φ φ φ φφφφφφφ φ • φ φ φ ♦ Φ · φφ φ denaturaci DNA být hybridizovány s označenou sondou.

Pozitivní klony jsou potom izolovány a charakterizovány.

DNA kódující homology PARP podle předloženého vynálezu nebo parciální fragmenty mohou také být syntetizovány chemicky vycházejíce z informace o sekvenci, obsažené v předloženém vynálezu. Například je možné pro tento účel syntetizovat a následně ligovat oligonukleotidy o délce okolo 100 baží způsobem známým per se, například získáním vhodných koncových míst, na kterých probíhá trávicí štěpení.

Nukleotidová sekvence podle předloženého vynálezu může také být připravena pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) (polymerase chain reaction). Během polymerázové řetězové reakce (PCR) je cílová DNA, jako například DNA z vhodného klonu plné délky, hybridizovaná s párem syntetických oligonukleotidových primerů, které jsou dlouhé okolo 15 baží a které se váží k opačným koncům cílové DNA. Sekvenční sekce ležící mezi nimi je potom přepsána za pomoci DNA polymerázy. Repetice tohoto cyklu, které několikrát proběhnou, dovolují, aby byla cílová DNA amplifikována (viz White a kol.(1989), Trends Genet. 5, 185).

U sekvencí nukleových kyselin podle předloženého vynálezu se také pokládá za zřejmé, že obsahují přepsané sekvence, jednovláknové DNA nebo RNA sekvence kódující a nekódující, komplementární DNA sekvence, mRNA sekvence a cDNA, které jsou z nich odvozeny.

Předložený vynález dále zahrnují nukleotidové sekvence, které hybridizují s výše uvedenými sekvencemi s výhodou za • 0 ··«· stringentních podmínek. Podmínky stringentní hybridizace existují pro účel předložené přihlášky vynálezu, když hybridizační sekvence mají homologii okolo 70 do 100 %, jako například okolo 80 do 100 % nebo 90 do 100 % (s výhodou v aminokyselinové sekci alespoň okolo 40, jako například okolo 50, 100, 150, 200, 400 nebo 500 aminokyselin).

Stringentní podmínky pro screening DNA, obzvláště cDNA knihovny, existují například, když je hybridizační směs promývána 0,lX SSC pufrem (20X SSC pufr = 3M NaCI, 0,3M citrát sodný, pH 7,0) a 0,1 % SDS při teplotě okolo 60?C.

Northern blotové analýzy jsou prováděny s výhodou za stringentních podmínek 0,lX SSC, 0,1 % SDS například při teplotě okolo 65§C.

Deriváty nukleových kyselin a konstrukty exprese:

U sekvencí nukleových kyselin se předpokládá, že také sestávají z derivátů, jako jsou například promotorové varianty nebo varianty alternativního sestřihu. Promotory operativně vázané protisměrně vzhledem k nukleotidové sekvenci podle předloženého vynálezu, mohou navíc být pozměněny přidáním nebo přidáními nukleotidů nebo substitucí či substitucemi, inverzí či inverzemi, inzercí či inzercemi a/nebo delecí či delecemi, ale bez poškození funkce nebo aktivity promotorů. Promotory mohou mít také zvýšenu svoji aktivitu pozměněním své sekvence nebo být úplně vyměněny více účinnými promotory, dokonce i z heterologních organismů. Promotorové varianty, které jsou • fl • « · flflfl· · · fl fl *· · fl · ···· fl · výše popsané, jsou použity k přípravě exprese kazet podle předloženého vynálezu.

Specifické příklady sestřihových variant lidského PARP2, které mohou být zmíněny, jsou:

Varianta lidského PARP2a: Delecí párů baží od páru baží v poloze 766 až do páru baží v poloze 904 (viz SEQ ID NO:1). Toto vede k posunu čtecího rámce s novým stop kodonem (TAA - odpovídající nukleotidům od polohy 922 až do polohy 924 v SEQ ID NO:1). Varianta lidského PARP2b: Inzerce 5'-gta tgc cag gaa ggt cat ggg cca gca aaa ggg tet ctg -3' za nukleotid v poloze 204 (SEQ ID N0:l). To zvětší aminokyselinovou sekvenci inzercí: GMPGRSWASXRVS

Pod deriváty nukleových kyselin se také mají na mysli varianty jejichž nukleotidové sekvence v oblasti od -1 do 1000 protisměrně vzhledem k start kodonu byly pozměněny tak, že genová exprese a/nebo exprese proteinu je zvýšena.

Kromě nukleotidové sekvence, která je výše popsaná, mohou být použity konstrukty nukleových kyselin, které podle předloženého vynálezu obsahují ve funkční, operativní vazbě jednu nebo více jiných regulačních sekvencí, jako jsou promotory, amplifikační signály, enhancery, polyadenylační sekvence, začátky replikace, reportérové geny, markér geny, které je možné selektovat a podobně. Tato vazba může, v závislosti zamýšleném použití, vést k zvýšené nebo snížené genové expresi.

U přirozených regulačních sekvencí je možné navíc ještě k « 0

0 0

0 • 0

0000

0

0000

0 • 0

0

0 0 • 0 0 ·· novým regulačním sekvencím jejich přítomnost protisměrně vzhledem k aktuálním strukturálním genům. Tato přirozená regulace může tam, kde je to vhodné, být vypnuta genetickou modifikací a exprese genů zvýšena nebo snížena. Nicméně genový konstrukt může mít také jednodušší strukturu tak, že žádné přídatné regulační signály nejsou inzertovány protisměrně vzhledem ke strukturálním genům a že přirozený promotor se svojí regulací není odstraněn. Namísto toho je přirozená regulační sekvence mutována takovou cestou, že k regulaci již dále nedochází a genová exprese je zvýšena nebo snížena. Také je možné inzertovat dodatečné výhodné regulační prvky na 3' konec sekvence nukleových kyselin. Sekvence nukleových kyselin mohou být přítomny v jedné nebo více kopiích v genovém konstruktu.

Výhodné regulační sekvence pro způsoby exprese podle předloženého vynálezu jsou například přítomny v promotorech jako jsou cos, tac, trp, tet, trp-tet, Ipp, lac, Ipp-lac, laclq, T7, T5, T3, gal, trc, ara, SPS, 1-PR nebo 1-PL, které jsou výhodně užívány v Gram-negativních bakteriích. Jiné výhodné regulačních sekvence jsou přítomny například v Gram-pozitivních promotorech amy a SPO2, v kvasinkových promotorech ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH nebo rostlinných promotorech CaMV/35S, SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, nos nebo v promotoru ubiquitinu nebo promotoru fazeolinu.

V principu je možné použít všechny přirozené promotory s jejich regulačními sekvencemi. Také je možné a výhodné použít syntetických promotorů.

·« 9 99

9 9 9

9 9 9 9 9 «999999 9

9»9 99

9

9999

U zmíněných regulačních sekvencí je zamýšlené provést specificky expresi sekvence nukleových kyselin a expresi proteinu. Toto může znamenat například v závislosti na hostitelském organismu, že je gen exprimován nebo nadměrně exprimován pouze po indukci nebo že je ihned exprimován a/nebo nadměrně exprimován.

Regulační sekvence nebo faktory mohou navíc s výhodou mít pozitivní vliv na expresi a takto zvyšovat nebo snižovat expresi. Zesílení regulačních prvků se může výhodně konat na úrovni transkripce za použití silných transkripčních signálů, jako jsou promotory a/nebo enhancery.

Nicméně je také možné zesílit translaci například zlepšením stability mRNA.

Enhancerem se má na mysli například DNA sekvence, která způsobuje zvýšenou expresi cestou zlepšené interakce mezi RNA polymerázou a DNA.

Rekombinantní konstrukt nukleové kyseliny nebo genový konstrukt je pro expresi ve vhodném hostitelském organismu výhodně inzertován do vektoru specifického pro hostitele, který vytváří podmínky pro optimální expresi genů v hostiteli. Vektory jsou dobře známé zkušenému pracovníkovi a mohou být také nalezeny v Cloning vectors (Pouwels P. H. a kol., Ed., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985). Kromě plasmidů se vektorem myslí také všechny jiné vektory známé zkušenému pracovníkovi, jako jsou například fágy, viry, jako jsou viry SV40, CMV, bakulovirus a adenovirus, transpozony, IS prvky, plazmidy, kosmidy a lineární nebo

9*

4 •

Μ · *4 « ♦ · 4 4 4 4 • · · ♦ 9 999 ·999* 4 4 4 9999 9 •· 9 9 9 φ ··* 44 · cirkulární DNA. Tyto vektory se mohou autonomně replikovat v hostitelském organismu nebo replikovat jako součást chromozomu.

Exprese genových konstruktů:

Výše popsané rekombinantní konstrukty podle předloženého vynálezu jsou výhodně vneseny do vhodného hostitelského systému a jsou exprimovány. Klonovací způsoby a transfekční způsoby, které jsou známé zkušenému pracovníkovi, jsou s výhodou použity za účelem vytvoření exprese zmíněných nukleových kyselin v daném systému exprese. Vhodné systémy jsou popsané například v Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel a kol., ed., Wiley Interscience, New York 1997.

Vhodné hostitelské organismy jsou v principu všechny organismy, které umožňují expresi nukleových kyselin podle předloženého vynálezu, jejich alelické varianty, jejich funkční ekvivalenty nebo deriváty nebo rekombinantní konstrukty nukleových kyselin. Hostitelským organismem se mají na mysli například bakterie, houby, kvasinky, rostlinné nebo zvířecí buňky. Organismům, kterým je dáván přednost jsou bakterie, jako jsou bakterie Escherichia, jako například bakterie Escherichia Streptomyces, Bacillus nebo Pseudomonas, mikroorganismy jako jsou Saccharomyces Aspergillus, vyšší eukaryotické buňky ze rostlin, například Sf9 nebo CHO buňky.

rodů coli, eukaryotické cerevisiae, zvířat nebo

Genové produkty mohou být také exprimovány, pokud je to + · ·· · ·* · • · · · · · * · *··* · · · · · · * * ···· · · · ···· « · · ··· · · · · · požadováno, v transgenních organismech jako jsou transgenní zvířata, kterými jsou obzvláště myši, ovce nebo transgenní rostliny. Transgenní organismy mohou také být tak zvaná knock-outovaná zvířata nebo rostliny, ve kterých odpovídající endogenní gen byl vypnut, jako například mutací nebo parciální nebo úplnou delecí.

Kombinace hostitelského organismu a vektorů vhodných pro organismy, jako jsou plazmidy, viry nebo fágy, jako například plazmidy s RNA polymerázou/promotorovým systémem, fágy μ, λ nebo jiné temperované fágy nebo transpozony a/nebo jiných výhodných regulačních sekvencí, vytvářejí expresní systém. Termínem expresní systémy má s výhodou na mysli například kombinace savčích buněk, jako jsou CHO buňky a vektorů, jako je pcDNA3neo vektor, které jsou vhodné pro savčí buňky.

Jak je výše uvedeno, genové produkty mohou také být exprimovány výhodně v transgenních zvířatech, například myších, ovcích nebo transgenních rostlinách. Podobně je možné programovat bezbuněčné translační systémy s RNA odvozenými z nukleových kyselin.

Genový produkt může také být exprimován ve formě terapeuticky nebo diagnosticky vhodných fragmentů. Pro izolaci rekombinantních proteinů je možné a výhodné použít vektorové systémy nebo olígonukleotidy, které prodlužují cDNA některými nukleotidovými sekvencemi a takto kódují pozměněné polypeptidy, který slouží k ulehčení purifikace. Vhodné modifikace tohoto typu jsou například tak zvané smyčky (tags) , které působí jako kotvy, jako například φφ · φφ

ΦΦΦ ΦΦΦ •ΦΦΦ φ φ • φ φ φφφφ φ φ φ φ φ φ · · φφ · φφ ·

Φ φφφφ φ Φ modifikace známá jako hexa-histidinová kotva nebo epitopy, které mohou být rozpoznány jako antigeny protilátkami (popsáno například v Harlow, E. a Pruh, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N.Y.) Press). Tyto kotvy mohou být použity k uchycení proteinů na pevný nosič jako například na polymerovou matrici, která může například být vložena do kolony na chromatografii nebo na mikrotitrační destičku nebo na jiný nosič.

Tyto kotvy mohou také být současně použity k rozpoznávání proteinů. Také je možné použít pro rozpoznání proteinů konvenční markéry jako jsou fluorescenční barviva, enzymové markéry, které tvoří reakční produkty po reakci se substrátem, které je možné detekovat nebo radioaktivní markéry, samotné nebo v kombinaci s kotvami pro odvozování proteinů.

Produkce protilátek:

Anti-PARP2 protilátky jsou vytvořeny způsobem, který je známý zkušenému pracovníkovi. Protilátkami se mají na mysli jak polyklonální, tak monoklonální, lidské nebo polidštěné protilátky nebo fragmenty z protilátek, protilátky s jednoduchým řetězcem nebo také syntetické protilátky, podobně jako protilátkové fragmenty jako jsou Fv fragment, Fab fragment a F(ab')₂ fragment. Vhodné způsoby produkce jsou popsány například v Campbell, A.M., Monoclonal Antibody Technology, (1987) Elsevier Verlag, Amsterdam, New York, Oxford a v Breitling, F. a Důbel, S., Rekombinante Antikorper (1997), Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg.

• 4 · ·

4 · 4 4

4 4 4 4 4

4 4444 4 4 4 • 4 4 4 4 4 · 44 4 • 4

4 4

4 • 4 • 4 • 4 4

4

4444

Další použití kódující sekvence:

Přítomná cDNA navíc vytváří základ pro klonování genomické sekvence nových PARP genů. Tato také obsahuje relevantní regulační nebo promotorovou sekvenci, která je k dispozici například sekvenací oblasti umístěné 5' směrem protisměrně cDNA podle předloženého vynálezu nebo umístěná v intronech genů. Informace cDNA sekvence je také základ pro tvorbu molekul, které mají opačnou polaritu nebo ribozymů, za pomoci známých způsobů (viz Jones, J.T. a Sallenger, B.A. (1997) Nat. Biotechnol. 15, 902; Nellen, W. a Lichtenstein, C. (1993) TIBS, 18, 419). Genomická DNA může být podobně použita k tvorbě genových konstruktů, které jsou výše popsané.

Jinou možností použití nukleotidových sekvencí nebo částí nukleotidových sekvencí je tvorba transgenních zvířat. Transgenní nadměrně zvýšená exprese nebo genetický knockout informace v sekvenci ve vhodném zvířecím modelu může dále poskytnout cenné informace, které se týkají (pato)fyziologie nových genů.

Terapeutické aplikace:

V případech, kdy je převládající nedostatek proteinu podle předloženého vynálezu, je možné použít několik způsobů pro nahrazení proteinu. Na jednu stranu může být protein, přirozený nebo rekombinantní, podáván přímo nebo cestou genové terapie ve formě jeho kódující nukleové kyseliny (DNA nebo RNA) . Je proto možné použít jakýkoli vhodný

9 9

9

9

9 • 9 9

9 9 9

9 9 9 9 • 99 ·

9 vektor, například jako virová a nevirová vehikula. Vhodné způsoby jsou popsané například Straussem a Barrangerem v Concepts in Gene Terapie (1997), Walter de Gruyter, Publ. Jiných alternativ je docíleno stimulací endogeního genu prostřednictvím vhodného agens.

Také je možné blokovat obrat nebo inaktivaci enzymů PARP podle předloženého vynálezu, například proteázami. Konečně mohou být použity inhibitory nebo agonisté enzymů PARP podle předloženého vynálezu.

V situacích, kdy je PARP přítomno v nadbytku nebo je PARP nadměrně aktivován, mohou být použity různé typy inhibiorů. Tato inhibice může být docílena jak molekulami, které mají opačnou polaritu, ribozymy, oligonukleotidy nebo protilátkami, tak i nízkomolekulárními sloučeninami.

Aktivní látky podle předloženého vynálezu, tj . PARP proteiny, nukleové kyseliny a PARP vazebné partnery, jako jsou například protilátky nebo modulátory, mohou být podávány buď jako jednoduché terapeuticky aktivní látky nebo jako směsi s jinými terapeuticky aktivními látkami. Mohou být podávány jako takové, ale obecně jsou podávány ve formě farmaceutických kompozic, tj. jako směsí aktivní látky nebo látek s alespoň jedním vhodným farmaceutickým nosičem nebo ředidlem. Aktivní látky nebo kompozice mohou být podávány jakýmkoli vhodným způsobem pro daný terapeutický účel, například ústy nebo parenterálně.

Povaha farmaceutických kompozic a farmaceutického nosiče nebo ředidla je závislá na požadovaném způsobu podávání.

9 4

4 ·

• · ·· · ·· · • · » · · · • · · · 4 4 4 9

9 4944 4 4 4 4494

4 4 9 4 4 · 44 9 ·· ·

Kompozi.ce, které jsou podávány ústy mohou být například ve formě tablet nebo kapsulí a mohou obsahovat obvyklé excipienty jako jsou pojidla (například sirup, akácie, želatina, sorbitol, kozinec nebo polyvinylpyrolidon) , objemová činidla (například laktózu, cukr, obilný škrob, fosforečnan vápenatý, sorbitol nebo glycin), lubrikační činidla (například stearát hořečnatý, talek, polyetylén glykol nebo oxid křemičitý), disintegrační činidla (například škrob) nebo zvlhčovači činidla (například laurylsulfát sodný). Produkty, které jsou podávány ústy ve formě tekutin jsou ve formě vodních nebo olejových suspenzí, roztoků, emulzí, sirupů, elixírů nebo sprejů atd. nebo mohou být ve formě suchých prášků, ke kterým je přidána voda nebo jiný vhodný nosič. Tekuté produkty těchto typů mohou obsahovat konvenční aditiva, například suspenzní činidla, esence, ředidla nebo emulzifikátory. Pro parenterální podání je možné použít, roztoky nebo suspenze s konvenčními farmaceutickými nosiči. Parenterální podání aktivních látek podle předloženého vynálezu se uskutečňuje s výhodou za použití tekutých farmaceutických kompozic, které mohou být podávány intravenózně. Tyto s výhodou alespoň jedné aktivní látky, s výhodou v rozpuštěné formě, ve farmaceuticky přijatelném nosiči vhodném pro tento účel. Příklady farmaceutických nosičů vhodných pro tento účel jsou obzvláště vodné roztoky, jako například fyziologický roztok, solný roztok ve fosfátovém pufru, Ringerův roztok, Ringerův roztok laktátu a tak podobně. Kompozice může navíc obsahovat dodatečné látky, jako jsou antioxidanty, parenterálně, obzvláště obsahují účinné množství chelatační činidla nebo antimikrobiální činidla.

• φ

ΦΦΦ 9 9 9

9 9 9 9 9

ΦΦΦΦΦΦΦ φ • · « φ φ

Φ · ···· • 9

V každém případě je volba dávkování aktivní látky podle předloženého vynálezu a časové rozložení jednotlivých dávek závislé na rozhodnutí ošetřujícího lékaře. Ošetřující lékař vybere vhodnou dávku a vhodné časové rozložení dávkování v závislosti na zvolené cestě podávání, v závislosti na účinnosti léku v jednotlivých případech, v závislosti na povaze a závažnosti stavu nemoci, které má být léčena a v závislosti na stavu pacienta a jeho odpovědi na terapii. Farmakologicky aktivní látky mohou takto například být podávány savci (člověk nebo zvíře) v dávkách okolo 0,5 mg do okolo 100 mg na kg tělesné hmotnosti a den. Mohou být podávány v jednoduché dávce nebo v několika dávkách.

Neterapeutické aplikace:

Nukleové kyseliny podle předloženého vynálezu, jako například cDNA, genomická DNA, promotor a polypeptid a jejich parciální fragmenty mohou také být užívány v rekombinantní nebo nerekombinantní formě pro vývoj různých testových systémů.

Například je možné vytvořit testový systém, který je vhodný pro měření aktivity promotoru nebo proteinu v přítomnosti testované látky. Způsoby měření v tomto případě jsou s výhodou jednoduché, například kolorimetrické způsoby, luminometrické způsoby, fluorimetrické způsoby, imunologické způsoby nebo radioaktivní způsoby a umožňují s výhodou rychlé měření velkého množství testované látky. Testy tohoto typu jsou vhodné a výhodné pro tak zvaný vysokovýkonostní screening. Tyto testové systémy umožňují u testovaných látek stanovit jejich vazbu k proteinům nebo ·· φφφ • · φ φ φ φ φ • Φ · ·· · • · φ • · · · • ····· φφφ ·· · • · φφφφ φφ • · • · • · • · · ·· · jejich agonismus proteinů, antagonismus proteinů nebo inhibici proteinů podle předloženého vynálezu.

Určení množství, aktivity a distribuce proteinů podle předloženého vynálezu nebo jejich podkladové mRNA v lidském těle může být použito pro diagnózu, pro určení predispozice a monitorování některých nemocí. Sekvence cDNA a genomické sekvence mohou podobně dále poskytnout informace týkající se genetických příčin a predispozicí k některým nemocím. Je možné použít pro tento účel DNA/RNA sond a protilátek širokého souboru různých typů. Nukleotidové sekvence podle předloženého vynálezu nebo části nukleotidových sekvencí mohou dále být použity ve formě vhodných sond pro detekci bodových mutací, deleci nebo inzercí.

Proteiny podle předloženého vynálezu mohou dále být použity k identifikaci a izolaci jejich přirozených ligandů nebo interagujících partnerů. Proteiny podle předloženého vynálezu mohou být navíc použity k identifikaci a izolaci umělých nebo syntetických ligandů. Pro tento účel rekombinantně připravený nebo purifikovaný přirozený protein může být odvozen takovou cestou, že vzniknou modifikace, který dovolí vazbu k nosičovým materiálům. Proteiny navázané touto cestou mohou být inkubovány s různými analyty, jako například proteinovými extrakty nebo peptidovými knihovnami nebo jinými zdroji ligandů. Specificky navázané peptidy, proteiny nebo nízkomolekulární neproteinové látky mohou být izolovány a charakterizovány touto cestou. Neproteinovými látkami se mají na mysli například nízkomolekulární chemické látky, který mohou vzniknout například z klasické syntézy léků nebo z tak • 4 494» 9 4 · 9994 9 9 4 9 • · 9 4 9 · 9··

4 9* < 9“ 999 zvané látkové knihovny, které byly syntetizovány kombinatoricky.

Použité proteinové extrakty jsou odvozeny například z homogenátů rostlin nebo částí rostlin, mikroorganismů, lidských nebo zvířecích tkání nebo orgánů.

Ligandy nebo interagující partneři mohou také být určeni způsoby jako je kvasinkový dvou-hybridní systém (Fields, S. a Song, 0. (1989) Nátuře, 340, 245). Expresívní banky, které mohou být použity v tomto případě, mohou být odvozeny například z lidských tkání, jako například z mozku, ze srdce, z ledvin atd.

Sekvence nukleových kyselin podle předloženého vynálezu a proteiny kódované sekvencemi nukleových kyselin mohou být použity pro vývoj reagencií, agonistů a antagonistů nebo inhibitorů pro diagnózu a terapii chronických a akutních nemocí spojených s expresí nebo aktivací jedné z proteinových sekvencí podle předloženého vynálezu, takové jako například se zvýšenou nebo sníženou expresí proteinových sekvencí. Vyvinuté reagencie, agonisté, antagonisté nebo inhibitory mohou následně být použity pro tvorbu farmaceutických přípravků pro léčbu nebo diagnózu nemocí. Příklady možných nemocí v této souvislosti jsou nemoci mozku, nemoci periferního nervového systému, nemoci kardiovaskulárního systému nebo nemoci oka, septický šok, reumatoidní artritida, diabetes, akutní selhání ledvin nebo rakovina.

Relevance proteinů podle předloženého vynálezu, pro zmíněné

C 9 4 • 0 · · « · · € • · · · · · • · · «e *

0 0 · «

4 4 9

4 0 ···

0 0 • 0 ·

indikace byla ověřena za použití specifických inhibitorů u relevantních zvířecích modelů.

Příklady provedení vynálezu

Následující příklady dále ilustrují podrobně předložený vynález.

Příklad 1: Izolace PARP2 a PARP3 cDNA

Přítomné cDNA sekvence byly nalezeny poprvé při sekvenční analýze cDNA klonů cDNA knihovny z lidského mozku (Human Brain 5'Stretch Plus cDNA Library, # HL3002a, Clontech). Myší PARP3 klony byly izolovány z lambda triplex cDNA knihovny myšího mozku (Clontech katalogové číslo ME5004t). Sekvence těchto klonů jsou popsané v SEQ ID NO: 1, 3, 7 a 9.

Příklad 2: Exprese PARP2 a PARP3 lidských tkáních

Exprese lidského PARP2 a lidského PARP3 byla zkoumaná u dvanácti lišících se lidských tkání pomocí analýzy Northern blot. Mnohočetný Northern blot lidských tkání (Human Multiple Tissue Northern Blot) (MTN™) dodávaný Clontech (#7760—1 a #7780-1) byl hybridizován pro tento účel s RNA sondou. Sonda byla vytvořena in vitro transkripcí odpovídajících cDNA lidského PARP2 a lidského PARP3 v přítomnosti digoxigeninem označených nukleotidů ve shodě se způsobem podle výrobce (Boehringer Mannheim DIG Easy Hyb katalogové číslo 1603 558, DIG Easy Hyb způsob pro RNA: RNA hybridizací). Protokol byl pozměněn provedením • · • · · • ···· • · · · · • ♦······ • · t · ·♦ * prehybridizace: 2x1 hodina s přidáním DNA ze sledího sperma (10 mg/ml hybridizačního roztoku). Hybridizace potom proběhla přes noc s přidáním DNA z sledího sperma (10 mg/ml hybridizačního roztoku). Proužky byly detekovány za použití CDP-Star protokolu (Boehringer Mannheim CDP-StarN katalogové číslo 1685 627) .

Po stringentním mytí byl transkript PARP2 hlavně detekován v lidském mozku, v srdci, v kosterním svalu, v ledvinách a v játrech. Transkript velikosti okolo 1,9 kb odpovídá délce určené cDNA (l,85kb) (viz Obr. 2(A)).

V jiných tkáních nebo orgánech je exprese lidského PARP2 znatelně slabší.

Po stringentním mytí byl transkript PARP3 hlavně detekován v srdci, v mozku, v ledvinách, v kosterním svalu a v játrech. Exprese v jiných tkáních (placenta, plíce, slinivka břišní) je o poznání menší (viz Figura 2(B)). Existují alespoň 2 transkripty lidského PARP3, které mohou pravděpodobně být vysvětleny lišícím se místem polyadenylace nebo alternativním sestřihem. Jejich velikosti (okolo 2,2 kb a 2,5 kb respektive) odpovídají délce určené cDNA (2,3kb). Mytí bylo provedeno za použití 0,2 x SSC/0,2 % SDS při teplotě prostředí po dobu 2 x 15 minut a potom za použití 0,1 x SSC/0,1 % SDS při teplotě 65§C po dobu 2 x 15 minut (připravený z 20X SSC: 3M NaCl, 0,3M citrát sodný, pH 7,0).

Příklad 3: Produkce protilátek ·· ·

0

0000* ·

- 55 0 0 0 ·<

Byly vytvořeny specifické protilátky proti proteinům podle předloženého vynálezu. Tyto specifické protilátky byly užívány mezi jiným pro analýzu tkáňového rozložení na úrovni proteinů PARP2 a PARP3 imunoblotingovou (Western blot) analýzou. Příklady produkce takových protilátek jsou uvedeny níže.

Následující peptidy byly připraveny syntézou pomocí způsobu pro výrobu protilátek, který je známý zkušenému pracovníkovi. V některých případech byl cysteinový zbytek připevněn na N nebo C konec sekvence za účelem ulehčení párování k KLH (keyhole limpet hernokyanin).

PARP-2: NH₂-MAARRRRSTGGGRARALNES-CO₂H (aminokyseliny v poloze 1 až 20; SEQ ID NO: 23)

NH₂-KTELQSPEHPLDQHYRNLHC-CO₂H (aminokyseliny v poloze 335 až 353; SEQ ID NO: 24)

PARP-3: NH₂-CKGRQAGREEDPFRSTAEALK-CO₂H (aminokyseliny v poloze 25 až 44 SEQ ID NO: 25)

NH₂-CKQQIARGFEALEALEEALK-CO₂H (aminokyseliny v poloze 230 až 248; SEQ ID NO: 26)

Produkce anti-PARP3 protilátky je popsána jako modelový příklad.

Polyklonální protilátky proti lidskému PARP3 byly získány z králíka za použití syntetického peptidů majícího peptidovou sekvenci H₂N-KQQIARG-FEALEALEEALK-CO₂H (SEQ ID NO: 27) (aminokyseliny v poloze 230 až 248 lidské PARP3 proteinové sekvence). Odpovídající myší sekvence se liší v této oblasti pouze jednou aminokyselinou (H₂N• ·

KQQIARGFEALEALEEAMK-CO₂H; SEQ ID NO: 28). Cystein byl také připevněn na N-konec, aby proteinu umožnil se párovat s

KLH.

• · · ·

9 9999 · ·

Μ ♦

Zajíci byly imunizováni celkově pětkrát, v intervalech 7 až 14 dnů konjugátem KLH-peptid. Antisérum bylo získáno afinně-purifikované za použití antigenu. Specifická IgG protilátková frakce byla izolována ze séra za použití odpovídajících peptidů, které byly pro tento účel nejprve imobilizovány na afinní koloně způsobem, který je známý zkušenému pracovníkovi. Odpovídající antiséra byla vložena do této afinní kolony a nespecificky nasorbované proteiny byly vymyty pufrem.

Specificky navázaná IgG protilátková frakce byla vymyta pomocí 0,2 M glycin/HCl pufr pH 2,2. pH bylo ihned zvýšeno za použití IM TRIS/ HCI pufru pH 7,5. Eluát obsahující IgG protilátkovou frakci byl smísen 1:1 (objemově) s nasyceným roztokem síranu amonného a inkubován při teplotě +40§C po dobu 30 minut až do úplné precipitace. Vzniklý precipitát byl centrifugován při 10 000 g a po odstranění supernatantu rozpuštěn v minimálním množství PBS/TBS. Vzniklý roztok byl potom dialyzován proti PBS/TBS v poměru 1:100 (objemově). Protilátky byly upraveny na koncentraci okolo 100 pg IgG protilátky/ml. PARP3 protilátky purifikovaná touto cestou měly vysokou specificitu pro PARP3. Přestože myší PARP3 byl rozpoznány dobře, neproběhla zkřížená reakce s PARP1 nebo PARP2, kterou by bylo možno pozorovat.

Příklad 4: Analýza tkáňového rozložení imunoblotingovou analýzou (Western blot) • fl ···· • · · «· ·

Tkáňové rozložení na úrovni proteinů bylo také zkoumáno pro PARP2 a PARP3 imunoblotíngovou analýzou (Western blot).

Příprava myších tkání pro proteinové gely:

Tkáně nebo buňky byly homogenizované za použití Potteru nebo Ultra-Turraxu. Pro homogenizaci 0,5 g tkáně (nebo buněk) bylo inkubováno v 5 ml pufru (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA, 6 mM MgC12), jedna tableta koktailu proteázového inhibitoru (Boehringer Mannheim, katalogové číslo: 1836153) a benzonáza (stupeň čistoty I, MERCK) při teplotě 37§C po dobu 3 0 minut. Tkáňové vzorky z myši byly vytvořeny ze srdce, z plic, z jater, z sleziny, z ledvin, z tenkého střeva, ze svalu, z mozku a z lidských embryonálních buněk ledvin (HEK293, lidské embryonální ledviny).

Proteinové gely:

NUPAGE systém dodávaný společností NOVEX byl použit ve shodě s instrukcemi pro proteinové gely. Byly použity polyakrylamidové gely (NuPAGE 4-12 % BisTris, NOVEX NP

0321), pracovní pufr (MES-Running pufr, NOVEX NP 0002), antioxidant (NOVEX NP 0005), protein standartní velikosti (Multi Mark Multi Colored Standard, NOVEX LC 5725), pufr pro vzorek (NuPAGE LDS Sample pufr (4X), NOVEX NP 0007). S gely bylo pracováno po dobu 45 minut při napětí 200 V.

Western blot:

Western bloty byly provedeny za použití NOVEX systému ve • · · •» ·

- 58 shodě s instrukcemi. Byla použita nitrocelulózové membrána (nitrocelulóza s póry o velikosti 45 gm, NOVEX LC 2001). Přenos probíhal po dobu 1 hodiny za působení proudu velikosti 200 mA. Pufr pro přenos se skládal z 50 ml koncentrátu pufru pro přenos (NOVEX NP 0006), 1 ml antioxidantů (NOVEX NP 0002), 100 ml metanolu analytické stupnice a 849 ml dvakrát destilované vody.

Kromě blotů vytvořených touto cestou byly také použity předem vytvořené bloty, například od Chemicon (blot myšího mozku, Chemicon, katalogové číslo: NS 106 s tkáněmi 1. frontální kůra mozková, 2. zadní kůra mozková, 3. mozeček, 4. hippocampus, 5. bulbus olfaktorius, 6. striatum, 7. talamus, 8. mezencefalon, 9. entorhinální kůra mozková, 10. most, 11. medulla, 12. mícha).

Protilátkové reakce s PARP3:

Western bloty byly blokovány v TBST (TBS + 0,3 % Tween 20) s 5 % práškem sušeného mléka po dobu alespoň 2 hodin (TBS: 100 mM Tris pH 7,5, 200 mM NaCl). Protilátkové reakce s primární protilátkou (ředění 1:1000) proběhlo v TBST s 5 % práškem sušeného mléka (viz výše) při teplotě prostředí, po dobu alespoň 2 hodin nebo při teplotě 4§C přes noc, za mírného míchání (vertikální rotátor). Protilátkové reakce byla následována mytím, které proběhlo třikrát, v TBST po dobu 5 minut. Inkubace s druhotnou protilátkou (antikráličí IgG protilátky, s navázanou peroxidázou, SIGMA A6154, ředění 1:2000) proběhlo v TBST s 5 %'práškem sušeného mléka po dobu jedné hodiny. Inkubace s druhotnou protilátkou byla následována mytím, které proběhlo třikrát, ·

• 4 • 4 *

4444 • 4 4 4 4

4 4 4« po dobu 5 minut, po každé stejným způsobem jako je výše uvedeno. Následná detekce byla založena na chemiluminescenci za použití SUPER BLAZE kitu (Pierce, Signál BLAZE Chemiluminescent substráte 34095) podle způsobu uvedeném výrobcem. Byl použit Lumi-Film (Chemiluminescenční Detekční Film, Boehringer katalogové číslo: 1666916). Filmy byly vyvolávané po dobu asi 2 minut (vyvolávací koncentrát pro rentgenové záření, ADEFO-Chemie GmbH), hydratované, fixované po dobu asi 4 minut (Acidofix 85 g/1 /AGFA), hydratované a potom sušené.

Příklad 5: Příprava enzymů

Lidská PARPl byla pro srovnání exprimována rekombinantně bakulovirovým systémem způsobem, který je známý zkušenému pracovníkovi a částečně purifikována popsaným způsobem (Shah a kol., Analytical Biochemistry 1995, 227, 1-13). Hovězí PARPl o čistotě 30-50 % (c=0,22 mg/ml, specifická aktivita 170 nmcl ADP-ribóz/min/mg celkového proteinu při teplotě 25§C) byla zakoupen u BIOMOL (katalogové číslo SE165) . Lidské a myší PARP2 a PARP3 byly exprimovány rekombinantně v bakulovirovém systému (Bac-to-Bac systém, BRL LifeScience). Pro tento účel byly vhodné cDNA klonovány v pFASTBAC-1 vektoru. Příprava rekombinantní bakulovirové DNA rekombinací v E. coli byla následována transfekcí hmyzích buněk (Sf9 nebo High-Five) vhodnými rekombinantními bakulovirovými DNA. Exprese odpovídajících proteinů byla ověřena Western blotovou analýzou. Virové kmeny byly amplifikovány způsobem, který je známý zkušenému pracovníkovi. Větší množství rekombinantních proteinů bylo získáno infekcí 500 ml kultury hmyzích buněk (2 x 106 ·· · · ♦ • · · » • · ·· ·»

- 60 - ’··’ ^; buněk/ml) s viry v MOI (multiplicita infekce; poměr virů k buňkám) nabývajícím hodnotu 5-10 a inkubací probíhající po dobu 3 až 4 ddnů. Hmyzí buňky byly potom peletovány centrifugací a proteiny byly purifikované z peletu.

Purifikace proběhla způsoby klasické proteinové purifikace známými zkušenému pracovníkovi, detekce enzymů proběhla vhodnými specifickými protilátkami. V některých případech, byly proteiny také afinně-purifikovány na 3aminobenzamidové afinní koloně známým způsobem (Burtscher a kol., Anal Biochem 1986, 152:285-290). Čistota přeshovala 90 %.

Příklad 6: Detekční systémy pro určení aktivity PARP2 a PARP3 a inhibiční účinek efektorů na PARPl, PARP2 a PARP3.

a) Produkce protilátek proti póly(ADP-ribóze)

Je možné použít póly(ADP-ribózu) jako antigen pro tvorbu anti-poly(ADP-ribóza) protilátek. Produkce anti-poly(ADPribóza) protilátek je popsána v literatuře (Kanai, Y. a kol. (1974) Biochem. Biophys. Res. Comm. 59:1, 300-306; Kawamaitsu, H. a kol. (1984) Biochemistry 23, 3771-3777; Kanai, Y. a kol. (1978) Imunology 34, 501-508).

Byly mezi jiným použity následující protilátky: antipoly (ADP-ribóza) protilátky (polyklonálního králičího antiséra), BIOMOL; katalogové číslo SA-276, anti-poly(ADPribóza) protilátky (monoklonální, myší; klon 10H; hybridomový supernatant, afinně-purifikovaný).

• · · · · * • · · · * _Α φ Μ·· · · • · · * • 0 F

Antiséra nebo monoklonální protilátky získané ze supernatantu hybridomu byly purifikovány proteinem afinní chromatografií způsobem, který je známý zkušenému pracovníkovi.

b) ELISA

Pomůcky:

ELISA barevné reagens: TMB mix, SIGMA T-8540 jamková mikrotitrační destička (FALCON Mikro-Test IIITM Flexible Assay Plate, # 3912) byla povlečena histony (SIGMA, H-7755). Histony byly pro tento účel rozpuštěny v karbonátovém pufru (0,05M Na2HCO3; pH 9,4) o koncentraci of 50 pg/ml. Jednotlivé jamky mikrotitrační destičky byly každá inkubovaná s objemem 150 μΐ tohoto roztoku histonů při teplotě prostředí po dobu alespoň 2 hodin nebo při teplotě 4§C přes noc. Jamky byly potom blokovány přidáním 150 μΐ 1 % BSA roztoku (SIGMA, A-7888) v karbonátovém pufru při teplotě prostředí po dobu 2 hodin. Toto bylo následováno třemi kroky mytí mycím pufrem (0,05 lx PBS; PBS (Fosfátový solný roztok; Gibco, číslo 10010): 0,21 g/1 KH₂PO₄, 9 g/1 NaCI, 0,726 g/1 Na₂HPO₄ * H₂O, pH 7,4). Kroky mytí byly všechny provedeny v mycím zařízení mikrotitračních destiček (Columbus, mycí zařízení mikrotitračních destiček, SLT-Labinstruments,

Rakousko).

% TweenlO v katalogové

Pro enzymatickou reakci byly požadovány roztoky pro enzymatickou reakci a roztok substrátu, v každém případě

«. · • · ♦··· • · ·

- 62 jako již předem připravená směs. Absolutní množství těchto roztoků záleželo na očekávaném počtu detekčních jamek.

Složení roztoku pro enzymatickou reakci na jamku:

- 4 μΐ PARP reakčního pufru (IM Tris-HCl pH 8,0, lOOmM MgCl₂, lOmM DTT)

- 20 ng PARP1 (lidská nebo hovězí) nebo 8 ng PARP2 (lidská nebo myší)

- 4 μΐ aktivané DNA (1 mg/ml; SIGMA, D-4522)

- H₂O do objemu 40 μΐ

Složení roztoku substrátu na jamku:

- 5 μΐ PARP reakčního pufru (lOx)

- 0,8 pl NAD roztoku (lOmM, SIGMA N-1511)

- 44 μΐ H₂O

Inhibitory byly rozpuštěny v lx PARP reakčním pufru. DMSO, který byl příležitostně použit pro rozpuštění inhibitorů ve vyšších koncentracích, byl bez problému až do konečné koncentrace 2 %. Pro enzymatickou reakci bylo vneseno 40 μΐ roztoku pro enzymatickou reakci do každé jamky a inkubováno s 10 pl roztoku inhibitoru po dobu 10 minut. Enzymatická reakce byla potom spuštěna přidáním 50 μΐ roztoku substrátu na jamku. Reakce byl provedena při teplotě prostředí po dobu 30 minutut a potom zastavena mytím mycím pufrem, které proběhlo třikrát.

Primární protilátky, které byly použity, byly specifické anti-poly(ADP-ribóza) protilátky v ředění 1:5000. Ředění proběhlo v protilátkovém pufru . (1 % BSA v PBS; 0,05 %

Tween20). Inkubační doba pro primární protilátky byla • · • « · ♦ ♦···

- 63 následném provedena dlouhá jednu hodinu při teplotě prostředí. Po mytí mycím pufrem, které proběhlo třikrát byla inkubace s druhotnými protilátkami (anti-myší IgG protilátky protilátky, Fab fragmenty, s navázanou peroxidázou, Boehringer Mannheim, katalogové číslo

1500,686; anti-králičí IgG protilátky, s navázanou peroxidázou, SIGMA, katalogové číslo A-6154) v ředění 1:10,000 v protilátkovém pufru při teplotě okolí po dobu jedné hodiny. Mytí mycím pufrem, které proběhlo třikrát bylo následováno barevnou reakcí za použití objemu 100 μΐ barevného reagens (TMB mix, SIGMA) na jamku při teplotě prostředí po dobu asi 15 minut. Barevná reakce byla zastavena přidáním objemu 100 μΐ 2M H2SO4. Zastavení bylo následováno měřěním, které proběhlo ihned, ve čtecím zařízením pro ELISA destičku (EAR340AT Easy Reader, SLTLabinstruments, Rakousko) (vlnová délka 450nm versus vlnové délce 620nm). Princip měření je zobrazen diagramaticky na obrázku 6.

Různé koncentrace byly použity pro vytvoření grafu zobrazujícího vliv dávky na účinek, pro určení hodnoty Ki inhibitoru. Hodnoty jsou získány v tripletu pro jednotlivou koncentrací inhibitoru. Aritmetické údaje jsou určeny za použití softwaru Mikrosoft® Excel. IC50 je určena za použitím Mikrocal® Origin Softwaru (Verse 5,0) (Sigmoidal Fit). Konverze hodnoty IC50 byla spočítaná touto cestou, hodnoty Ki byly určeny za použití kalibračních inhibitorů. Kalibrační inhibitory byly také měřeny v každé analýze. Hodnoty Ki kalibračních inhibitorů byly určeny u téhož detekčního systému analýzou Dixonova diagramu způsobem, který je známý zkušenému pracovníkovi.

bj HTRF detekce (homogenous time-resolved fluorescence)

Při HTRF detekci PARP podle předloženého vynálezu jsou označeny histony, které jsou cílovými proteiny pro modifikaci PARP, nepřímo za pomoci XL665 fluoroforu. Antipoly(ADP ribóza) protilátka je přímo označená europium kryptátem (anti-PAR-kryptát). Pokud je XL665 fluorofor v bezprostřední prostorové blízkosti, která je zaručena vazbou na póly(ADP-ribózy) na histon, potom je možný přesun energie. Emise při vlnové délce 665 nm je takto přímo úměrná množství navázané protilátky, které je jako takové ekvivalentní k množství póly(ADP-ribózy) . Měřený signál takto odpovídá PARP aktivitě. Princip měření je zobrazen diagramaticky na obrázku 7. Použité pomůcky jsou shodné s pomůckami užívanými v ELISA detekci (viz výše), pokud by výslovně nebylo uvedeno jinak.

Histony byly rozpuštěny v koncentraci 3 mg/ml Hepes pufru (50mM, pH=7,5). Navázání biotinu proběhlo za pomoci sulfoNHS-LC-biotinu (Pierce, #21335T). Byl použit molární poměr 4 molekul biotinu na histon. Inkubační doba byla dlouhá 90 minut (RT). Histony s navázaným biotinem byly potom purifikované na G25 SF HR10/10 koloně (Pharmacia, 17-059101) v Hepes pufru (50mM, pH=7,0) za účelem odstranění nadbytku navázaného biotinového reagens. Anti-poly(ADPribóza) protilátka byla označená za pomoci europium kryptátu za použití bifunkčních pérovacích reagencií (Lopez, E. a kol., Clin. Chem. 39(2), 196-201 (1993); US Patent 5,534,622).

• ·

Purifikace proběhla na G25SF HR10/30 koloně. Byl docílen molární. poměr 3,1 kryptátu na protilátku. Výtěžek byl 25 %. Konjugáty byly skladované při teplotě -80§C v přítomnosti 0,1 % BSA ve fosfátovém pufru (O,1M, pH=7).

Pro enzymatickou reakci byly následující látky napipetované do každé jamky:

- 10 μΐ PARP roztoku PARP HTRF reakčním pufru (50mM TrisHCI pH 8,0, lOmM MgC12, lmM DTT) s 20ng PARP1 (lidské nebo hovězího) nebo 8ng PARP2 (lidské nebo myšího)

- 10 μΐ aktivané DNA v PARP HTRF reakčním pufru (50pg/ml)

- 10 μΐ histonů s navázaným biotinem v PARP HTRF reakčním pufru (l,25pM)

- 10 μΐ inhibitor v PARP HTRF reakčním pufru

Tyto reagencie byly inkubovány po dobu 2 minut před tím, než byla reakce spuštěna přidáním

- 10 μΐ NAD roztoku v PARP HTRF reakčním pufru (41 μΜ/ml). Reakční doba byla 30 minut při teplotě prostředí.

Reakce byla potom zastavena přidáním

- 10 μΐ PARP inhibitoru (25 μΜ, Ki=10nM) ve vývojovém pufru (lOOmM Tris-HCl pH 7,2, 0,2M KF, 0,05 % BSA).

v následujících látky byly potom přidány:

- 10 μΐ EDTA roztoku (SIGMA, E-7889, 0,5M v H20)

- 100 μΐ Sa-XL665 (Packard Instruments) ve vývojovém pufru (15-31,25nM)

- 50 μΐ anti-PAR kryptátu ve vývojovém pufru (l,6-3,3nM).

Měření bylo potom možné podobu 30 minut (po uplynutí doby φφ φφ • ·

Φ · φφ·· φ · φ φ • φ • φ φφ φ φ φ φ φ · · φ * · • φφ φ * ΦΦΦΦ •

φ φ

φ φφ hodin). Měření proběhlo v analyzujícím zařízení pro HTRF mikrodestičky (Canberra Packard Instruments). Hodnoty Ki

byly spočítané ELISA.	stejným způsobem	jako	je popsáno pro	Způsob
Příklad 7: Testové systémy účinnosti PARP inhibitorů	pro	určení terapeutické
U nových PARP	inhibitorů může	být	zkontrolovaná	j ej ich

terapeutická účinnost v relevantním farmakologických modelech. Příklady několika vhodných modelů jsou uvedeny v Tabulce 1.

Porucha	Model	Literatura
Neurodegenerativní porucha (mrtvice, Parkinsonova nemoc atd.)	NMD A excitotoxicita u myši nebo krys	viz dále
Mrtvice	Permanentní MCAO (middle cerebral arterial occlusion)	Tokime, T. a kol., J. Cereb. Blood Flow Metab., 18(9): 991-7, 1998. Guegan, C., Brain Research. Molecular Brain Research, 55(1): 133-40, 1998.
	Transientní, fokální MCAO in krys nebo myši	Eliasson MJL a kol., Nat Med 1997, 3:1089-1095. Endres, M. a kol., J. Cereb. Blood Flow Metab. 1997, 17:1143-1151. Takahashi, K. a kol., J. Cereb. Blood Flow Metab. 1997, 17:1137-1142.

• 4 • ♦•4 *

* 4 • 9

4 4 *

4

4

4

4 4

4 ·· * 4 ♦ 444 ♦ 44

4

4 ♦ 4

4

Parkinsonova nemoc	MPTP (l-metyl-4- fenyl-1,2,3,6- tetrahydropyridin) toxicita u myši/krys	Cosi, C. a kol. Brain Res., 1998, 809(1):58-67. Cosi, C. a kol. Brain Res., 1996 , 729(2), 264- 269
Srdeční infarkt	Koronarární cévní okluze u krys, prasat a králíka	Richard, V. a kol., Br. J. Pharmacol. 1994, 113, 869- 876. Thiemermann, C. a kol, Proč. Nati. Acad. Sci USA. 1997, 94 (2) :679-83. Zingarelli, B. a kol., Cardiovasc. Res. 2 1997, 36(2):205-15.
	Langendorfův srdeční model u krys a králíků	Viz dále
Septický šok	Endotoxin šoku u krys	Szabo C a kol., J. Clin Invest, 1997, 100 (3), 723-735.
	Zymosanem nebo carrageenanem indukované vícenásobné selhání orgánů u krys a myší	Szabo, C. a kol. J. Exp Med. 1997, 186(7):1041-9. Cuzzocrea, S. a kol. Eur J. Pharmacol. 1998, 342 (1), 67-76.
Revmatická artritida	Adjuvantem nebo kolagenem indukovaná artritida u rys nebo myší	Szabo, C. a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA. 1998, 95(7):3867-72.
Diabetes	Streptozotocinem nebo alloxanem indukovaný nebo	Uchgata, Y. a kol., Diabetes 1983, 32, 316- 318. Masiello, P. a kol., Diabetologia 1985, 28,

·«

9 · · • · · · • ····♦

0 0 ·

0

0 0 • 0000 0 0 •

0·

0

0· · • · ·

	související s obezitou	Diabetologia 1985, 28, 683-686. Shimabukuro, M. a kol., J. Clin. Iryvest. 1997, 100, 290-295.
Rakovina	In vitro model, viz dále	Schlicker a kol., 1999, 75(1), 91-100.

a) model NMDA excitotoxicity

Glutamát je nejdůležitější excitační neurotransmiter v mozku. V normálním případě je glutamát secernován do synaptické štěrbiny a stimuluje post-synaptické glutamátové receptory, konkrétně glutamátové receptory typu NMDA a typu AMPA. Tato stimulace hraje nezastupitelnou úlohu v nesčetných funkcích mozku, mezi které je možné počítat učení, paměť a motorickou kontrolu.

V případě akutní a chronické neurodegenerace (například mrtvice) vznikne zvýšená presynaptická sekrece glutamátu, která tímto mechanismem v nadbytku stimuluje receptory. Zvýšená presynaptická sekrece glutamátu vede k smrti buněk stimulovaných touto cestou. Tyto zvýšené aktivity glutamátu vznikají u velkého počtu neurologických nemocí nebo psychologických poruch a vedou ke stavům nadměrné zvýšené excitace nebo toxickým efektům na centrální nervový systém (CNS) , ale také na periferní nervový systém. Glutamát je takto účasten na velkém počtu neurodegenerativních nemocí, obzvláště neurotoxických poruch, které následují po hypoxii, anoxii, ischemii a po lézích jako jsou léze, které vznikají po mrtvici a traumatu a mrtvici, Alzheimerově nemoci, Huntingtonově chorobě, amyotrofické lateralní • ··

4 ·

4

4444 4 4 ♦

4

4

• 4 44 skleróze (ALS; Lou Gehringova nemoc), lebečních traumatech, traumatech míchy, periferních neuropatiích, u s AIDS spojené demence a Parkinsonové chorobě. Jinou nemocí, ve které jsou glutamátové receptory důležité, je epilepsie (viz Brain Res Bull 1998; 46(4):281-309, Eur. Neuropsychopharmacol. 1998, 8(2):141-52.).

Účinky glutamátu jsou zprostředkované cestou různých receptorů. Jeden z těchto receptorů je nazýván NMDA (Nmetyl-D-aspartátový) receptor po specifickém agonistovi (Arzneim. Forschung 1990, 40, 511-514; TIPS, 1990, 11, 334338; Drugs of the Future 1989, 14, 1059-1071). N-Metyl-Daspartát je silným agonistou jedné třídy glutamátových receptorů (NMDA typu). Stimulace NMDA receptorů vede k influxu kalcia do buňky a k tvorbě volných radikálů. Volné radikály vedou k DNA poškození a aktivaci PARP. PARP jako taková způsobí buněčnou smrt cestou deplece makroergních fosfátů (NAD a ATP) v buňce. Deplece makroergních fosfátů vysvětluje toxicitu NMDA. Na působení prostřednictvím NMDA na zvířata se tedy může nahlížet jako na model výše uvedených nemocí, ve kterých je zavzata excitotoxicita.

Vzhledem k důležitosti glutamátových receptorů v neurodegenerativních chorobách bylo mnoho farmacologických přístupů do současnosti vedeno cestou specifického zablokování právě těchto receptorů. Nicméně tyto přístupy prokázaly, že jsou provázeny problémy (vedlejšími účinky), protože NMDA receptory jsou důležité v normálním vedení stimulu. Navíc je stimulace receptorů dějem, který proběhne velmi rychle tak, že podávání receptorů je často provázeno přílišným zpožděním (problém časového okna). Naskýtá se • φφφφ φ φ

ΦΦ · • · · • · · · • · ···« • · · • φ · zde tedy takto velká potřeba nových principů účinků a inhibitorů proti NMDA-spojené neurotoxicitě.

Na ochranu proti mozkové nadměrně zvýšené excitaci excitačními aminokyselinami (NMDA antagonismus u myši) může být pohlíženo jako na adekvátní důkaz aktivity efektorů PARP u nemocí založených na Intracerbrálním podáním excitačních aminokyselin (EAA) se indukuje tak masivní nadměrně zvýšená excitace, že tato masivní nadměrně zvýšená excitace vede během krátké doby ke křečím a smrti zvířete (myši).

farmakologického excitotoxicitě.

V uvedeném případě zde bylo podáno unilaterálě intracerebroventrikulárně množství 10 μΐ o síle 0,035 % vodného roztoku NMDA po uplynutí doby 120 minut po intraperitoneálním (i.p.) podání testované látky. Tyto symptomy mohou být inhibibovány systémovým, například intraperitoneálním, podáním centrálně účinkujících léků. Vzhledem k tomu, že nadměrná aktivace EAA receptorů v centrálním nervovém systému hraje důležitou roli v patogenezi různých neurologických nemocí, tak může být získána informace, z detekovaného EAA antagonizmu in vivo, o možném terapeutickém použití látky u takových nemocí centrálního nervového systému. ED50, při které je 50 % zvířat po předcházejícím intraperitoneálním podání měřené látky bez symptomů se stanovenou dávkou NMDA, byla určena jako míra aktivity látky.

b) Langendorfův model srdce (model srdečního infarktu)

Krysí samci Sprague-Dawley (tělesná hmotnost 300-400 g;

• · · · · • fl flflflfl · · • flfl ♦ • fl · • fl fl ·

• · • fl • · • fl narozeni v lednu, Le Genest-St-Isle, Francie) byly použiti pro test. Na krysy bylo působeno orálním podáním aktivní látky nebo placeba (objemově: 5 ml/kg). 0 50 minut později byl podáván heparin intraperitoneální cestou (Liquemin N Roche, 125 IU/zvířecích v 0,5 ml). Zvířata byla uvedena do narkózy za pomoci Inactinu® T133 (thiobetabarbital sodný v 10 % koncentraci), fixována na operačním stole, tracheotomizovaná a ventilovaná pomocí Harvard ventilátory pump (40 úderů/min, 4,5 ml/úder). Thorakotomie byla následována bezprostřední kateterizací aorty, odstraněním srdce a bezprostřední retrográdní perfuzí. Srdce byla perfundovaná při konstantním tlaku o hodnotě 75 mmHg, který je docílen za použití Gilson Miniplus 2 perfusion pump. Složení perfundované tekutiny (v mmol/1): NaCl 118, KCI 4,7, CaCl₂ x 2 H₂O 2,52, MgSO₄ x 7 H₂O 1,64, NaHCO₃ 24,88, KH₂PO₄ 1,18, glukóza 11. Teplot byla udržována na hodnotě 37 §C po dobu trvání pokusu. Funkční parametry byly neustále zaznamenávány za použití Gould 4-channel recorder. Měření hodnot byla provedena pro veličiny tlaku krve v levé komoře srdce (LVP; mmHg) , tlaku krve v levé komoře srdce na konci diastoly (LVEDP mmHg), uvolňování enzymů (kreatin kináza, mU/ml/g), velikost průtoku krve koronárním řečištěm (ml/min), HR (tepovou frekvenci, min' -¹) . Tlak krve v levé komoře srdce byl měřen za použití latexového balónu, který je plněný tekutinou a Statham23 Db tlakovým transduktorem. Objem balónu byl nejprve uzpůsoben tomu, aby dosáhl hodnoty tlaku krve v levé komoře srdce na konci diastoly LVEDP okolo hodnoty 12 mmHg. Hodnota dP/dt_max (maximální pumpovací síla) je odvozena ze signálu tlaku za použití difernciátoru modulu. Srdeční frekvence byla spočítaná ze signálu tlaku. Velikost průtoku byla určena za • φ ·· · ·* φφφ · · • ΦΦΦ φ φ ; ; ;·;· φ φ · ···· · · · φφφ φφ · φφ φφ použiti zařízení počítajícího kapky (drop counter) (BMT

Messtechnik GmbH Berlin) . Po ekvilibrační době 20 minut byla srdce vystavena po dobu 30 minut trvající globální ischemli, která vznikala zastavením perfuzní dodávky krve při teplotě udržovnané na hodnotě 37 §C. Během následující 60 minutové reperfúzní periody byly odebírány vzorky perfuzátu po době 3, 5, 10, 15, 30, 45 a 60 minut pro analýzu aktivity kreatin kinázy (CK). Hodnoty a standartní deviace měřených parametrů byly analyzovány statisticky (Dunnett test). Limit významnosti byl p=0,05.

Pokus na králičích srdcích byl proveden podobně. Byly použiti samci bíých Novozélandských králíků (získáných z Interfauna). Srdce byla připravena také způsobem, který je shodný se způsobem, který je výše uveden pro krysí model. Perfuzní tlak byl nastaven na maximální hodnotu 60 mmHg a velikost průtoku byla nastavena na hodnotu přibližně 25ml/min. Ekvilibrační čas byl okolo 30 minut. Látka byla podávána infuzí přímo proti proudu ze srdce. Po uplynutí 15 minut po začátku infúze byla provedena 30 minut trvající celková ischemie, která vznikla zastavením proudu krve zatímco se udržovala stálá teplota srdce. Potom následovala 30 minut trvající reperfuze. Perfuzát byl odebírán za účelem vyšetření aktivity kreatin kinázy (CK) před podáním látky, po uplynutí doby 15 minut a po uplynutí různě dlouhých dob (5, 10, 15, 20, 30 minut) během reperfuze.

Byly měřeny následující parametry: tlak krve v levé komoře srdce (LVP; mmHg) , tlak krve v levé komoře srdce na konci diastoly (LVEDP; mmHg), LVdP/dt, PP (mmHg), HR (srdeční CK aktivita (ϋ/min/g srdeční úderů/min), frekvence;

hmotnosti) • · • · · • · * • · ·♦·

c) Zvířecí modely pro akutní selhání ledvin

Byl zkoumán ochranný účinek intravenózního podávání PARP inhibitorů (po dobu 4 dnů) na funkci ledvin u krys s postischemickým akutním selháním ledvin.

Byly použiti krysí samci Sprague-Dawley (hmotnosti okolo 330 g na začátku pokusů; chovatel: Charles River). 10-15 zvířat byly použito v každé pokusné skupině. Podávání aktivní látky/placeba probíhalo neustále osmotickou mikropumpou do véna femoralis. Byly provedeny odběry krve z orbity (v množství 1,5 ml plné krve), během kterých byla zvířata v narkóze, do které byla uvedena inhalační cestou za pomoci enfluranu (Ethrane Abbot, Wiesbaden).

Po průvodních měřeních (krevního vzorku) a určení množství vyloučené moči za dobu 24 hodin, byly krysy uvedeny do narkózy (Nembutal, pentobarbital sodný, Sanofi CÉVA; 50mg/kg intraperitoneálně, objemově injikovaný v množství 1,0 ml/kg) a připevněny na operačním stole, který bylo možno zahřívat na teplotu 37§C. 125 IU/kg heparinu (Liquemin N, Roche) byly podáno intravenózně do véna caudalis. Bylo provedeno otevření břišní dutiny a bylo provedeno vypreparování pravé ledviny. Větvení arteria renalis bylo vypreparováno a při odstupu podvázáno za použití podvazů (Diefenbach 38mm). Levá arteria renalis byla podobně vypreparována a podvázána (při odstupu, asi v polovině cesty k ledvině). Během operace byla implantována osmotická mikropumpa do véna femoralis. Tenké střevo bylo reinzertováno a ztráta tekutin byla kompenzována vlažným • · • · · • · · · • · ···· ♦ · · ·· · *· · • 9 · • · * · • ♦ · ···· • · · ·· ·

0,9 % NaCl. Zvířata byla přikryta vlhkou pokrývkou a udržována v teple pod červeným světlem. Po 40 minutách byl zazamenáván vzhled ledvin a podvazy byly odstraněny, první pravý, potom levý. Tenké střevo byl vráceno nazpět a byly přidány 2 kapky antibiotik (Tardomyocel, Bayer) . Břišní stěna byla uzavřena sterilním kočičím střevem (Ethicon no.

4) a bylo na ni působeno ještě jednou 1 kapkou antibiotika. Epidermis byla zašita sterilním šicím materiálem Ethibond Exel (Ethicon) no. 3/0 a steh byl posprejován Nebacetin N (Yamanouchi) sprejem na rány. Desetina denní dávky lék/placebo byla podána intravenózně jako bolus.

Vzorky a krev byly odebírány pro zkoumání biochemických parametrů séru a moči: ionty sodíku, draslíku, kreatinin, proteiny (pouze u moči), ve dnech 1, 2 a 4 pokusu. Navíc byl zaznamenáván příjem potravy a spotřeba vody, tělesná hmotnost a objem moči. Po uplynutí 14 dnů byla zvířata utracena a ledviny byly zkoumány.

Zkoumání se netýkalo těch zvířat, která zemřela na infarkt během pokusu nebo u nichž se prokázal infarkt pomocí nekropsie provedené 14. den. Clearance kreatininu a exkreční frakce sodíku byly použity pro výpočet ledviných funkčních parametrů, ve srovnání se zvířaty, kterým bylo podáváno placebo.

d) In vitro model pro studium radiosenzitizace (nádorová terapie)

MCF-7-buňky (lidský karcinom prsu) byly kultivované v Dulbeccově pozměněném Eaglově médiu s 10 % teplem

4

9 • · · • · · 9 • 9 ···· • · · • 9 · · ·

9 9 4

9 9499 ·

9 9 ·

9 inaktivovaným FCS a 2 mM L-glutaminu. Buňky byly naočkovány přes noc v buněčných hustotách 100, 1000 nebo 10 000 buněk na jamku do 6 jamkové destičky a potom exponované ionizačnímu záření, jehož dávka se pohybovala v oblasti od 0 do 10 Gy (137CS, Shepard Mark, model 1-68A, rychlost ionizace 3,28 Gy/mín). 10 dnů po iradiaci byl pokus zkoumán způsobem, při kterém se kolonie s padesáti buňkami počítaly jako pozitivní.

e) Model mrtvice (fokální mozková ischemie; okluze MCA (arteria cerebri média) na kryse

Fokální ischemie byla provedena prostřednictvím kauterizace pravé distální MCA (arteria cerebri média) na SpragueDawley nebo Long-Evans krysách. Na krysy se mohlo působit před nebo po začátku okluze MCA (arteria cerebri média) modulátory proteinů podle předloženého vynálezu. Obvykle byly dávky vybírány v rozmezí hodnot 1-10 mg/kg (aplikace bolu), s možností následovně nepřetržité infuze 0,5-5 mg/kg/hodinu.

Krysy byly uvedeny do narkózy za pomoci halothanu ve směsi se 70 % dusíkem a se 30 % kyslíkem (4 % v počáteční fázi a 0,8-1,2 % během operace). Tělesná teplota byla neustále měřena rektálně a byla udržována na konstantní hodnotě při teplotě 37,5 §C ± 0,5 §C prostřednictvím oteplovacího blanketu, jehož funkci je možné kontrolovat. Katetr v ocasní žíle poskytoval možnost měření arteriálního krevního tlaku, arteriálního pH, (parciálního tlaku kyslíku Pa(0₂) a parciálního tlaku oxidu uhličitého Pa(C0₂). Potom byla provedena fokální iscehmie za použití způsoby Chen a kol.

·· ·· · • ·· • · « · ·

• ····· » · • · · ·

• · · · • ····» · · • · · · (Stroke 17: 738-743; 1986) nebo Liu a kol. (Am. J. physiol. 256: H589-593; 1989) prostřednictvím nepřetržité kauterizace distální části pravé MCA (arteria cerebri média). Když byla operace ukončena, byla zvířata udržována v teplém prostředí po dobu dalších 24 hodin. Potom byla zvířata utracena za použití C0₂ a dekapitována. Jejich mozky byly odebrány, zmrazený šokem (suchým ledem nebo tekutým dusíkem) a skladované při teplotě -80§C. Mozky byly nařezány na 0,02 mm tlusté plátky a každý dvacátý plátek byl použit pro následnou analýzu. Uvedené řezy byly obarveny za pomoci kresyl violetě (Nisslovo barvení). TTC (2,3,4-trifenyltetrazoliumchlorid) může být alternativně použit pro barvení. Velikost infarktu může potom být analyzována pod mikroskopem. Pro přesnou kvantifikaci může být použit počítačový software, který analyzuje obrazy (J. Cereb. Clood. Flow Metabol. 10: 290-293; 1990).

f) Septický šok

Na skupinu 10 samců myši C57/BL (tělesná hmotnost nabývá hodnot 18-20 g) bylo působeno LPS (lipopolysacharidem z E. coli, LDioo 20 mg/zvíře intravenózně) spolu s galaktozaminem (20 mg/zvíře intravenózně). Látka, která má být testovaná byla podána intraperitoneálně nebo intravenózně během tří po sobě následujících dnů (například 1 až 10 mg/kg), přičemž první dávka byla podána po uplynutí doby 30 minut po začátku působení lipopolysacharidem (LPS). Stupeň úmrtnosti byl určován každých 12 hodin. Alternativně může být také látka podána v několika dávkách, které jsou rozložené na několik dní.

• · • · · • 9 · · · • 9 · · · 9 9

g) Určení pozměněné genové exprese ve stárnoucích buňkách

Stárnutí buněk je simulováno změnou média buněčné kultury z úplného média na médium s redukovanou koncentrací séra a následně potom je analyzováno prostřednictvím kvantitativní PCR nebo Northern Blotingu (Linskens a kol., Nucleic Acids Res. 1995, 23(16): 3244-51). Jako typické markéry pro stárnutí kůže mohou být například použity kolagen nebo elastin. Jsou použity lidské fibroblasty nebo buněčné linie fibroblastů, který simulují stárnutí kůže. Modulátory proteinů podle předloženého vynálezu jsou přidány do média a je pozorován jejich účinek na změnu genové exprese. Může být pozorovaná zvýšená produkce elastinu v buňkách, u kterých je patrno snížení procesu stárnutí, které vzniklo prostřednictvím zmíněných modulátorů.

Zastupuj e:

dr. 0. Švorčík ·· · 0· 0 00 • · 0 0 0 · * · ·

0 0 0 0 0 0 0 0 · • 00000*0 »000000 0 • 0 · ·· · 0 ·

- 7 7αSeznam sekvencí (1) Obecné informace (i) Přihlašovatel (A) Jméno: BASF Aktiengesselscheft (B) Ulice:

(C) Město: Ludwigshafen (D) Země: Německo (E) Poštovní kód: 67065 (ii) Název vynálezu: Nové póly ADP ribóza polymerázové geny (iii) Počet sekvencí: 28 (iv) Počítačová forma (A) Typ média: floppy disk (B) Počítač: IBM PC compatible (C) Operační systém: PC DOS/MS DOS (D) Software: Patentln Relesase 1.0, Version 1.30 (EPO) (2) Informace pro SEQ ID NO: 1 (i) vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 1843 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) negativní orientace: ne (v) Původní zdroj:

(F) Typ tkáně: mozek (ix) Znaky:

(A) Jméno/klíč: CDS (B) Poloha: 3..1715 (D) Další informace: /produkt=poly ADP ribóza polymeráza (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 1

CC ATG GCG GCG CGG CGG CGA CGG AGC ACC GGC GGC GGC AGG GCG AGA 47

Met Ala Ala Arg Arg Arg Arg Ser Thr Gly Gly Gly Arg Ala Arg

10 15

GCA TTA AAT GAA AGC AAA AGA GTT AAT AAT GGC AAC ACG GCT CCA GAA Ala Leu Asn Glu Ser Lys Arg Val Asn Asn Gly Asn Thr Ala Pro Glu 20 25 30

GAC Asp

TCT TCC CCT GCC

AAG AAA ACT CGT AGA TGC CAG AGA CAG GAG TCG

143

Ser Ser

Pro 35

Ala

Lys Lys

Thr

Arg Arg Cys 40

Gin Arg

Gin 45

Glu

Ser

AAA

AAG

ATG

CCT

GTG

GCT

GGA

GGA

AAA

GCT

AAT

AAG

GAC

AGG

ACA

GAA

191

Lys

Lys

Met

Pro

Val

Ala

Gly

Gly

Lys

Ala

Asn

Lys

Asp

Arg

Thr

Glu

50

55

60

GAC

AAG

CAA

GAT

GAA

TCT

GTG

AAG

GCC

TTG

CTG

TTA

AAG

GGC

AAA

GCT

239

*

Asp

Lys

Gin

Asp

Glu

Ser

Val

Lys

Ala

Leu

Leu

Leu

Lys

Gly

Lys

Ala

65

70

75

CCT

GTG

GAC

CCA

GAG

TGT

ACA

GCC

AAG

GTG

GGG

AAG

GCT

CAT

GTG

TAT

287

*

Pro

Val

Asp

Pro

Glu

Cys

Thr

Ala

Lys

Val

Gly

Lys

Ala

His

Val

Tyr

80

85

90

95

TGT

GAA

GGA

AAT

GAT

GTC

TAT

GAT

GTC

ATG

CTA

AAT

CAG

ACC

AAT

CTC

335

Cys

Glu

Gly

Asn

Asp

Val

Tyr

Asp

Val

Met

Leu

Asn

Gin

Thr

Asn

Leu

100

105

110

CAG

TTC

AAC

AAC

AAC

AAG

TAC

TAT

CTG

ATT

CAG

CTA

TTA

GAA

GAT

GAT

383

Gin

Phe

Asn

Asn

Asn

Lys

Tyr

Tyr

Leu

Ile

Gin

Leu

Leu

Glu

Asp

Asp

115

120

125

GCC

CAG

AGG

AAC

TTC

AGT

GTT

TGG

ATG

AGA

TGG

GGC

CGA

GTT

GGG

AAA

431

Ala

Gin

Arg

Asn

Phe

Ser

Val

Trp

Met

Arg

Trp

Gly

Arg

Val

Gly

Lys

130

135

140

ATG

GGA

CAG

CAC

AGC

CTG

GTG

GCT

TGT

TCA

GGC

AAT

CTC

AAC

AAG

GCC

479

Met

Gly

Gin

His

Ser

Leu

Val

Ala

Cys

Ser

Gly

Asn

Leu

Asn

Lys

Ala

145

150

155

AAG

GAA

ATC

TTT

CAG

AAG

AAA

TTC

CTT

GAC

AAA

ACG

AAA

AAC

AAT

TGG

527

Lys

Glu

Ile

Phe

Gin

Lys

Lys

Phe

Leu

Asp

Lys

Thr

Lys

Asn

Asn

Trp

160

165

170

175

GAA

GAT

CGA

GAA

AAG

TTT

GAG

AAG

GTG

CCT

GGA

AAA

TAT

GAT

ATG

CTA

575

Glu

Asp

Arg

Glu

Lys

Phe

Glu

Lys

Val

Pro

Gly

Lys

Tyr

Asp

Met

Leu

180

185

190

CAG

ATG

GAC

TAT

GCC

ACC

AAT

ACT

CAG

GAT

GAA

GAG

GAA

ACA

AAG

AAA

623

Gin

Met

Asp

Tyr

Ala

Thr

Asn

Thr

Gin

Asp

Glu

Glu

Glu

Thr

Lys

Lys

195

200

205

GAG

GAA

TCT

CTT

AAA

TCT

ccc

TTG

AAG

CCA

GAG

TCA

CAG

CTA

GAT

CTT

671

Glu

Glu

Ser

Leu

Lys

Ser

Pro

Leu

Lys

Pro

Glu

Ser

Gin

Leu

Asp

Leu

-

210

215

220

CGG

GTA

CAG

GAG

TTA

ATA

AAG

TTG

ATC

TGT

AAT

GTT

CAG

GCC

ATG

GAA

719

Arg

Val

Gin

Glu

Leu

Ile

Lys

Leu

Ile

Cys

Asn

Val

Gin

Ala

Met

Glu

•

225

230

235

GAA

ATG

ATG

ATG

GAA

ATG

AAG

TAT

AAT

ACC

AAG

AAA

GCC

CCA

CTT

GGG

767

Glu

Met

Met

Met

Glu

Met

Lys

Tyr

Asn

Thr

Lys

Lys

Ala

Pro

Leu

Gly

240

245

250

255

AAG

CTG

ACA

GTG

GCA

CAA

ATC

AAG

GCA

GGT

TAC

CAG

TCT

CTT

AAG

AAG

815

Lys

Leu

Thr

Val

Ala

Gin

Ile

Lys

Ala

Gly

Tyr

Gin

Ser

Leu

Lys

Lys

- 79 «·· · · · · · · ···· · · · · 4· • 9 lt»t * · · ···· · · · • · · · · · · · • · · tt · · · ·

260 265 270

ATT GAG Tle Glu

GAT Asp

TGT ATT CGG GCT GGC CAG CAT GGA CGA GCT CTC ATG GAA

863

Cys 275

Ile

Arg

Ala

Gly

Gin 280

His

Gly

Arg

Ala

Leu 285

Met

Glu

GGA

TGC

AAT

GAA

TTC

TAC

ACC

AGG

ATT

CCG

CAT

GAC

TTT

GGA

CTC

CGT

911

Ala

Cys

Asn

Glu

Phe

Tyr

Thr

Arg

Ile

Pro

His

Asp

Phe

Gly

Leu

Arg

290

295

300

ACT

CCT

CCA

CTA

ATC

CGG

ACA

CAG

AAG

GAA

CTG

TCA

GAA

AAA

ATA

CAA

959

Thr

Pro

Pro

Leu

ile

Arg

Thr

Gin

Lys

Glu

Leu

Ser

Glu

Lys

Ile

Gin

305

310

315

TTA

CTA

GAG

GCT

TTG

GGA

GAC

ATT

GAA

ATT

GCT

ATT

AAG

CTG

GTG

AAA

1007

Leu

Leu

Glu

Ala

Leu

Gly

Asp

Ile

Glu

Ile

Ala

Ile

Lys

Leu

Val

Lys

320

325

330

335

ACA

GAG

CTA

CAA

AGC

CCA

GAA

CAC

CCA

TTG

GAC

CAA

CAC

TAT

AGA

AAC

1055

Thr

Glu

Leu

Gin

Ser

Pro

Glu

His

Pro

Leu

Asp

Gin

His

Tyr

Arg

Asn

340

345

350

CTA

CAT

TGT

GCC

TTG

CGC

CCC

CTT

GAC

CAT

GAA

AGT

TAC

GAG

TTC

AAA

1103

Leu

His

Cys

Ala

Leu

Arg

Pro

Leu

Asp

His

Glu

Ser

Tyr

Glu

Phe

Lys

355

360

365

GTG

ATT

TCC

CAG

TAC

CTA

CAA

TCT

ACC

CAT

GCT

CCC

ACA

CAC

AGC

GAC

1151

Val

Tle

Ser

Gin

Tyr

Leu

Gin

Ser

Thr

His

Ala

Pro

Thr

His

Ser

Asp

370

375

380

TAT

ACC

ATG

ACC

TTG

CTG

GAT

TTG

TTT

GAA

GTG

GAG

AAG

GAT

GGT

GAG

1199

Tyr

Thr

Met

Thr

Leu

Leu

Asp

Leu

Phe

Glu

Val

Glu

Lys

Asp

Gly

Glu

385

390

395

AAA

GAA

GCC

TTC

AGA

GAG

GAC

CTT

CAT

AAC

AGG

ATG

CTT

CTA

TGG

CAT

1247

Lys

Glu

Ala

Phe

Arg

Glu

Asp

Leu

His

Asn

Arg

Met

Leu

Leu

Trp

His

400

405

410

415

GGT

TCC

AGG

ATG

AGT

AAC

TGG

GTG

GGA

ATC

TTG

AGC

CAT

GGG

CTT

CGA

1295

Gly

Ser

Arg

Met

Ser

Asn

Trp

Val

Gly

Ile

Leu

Ser

His

Gly

Leu

Arg

420

425

430

ATT

GCC

CCA

CCT

GAA

GCT

CCC

ATC

ACA

GGT

TAC

ATG

TTT

GGG

AAA

GGA

1343

Ile

Ala

Pro

Pro

Glu

Ala

Pro

Ile

Thr

Gly

Tyr

Met

Phe

Gly

Lys

Gly

435

440

445

ATC

TAC

TTT

GCT

GAC

ATG

TCT

TCC

AAG

AGT

GCC

AAT

TAC

TGC

TTT

GCC

1391

Tle

Tyr

Phe

Ala

Asp

Met

Ser

Ser

Lys

Ser

Ala

Asn

Tyr

Cys

Phe

Ala

450

455

460

TCT

CGC

CTA

AAG

AAT

ACA

GGA

CTG

CTG

CTC

TTA

TCA

GAG

GTA

GCT

CTA

1439

Ser

Arg

Leu

Lys

Asn

Thr

Gly

Leu

Leu

Leu

Leu

Ser

Glu

Val

Ala

Leu

465

470

475

GGT

CAG

TGT

AAT

GAA

CTA

CTA

GAG

GCC

AAT

ČCT

AAG

GCC

GAA

GGA

TTG

1487

Gly

Gin

Cys

Asn

Glu

Leu

Leu

Glu

Ala

Asn

Pro

Lys

Ala

Glu

Gly

Leu

480

485

490

495

CTT

CAA

GGT

AAA

CAT

AGC

ACC

AAG

GGG

CTG

GGC

AAG

ATG

GCT

CCC

AGT

1535

• 0

- 80 0 0 · 0 0 · • • 0 0 0 * ·*0 • •00 0 00* *0 • 0000000 0000000 0 0·· 00* 00 00 · 00 0 000

Leu Gin

Gly

Lys

His 500

Ser

Thr

Lys Gly Leu Gly Lys Met Ala Pro

Ser

505

510

TCT

GCC

CAG

TTC

GTC

ACC

CTG

AAT

GGG

AGT

ACA

GTG

CCA

TTA

GGA

CCA

1583

Ser

Ala

His

Phe

Val

Thr

Leu

Asn

Gly

Ser

Thr

Val

Pro

Leu

Gly

Pro

515

520

525

GCA

AGT

GAC

ACA

GGA

ATT

CTG

AAT

CCA

GAT

GGT

TAT

ACC

CTC

AAC

TAC

1631

Ala

Ser

Asp

Thr

Gly

Ile

Leu

Asn

Pro

Asp

Gly

Tyr

Thr

Leu

Asn

Tyr

530

535

540

AAT

GAA

TAT

ATT

GTA

TAT

AAC

CCC

AAC

CAG

GTC

CGT

ATG

CGG

TAC

CTT

1679

Asn

Glu

Tyr

Ile

Val

Tyr

Asn

Pro

Asn

Gin

Val

Arg

Met

Arg

Tyr

Leu

545

550

555

TTA

AAG

GTT

CAG

TTT

AAT

TTC

CTT

CAG

CTG

TGG

TGA

ATGTTGATAT

1725

Leu

Lys

Val

Gin

Phe

Asn

Phe

Leu

Gin

Leu

Trp

*

560 565 570

TAAATAAACC AGAGATCTGA TCTTCAAGCA AGAAAATAAG CAGTGTTGTA CTTGTGAATT 1785

TTGTGATATT TTATGTAATA AAAACTGTAC AGGTCTAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAA 1843 (2) Informace pro SEQ ID NO: 2 (í) vlastností sekvence:

(A) Délka: 571 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein

	(xi) Popis	sekvence:	SEQ	ID	NO:	2
Met 1	Ala Ala Arg	Arg Arg Arg 5	Ser	Thr	Gly 10	Gly Gly Arg Ala Arg Ala 15
Leu	Asn Glu Ser 20	Lys Arg Val	Asn	Asn 25	Gly	Asn Thr Ala Pro Glu Asp 30
Ser	Ser Pro Ala 35	Lys Lys Thr	Arg 40	Arg	Cys	Gin Arg Gin Glu Ser Lys 45
Lys	Met Pro Val 50	Ala Gly Gly 55	Lys	Ala	Asn	Lys Asp Arg Thr Glu Asp 60
Lys 65	Gin Asp Glu	Ser Val Lys 70	Ala	Leu	Leu	Leu Lys Gly Lys Ala Pro 75 80
Val	Asp Pro Glu	Cys Thr Ala 85	Lys	Val	Gly 90	Lys Ala His Val Tyr Cys 95
Glu	Gly Asn Asp 100	Val Tyr Asp	Val	Met 105	Leu	Asn Gin Thr Asn Leu Gin 110
Phe	Asn Asn Asn 115	Lys Tyr Tyr	Leu 120	Ile	Gin	Leu Leu Glu Asp Asp Ala 125

Gin Arg Asn Phe Ser Val Trp Met Arg Trp Gly Arg Val Gly Lys Met • * · · · · *

- 81 • · · • · · • · · · • · · · · · • · ·

1.30 135 140

Gly 145

Gin

His

Ser

Leu

Val 150

Ala

Cys

Ser

Gly

Asn 155

Leu

Asn

Lys

Ala

Lys 160

Glu

Lle

Phe

Gin

Lys 165

Lys

Phe

Leu

Asp

Lys 170

Thr

Lys

Asn

Asn

Trp 175

Glu

Asp

Arg

Glu

Lys 180

Phe

Glu

Lys

Val

Pro 185

Gly

Lys

Tyr

Asp

Met 190

Leu

Gin

Met

Asp

Tyr 195

Ala

Thr

Asn

Thr

Gin 200

Asp

Glu

Glu

Glu

Thr 205

Lys

Lys

Glu

Glu

Ser 210

Leu

Lys

Ser

Pro

Leu 215

Lys

Pro

Glu

Ser

Gin 220

Leu

Asp

Leu

Arg

Val 225

Gin

Glu

Leu

Ile

Lys 230

Leu

Ile

Cys

Asn

Val 235

Gin

Ala

Met

Glu

Glu 240

Met

Met

Met

Glu

Met 245

Lys

Tyr

Asn

Thr

Lys 250

Lys

Ala

Pro

Leu

Gly 255

Lys

Leu

Thr

Val

Ala 260

Gin

Ile

Lys

Ala

Gly 265

Tyr

Gin

Ser

Leu

Lys 270

Lys

Ile

Glu

Asp

Cys 275

Ile

Arg

Ala

Gly

Gin 280

His

Gly

Arg

Ala

Leu 285

Met

Glu

Ala

Cys

Asn 290

Glu

Phe

Tyr

Thr

Arg 295

Ile

Pro

His

Asp

Phe 300

Gly

Leu

Arg

Thr

Pro 305

Pro

Leu

Ile

Arg

Thr 310

Gin

Lys

Glu

Leu

Ser 315

Glu

Lys

Ile

Gin

Leu 320

Leu

Glu

Ala

Leu

Gly 325

Asp

Ile

Glu

lle

Ala 330

Ile

Lys

Leu

Val

Lys 335

Thr

Glu

Leu

Gin

Ser 340

Pro

Glu

His

Pro

Leu 345

Asp

Gin

His

Tyr

Arg 350

Asn

Leu

His

Cys

Ala 355

Leu

Arg

Pro

Leu

Asp 360

His

Glu

Ser

Tyr

Glu 365

Phe

Lys

Val

Ile

Ser 370

Gin

Tyr

Leu

Gin

Ser 375

Thr

His

Ala

Pro

Thr 380

His

Ser

Asp

Tyr

Thr 385

Met

Thr

Leu

Leu

Asp 390

Leu

Phe

Glu

Val

Glu 395

Lys

Asp

Gly

Glu

Lys 400

Glu

Ala

Phe

Arg

Glu 405

Asp

Leu

His

Asn

Arg 410

Met

Leu

Leu

Trp

His 415

Gly

Ser

Arg

Met

Ser 420

Asn

Trp

Val

Gly

Ile 425

Leu

Ser

His

Gly

Leu 430

Arg

Ile

Ala

Pro

Pro 435

GlU

Ala

Pro

Ile

Thr 440

Gly

Tyr

Met

Phe

Gly 445

Lys

Gly

Ile

Tyr Phe Ala Asp Met Ser Ser Lys Ser Ala Asn Tyr Cys Phe Ala Ser • · · · • · · ♦ · •9999 9 9

- 82 450 455 460

Arg Leu Lys Asn Thr Gly Leu Leu Leu Leu Ser Glu Val Ala Leu Gly

465

470

475

480

Gin

Cys

Asn

Glu

Leu

Leu

Glu

Ala

Asn

Pro

Lys

Ala

Glu

Gly

Leu

Leu

485

490

495

Gin

Gly

Lys

His

Ser

Thr

Lys

Gly

Leu

Gly

Lys

Met

Ala

Pro

Ser

Ser

500

505

510

Ala

His

Phe

Val

Thr

Leu

Asn

Gly

Ser

Thr

Val

Pro

Leu

Gly

Pro

Ala

515

520

525

Ser

Asp

Thr

Gly

Ile

Leu

Asn

Pro

Asp

Gly

Tyr

Thr

Leu

Asn

Tyr

Asn

530

535

540

Glu

Tyr

Ila

Val

Tyr

Asn

Pro

Asn

Gin

Val

Arg

Met

Arg

Tyr

Leu

Leu

545

550

555

560

Lys

val

Gin

Phe

Asn

Phe

Leu

Gin

Leu

Trp

*

565 570 (2) Informace pro SEQ ID NO: 3 (i) vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 2265 párů bází (B) Typ: nukleové kyselina (C) Vláknitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) negativní orientace: ne (v) Původní zdroj:

(F) Typ tkáně: uterus (ix) Znaky:

(A) Jméno/klíč: CDS (B) Poloha: 242..1843 (D) Další informace: /produkt=poly ADP ribóza polymeráza (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 3

TGGGACTGGT CGCCTGACTC GGCCTGCCCC AGCCTCTGCT TCACCCCACT GGTGGCCAAA 60

TAGCCGATGT CTAATCCCCC ACACAAGCTC ATCCCCGGCC TCTGGGATTG TTGGGAATTC 120

TCTCCCTAAT TCACGCCTGA GGCTCATGGA GAGTTGCTAG ACCTGGGACT GCCCTGGGAG 180

GCGCACACAA CCAGGCCGGG TGGCAGCCAG GACCTCTCCC ATGTCCCTGC TTTTCTTGGC 240

C ATG GCT CCA AAG CCG AAG CCC TGG GTA CAG ACT GAG GGC CCT GAG 286

Met Ala Pro Lys Pro Lys Pro Trp Val Gin Thr Glu Gly Pro Glu • ·

- 83 575 580 585

AAG Lys

AAG AAG

GGC Gly 590

CGG CAG GCA GGA

AGG Arg 595

GAG GAG GAC CCC

TTC CGC TCC

334

Lys

Lys

Arg

Gin

Ala

Gly

Glu

Glu

Asp

Pro

Phe 600

Arg

Ser

ACC

GCT

GAG

GCC

CTC

AAG

GCC

ATA

CCC

GCA

GAG

AAG

CGC

ATA

ATC

CGC

382

Thr

Ala

Glu 605

Ala

Leu

Lys

Ala

Ile 610

Pro

Ala

Glu

Lys

Arg 615

Ile

Ile

Arg

GTG

GAT

CCA

ACA

TGT

CCA

CTC

AGC

AGC

AAC

CCC

GGG

ACC

CAG

GTG

TAT

430

Val

Asp 620

Pro

Thr

Cys

Pro

Leu 625

Ser

Ser

Asn

Pro

Gly 630

Thr

Gin

Val

Tyr

GAG

GAC

TAC

AAC

TGC

ACC

CTG

AAC

CAG

ACC

AAC

ATC

GAG

AAC

AAC

AAC

478

Glu 635

Asp

Tyr

Asn

Cys

Thr 640

Leu

Asn

Gin

Thr

Asn 645

Ile

Glu

Asn

Asn

Asn 650

AAC

AAG

TTC

TAC

ATC

ATC

CAG

CTG

CTC

CAA

GAC

AGC

AAC

CGC

TTC

TTC

526

Asn

Lys

Phe

Tyr

Ile 655

Ile

Gin

Leu

Leu

Gin 660

Asp

Ser

Asn

Arg

Phe 665

Phe

ACC

TGC

TGG

AAC

CGC

TGG

GGC

CGT

GTG

GGA

GAG

GTC

GGC

CAG

TCA

AAG

574

Thr

cys

Trp

Asn 670

Arg

Trp

Gly

Arg

Val 675

Gly

Glu

Val

Gly

Gin 680

Ser

Lys

ATC

AAC

CAC

TTC

ACA

AGG

CTA

GAA

GAT

GCA

AAG

AAG

GAC

TTT

GAG

AAG

622

Ile

Asn

His 685

Phe

Thr

Arg

Leu

Glu 690

Asp

Ala

Lys

Lys

Asp 695

Phe

Glu

Lys

AAA

TTT

CGG

GAA

AAG

ACC

AAG

AAC

AAC

TGG

GCA

GAG

CGG

GAC

CAC

TTT

670

Lys

Phe 700

Arg

Glu

Lys

Thr

Lys 705

Asn

Asn

Trp

Ala

Glu 710

Arg

Asp

His

Phe

GTG

TCT

CAC

CCG

GGC

AAG

TAC

ACA

CTT

ATC

GAA

GTA

CAG

GCA

GAG

GAT

718

Val 715

Ser

His

Pro

Gly

Lys 720

Tyr

Thr

Leu

Ile

Glu 725

Val

Gin

Ala

Glu

Asp 730

GAG

GCC

CAG

GAA

GCT

GTG

GTG

AAG

GTG

GAC

AGA

GGC

CCA

GTG

AGG

ACT

766

Glu

Ala

Gin

Glu

Ala 735

Val

Val

Lys

Val

Asp 740

Arg

Gly

Pro

Val

Arg 745

Thr

GTG

ACT

AAG

CGG

GTG

CAG

CCC

TGC

TCC

CTG

GAC

CCA

GCC

ACG

CAG

AAG

814

Val

Thr

Lys

Arg 750

Val

Gin

Pro

Cys

Ser 755

Leu

Asp

Pro

Ala

Thr 760

Gin

Lys

CTC

ATC

ACT

AAC

ATC

TTC

AGC

AAG

GAG

ATG

TTC

AAG

AAC

ACC

ATG

GCC

862

Leu

Ile

Thr 765

Asn

Ile

Phe

Ser

Lys 770

Glu

Met

Phe

Lys

Asn 775

Thr

Met

Ala

CTC

ATG

GAC

CTG

GAT

GTG

AAG

AAG

ATG

CCC

CTG

GGA

AAG

CTG

AGC

AAG

910

Leu

Met 780

Asp

Leu

Asp

Val

Lys 785

Lys

Met

Pro

Leu

Gly 790

Lys

Leu

Ser

Lys

CAA

CAG

ATT

GCA

CGG

GGT

TTC

GAG

GCC

TTG

GAG

GCG

CTG

GAG

GAG

GCC

958

Gin 795

Gin

Ile

Ala

Arg

Gly 800

Phe

Glu

Ala

Leu

Glu 805

Ala

Leu

Glu

Glu

Ala 810

CTG

AAA

GGC

CCC

ACG

GAT

GGT

GGC

CAA

AGC

CTG

GAG

GAG

CTG

TCC

TCA

1006

• φ · φφφφφ « ·

- 84 • · • · φ • φφφφ

Leu

Lys

Gly

Pro

Thr 815

Asp

Gly

Gly

Gin

Ser 820

Leu

Glu

Glu

Leu

Ser 825

Ser

CAC

T?TT

TAC

ACC

GTC

ATC

CCG

CAC

AAC

TTC

GGC

CAC

AGC

CAG

CCC

CCG

1054

His

Phe

Tyr

Thr 830

Val

Ile

Pro

His

Asn 835

Phe

Gly

His

Ser

Gin 840

Pro

Pro

ccc

ATC

AAT

TCC

CCT

GAG

CTT

CTG

CAG

GCC

AAG

AAG

GAC

ATG

CTG

CTG

1102

Pro

Ile

Asn 845

Ser

Pro

Glu

Leu

Leu 850

Gin

Ala

Lys

Lys

Asp 855

Met

Leu

Leu

GTG

CTG

GCG

GAC

ATC

GAG

CTG

GCC

CAG

GCC

CTG

CAG

GCA

GTC

TCT

GAG

1150

Val

Leu 860

Ala

Asp

Ile

Glu

Leu 865

Ala

Gin

Ala

Leu

Gin 870

Ala

Val

Ser

Glu

CAG

GAG

AAG

ACG

GTG

GAG

GAG

GTG

CCA

CAC

CCC

CTG

GAC

CGA

GAC

TAC

1198

Gin 875

Glu

Lys

Thr

Val

Glu 880

Glu

Val

Pro

His

Pro 885

Leu

Asp

Arg

Asp

Tyr 890

CAG

CTT

CTC

AAG

TGC

CAG

CTG

CAG

CTG

CTA

GAC

TCT

GGA

GCA

CCT

GAG

1246

Gin

Leu

Leu

Lys

Cys 895

Gin

Leu

Gin

Leu

Leu 900

Asp

Ser

Gly

Ala

Pro 905

Glu

TAC

AAG

GTG

ATA

CAG

ACC

TAC

TTA

GAA

CAG

ACT

GGC

AGC

AAC

CAC

AGG

1294

Tyr

Lys

Val

Ile 910

Gin

Thr

Tyr

Leu

Glu 915

Gin

Thr

Gly

Ser

Asn 920

His

Arg

TGC

CCT

ACA

CTT

CAA

CAC

ATC

TGG

AAA

GTA

AAC

CAA

GAA

GGG

GAG

GAA

1342

Cys

Pro

Thr 925

Leu

Gin

His

Ile

Trp 930

Lys

Val

Asn

Gin

GlU 935

Gly

Glu

Glu

GAC

AGA

TTC

CAG

GCC

CAC

TCC

AAA

CTG

GGT

AAT

CGG

AAG

CTG

CTG

TGG

1390

Asp

Arg 940

Phe

Gin

Ala

His

Ser 945

Lys

Leu

Gly

Asn

Arg 950

Lys

Leu

Leu

Trp

CAT

GGC

ACC

AAC

ATG

GCC

GTG

GTG

GCC

GCC

ATC

CTC

ACT

AGT

GGG

CTC

1438

His 955

Cly

Thr

Asn

Met

Ala 960

Val

Val

Ala

Ala

Ile 965

Leu

Thr

Ser

Gly

Leu 970

CGC

ATC

ATG

CCA

CAT

TCT

GGT

GGG

CGT

GTT

GGC

AAG

GGC

ATC

TAC

TTT

1486

Arg

Ile

Met

Pro

His 975

Ser

Gly

Gly

Arg

Val 980

Gly

Lys

Gly

Ile

Tyr 985

Phe

GCC

TCA

GAG

AAC

AGC

AAG

TCA

GCT

GGA

TAT

GTT

ATT

GGC

ATG

AAG

TGT

1534

Ala

Ser

Glu

Asn 990

Ser

Lys

Ser

Ala

Gly 995

Tyr

Val

Ile

Gly

Met Lys 1000

Cys

GGG

GCC

CAC

CAT

GTC

GGC

TAC

ATG

TTC

CTG

GGT

GAG

GTG

GCC

CTG

GGC

1582

Gly

Ala

His His 1005

Val

Gly

Tyr

Met Phe 1010

Leu

Gly

Glu

Val Ala 1015

Leu

Gly

AGA

GAG

CAC

CAT

ATC

AAC

ACG

GAC

AAC

CCC

AGC

TTG

AAG

AGC

CCA

CCT

1630

Arg

Glu His 1020

His

Ile

Asn

Thr Asp 1025

Asn

Pro

Ser

Leu Lys 1030

Ser

Pro

Pro

CCT

GGC

TTC

GAC

AGT

GTC

ATT

GCC

CGA

GGC

CAC

ACC

GAG

CCT

GAT

CCG

1678

Pro Gly Phe 1035

Asp

Ser

val Ile 1040

Ala

Arg

Gly

His Thr 1045

Glu

Pro

Asp

Pro 1050

·· · ·· * *· • · · · · · ··· ···· *··· ·* • · ··♦· · · · ···· « · · • · · ··· · · ·· · ·· · ·· ·

ACC Thr

CAG Gin

GAC Asp

ACT Thr

GAG TTG Glu Leu 1055

GAG Glu

CTG Leu

GAT Asp

GGC CAG Gly Gin 1060

CAA Gin

GTG Val

GTG Val

GTG CCC Val Pra 1065

1726

CAG

GGC

CAG

CCT

GTG CCC

TGC

CCA

GAG

TTC AGC

AGC

TCC

ACA

TTC TCC

1774

Gin

Gly

Gin

Pro

Val Pro

Cys

Pro

Glu

Phe Ser

Ser

Ser

Thr

Phe Ser

1070

1075

1080

CAG

AGC

GAG

TAC

CTC ATC

TAC

CAG

GAG

AGC CAG

TGT

CGC

CTG

CGC TAC

1822

Gin

Ser

Glu

Tyr

Leu Ile

Tyr

Gin

Glu

Ser Gin

Cys

Arg

Leu Arg Tyr

10S5

1090

1095

CTG	CTG GAG	GTC	CAC	CTC	TGA GTGCCCGCCC TGTCCCCCGG GGTCCTGCAA	1873
Leu	Leu Glu	Val	His	Leu	★
	1100				1105

GGCTGGACTG	TGATCTTCAA	TCATCCTGCC	CATCTCTGGT	ACCCCTATAT	CACTCCTTTT	1933
TTTCAAGAAT	ACAATACGTT	GTTGTTAACT	ATAGTCACCA	TGCTGTACAA	GATCCCTGAA	1993
CTTATGCCTC	CTAACTGAAA	TTTTGTATTC	TTTGACACAT	CTGCCCAGTC	CCTCTCCTCC	2053
CAGCCCATGG	TAACCAGCAT	TTGACTCTTT	ACTTGTATAA	GGGCAGCTTT	TATAGGTTCC	2113
ACATGTAAGT	GAGATCATGC	AGTGTTTGTC	TTTCTGTGCC	TGGCTTATTT	CACTCAGCAT	2173
AATGTGCACC	GGGTTCACCC	ATGTTTTCAT	AAATGACAAG	ATTTCCTCCT	TTAAAAAAAA	2233
AAAAAAAAAA	AAAAAAAAAA	AAAAAAAAAA	AA			2265

(2) Informace pro SEQ ID NO: 4 (i) vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 534 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein

	(xi) Popis	sekvence:	SEQ	ID NO:	4
Met 1	Ala Pro Lys	Pro Lys Pro 5	Trp	Val Gin 10	Thr Glu Gly Pro Glu Lys 15
Lys	Lys Gly Arg 20	Gin Ala Gly	Arg	Glu Glu 25	Asp Pro Phe Arg Ser Thr 30
Ala	Glu Ala Leu 35	Lys Ala Ile	Pro 40	Ala Glu	Lys Arg Ile Ile Arg Val 45
Asp	Pro Thr Cys 50	Pro Leu Ser 55	Ser	Asn Pro	Gly Thr Gin Val Tyr Glu 60
Asp 65	Tyr Asn Cys	Thr Leu Asn 70	Gin	Thr Asn	Ile Glu Asn Asn Asn Asn 75 80
Lys	Phe Tyr Ile	Ile Gin Leu 85	Leu	Gin Asp 90	Ser Asn Arg Phe Phe Thr 95

Cys Trp Asn Arg Trp Gly Arg Val Gly Glu Val Gly Gin Ser Lys Ile φ φ

- 86 φ φ φφφφ

ΦΦΦ φ φφφφ

100 105 110

Asn

His

Phe

Thr

Arg

Leu

Glu

Asp

Ala

Lys

Lys

Asp

Phe

Glu

Lys

Lys

115

120

125

Phe

Arg

Glu

Lys

Thr

Lys

Asn

Asn

Trp

Ala

Glu

Arg

Asp

His

Phe

Val

130

135

140

Ser

His

Pro

Gly

Lys

Tyr

Thr

Leu

Ile

Glu

Val

Gin

Ala

Glu

Asp

Glu

145

150

155

160

Ala

Gin

Glu

Ala

Val

Val

Lys

Val

Asp

Arg

Gly

Pro

Val

Arg

Thr

Val

165

170

175

Thr

Lys

Arg

Val

Gin

Pro

Cys

Ser

Leu

Asp

Pro

Ala

Thr

Gin

Lys

Leu

180

185

190

Ile

Thr

Asn

Ile

Phe

Ser

Lys

Glu

Met

Phe

Lys

Asn

Thr

Met

Ala

Leu

195

200

205

Met

Asp

Leu

Asp

Val

Lys

Lys

Met

Pro

Leu

Gly

Lys

Leu

Ser

Lys

Gin

210

215

220

Gin

Ile

Ala

Arg

Gly

Phe

Glu

Ala

Leu

Glu

Ala

Leu

Glu

Glu

Ala

Leu

225

230

235

240

Lys

Gly

Pro

Thr

Asp

Gly

Gly

Gin

Ser

Leu

Glu

Glu

Leu

Ser

Ser

His

245

250

255

Phe

Tyr

Thr

Val

Ile

Pro

His

Asn

Phe

Gly

His

Ser

Gin

Pro

Pro

Pro

260

265

270

Ile

Asn

Ser

Pro

Glu

Leu

Leu

Gin

Ala

Lys

Lys

Asp

Met

Leu

Leu

Val

275

280

285

Leu

Ala

Asp

Ile

Glu

Leu

Ala

Gin

Ala

Leu

Gin

Ala

Val

Ser

Glu

Gin

290

295

300

Glu

Lys

Thr

Val

Glu

Glu

Val

Pro

His

Pro

Leu

Asp

Arg

Asp

Tyr

Gin

305

310

315

320

Leu

Leu

Lys

Cys

Gin

Leu

Gin

Leu

Leu

Asp

Ser

Gly

Ala

Pro

Glu

Tyr

325

330

335

Lys

Val

Ile

Gin

Thr

Tyr

Leu

Glu

Gin

Thr

Gly

Ser

Asn

His

Arg

Cys

340

345

350

Pro

Thr

Leu

Gin

His

Ile

Trp

Lys

Val

Asn

Gin

Glu

Gly

Glu

Glu

Asp

355

360

365

Arg

Phe

Gin

Ala

His

Ser

Lys

Leu

Gly

Asn

Arg

Lys

Leu

Leu

Trp

His

370

375

380

Gly

Thr

Asn

Met

Ala

Val

Val

Ala

Ala

Ile

Leu

Thr

Ser

Gly

Leu

Arg

385

390

395

400

Ile

Met

Pro

His

Ser

Gly

Gly

Árg

Val

Gly

Lys

Gly

Ile

Tyr

Phe

Ala

405

410

415

Ser Glu Asn Ser Lys Ser Ala Gly Tyr Val Ile Gly Met Lys Cys Gly

- 87 ·· · ·· · ·· ··. «·« · · · *««· · · · · ·· • · ·«·· · · · ···· . · * «·· · · · ·* ·· · ·· · ·· ·

420 425 430

Ala His

His Val Gly Tyr Met Phe Leu Gly Glu Val Ala Leu Gly Arg

435

440

445

Glu

His

HiS

Ile

Asn

Thr

Asp

Asn

Pro

Ser

Leu

Lys

Ser

Pro

Pro

Pro

450

455

460

Gly

Phe

Asp

Ser

Val

Ile

Ala

Arg

Gly

His

Thr

Glu

Pro

Asp

Pro

Thr

465

470

475

480

Gin

Asp

Thr

Glu

Leu

GlU

Leu

Asp

Gly

Gin

Gin

Val

Val

Val

Pro

Gin

485

490

495

Gly

Gin

Pro

Val

Pro

Cys

Pro

Glu

Phe

Ser

Ser

Ser

Thr

Phe

Ser

Gin

500

505

510

Ser

Glu

Tyr

Leu

Ile

Tyr

Gin

Glu

Ser

Gin

Cys

Arg

Leu

Arg

Tyr

Leu

515

520

525

Leu

Glu

Val

His

Leu

*

530 (2) Informace pro SEQ ID NO: 5 (i) vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 2265 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) negativní orientace: ne (v) Původní zdroj:

(F) Typ tkáně: uterus (ix) Znaky:

(A) Jméno/klíč: CDS (B) Poloha: 221..1843 (D) Další informace: /produkt=poly ADP ribóza polymeráza (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 5

TGGGACTGGT CGCCTGACTC GGCCTGCCCC AGCCTCTGCT TCACCCCACT GGTGGCCAAA 60

TAGCCGATGT CTAATCCCCC ACACAAGCTC ATCCCCGGCC TCTGGGATTG TTGGGAATTC 120

TCTCCCTAAT TCACGCCTGA GGCTCATGGA GAGTTGCTAG ACCTGGGACT GCCCTGGGAG 180

GCGCACACAA CCAGGCCGGG TGGCAGCCAG GACCTCTCCC ATG TCC CTG CTT TTC 235

Met Ser Leu Leu Phe 535

TTG GCC ATG GCT CCA AAG CCG AAG CCC TGG GTA CAG ACT GAG GGC CCT 283 • · • · · • · · · · • · > · 4 » · · · » 4 4 444 » · 4 ·

• 4

Leu Ala Met 540

Ala Pro Lys 545

Pro

Lys

Pro Trp Val Gin Thr Glu Gly Pro

550

555

GAG

AAG

AAG

AAG

GGC

CGG

CAG

GCA

GGA

AGG

GAG

GAG

GAC

CCC

TTC

CGC

331

Glu

Lys

Lys

Lys

Gly

Arg

Gin

Ala

Gly

Arg

Glu

Glu

Asp

Pro

Phe

Arg

560

565

570

TCC

ACC

GCT

GAG

GCC

CTC

AAG

GCC

ATA

CCC

GCA

GAG

AAG

CGC

ATA

ATC

379

Ser

Thr

Ala

Glu

Ala

Leu

Lys

Ala

Ile

Pro

Ala

Glu

Lys

Arg

ile

Ile

575

580

585

CGC

GTG

GAT

CCA

ACA

TGT

CCA

CTC

AGC

AGC

AAC

CCC

GGG

ACC

CAG

GTG

427

Arg

Val

Asp

Pro

Thr

Cys

Pro

Leu

Ser

Ser

Asn

Pro

Gly

Thr

Gin

Val

590

595

600

TAT

GAG

GAC

TAC

AAC

TGC

ACC

CTG

AAC

CAG

ACC

AAC

ATC

GAG

AAC

AAC

475

Tyr

Glu

Asp

Tyr

Asn

Cys

Thr

Leu

Asn

Gin

Thr

Asn

Ile

Glu

Asn

Asn

605

610

615

AAC

AAC

AAG

TTC

TAC

ATC

ATC

CAG

CTG

CTC

CAA

GAC

AGC

AAC

CGC

TTC

523

Asn

Asn

Lys

Phe

Tyr

Ile

Ile

Gin

Leu

Leu

Gin

Asp

Ser

Asn

Arg

Phe

620

625

630

635

TTC

ACC

TGC

TGG

AAC

CGC

TGG

GGC

CGT

GTG

GGA

GAG

GTC

GGC

CAG

TCA

571

Phe

Thr

Cys

Trp

Asn

Arg

Trp

Gly

Arg

val

Gly

Glu

Val

Gly

Gin

Ser

640

645

650

AAG

ATC

AAC

CAC

TTC

ACA

AGG

CTA

GAA

GAT

GCA

AAG

AAG

GAC

TTT

GAG

619

Lys

Ile

Asn

His

Phe

Thr

Arg

Leu

Glu

Asp

Ala

Lys

Lys

Asp

Phe

Glu

655

660

665

AAG

AAA

TTT

CGG

GAA

AAG

ACC

AAG

AAC

AAC

TGG

GCA

GAG

CGG

GAC

CAC

667

Lys

Lys

Phe

Arg

Glu

Lys

Thr

Lys

Asn

Asn

Trp

Ala

Glu

Arg

Asp

His

670

675

680

TTT

GTG

TCT

CAC

CCG

GGC

AAG

TAC

ACA

CTT

ATC

GAA

GTA

CAG

GCA

GAG

715

Phe

Val

Ser

His

Pro

Gly

Lys

Tyr

Thr

Leu

Ile

Glu

Val

Gin

Ala

Glu

685

690

695

GAT

GAG

GCC

CAG

GAA

GCT

GTG

GTG

AAG

GTG

GAC

AGA

GGC

CCA

GTG

AGG

763

Asp

Glu

Ala

Gin

Glu

Ala

Val

Val

Lys

Val

Asp

Arg

Gly

Pro

Val

Arg

700

705

710

715

ACT

GTG

ACT

AAG

CGG

GTG

CAG

CCC

TGC

TCC

CTG

GAC

CCA

GCC

ACG

CAG

811

Thr

Val

Thr

Lys

Arg

Val

Gin

Pro

Cys

Ser

Leu

Asp

Pro

Ala

Thr

Gin

720

725

730

AAG

CTC

ATC

ACT

AAC

ATC

TTC

AGC

AAG

GAG

ATG

TTC

AAG

AAC

ACC

ATG

359

Lys

Leu

Ile

Thr

Asn

Ile

Phe

Ser

Lys

Glu

Met

Phe

Lys

Asn

Thr

Met

735

740

745

GCC

CTC

ATG

GAC

CTG

GAT

GTG

AAG

AAG

ATG

CCC

CTG

GGA

AAG

CTG

AGC

907

Ala

Leu

Met

Asp

Leu

Asp

Val

Lys

Lys

Met

Pro

Leu

Gly

Lys

Leu

Ser

750

755

760

AAG

CAA

CAG

ATT

GCA

CGG

GGT

TTC

GAG

GCC

TTG

GAG

GCG

CTG

GAG

GAG

955

Lys

Gin

Gin

Ile

Ala

Arg

Gly

Phe

Glu

Ala

Leu

Glu

Ala

Leu

Glu

Glu

765

770

775

GCC Ala 780

CTG AAA GGC

CCC ACG

GAT GGT GGC CAA AGC CTG GAG GAG CTG TCC

1003

Leu

Lys

Gly

Pro

Thr 785

Asp

Gly Gly

Gin

Ser 790

Leu

Glu

Glu

Leu

Ser 795

TCA

CAC

TTT

TAC

ACC

GTC

ATC

CCG

CAC

AAC

TTC

GGC

CAC

AGC

CAG

CCC

1051

Ser

His

Phe

Tyr

Thr

Val

Ile

Pro

His

Asn

Phe

Gly

His

Ser

Gin

Pro

800

805

810

CCG

CCC

ATC

AAT

TCC

CCT

GAG

CTT

CTG

CAG

GCC

AAG

AAG

GAC

ATG

CTG

1099

Pro

Pro

Ile

Asn

Ser

Pro

Glu

Leu

Leu

Gin

Ala

Lys

Lys

Asp

Met

Leu

815

820

825

CTG

GTG

CTG

GCG

GAC

ATC

GAG

CTG

GCC

CAG

GCC

CTG

CAG

GCA

GTC

TCT

1147

Leu

Val

Leu

Ala

Asp

Ile

Glu

Leu

Ala

Gin

Ala

Leu

Gin

Ala

Val

Ser

830

835

840

GAG

CAG

GAG

AAG

ACG

GTG

GAG

GAG

GTG

CCA

CAC

CCC

CTG

GAC

CGA

GAC

1195

Glu

Gin

Glu

Lys

Thr

Val

Glu

Glu

Val

Pro

His

Pro

Leu

Asp

Arg

Asp

845

850

855

TAC

CAG

CTT

CTC

AAG

TGC

CAG

CTG

CAG

CTG

CTA

GAC

TCT

GGA

GCA

CCT

1243

Tyr

Gin

Leu

Leu

Lys

Cys

Gin

Leu

Gin

Leu

Leu

Asp

Ser

Gly

Ala

Pro

860

865

870

875

GAG

TAC

AAG

GTG

ATA

CAG

ACC

TAC

TTA

GAA

CAG

ACT

GGC

AGC

AAC

CAC

1291

Glu

Tyr

Lys

Val

Ile

Gin

Thr

Tyr

Leu

Glu

Gin

Thr

Gly

Ser

Asn

His

380

885

890

AGG

TGC

CCT

ACA

CTT

CAA

CAC

ATC

TGG

AAA

GTA

AAC

CAA

GAA

GGG

GAG

1339

Arg

Cys

Pro

Thr

Leu

Gin

His

Ile

Trp

Lys

Val

Asn

Gin

Glu

Gly

Glu

895

900

905

GAA

GAC

AGA

TTC

CAG

GCC

CAC

TCC

AAA

CTG

GGT

AAT

CGG

AAG

CTG

CTG

1387

Glu

Asp

Arg

Phe

Gin

Ala

His

Ser

Lys

Leu

Gly

Asn

Arg

Lys

Leu

Leu

910

915

920

TGG

CAT

GGC

ACC

AAC

ATG

GCC

GTG

GTG

GCC

GCC

ATC

CTC

ACT

AGT

GGG

1435

Trp

His

Gly

Thr

Asn

Met

Ala

Val

Val

Ala

Ala

Ile

Leu

Thr

Ser

Gly

925

930

935

CTC

CGC

ATC

ATG

CCA

CAT

TCT

GGT

GGG

CGT

GTT

GGC

AAG

GGC

ATC

TAC

1483

Leu

Arg

Ile

Met

Pro

His

Ser

Gly

Gly

Arg

Val

Gly

Lys

Gly

Ile

Tyr

940

945

950

955

TTT

GCC

TCA

GAG

AAC

AGC

AAG

TCA

GCT

GGA

TAT

GTT

ATT

GGC

ATG

AAG

1531

Phe

Ala

Ser

Glu

Asn

Ser

Lys

Ser

Ala

Gly

Tyr

Val

Ile

Gly

Met

Lys

960

965

970

TGT

GGG

GCC

CAC

CAT

GTC

GGC

TAC

ATG

TTC

CTG

GGT

GAG

GTG

GCC

CTG

1579

Cys

Gly

Ala

His

His

val

Gly

Tyr

Met

Phe

Leu

Gly

Glu

Val

Ala

Leu

975

980

985

GGC

AGA

GAG

CAC

CAT

ATC

AAC

ACG

GAC

AAC

CCC

AGC

TTG

AAG

AGC

CCA

1627

Gly

Arg

Glu

His

His

Ile

Asn

Thr

Asp

Asn

Pro

Ser

Leu

Lys

Ser

Pro

990

995

1000

CCT

CCT

GGC

TTC

GAC

AGT

GTC

ATT

GCC

CGA

GGC

CAC

ACC

GAG

CCT

GAT

1675

Pro

Pro

Gly

Phe

Asp

Ser

Val

Ile

Ala

Arg

Gly

His

Thr

Glu

Pro

Asp

φφ • · • · · • φφφφ φ φ φ φ φφ φ • φ · • · · · • φ φ φ φ φ φφφ

1005 1010 1015

CCG ACC Pro Thr 1020	CAG Gin	GAC ACT Asp Thr	GAG TTG GAG CTG GAT GGC CAG CAA GTG GTG GTG	1723
Glu Leu 1025	Glu Leu	Asp	Gly Gin 1030	Gin Val	Val	Val 1035
CCC CAG	GGC	CAG CCT	GTG CCC	TGC CCA	GAG	TTC AGC	AGC TCC	ACA	TTC	1771
Pro Gin	Gly	Gin Pro	Val Pro	Cys Pro	Glu	Phe Ser	Ser Ser	Thr	Phe
		1040		1045		1050
TCC CAG	AGC	GAG TAC	CTC ATC	TAC CAG	GAG	AGC CAG	TGT CGC	CTG	CGC	1819
Ser Gin	Ser	Glu Tyr	Leu Ile	Tyr Gin	Glu	Ser Gin	Cys Arg	Leu	Arg
		1055		1060		1065
TAC CTG	CTG	GAG GTC	CAC CTC	TGA GTGCCCGCCC TGTCCCCCGG GGTCCTGCAA	1873
Tyr Leu	Leu	Glu Val	His Leu	ic
	1070		1075

GGCTGGACTG	TGATCTTCAA	TCATCCTGCC	CATCTCTGGT	ACCCCTATAT	CACTCCTTTT	1933
TTTCAAGAAT	ACAATACGTT	GTTGTTAACT	ATAGTCACCA	TGCTGTACAA	GATCCCTGAA	1993
CTTATGCCTC	CTAACTGAAA	TTTTGTATTC	TTTGACACAT	CTGCCCAGTC	CCTCTCCTCC	2053
CAGCCCATGG	TAACCAGCAT	TTGACTCTTT	ACTTGTATAA	GGGCAGCTTT	TATAGGTTCC	2113
ACATGTAAGT	GAGATCATGC	AGTGTTTGTC	TTTCTGTGCC	TGGCTTATTT	CACTCAGCAT	2173
AATGTGCACC	GGGTTCACCC	ATGTTTTCAT	AAATGACAAG	ATTTCCTCCT	TTAAAAAAAA	2233
ΑΑΑΑΑΑΑΆΑΑ	ΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑ	ΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑ	AA			2265

(2) Informace pro SEQ ID NO: 6 (i) vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 541 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein

	(xi) Popis	sekvence:	SEQ	ID NO:	6
Met 1	Ser Leu Leu	Phe Leu Ala 5	Met	Ala Pro 10	Lys Pro Lys Pro Trp Val 15
Gin	Thr Glu Gly 20	Pro Glu Lys	Lys	Lys Gly 25	Arg Gin Ala Gly Arg Glu 30
Glu	Asp Pro Phe 35	Arg Ser Thr	Ala 40	Glu Ala	Leu Lys Ala Ile Pro Ala 45
Glu	Lys Arg Ile 50	Ile Arg Val 55	Asp	Pro Thr	Cys Pro Leu Ser Ser Asn 60
Pro 65	Gly Thr Gin	Val Tyr Glu 70	Asp	Tyr Asn	Cys Thr Leu Asn Gin Thr 75 80
Asn	Ile Glu Asn	Asn Asn Asn	Lys	Phe Tyr	Ile Ile Gin Leu Leu Gin

• ·

- 91 85 90 95

Asp Ser Asn Arg

Phe

Phe Thr Cys

Trp Asn Arg Trp Gly Arg Val

Gly

100

105

110

Glu

Val

Gly

Gin

Ser

Lys

Ile

Asn

His

Phe

Thr

Arg

Leu

Glu

Asp

Ala

115

120

125

Lys

Lys

Asp

Phe

Glu

Lys

Lys

Phe

Arg

Glu

Lys

Thr

Lys

Asn

Asn

Trp

130

135

140

Ala

Glu

Arg

Asp

His

Phe

Val

Ser

His

Pro

Gly

Lys

Tyr

Thr

Leu

Ile

145

150

155

160

Glu

Val

Gin

Ala

Glu

Asp

Glu

Ala

Gin

Glu

Ala

Val

Val

Lys

Val

Asp

165

170

175

Arg

Gly

Pro

Val

Arg

Thr

Val

Thr

Lys

Arg

Val

Gin

Pro

Cys

Ser

Leu

180

185

190

Asp

Pro

Ala

Thr

Gin

Lys

Leu

Ile

Thr

Asn

Ile

Phe

Ser

Lys

Glu

Met

195

200

205

Phe

Lys

Asn

Thr

Met

Ala

Leu

Met

Asp

Leu

Asp

Val

Lys

Lys

Met

Pro

210

215

220

Leu

Gly

Lys

Leu

Ser

Lys

Gin

Gin

Ile

Ala

Arg

Gly

Phe

Glu

Ala

Leu

225

230

235

240

Glu

Ala

Leu

Glu

Glu

Ala

Leu

Lys

Gly

Pro

Thr

Asp

Gly

Gly

Gin

Ser

245

250

255

Leu

Glu

Glu

Leu

Ser

Ser

His

Phe

Tyr

Thr

Val

Ile

Pro

His

Asn

Phe

260

265

270

Gly

His

Ser

Gin

Pro

Pro

Pro

Ile

Asn

Ser

Pro

Glu

Leu

Leu

Gin

Ala

275

280

285

Lys

Lys

Asp

Met

Leu

Leu

Val

Leu

Ala

Asp

Ile

Glu

Leu

Ala

Gin

Ala

290

295

300

Leu

Gin

Ala

Val

Ser

Glu

Gin

Glu

Lys

Thr

Val

Glu

Glu

Val

Pro

His

305

310

315

320

Pro

Leu

Asp

Arg

Asp

Tyr

Gin

Leu

Leu

Lys

Cys

Gin

Leu

Gin

Leu

Leu

325

330

335

Asp

Ser

Gly

Ala

Pro

Glu

Tyr

Lys

Val

Ile

Gin

Thr

Tyr

Leu

Glu

Gin

340

345

350

Thr

Gly

Ser

Asn

His

Arg

Cys

Pro

Thr

Leu

Gin

His

Ile

Trp

Lys

Val

355

360

365

Asn

Gin

Glu

Gly

Glu

Glu

Asp

Arg

Phe

Gin

Ala

His

Ser

Lys

Leu

Gly

370

375

380

Asn

Arg

Lys

Leu

Leu

Trp

His

Gly

Thr

Asn

Met

Ala

Val

Val

Ala

Ala

385

390

395

400

Ile Leu Thr Ser Gly Leu Arg Ile Met Pro His Ser Gly Gly Arg Val

- 92 ·· · • · · • » · · • ·· ··« • · · ·» · ·· < *· z » · * · a • a a < a · a a · aaaa a a · » a a a ·

405 410 415

Gly Lys Gly Ile 420

Tyr Phe Ala

Ser

Glu Asn Ser Lys Ser Ala Gly Tyr

425

430

Val

Ile

Gly

Met

Lys

cys

Gly

Ala

His

His

Val

Gly

Tyr

Met

Phe

Leu

435

440

445

Gly

Glu

Val

Ala

Leu

Gly

Arg

Glu

His

His

Ile

Asn

Thr

Asp

Asn

Pro

450

455

460

Ser

Leu

Lys

Ser

Pro

Pro

Pro

Gly

Phe

Asp

Ser

Val

Ile

Ala

Arg

Gly

465

470

475

480

His

Thr

Glu

Pro

Asp

Pro

Thr

Gin

Asp

Thr

Glu

Leu

Glu

Leu

Asp

Gly

485

490

495

Gin

Gin

Val

Val

Val

Pro

Gin

Gly

Gin

Pro

Val

Pro

Cys

Pro

Glu

Phe

500

505

510

Ser

Ser

Ser

Thr

Phe

Ser

Gin

Ser

Glu

Tyr

Leu

Ile

Tyr

Gin

Glu

Ser

515

520

525

Gin

Cys

Arg

Leu

Arg

Tyr

Leu

Leu

Glu

Val

His

Leu

it

530

535

540

(2) Informace pro SEQ ID NO: 7 (i) vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 1740 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) negativní orientace: ne (v) Původní zdroj:

(A) Organismus: Mus musculus (ix) Znaky:

(A) Jméno/klíč: CDS (B) Poloha: 112..1710 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 7

CCCGGCTTTC ACTTTTTCTG CTGCCTCGGG GAACACCTCG AGCCAACTGC TTCCTAACTC 60

AGGGTGGGCA GAACTGACGG GATCTAAGCT TCTGCATCTC TGAGGAGAAC C ATG GCT 117

Met Ala

CCA AAA CGA AAG GCC TCT GTG CAG ACT GAG GGC TCC AAG AAG CAG CGA Pro Lys Arg Lys Ala Ser Val Gin Thr Glu Gly Ser Lys Lys Gin Arg

545 550 555

165 ·· · • ·

CAA Gin 560

GGG ACA GAG GAG

GAG GAC AGC

TTC CGG TCC ACT GCC GAG GCT CTC

213

Gly

Thr

Glu

Glu

Glu 565

Asp Ser

Phe

Arg

Ser Thr Ala Glu Ala Leu

570

575

AGA

GCA

GCA

CCT

GCT

GAT

AAT

CGG

GTC

ATC

CGT

GTG

GAC

CCC

TCA

TGT

261

Arg

Ala

Ala

Pro

Ala

Asp

Asn

Arg

val

Ile

Arg

Val

Asp

Pro

Ser

Cys

580

585

590

CCA

TTC

AGC

CGG

AAC

CCC

GGG

ATA

CAG

GTC

CAC

GAG

GAC

TAT

GAC

TGT

309

Pro

Phe

Ser

Arg

Asn

Pro

Gly

Ile

Gin

Val

His

Glu

Asp

Tyr

Asp

Cys

595

600

605

ACC

CTG

AAC

CAG

ACC

AAC

ATC

GGC

AAC

AAC

AAC

AAC

AAG

TTC

TAT

ATT

357

Thr

Leu

Asn

Gin

Thr

Asn

Ile

Gly

Asn

Asn

Asn

Asn

Lys

Phe

Tyr

Ile

610

615

620

ATC

CAA

CTG

CTG

GAG

GAG

GGT

AGT

CGC

TTC

TTC

TGC

TGG

AAT

CGC

TGG

405

Ile

Gin

Leu

Leu

Glu

Glu

Gly

Ser

Arg

Phe

Phe

Cys

Trp

Asn

Arg

Trp

625

630

635

GGC

CGC

GTG

GGA

GAG

GTG

GGC

CAG

AGC

AAG

ATG

AAC

CAC

TTC

ACC

TGC

453

Gly

Arg

Val

Gly

Glu

Val

Gly

Gin

Ser

Lys

Met

Asn

His

Phe

Thr

Cys

640

645

650

655

CTG

GAA

GAT

GCA

AAG

AAG

GAC

TTT

AAG

AAG

AAA

TTT

TGG

GAG

AAG

ACT

501

Leu

Glu

Asp

Ala

Lys

Lys

Asp

Phe

Lys

Lys

Lys

Phe

Trp

Glu

Lys

Thr

660

665

670

AAA

AAC

AAA

TGG

GAG

GAG

CGG

GAC

CGT

TTT

GTG

GCC

CAG

CCC

AAC

AAG

549

Lys

Asn

Lys

Trp

Glu

Glu

Arg

Asp

Arg

Phe

Val

Ala

Gin

Pro

Asn

Lys

675

680

685

TAC

ACA

CTT

ATA

GAA

GTC

CAG

GGA

GAA

GCA

GAG

AGC

CAA

GAG

GCT

GTA

597

Tyr

Thr

Leu

Ile

Glu

Val

Gin

Gly

Glu

Ala

GlU

Ser

Gin

Glu

Ala

Val

690

695

700

GTG

AAG

GCC

TTA

TCT

CCC

CAG

GTG

GAC

AGC

GGC

CCT

GTG

AGG

ACC

GTG

645

Val

Lys

Ala

Leu

Ser

Pro

Gin

Val

Asp

Ser

Gly

Pro

Val

Arg

Thr

Val

705

710

715

GTC

AAG

CCC

TGC

TCC

CTA

GAC

CCT

GCC

ACC

CAG

AAC

CTT

ATC

ACC

AAC

693

Val

Lys

Pro

Cys

Ser

Leu

Asp

Pro

Ala

Thr

Gin

Asn

Leu

Ile

Thr

Asn

720

725

730

735

ATC

TTC

AGC

AAA

GAG

ATG

TTC

AAG

AAC

GCA

ATG

ACC

CTC

ATG

AAC

CTG

741

Ile

Phe

Ser

Lys

Glu

Met

Phe

Lys

Asn

Ala

Met

Thr

Leu

Met

Asn

Leu

740

745

750

GAT

GTG

AAG

AAG

ATG

CCC

TTG

GGA

AAG

CTG

ACC

AAG

CAG

CAG

ATT

GCC

789

Asp

Val

Lys

Lys

Met

Pro

Leu

Gly

Lys

Leu

Thr

Lys

Gin

Gin

Ile

Ala

755

760

765

CGT

GGC

TTC

GAG

GCC

TTG

GAA

GCT

CTA

GAG

GAG

GCC

ATG

AAA

AAC

CCC

837

Arg

Gly

Phe

Glu

Ala

Leu

Glu

Ala

Leu

Glu

Glu

Ala

Met

Lys

Asn

Pro

770

775

780

ACA

GGG

GAT

GGC

CAG

AGC

CTG

GAA

GAG

CTC

TCC

TCC

TGC

TTC

TAC

ACT

885

Thr

Gly

Asp

Gly

Gin

Ser

Leu

Glu

Glu

Leu

Ser

Ser

Čys

Phe

Tyr

Thr

• ·

0 0

Φ 0·

0·

- 94 • 000

785 790 795

GTC ATC CCA

CAC His

AAC TTC GGC CGC

AGC CGA CCC CCG CCC ATC AAC TCC

933

Val 800

Ile

Pro

Asn

Phe Gly 805

Arg

Ser

Arg

Pro 810

Pro

Pro

Ile

Asn

Ser 815

CCT

GAT

GTG

CTT

CAG

GCC

AAG

AAG

GAC

ATG

CTG

CTG

GTG

CTA

GCG

GAC

981

Pro

Asp

Val

Leu

Gin

Ala

Lys

Lys

Asp

Met

Leu

Leu

Val

Leu

Ala

Asp

820

825

830

ATC

GAG

TTG

GCG

CAG

ACC

TTG

CAG

GCA

GCC

CCT

GGG

GAG

GAG

GAG

GAG

1029

Ile

Glu

Leu

Ala

Gin

Thr

Leu

Gin

Ala

Ala

Pro

Gly

Glu

Glu

Glu

Glu

835

840

845

AAA

GTG

GAA

GAG

GTG

CCA

CAC

CCA

CTG

GAT

CGA

GAC

TAC

CAG

CTC

CTC

1077

Lys

Val

Glu

Glu

Val

Pro

His

Pro

Leu

Asp

Arg

Asp

Tyr

Gin

Leu

Leu

850

855

860

AGG

TGC

CAG

CTT

CAA

CTG

CTG

GAC

TCC

GGG

GAG

TCC

GAG

TAC

AAG

GCA

1125

Arg

Cys

Gin

Leu

Gin

Leu

Leu

Asp

Ser

Gly

Glu

Ser

Glu

Tyr

Lys

Ala

865

870

875

ATA

CAG

ACC

TAC

CTG

AAA

CAG

ACT

GGC

AAC

AGC

TAC

AGG

TGC

CCA

AAC

1173

Ile

Gin

Thr

Tyr

Leu

Lys

Gin

Thr

Gly

Asn

Ser

Tyr

Arg

cys

Pro

Asn

880

885

890

895

CTG

CGG

CAT

GTT

TGG

AAA

GTG

AAC

CGA

GAA

GGG

GAG

GGA

GAC

AGG

TTC

1221

Leu

Arg

His

Val

Trp

Lys

Val

Asn

Arg

Glu

Gly

Glu

Gly

Asp

Arg

Phe

900

905

910

CAG

GCC

CAC

TCC

AAA

CTG

GGC

AAT

CGG

AGG

CTG

CTG

TGG

CAC

GGC

ACC

1269

Gin

Ala

His

Ser

Lys

Leu

Gly

Asn

Arg

Arg

Leu

Leu

Trp

His

Gly

Thr

915

920

925

AAT

GTG

GCC

GTG

GTG

GCT

GCC

ATC

CTC

ACC

AGT

GGG

CTC

CGA

ATC

ATG

1317

Asn

Val

Ala

Val

Val

Ala

Ala

Ile

Leu

Thr

Ser

Gly

Leu

Arg

Ile

Met

930

935

940

CCA

CAC

TCG

GGT

GGT

CGT

GTT

GGC

AAG

GGT

ATT

TAT

TTT

GCC

TCT

GAG

1365

Pro

His

Ser

Gly

Gly

Arg

Val

Gly

Lys

Gly

Ile

Tyr

Phe

Ala

Ser

Glu

945

950

955

AAC

AGC

AAG

TCA

GCT

GGC

TAT

GTT

ACC

ACC

ATG

CAC

TGT

GGG

GGC

CAC

1413

Asn

Ser

Lys

Ser

Ala

Gly

Tyr

Val

Thr

Thr

Met

His

Cys

Gly

Gly

His

960

965

970

975

CAG

GTG

GGC

TAC

ATG

TTC

CTG

GGC

GAG

GTG

GCC

CTC

GGC

AAA

GAG

CAC

1461

Gin

Val

Gly

Tyr

Met

Phe

Leu

Gly

Glu

Val

Ala

Leu

Gly

Lys

Glu

His

980

985

990

CAC

ATC

ACC

ATC

GAT

GAC

CCC

AGC

TTG

AAG

AGT

CCA

CCC

CCT

GGC

TTT

1509

His

Ile

Thr

Ile

Asp

Asp

Pro

Ser

Leu

Lys

Ser

Pro

Pro

Pro

Gly

Phe

995

1000

1005

GAC

AGC

GTC

ATC

GCC

CGA

GGC

CAA

ACC

GAG

CCG

GAT

CCC

GCC

CAG

GAC

1557

Asp

Ser

Val

Ile

Ala

Arg

Gly

Gin

Thr

Glu

Pro

Asp

Pro

Ala

Gin

Asp

1010

1015

1020

ATT

GAA

CTT

GAA

CTG

GAT

GGG

CAG

CCG

GTG

GTG

GTG

CCC

CAA

GGC

CCG

1605

• · · • · · · • · · · · * ·

- 95 *· 9 • · « • · · · • · · · · · • » ·

ile

Glu Leu 1025

Glu

Leu

Asp

Gly Gin 1030

Pro

Val

Val Val Pro 1035

Gin

Gly

Pro

CCT

GIG

CAG

TGC

CCG

TCA

TTC

AAA

AGC

ICC

AGC TTC

AGC

CAG

AGT

GAA

1653

Pro 1040

Val 1

Gin

Cys

Pro

Ser 1045

Phe

Lys

Ser

Ser

Ser Phe 1050

Ser

Gin

Ser

Glu 1055

TAC

CTC

ATA

TAC

AAG

GAG

AGC

CAG

TGT

CGC

CTG CGC

TAC

CTG

CTG

GAG

1701

Tyr

Leu

Ile

Tyr

Lys Glu 1060

Ser

Gin

Cys

Arg Leu Arg 1065

Tyr

Leu

Leu 1070

Glu 1

ATT CAC CTC TAAGČTGCTT GCCCTCCCTA GGTCCAAGCC 1740

Ile His Leu (2) Informace pro SEQ ID NO: 8 (i) vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 533 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 8

Met 1

Ala

Pro

Lys

Arg 5

Lys

Ala

Ser

Val

Gin 10

Thr

Glu

Gly

Ser

Lys 15

Lys

Gin

Arg

Gin

Gly 20

Thr

Glu

Glu

Glu

Asp 25

Ser

Phe

Arg

Ser

Thr 30

Ala

Glu

Ala

Leu

Arg 35

Ala

Ala

Pro

Ala

Asp 40

Asn

Arg

Val

Ile

Arg 45

Val

Asp

Pro

Ser

Cys 50

Pro

Phe

Ser

Arg

Asn 55

Pro

Gly

Ile

Gin

Val 60

His

Glu

Asp

Tyr

Asp 65

Cys

Thr

Leu

Asn

Gin 70

Thr

Asn

Ile

Gly

Asn 75

Asn

Asn

Asn

Lys

Phe 80

Tyr

Ile

Ile

Gin

Leu 85

Leu

Glu

Glu

Gly

Ser 90

Arg

Phe

Phe

Cys

Trp 95

Asn

Arg

Trp

Gly

Arg 100

Val

Gly

Glu

Val

Gly 105

Gin

Ser

Lys

Met

Asn 110

His

Phe

Thr

Cys

Leu 115

Glu

Asp

Ala

Lys

Lys 120

Asp

Phe

Lys

Lys

Lys 125

Phe

Trp

Glu

Lys

Thr 130

Lys

Asn

Lys

Trp

Glu 135

Glu

Arg

Asp

Arg

Phe 140

Val

Ala

Gin

Pro

Asn 145

Lys

Tyr

Thr

Leu

Ile 150

Glu

Val

Gin

Gly

Glu 155

Ala

Glu

Ser

Gin

Glu 160

Ala

Val

Val

Lys

Ala 165

Leu

Ser

Pro

Gin

Val 170

Asp

Ser

Gly

Pro

Val 175

Arg

Thr Val Val Lys Pro Cys Ser Leu Asp Pro Ala Thr Gin Asn Leu Ile

180 185 190

Thr

Asn

Ile 195

Phe

Ser

Lys Glu

Met Phe Lys Asn Ala Met Thr Leu Met

200

205

Asn

Leu

Asp

Val

Lys

Lys

Met

Pro

Leu

Gly

Lys

Leu

Thr

Lys

Gin

Gin

210

215

220

Ile

Ala

Arg

Gly

Phe

Glu

Ala

Leu

Glu

Ala

Leu

Glu

Glu

Ala

Met

Lys

225

230

235

240

Asn

Pro

Thr

Gly

Asp

Gly

Gin

Ser

Leu

Glu

Glu

Leu

Ser

Ser

Cys

Phe

245

250

255

Tyr

Thr

Val

Ile

Pro

His

Asn

Phe

Gly

Arg

Ser

Arg

Pro

Pro

Pro

Ile

260

265

270

Asn

Ser

Pro

Asp

Val

Leu

Gin

Ala

Lys

Lys

Asp

Met

Leu

Leu

Val

Leu

275

280

285

Ala

Asp

Ile

Glu

Leu

Ala

Gin

Thr

Leu

Gin

Ala

Ala

Pro

Gly

Glu

Glu

290

295

300

Glu

Glu

Lys

Val

Glu

Glu

Val

Pro

His

Pro

Leu

Asp

Arg

Asp

Tyr

Gin

305

310

315

320

Leu

Leu

Arg

Cys

Gin

Leu

Gin

Leu

Leu

Asp

Ser

Gly

Glu

Ser

Glu

Tyr

325

330

335

Lys

Ala

Ile

Gin

Thr

Tyr

Leu

Lys

Gin

Thr

Gly

Asn

Ser

Tyr

Arg

Cys

340

345

350

Pro

Asn

Leu

Arg

His

Val

Trp

Lys

Val

Asn

Arg

Glu

Gly

Glu

Gly

Asp

355

360

365

Arg

Phe

Gin

Ala

His

Ser

Lys

Leu

Gly

Asn

Arg

Arg

Leu

Leu

Trp

His

370

375

380

Gly

Thr

Asn

Val

Ala

Val

Val

Ala

Ala

Ile

Leu

Thr

Ser

Gly

Leu

Arg

385

390

395

400

Ile

Met

Pro

His

Ser

Gly

Gly

Arg

Val

Gly

Lys

Gly

Ile

Tyr

Phe

Ala

405

410

415

Ser

Glu

Asn

Ser

Lys

Ser

Ala

Gly

Tyr

Val

Thr

Thr

Met

His

Cys

Gly

420

425

430

Gly

His

Gin

Val

Gly

Tyr

Met

Phe

Leu

Gly

Glu

Val

Ala

Leu

Gly

Lys

435

440

445

Glu

His

His

Ile

Thr

Ile

Asp

Asp

Pro

Ser

Leu

Lys

Ser

Pro

Pro

Pro

450

455

460

Gly

Phe

Asp

Ser

Val

Ile

Ala

Arg

Gly

Gin

Thr

Glu

Pro

Asp

Pro

Ala

465

470

475

480

Gin

Asp

Ile

Glu

Leu

Glu

Leu

Asp

Gly

Gin

Pro

Val

val

Val

Pro

Gin

485

490

495

Gly

Pro

Pro

Val

Gin

Cys

Pro

Ser

Phe

Lys

Ser

Ser

Ser

Phe

Ser

Gin

> · · · · > · · ► · *

- 97 500 505 510

Ser	Glu Tyr Leu Ile Tyr Lys Glu Ser Gin Cys Arg Leu Arg Tyr Leu
515	520	525
Lea	Glu Ile His	Leu
	530

(2) Informace pro SEQ ID NO: 9 (i) vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 1587 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Vláknitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: ne (iv) negativní orientace: ne (v) Původní zdroj:

(A) Organismus: Mus musculus (ix) Znaky:

(A) Jméno/klíč: CDS (B) Poloha: 1..1584 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 9

ATG GCT

CCA AAA CGA AAG

GCC TCT GTG CAG ACT GAG GGC TCC AAG AAG

48

Met

Ala 535

Pro Lys

Arg

Lys

Ala 540

Ser

Val Gin

Thr Glu 545

Gly

Ser Lys

Lys

CAG

CGA

CAA

GGG

ACA

GAG

GAG

GAG

GAC

AGC

TTC

CGG

TCC

ACT

GCC

GAG

96

Gin

Arg

Gin

Gly

Thr

Glu

Glu

Glu

Asp

Ser

Phe

Arg

Ser

Thr

Ala

Glu

550

555

560

565

GCT

CTC

AGA

GCA

GCA

CCT

GCT

GAT

AAT

CGG

GTC

ATC

CGT

GTG

GAC

CCC

144

Ala

Leu

Arg

Ala

Ala

Pro

Ala

Asp

Asn

Arg

Val

Ile

Arg

Val

Asp

Pro

570

575

580

TCA

TGT

CCA

TTC

AGC

CGG

AAC

CCC

GGG

ATA

CAG

GTC

CAC

GAG

GAC

TAT

192

Ser

Cys

Pro

Phe

Ser

Arg

Asn

Pro

Gly

Ile

Gin

Val

His

Glu

Asp

Tyr

585

590

595

GAC

TGT

ACC

CTG

AAC

CAG

ACC

AAC

ATC

GGC

AAC

AAC

AAC

AAC

AAG

TTC

240

Asp

Cys

Thr

Leu

Asn

Gin

Thr

Asn

Ile

Gly

Asn

Asn

Asn

Asn

Lys

Phe

600

605

610

TAT

ATT

ATC

CAA

CTG

CTG

GAG

GAG

GGT

AGT

CGC

TTC

TTC

TGC

TGG

AAT

288

Tyr

Ile

Ile

Gin

Leu

Leu

Glu

Glu

Gly

Ser

Arg

Phe

Phe

Cys

Trp

Asn

615

620

625

CGC

TGG

GGC

CGC

GTG

GGA

GAG

GTG

GGC

CAG

AGC

AAG

ATG

AAC

CAC

TTC

336

Arg

Trp

Gly

Arg

Val

Gly

Glu

Val

Gly

Gin

Ser

Lys

Met

Asn

His

Phe

630

635

640

645

• · · • · · · · ·

9 9

9

ACC TGC CTG

GAA GAT GCA

AAG Lys

AAG GAC TTT AAG AAG AAA TTT TGG GAG

Thr

Cys

Leu

Glu Asp 650

Ala

Lys Asp

Phe 655

Lys

Lys

Lys

Phe Trp 660

Glu

AAG

ACT

AAA

AAC

AAA

TGG

GAG

GAG

CGG

GAC

CGT

TTT

GTG

GCC

CAG

CCC

Lys

Thr

Lys

Asn

Lys

Trp

Glu

Glu

Arg

Asp

Arg

Phe

Val

Ala

Gin

Pro

665

670

675

AAC

AAG

TAC

ACA

CTT

ATA

GAA

GTC

CAG

GGA

GAA

GCA

GAG

AGC

CAA

GAG

Asn

Lys

Tyr

Thr

Leu

Ile

Glu

Val

Gin

Gly

Glu

Ala

Glu

Ser

Gin

Glu

680

685

690

GCT

GTA

GTG

AAG

GTG

GAC

AGC

GGC

CCT

GTG

AGG

ACC

GTG

GTC

AAG

CCC

Ala

Val

Val

Lys

Val

Asp

Ser

Gly

Pro

Val

Arg

Thr

Val

Val

Lys

Pro

695

700

705

TGC

TCC

CTA

GAC

CCT

GCC

ACC

CAG

AAC

CTT

ATC

ACC

AAC

ATC

TTC

AGC

Cys

Ser

Leu

Asp

Pra

Ala

Thr

Gin

Asn

Leu

Ile

Thr

Asn

Ile

Phe

Ser

710

715

720

725

AAA

GAG

ATG

TTC

AAG

AAC

GCA

ATG

ACC

CTC

ATG

AAC

CTG

GAT

GTG

AAG

Lys

Glu

Met

Phe

Lys

Asn

Ala

Met

Thr

Leu

Met

Asn

Leu

Asp

Val

Lys

730

735

740

AAG

ATG

CCC

TTG

GGA

AAG

CTG

ACC

AAG

CAG

CAG

ATT

GCC

CGT

GGC

TTC

Lys

Met

Pro

Leu

Gly

Lys

Leu

Thr

Lys

Gin

Gin

Ile

Ala

Arg

Gly

Phe

745

750

755

GAG

GCC

TTG

GAA

GCT

CTA

GAG

GAG

GCC

ATG

AAA

AAC

CCC

ACA

GGG

GAT

Glu

Ala

Leu

Glu

Ala

Leu

Glu

Glu

Ala

Met

Lys

Asn

Pro

Thr

Gly

Asp

760

765

770

GGC

CAG

AGC

CTG

GAA

GAG

CTC

TCC

TCC

TGC

TTC

TAC

ACT

GTC

ATC

CCA

Gly

Gin

Ser

Leu

Glu

Glu

Leu

Ser

Ser

Cys

Phe

Tyr

Thr

Val

Ile

Pro

775

780

785

CAC

AAC

TTC

GGC

CGC

AGC

CGA

CCC

CCG

CCC

ATC

AAC

TCC

CCT

GAT

GTG

His

Asn

Phe

Gly

Arg

Ser

Arg

Pro

Pro

Pro

Ile

Asn

Ser

Pro

Asp

Val

790

795

800

805

CTT

CAG

GCC

AAG

AAG

GAC

ATG

CTG

CTG

GTG

CTA

GCG

GAC

ATC

GAG

TTG

Leu

Gin

Ala

Lys

Lys

Asp

Met

Leu

Leu

Val

Leu

Ala

Asp

Ile

Glu

Leu

810

815

820

GCG

CAG

ACC

TTG

CAG

GCA

GCC

CCT

GGG

GAG

GAG

GAG

GAG

AAA

GTG

GAA

Ala

Gin

Thr

Leu

Gin

Ala

Ala

Pro

Gly

Glu

Glu

Glu

Glu

Lys

Val

Glu

825

830

835

GAG

GTG

CCA

CAC

CCA

CTG

GAT

CGA

GAC

TAC

CAG

CTC

CTC

AGG

TGC

CAG

Glu

Val

Pro

His

Pro

Leu

Asp

Arg

Asp

Tyr

Gin

Leu

Leu

Arg

Cys

Gin

840

845

850

CTT

CAA

CTG

CTG

GAC

TCC

GGG

GAG

TCC

GAG

TAC

AAG

GCA

ATA

CAG

ACC

Leu

Gin

Leu

Leu

Asp

Ser

Gly

Glu

Ser

Glu

Tyr

Lys

Ala

Ile

Gin

Thr

855

860

865

TAC

CTG

AAA

CAG

ACT

GGC

AAC

AGC

TAC

AGG

TGC

CCA

AAC

CTG

CGG

CAT

Tyr

Leu

Lys

Gin

Thr

Gly

Asn

Ser

Tyr

Arg

Cys

Pro

Asn

Leu

Arg

His

384

432

480

528

576

624

672

720

768

816

864

912

960

1008

1056 • φ φ φ φφφφ

870

875

880

885

GTT

TGG

AAA

GTG

AAC

CGA

GAA

GGG

GAG

GGA

GAC

AGG

TTC

CAG

GCC

CAC

1104

Val

Trp

Lys

Val

Asn

Arg

Glu

Gly

Glu

Gly

Asp

Arg

Phe

Gin

Ala

His

890

895

900

TCC

AAA

CTG

GGC

AAT

CGG

AGG

CTG

CTG

TGG

CAC

GGC

ACC

AAT

GTG

GCC

1152

Ser

Lys

Leu

Gly

Asn

Arg

Arg

Leu

Leu

Trp

His

Gly

Thr

Asn

Val

Ala

905

910

915

GTG

GTG

GCT

GCC

ATC

CTC

ACC

AGT

GGG

CTC

CGA

ATC

ATG

CCA

CAC

TCG

1200

Val

Val

Ala

Ala

Ile

Leu

Thr

Ser

Gly

Leu

Arg

Ile

Met

Pro

His

Ser

920

925

930

GGT

GGT

CGT

GTT

GGC

AAG

GGT

ATT

TAT

TTT

GCC

TCT

GAG

AAC

AGC

AAG

1248

Gly

Gly

Arg

Val

Gly

Lys

Gly

Ile

Tyr

Phe

Ala

Ser

Glu

Asn

Ser

Lys

935

940

945

TCA

GCT

GGC

TAT

GTT

ACC

ACC

ATG

CAC

TGT

GGG

GGC

CAC

CAG

GTG

GGC

1296

Ser

Ala

Gly

Tyr

Val

Thr

Thr

Met

His

Cys

Gly

Gly

His

Gin

Val

Gly

950

955

960

965

TAC

ATG

TTC

CTG

GGC

GAG

GTG

GCC

CTC

GGC

AAA

GAG

CAC

CAC

ATC

ACC

1344

Tyr

Met

Phe

Leu

Gly

Glu

Val

Ala

Leu

Gly

Lys

Glu

His

His

Ile

Thr

970

975

980

ATC

GAT

GAC

CCC

AGC

TTG

AAG

AGT

CCA

CCC

CCT

GGC

TTT

GAC

AGC

GTC

1392

Ile

Asp

Asp

Pro

Ser

Leu

Lys

Ser

Pro

Pro

Pro

Gly

Phe

Asp

Ser

Val

985

990

995

ATC

GCC

CGA

GGC

CAA

ACC

GAG

CCG

GAT

CCC

GCC

CAG

GAC

ATT

GAA

CTT

1440

Ile

Ala

Arg

Gly

Gin

Thr

Glu

Pro

Asp

Pro

Ala

Gin

Asp

Ile

Glu

Leu

1000

1005

1010

GAA

CTG

GAT

GGG

CAG

CCG

GTG

GTG

GTG

CCC

CAA

GGC

CCG

CCT

GTG

CAG

1488

Glu

Leu

Asp

Gly

Gin

Pro

Val

Val

Val

Pro

Gin

Gly

Pro

Pro

Val

Gin

1015

1020

1025

TGC

CCG

TCA

TTC

AAA

AGC

TCC

AGC

TTC

AGC

CAG

AGT

GAA

TAC

CTC

ATA

1536

Cys

Pro

Ser

Phe

Lys

Ser

Ser

Ser

Phe

Ser

Gin

Ser

Glu

Tyr

Leu

Ile

1030

1035

1040

1045

TAC

AAG

GAG

AGC

CAG

TGT

CGC

CTG

CGC

TAC

CTG

CTG

GAG

ATT

CAC

CTC

1584

Tyr

Lys

Glu

Ser

Gin

Cys

Arg

Leu

Arg

Tyr

Leu

Leu

Glu

Ile

His

Leu

1050

1055

1060

ΤΑΑ 1587 (2) Informace pro SEQ ID NO: 10 (i) vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 528 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 10

Met Ala Pro Lys Arg Lys Ala Ser Val Gin Thr Glu Gly Ser Lys Lys

- 100 9 ·

9999

999·· 9 9

9 9 9 9 ··· • 99 9 ·· 999

10 15

Gin

Arg Gin Gly Thr Glu Glu Glu Asp

Ser Phe Arg Ser Thr 30

Ala

Glu

20

25

Ala

Leu

Arg

Ala

Ala

Pro

Ala

Asp

Asn

Arg

Val

Ile

Arg

Val

Asp

Pro

35

40

45

Ser

Cys

Pro

Phe

Ser

Arg

Asn

Pro

Gly

lle

Gin

Val

His

Glu

Asp

Tyr

-

50

55

60

Asp

Cys

Thr

Leu'

Asn

Gin

Thr

Asn

Ile

Gly

Asn

Asn

Asn

Asn

Lys

Phe

65

70

75

80

Tyr

Ile

Ile

Gin

Leu

Leu

Glu

Glu

Gly

Ser

Arg

Phe

Phe

Cys

Trp

Asn

85

90

95

Arg

Trp

Gly

Arg

Val

Gly

Glu

Val

Gly

Gin

Ser

Lys

Met

Asn

His

Phe

100

105

110

Thr

Cys

Leu

Glu

Asp

Ala

Lys

Lys

Asp

Phe

Lys

Lys

Lys

Phe

Trp

Glu

115

120

125

Lys

Thr

Lys

Asn

Lys

Trp

Glu

Glu

Arg

Asp

Arg

Phe

Val

Ala

Gin

Pro

130

135

140

Asn

Lys

Tyr

Thr

Leu

Ile

Glu

Val

Gin

Gly

Glu

Ala

Glu

Ser

Gin

Glu

145

150

155

160

Ala

Val

Val

Lys

Val

Asp

Ser

Gly

Pro

Val

Arg

Thr

Val

Val

Lys

Pro

165

170

175

Cys

Ser

Leu

Asp

Pro

Ala

Thr

Gin

Asn

Leu

Ile

Thr

Asn

Ile

Phe

Ser

180

185

190

Lys

Glu

Met

Phe

Lys

Asn

Ala

Met

Thr

Leu

Met

Asn

Leu

Asp

Val

Lys

195

200

205

Lys

Met

Pro

Leu

Gly

Lys

Leu

Thr

Lys

Gin

Gin

Ile

Ala

Arg

Gly

Phe

210

215

220

Glu

Ala

Leu

Glu

Ala

Leu

Glu

Glu

Ala

Met

Lys

Asn

Pro

Thr

Gly

Asp

225

230

235

240

Gly

Gin

Ser

Leu

Glu

Glu

Leu

Ser

Ser

Cys

Phe

Tyr

Thr

Val

Ile

Pro

245

250

255

His

Asn

Phe

Gly

Arg

Ser

Arg

Pro

Pro

Pro

Ile

Asn

Ser

Pro

Asp

Val

260

265

270

Leu

Gin

Ala

Lys

Lys

Asp

Met

Leu

Leu

Val

Leu

Ala

Asp

Ile

Glu

Leu

275

280

285

Ala

Gin

Thr

Leu

Gin

Ala

Ala

Pro

Gly

Glu

Glu

Glu

Glu

Lys

Val

Glu

290

295

300

Glu

Val

Pro

His

Pro

Leu

Asp

Arg

Asp

Tyr

Gin

Leu

Leu

Arg

Cys

Gin

305

310

315

320

Leu Gin Leu Leu Asp- Ser Gly Glu Ser Glu Tyr Lys Ala Ile Gin Thr • ·

- 101 • · 0 · · · • ····* · 0 ·

000 000 00 ·· 0 00 0 000

325 330 335

Tyr

Leu Lys Gin Thr 340

Gly Asn

Ser Tyr Arg Cys Pro Asn Leu

Arg

His

345

350

Val

Trp

Lys

Val

Asn

Arg

Glu

Gly

Glu

Gly

Asp

Arg

Phe

Gin

Ala

His

355

360

365

Ser

Lys

Leu

Gly

Asn

Arg

Arg

Leu

Leu

Trp

His

Gly

Thr

Asn

Val

Ala

370

375

380

Val

Val

Ala

Ala

Ile

Leu

Thr

Ser

Gly

Leu

Arg

Ile

Met

Pro

His

Ser

385

390

395

400

Gly

Gly

Arg

Val

Gly

Lys

Gly

Ile

Tyr

Phe

Ala

Ser

Glu

Asn

Ser

Lys

405

410

415

Ser

Ala

Gly

Tyr

Val

Thr

Thr

Met

His

Cys

Gly

Gly

His

Gin

Val

Gly

420

425

430

Tyr

Met

Phe

Leu

Gly

Glu

Val

Ala

Leu

Gly

Lys

Glu

His

His

Ile

Thr

435

440

445

Ile

Asp

Asp

Pro

Ser

Leu

Lys

Ser

Pro

Pro

Pro

Gly

Phe

Asp

Ser

Val

450

455

460

Ile

Ala

Arg

Gly

Gin

Thr

Glu

Pro

Asp

Pro

Ala

Gin

Asp

Ile

Glu

Leu

465

470

475

480

Glu

Leu

Asp

Gly

Gin

Pro

Val

Val

Val

Pro

Gin

Gly

Pro

Pro

Val

Gin

485

490

495

Cys

Pro

Ser

Phe

Lys

Ser

Ser

Ser

Phe

Ser

Gin

Ser

Glu

Tyr

Leu

Ile

500

505

510

Tyr

Lys

Glu

Ser

Gin

Cys

Arg

Leu

Arg

Tyr

Leu

Leu

Glu

Ile

His

Leu

515

520

525

(2) Informace pro SEQ ID NO: 11 (i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 14 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Vláknitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ Molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ano (ix) Znaky:

(A) Jméno/klič: Oblast (B) Poloha: 2 (D) Další informace: /poznámka=Xaa místo 1 až 5 dalších aminokyselin (ix) Znaky:

·« · • *

- 102 I · ···· · · · ···· · · <

> * · · · · · l •» · ·· · ·· (A) Jméno/klíč: Oblast (B) Poloha: 3 (D) Další informace: /poznámka=Xaa místo Ser nebo Thr (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 11

Pro Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Gly Lya Gly Ile Tyr Phe Ala 15 10 (2) Informace pro SEQ ID NO: 12 (i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 21 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Vláknitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ Molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ano (ix) Znaky:

(A) Jméno/klíč: Oblast (B) Poloha: 1 (D) Další informace: /poznámka=Xaa místo Ser nebo Thr (ix) Znaky:.

(A) Jméno/klíč: Oblast (B) Poloha: 6 (D) Další informace: /poznámka=Xaa místo Ile nebo Val (ix) Znaky:

(A) Jméno/klíč: Oblast (B) Poloha: 9 (D) Další informace: /poznámka=Xaa místo 1 až 5 dalších aminokyselin (ix) Znaky:

(A) Jméno/klíč: Oblast (B) Poloha: 10 (D) Další informace: /poznámka=Xaa místo Ser nebo Thr (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 12

Xaa Xaa Gly Leu Arg Xaa Xaa Pro Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Gly Lys 15 10 15

Gly Ile Tyr Phe Ala 20 (2) Informace pro SEQ ID NO: 13 (i) Vlastnosti sekvence:

··· ··· · · ···· ···* · · • ······· ······♦ · • · · · · · · · • · · · · · · ·

- 103 ·· · (A) Délka: 45 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Vláknitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ Molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ano (ix) Znaky:

(A) Jméno/klíč: Oblast (B) Poloha: 16 (D) Další informace: /poznámka=Xaa místo Ser nebo Thr (ix) Znaky:

(A) Jméno/klíč: Oblast (B) Poloha: 21 (D) Další informace: /poznámka=Xaa místo Ile nebo Val (ix) Znaky:

(A) Jméno/klíč: Oblast (B) Poloha: 24 (D) Další informace: /poznámka=Xaa místo 1 až 5 dalších aminokyselin (ix) Znaky:

(A) Jméno/klíč: Oblast (B) Poloha: 25 (D) Další informace: /poznámka=Xaa místo Ser nebo Thr (ix) Znaky:

(A) Jméno/klíč: Oblast (B) Poloha: 6 (D) Další informace: /poznámka=Xaa místo Ser nebo Thr

(xi) Popis

sel

ívence:

SEQ

ID'

NO:

13

Leu Leu 1

Trp

His

Gly 5

Xaa

Xaa

Xaa

Xaa

Xaa 10

Xaa

Xaa

Xaa

Ile

Leu 15

Xaa

Xaa Gly

Leu

Arg 20

Xaa

Xaa

Pro

Xaa

Xaa 25

Gly

Xaa

Xaa

Xaa

Gly 30

Lys

Gly

Ile Tyr

Phe 35

Ala

Xaa

Xaa

Xaa

Ser 40

Lys

Ser

Ala

Xaa

Tyr 45

(2) Informace pro SEQ ID NO: 14 (i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 22aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Vláknitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární ·· · *· * ·· fl·· · · · ··· • ··· · · · · · · • · ···· · · · flflflfl flfl · • flfl · · · flfl ·· · flfl · flfl · (íi) Typ Molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ano (ix) Znaky:

(A) Jméno/klič: Oblast (B) Poloha: 1 (D) Další informace: /poznámka=Xaa místo Leu nebo Val (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 14

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa, 15 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu 20 (2) Informace pro SEQ ID NO: 15 (i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 27 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Vláknitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ Molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ano (ix) Znaky:

(A) Jméno/klič: Oblast (B) Poloha: 21 (D) Další informace: /poznámka=Xaa místo Asp nebo Glu (ix) Znaky:

(A) Jméno/klič: Oblast (B) Poloha: 22 (D) Další informace: /poznámka=Xaa místo 10 až 11 dalších aminokyselin (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 15

Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa 15 10 15

Gin Leu Leu Xaa Xaa Xaa Trp Gly Arg Val Gly 20 25 (2) Informace pro SEQ ID NO: 16 (i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 29 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina • · • · • · · • *···

- 105 (C) Vláknitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ Molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ano (xí) Popis sekvence: SEQ ID NO: 16

Ala 1

Xaa

Xaa

Xaa

Phe 5

Xaa

Lys

Xaa

Xaa

Xaa 10

Xaa

Lys

Thr Xaa

Asn Xaa 15

Trp

Xaa

Xaa

Xaa 20

Xaa

Xaa

Phe

Xaa

Xaa 25

Xaa

Pro

Xaa

Lys

(2) Informace pro SEQ ID NO: 17 (i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 44 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Vláknitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ Molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ano (ix) Znaky:

(A) Jméno/klíč: Oblast (B) Poloha: 4 (D) Další informace: /poznámka=Xaa místo Ile nebo Leu

	(xi)	Popis	sekvence: SEQ	ID NO: :	17
Gin	xaa	Leu Xaa	Xaa Xaa Ile Xaa	Xaa Xaa	Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1			5	10	15
Met	xaa	Xaa Xaa	Xaa Xaa Xaa Xaa	Xaa Xaa	Xaa Pro Leu Gly Lys Leu
		20		25	30
Xaa	Xaa	Xaa Gin	Ile Xaa Xaa Xaa	Xaa Xaa	Xaa Leu
		35	40

(2) Informace pro SEQ ID NO: 18 (i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 15 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Vláknitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ Molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ano ·· · • · · • · · · φ *«**· φ φ » φφ « »· • φ φ · · φ φφφφ φ φ φ φ φφφφ · φ ·

Φ Φ · Φ ο

- 106 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 18

Phe Tyr Thr Xaa Ile Pro His Xaa Phe Gly Xaa Xaa Xaa Pro Pro 15 10 15 (2) Informace pro SEQ ID NO: 19 (i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 17 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Vláknitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ Molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ano (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 19

Lys Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Leu Xaa Asp Ile Glu Xaa Ala Xaa Xaa 15 10 15

Leu (2) Informace pro SEQ ID NO: 20 (i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 20 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Vláknitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ Molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ano (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 20

Gly Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Glu Val Ala Leu Gly 15 10 (2) Informace pro SEQ ID NO: 21 (i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 20 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Vláknitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ Molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ano (ix) Znaky:

• ···»· · · «···· · ·

107 (A) Jméno/klíč: Oblast (B) Poloha: 14 (D) Další informace: /poznámka=Xaa místo 7 až 9 dalších aminokyselin (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 21 Gly xaa Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Leu Xaa

Gly Xaa Xaa Val 20 (2) Informace pro SEQ ID NO: 22 (i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 16 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Vláknitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ Molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ano (ix) Znaky:

(A) Jméno/klíč: Oblast (B) Poloha: 2 (D) Další informace: /poznámka=Xaa místo Tyr nebo Phe (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 22

Glu Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Gin Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Leu 15 10 15 (2) Informace pro SEQ ID NO: 23 (i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 20 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Vláknitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ Molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 23

Met Ala Ala Arg Arg Arg Arg Ser Thr Gly Gly Gly Arg Ala Arg Ala 15 10 15

Leu Asn Glu Ser • · • · • · * • · · · · • · · • · · · • · · · · · ·

- 108 20 (2) Informace pro SEQ ID NO: 24 (i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 20 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Vláknitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ Molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 24 lys Thr Glu Leu Gin Ser Pro Glu His Pro Leu Asp Gin His Tyr Arg 15 10 15

Asn Leu His Cys 20 (2) Informace pro SEQ ID NO: 25 (i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 21 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Vláknitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ Molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 25

Cys Lys Gly Arg Gin Ala Gly Arg Glu Glu Asp Pro Phe Arg Ser Thr 15 10 15

Ala Glu Ala Leu Lys 20 (2) Informace pro SEQ ID NO: 26 (i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 21 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Vláknitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ Molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 26 ··· · · · ·· • · · · · · ··« • · · · ···· · · • «···*«· ······· · • · · · · · · · ·· · ·· · ·· ·

- 109 Cys Lys Gin Gin Ile Ala Arg Gly Phe Glu Ala Leu Glu Ala Leu Glu 15 10 15

Glu Ala Leu Lys 20 (2) Informace pro SEQ ID NO: 27 (i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 19 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Vláknitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ Molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 27

Lys Gin Gin Ile Ala Arg Gly Phe Glu Ala Leu Glu Ala Leu Glu Glu 15 10 15

Ala Leu Lys (2) Informace pro SEQ ID NO: 28 (i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 19 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Vláknitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ Molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 28

Lys Gin Gin Ile Ala Arg Gly Phe Glu Ala Leu Glu Ala Leu Glu Glu 1 5 10 15

Ala Met Lys

Claims (32)

1. NÁROKY

   JUDr. Otakar Švorčík - 110 advokát

   Hálkova 2, 120 00 Praha 2 • · ···· fl · · ···· · · · ··· · e · ·· « · í! ·· fl ··

   Upravená strana

   PATENTOVÉ

   1. Homolog póly(ADP-ribóza) polymerázy (PARP), získaný z člověka nebo jiných zdrojů, který má aminokyselinovou sekvenci, která obsahuje

   a) funkční NAD⁺ vazebnou doménu a

   b) neosahuje sekvenci motivu zinkového prstu obecného vzorce

   CX₂CX_mHX₂C ve kterém m je celé. číslo od 28 nebo 30 a X jsou zbytky, kterými jsou nezávisle sobě jakékoli aminokyseliny.
2. 2. Homolog póly(ADP-ribóza) polymerázy (PARP) podle nároku 1, ve kterém funkční NAD⁺ vazebná doména obsahuje jeden z následujících obecných motivů:

   PX_n (S/T) GX₃GKGIYFA, (S/T)XGLR(I/V) XPX_n (S/T) GX3GKGIYFA nebo

   LLWHG (S/T) X₇IL (S/T) XGLR (I/V) XPX_n (S/T) GX3GKGIYFAX3SKSAXY ve kterých n je celé číslo od 1 do 5 a X jsou zbytky, kterými jsou, nezávisle jeden na druhém, jakékoli aminokyseliny.
3. 3. PARP homolog podle jednoho z předcházejících nároků, který obsahuje alespoň jeden z následujících motivů části sekvence:

   • · · <·· ··· ···· · · · · · · • · ···· · · · ···· · · · • · · · · · · ·

   - HI - ” Opravená strana

   LX₉NX₂VX₂QLLX (D/E) Xio/nWGRVG,

   AX₃ FXKX₄ KTXNXWXs fx₃ PXK,

   QXL(I/L)X₂IX₉MX_1OPLGKLX3QIX6L,

   FYTXIPHXFGX3PP; a kx₃lx₂zlxdiexax₂l, ve kterém X jsou zbytky, kterými jsou, nezávisle jeden na druhém, jakékoli aminokyseliny.
4. 4. Homolog póly(ADP-ribóza) polymerázy (PARP) podle kteréhokoli z předcházejících nároků, vybraný z lidských homologů póly(ADP-ribóza) polymerázy (PARP), které mají aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2 (lidský PARP2) nebo SEQ ID NO: 4 nebo 6 (lidský PARP3 typ 1 nebo typ 2) ; nebo myších homologů póly(ADP-ribóza) polymeráz (PARP), které mají aminokyselinovou sekvence SEQ ID N0:8 (myší PARP dlouhá forma) nebo SEQ ID NO:10 (myší PARP krátká forma).
5. 5. Vazebný partner specifický pro homolog póly(ADP-ribóza) polymerázy (PARP) podle kteréhokoli z předcházejících nároků, vybraný ze souboru zahrnujícího

   a) protilátky a fragmenty protilátek,

   b) proteinům podobné sloučeniny, které interagují s částečnou sekvencí proteinu, a

   c) nízkomolekulární efektory, které modulují katalytickou aktivitu PARP nebo jiné biologické funkce PARP molekuly.
6. 6. Nukleová kyselina, zahrnující

   a) nukleotidovou sekvenci kódující alespoň jeden homolog póly(ADP-ribóza) polymerázy (PARP) podle jednoho z nároků 1 až 4 nebo komplementární nukleotidovou sekvenci • · · · · · • · w · · « · • ··· · · · · · • · ···· » * · ···· * · · • · · ·· · · · · ·

   - 112 - * Upravená strana nukleotidové sekvence kódující alespoň jeden homolog póly(ADP-ribóza) polymerázy (PARP);

   b) nukleotidovou sekvenci, která hybridizuje se sekvencí podle bodu a) za stringentních podmínek; nebo

   c) nukleotidovou sekvencu, která je odvozena z nukleotidových sekvencí definovaných v bodě a) a v bodě b) degenerací genetického kódu.
7. 7. Nukleová kyselina podle nároku 6 obsahující

   a) nukleotidy v poloze +3 až +1715 ukázáné v SEQ ID NO:1;

   b) nukleotidy v poloze +242 až + 1843 ukázáné v SEQ ID NO: 3 ; c) nukleotidy v poloze +221 až + 1843 ukázáné v SEQ ID NO: 5 ; d) nukleotidy v poloze + 112 až + 1710 ukázáné v SEQ ID NO: 7;

   nebo

   e) nukleotidy v poloze +1 až +1584 ukázáné v SEQ ID NO:9.
8. 8. Kazetu exprese, která obsahuje pod genetickou kontrolou alespoň jedné regulační nukleotidové sekvence, alespoň jednu nukleotidovou sekvenci podle jednoho z nároků 6 a 7.
9. 9. Rekombinantní vektor obsahující alespoň jednu kazetu exprese podle nároku 8.
10. 10. Rekombinantní mikroorganismus, obsahující alespoň jeden rekombinantní vektor podle nároku 9.
11. 11. Transgenní savec, obsahující vektor podle nároku 9.
12. 12. PARP-deficitního savec nebo PARP-deficitní eukaryotická buňka, ve kterých je inhibovaná funkční exprese alespoň

    - 113 • · · · φ · • · « * · · · · · ···· · · · · · · • ·····>» ······· φ • · · » φ · ·· ·· , t ·· , ·, ·· · upravena strana jednoho genu, který kóduje PARP homolog podle jednoho z nároků 1 až 4.
13. 13. Způsob in vitro detekce PARP inhibitorů, vyznačující se tím, 2e sestává z

    a) inkubace polyADP-ribozylovatelného cíle na nosiči nebo bez nosiče s reakční směsí, která obsahuje al) PARP homolog podle jednoho z nároků 1 až 4, a2) PARP aktivátor; a a3) PARP inhibitor nebo analyt, ve kterém se předpokládá přítomnost alespoň jednoho PARP inhibitoru;

    b) provedení polyADP ribozylační reakce; a

    c) kvalitativní nebo kvantitativní určení polyADP ribozylace cíle.
14. 14. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, že homolog póly(ADP-ribóza) polymerázy (PARP) je preinkubován s PARP aktivátorem a PARP inhibitorem nebo analytem, ve kterém se předpokládá přítomnost alespoň jednoho PARP inhibitoru, před provedením polyADP ribozylační reakce.
15. 15. Způsob podle jednoho z nároků 13 a 14, vyznačující se tím, že polyADP-ribozylovatelný cíl je protein histonu.
16. 16. Způsob podle kteréhokoli z nároků 13 až 15, vyznačující se tím, že PARP aktivátor je aktivovaná DNA.
17. 17. Způsob podle kteréhokoli z nároků 13 až 16, vyznačující se tím, že polyADP ribozylační reakce je spuštěna přidáním • · · · · · · • · · · · ·

    - 114

    Upravená s*trana'

    NAD⁺.
18. 18. Způsob podle kteréhokoli z nároků 13 až 17, vyznačující se tím, že polyADP ribozylace cíle na nosiči je určena za použití anti-poly(ADP-ribóza) protilátek.
19. 19. Způsob podle kteréhokoli z nároků 13 až 17, vyznačující se tím, že cíl, který není na nosiči, je označen akceptorem fluoroforu.
20. 20. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, že polyADP ribozylace cíle, který není na nosiči, je určena za použití anti-poly(ADP-ribóza) protilátky, která je označená donorem fluoroforu, který je schopný přenosu energie na akceptor fluoroforu.
21. 21. Způsob podle jednoho z nároků 19 a 20, vyznačující se tím, že cíl je histon s navázaným biotinem a akceptor fluoroforu se k němu kopuluje prostřednictvím avidinu nebo streptavidinu.
22. 22. Způsob podle jednoho z nároků 20 a 21, vyznačující se tím, že anti-poly(ADP-ribóza) protilátka nese europium kryptát jako donor fluoroforu.
23. 23. In vitro screeningový způsob pro vazebné partnery PARP molekuly, vyznačující se tím, že sestává z al) imobilizace na nosiči alespoň jednoho homologů póly(ADP-ribóza) polymerázy (PARP) podle jednoho z nároků 1 až 4;

    bl) uvedení v kontakt imobilizovaného homologů poly(ADP• · • · • · · · · · ··· • · · · 0··· 0 0

    0 0000000 0000000 0

    - 115 00 · , · 00 0

    Upravena strana ribóza) polymerázy (PARP) s analytem, ve kterém se předpokládá přítomnost alespoň jednoho vazebného partnera; a cl) určení, tam, kde je to vhodné po inkubační periodě, složek analytu navázaných k imobilizovanému homologu póly(ADP-ribóza) polymerázy (PARP);

    nebo a2) imobilizace na nosič analytu, který obsahuje alespoň jednoho možného vazebného partnera PARP molekuly;

    b2) uvedení v kontakt imobilizovaného analytu s alespoň jedním PARP homologem podle jednoho z nároků 1 až 4, pro který je hledán vazebný partner; a c2) prohlédnutí imobilizovaného analytu, jestli navázal homolog póly(ADP-ribóza) polymerázy (PARP), tam, kde je to vhodné po inkubační periodě.
24. 24. Způsob pro kvalitativní nebo kvantitativní určení nukleových kyselin kódujících homolog póly(ADP-ribóza) polymerázy (PARP) podle jednoho z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že sestává z

    a) inkubace biologického vzorku s definovaným množstvím exogenní nukleové kyseliny podle jednoho z nároků 6a 7, hybridizace za stringentních podmínek, určení hybridizace nukleových kyselin a tam, kde je to vhodné, porovnání se standartem; nebo

    b) inkubace biologického vzorku s párem oligonukleotidových primerů se specificitou pro nukleovou kyselinu kódující • · · · · · · · · · · · · · · · • ······· ·······

    116 ·♦ , 1 · · X · · · ·

    Upravena strana homolog póly(ADP-ribóza) polymerázy (PARP), amplifikace nukleové kyseliny, určení amplifikačního produktu a tam, kde je to vhodné, porovnání se standartem.
25. 25. Způsob pro kvalitativní nebo kvantitativní určení homologu póly(ADP-ribóza) polymerázy (PARP) podle jednoho z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že sestává z

    a) inkubace biologického vzorku s vazebným partnerem specifickým pro PARP homolog,

    b) detekce komplexu vazebného partnera/PARP a tam, kde je to vhodné,

    c) srovnání výsledku se standartem.
26. 26. Způsob podle nároku 25, vyznačující se tím, že vazebným partnerem je protilátka nebo vazebný fragment protilátky, na kterou je navázaná detekovatelná značka, tam kde je to vhodné.
27. 27. Způsob podle kteréhokoli z nároků 24 to 26 pro diagnózu chorob mediovaných nedostatkem energie.
28. 28. Způsob pro určení účinosti PARP efektorů, vyznačující se tím, že sestává z

    a) inkubace homologu póly(ADP-ribóza) polymerázy (PARP) podle jednoho z nároků 1 až 4 s analytem, který obsahuje efektor fyziologické nebo patologické PARP aktivity; opětovného odstranění efektorů, tam kde je to vhodné; a

    b) určení aktivity PARP homologu, tam, kde je to vhodné po přidání substrátů a kosubstrátů.

    - 117 ··· · · · · · · • · · · · · · · · · • ··*···· ······* · • · · ··· · · • · · · a · · ♦ ·

    Upravená strana
29. 29. Kompozice genové terapie, vyznačující se tím, že obsahuje ve vehikulu přijatelným pro genovou terapii konstrukt nukleové kyseliny, který

    a) obsahuje nukleovou kyselinu opačné polarity vzhledem ke kódující nukleové kyselině podle jednoho z nároků 6 a 7; nebo

    b) ribozym proti nukleové kyselině podle jednoho z nároků 6 a 7; nebo

    c) kóduje specifický PARP inhibitor.
30. 30. Farmaceutická kompozice vyznačující se tím, že obsahuje ve farmaceuticky přijatelném vehikulu, alespoň jeden PARP protein podle jednoho z nároků 1 až 4, alespoň jeden PARP vazebný partner podle nároku 5 nebo alespoň jednu kódující nukleotidovou sekvenci podle nároku 6 nebo 7.
31. 31. Použití nízkomolekulárních PARP vazebných partnerů podle nároku 5 pro přípravu farmaceutických prostředků pro diagnózu nebo terapii patologických stavů ve vývinu a/nebo postupu, při nichž se účastní alespoň jeden PARP protein nebo od něj odvozený polypeptid.
32. 32. Použití nízkomolekulárních PARP vazebných partnerů podle nároku 5 pro přípravu farmaceutických prostředků pro diagnózu nebo terapii patologických stavů, které mají původ v nedostatku energie.